DE60130464T2

DE60130464T2 - Pre-adipose zelllinien

Info

Publication number: DE60130464T2
Application number: DE60130464T
Authority: DE
Inventors: Christian Darimont; Katherine Mace; Andrea Pfeifer
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-07-14
Also published as: US7294509B2; EP1303589B1; ATE373082T1; CN100595274C; US20030175957A1; WO2002006450A1; EP1303589A1; AU2001277539A1; CN1458973A; DE60130464D1; JP2004504024A

Description

Diese Erfindung betrifft humane Präadipozyten-Zelllinien, die zur Differenzierung in Fettzellen fähig sind. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung vom weißen Fettgewebe abstammende Präadipozyten-Zelllinien und ihre Verwendung bei der Entwicklung von Arzneimitteln und Nahrungsinhaltsstoffen und -ergänzungen gegen Adipositas, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Die Adipositas ist von den National Institutes of Health der USA zu einem Risiko für die Volksgesundheit erklärt worden. Die Adipositas kann als das Vorhandensein von übermäßig viel Fettgewebe definiert werden, wovon 30 bis 50 % der Bevölkerung Nordamerikas und ein beträchtlicher Anteil der Bevölkerung weltweit betroffen sind. Man schätzt, dass die Folgen der Adipositas, z. B. der nicht-insulinabhängige Diabetes, die koronare Herzkrankheit und der Bluthochdruck, zu direkten Kosten in Höhe von 45,8 Milliarden Dollar und zusätzlichen indirekten Kosten in Höhe von 23 Milliarden Dollar, z. B. durch Arbeitsausfälle, geführt haben.
Man geht davon aus, dass die Aufnahme von zu viel Fett und Kohlenhydraten zur Adipositas und Hyperlipidämie führt und letztlich sogar Bluthochdruck und Arteriosklerose hervorruft. Die Unterdrückung der Aufnahme von Fett und Kohlenhydraten und die Verringerung der Fettakkumulation werden deshalb als äußerst wünschenswerte Ziele anerkannt. Nach der Aufnahme von zu vielen Kalorien leiden Kleinkinder unter einer Vermehrung der Adipozyten und geraten in den Zustand, den man durchaus als potenzielle Adipositas bezeichnen könnte. Aus diesem Grund wurde berichtet, dass die Unterdrückung der Zunahme der Adipozytenzahl, insbesondere bei Kleinkindern, direkt zur Verhinderung der Adipositas und der Herz-Kreislauf-Erkrankungen führt, die man durchaus als Komplikationen der Adipositas bei Kindern und in der Folge bei Erwachsenen bezeichnen könnte.
Für die Bekämpfung dieses offensichtlichen Gesundheitsproblems sind sowohl prophylaktische als auch therapeutische Ansätze erforderlich. Für prophylaktische Zwecke wäre es nützlich, in der Lage zu sein, die Neigung oder Anfälligkeit einer Person für Adipositas vorherzusagen und zu bestimmen. Für therapeutische Zwecke wäre ein Mittel zur Hemmung der Entwicklung oder Differenzierung von Adipozyten (Fettzellen) von großem Nutzen. Keines dieser erwünschten Ziele ist bisher erreicht worden, was hauptsächlich daran liegt, dass wenig über die Regulation und Steuerung der Entwicklung des Fettgewebes, z. B. die Proliferation und Differenzierung von Adipozytenvorläufern, bekannt ist.
Die Identifizierung von Mitteln bzw. Substanzen, die diese Proliferation und Differenzierung steuern, ist für das Verständnis der Entwicklung des normalen Fettgewebes und für die Entwicklung von Ansätzen zur Kontrolle anormaler Stadien der Entwicklung des Fettgewebes, wie der Adipositas, sehr wichtig.
Zur Bestimmung, ob eine Substanz an der physiologischen Regulation der Entwicklung des Fettgewebes beteiligt ist, können Untersuchungen durchgeführt werden, ob die Adipozyten oder deren Vorläufer auf diesen Faktor ansprechen und, letztlich, ob dieser Faktor effizient und spezifisch die Entwicklung des Fettgewebes in vivo modulieren kann. Geeignete Studien konnten bisher nicht durchgeführt werden, was hauptsächlich auf dem Fehlen geeigneter, von humanem Fettgewebe abstammender Gewebe oder Zellen beruht, die Eigenschaften normaler Adipozyten aus lebendem Gewebe aufweisen und für die Durchführung der Experimente in vitro über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können.
Fettzellen oder Adipozyten, die Haupt-Zellpopulation des Fettgewebes, stellen einen wichtigen Speicher für Triglyceride dar, und sie werden als endokrine Zellen angesehen. Das Fettgewebe stellt eine Energiereserve in Form von Triglyceriden für den Körper bereit, und dieses Gewebe kann freie Fettsäuren abgeben, wenn die Kalorienaufnahme unter den metabolischen Bedarf absinkt. Als Reaktion auf eine erhöhte Nahrungsaufnahme erhöht der Körper normalerweise automatisch den Energieverbrauch durch Aktivität, um ein Energiegleichgewicht aufrecht zu erhalten. Energie kann auch in Form von Wärme abgegeben werden. Es gibt verbreitete Wege zur Energieregulation, die die Nahrungsaufnahme mit der metabolischen Aktivität ausbalancieren und die hauptsächlich über den Hypothalamus vermittelt werden. Es ist nun auch offensichtlich, dass die Adipozyten eine aktive Rolle in diesem Prozess spielen und wahrscheinlich Moleküle bilden, die der Rückkopplung dienen und eine Regulation des Triglyceridmetabolismus bewirken. Weiterhin sind Adipozyten zur Sekretion von Hormonen, die Schlüsselfunktionen in peripheren oder zentralen Organen modulieren, in der Lage. Das beste Beispiel ist das Leptin, das von Adipozyten sekretiert wird und über Rezeptoren im Hypothalamus den Energiemetabolismus und die Sättigung reguliert. Es wäre deshalb äußerst interessant, derartige Moleküle finden und untersuchen zu können.
Es gibt im Wesentlichen zwei Typen von Fettgewebe, braunes und weißes, die im Körper recht unterschiedliche Aufgaben erfüllen. US 6 071 747 betrifft immortalisierte Zelllinien, die von braunem oder weißem humanem Fettgewebe abstammen, einschließlich von Präadipozyten-Zelllinien. Immortalisierte Präadipozyten-Zelllinien werden erzeugt durch: das Abtrennen der Zellen aus einem humanen Fettgewebe, das Dedifferenzieren und die Proliferation der erhaltenen Zellen zur Gewinnung eines Präadipozytenklons und das Immortalisieren des Präadipozytenklons. Das wurde für braunes Fettgewebe gezeigt, das bei einer Karyotypanalyse normale Chromosomen und die üblichen funktionellen Eigenschaften aufwies. Differenziell exprimierte Gene, die eine Rolle bei der Entwicklung brauner und weißer Präadipozyten spielen, wurden von Boeuf S. et al., Physiol. Genomics 7 (2001), S. 15-25, identifiziert. Zu diesem Zweck wurden Primärzellkulturen von Fettzellen hergestellt und mittels einer Representational-Difference-Analyse und eines DNA-Microarray-Screenings untersucht.
Das weiße Fett ist so ausgelegt, dass es überschüssige Kalorien speichert, während das braune Fettgewebe ein einzigartiges System zur Beseitigung überschüssiger Kalorien einsetzt und es zur Erzeugung von Körperwärme verwendet. Für weiße Adipozyten wurde jedoch gezeigt, dass sie entkoppelnde Proteine exprimieren, die an der Steuerung der Thermogenese beteiligt sind. Da nur das weiße Fettgewebe beim erwachsenen Menschen fortbesteht, könnte eine durch das weiße Fett induzierte Thermogenese den Energieverbrauch steigern.
Ein Ziel der Erfindung besteht demnach darin, Hilfsmittel zur weiteren Untersuchung der Rolle des weißen Fettgewebes im Körper bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Hilfsmittel bereitzustellen, die eine Untersuchung der Wirkung von neuen Arzneimitteln oder Nahrungsinhaltsstoffen auf das weiße Fettgewebe ermöglichen.
Das obige Ziel ist durch die Bereitstellung neuartiger Präadipozyten-Zelllinien erreicht worden, die von weißen Fettzellen abstammen und die die Fähigkeit zur Differenzierung in reife weiße Fettzellen besitzen, wobei sie die gleichen Zelleigenschaften wie normale weiße Fettzellen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine humane Präadipozyten-Zelllinie bereit, die durch die folgenden Schritte erhalten werden kann: a) Abtrennen von Zellen von einem menschlichen Fettgewebe, b) Dedifferenzieren und Vermehren der in a) erhaltenen Zellen, um einen Präadipozytenklon zu erhalten, c) Immortalisieren eines unter Schritt b) isolierten Präadipozytenklons, d) Selektionieren auf immortalisierte Zellen, und e) Selektionieren auf Zellen, die in weiße Fettzellen differenzieren können. Die aus der Präadipozyten-Zelllinie differenzierten Fettzellen zeigen ein Stoffwechselmuster von Lipoproteinlipase, Fettsäuresynthase, Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin, den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ und β (PPARγ, β) und der Hormon-sensitiven Lipase, das mit dem normaler Fettzellen identisch ist, wobei die Fettzellen Zelleigenschaften von normalen weißen Fettzellen aufweisen.
Figuren:
1 zeigt schematisch, wie die Präadipozyten-Zellen erhalten wurden.
2 zeigt die Expression des großen T-Antigens von SV40 in den verschiedenen, mittels RT-PCR und Immunfluoreszenz analysierten immortalisierten Klonen.
3 zeigt die Zelldifferenzierung unter verschiedenen adipogenen Bedingungen.
4 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, die das Expressionsmuster verschiedener Marker der Adipozytendifferenzierung in der Zelllinie im Vergleich zu humanem Fettgewebe untersuchen.
Zelllinien haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Molekular- und Zellbiologie gespielt, insbesondere bei der Aufklärung intrazellulärer Aktivitäten, der Wirkungen extrazellulärer Moleküle und von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Zelllinien werden normalerweise schrittweise etabliert über die Explantation von Gewebe, das eine heterogene Zellpopulation enthält, die Abtrennung der Zellen, die Isolierung eines interessierenden Zellklons und das Kultivieren des Zellklons, sodass die Gesamtzellzahl über mehrere Generationen ansteigt und die Population bezüglich ihrer Abstammung einheitlich ist. Trotzdem werden diese Zellen in einer In-vitro-Kultur nur für eine begrenzte Anzahl von Passagen überleben, ehe sie ins Seneszenzstadium eintreten.
Zellen, die praktisch kontinuierlich kultiviert werden können, kennt man als so genannte immortalisierte Zellen. Immortalisierte Zellen haben viele Vorteile gegenüber nicht-immortalisierten Zellen, da sie zur Bereitstellung einer Population aus einer großen Zahl einheitlicher Zellen kultiviert werden können. Normalerweise werden immortalisierte Zelllinien mithilfe eines rekombinanten Virus oder eines Retrovirus erzeugt, wobei dieses Verfahren allerdings dazu führt, dass die so immortalisierten Zellen bezüglich ihrer zellulären Funktion etwas unausgeglichen sind. In dieser Hinsicht unterscheiden sich immortalisierte Zelllinien am häufigsten insofern erheblich von den Zellen, von denen sie abstammen, als sie ein anderes metabolisches Muster aufweisen und keine enzymatisch aktiven oder strukturellen Polypeptide produzieren, die man normalerweise im besagten Zelltyp findet. Darüber hinaus wird dadurch auch das Potenzial zur Differenzierung stark beeinflusst. Als Konsequenz daraus ist es für verschiedene Zelltypen immer noch schwierig, sie zu isolieren und kontinuierlich zu kultivieren.
Die vorliegende Erfindung stellt nun neuartige immortalisierte Zelllinien bereit, die in der Lage sind, in reife weiße Adipozyten zu differenzieren, wobei diese weißen Adipozyten das gleiche morphologische Muster aufweisen, z. B. bezüglich der Polypeptidexpression oder des Aussehens der Zellen, wie aus lebendem Gewebe erhaltene weiße Adipozyten.
Die erfindungsgemäßen Präadipozyten-Zelllinien können mit Verbindungen, die in diesem Gebiet bekannt sind, wie Insulin, Triiodthyronin, Dexamethason und Aktivatoren Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptoren (PPAR), in reife weiße Adipozyten differenziert werden. Die so erhaltenen weißen Adipozyten zeigen dann die gleichen metabolischen Marker wie normale weiße Fettzellen, wie an der Synthese von Triglyceriden beteiligte Enzyme, z. B. die Lipoproteinlipase und die Fettsäuresynthase, das Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin, die Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ (PPAR γ) und die hormonsensitive Lipase. Die weißen Adipozyten können für wenigstens 12 Passagen, vorzugsweise wenigstens 20 Passagen, bevorzugter wenigstens 30 Passagen und am bevorzugtesten wenigstens 50 Passagen in Kultur gehalten werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelllinie eine beliebige der Zelllinien, die gemäß dem Budapester Vertrag mit dem Institute Pasteur am 13. Juli 2000 hinterlegt wurden und die Hinterlegungsnummer CNCM I-2520 erhielten, oder die Zelllinie, die am 27. April 2001 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer CNCM 12663 erhielt.
Das Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Zelllinien umfasst die folgenden Schritte a) bis e).
Im Schritt a) werden weiße Fettzellen in vitro aus einem geeigneten Fettgewebe eines humanen Spenders isoliert. Das vom Spender erhaltene primäre Gewebe wird zuerst so behandelt, dass die Adipozyten von anderen vorhandenen Zellen abgetrennt werden, z. B. durch die Behandlung der Gewebeprobe mit einer collagenasehaltigen Lösung und das Abtrennen der Adipozyten von den anderen Zellen durch sukzessive Filtrationen gefolgt von einer Zentrifugation.
Im nachfolgenden Schritt b) werden die im Schritt a) erhalten Fettzellen dedifferenziert, was z. B. mittels des sogenannten „Ceiling-Culture-Verfahrens" erreicht werden kann, das früher für Nageradipozyten beschrieben wurde (Sugihara H., Yonemitsu N., Miyabara S., Yun K. 1986. Primary culture of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation 31: 42-49). Gemäß diesem Verfahren werden die Adipozyten in eine Kulturflasche transferiert, die bis oben hin mit Kulturmedium gefüllt ist, und diese wird auf den Kopf gestellt. Nach sechs Tagen bei diesen Bedingungen dedifferenzierten Adipozyten spontan zu fibroblastenähnlichen Zellen, die keine Lipidtröpfchen enthielten. Die resultierenden dedifferenzierten Adipozyten lässt man dann bei den gleichen Kulturbedingungen wie oben proliferieren, wodurch aktiv wachsende Präadipozyten erhalten werden.
Im nächsten Schritt c) werden die so erhaltenen Präadipozyten immortalisiert. Das kann durch das Infizieren der Zellen mit einem rekombinanten Vektor, wie mit einem rekombinanten Plasmid, einem rekombinanten Virus oder einem Retrovirus, z. B. einem rekombinanten retroviralen Vektor, der das Gen des großen T-Antigens des SV40-Virus (Simian-Virus) oder das E6- oder E7-Gen des HPV-Virus (Human Papilloma Virus) trägt, erreicht werden. Gemäß einem alternativen Verfahren trägt der rekombinante Vektor die Telomerase-Reverse-Transcriptase (TERT)-Gene, die vorzugsweise von der gleichen Spezies stammen wie die Zellen, die immortalisiert werden sollen. Der Hauptinhalt des letzteren Verfahrens besteht darin, dass im Wesentlichen eine Verkürzung der Telomere des Chromosoms verhindert wird, ein Effekt, von dem gut bekannt ist, dass er von einer Seneszenz begleitet wird. Die Aufrechterhaltung der Telomere und die Immortalisierung von Zellen wurde für epitheliale Zellen von Kiyono et al., Nature 396 (1998), 84-88, berichtet, und dieses Dokument wird hier mit der entsprechenden Literaturstelle mit aufgenommen.
Eine sukzessive Infektion mit dem SV40-Virus (Simian-Virus) oder dem E6- oder E7-Gen des HPV-Virus und dem TERT-Gen stellt ebenfalls ein alternatives Verfahren zur Immortalisierung humaner Präadipozyten dar.
Im nachfolgenden Schritt d) erfolgt eine Selektion auf Zellen, die positiv bezüglich einer Immortalisierung sind, was z. B. einfach durch das Kultivieren der im Schritt c) erhalten Zellen über mehrere Passagen oder durch das Testen der Zellen auf Gene des zur Immortalisierung eingesetzten Vektors, wie auf Gene des SV40-Virus oder Gene des HPV-Virus, durchgeführt werden kann. Das kann über den Nachweis der Expression des betreffenden Gens mit Hilfe von Antikörpern erreicht werden, oder es kann eine Analyse mittels PCR-Techniken beinhalten. Die Expression der Telomerase-Reverse-Transcriptase-Gene wird über die Messung der Telomeraseaktivität, die über den Einsatz des Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) bestimmt wird, nachgewiesen.
Im nachfolgenden Schritt e) werden die Zellen, die durch die Einführung des Vektors positiv bezüglich der Immortalisierung geworden sind, auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung in reife weiße Fettzellen getestet. Dazu werden die im Schritt d) erhaltenen Zelllinien mit üblichen Differenzierungsmitteln behandelt, sodass sie über die Anfärbung intrazellulärer Lipide erkennbar werden. Die Lipidfärbung wird üblicherweise mit dem Ölrot-O-Verfahren durchgeführt, das spezifisch Lipide anfärbt.
Die aus der Präadipozyten-Zelllinie differenzierten Fettzellen zeigen ein Stoffwechselmuster von Lipoproteinlipase, Fettsäuresynthase, Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin, den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ und β (PPARγ, β) und der Hormon-sensitiven Lipase, das mit dem normaler Fettzellen identisch ist, wobei die Fettzellen Zelleigenschaften von normalen weißen Fettzellen zeigen.
Die erfindungsgemäßen Zelllinien können für verschiedene Zwecke eingesetzt werden, zum Beispiel als Hilfsmittel zur Untersuchung der Rolle der Steuerung der Regulation der Lipidaufnahme und -abgabe durch weiße Adipozyten oder zur Identifizierung von Substanzen, die die Differenzierung von Präadipozyten in reife Adipozyten steuern, oder für das Screenen auf Verbindungen, die in der Lage sind, die Expression von Zielen für die Adipositas, den Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu steuern. Insbesondere könnten diese Zelllinien hilfreich für das Screening auf Faktoren sein, die in der Lage sind, die Freisetzung von Verbindungen, die an der Steuerung des Energiemetabolismus beteiligt sind, wie Leptin, durch Adipozyten zu regulieren.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung veranschaulichen, ohne sie auf die erwähnten spezifischen Ausführungsformen einzuschränken.
Beispiel 1
EXTRAKTION VON ADIPOZYTEN AUS HUMANEM SUBKUTANEM FETTGEWEBE
Nach dem chirurgischen Eingriff wurde die Biopsie von subkutanem Fettgewebe eines fettleibigen Patienten bei Raumtemperatur in eine Mischung aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und Ham's-F12-Medium (Vol./Vol.) (Gibco BRL), die mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) (Gibco BRL), 100 μg/ml Streptomycin/Penicillin und 2 mM Glutamin supplementiert war, gegeben. Dieses Medium wurde Basalmedium genannt. Das Fettgewebe wurde zu kleinen Stückchen zerkleinert und 20 min bei 37 °C in 3 ml Verdaumedium pro Gramm Gewebe verdaut. Das Verdaumedium enthielt 2 mg/ml Collagenase (Roche Biomedical) und 20 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma) gelöst in DMEM-Medium.
Der Verdau wurde durch die Zugabe des gleichen Volumens an FKS gestoppt, sodass eine FKS-Konzentration von 20 % erhalten wurde. Die Verdauflüssigkeit wurde zweimal durch Filter unterschiedlicher Porosität (250, 100 μm) filtriert und 10 min bei 1000 Upm zentrifugiert. Die Adipozytenfraktion wurde in Form einer dünnen und weißen schwimmenden Schicht erhalten, die abgenommen und in 30 ml Phosphatpuffer von 37 °C gegeben wurde. Die Suspension wurde zentrifugiert (10 min bei 1000 Upm), wodurch eine Adipozytenfraktion erhalten wurde, die anderer kontaminierender Zellen beraubt war.
Beispiel 2
DEDIFFERENZIERUNG UND PROLIFERATION PRIMÄRER ADIPOZYTEN
Ungefähr 10⁶ Adipozyten wurden in einer 25-cm²–Flasche, die vollständig mit DMEM gefüllt war, das mit Ham's-F12-Medium (Vol./Vol.) gemischt und mit 20 % FKS, 10 mg/ml Streptomycin/Penicillin und 2 mM Glutamin supplementiert war, inkubiert. Die Flasche wurde auf den Kopf gestellt, um es den Adipozyten zu ermöglichen, sich an die obere innere Oberfläche anzuheften. Nach 8 Tagen Kultivierung in der passenden Umgebung (37 °C, 90 % Luftfeuchtigkeit) waren die Zellen angewachsen und hatten begonnen, sich spontan zu Präadipozyten zu dedifferenzieren und zu proliferieren. Die Flasche wurde dann in die richtige Position gebracht, und das Medium wurde entfernt. Es wurden 5 ml des oben beschriebenen Basalmediums in die Flasche gegeben. Nach 2 Tagen bei diesen Bedingungen wurden die Zellen infiziert.
Beispiel 3
IMMORTALISIERUNG DER ZELLEN
1. Erzeugung des Retrovirus
Ein rekombinanter retroviraler Vektor, der das Gen des großen T-Antigens des SV40-Virus (Simian-Virus) oder die Gene E6/E7 des HPV-Virus (Human Papilloma Virus) oder die der humanen Telomerase-Reverse-Transcriptase (hTERT) trug, wurde über eine Insertion mittels gentechnologischer Standardverfahren in die BamHI-Stelle des retroviralen pLHXSD-Vektors (Stockschlaeder et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 33-39), der das Histidinol-Gen als Selektionsmarker enthielt, konstruiert.
Infektiöse rekombinante Viruspartikel wurden durch die Transfektion des rekombinanten retroviralen Vektors in die amphotrope Verpackungszelllinie Phoenix (Clontech), gefolgt von dem Kokultivieren mit der ecotropen Verpackungszelllinie Psi2 (ATCC) zur Ermöglichung einer „fing-Pong"-Infektion zur Erzielung eines höheren Virustiters, erzeugt (Lynch C., Miller D. 1991. Production of high helper virus-free retroviral vectors by cocultivation of packaging cells with different host racipes. J. Virol. 65: 3887-3890).
2. Infektion primärer Fettzellen
Wie oben beschrieben hergestellte infektiöse rekombinante Viruspartikel wurden zur Infizierung primärer humaner dedifferenzierter Fettzellen, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden waren, eingesetzt. Die Zellen wurden 3 Stunden bei 37 °C (90 % Luftfeuchtigkeit) mit dem rekombinanten Virus in Gegenwart von 20 μg/ml DEAE-Dextran inkubiert. Nach der Infektion wurde das Kulturmedium gegen das Basalmedium ausgetauscht.
Zehn Tage nach der Infektion wurden die ersten Klone durch Aufsaugen gepickt und separat vermehrt. Die Expression der Gene des SV40-T-Antigens oder von E7 in den verschiedenen Klonen wurde mittels RT-PCR unter Einsatz von

SV40-T-Antigen: 5' GGATTCAGTGGTGTATGACT,

5' AGGCACACTGTACTCATTCA,

E7: 5' GGAGATACACCTACATTGCA,

5' GATGGGGCACACAATTCCTA

(alle bezogen von Microsynth)

und einer Immunfärbung unter Verwendung monoklonaler, gegen das humane SV40-T-Antigen gerichteter Mausantikörper (Oncogene) bestimmt. Die Telomeraseaktivität wurde über den Einsatz des Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) nach Kim et al., Science 266 (1994), 2011-2015, bestimmt.
Beispiel 4
DIFFERENZIERUNG INFIZIERTER ZELLEN
Man ließ Zellen, die für das 7SV40-T-Antigen, E7, TERT oder E7 und TERT positiv waren und wie im Beispiel 3 beschrieben erhalten worden waren, in dem Basalmedium, wie es im Beispiel 1 definiert wurde, bis zur Konfluenz wachsen, und dann wurde ein adipogener Cocktail zu dem Medium gegeben, der das Basalmedium enthielt und mit 850 nM Insulin, 10 μg/ml Transferrin, 1 nM Triiodthyronin, 500 μM Fetuin, 33 μM Panthotensäure, 1 mM Hepes, 15 mM NaHCO₃ und 1 μM Dexamethason und 1 μM BRL49653, einem PPARγ-Agonisten, supplementiert war. Die Zellen wurden dann weiter inkubiert. Am Tag 10 nach dem Erreichen der Konfluenz begannen die Zellen, einen adipozytenartigen Phänotyp mit intrazellulären Lipidtröpfchen zu zeigen, die durch eine spezifische Färbung nachgewiesen werden konnten. Diese Ölrot-O-Färbung wurde an mit 10 % Formaldehyd fixierten Zellen durchgeführt, die 2 Stunden mit dem in Isopropanol gelösten Farbstoff inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann mit Wasser und gewaschen und unter dem Mikroskop inspiziert. Die differenzierten Adipozyten erschienen als Zellen, die mit roten zytoplasmatischen Flecken, die die Akkumulation von Lipidtröpfchen widerspiegelten, angefüllt waren.
Beispiel 5
EXPRESSION VON ADIPOZYTEN IN DIFFERENZIERTEN IMMORTALISIERTEN HUMANEN PRAADIPOZYTEN
Konfluente immortalisierte humane Präadipozyten der Zelllinie CNCM I-2550 (erhalten wie in den vorhergehenden Beispielen) wurden in einem serumfreien, im Beispiel 4 beschriebenen, chemisch definierten Medium kultiviert.

Am Tag 17 nach dem Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit Hank's Balanced Salt Solution gewaschen, und die RNA wurde mittels des RNeasy Total RNA Purification System (Qiagen AG, Schweiz) extrahiert. Die reverse Transkription wurde mit einem Einsatz von 2 μg Gesamt-RNA mithilfe des Erststrang-cDNA-Synthese-Kits für die RT-PCR (AMV, Roche Biomedical, Schweiz) mit Oligo-d(T)₁₅ als Primer durchgeführt. Die für die Amplifizierung der interessierenden cDNAs eingesetzten Primer wurden von Microsynth (Windisch, Schweiz) synthetisiert. Die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärts-Primer sahen folgendermaßen aus:

Actin	vorwärts 5'-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3'
	rückwärts 5'-CATAGTCCGCCTAGAAGC-3'
Adipsin	vorwärts 5'-TACAGCTGTCGGAGAAGG-3'
	rückwärts 5'-TTCTTGCGGTTGCCGCAAAC-3'
Adiponectin	vorwärts 5'-GGGAGCTGTTCTACTGCTAT-3'
	rückwärts 5'-CTCCAATCCCACACTGAATG-3'
Fettsäurebindungsprotein	vorwärts 5'-GGTACCTGGAAACTTGTCTC-3'
	rückwärts 5'-AACTTCAGTCCAGGTCAACG-3'
Lipoproteinlipase (LPL)	vorwärts 5'-TTTCTCTGTATGGCACCGTG-3'
	rückwärts 5'-TTCACAAATACCGCAGGTGC-3'
Fettsäuresynthase (FAS)	vorwärts 5'-GGTCTTGAGAGATGGCTTGC-3'
	rückwärts 5'-CAGGTTGACAGCAGCCAAGT-3'
Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor δ (PPAR δ)	vorwärts 5'-TCAACGACCAGGTTACCCTTT-3'
	rückwärts 5'-CTTGATCCGCTGCATCATCT-3'
Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor γ (PPAR γ)	vorwärts 5'-GTGCAGGAGATCACAGAGAT-3'
	rückwärts 5'-TTGCCAAGTCGCTGTCATCT-3'

Der PCR-Ansatz wurde in einem DNA-Thermocycler (Bioconcept, Allschwil, Schweiz) für 2 Zyklen 1 min bei 98 °C, 2 min bei 60 °C und 2 min bei 72 °C erhitzt und dann 28-mal durch einen Denaturierungsschritt von 1 min bei 94 °C, einen Hybridisierungsschritt von 1 min bei 60 °C und einen Verlängerungsschritt von 2 min bei 72 °C zyklisiert.
Actin-Primer wurden als interne Kontrolle in der Reaktion mitgeführt. Die PCR-Produkte (10 μl) wurden auf einem 2 %-igen Agarosegel aufgetrennt und über eine Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Expression der einzelnen Adipozytenmarker durch die untersuchte Zelllinie mit der des Fettgewebes praktisch identisch ist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Menschliche Prä-Fettzelllinie, die über die Schritte erhältlich ist von (a) Abtrennen von Zellen in vitro von einem menschlichen Fettgewebe, (b) De-Differenzieren und Vermehren der in (a) erhaltenen Zellen, um einen Prä-Adipozyten-Klon zu erhalten, (c) Immortalisieren eines unter Schritt (b) isolierten Prä-Fettzell-Klons, (d) Selektionieren auf immortalisierte Zellen, und (e) Selektionieren auf Zellen, die in weiße Fettzellen differenzieren können, wobei die Fettzellen, die von der Prä-Fettzelllinie differenziert werden ein Stoffwechselmuster von Lipoprotein-Lipase, Fettsäuresynthase, Fettsäure-Bindendes Protein von Adipozyten, Leptin, Adipsin, Adiponectin, Peroxisomenproliferator aktivierte Rezeptoren und γ und β (PPARγ, β) und die Hormon-sensitive Lipase identisch zu normalen Fettzellen zeigen, wobei die Fettzellen Zelleigenschaften von normalen weißen Fettzellen zeigen.
Menschliche Prä-Fettzelllinie, die als CNCM I-2520 oder CNCM I-2663 vorliegt.
Verfahren zum Herstellen einer Prä-Fettzelllinie nach einem der vorstehenden Ansprüche, das die Schritte umfasst: (a) Abtrennen von Zellen in vitro von einem menschlichen Fettgewebe, (b) De-Differenzieren und Vermehren der in (a) erhaltenen Zellen, um einen Prä-Fettzell-Klon zu erhalten, (c) Immortalisieren eines unter Schritt (b) isolierten Prä-Fettzell-Klons, (d) Selektionieren auf immortalisierte Zellen, und (e) Selektionieren auf Zellen, die in weiße Fettzellen differenzieren können.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Immortalisierungsschritt mit einem das SV40 T-Antigen tragenden rekombinanten Vektor ausgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Immortalisierungsschritt mit einem die E7 Gene des HPV-Virus tragenden rekombinanten Vektor ausgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Immortalisierungsschritt durch das Telomerase-Verfahren ausgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Immortalisierungsschritt in Verbindung mit einem rekombinanten Vektor, der die E7 Gene des HPV-Virus trägt und einem Virus ausgeführt wurde, das das Telomerase-Reverse Transkriptasegen trägt.
Verwendung einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Identifikation von Substanzen, die die Regulation der Aufnahme und Abgabe von Lipid durch menschliche weiße Adipozyten steuern.
Verwendung einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Identifikation von Substanzen, die die Differenzierung von Prä-Adipozyten in reife Adipozyten steuern.
Verwendung einer Zelllinie nach den Ansprüchen 1 bis 2 zum Durchmustern von Verbindungen, die die Expression von Zielen gegenüber Fettleibigkeit, Kreislauferkrankungen und Diabetes steuern können.
Verwendung einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zum Durchmustern von Verbindungen, die die Sekretion von beliebigen Metaboliten oder Hormonen von menschlichen Adipozyten regulieren können.