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DE60129877T2 - Aminosaüre-herstellende Escherichia Stämme und Verfahren zur Herstellung einer Aminosaüre - Google Patents

Aminosaüre-herstellende Escherichia Stämme und Verfahren zur Herstellung einer Aminosaüre Download PDF

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DE60129877T2
DE60129877T2 DE60129877T DE60129877T DE60129877T2 DE 60129877 T2 DE60129877 T2 DE 60129877T2 DE 60129877 T DE60129877 T DE 60129877T DE 60129877 T DE60129877 T DE 60129877T DE 60129877 T2 DE60129877 T2 DE 60129877T2
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Vitaliy Arkadyevich Livshits
Vera Georgievna Doroshenko
Sergei Vladimirovich Mashko
Valery Zavenovich Akhverdian
Yuri Ivanovich Kozlov
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Ajinomoto Co Inc
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie und genauer gesagt ein Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung eines Aminosäure produzierenden Bakteriums der Gattung Escherichia, welches Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten kann.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Saccharose und Saccharose enthaltende Substrate (beispielsweise Melasse) werden oft als Ausgangspunkt für die mikrobielle Produktion von kommerziellen Produkten, wie Aminosäuren, Vitaminen und organischen Säuren, eingesetzt. Die Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren aus Kohlenhydraten dienen der Maximierung der Effizienz, mit der das Kohlenstoffskelett von Kohlenhydraten in ein gewünschtes Produkt umgewandelt wird.
  • Die Mehrheit der Saccharose-positiven Bakterien bewerkstelligen die Aufnahme und die Phosphorilierung von Saccharose durch ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Saccharose-6-Phosphotransferasesystem (Saccharose-PTS), wobei intracelluläres Saccharose-6-phosphat erhalten wird. Dieses Phosphat wird durch Saccharose-6-phosphathydrolase (Invertase oder Sucrase) in D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose hydrolysiert, welche ihrerseits durch eine ATP-D-Fructose-6-phosphatphosphotransferase (Fructokinase) phosphoriliert wird. Solche Systeme und metabolischen Wege sind auf molekularer Ebene für die Grammpositiven Bakterien Bacillus subtilis und Streptococcus mutans (Debarbouille et al., 1991, Res. Microbiol., 142: 757-764; Sato et al., 1989, J. Bacteriol., 171: 263-271) und für Gramm-negative Bakterien beschrieben worden. Ein weiteres, Plasmid kodiertes pUR400-System für Enterobacterien ist berichtet worden (Aulkemeyer et al., (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988. Mol. Microbiol., 2: 1-8; Schmid et al., 1991. Mol. Microbiol., 5: 941-950).
  • Obwohl etwa 50 der Wildtypisolate von Escherichia coli Saccharose-positiv sind, können die Laborstämme von E. coli, wie E. coli K12, E. coli B, E. coli C, die derzeit zum Züchten der industriell wichtigen Produktionsstämme verwendet werden, Saccharose nicht verwerten. Diese Eigenschaft kann jedoch auf einfache Weise durch Einverleiben von Saccharoseverwertungsgenen aus Saccharose-positiven Stämmen von E. coli oder Salmonella unter Einsatz der Konjugation, Transduction oder Klonierungsverfahren auf diese Stämme übertragen werden (Wohlhieter et al., 1975, J. Bacteriol., 122:401-406; Parsell and Smith, 1975, J. Gen. Microbiol., 87: 129-137; Alaeddinoglu and Charles, 1979, J. Gen. Microbiol., 110:47-59; Livshits et al., 1982, In: Metabolic plasmids. P.132-134; Garsia, 1985, Mol. Gen. Genet., 201:575-577; US Patent Nr. 5,175,107 ).
  • Phosphoenolpyruvat (PEP) ist einer der wesentlichen Bausteine in mehreren biosynthetischen Wegen. PEP wird mit Kohlendioxid unter Bildung von Oxalessigsäure kombiniert. Oxalessigsäure dient als Kohlenstoffskelett für Asparaginsäure, Asparagin, Threonin, Isoleucin, Methionin und Lysin. Daneben wird eine äquimolare Menge PEP mit Erythrose-4-phosphat unter Bildung von 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP), dem ersten Intermediat des gemeinsamen Abschnittes des aromatischen Biosyntheseweges, kondensiert. Aus dieser metabolischen Route können solche kommerziell wichtigen Aminosäuren wie Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin erhalten werden. Die Ausbeute dieser Metaboliten kann durch die Verfügbarkeit von PEP limitiert werden.
  • Während der Glycolyse werden vier Mol PEP aus zwei Mol Glucose produziert, und die Hälfte des PEP wird obligatorisch verbraucht, um Energie für die Glucoseaufnahme bereitzu stellen. Im Fall der Saccharoseaufnahme produzieren zwei Mol Hexose (Glucose und Fructose), die sich aus einem Mol Saccharose ergeben, auch vier Mol PEP, es wird jedoch nur ein Mol für den Saccharosetransport verbraucht, so dass die Menge des verfügbaren PEP als Quelle für Kohlenstoffskelette für die Biosynthese 1,5-fach erhöht wird. Deshalb ist es möglich, die Aminosäureausbeute durch Bereitstellen des Aminosäure produzierenden Stammes von E. coli mit der Fähigkeit zur Verwertung von Saccharose und durch Einsatz von Saccharose oder Saccharose enthaltenden Substraten als Kohlenstoffquelle zu verbessern.
  • Im Stand der Technik ist der Threonin produzierende Stamm VKPM B-3996 auf der Grundlage von E. coli K-12, der Saccharose verwerten kann ( US Patent Nr. 5,705,371 ), bekannt. Die Restriktion und die Sequenzanalyse der klonierten Saccharosegene aus dem Stamm VKPM B-3996 zeigte, dass sie fast identisch sind zu denjenigen von pUR400 (Zugangsnummer: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416), welches PTS-Sucrose für den Transport und den Metabolismus kodiert (Lengeler et al., 1982, J. Bacteriol., 151:468-471; Schmid et al., 1988, Mol. Microbiol., 2:1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:941-950).
  • Ein chromosomal kodierter, nicht-PTS-Metabolismusweg für die Verwertung von Saccharose wurde auch in Escherichia coli gefunden (Bockmann et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 235:22-32). Der Syntheseweg umfasst ein Protonsymport-Transportsystem (Permease vom LacY-Typ), eine Invertase, eine Fructokinase und einen Saccharose spezifischen Repressor. Durch Verwendung dieses nicht-PTS-Metabolismusweges konnte der Ausstoß einer Aminosäure, die sich von einem PEP-Vorläufer ableitet, weiter erhöht werden, weil der Saccharosetransport in die Zellen nicht an PEP gekoppelt ist. Dieser Ansatz wurde jedoch für die Verbesserung von Aminosäure produzierenden Stämmen bislang niemals versucht.
  • Tsunekawa, H. et al.: "Acquisition of a sucrose utilization system in Escherichia-coli K-12 derivatives and its applications to industry", Applied an Environmental Microbiology, vol. 58, Nr. 6, 1992, Seiten 2081-2088, ISSN: 0099-2240 offenbart die Konstruktion von phänotypisch stabilen SRC+-Derivaten von Escherichia coli K12, der Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle nicht verwerten kann.
  • Debabov, V.: "Construction of strains producing L-threonine", Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Seiten 254 bis 258 offenbart ein Bakterium der Gattung Escherichia, das aus einem Saccharose nicht assimilierenden Stamm konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene enthält und die Fähigkeit zur Produktion und Anhäufung von Homoserin in einem Kulturmedium hat, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird, das Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle enthält.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen von Escherichia coli bereit zu stellen, welche die für den metabolischen Syntheseweg für die Verwertung von Saccharose kodierenden Gene enthalten, insbesondere für den nicht-PTS-Metabolismusweg für die Verwertung von Saccharose.
  • Die Erfinder haben gefunden, dass ein Bakterium der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure die Aminosäure durch Einführen von Saccharosegenen in das Bakterium effizient produziert. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit:
    • (1) Ein Verfahren zur Produktion von Lysin, welches die Stufe umfasst, bei der ein Bakterium der Gattung Escherichia in einem Kulturmedium, welches Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, kultiviert wird, wobei das Bakterium aus einem Saccharose nicht-assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene aus Escherichia coli VKPM B-7915 enthält und die Fähigkeit hat, Lysin in einem Kulturmedium, das Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu produzieren und anzuhäufen.
    • (2) Verfahren nach Punkt (1), wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäure in der L-Konfiguration, wenn nichts anderes angegeben ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben.
  • Das Bakterium der Gattung Escherichia, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist ein Bakterium, das aus einem Saccharose nicht assimilierenden Stamm von Escherichia coli als Ausgangsstamm konstruiert wird, wobei dieser Stamm Saccharosegene enthält, insbesondere Saccharose-nicht-PTS-Gene, und die Fähigkeit zur Produktion einer Aminsäure hat.
  • Ein Saccharose nicht assimilierender Stamm von Escherichia coli ist nicht besonders eingeschränkt, solange er die Fähigkeit hat, eine Aminosäure zu produzieren, oder diese Fähigkeit übertragen kann. Die Beispiele solcher Stämme umfassen E. coli K-12, E. coli B und E. coli C, und deren Derivatstämme, genauer gesagt die nachstehend erwähnten Aminosäure produzierenden Stämme.
  • Das in der vorliegende Erfindung eingesetzte Bakterium kann durch Einführen von Saccharose-PTS-Genen in einen Aminosäure produzierenden Stamm, wie die vorstehend beschriebenen Stämme, erhalten werden. Alternativ dazu kann das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Bakterium durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auf ein Bakterium der Gattung Escherichia, worin Saccharose-PTS-Gene eingeführt sind, erhalten werden.
  • Eine Aminosäure kann auch effizient durch Einführen von Saccharose-PTS in ein Bakterium der Gattung Escherichia hergestellt werden. Beispiele für Saccharose-PTS-Gene sind die SCR-Gene, die in dem pUR400-System enthalten sind und von Enterobacterien abgeleitet sind (Aulkemeyer et al. (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988, Mol. Microbiol., 2:1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:941-950). Alternativ dazu können die Saccharose-PTS-Gene aus dem Transposon Tn2555 präpariert werden (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22:645-658).
  • Die Saccharose-PTS-Genen können in ein Bakterium der Gattung Escherichia beispielsweise durch Einführen eines rekombinanten Plasmids, welches die gewünschten Gene enthält, in das Bakterium einverleibt werden. Genauer gesagt können die gewünschten Gene in ein Bakterium der Gattung Escherichia durch Einführen eines Plasmids, eines Phagen oder eines Transposons (Berg, D. E. and Berg, C.M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)), welches die gewünschten Gene trägt, in eine Zelle des Bakteriums einverleibt werden.
  • Der Vektor ist beispielsweise ein Plasmidvektor, wie pBR322, pMW118, pUC19 oder dergleichen, oder ein Phagenvektor, einschließlich Phage P1vir, mini-Mud, wie pMu4041 oder dergleichen. Das Transposon ist beispielsweise Mu, Tn10, Tn5 oder dergleichen.
  • Die Einführung einer DNA in ein Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise durch das Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) oder durch ein Verfahren, bei dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um ihre Permeabilität für DNA zu erhöhen (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) und dergleichen durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die Einführung einer DNA auch durch Transduktion unter Verwendung eines Phagenvektors durchgeführt werden.
  • Die Saccharose-PTS-Gene werden in ein Aminosäure produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia mit dem Ergebnis eingeführt, das die Aminosäure aus Saccharose produziert wird. Als Bakterium der Gattung Escherichia, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt werden, können Stämme eingesetzt werden, welche die gewünschte Aminosäure produzieren können. Daneben kann die Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auf ein Bakterium übertragen werden, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt werden. Beispiele der Aminosäure produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia coli werden nachstehend beschrieben.
  • Lysin produzierende Bakterien
  • Als Lysin produzierende Bakterien sind E. coli VL612 bevorzugt (Beispiel 5). Zudem können Lysin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia beispielhaft genannt werden, genauer gesagt ein mutierter Stamm mit Resistenz gegenüber Lysinanaloga. Das Lysinanalogon inhibiert die Proliferation von Bakterien der Gattung Escherichia, die Supression ist jedoch vollständig oder teilweise aufgehoben, wenn Lysin in einem Medium koexistiert. Als Beispiele seien Oxalysin, Lysinhydroxamat, (S)-2-Aminoethyl-L-cystein (AEC), Gamma-Methyllysin, Chlorcaprolactam und dergleichen genannt. Mutierte Stämme mit Resistenz gegenüber diesen Lysinanaloga werden erhalten, indem ein üblicher künstlicher Mutationsvorgang auf Bakterien der Gattung Escherichia angewandt wird. Der für die Lysinproduktion einzusetzende Bakterienstamm ist beispielsweise Escherichia coli AJ11442 (hinterlegt als FERM BP-1543 und NRRL 8-12185; vgl. die offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 56-18596 oder das US Patent Nr. 4,346,170 ) und Escherichia coli VL611. Escherichia coli AJ11442 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Postleitzahl: 305, 13, Higashi 1 chome, Tsukubashi, Ibarakiken, Japan) am 5. Mai 1981 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-5084 hinterlegt und nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens aus der ursprünglichen Hinterlegung am 29. Oktober 1987 in eine internationale Hinterlegung unter der Nummer FERM BP-1543 überführt. In der Aspartokinase der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen ist die Rückkopplungshemmung durch Lysin aufgehoben.
  • Daneben können beispielsweise Threonin produzierende Bakterien genannt werden, weil die Inhibition ihrer Aspartokinase durch Lysin im Allgemeinen in Threonin produzierenden Bakterien ebenfalls aufgehoben ist. Als Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia coli kann MG442 beispielhaft genannt werden (Gusyatiner, et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947-956 (1978).
  • Ein oder mehrere Gene, welche ein oder mehrere Enzyme im Lysinbiosyntheseweg kodieren, können in dem vorstehend genannten Bakterium verstärkt sein. Ein Beispiel eines solchen Gens ist das Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert und so mutiert ist, dass die Rückkopplungshemmung durch Asparaginsäuren aufgehoben ist (vgl. die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-83714 ).
  • Eine Aminosäure kann effizient aus Saccharose hergestellt werden durch Kultivieren des vorstehend beschriebenen Bakteriums, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt sind und welches eine Aminosäure produzieren kann, in einem Saccharose enthaltenden Kulturmedium, wobei die Aminosäure in dem Medium produziert und angehäuft wird, und durch Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium. Die Aminosäure ist Lysin.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Aminosäuren kann die Kultivierung des Bakteriums der Gattung Escherichia, die Gewinnung und die Reinigung der Aminosäure aus dem flüssigen Medium auf ähnliche Weise wie bei herkömmlichen Fermentationsverfahren durchgeführt werden, wobei die Aminosäure unter Verwendung eines Bakteriums produziert wird. Ein in der Kultur eingesetztes Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und Mineralien sowie bei Bedarf eine mäßige Menge an Nährstoffen umfasst, welche das eingesetzte Bakterium zum Wachsen benötigt. Als Hauptkohlenstoffquelle wird Saccharose eingesetzt. Eine kleine Menge an Kohlenstoffquellen außer Saccharose kann in dem Medium als Hilfskohlenstoffquelle enthalten sein. Als Stickstoffquelle werden verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle, Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentierte Mikroorganismen eingesetzt. Als Mineralien werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-Sulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat eingesetzt.
  • Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, beispielsweise als Schüttelkultur, unter Belüften und Rühren bei einer Temperatur von 20-40 °C, vorzugsweise zwischen 30 und 38 °C, durchgeführt. Der pH-Wert der Kultur ist üblicherweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine 1- bis 3-tägige Kultivierung zu einer Anhäufung der gewünschten Aminosäure in dem flüssigen Medium.
  • Nach der Kultivierung werden Feststoffe, wie Zellen, aus dem flüssigen Medium durch Zentrifugation und Membranfiltration entfernt, und dann kann die gewünschte Aminosäure durch Innenaustausch, Konzentration und Kristallfraktionierung gewonnen und gereinigt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Konstruktion der Plasmide pM1 und pM2, die von mini-Mud 4041 abgeleitet sind.
  • 2 zeigt das Schema der Klonierung der scr-Gene in pM1.
  • 3 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMT1 und pMT2.
  • 4 zeigt die Konformation des Plasmids pMH10, welches ein KmR-Gen, Gene A und B des Mu-Phagen, welche für die Mu-Transposase kodieren, das ner-Gen, das für einen negativen Regulator kodiert, und das cts62-Gen enthält, das für den Mu-Repressor kodiert.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele eingehender erklärt.
  • Beispiel 1: Präparation des Donors von Saccharose-PTS-Genen
  • Der Stamm VD1 wurde als Donor der PTS-Gene für die Verwertung von Saccharose (scr) eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt erhalten. Das Transposon Tn2555 trägt die scr-Gene (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22:645-658). Die Restriktionsanalyse und die Teilsequenzierung zeigten, dass die scr-Gene von Tn2555 zu denjenigen aus pUR400 (Zugangsnummer: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416), welche den Saccharosetransport und den Saccharosemetabolismus über das PTS-System kontrollieren, identisch sind.
  • Die scr-Gene von Tn2555 wurden in pM1, einem mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat, erhalten durch die Deletion der Mu-Phagen-Gene, welche für die Transposase und den Repressor kodieren, kloniert (M. Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, Seiten 309-316). Dies wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde das SspI-Fragment von pBRS5.2 (pBR325::Tn2555) (Doroshenko et al., 1988, Molek. Biol. 22: 645-658), welches scrYABR-Gene und nur einen Teil des scrK-Gens enthält, in das mit PvuII geschnittene Plasmid pM1 unter Ersetzen des kan-Gens eingeführt.
  • Das vorstehend beschriebene Plasmid pM1 wurde wie folgt erhalten (1). Das Plasmid pMu4041 wurde mit HindIII verdaut und unter Ausschneiden des Gens A und des Gens B, die für die Transposase des Phagen Mu kodieren, und des Nährgens, das für einen negativen Regulator kodiert, erneut in die Ringform überführt, wobei das Plasmid pMD4041 erhalten wurde. Dann wurde pMD4041 mit AvaIII und HindIII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft, und danach wurde erneut ein Ringschluss durchgeführt, um den cts62-Phage-Mu-Rrepressor zu entfernen.
  • In der zweiten Stufe wurde das BamHI-Fragment des erhaltenen Plasmids gegen das BamHI-Fragment von pBRS5.2 ausgetauscht, wobei das scrK-Gen wiederhergestellt wurde. Somit wurde der gesamte Saccharose-Cluster von Tn2555 in das Plasmid kodiert, das auch einen ampR-Marker und Enden von Phage Mu enthielt. Dieses Plasmid, das pMS1 genannt wurde, enthält ein transponierbares DNA-Fragment mini-Mu-scrKYABR (2).
  • Um mini-Mu-scrKYABR in das Bakteriumchromosom zu integrieren, wurde ein Standardverfahren eingesetzt. Das Plasmid pMS1 wurde in die Zellen MG1655(pMH10) eingeführt. Die Mu-Transposase, kodiert durch pMH10 (pACYC177-Derivat, welches ein KmR-Gen, A- und B-Gene des Mu-Phagen, die für Mu-Transposase kodieren, das ctso2-Gen, das für einen Mu-Repressor kodiert, und das Repressor-Gen cI857 des Phagen lambda enthält), wurde durch 15 minütige Inkubation bei 42 °C unmittelbar nach der Transformation induziert. Es wurden Saccharose-positive (Scr+)-Klone auf M9 Agarplatten, enthaltend 0,2 % Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle bei 30 °C selektiert, ge waschen und in LB-Brühe (J. Miller. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor laboratory, New York, 1972), welche keine Antibiotika enthielt, während 48-72 Stunden inkubiert. Dann wurden die geeigneten Verdünnungen der Kulturbrühe auf M9 Agarplatten, enthaltend 0,2 % Saccharose, plattiert. Es wurden mehrere zehn AmpS-, KmS-Klone abgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass sie kein Plasmid enthielten. Unter diesen wurde der Stamm VD1 (MG1655::mini-MuscrKYABR) selektiert, der ein prototropher, schnellwachsender Saccharose-positiver Stamm ist.
  • Daneben wurde der Stamm VL478, der das Plasmid pVG478 enthält, welches Saccharose-Gene in dem Transposon Tn2555 trägt (Molecular Genetics, Microbiology and Virology, Nr.6, 23-28 (1987)) auch als Donor von scr-Genen eingesetzt. Der Stamm VL478 wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7915 hinterlegt.
  • Die vorstehend genannten Stämme wurden als Donoren von scr-Genen in den folgenden Beispielen eingesetzt.
  • Beispiel 2: Präparation des Threonin produzierenden Stammes von E. coli, welcher Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion unter Verwendung des Stammes (1) (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als Empfängerstamm, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli VL643 wie folgt neu konstruiert.
  • Der bekannte Stamm E. coli MG442 (Guayatiner et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947-956 (1978), VKPM B-1628) wurde mit der rhtA23-Mutation aus dem Stamm 472T23/pYN7 (VKPM B-2307) transduziert, wobei der Stamm VL64 erhalten wurde. Die Mutation rhtA23 überträgt eine Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von Threonin (>40 mg/ml) oder Homoserin (>5 mg/ml) und verbessert die Threoninproduktion (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457).
  • Der so erhaltene Threonin produzierende Stamm VL643 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL644 erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Kulturbrühe kultiviert, und 0,3 ml jeder der erhaltenen Kulturen wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g/l):
    Saccharose (oder Glucose) 50,0
    (NH4)2SO4 10,0
    K2HPO4 1,0
    NaCl 1,0
    MgSO4·7H2O 0,8
    FeSO4·7H2O 0,02
    MnSO4·5H2O 0,02
    Thiaminhydrochlorid 0,002
    CaCO3 20
    • (MgSO4·7H2O und CaCO3 wurden jeweils getrennt sterilisiert).
  • Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Threonin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%) OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%)
    VL643 10,1 7,0 14,0 – – –
    VL644 9,9 7,2 14,4 10,5 9,7 19,4
  • Tabelle 1 zeigt, dass die beiden Stämme VL643 und VL644 in einem Medium mit Glucose gleichermaßen wuchsen und etwa die selbe Menge Threonin anhäuften. Daneben wuchs der Stamm VL644 in einem Medium mit Saccharose gut und häufte unter dieser Bedingung mehr Threonin mit höherer Ausbeute an.
  • Beispiel 3: Präparation des Threonin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion unter Verwendung des Stammes (2) (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als Empfängerstamm, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli VL2055 konstruiert.
  • E. coli VL2055 wurde von dem bekannten E. coli Stamm VKPM B-3996 abgeleitet ( US Patent Nr. 5,705,371 ). Der Stamm B-3996, dessen Wirtsstamm E. coli TDH-6 ist, ist bezüglich des thrC-Gens defizient und assimiliert Saccharose, wobei das ilvA-Gen eine Leckmutation hat. Der Stamm B-3996 enthält das Plasmid pVIC40, das durch Einführen des thrA*BC Operons, einschließlich des thrA*-Gens, das für AKI-HDI kodiert, welche im Wesentlichen von der Inhibition durch Threonin befreit war, in einen von RSF1010 abgeleiteten Vektor erhalten worden war.
  • Aus dem Stamm B-3996 wurde VL2055 in den folgenden zwei Stufen konstruiert.
  • Am Anfang wurde das plasmidfreie Derivat des Stammes VKPM B-3996, nämlich TDH-6, nach spontaner Eliminierung des Plasmids pVIC40 selektiert. Dann wurde durch ein bekanntes Verfahren (NTG-Mutagenese) eine Mutation erhalten, durch die das Kan-Gen des Transposons Tn5, welches in das tdh-Gen von TDH-6 eingeführt war, inaktiviert wurde. Dann wurde das Saccharose nicht verbrauchende Derivat des erhaltenen Stammes nach der Eliminierung der genetischen Determinanten der Saccharoseassimilation selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL2053 erhalten.
  • Andererseits wurde das Plasmid pPRT614 ( EP 0 593 792 ), das in E. coli VKPM B-5318 enthalten ist, mit HindIII und BamHI verdaut, wobei das Fragment ausgeschnitten wurde, welches das Threoninoperon unter den Promotor PR des Phagen lambda enthielt. Das Threoninoperon enthält eine Mutation in dem thrA-Gen (thrA*) welche die Unempfindlichkeit von Aspartokinasehomoserindehydrogenase I gegenüber der Rückkopplungshemmung durch Threonin verleiht. Das erhaltene Fragment wurde in pM1, einem mini-Mud-Vektor-pMU4041-Derivat, kloniert (M. Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, Seiten 309-316), wobei das Plasmid pMT2 erhalten wurde (3).
  • Zudem wurde das cat-Gen von Tn9 aus pACYC184, welches Resistenz gegenüber Chloramphenicol verleiht, in pMT2 kloniert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMT1 erhalten, welches ein transponierbares Konstrukt von PR-thrA*BC und die von Mu-Enden flankierten cat-Gene (mini-Mu-thrA*BC-cat) enthielt (3).
  • Das Plasmid wurde in die Zellen von E. coli 0600 (pMH10) eingeführt. Die Mu-Transposase, die von pMH10 kodiert wird (pACYC177-Derivat, welches ein KmR-Gen, die Gene A und B des Phagen Mu, die für Mu-Transposase kodieren, das für einen negativen Regulator kodierende ner-Gen und das für einen Mu-Repressor kodierende cts62-Gen enthält, vgl. 4), wurde durch 15 minütige Inkubation bei 42 °C unmittelbar nach der Transformation induziert.
  • Chloramphenicol resistente (CmR) Klone wurden auf LB Agarplatten, die 15 mg/l Chloramphenicol enthielten, bei 30 00 selektiert. Mehrere zehn KmS-Klone wurden aufgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass die meisten dieser Klone kein Plasmid enthielten. Dann wurden die PR-thrA*BC-cat-Gene aus dem Chromosom eines der selektierten Stämme C600 Thr+, CmR unter Verwendung von P1vir in den Stamm VL2053, erhalten in der ersten Stufe, transduziert, wobei der neue plasmidfreie Threonin produzierende Stamm VL2055 erhalten wurde.
  • Der Threonin produzierende Stamm VL2055 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 50 mg/l Isoleucin und 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme VL2055 Scr bzw. VL2055 Csc erhalten. Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 ° C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung in ein 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g(l):
    Saccharose (oder Glucose) 80
    Isoleucin 0,1
    (NH4)2SO4 22
    K2HPO4 2
    NaCl 0,8
    MgSO4·7H2O 0,8
    FeSO4·7H2O 0,02
    MnSO4·5H2O 0,02
    Thiaminhydrochlorid 0,2
    Hefeextrakt 1,0
    CaCO3 30
    • (MgSO4·7H2O und CaCO3 wurden jeweils getrennt sterilisiert).
  • Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Threonin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%) OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%)
    VL2055 12,0 18,9 23,6 – – –
    VL2055 scr 11,7 19,5 24,4 11,4 23,3 29,1
    VL2055 csc 11,6 19,2 24,0 11,6 27,9 34,9
  • Tabelle 2 zeigt, dass beide Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich VL2055 scr und VL2055 csc, dieselben Wachstumseigenschaften aufwiesen und etwa dieselbe Menge Threonin wie ihr Ausgangsstamm VL2055 anhäuften, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Diese Stämme häuften jedoch mehr Threonin bei höherer Ausbeute an, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Daneben war der Stamm VL2055 csc (mit Saccharose-nicht-PTS-Genen) unter dieser Bedingungen produktiver als der Stamm VL2055 scr (mit Saccharose-PTS-Genen).
  • Beispiel 4 Präparation des Homoserin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Homoserinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als ein Empfängerstamm, der Homoserin produziert, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli NZ10 rhtA23/pAL4 durch Ableitung von dem Stamm NZ10 konstruiert. Der Stamm NZ10 (thrB) ist eine leuB+-Revertante, die von dem E. coli-Stamm C600 (thrB, leuB) erhalten wurde (Appleyard R. K., Genetics, 39, 440-452 (1954)). Dann wurde die rhtA23-Mutation wie in Beispiel 2 beschrieben eingeführt, wobei der Stamm NZ10 rhtA23 erhalten wurde. Dieser Stamm wurde mit dem Plasmid pAL4 transformiert, welches ein pBR322-Vektor ist, in den das thrA-Gen, das für Aspartokinasehomoserindehydrogenase I kodiert, eingeführt war.
  • Der Homoserin produzierende Stamm NZ10 rhtA23/pAL4 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VD1 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurde auf M9 Minimalmedium, enthalten 0,2 Saccharose und 50 mg/l Threonin, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme NZ10 rhtA23 scr/pAL4 erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 ml Teströhrchen eingeimpft und 48 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert.
  • Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3, außer dass 0,2 g/l Threonin anstelle von Isoleucin zugegeben wurde.
  • Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Homoserin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Homoserin (g/l) Ausbeute (%) OD560 Homoserin (g/l) Ausbeute (%)
    NZ10rhtA23/ pAL4 19,3 7,8 9,7 – – –
    NZ10rhtA23 Scr/pAL4 20,0 8,0 10,0 21,4 12,2 15,2
  • Tabelle 3 zeigt, dass der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 und dessen Ausgangsstamm NZ10 rhtA23/pAL4 etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Homoserin anhäuften, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 häufte jedoch mehr Homoserin mit höherer Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.
  • Beispiel 5 Präparation des Isoleucin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Isoleucinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als Isoleucin produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia wurde E. coli K-12 Stamm 44-3-15 eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt konstruiert. Der Wildtypstamm E. coli K12 VKPM B-7 wurde als Ausgangsstamm eingesetzt. Nach den aufeinander folgenden Vorgängen der NTG-Mutagenese und der Selektion auf Resistenz gegenüber Valin, 4-Aza-DL-leucin und 3-Hydroxy-DL-leucin wurde der Stamm 44 erhalten, der mindestens zwei Mutationen im ilvGMEDA-Operon enthält. Eine Mutation in dem i1vG-Gen (ilvG*), der die Acetohydroxysäuresynthase-II-Aktivität wiederherstellt, und eine Mutation in dem ilvA-Gen (ilvA*), die die Threonindeaminase-Unempfindlichkeit gegenüber der Rückkopplungshemmung durch Isoleucin überträgt. Dieser Stamm kann eine gewisse Menge Isoleucin produzieren.
  • Andererseits wurde das Plasmid pVR72, ein Derivat des Plasmids pVR4 (Gavrilova et al., 1988, Biotechnologiya (auf Russisch), 4: 600-608), das die ilvG5MEDA7434YC-Gene enthielt, durch die Einführung der BamHI-Linker in die Schnittstellen von DraIII und XmaIII konstruiert. Dann wurde das BamHI-Fragment von pVR72, welches ilvG5MEDA7434YC-Gene mit deletiertem Promotor und Attenuator enthielt, in pM2 kloniert, einem Mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat, welches den PR- Promotor des Phagen lambda enthält. Das erhaltene Plasmid wurde für die Einführung des Mini-Mu-PR-ilvG*MEDPA*YC-Konstrukts in das Plasmid des Stammes 44 (pMH10) wie vorstehend beschrieben eingesetzt. Nach der Induktion der Mu-Transposase wurden die Klone auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Isoleucin getestet. Unter ihnen wurde der produktivste Stamm 44-3 selektiert. Schließlich wurde das Mini-Mu-PR-thrA*BC-cat-Konstrukt wie vorstehend beschrieben aus C600 THr+, CmR in den Stamm 44-3 transduziert. Auf diese Weise wurde der Stamm 44-3-15 erhalten.
  • Der Isoleucin produzierende Stamm 44-3-15 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanden wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme 44-3-15 scr und 44-3-15 Csc erhalten.
  • Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3, außer dass Isoleucin nicht zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden die zugegebene Menge Isoleucin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Isoleucin (g/l) Ausbeute (%) OD560 Isoleucin (g/l) Ausbeute (%)
    44-3-15 16,1 10,4 13,0 – – –
    44-3-15 Scr 16,4 10,8 13,5 16,1 13,1 16,4
    44-3-15 Csc 15,3 10,5 13,1 16,0 13,6 17,0
  • Tabelle 4 zeigt, dass die beiden Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich 44-3-15 Scr und 44-3-15 Csc, dieselben Wachstumseigenschaften hatten und etwa dieselbe Menge Isoleucin wie ihr Ausgangsstamm 44-3-15 anhäuften, wenn er in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurde. Diese Stämme akkumulierten jedoch mehr Isoleucin mit höherer Ausbeute, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Daneben war der Stamm 44-3-15 Csc (mit dem Saccharose-nicht-PTS-Genen) unter dieser Bedingung etwas produktiver als der Stamm 44-3-15 Scr (mit Saccharose-PTS-Genen).
  • Beispiel 6: Präparation der Lysin produzierenden Stämme von E. coli, die Saccharose verwerten können, und Lysinproduktion unter Verwendung dieser Stämme
  • Als Lysin produzierender Empfängerstamm wurde der E. coli Stamm VL612 eingesetzt. Dieser Stamm wurde von dem bekannten E. coli Stamm Gifl02 (Theze, J. and Saint Girons., J.
  • Bacteriol., 118, 990-998, 1974) in zwei Stufen erhalten. In der ersten Stufe wurden die Mutanten des Stammes, die gegenüber 2 mg/ml S-(2-Aminoethyl)-L-cystein resistent sind, selektiert, und unter diesen wurde der Stamm VL611 gefunden, der Lysin produzieren kann. In der zweiten Stufe wurde die Mutation rhtA23 in VL611 wie vorstehend beschrieben eingeführt, wobei der Stamm VL612 erhalten wurde.
  • Der Stamm VL612 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 50 mg/l Homoserin und 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL613 (VKPM B-3423) erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 ml Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 2, außer dass 0,2 g/l Homoserin zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Lysin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Leucin (g/l) Ausbeute (%) OD560 Leucin (g/l) Ausbeute (%)
    VL612 11,5 2,8 5,6 – – –
    VL613 11,2 2,7 5,4 11,4 4,2 8,4
  • Tabelle 5 zeigt, dass der Stamm VL612 und der Stamm VL613 in einem Glucose enthaltenden Medium etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Lysin anhäuften. Der Stamm VL613 häufte jedoch mehr Lysin in einer höheren Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.
  • Beispiel 7: Präparation des Valin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Valinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als Valin produzierender Stamm der Gattung Escherichia wurde der Stamm Escherichia coli VL1971 eingesetzt. Dieser Stamm ist ein Derivat des bekannten Stamms VL1970 (VKPM B-4411, US Patent Nr. 5,658,766 ), in den die Mutation rhtA23 wie in Beispiel 1 beschrieben eingeführt wurde.
  • Der E. coli Stamm VL1971 wurde mit dem Phagen P1vir infiziert, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet wurde, und auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2% Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, plattiert. Die nach 40 Stunden gewachsenen Transduktanten wurden aufgenommen, gereinigt, und unter ihnen wurde der Valin produzierende Stamm VL1972 (VKPM B-4413), der Saccharose verwerten kann, selektiert.
  • VL1971 und VL1972 wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3.
  • Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Valin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Valin(g/l) Ausbeute (%) OD560 Valin (g/l) Ausbeute (%)
    VL1971 12,4 8,0 10,0 – – –
    VL1972 12,6 8,2 10,2 14,4 11,2 14,0
  • Tabelle 6 zeigt, dass VL1971 und VL1972 gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Valin anhäuften, wenn sie in Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Der Stamm VL1972 häufte jedoch Valin in höherer Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.
  • Es sei angemerkt, dass PTS-Saccharose-Gene die höhere Produktivität auf Valinproduzenten übertragen, obwohl Phosphoenolpyruvat für die Valinsynthese nicht erforderlich ist.
  • Beispiel 8: Präparation des Tryptophan produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und die Tryptophanproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
  • Als Empfängerstamm des Bakteriums der Gattung Escherichia wurde der Stamm SV164(pGH5) ( WO94/08031 ) eingesetzt.
  • Der Tryptophan überproduzierende Stamm SV164 (pGH5) wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium selektiert, welches 50 mg/l Tyrosin, 50 mg/ml Phenylalanin, 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle und 15 mg/l Tetracyclin enthielt. Auf diese Weise wurden die Stämme SV164scr (pGH5) bzw. SV164csc (pGH5) erhalten.
  • Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 29 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 40 Stunden bei 29 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g/l):
    Glucose (oder Saccharose) 40
    Phenylalanin 0,1
    Tyrosin 0,1
    (NH4)2SO4 15
    K2HPO4 1,5
    NaCl 0,5
    MgSO4·7H2O 0,3
    CaCl2*2H2O 0,015
    FeSO4·7H2O 0,075
    Na3-Citrat 1
    Na2MoO4·2H2O 0,00015
    H3BO3 0,0025
    COCl2·6H2O 0,0007
    CuSO4·5H2O 0,00025
    MnCl2·4H2O 0,0016
    ZnSO4·7H2O 0,0003
    Thiamin HCl 0,005
    Pyrodixin 0,03
    Feststoffe der Maisquellflüssigkeit (Ajinomoto) 2
    CaCO3 30
    Tetracyclin 0,015
  • Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Tryptophan und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Aus Tabelle 7 geht hervor, dass beide Saccharose verwertenden Stämme, nämlich SV164scr (pGH5) und SV164csc (pGH5), nahezu dieselben Wachstumseigenschaften und etwa dieselbe angehäufte Menge Tryptophan wie ihr Ausgangsstamm SV164 (pGH5) hatten, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Diese Stämme häuften jedoch mehr Tryptophan mit höherer Ausbeute an, wenn sie in Saccharose enthaltendem Medium kultiviert wurden. Der Stamm SV164csc (pGH5) (mit Saccharose- nicht-PTS-Genen) war unter dieser Bedingung produktiver als der Stamm SV164scr (pGH5) (mit Saccharose PTS-Genen). Tabelle 7
    Stamm Glucose Saccharose
    OD560 Tryptophan (g/l) Ausbeute (%) OD560 Tryptophan (g/l) Ausbeute (%)
    SV164 (pGH5) 6,0 5,0 12,5 – – –
    SV164scr (pGH5) 6,2 5,1 12,7 6,2 5,5 13,7
    SV164csc (pGH5) 6,0 5,0 12,5 6,2 5,6 14,0

Claims (2)

  1. Verfahren zur Produktion von Lysin, welches die Stufe umfasst, bei der ein Bakterium der Gattung Escherichia in einem Kulturmedium, welches Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, kultiviert wird, wobei das Bakterium aus einem Saccharose nicht-assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene aus Escherichia coli VKPM 3-7915 enthält und die Fähigkeit hat, Lysin in einem Kulturmedium, das Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu produzieren und anzuhäufen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
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