DE60128701T2

DE60128701T2 - Claudin polypeptide

Info

Publication number: DE60128701T2
Application number: DE60128701T
Authority: DE
Inventors: Adel Seattle YOUAKIM; Robert F. Bellevue DUBOSE; Steven R. Seattle WILEY
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-08-15
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2021-08-16
Also published as: AU8497701A; WO2002014499A9; MXPA03001468A; US20080254506A1; ES2284678T3; EP1311663A2; AU2001284977B2; CA2418725A1; DE60128701D1; WO2002014499A2; JP2004519215A; EP1311663B1; WO2002014499A3; ATE363531T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft neuartige humane und murine Polypeptide der Claudinpolypeptid-Familie und Verfahren zum Herstellen und Verwenden dieser.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Claudinpolypeptide sind eine verwandte Gruppe von „Tetraspan"-Polypeptiden, Polypeptide mit vier Membran-umspannenden oder Transmembrandomänen, die mit zellulären Tight junctions assoziiert werden. Tight junctions, die auch „Zonula occludens" genannt werden, bilden eine regulierte, halbdurchlässige Barriere in den Interzellularräumen innerhalb von Schichten von Epithel- oder Endothelzellen. Eine unzureichende oder ungeeignet regulierte Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion trägt zu der Initiierung, Aufrechterhaltung und Verschlimmerung der Entzündung in Geweben wie dem Dann, den Lungen usw. bei. Tight junctions bilden außerdem einen „Zaun", der die apikalen und basolateralen Regionen der Membranen dieser Zellen trennt, was die Schaffung unterschiedlicher physiologischer Umgebungen auf den gegenüberliegenden Seiten einer Zellschicht ermöglicht, wie die unterschiedlichen physiologischen Umgebungen, die zum Transport von Materialien über das Darmepithel erforderlich sind. Es wurde auch eingebracht, dass Tight junctions wäßrige Poren enthalten, wobei der parazelluläre Transport zwischen den Zellen einer Epithel- oder Endothelschicht durch diese Poren erfolgt. Polypeptide der Claudin-Familie werden in Epithelzellen und/oder Endothelzellen während der gesamten Entwicklung exprimiert, wobei individuelle Mitglieder der Claudinpolypeptid-Familie in unterschiedlichen Geweben exprimiert werden. Die physiologischen Funktionen, die mit einem bestimmten Claudinpolypeptid assoziiert werden, hängen mit den Funktionen zusammen, die von dem bestimmten Gewebe bzw. den bestimmten Geweben ausgeführt werden, in denen es exprimiert wird.
Herkömmliche Strukturmerkmale der Claudin-Familie von Polypeptiden sind die vier Membran-umspannenden Domänen (Transmembrandomänen), die zwei extrazellulären Loops (Schleifen), die von den Transmembrandomänen gebildet werden, und die zytoplasmatische Schwanzdomäne. Man glaubt, dass die zytoplasmatische Schwanzdomäne an Interaktionen mit anderen, mit Tight junctions assoziierten Proteinen, wie der ZO-Familie (ZO = Zonula occludens) von Proteinen, beteiligt ist. Man glaubt, dass diese Interaktionsaktivitäten von Claudinpolypeptiden PDZ-Domänen enthaltende Polypeptide einschließen, wobei eine PDZ-Domäne an die C-terminalen Reste der zytoplasmatischen Schwanzdomäne eines Claudinpolypeptids bindet; die Assoziation von PDZ enthaltenden Polypeptiden kann dann in der Oligomerisierung von Claudinpolypeptiden resultieren. Die extrazellulären Loop-Domänen von Claudinpolypeptiden können zur Tight junction-Bildung beitragen, bei der es sich um einen wichtigen Aspekt sowohl der Barrierefunktion als auch der Ionentransportfunktion von Claudinpolypeptiden handelt, und/oder als ein Rezeptor für virale Proteine, Enterotoxine oder Allergene fungieren. Von der Tight junction-Bildungsaktivität der Claudinpolypeptid-Familie wird angenommen, dass sie durch homotypische Interaktionen mit den extrazellulären Loops desselben Claudinpolypeptids, das auf benachbarten Epithel- oder Endothelzellen exprimiert wird, oder heterotypische Interaktionen mit den extrazellulären Loops anderer Claudin-Familienmitgliedern oder anderen Polypeptiden, bei denen es sich nicht um Claudinpolypeptide handelt, erfolgen. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass die biologischen Effekte von Claudinpolypeptiden Claudinpolypeptide erfordern und insbesondere deren zum N-Terminus gelegenen extrazellulären Domäne zur Verarbeitung von Matrixmetalloproteinasen zu deren aktiver Form (Miyamori et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 2804-28211). Aufgrund ihrer Rollen bei der „tight junction"-Bildung, der Epithel- und Endothel-Barrierefunktion, dem Ionentransport und der Bindung an virales Protein, der Enterotoxin-Bindung oder Allergen-Bindung werden Claudinpolypeptide mit Erkrankungen assoziiert, die unregulierten oder ungeeignet regulierten Transport über das Epithel oder Endothel einschließen, wie Entzündung, Asthma, Allergie, Metastasen von Krebszellen und Ionentransporterkrankungen wie Magnesiumtransportdefekte in der Niere. Darüber hinaus, weil von einem Claudinpolypeptid, das in Nervenzellen exprimiert wird, gezeigt wurde, dass es zur Bildung der Myelinscheide in Oligodendrozyten erforderlich ist, werden Claudinpolypeptide mit Demyelinisationserkrankungen, wie multipler Sklerose (MS), autoimmuner Enzephalomyelitis, Optikusneuritis, progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie (PML) usw., assoziiert.
Charakteristika und Aktivitäten der Claudinpolypeptid-Familie sind in den folgenden Referenzen weiter beschrieben: K. Fujitaab et al., 2000, Clostridium perfringens enterotoxin binds to the second extracellular loop of claudin-3, a tight junction integral membrane Protein, FEBS Lett. 476: 258-261; T. Kinugasa et al., 2000, Claudin regulate the intestinal barrier in response to immune mediators, Gastroenterology 118: 1001-1011; S. Tsukita und M. Furuse, 2000, Pores in the wall: claudins constitute tight junction strands containing aqueous pores, J. Cell Biol. 149: 13-16; J.M. Bronstein et al., 2000, Involvement of OSP/claudin-11 in oligodendrocyte membrane interactions: role in biology and disease, J. Neurosci. Res. 59: 706-711; M. Itob et al., 1999, Direct binding of three tight junction-associated MAGUKs, ZO-1, ZO-2, and ZO-3, with the COOH termini of claudins, J. Cell Biol. 147: 1351-1363; M. Furuse et al., 1999, Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands, J. Cell Biol. 147: 891-903; K. Morita et al., 1999, Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells, J. Cell Biol. 147: 185-194; K. Kubota et al., 1999, Ca(2+)-independent cell-adhesion activity of claudins, a family of integral membrane Proteins localized at tight junctions, Curr. Biol. 9: 1035-1038; H. Wan et al., 1999, Der p 1 facilitates transepithelial allergen delivery by disruption of tight junctions, J. Clin. Invest. 104: 123-133; D.B. Simon et al., 1999, Paracellin-1, a renal tight junction Protein required for paracellular Mg²⁺ resorption, Science 285: 103-106; K. Morita et al., 1999, Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain Protein components of tight junction strands, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 511-516; M. Furuse et al., 1998, A single gene product, claudin-1 or -2, reconstitutes tight junction strands and recruits occludin in fibroblasts, J. Cell Biol. 143: 391-401; M. Furuse et al., 1998, Claudin-1 and -2: novel integral membrane Proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin, J. Cell Biol. 141: 1539-1550.
Um wirksamere Behandlungen von Erkrankungen zu entwickeln, die eine Störung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion oder einen unregulierten Transport über das Epithel oder Endothel einschließen, wie entzündliche Darmerkrankung, oder Demyclinisation einschließen, wie Multiple Sklerose, werden Informationen über zuvor nicht identifizierte Mitglieder der Claudinpolypeptid-Familie benötigt, so dass die Charakteristika und Aktivitäten solcher neuen Claudin-Familienmitglieder erforscht werden können. Insbesondere besteht Bedarf an der Charakterisierung zuvor nicht identifizierter humaner Claudinpolypeptide.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen Mitglieds der humanen Claudinpolypeptid-Familie, humanes Claudin-21.
Die Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4 und Aminosäuren 1 bis 13 der SEQ ID NO:4;
(b) SEQ ID NO:6;
(c) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1 bis 33 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 11 bis 30 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 12 bis 26 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 25 bis 220 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 34 bis 81 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 101 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 102 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 103 bis 116 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 117 bis 145 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 118 bis 137 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 146 bis 161 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 181 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 191 der SEQ ID NO:6 und Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6;
(d) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren und mit einer Claudinpolypeptid-Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung und PDZ-Domänenbindungsaktivität;
(e) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen aus (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der extrazellulären Loop-Domäne;
(f) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen aus (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der zytoplasmatischen Schwanzdomäne;
(g) Aminosäuresequenzen mit Claudinpolypeptid-Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung und PDZ-Domänenbindungsaktivität, und mindestens 30 Aminosäuren umfassend und welche Aminosäureidentität mit einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(f) teilen, wobei der Prozentsatz an Aminosäureidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mehr als 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% und mindestens 99,5%; und
(h) einer Aminosäuresequenz von (g), wobei ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von (g), an einen Antikörper bindet, der auch an ein Polypeptid, umfassend eine der Aminosäuresequenzen von (a)-(f), bindet.

Ebenfalls hierin beschrieben ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(j) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(k) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), mit Claudinpolypeptid-Aktivität;
(l) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der extrazellulären Loop-Domäne;
(m) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der zytoplasmatischen Schwanzdomäne;
(n) Aminosäuresequenzen, umfassend mindestens 20 Aminosäuren und welche Aminosäureidentität mit einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(h) teilen, wobei der Prozentsatz an Aminosäureidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% und mindestens 99,5%;
(o) einer Aminosäuresequenz von (i), wobei ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von (i), an einen Antikörper bindet, der auch an ein Polypeptid, umfassend eine der Aminosäuresequenzen von (a)-(h), bindet; und
(p) einer Aminosäuresequenz von (n) oder (o) mit Claudinpolypeptid-Aktivität.

Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes Polypeptid mit PDZ-Domänenbindungsaktivität und umfassend eine Aminosäuresequenz, die mehr als 90% Aminosäureidentität über ihre Länge mit Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6 teilt, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem eine isolierte Nukleinsäure bereit, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die (i) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) SEQ ID NO:4;
(b) SEQ ID NO:6;
(c) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 25 bis 220 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 117 bis 145 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 118 bis 137 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 146 bis 161 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 181 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 191 der SEQ ID NO:6 und Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6; und
(d) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1 bis 33 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 101 der SEQ ID NO:6 und Aminosäuren 82 bis 102 der SEQ ID NO:6;

(a) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:10 und Aminosäuren 19 bis 33 der SEQ ID NO:10;
(b) SEQ ID NO:8;
(c) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 5 bis 27 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 28 bis 76 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 77 bis 99 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 100 bis 118 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 119 bis 141 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 142 bis 160 der SEQ ID NO:8, Aminosäuren 161 bis 183 der SEQ ID NO:8 und Aminosäuren 184 bis 211 der SEQ ID NO:8;
(d) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(e) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(f) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c) mit Claudinpolypeptid-Aktivität;
(g) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der extrazellulären Loop-Domäne;
(h) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der zytoplasmatischen Schwanzdomäne;
(i) Aminosäuresequenzen, umfassend mindestens 20 Aminosäuren und welche Aminosäureidentität mit einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(h) teilen, wobei der Prozentsatz an Aminosäureidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% und mindestens 99,5%;
(j) einer Aminosäuresequenz von (i), wobei ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von (i), an einen Antikörper bindet, der auch an ein Polypeptid, umfassend eine der Aminosäuresequenzen von (a)-(h), bindet; und
(k) einer Aminosäuresequenz von (i) oder (j) mit Claudinpolypeptid-Aktivität.

Ebenfalls beschrieben ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) SEQ ID NO:11;
(b) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 11 bis 33 der SEQ ID NO:11, Aminosäuren 77 bis 99 der SEQ ID NO:11, Aminosäuren 119 bis 141 der SEQ ID NO:11 und Aminosäuren 167 bis 189 der SEQ ID NO:11;
(c) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 34 bis 76 der SEQ ID NO:11, Aminosäuren 100 bis 118 der SEQ ID NO:11, Aminosäuren 142 bis 166 der SEQ ID NO:11 und Aminosäuren 190 bis 229 der SEQ ID NO:11;
(d) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(e) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren;
(f) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c) mit Claudinpolypeptid-Aktivität;
(g) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der extrazellulären Loop-Domäne;
(h) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der zytoplasmatischen Schwanzdomäne;
(i) Aminosäuresequenzen, umfassend mindestens 20 Aminosäuren und welche Aminosäureidentität mit einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(h) teilen, wobei der Prozentsatz an Aminosäureidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% und mindestens 99,5%;
(j) einer Aminosäuresequenz von (i), wobei ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von (i), an einen Antikörper bindet, der auch an ein Polypeptid, umfassend eine der Aminosäuresequenzen von (a)-(h), bindet; und
(k) einer Aminosäuresequenz von (i) oder (j) mit Claudinpolypeptid-Aktivität.

Andere Gesichtspunkte der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuren, die Polypeptide der Erfindung kodieren, und isolierte Nukleinsäuren, vorzugsweise mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden, die unter Bedingungen moderater Stringenz an die Nukleinsäuren, die Polypeptide der Erfindung kodieren, hybridisieren. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kodierten solche Nukleinsäuren ein Polypeptid mit Claudinpolypeptid-Aktivität oder umfassen eine Nukleotidsequenz, die eine Nukleotidsequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen der Nukleinsäuren der Erfindung teilt, wobei der Prozentsatz an Nukleotidsequenzidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% und mindestens 99,5%.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind isolierte Polypeptide und Nukleinsäuren, die aus hierin offenbarten Aminosäurensequenzen bzw. Nukleotidsequenzen bestehen.
Von der Erfindung werden weiterhin Expressionsvektoren und rekombinante Wirtszellen, umfassend mindestens eine Nukleinsäure der Erfindung, und bevorzugte rekombinante Wirtszellen, wobei die Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert ist, bereitgestellt.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches durch die Nukleinsäuren der Erfindung kodiert wird, umfassend das Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression dieses Polypeptids fördern, wobei die rekombinante Wirtszelle mindestens eine Nukleinsäure der Erfindung umfasst. Ein bevorzugtes, von der Erfindung bereitgestelltes Verfahren umfasst weiterhin das Reinigen dieses Polypeptids. In einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird das Polypeptid, hergestellt nach dem Verfahren, bereitgestellt.
Weitere Gesichtspunkte der Erfindung sind isolierte Antikörper, welche an die Polypeptide der Erfindung binden, vorzugsweise monoklonale Antikörper, außerdem vorzugsweise humane oder humanisierte Antikörper, und vorzugsweise wobei der Antikörper die Aktivität der Polypeptide hemmt.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zum Entwerfen eines Inhibitors der Polypeptide der Erfindung bereit, wobei das Verfahren die Schritte des Ermitteln der dreidimensionalen Struktur eines beliebigen derartigen Polypeptids, Analysierens der dreidimensionalen Struktur für die wahrscheinlichen Bindungsstellen von Substraten, Synthetisieren eines Moleküls, das eine vorhergesagte reaktive Stelle einbindet, und Bestimmens der polypeptidhemmenden Aktivität des Moleküls umfasst.
In einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Claudinpolypeptid-Aktivität verändern, bereitgestellt, umfassend

(a) das Mischen einer Testverbindung mit einem Polypeptid der Erfindung und
(b) das Feststellen, ob die Testverbindung die Claudinpolypeptid-Aktivität dieses Polypeptids verändert.

In einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Bindungsaktivität von Claudinpolypeptiden hemmen, bereitgestellt, umfassend

(a) das Mischen einer Testverbindung mit einem Polypeptid der Erfindung und einem Bindungspartner dieses Polypeptids und
(b) das Feststellen, ob die Testverbindung die Bindungsaktivität dieses Polypeptids hemmt.

Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Erhöhen der Tight junction-Bildung oder zur Förderung der Aktivitäten der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion bereit, das das Bereitstellen eines Polypeptids der Erfindung umfasst; mit einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, die weiterhin das Erhöhen dieser Aktivitäten in einem Patienten durch Verabreichen mindestens eines Polypeptids der Erfindung umfasst.
Von der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Verminderung der Tight junction-Bildungsaktivität oder der Aktivität der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion bereit, das das Bereitstellen mindestens eines Antagonisten der Polypeptide der Erfindung umfasst; mit einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, die weiterhin das Verringern dieser Aktivitäten in einem Patienten durch Verabreichen mindestens eines Antagonisten der Polypeptide der Erfindung umfasst, und mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wobei der Antagonist ein Antikörper ist, der die Aktivität eines beliebigen der Polypeptide hemmt.
Die Erfindung stellt darüber hinaus die Verwendung des Polypeptids der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion bereit, die das Verabreichen des Polypeptids der Erfindung umfasst; mit einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus entzündlicher Darmerkrankung, Asthma, Allergie und Ionentransportdefekten.
Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Behandeln einer Demyelinisationserkrankung, das das Verabreichen des Polypeptids der Erfindung umfasst; mit einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die Demyelinisationserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Multipler Sklerose, autoimmuner Enzephalomyelitis, Optikusneuritis und progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie.
In anderen Gesichtspunkten betrifft die Erfindung die Verwendung eines Antagonisten des Polypeptids der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Viruserkrankung oder einer mit Enterotoxin zusammenhängenden Erkrankung, die das Verabreichen eines Antagonisten des Polypeptids der Erfindung umfasst; mit einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die Viruserkrankung oder die mit Enterotoxin zusammenhängende Erkrankung mit Clostridium perfringens-Enterotoxin in Kontakt gebracht wird, und mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wobei der Antagonist die Bindung von Clostridium perfringens-Enterotoxin an die extrazellulären Loops eines Claudinpolypeptids der Erfindung blockiert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Struktur von humanen Claudinpolypeptiden
Wir haben neue Mitglieder der Claudinpolypeptid-Familie identifiziert, humanes Claudin-21, humanes Claudin-19 und humanes Claudin-22. Zu typischen Strukturelementen, die den Mitgliedern der Claudinpolypeptid-Familie gemein sind, zählen eine nicht abgespaltene Signalpeptidsequenz, vier Membran-umspannende Domänen, zwei extrazelluläre Loops, die von den Membran-umspannenden Domänen gebildet werden, und ein zytoplasmatischer Schwanz am C-Terminus des Polypeptids. Sowohl der N-Terminus als auch der C-Terminus des Polypeptids sind intrazellulär. Die zwei extrazellulären Loop-Domänen von Claudinpolypeptiden befinden sich zwischen der ersten und der zweiten Transmembrandomäne bzw. zwischen der dritten und der vierten Transmembrandomäne des Polypeptids. Die kurze Region zwischen der zweiten und der dritten Transmembrandomäne des Polypeptids ist intrazellulär. Die zytoplasmatische Schwanzdomäne von Claudinpolypeptiden erstreckt sich von der vierten Transmembrandomäne zum C-Terminus des Polypeptids.
Die Aminosäuresequenzen von humanem Claudin-21 (SEQ ID NO:6), humanem Claudin-19 (SEQ ID NO:8) und humanem Claudin-22 (SEQ ID NO:11) enthalten die Strukturmerkmale von Claudinpolypeptiden. Humanes Claudin-21 enthält eine Signalsequenzdomäne (Aminosäuren 12 bis 26 der SEQ ID NO:6), die die Spaltung der Aminosäuresequenz der vollständigen SEQ ID NO:6 zwischen den Aminosäuren 24 und 25 der SEQ ID NO:6 steuern würde, um ein reifes oder verarbeitetes Claudin-21-Polypeptid mit der Aminosäure 25 der SEQ ID NO:6 als der N-terminalen Aminosäure zu bilden. Von dieser Signalsequenzdomäne wird jedoch vorhergesagt, dass sie sich in der ersten Transmembrandomäne (TM-Domäne) befindet, die die Aminosäuren 11 bis 30 der SEQ ID NO:6 umfasst, was mit den anderen Claudin-Familienmitgliedern konsistent ist, in denen die Signalsequenz nicht abgespalten ist, sondern in die Zellmembran inseriert ist, wobei sich das äußerste N-terminale Ende des Claudinpolypeptids (in diesem Fall, Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:6) in der Zelle befindet. Von humanem Claudin-21 wird ebenfalls vorhergesagt, dass es eine zweite TM-Domäne, die die Aminosäuren 82 bis 101 der SEQ ID NO:6 umfasst, eine dritte TM-Domäne, die die Aminosäuren 118 bis 137 der SEQ ID NO:6 umfasst, und eine vierte TM-Domäne, die die Aminosäuren 162 bis 181 der SEQ ID NO:6 umfasst, aufweist. Eine Hidden-Markov-Modell-Analyse (HMM-Analyse) sagt dasselbe nicht abgespaltene Signal und ähnliche Transmembrandomänen vorher: Aminosäuren 12 bis 31 der SEQ ID NO:6; Aminosäuren 82 bis 105 der SEQ ID NO:6; Aminosäuren 118 bis 140 der SEQ ID NO:6 und Aminosäuren 166 bis 188 der SEQ ID NO:6. Diese vorhergesagten Positionen für die humanen Claudin-21-TM-Domänen entsprechen auch gut den von Morita et al. (1999, Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain Protein components of tight junction strands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 511-516) für andere Mitglieder der Claudinpolypeptid-Familie identifizierten. Auf Grundlage der Alignments mit anderen Familienmitgliedern und unter Bezugnahme auf 1 von Morita et al. wird von den vier Transmembrandomänen vorhergesagt, dass sie sich von den Aminosäuren 1 bis 33, 82 bis 102, 117 bis 145 bzw. 162 bis 191 der SEQ ID NO:6 erstrecken. Diese vorhergesagten Positionen für die vier TM-Domänen von humanem Claudin-21 ordnet die erste extrazelluläre Loop von humanem Claudin-21 als ungefähr um Aminosäure 31 bis Aminosäure 34 der SEQ ID NO:6 beginnend und sich bis ungefähr Aminosäure 81 der SEQ ID NO:6 erstreckend und vorzugsweise von Aminosäure 34 bis Aminosäure 81 der SEQ ID NO:6 und die zweite extrazelluläre Loop von humanem Claudin-21 als ungefähr um Aminosäure 138 bis Aminosäure 146 der SEQ ID NO:6 beginnend und sich bis ungefähr Aminosäure 161 der SEQ ID NO:6 erstreckend und vorzugsweise von Aminosäure 146 bis Aminosäure 161 der SEQ ID NO:6 an. Die intrazelluläre Sequenz zwischen der zweiten und der dritten TM-Domäne erstreckt sich von ungefähr Aminosäure 102 oder 103 der SEQ ID NO:6 bis ungefähr Aminosäure 116 bis 117 der SEQ ID NO:6 und vorzugsweise von Aminosäure 103 bis Aminosäure 116 der SEQ ID NO:6. Die zytoplasmatische Schwanzdomäne von humanem Claudin-21 beginnt ungefähr um Aminosäure 182 bis Aminosäure 192 der SEQ ID NO:6 und erstreckt sich bis zu dem vorhergesagten C-Terminus der SEQ ID NO:6 bei Aminosäure 220; vorzugsweise erstreckt sich die zytoplasmatische Schwanzdomäne von SEQ ID NO:6 von Aminosäure 192 bis Aminosäure 220 der SEQ ID NO:6. Humanes Claudin-19 enthält eine nicht abgespaltene Signalsequenzdomäne (Aminosäuren 8 bis 25 der SEQ ID NO:8), die die Spaltung der Aminosäuresequenz der vollständigen SEQ ID NO:8 zwischen die Aminosäuren 24 und 25 der SEQ ID NO:8 steuern würde. Eine Hidden-Markov-Modell-Analyse (HMM- Analyse) sagt die folgenden Transmembrandomänen für humanes Claudin-19 vorher: Aminosäuren 5 bis 27 der SEQ ID NO:8; Aminosäuren 77 bis 99 der SEQ ID NO:8; Aminosäuren 119 bis 141 der SEQ ID NO:8 und Aminosäuren 161 bis 183 der SEQ ID NO:8. Humanes Claudin-22 enthält eine nicht abgespaltene Signalsequenzdomäne (Aminosäuren 11 bis 27 der SEQ ID NO:11), die die Spaltung der Aminosäuresequenz der vollständigen SEQ ID NO:11 zwischen die Aminosäuren 24 und 25 der SEQ ID NO:11 steuern würde. Eine Hidden-Markov-Modell-Analyse (HMM-Analyse) sagt die folgenden Transmembrandomänen für humanes Claudin-22 vorher: Aminosäuren 11 bis 33 der SEQ ID NO:11; Aminosäuren 77 bis 99 der SEQ ID NO:11; Aminosäuren 119 bis 141 der SEQ ID NO:11 und Aminosäuren 167 bis 189 der SEQ ID NO:11. Der Fachmann wird erkennen, dass die Abgrenzungen dieser Regionen dieser Polypeptide ungefähr sind und dass die genauen Abgrenzungen solcher Domänen, wie beispielsweise die Abgrenzungen der Transmembrandomänen, sich von den hierin für humanes Claudin-19, -21 und -22 vorhergesagten unterscheiden können.
Man glaubt, dass die äußersten C-terminalen Reste der zytoplasmatischen Schwanzdomänen von Claudinpolypeptiden an der Interaktion mit PDZ-Domänen enthaltenden Proteinen beteiligt sind, so dass Substitutionen dieser Reste wahrscheinlich mit einem veränderten PDZ-Domänenerkennungsmuster oder einer veränderten PDZ-Domänenbindungsfunktion oder mit einem Fehlen dieser Funktion für das Polypeptid assoziiert sind. Die meisten Mitglieder der Claudinpolypeptid-Familie, wie das hierin beschriebene humane Claudin-19, weisen an ihren C-Termini eine -Tyr-Val-COOH-Aminosäuresequenz auf. Von humanem Claudin-21 wird vorhergesagt, dass es an seinem C-Terminus eine -Asp-Pro-Gln-Val-COOH-Aminosäuresequenz aufweist. Obwohl dies nicht exakt mit den C-terminalen Aminosäuresequenzen anderer Polypeptide der Claudin-Familie übereinstimmt, ist es in überwiegender Hinsicht mit den Consensus-Anforderungen für Polypeptide der „Gruppe 1", die mit PDZ-Domänen interagieren, konsistent (D. Cowburn, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 835-838): Val/Ile/Leu/Met als der C-terminale Rest, wobei vorzugsweise Thr/Ser/Tyr an der -2-Position und Glu an der -3-Position ist. Humanes Claudin-21 weist Val als den C-terminalen Rest und Asp mit einer sauren Seitenkette wie Glu an der -3-Position auf. Humanes Claudin-22 weist Ile als den C-terminalen Rest auf. Folglich wird von humanem Claudin-21 und -22 vorhergesagt, dass sie mit PDZ-Domänen enthaltenden Polypeptiden interagieren, obwohl sie mit anderen Untereinheiten von PDZ- Domänen interagieren können als andere Claudin-Familienmitglieder, oder sie können bei ihren Interaktionen mit PDZ-Domänen enthaltenden Polypeptiden eine andere Kinetik oder Affinität aufzeigen.
Biologische Aktivitäten und Funktionen von Claudinpolypeptiden der Erfindung
Wie hierin verwendet, beinhaltet „Claudinpolypeptide der Erfindung" humanes Claudin-21 und, soweit zutreffend, Spezieshomologa wie murines Claudin-21 (SEQ ID NO:7) und Varianten und Fragmente dieser humanen Claudinpolypeptide und deren Spezieshomologa. Claudinpolypeptide der Erfindung weisen biologische Aktivitäten und Funktionen auf, die mit denen der anderen Polypeptide der Claudin-Familie konsistent sind. Polypeptide der Claudin-Familie werden während der gesamten Entwicklung in Zelltypen, einschließlich Epithel- und Endothelzellen, exprimiert. Typische biologische Aktivitäten oder Funktionen, die mit dieser Familie von Polypeptiden assoziiert werden, sind Tight junction-Bildung, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransport, Bindung an virales Protein, homotypische oder heterotypische Bindung und PDZ-Domänenbindung. Polypeptide mit Tight junction-Bildungsaktivität binden an andere mit Tight junctions assoziierte Moleküle, um Tight junction-Strukturen zu bilden, die die Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion und den parazellulären Transport regulieren. Die Tight junction-Bildungsaktivität wird mit den extrazellulären Loops und möglicherweise der zytoplasmatischen Schwanzdomäne von Claudinpolypeptiden assoziiert. Folglich beinhalten bevorzugte humane Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptide für Zwecke, die eine Tight junction-Bildungsaktivität erfordern, jene, die die extrazellulären Loop-Domänen aufweisen und Aktivitäten zur Tight junction-Bildung aufzeigen, wie Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, parazellulärer Ionentransport oder Bindung an virales Protein. Zu bevorzugten Claudinpolypeptiden der Erfindung zählen weiterhin Oligomere oder Fusionspolypeptide, die mindestens eine extrazelluläre Loop- oder zytoplasmatische Schwanzdomäne eines oder mehrerer Claudinpolypeptide der Erfindung umfassen, und Fragmente eines beliebigen dieser Polypeptide, die eine Tight junction-Bildungsaktivität aufweisen. Die Tight junction-Bildungsaktivität von humanem Claudin-19, -21 und -22 und anderen Polypeptiden der Claudin-Familie kann beispielsweise ermittelt werden, indem Claudinpolypeptide in Zellen, die normalerweise keine Tight junctions bilden, wie L-Fibroblasten, zusammen mit Occludin oder einem beliebigen anderen Polypeptid, das das Claudinpolypeptid zum Interagieren bei der Bildung von Tight junctions benötigt, eingeführt werden und dann die resultierenden Tight junction-Strukturen mittels Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz-Verfahren sichtbar gemacht werden (siehe beispielsweise M. Furuse et al., 1998, A single gene product, caudin-1 or -2, reconstitutes tight junction strands and recruits occludin in fibroblasts, J. Cell Biol. 143: 391-401). Alternativ kann die Aktivität zum parazellulären Innentransport von humanem Claudin-19, -21 und -22 und anderen Polypeptiden der Claudin-Familie mittels Elektrophysiologie oder durch Verwendung von luminiszierenden Ionen-Indikatormolekülen wie Äquorin, vorzugsweise in Mizellenpräparaten von Zellen, die Claudinpolypeptide exprimieren, geprüft werden.
Claudinpolypeptide wie humanes Claudin-19, -21 oder -22 weisen eine Aktivität zur homotypischen Bindung, heterotypischen Bindung, Bindung an virales Protein und/oder Enterotoxin-Bindung auf; jede dieser Bindungsaktivitäten wird mit den extrazellulären Loop-Domänen von Claudinpolypeptiden assoziiert. Folglich beinhalten bevorzugte Claudinpolypeptide der Erfindung für Zwecke, die eine Aktivität zur homotypischen Bindung, heterotypischen Bindung, Bindung an virales Protein und/oder Enterotoxin-Bindung erfordern, jene, die mindestens eine extrazelluläre Loop-Domäne aufweisen und mindestens eine solche Aktivität aufzeigen. Claudinpolypeptide weisen auch eine Aktivität zur PDZ-Domänenbindung auf, die mit den zytoplasmatischen Schwanzdomänen von Claudinpolypeptiden assoziiert wird. Folglich beinhalten bevorzugte Claudinpolypeptide der Erfindung für Zwecke, die eine Aktivität zur PDZ-Domänenbindung erfordern, jene, die eine zytoplasmatische Schwanzdomäne aufweisen und eine Aktivität zur PDZ-Domänenbindung aufzeigen. Zu bevorzugten Claudinpolypeptiden der Erfindung zählen weiterhin Oligomere oder Fusionspolypeptide, die mindestens eine extrazelluläre Loop- und/oder zytoplasmatische Schwanzdomäne eines oder mehrerer Claudinpolypeptide der Erfindung umfassen, und Fragmente eines beliebigen dieser Polypeptide, die eine Aktivität zur homotypischen Bindung, heterotypischen Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung und/oder PDZ-Domänenbindung aufweisen. Die Bindungsaktivität oder -aktivitäten von humanem Claudin-19, -21 und -22 und anderen Polypeptiden der Claudin-Familie können beispielsweise in einem Yeast-two-Hybrid-Assay oder in einem In-vitro-Assay, der die Bindung zwischen einem Claudinpolypeptid und einem seiner Partner zur homotypischen und/oder heterotypischen Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin- und/oder PDZ-Domänen enthaltenden Bindung misst, ermittelt werden, wobei entweder das Claudinpolypeptid oder sein Bindungspartner mit einem radioaktiven, fluoreszierenden oder biolumineszierenden Protein markiert wird, so dass die Bindung nachgewiesen werden kann.
Der Ausdruck „Aktivität von humanem Claudinpolypeptid", wie hierin verwendet, beinhaltet eine beliebige oder mehrere beliebige der folgenden: Tight junction-Bildung, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion und Ionentransportaktivität; homotypischen Bindung, heterotypischen Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung und PDZ-Domänenbindungsaktivität sowie die Ex-vivo- und In-vivo-Aktivitäten von Claudinpolypeptiden der Erfindung. Das Ausmaß, zu dem Claudinpolypeptide der Erfindung und Fragmente und andere Derivate dieser Polypeptide diese Aktivitäten aufzeigen, kann mittels Standardassayverfahren ermittelt werden. Beispielhafte Assays sind hierin offenbart; Fachleute werden zu schätzen wissen, dass andere, ähnliche Arten von Assays zum Messen der biologischen Aktivitäten von Claudinpolypeptiden der Erfindung und anderen Claudin-Familienmitgliedern verwendet werden können.
Ein Gesichtspunkt der biologischen Aktivität von Claudinpolypeptiden, einschließlich humanem Claudin-19, -21 und -22, ist die Fähigkeit von Mitgliedern dieser Polypeptidfamilie, bestimmte Bindungspartner, wie homotypische und heterotypische Polypeptide, virale Proteine, Enterotoxin und PDZ-Domänen enthaltende Polypeptide, mit der Bindung extrazellulärer Loop-Domänen beispielsweise an homotypische Polypeptide und der Bindung der zytoplasmatischen Schwanzdomäne an PDZ-Domänen enthaltende Polypeptide zu binden. Der Ausdruck „Bindungspartner", wie hierin verwendet, beinhaltet Liganden, Rezeptoren, Substrate, Antikörper, andere Claudinpolypeptide, dasselbe humane Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptid (im Fall von homotypischen Interaktionen) und ein beliebiges anderes Molekül, das mit einem humanem Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptid durch Kontakt oder Nähe zwischen bestimmten Abschnitten des Bindungspartners und des humanen Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptids interagiert. Bindungspartner für Claudinpolypeptide der Erfindung werden auch von Epithel- und Endothelzellen exprimiert, während Claudinpolypeptide, die in Epithelzellen exprimiert werden, an Moleküle an benachbarten Epithelzellen binden, um Tight junctions zu bilden, und Claudinpolypeptide, die in Endothelzellen exprimiert werden, an Moleküle an benachbarten Endothelzellen binden. Somit sind die Interaktionen zwischen Claudinpolypeptiden der Erfindung und deren Bindungspartnern wahrscheinlich am Vermitteln von Interaktionen zwischen angrenzenden Epithelzellen und Interaktionen zwischen angrenzenden Endothelzellen beteiligt. Da die extrazellulären Loop-Domänen von Claudinpolypeptiden der Erfindung an homotypische oder heterotypische Polypeptide binden, wird von einem Polypeptidderivat, das eine oder mehrere extrazelluläre Loop-Domänen umfasst, wenn es als ein von dem Rest eines humanen Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptids separates Fragment oder als ein lösliches Polypeptid, das beispielsweise an eine Immunglobulin-Fc-Domäne fusioniert ist, exprimiert wird, erwartet, dass es die Bindung von Claudinpolypeptiden der Erfindung an deren Bindungspartner unterbricht. Durch Binden an einen oder mehrere Bindungspartner verhindern die separate extrazelluläre Loop-Domäne bzw. die separaten extrazellulären Loop-Domänen wahrscheinlich die Bindung durch das native humane Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptid bzw. die nativen humanen Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptide und wirkt somit in einer dominant-negativen Art und Weise, um die biologischen Aktivitäten zu hemmen, die über die Bindung von Claudinpolypeptiden der Erfindung an homotypische oder heterotypische Polypeptide vermittelt werden. Die biologischen Aktivitäten und Partnerbindungseigenschaften von humanem Claudin-19, -21 und -22 und anderen Polypeptiden der Claudin-Familie können mittels Standardverfahren und mit den hierin beschriebenen Assays geprüft werden.
Polypeptide der Claudin-Familie, wie humanes Claudin-19, -21 und -22, sind an der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion und Transportkrankheiten oder -erkrankungen, die in ihrer Ätiologie als ein gemeinsames Merkmal eine anomale „tight junction"-Bildung oder eine ungeeignet regulierte Tight junction-Funktion (d. h. anomale Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion) gemein haben, beteiligt. Genauer ausgedrückt, die folgenden Erkrankungen, die Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion und/oder Bindung an Claudinpolypeptide einschließen, sind jene, die bekannt sind oder von denen wahrscheinlich ist, dass sie die biologischen Aktivitäten von Claudinpolypeptiden einschließen: Entzündung, Asthma, Allergie, Metastasen von Krebszellen, Ionentransporterkrankungen wie Magnesiumtransportdefekte in der Niere, entzündliche Darmerkrankung und Kontakt mit Clostridium perfringens-Enterotoxin (CPE). Darüber hinaus, weil von einem Claudinpolypeptid, das in Nervenzellen exprimiert wird, gezeigt wurde, dass es zur Bildung der Myelinscheide in Oligodendrozyten erforderlich ist, werden Claudinpolypeptide mit Demyelinisationserkrankungen, wie multipler Sklerose (MS), autoimmuner Enzephalomyelitis, Optikusneuritis, progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie (PML), assoziiert. Zudem können Krankheiten, die von einer oder mehreren der obigen Erkrankungen begünstigt werden, direkt oder indirekt Claudinpolypeptide einschließen. Zum Beispiel wurde Empfänglichkeit für das plötzliche Kindstod-Syndrom (plötzlicher Kindstod, sudden infant death syndrome, SIDS) mit Kontakt mit CPE assoziiert. Das Blockieren oder Hemmen von Interaktionen zwischen Claudinpolypeptiden der Erfindung und deren Substraten, Liganden, Rezeptoren, Bindungspartnern und/oder anderen interagierenden Polypeptiden ist ein Gesichtspunkt der Erfindung und stellt Verfahren zum Behandeln oder Lindern dieser Krankheiten und Erkrankungen durch Verwendung von Inhibitoren der Aktivität des humanen Claudin-21 bereit. Beispiele solcher Inhibitoren oder Antagonisten werden im Folgenden ausführlicher beschrieben. Für bestimmte Erkrankungen, die einen Defekt der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion oder des Ionentransports einschließen, der mit einer zu geringen Aktivität des humanen Claudin-21 assoziiert wird, umfassen Verfahren zum Behandeln oder Lindern dieser Erkrankungen das Erhöhen der Menge oder Aktivität von Claudinpolypeptiden der Erfindung, indem isolierte Claudinpolypeptide der Erfindung oder aktive Fragmente oder Fusionspolypeptide davon bereitgestellt werden oder indem Verbindungen (Agonisten) bereitgestellt werden, die endogene oder exogene Claudinpolypeptide der Erfindung aktivieren. Zusätzliche Verwendungszwecke für Claudinpolypeptide der Erfindung und Agonisten und Antagonisten davon beinhalten diagnostische Reagenzien für Epithel- oder Endotheltransporterkrankungen; Forschungsreagenzien zur Untersuchung von Occludin oder Polypeptiden der ZO-Familie und der Bildung von Tight junctions; Reinigung, Verarbeitung und Konservierung von Occludin oder ZO-Polypeptiden oder Epithel- oder Endothelzellen oder als ein Trägerstoff oder Targeting-Molekül zur Abgabe von Therapeutika, insbesondere im Hinblick auf die Rolle von Claudinen bei den Tight junctions der Blut-Hirn-Schranke (U. Kniesel und H. Wolburg, 2000, Cell Mol. Neurobiol. 20: 57-76).
Claudinpolypeptide der Erfindung
Ein humanes Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptid ist ein Polypeptid, das mit einer Aminosäuresequenz von humanem Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptid ein ausreichendes Maß an Aminosäureidentität oder -ähnlichkeit teilt, wie den in Tabelle 1 gezeigten, die (A) von Fachleuten als ein Polypeptid identifiziert werden, das wahrscheinlich bestimmte strukturelle Domänen gemein hat, und/oder (B) biologische Aktivitäten mit humanen Claudinpolypeptiden gemein haben und/oder (C) an Antikörper binden, die ebenfalls spezifisch an andere humane Claudinpolypeptide binden. Claudinpolypeptide der Erfindung können aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden oder dieselbe Struktur wie natürlich vorkommende Claudinpolypeptide haben oder können so produziert werden, dass sie Strukturen aufweisen, die sich von natürlich vorkommenden Claudinpolypeptiden unterscheiden. Polypeptide, die von einem beliebigen humanen Claudin-21-Polypeptid mittels einer beliebigen Art der Veränderung (beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren; Änderungen des Glykosylierungszustands des Polypeptids; Neufaltung oder Isomerisierung, um seine dreidimensionale Struktur oder seinen Selbstassoziationszustand zu ändern; und Änderungen seiner Assoziation mit anderen Polypeptiden oder Molekülen) abgeleitet werden, sind ebenfalls Claudinpolypeptide der Erfindung. Folglich beinhalten die von der Erfindung bereitgestellten Polypeptide Polypeptide, die durch Aminosäuresequenzen gekennzeichnet sind, die denen der hierin beschriebenen Claudinpolypeptide der Erfindung ähnlich sind, in denen jedoch Modifikationen naturgemäß bereitgestellt sind oder die absichtlich gentechnisch modifiziert wurden. Ein Polypeptid, das mit Claudinpolypeptiden der Erfindung biologische Aktivitäten gemein hat, ist ein Polypeptid mit Aktivität von humanem Claudin-21. Zu Beispielen biologischer Aktivitäten, die von Mitgliedern der Claudinpolypeptid-Familie aufgezeigt werden, zählen, ohne Einschränkung, Tight junction-Bildung, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransport, homotypische oder heterotypische Bindung, Bindung an virales Protein und Enterotoxin-Bindung.
Die vorliegende Erfindung stellt sowohl vollständige als auch reife Formen von Claudinpolypeptiden der Erfindung. Vollständige Polypeptide sind diejenigen, die die komplette primäre Aminosäuresequenz der Polypeptide, wie anfänglich translatiert, aufweisen. Die Aminosäuresequenzen von vollständigen Polypeptiden können beispielsweise mittels Translation des kompletten offenen Leserasters (open reading frame, „ORF") eines cDNA-Moleküls erhalten werden. Mehrere vollständige Polypeptide können von einem einzigen genetischen Locus kodiert werden, wenn mehrere mRNA-Formen von diesem Locus durch alternatives Spleißen oder durch Verwendung mehrerer Translationsinitiationsstellen produziert werden. Die „reife Form" eines Polypeptids bezieht sich auf ein Polypeptid, das posttranslationalen Verarbeitungsschritten, wie einer Spaltung der Signalsequenz oder einer proteolytischen Spaltung, um eine Prodomäne zu entfernen, unterzogen wurde. Mehrere reife Formen eines bestimmten vollständigen Polypeptids können beispielsweise mittels Spaltung der Signalsequenz an mehreren Stellen oder mittels differentieller Regulierung von Proteasen, die das Polypeptid spalten, produziert werden. Die reife Form bzw. die reifen Formen eines solchen Polypeptids können mittels Expression in einer geeigneten Säugetierzelle oder einer anderen Wirtszelle eines Nukleinsäuremoleküls, das das vollständige Polypeptid kodiert, erhalten werden. Die Sequenz der reifen Form des Polypeptids kann auch aus der Aminosäuresequenz der vollständigen Form durch Identifizierung von Signalsequenzen oder Proteasespaltstellen ermittelbar sein. Die Claudinpolypeptide der Erfindung beinhalten auch jene, die aus posttranskriptionalen oder posttranslationalen Verarbeitungsereignissen resultieren, wie alternierender mRNA-Verarbeitung, die ein verkürztes, jedoch biologisch aktives Polypeptid, beispielsweise eine natürlich vorkommende, lösliche Form des Polypeptids, ergeben kann. Ebenfalls umfasst von der Erfindung sind Variationen, die der Proteolyse zuzuschreiben sind, wie Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen aufgrund der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren aus dem Polypeptid (im allgemeinen von 1 bis 5 terminale Aminosäuren).
Die Erfindung beinhaltet weiterhin Claudinpolypeptide der Erfindung mit oder ohne assoziierter Glykosylierung der nativen Struktur. Polypeptide, die in Hefe- oder Säugetierexpressionssystemen (z. B. COS-1- oder CHO-Zellen) exprimiert werden, können einem nativen Polypeptid in Bezug auf das Molekulargewicht und das Glykosylierungsmuster, je nach der Wahl des Expressionssystems, ähnlich sein oder sich von diesem erheblich unterscheiden. Die Expression von Polypeptiden der Erfindung in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, liefert unglykosylierte Moleküle. Des Weiteren kann ein gegebenes Präparat mehrere unterschiedlich glykosylierte Spezies des Polypeptids enthalten. Glykosylgruppen können mittels herkömmlicher Verfahren, insbesondere jenen, die Glykopeptidase einsetzen, entfernt werden. Im allgemeinen können glykosylierte Polypeptide der Erfindung mit einem molaren Überschuß an Glykopeptidase (Boehringer Mannheim) inkubiert werden.
Spezieshomologa von Claudinpolypeptiden der Erfindung und von Nukleinsäuren, die diese kodieren, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Wie hierin verwendet, ist ein Spezieshomologon ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure mit einer Ursprungsspezies, die sich von der eines gegebenen Polypeptids oder einer gegebenen Nukleinsäure unterscheidet, jedoch mit einer signifikanten Sequenzähnlichkeit zu dem gegebenen Polypeptid oder der gegebenen Nukleinsäure, wie von Fachleuten bestimmt. Spezieshomologa können mittels Herstellung geeigneter Sonden oder Primer aus Polynukleotiden, die die hierin bereitgestellten Aminosäuresequenzen kodieren, und Screenen einer geeigneten Nukleinsäurequelle aus der gewünschten Spezies isoliert und identifiziert werden. Die Erfindung umfasst auch allelische Varianten von Claudinpolypeptiden der Erfindung und Nukleinsäuren, die diese kodieren; das heißt, natürlich vorkommende alternative Formen solcher Polypeptide und Nukleinsäuren, in denen Unterschiede bei der Aminosäure- oder Nukleotidsequenz genetischem Polymorphismus (allelische Variation unter Einzelpersonen innerhalb einer Population) zugeschrieben werden können.
Fragmente der Claudinpolypeptide der vorliegenden Erfindung werden von der vorliegenden Erfindung umfasst und können in linearer Form oder unter Verwendung bekannter Verfahren zyklisiert sein, beispielsweise wie in H.U. Saragovi et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992), und in R.S. McDowell et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9245-9253 (1992), beschrieben. Zu Polypeptiden und Polypeptidfragmenten der vorliegenden Erfindung und Nukleinsäuren, die diese kodieren, zählen Polypeptide und Nukleinsäuren mit Aminosäure- oder Nukleotidsequenzlängen, die mindestens 25% (mehr bevorzugt mindestens 50% oder mindestens 60% oder mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 80%) der Länge eines humanen Claudin-21-Polypeptids ausmachen und mindestens 70% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5% oder mindestens 99% und am meisten bevorzugt mindestens 99,5%) mit diesem humanen Claudin-21-Polypeptid oder der kodierenden Nukleinsäure haben, wobei die Sequenzidentität bestimmt wird, indem die Aminosäuresequenzen der Polypeptide mittels Alignment verglichen werden, um die Überlappung und Identität zu maximieren, während die Sequenzlücken minimiert werden. Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Polypeptide und Polypeptidfragmente und Nukleinsäuren, die diese kodieren, die ein Segment enthalten oder kodieren, das vorzugsweise mindestens 8 oder mindestens 10 oder vorzugsweise mindestens 15 oder mehr bevorzugt mindestens 20 oder noch mehr bevorzugt mindestens 30 oder am meisten bevorzugt mindestens 40 aufeinanderfolgende Aminosäuren umfasst. Solche Polypeptide und Polypeptidfragmente können auch ein Segment enthalten, das mindestens 60% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5% oder mindestens 99% und am meisten bevorzugt mindestens 99,5%) mit einem beliebigen derartigen Segment eines beliebigen der Claudinpolypeptide der Erfindung teilt, wobei die Sequenzidentität bestimmt wird, indem die Aminosäuresequenzen der Polypeptide mittels Alignment verglichen werden, um die Überlappung und Identität zu maximieren, während die Sequenzlücken minimiert werden. Der Prozentsatz an Identität kann mittels Sichtinspektion und mathematischer Berechnung ermittelt werden. Alternativ kann der Prozentsatz an Identität von zwei Aminosäure- oder zwei Nukleinsäuresequenzen durch Vergleichen der Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, ermittelt werden, das von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) beschrieben wird und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Gleichheiten und 0 für Ungleichheiten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353-358, 1979, beschrieben; (2) eine Penalty von 3,0 für jede Gap (Lücke) und eine weitere Penalty von 0,10 für jedes Symbol in jeder Gap und (3) keine Penalty für End-Gaps. Andere Programme, die von Fachleuten der Technik des Sequenzvergleichs verwendet werden, können ebenfalls eingesetzt werden, wie beispielsweise das BLASTN-Programm, Version 2.0.9, zur Verwendung über die Website der National Library of Medicine, ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi, erhältlich, oder der UW-BLAST 2.0-Algorithmus. Die Standardparametereinstellungen für UW-BLAST 2.0 werden auf der folgenden Internetseite beschrieben: blast.wustl.edu/blast/README.html#References. Darüber hinaus verwendet der BLAST-Algorithmus die BLOSUM64-Aminosäuren-Scoring-Matrix und optionale Parameter, die verwendet werden können, sind wie folgt: (A) Einbeziehen eines Filters zum Maskieren von Segmenten der Abfragesequenz, die eine geringe Zusammensetzungskomplexität aufweisen (wie mit dem SEG-Programm von Wootton & Federhen (Computers and Chemistry, 1993) bestimmt; siehe auch J.C. Wootton und S. Federhen, 1996, Analysis of compositionally biased regions in sequence databases, Methods Enzymol. 266: 554-571), oder Segmenten, die aus internalen Redundanzen mit kurzer Periodizität bestehen (wie mit dem XNU-Programm von Claverie & States (Computers and Chemistry, 1993) bestimmt), und (B) einen statistisch signifikanten Schwellwert zum Melden von Übereinstimmungen im Vergleich zu Datenbasensequenzen oder E-Score (die erwartete Wahrscheinlichkeit von Übereinstimmungen, die lediglich durch Zufall gefunden werden, gemäß dem stochastischen Modell von Karlin und Altschul (1990); wenn die statistische Signifikanz, die einer Übereinstimmung zugeschrieben wird, größer als dieser E-Score-Schwellwert ist, wird die Übereinstimmung nicht gemeldet); bevorzugte E-Score-Schwellwerte sind 0,5 oder, in Reihenfolge der zunehmenden Präferenz, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75 oder 1e-100.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem lösliche Formen von Claudinpolypeptiden der Erfindung bereit, die bestimmte Fragmente oder Domänen dieser Polypeptide umfassen, und insbesondere jene, die die extrazelluläre Domäne oder ein oder mehrere Fragmente der extrazellulären Domäne umfassen. Lösliche Polypeptide sind Polypeptide, die von den Zellen sezerniert werden können, in denen sie exprimiert werden. In solchen Formen werden ein Teil oder alle der intrazellulären und Transmembrandomänen des Polypeptids deletiert, so dass das Polypeptid vollständig von der Zelle sezerniert wird, in der es exprimiert wird. Die intrazellulären und Transmembrandomänen von Polypeptiden der Erfindung können gemäß bekannten Techniken zur Bestimmung solcher Domänen aus Sequenzinformationen identifiziert werden. Zu löslichen Claudinpolypeptiden der Erfindung zählen auch jene Polypeptide, die einen Teil der Transmembranregion enthalten, vorausgesetzt, dass das lösliche humane Claudin-21-Polypeptid aus einer Zelle sezerniert werden kann und vorzugsweise die Aktivität von humanem Claudin-21 beibehält. Zu löslichen Claudinpolypeptiden der Erfindung zählen weiterhin Oligomere oder Fusionspolypeptide, die den extrazellulären Abschnitt mindestens eines humanen Claudin-21-Polypeptids umfassen, und Fragmente eines beliebigen dieser Polypeptide, die die Aktivität von humanem Claudin-21 aufweisen. Ein sezerniertes lösliches Polypeptid kann identifiziert werden (und von seinen unlöslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden werden), indem intakte Zellen, die das gewünschte Polypeptid exprimieren, aus dem Kulturmedium getrennt werden, z. B. mittels Zentrifugierung, und das Medium (der Überstand) auf das Vorliegen des gewünschten Polypeptids geprüft wird. Das Vorliegen des gewünschten Polypeptids in dem Medium weist darauf hin, dass das Polypeptid von den Zellen sezerniert wurde und folglich eine lösliche Form des Polypeptids ist. Die Verwendung von löslichen Formen von Claudinpolypeptiden der Erfindung ist für viele Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Polypeptide aus rekombinanten Wirtszellen wird vereinfacht, da die löslichen Polypeptide von den Zellen sezerniert werden. Darüber hinaus sind lösliche Polypeptide im allgemeinen zur parenteralen Verabreichung und für viele enzymatische Vorgänge besser geeignet als membrangebundene Formen.
In einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung umfassen bevorzugte Polypeptide verschiedene Kombinationen von Domänen von humanem Claudin-21-Polypeptid, wie die zytoplasmatische Schwanzdomäne und die extrazelluläre Loop-Domäne. Dementsprechend zählen zu Polypeptiden der vorliegenden Erfindung und Nukleinsäuren, die diese kodieren, jene, die zwei oder mehr Kopien einer Domäne wie der zytoplasmatischen Schwanzdomäne, zwei oder mehr Kopien einer Domäne wie der extrazellulären Loop-Domäne oder mindestens eine Kopie jeder Domäne umfassen oder kodieren, und diese Domänen können in einer beliebigen Reihenfolge in solchen Polypeptiden präsentiert werden.
Weitere Modifikationen der Peptid- oder DNA-Sequenzen können von Fachleuten unter Verwendung bekannter Techniken vorgenommen werden. Zu Modifikationen von Interesse der Polypeptidsequenzen können die Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion einer ausgewählten Aminosäure zählen. Zum Beispiel können ein oder mehrere der Cysteinreste deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um die Konformation des Moleküls zu verändern, eine Veränderung, die das Verhindern der Bildung inkorrekter intramolekularer Disulfidbrücken bei der Faltung oder Renaturierung einschließen kann. Techniken für eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion sind Fachleuten wohl bekannt (siehe z. B. US-Pat. Nr. 4,518,584 ). Als ein anderes Beispiel können N-Glykosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne des Polypeptids derart modifiziert werden, dass sie die Glykosylierung ausschließen, was die Expression eines reduzierten Kohlenhydratanalogons in Säugetier- und Hefeexpressionssystemen ermöglicht. N-Glykosylierungsstellen in eukaryontischen Polypeptiden zeichnen sich durch ein Aminosäurentriplett, Asn-X-Y, aus, wobei X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen zu der Nuldeotidsequenz, die diese Tripletts kodiert, werden in der Verhinderung der Anlagerung von Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette resultieren. Die Veränderung eines einzigen Nukleotids, das beispielsweise derart ausgewählt wird, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, reicht dazu aus, eine N-Glykosylierungsstelle zu deaktivieren. Alternativ kann das Ser oder Thr durch eine andere Aminosäure, wie Ala, ersetzt werden. Zu bekannten Vorgehensweisen zum Deaktivieren von N-Glykosylierungsstellen in Polypeptiden zählen die in der US-Patentschrift 5,071,972 und der EP 276,846 beschriebenen. Zu weiteren Varianten innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung zählen Polypeptide, die derart modifiziert werden können, dass sie Derivate davon erzeugen, indem sie kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Teilen, wie Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen bilden. Kovalente Derivate können hergestellt werden, indem die chemischen Teile sich mit funktionellen Gruppen an Aminosäurenseitenketten oder mit dem N-Terminus oder C-Terminus eines Polypeptids verbinden. Konjugate, die Diagnostika (nachweisbar) oder Therapeutika umfassen, die daran angelagert sind, werden hierin in Erwägung gezogen. Vorzugsweise bewahrt eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion die gewünschte Aktivität des Polypeptids oder eines substantiellen Äquivalents davon. Ein Beispiel ist eine Variante, die mit im wesentlichen derselben Bindungsaffinität bindet, wie dies die native Form tut. Die Bindungsaffinität kann mittels herkömmlicher Vorgehensweisen gemessen werden, z. B. wie in der US-Patentschrift Nr. 5,512,457 beschrieben und wie hierin dargelegt.
Zu anderen Derivaten zählen kovalente oder aggregative Konjugate der Polypeptide mit anderen Polypeptiden oder Polypeptiden, wie mittels Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispiele von Fusionspolypeptiden werden im folgenden in Verbindung mit Oligomeren erörtert. Des weiteren können Fusionspolypeptide Peptide umfassen, die hinzugefügt wurden, um die Reinigung und Identifizierung zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen beispielsweise Poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, beschrieben werden. Ein solches Peptid ist das FLAG^®-Peptid, das stark antigen ist und ein Epitop bereitstellt, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden ist, was einen schnellen Assay und eine einfache Reinigung exprimierten rekombinanten Polypeptids ermöglicht. Ein murines Hybridom, das mit 4E11 bezeichnet wird, produziert einen monoklonalen Antikörper, der das FLAG^®-Peptid in Gegenwart bestimmter zweiwertiger Metallkationen bindet, wie in der US-Patentschrift 5,011,912 beschrieben. Die 4E11-Hybridomzelllinie wurde in der American Type Culture Collection unter der Zugangsnr. HB 9259 hinterlegt. Monoklonale Antikörper, die das FLAG^®-Peptid binden, sind von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut, USA, erhältlich.
Von der Erfindung umfasst sind Oligomere oder Fusionspolypeptide, die ein humanes Claudin-21-Polypeptid, ein oder mehrere Fragmente von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder ein beliebiges der Derivat- oder Variantenformen von Claudinpolypeptiden der Erfindung enthalten. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Oligomere lösliche Claudinpolypeptide der Erfindung. Oligomere können in der Form kovalent verbundener oder nicht kovalent verbundener Multimere vorliegen, einschließlich Dimere, Trimere oder höherer Oligomere. In einem Gesichtspunkt der Erfindung bewahren die Oligomere die Bindungsfähigkeit der Polypeptidbestandteile und stellen somit zweiwertige, dreiwertige usw. Bindungsstellen bereit. In einer alternativen Ausführungsform ist die Erfindung auf Oligomere gerichtet, die mehrere Claudinpolypeptide der Erfindung umfassen, die mittels kovalenter oder nicht kovalenter Interaktionen zwischen Peptidteilen, die an die Polypeptide fusioniert sind, verbunden sind, wobei solche Peptide die Eigenschaft zum Begünstigen der Oligomerisierung aufweisen. Leucin-Zipper und bestimmte Polypeptide, die von Antikörpern abgeleitet wurden, zählen zu den Peptiden, die die Oligomerisierung der daran angelagerten Polypeptide begünstigen können, wie im folgenden ausführlicher beschrieben.
In Ausführungsformen, in denen Varianten der Claudinpolypeptide der Erfindung derart konstruiert sind, dass sie eine Membran-umspannende Domäne enthalten, werden sie ein Membranpolypeptid des Typs 1 bilden. Membran-umspannende Claudinpolypeptide der Erfindung können mit extrazellulären Domänen von Rezeptorpolypeptiden, für die der Ligand bekannt ist, fusioniert werden. Solche Fusionspolypeptide können dann manipuliert werden, um die intrazellulären Signalstoffwechselwege zu kontrollieren, die von dem Membran-umspannenden, humanen Claudin-21-Polypeptid ausgelöst werden. Claudinpolypeptide der Erfindung, die die Zellmembran umspannen, können ebenfalls mit Agonisten oder Antagonisten von Zelloberflächenrezeptoren oder Zelladhäsionsmolekülen fusioniert werden, um die intrazellulären Effekte von humanem Claudin-21 weiter zu modulieren. In einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung können Interleukine zwischen dem bevorzugten Fragment des humanen Claudin-21-Polypeptids und anderen Fusionspolypeptiddomänen angeordnet sein.
Auf Immunglobulin basierende Oligomere. Die Polypeptide der Erfindung oder Fragmente davon können zu vielen Zwecken, einschließlich des Erhöhens der Wertigkeit von Polypeptidbindungsstellen, an Moleküle wie Immunglobuline fusioniert werden. Zum Beispiel können Fragmente eines humanen Claudin-21-Polypeptids direkt oder über Linkersequenzen an den Fc-Abschnitt eines Immunglobulins fusioniert werden. Bei einer zweiwertigen Form des Polypeptids könnte eine solche Fusion am Fc-Abschnitt eines IgG-Moleküls sein. Andere Immunglobulin-Isotypen können gleichfalls zum Erzeugen solcher Fusionen verwendet werden. Zum Beispiel würde eine Polypeptid-IgM-Fusion eine zehnwertige Form des Polypeptids der Erfindung erzeugen. Der Ausdruck „Fc-Polypeptid", wie hierin verwendet, beinhaltet native und Muteinformen von Polypeptiden, die sich aus der Fc-Region eines Antikörpers, der eine beliebige oder alle der CH-Domänen der Fc-Region umfasst, zusammensetzen. Verkürzte Formen solcher Polypeptide, die die Gelenkregion enthalten, die Dimerisation begünstigt, sind ebenfalls eingeschlossen. Bevorzugte Fc-Polypeptide umfassen ein Fc-Polypeptid, das von einem humanen IgGI-Antikörper abgeleitet ist. Als eine Alternative wird ein Oligomer unter Verwendung von Polypeptiden, die von Immunglobulinen abgeleitet sind, hergestellt. Die Herstellung von Fusionspolypeptiden, die bestimmte heterologe Polypeptide umfassen, die an verschiedene Abschnitte von Antikörper abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, wurden beschrieben, z. B. von Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991); Bym et al. (Nature 344:677, 1990) und Hollenbaugh und Aruffo („Construction of Immunglobulin Fusion Polypeptides” in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1-10.19.11, 1992). Verfahren zur Herstellung und Verwendung von auf Immunglobulin basierenden Oligomeren sind in der Technik wohl bekannt. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Dimer gerichtet, das zwei Fusionspolypeptide umfasst, die durch Fusionieren eines Polypeptids der Erfindung an ein Fc-Polypeptid, das von einem Antikörper abgeleitet ist, erzeugt werden. Eine Genfusion, die das Polypeptid/Fc-Fusionspolypeptid kodiert, wird in einen adäquaten Expressionsvektor inseriert. Polypeptid/Fc-Fusionspolypeptide werden in Wirtszellen exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert wurden, und es wird ihnen ermöglicht, sich ziemlich wie Antikörpermoleküle zusammenzufügen, worauf sich Disulfidbindungen in der Kette zwischen den Fc-Teilen bilden, um zweiwertige Moleküle zu ergeben. Ein geeignetes Fc Polypeptid, in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben, ist ein Einzelkettenpolypeptid, das sich von der N-terminalen Gelenkregion zu dem nativen C-Terminus der Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein weiteres geeignetes Fc-Polypeptid ist das Fc-Mutein, das in der US-Patentschrift 5,457,035 und in Baum et al. (EMBO J. 13:3992-4001, 1994) beschrieben wird. Die Aminosäuresequenz dieses Muteins ist mit der der nativen Fc-Sequenz identisch, die in WO 93/10151 dargeboten wird, mit der Ausnahme, dass die Aminosäure 19 von Leu in Ala geändert wurde, die Aminosäure 20 von Leu in Glu geändert wurde und die Aminosäure 22 von Gly in Ala geändert wurde. Das Mutein weist eine verminderte Affinität für Fc-Rezeptoren auf. Die oben beschriebenen Fusionspolypeptide, die Fc-Teile (und daraus gebildete Oligomere) umfassen, bieten den Vorteil der einfachen Reinigung mittels Affinitätschromatographie über Polypeptid-A- oder Polypeptid-G-Säulen. In anderen Ausführungsformen können die Polypeptide der Erfindung durch den variablen Abschnitt einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers ersetzt werden. Wenn Fusionspolypeptide mit sowohl der schweren als auch der leichten Kette eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein Oligomer mit bis zu vier extrazellulären Regionen von humanem Claudin-21 zu bilden.
Auf Peptidlinker basierende Oligomere. Alternativ ist das Oligomer ein Fusionspolypeptid, das mehrere Claudinpolypeptide der Erfindung umfasst, mit oder ohne Peptidlinker (Spacer-Peptide). Zu den geeigneten Peptidlinkern zählen die in den US-Patentschriften 4,751,180 und 4,935,233 beschriebenen. Eine DNA-Sequenz, die einen gewünschten Peptidlinker kodiert, kann zwischen den DNA-Sequenzen der Erfindung und im selben Leseraster wie diese unter Anwendung einer beliebigen geeigneten herkömmlichen Technik inseriert werden. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das den Linker kodiert, zwischen den Sequenzen ligiert werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein Fusionspolypeptid von zwei bis vier lösliche Claudinpolypeptide der Erfindung, die durch Ppeptidlinker getrennt sind. Geeignete Peptidlinker, deren Kombination mit anderen Polypeptiden und deren Verwendung sind Fachleuten wohl bekannt.
Leucin-Zipper. Ein anderes Verfahren zum Herstellen der Oligomere der Erfindung beinhaltet die Verwendung eines Leucin-Zippers. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die die Oligomerisierung der Polypeptide, in denen sie vorgefunden werden, fördern. Leucin-Zipper wurden ursprünglich in mehreren DNA-bindenden Polypeptiden identifiziert (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) und wurden seitdem in einer Vielfalt unterschiedlicher Polypeptide gefunden. Zu den bekannten Leucin-Zippern zählen natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren. Die Zipper-Domäne (hierin auch als eine oligomerisierende oder Oligomere bildende Domäne bezeichnet) umfasst eine repetitive Heptad-Wiederholung, oftmals mit vier oder fünf Leucinresten, die mit anderen Aminosäuren durchsetzt sind. Die Verwendung von Leucin-Zippern und die Herstellung von Oligomeren unter Verwendung von Leucin-Zippern sind in der Technik wohl bekannt.
Andere Fragmente und Derivate der Sequenzen von Polypeptiden, von denen erwartet werden würde, dass sie die Polypeptidaktivität vollständig oder zum Teil bewahren, und die folglich für ein Screening oder andere immunologische Methoden geeignet sein können, können angesichts der Offenbarungen hierin ebenfalls von Fachleuten vorgenommen werden. Man glaubt, dass solche Modifikationen von der vorliegenden Erfindung umfasst werden.
Nukleinsäuren, die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren
Von der Erfindung umfasst sind Nukleinsäuren, die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren. Diese Nukleinsäuren können in verschiedenerlei Art und Weise identifiziert werden, einschließlich Isolierung von genomischen oder cDNA-Molekülen aus einer geeigneten Quelle. Nukleotidsequenzen, die den hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen entsprechen, die als Sonden oder Primer zur Isolierung von Nukleinsäuren oder als Abfragesequenzen für Datenbanksuchen verwendet werden sollen, können durch „Rücktranslation" aus dem Aminosäuresequenzen oder durch Identifizierung von Regionen von Aminosäureidentität mit Polypeptiden, für die die kodierende DNA-Sequenz identifiziert wurde, erhalten werden. Die wohl bekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann zum Isolieren und Amplifizieren einer DNA-Sequenz, die ein humanes Claudin-21-Polypeptid oder eine gewünschte Kombination von humanen Claudin-21-Polypeptid-Fragmenten kodiert, eingesetzt werden. Oligonukleotide, die die gewünschten Termini der Kombination von DNA-Fragmenten definieren, werden als 5'- und 3'-Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können darüber hinaus Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, um die Insertion der amplifizierten Kombination von DNA-Fragmenten in einen Expressionsvektor zu erleichtern. PCR-Techniken sind in Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego (1989), S. 189-196; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Inns et al., Hrsg., Academic Press, Inc. (1990), beschrieben.
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung beinhalten DNA und RNA in sowohl einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form sowie die entsprechenden komplementären Sequenzen. DNA beinhaltet beispielsweise cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, mittels PCR amplifizierte DNA und Kombinationen davon. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung beinhalten vollständige Gene oder cDNA-Moleküle sowie eine Kombination von Fragmenten davon. Die Nukleinsäuren der Erfindung stammen vorzugsweise aus menschlichen Quellen, die Erfindung schließt jedoch ebenso die von nicht menschlichen Spezies stammenden ein.
„Eine isolierte Nukleinsäure, im wesentlichen bestehend aus einer Nukleotidsequenz" bedeutet, dass die Nukleinsäure zusätzlich zu der Nukleotidsequenz zusätzliches Material aufweisen kann, das kovalent an einem oder beiden Enden des Nukleinsäuremoleküls verbunden ist, wobei das zusätzliche Material vorzugsweise zwischen 1 und 100.000 zusätzliche Nukleotide, die kovalent an einem Ende, jedem Ende oder beiden Enden des Nukleinsäuremoleküls verbunden ist, und mehr bevorzugt zwischen 1 und 10.000 zusätzliche Nukleotide, die kovalent an einem Ende, jedem Ende oder beiden Enden des Nukleinsäuremoleküls verbunden ist, und am meisten bevorzugt zwischen 10 und 1000 zusätzliche Nukleotide, die kovalent an einem Ende, jedem Ende oder beiden Enden des Nukleinsäuremoleküls verbunden ist, ist. Eine isolierte Nukleinsäure, im wesentlichen bestehend aus einer Nukleotidsequenz, kann ein Expressionsvektor oder ein anderes Konstrukt, das die Nukleotidsequenz umfasst, sein.
Eine „isolierte Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure, die von angrenzenden genetischen Sequenzen getrennt wurde, die im Genom des Organismus vorliegen, aus dem die Nukleinsäure isoliert wurde, im Fall von Nukleinsäuren aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert wurde. Im Fall von Nukleinsäuren, die enzymatisch aus einer Matrize oder chemisch synthetisiert werden, wie beispielsweise PCR-Produkte, cDNA-Moleküle oder Oligonukleotide, wird verstanden, dass die aus solchen Verfahren resultierenden Nukleinsäuren isolierte Nukleinsäuren sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül in der Form eines separaten Fragments oder als ein Bestandteil eines größeren Nukleinsäurekonstrukts. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung bestimmte isolierte Nukleinsäuren, die im wesentlichen von kontaminierendem endogenem Material frei sind. Das Nukleinsäuremolekül wurde vorzugsweise von DNA oder RNA abgeleitet, die mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, die die Identifizierung, die Manipulation und das Gewinnen ihrer Bestandteilsnukleotidsequenzen mittels biochemischer Standardverfahren ermöglicht (wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), umrissen). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in der Form eines offenen Leserasters bereitgestellt und/oder konstruiert, das nicht von internen untranslatierten Sequenzen oder Introns unterbrochen wird, die in der Regel in eukaryontischen Genen vorliegen. Sequenzen untranslatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leseraster vorliegen, wo diese die Manipulation oder Expression der kodierenden Region nicht stören.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem Nukleinsäuren, die unter moderat stringenten Bedingungen und mehr bevorzugt hoch stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren hybridisieren, die hierin beschriebene Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren. Die grundlegenden Parameter, die die Wahl der Hybridisierungsbedingungen beeinflussen, und die Anleitung zum Festlegen geeigneter Bedingungen werden von J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Kapitel 9 und 11; und Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., Abschnitte 2.10 und 6.3-6.4) ausgeführt und können von Durchschnittsfachleuten auf Grundlage beispielsweise der Länge und/oder der Basenzusammensetzung der DNA leicht ermittelt werden. Eine Methode zum Erzielen moderat stringenter Bedingungen beinhaltet die Verwendung einer Vorwaschlösung, die 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) enthält, eines Hybridisierungspuffers aus etwa 50% Formamid, 6 × SSC, und eine Hybridisierungstemperatur von etwa 55 Grad Celsius (oder anderen ähnlichen Hybridisierungslösungen, wie einer, die etwa 50% Formamid enthält, mit einer Hybridisierungstemperatur von etwa 42 Grad Celsius) und Waschbedingungen von etwa 60 Grad Celsius in 0,5 × SSC, 0,1% SDS. Im Allgemeinen sind hoch stringente Bedingungen als Hybridisierungsbedingungen wie oben definiert, jedoch mit einem Waschen bei ungefähr 68 Grad Celsius, 0,2 × SSC, 0,1% SDS. SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat) kann in den Hybridisierungs- und Waschpuffern durch SSPE (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4) ersetzt werden; die Waschvorgänge werden für 15 Minuten durchgeführt, bis die Hybridisierung abgeschlossen ist. Es sollte verstanden werden, dass die Waschtemperatur und die Waschsalzkonzentration nach Bedarf derart angepaßt werden können, dass ein gewünschtes Ausmaß an Stringenz erzielt wird, indem die Grundsätze angewendet werden, die die Hybridisierungsreaktionen und Duplexstabilität bestimmen, wie bekannt ist und weiter unten beschrieben wird (siehe z. B. Sambrook et al., 1989). Wenn eine Nukleinsäure an eine Zielnukleinsäure mit unbekannter Sequenz hybridisiert wird, wird von der Hybridlänge angenommen, dass sie der der hybridisierenden Nukleinsäure entspricht. Wenn Nukleinsäuren mit bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge durch Alignment der Sequenzen der Nukleinsäuren und Identifizieren der Region oder der Regionen mit optimaler Sequenzkomplementarität ermittelt werden. Die Hybridisierungstemperatur für Hybride, von denen erwartet wird, dass sie weniger als 50 Basenpaare lang sind, sollte 5 bis 10 Grad Celsius niedriger als die Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids sein, wobei Tm entsprechend der folgenden Gleichungen bestimmt wird. Für Hybride, die weniger als 18 Basenpaare lang sind, Tm (Grad Celsius) = 2 (Anz. von A- + T-Basen) + 4 (Anz. von G- und C-Basen). Für Hybride, die mehr als 18 Basenpaare lang sind, Tm (Grad Celsius) = 81,5 + 16,6 (log₁₀[Na⁺]) + 0,41 (% G + C) – (600/N), wobei N die Anzahl der Basen im Hybrid ist und [Na⁺] die Konzentration von Natriumionen im Hybridisierungspuffer ist ([Na⁺] für 1 × SSC = 0,165 M). Vorzugsweise weist jede derartige hybridisierende Nukleinsäure eine Länge auf, die mindestens 15, 18, 20, 25, 30, 40 oder mehr bevorzugt 50 Nukleotide oder mindestens 25% (mehr bevorzugt mindestens 50% oder mindestens 60% oder mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 80%) der Länge der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, an die sie hybridisiert, ausmacht und mindestens 60% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5% oder mindestens 99% und am meisten bevorzugt mindestens 99,5%) mit der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, an die sie hybridisiert, aufweist, wobei die Sequenzidentität durch Vergleichen der Sequenzen der hybridisierenden Nukleinsäuren mittels Alignment bestimmt wird, um die Überlappung und Identität zu maximieren, während die Sequenzlücken minimiert werden, wie oben ausführlicher beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Gene bereit, die den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen entsprechen. „Entsprechende Gene" sind die Regionen des Genoms, die transkribiert werden, um die mRNAs zu produzieren, aus denen cDNA-Nukleinsäuresequenzen abgeleitet werden, und können aufeinanderfolgende Regionen des Genoms beinhalten, die für die regulierte Expression solcher Gene erforderlich sind. Entsprechende Gene können folglich kodierende Sequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, alternativ gespleißte Exons, Introns, Promotoren, Enhancer und Silencer- oder Suppressorelemente beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die entsprechenden Gene können gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzinformationen isoliert werden. Solche Verfahren beinhalten die Herstellung von Sonden oder Primer aus den offenbarten Sequenzinformationen zur Identifizierung und/oder Amplifikation von Genen in adäquaten genomischen Bibliotheken oder anderen Quellen genomischer Materialien. Ein „isoliertes Gen" ist ein Gen, das von den angrenzenden kodierenden Sequenzen, falls vorhanden, die in dem Genom des Organismus vorliegen, aus dem das Gen isoliert wurde, getrennt wurde.
Verfahren zum Herstellen und Reinigen von Claudinpolypeptiden der Erfindung
Verfahren zum Herstellen von Claudinpolypeptiden der Erfindung sind im Folgenden beschrieben. Die Expression, Isolierung und Reinigung der Polypeptide und Fragmente der Erfindung können mittels einer beliebigen geeigneten Technik erzielt werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der folgenden Verfahren.
Die isolierte Nukleinsäure der Erfindung kann operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft werden, wie den pMT2- oder pED-Expressionsvektoren, die in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991); und Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985), offenbart sind, um das Polypeptid rekombinant zu produzieren. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind in der Technik bekannt. Allgemeine Verfahren zum Exprimieren rekombinanter Polypeptide sind ebenfalls bekannt und sind in R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990), beispielhaft dargelegt. Wie hierin verwendet, bedeutet „operativ verknüpft", dass die Nukleinsäure der Erfindung und eine Expressionskontrollsequenz derart in einem Konstrukt, einem Vektor oder einer Zelle angeordnet sind, dass das Polypeptid, das von der Nukleinsäure kodiert wird, exprimiert wird, wenn adäquate Moleküle (wie Polymerasen) vorliegen. Als eine Ausführungsform der Erfindung ist mindestens eine Expressionskontrollsequenz mit der Nukleinsäure der Erfindung in einer rekombinanten Wirtszelle oder einem Nachkommen davon operativ verknüpft, wobei die Nukleinsäure und/oder die Expressionskontrollsequenz beispielsweise mittels Transformation oder Transfektion oder mittels eines beliebigen anderen geeigneten Verfahrens in die Wirtszelle eingeführt wurde. Als eine andere Ausführungsform der Erfindung ist mindestens eine Expressionskontrollsequenz derart in das Genom einer rekombinanten Wirtszelle integriert, dass sie operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist mindestens eine Expressionskontrollsequenz durch die Aktion eines transagierenden Faktors, wie eines Transkriptionsfaktors, entweder in vitro oder in einer rekombinanten Wirtszelle, operativ mit einer Nukleinsäure der Erfindung verknüpft.
Darüber hinaus kann eine Sequenz, die ein entsprechendes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodiert, in Expressionsvektoren eingebunden werden. Die Wahl des Signalpeptids oder Leaders kann von Faktoren wie der Art der Wirtszellen, in denen das rekombinante Polypeptid produziert werden soll, abhängen. Um dies zu veranschaulichen, zählen zu Beispielen heterologer Signalpeptide, die in Wirtszellen eines Säugetiers funktionell sind, die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), die in der US-Patentschrift 4,965,195 beschrieben ist; die Signalsequenz für Interleukin-2-Rezeptor, die in Cosman et al., Nature 312:768 (1984), beschrieben ist; das Interleukin-4-Rezeptor-Signalpeptid, das in EP 367,566 beschrieben ist; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in der US-Patentschrift 4,968,607 beschrieben ist; und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in EP 460,846 beschrieben ist. Eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) kann im Raster mit der Nukleinsäuresequenz der Erfindung fusioniert werden, so dass die DNA zunächst transkribiert und die mRNA translatiert wird, in ein Fusionspolypeptid, das das Signalpeptid umfasst. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktionell ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird bei Sekretion von Polypeptid aus der Zelle von dem Polypeptid abgespalten. Der gelernte Fachmann wird auch erkennen, dass die Position bzw. die Positionen, an der bzw. denen das Signalpeptid abgespalten wird, sich von der bzw. denen unterscheiden kann bzw. können, die von einem Computerprogramm vorhergesagt wurde bzw. wurden, und kann bzw. können entsprechend solcher Faktoren wie der Art der Wirtszellen, die beim Exprimieren eines rekombinanten Polypeptids eingesetzt werden, variieren. Eine Herstellung eines Polypeptids kann eine Mischung von Polypeptidmolekülen mit unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren beinhalten, die aus der Spaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle resultieren.
Etablierte Verfahren zum Einführen von DNA in Säugetierzellen wurden beschrieben (R.J. Kaufman, Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, S. 15-69). Weitere Protokolle, die im Handel erhältliche Reagenzien verwenden, wie Lipofectamine-Lipidreagenz (Gibco BRL) oder Lipofectamine-Plus-Lipidreagenz, können zum Transfizieren von Zellen verwendet werden (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987). Darüber hinaus kann Elektroporation zum Transfizieren von Säugetierzellen unter Anwendung herkömmlicher Vorgehensweisen verwendet werden, wie denen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Die Auswahl stabiler Transformanten kann unter Anwendung von in der Technik bekannter Verfahren vorgenommen werden, wie beispielsweise Resistenz gegenüber zytotoxischen Arzneimitteln. Kaufman et al., Meth. In Enzymology 185:487-511, 1990, beschreiben mehrere Auswahlschemata, wie Dihydrofolatreduktase-Resistenz (DHFR-Resistenz). Ein geeigneter Stamm zur DHFR-Auswahl kann der CHO-Stamm DX-B11 sein, dem es an DHFR mangelt (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). Ein Plasmid, das die DHFR-cDNA exprimiert, kann in den Stamm DX-B11 eingeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in den entsprechenden Selektivmedien wachsen. Zu anderen Beispielen selektierbarer Marker, die in einen Expressionsvektor eingebunden werden können, zählen cDNAs, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen, wie G418 und Hygromycin B. Zellen, die den Vektor beherbergen, können auf Grundlage der Resistenz gegenüber diesen Verbindungen ausgewählt werden.
Alternativ können Genprodukte über homologe Rekombinations- oder „Gen-Targeting"-Techniken erhalten werden. Solche Techniken setzen die Einführung exogener Transkriptionskontrollelemente (wie des CMV-Promotors oder dergleichen) in eine bestimmte vorherbestimmte Stelle an dem Genom ein, um die Expression der endogenen Nukleinsäuresequenz von Interesse zu induzieren. Die Position der Integration in ein Wirtschromosom oder -genom kann von einem Fachmann angesichts der bekannten Position und Sequenz des Gens einfach ermittelt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erwägt die vorliegende Erfindung auch die Einführung exogener Transkriptionskontrollsequenzen in Verbindung mit einem amplifizierbaren Gen, um erhöhte Mengen des Genprodukts zu produzieren, wiederum ohne Erfordernis einer Isolierung der Gensequenz selbst aus der Wirtszelle. Die Ausübung von homologer Rekombination oder Gen-Targeting wird von Schimke et al., „Amplification of Genes in Somatic Mammalian cells", Methods in Enzymology 151:85-104 (1987), sowie von Capecchi et al., „The New Mouse Genetics: Altering the Genome by Gene Targeting", TIG 5:70-76 (1989), erläutert.
Eine Reihe von Arten von Zellen kann als geeignete Wirtszellen zur Expression des Polypeptids fungieren. Zu Wirtszellen eines Säugetiers zählen beispielsweise die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), CHO-Zellen (CHO = chinese hamster ovary, Ovar des chinesischen Hamsters), HeLa-Zellen, BHK-Zelllinien (ATCC CRL 10), die CV1/EBNA-Zelllinie, die von der Zelllinie CV1 von Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze abgeleitet sind (ATCC CCL 70), wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben, menschliche 293-Nierenzellen, menschliche A431-Epidermiszellen, menschliche Colo205-Zellen, andere transformierte Zelllinien von Primaten, normale diploide Zellen, Zellstämme, die von einer in-vitro-Kultur primären Gewebes abgeleitet sind, primäre Explantate, HL-60, U937, HaK- oder Jurkat-Zellen. Alternativ kann es möglich sein, das Polypeptid in niederen Eukaryonten wie Hefe oder in Prokaryonten wie Bakterien zu produzieren. Zu potentiell geeigneten Hefestämmen zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces-Stämme, Candida oder ein beliebiger Hefestamm, der heterologe Polypeptide exprimieren kann. Zu potentiell geeigneten Bakterienstämmen zählen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium oder ein beliebiger Bakterienstamm, der heterologe Polypeptide exprimieren kann. Wenn das Polypeptid in Hefe oder Bakterien hergestellt wird, kann es erforderlich sein, das darin produzierte Polypeptid zu modifizieren, beispielsweise mittels Phosphorylierung oder Glykosylierung der entsprechenden Stellen, um das funktionelle Polypeptid zu erhalten. Solche kovalenten Anlagerungen können unter Anwendung bekannter chemischer oder enzymatischer Verfahren erzielt werden. Das Polypeptid kann auch produziert werden, indem die isolierte Nukleinsäure der Erfindung mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Expressionsvektoren von Insekten operativ verknüpft und ein Insektenexpressionssystem eingesetzt wird. Materialien und Verfahren für Baculovirus /Insektenzellexpressionssystemen sind in Kitform von Z. B. Invitrogen, San Diego, Kalif., USA (das MaxBac^®-Kit), im Handel erhältlich und solche Verfahren sind in der Technik wohl bekannt, wie in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987), und Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988), beschrieben. Wie hierin verwendet, ist eine Insektenzelle, die eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung exprimieren kann, „transformiert". Zellfreie Translationssysteme könnten auch eingesetzt werden, um Polypeptide unter Verwendung von RNAs, die von hierin offenbarten Nukleinsäurekonstrukten abgeleitet sind, zu produzieren. Eine Wirtszelle, die eine isolierte Nukleinsäure der Erfindung umfasst, vorzugsweise mit mindestens einer Expressionskontrollsequenz operativ verknüpft ist, ist eine „rekombinante Wirtszelle".
Das Polypeptid der Erfindung kann hergestellt werden, indem transformierte Wirtszellen unter Kulturbedingungen kultiviert werden, die dazu geeignet sind, das rekombinante Polypeptid zu exprimieren. Das resultierende exprimierte Polypeptid kann dann aus einer solchen Kultur (d. h. aus Kulturmedium oder Zellextrakten) unter Anwendung bekannter Reinigungsverfahren, wie Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie, gereinigt werden. Die Reinigung des Polypeptids kann auch eine Affinitätssäule beinhalten, die Agenzien enthält, die an das Polypeptid binden werden; einen oder mehrere Säulenschritte über derartige Affinitätsharze wie Concanavalin A/Agarose, Heparin/Toyopearl^® oder Cibacrom blue 3GA Sepharose^®; einen oder mehrere Schritte, die hydrophobe Interaktionschromatographie unter Verwendung solcher Harze wie Phenylether, Butylether oder Propylether beinhalten, oder Immunaffinitätschromatographie. Alternativ kann das Polypeptid der Erfindung auch in einer Form exprimiert werden, die die Reinigung erleichtern wird. Zum Beispiel kann es als ein Fusionspolypeptid exprimiert werden, wie die von Maltose bindendem Polypeptid (MBP), Glutathion-S-Transferase (GST) oder Thioredoxin (TRX). Kits zur Expression und Reinigung solcher Fusionspolypeptide sind von New England BioLab (Beverly, Mass., USA), Pharmacia (Piscataway, NJ., USA) bzw. InVitrogen erhältlich. Das Polypeptid kann auch mit einem Epitop markiert und anschließend unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers, der auf ein solches Epitop gerichtet ist, gereinigt werden. Ein solches Epitop („Flag") ist von Kodak (New Haven, Conn., USA) im Handel erhältlich. Schließlich können ein oder mehrere Schritte der Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (reverse-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC), die hydrophobe RP-HPLC-Medien einsetzen, z. B. Kieselgel mit seitenständigen Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, zum weiteren Reinigen des Polypeptids eingesetzt werden. Einige oder alle der vorstehenden Reinigungsschritte können auch in verschiedenen Kombinationen zum Bereitstellen eins im wesentlichen homogen isolierten rekombinanten Polypeptids eingesetzt werden. Das so gereinigte Polypeptid ist im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden eines Säugetiers und wird gemäß der vorliegenden Erfindung als ein „isoliertes Polypeptid" definiert; zu solchen isolierten Polypeptide der Erfindung zählen isolierte Antikörper, die an Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente, Varianten, Bindungspartner usw. binden. Das Polypeptid der Erfindung kann auch als ein Produkt transgener Tiere exprimiert werden, z. B. als ein Bestandteil der Milch transgener Kühe, Ziegen, Schweine oder Schafe, die sich durch Soma- oder Keimzellen auszeichnen, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die das Polypeptid kodiert.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu nutzen, die ein polypeptidbindendes Polypeptid der Erfindung umfasst, wie einen monoklonalen Antikörper, der gegen Polypeptide der Erfindung erzeugt wird, um exprimierte Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. Diese Polypeptide können aus einer Affinitätssäule unter Anwendung herkömmlicher Techniken, z. B. in einem Elutionspuffer mit hoher Salzkonzentration, entfernt werden und dann in einen Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration zur Verwendung dialysiert werden, oder durch Ändern des pH-Werts oder anderer Bestandteile in Abhängigkeit von der genutzten Affinitätsmatrix, oder unter Verwendung des natürlich vorkommenden Substrats des Affinitätsteils, wie eines von der Erfindung abgeleiteten Polypeptids, kompetitiv entfernt werden. In diesem Gesichtspunkt der Erfindung können polypeptidbindende Polypeptide, wie die Anti-Polypeptid-Antikörper der Erfindung, oder andere Polypeptide, die mit dem Polypeptid der Erfindung interagieren können, an einen Festphasenträger, wie einer Säulenchromatographiematrix oder einem ähnlichen Substrat, das zum Identifizieren, Trennen oder Reinigen von Zellen, die Polypeptide der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimieren, geeignet sind, gebunden werden. Die Anlagerung von polypeptidbindenden Polypeptiden der Erfindung an eine Festphasenkontaktoberfläche kann mit einem beliebigen Mittel erzielt werden, zum Beispiel können magnetische Mikrosphären mit diesen polypeptidbindenden Polypeptiden beschichtet und durch ein Magnetfeld in dem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen werden mit der Festphase in Kontakt gebracht, auf der sich solche polypeptidbindenden Polypeptide befinden. Zellen, die Polypeptide der Erfindung auf ihrer Oberfläche aufweisen, binden an das fixierte polypeptidbindende Polypeptid und ungebundene Zellen werden dann weggespült. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist zum Reinigen, Screenen oder Trennen solcher Polypeptide exprimierenden Zellen aus Lösung geeignet. Verfahren zum Freisetzen positiv selektierter Zellen aus der Festphase sind in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise nicht toxisch und nicht schädlich für die Zellen und werden vorzugsweise auf das Spalten der Zelloberflächenbindungspartner gerichtet. Alternativ können Mischungen von Zellen, von denen vermutet wird, dass sie Polypeptide exprimierende Zellen der Erfindung enthalten, zunächst mit einem biotinylierten, polypeptidbindenden Polypeptid der Erfindung inkubiert werden. Die Inkubationszeiträume sind in der Regel über eine Dauer von mindestens einer Stunde, um eine ausreichende Bindung an Polypeptide der Erfindung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule geleitet, die mit mit Avidin beschichteten Kügelchen gepackt ist, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin für die Bindung der polypeptidbindenden Zellen an die Kügelchen sorgt. Die Verwendung von mit Avidin beschichteten Kügelchen ist in der Technik bekannt. Siehe Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). Das Auswaschen von ungebundenem Material und das Freisetzen der gebundenen Zellen werden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt.
Das Polypeptid kann auch mittels bekannter herkömmlicher chemischer Synthese produziert werden. Verfahren zum Konstruieren der Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch Synthesemittel sind Fachleuten bekannt. Die synthetisch konstruierten Polypeptidsequenzen können aufgrund dessen, dass sie mit Polypeptiden primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur- und/oder Konformationscharakteristika gemein haben, über mit diesen gemeine biologische Eigenschaften verfügen, einschließlich Polypeptid-Aktivität. Folglich können sie als biologisch aktive oder immunologische Substitute für natürliche, gereinigte Polypeptide beim Screenen auf therapeutische Verbindungen und in immunologischen Verfahren zur Entwicklung von Antikörpern eingesetzt werden.
Der gewünschte Reinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Verwendung des Polypeptids ab. Ein verhältnismäßig hoher Reinheitsgrad ist erwünscht, wenn das Polypeptid beispielsweise in vivo verabreicht werden soll. In einem solchen Fall werden die Polypeptide derart gereinigt, dass bei einer Analyse mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) keine Polypeptid-Banden, die anderen Polypeptiden entsprechen, nachweisbar sind. Ein Fachmann der einschlägigen Technik wird erkennen, dass mehrere Banden, die dem Polypeptid entsprechen, mittels SDS-PAGE aufgrund anderer Glykosylierung, anderer posttranslationaler Verarbeitung und dergleichen sichtbar gemacht werden können. Am meisten bevorzugt wird das Polypeptid der Erfindung zur substantiellen Homogenität gereinigt, wie durch eine einzige Polypeptid-Bande bei Analyse mittels SDS-PAGE angezeigt. Die Polypeptid-Bande kann mittels Silberfärbung, Coomassie-Blau-Färbung oder (wenn das Polypeptid radioaktiv markiert ist) mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
Antagonisten und Agonisten von Claudinpolypeptiden der Erfindung
Ein beliebiges Verfahren, das Claudinpolypeptide der Erfindung neutralisiert oder die Expression des humanen Claudin-21-Gens (entweder Transkription oder Translation) hemmt, kann zum Verringern der biologischen Aktivitäten von Claudinpolypeptiden der Erfindung verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen hemmen Antagonisten die Bindung mindestens eines humanen Claudin-21-Polypeptids an Bindungspartner, die auf Zellen exprimiert werden, wodurch die biologischen Aktivitäten, die von der Bindung jener Claudinpolypeptide der Erfindung an die Zellen induziert werden, gehemmt werden. In bestimmten anderen Ausführungsformen der Erfindung können Antagonisten dazu entworfen werden, das Ausmaß der Expression endogenen humanen Claudin-21-Gens zu verringern, z. B. unter Verwendung wohl bekannter Antisense- oder Ribozym-Ansätze, um die Translation von mRNA-Transkripten von humanem Claudin-21 zu hemmen oder zu verhindern; Tripelhelix-Ansätze, um die Transkription des humanen Claudin-21-Gens zu hemmen; oder targetierter homologer Rekombination, um das humane Claudin-21-Gen oder seine endogenen Promotoren oder Enhancer-Elemente zu deaktivieren oder „auszuknocken" („Knock-out"). Solche Antisense-, Ribozym- und Triple-Helix-Antagonisten (Tripelhelix-Antagonisten) können dazu entworfen werden, die Aktivität von entweder unbeeinträchtigtem oder, falls zutreffend, mutiertem humanem Claudin-21-Gen zu verringern oder zu hemmen. Techniken zur Produktion und Verwendung solcher Moleküle sind Fachleuten wohl bekannt.
Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle wirken dahingehend, die Translation von mRNA zu blockieren, indem sie an targetierte mRNA hybridisieren und die Polypeptidtranslation verhindern. Antisense-Ansätze beinhalten das Design von Oligonukleotiden (entweder DNA oder RNA), die zu einer mRNA von humanem Claudin-21 komplementär sind. Die Antisense-Oligonukleotide werden an die komplementären Zielgen-mRNA-Transkripte binden und die Translation verhindern. Eine absolute Komplementarität, obgleich bevorzugt, ist nicht erforderlich. Eine Sequenz, die zu einem Abschnitt einer Nukleinsäure „komplementär" ist, wie hierin erwähnt, steht für eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um mit der Nukleinsäure hybridisieren zu können, wodurch ein stabiler Duplex (oder Triplex, wie jeweils anwendbar) gebildet wird. Im Fall von doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein einziger Strang der Duplex-DNA getestet werden oder es kann die Triplexbildung geprüft werden. Die Fähigkeit zum Hybridisieren wird von sowohl dem Komplementaritätsgrad als auch der Länge der Antisense-Nukleinsäure abhängen. Oligonukleotide, die zu dem 5'-Ende der Message komplementär sind, z. B. der 5'-untranslatierten Sequenz bis zu und einschließlich des AUG-Initiationscodons, sollten beim Hemmen der Translation am wirksamsten arbeiten. Oligonukleotide, die zu entweder der 5'- oder der 3'-untranslatierten, nichtkodierenden Region des humanen Claudin-21-Gentranskripts komplementär sind, könnten jedoch in einem Antisense-Ansatz verwendet werden, um die Translation von endogener humaner Claudin-21-mRNA zu hemmen. Oligonukleotide, die zu der 5'-untranslatierten Region der mRNA komplementär sind, sollten das Komplement des AUG-Startcodons enthalten. Antisense-Nukleinsäuren sollten mindestens sechs Nukleotide lang sein und sind vorzugsweise Oligonukleotide, deren Länge von 6 bis etwa 50 Nukleotide reicht. In spezifischen Gesichtspunkten macht das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide oder mindestens 50 Nukleotide aus. Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimäre Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon sein, einzelsträngig oder doppelsträngig. Das Oligonukleotid kann beispielsweise am Basenteil, am Zuckerteil oder an der Phosphathauptkette modifiziert sein, um die Stabilität des Moleküls, die Hybridisierung usw. zu verbessern. Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen wie Peptide (z. B. zum Targetieren von Wirtzellrezeptoren in vivo) oder Agenzien, die den Transport über die Zellmembran erleichtern (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556); Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT-Veröffentlichung Nr. WO88/09810 , veröffentlicht am 15. Dez. 1988), oder von Hybridisierung ausgelöste Spaltungsagenzien oder interkalierende Agenzien enthalten. (Siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Die Antisense-Moleküle sollten an Zellen abgegeben werden, die das humane Claudin-21-Transkript in vivo exprimieren. Eine Reihe von Verfahren wurde zum Abgeben von Antisense-DNA oder -RNA an Zellen entwickelt; z. B. können Antisense-Moleküle direkt in das Gewebe oder die Zellursprungsstelle injiziert werden, oder modifizierte Antisense-Moleküle, die dazu entworfen sind, die gewünschten Zellen zu targetieren (z. B. Antisense, die mit Peptiden oder Antikörpern verbunden sind, die spezifisch Rezeptoren oder Antigene binden, die auf der Zielzelloberfläche exprimiert werden), können systemisch verabreicht werden. Es ist jedoch häufig schwierig, intrazelluläre Konzentrationen des Antisense zu erzielen, die zum Unterdrücken der Translation endogener mRNAs ausreichen. Folglich nutzt ein bevorzugter Ansatz ein rekombinantes DNA-Konstrukt, in dem das Antisense-Oligonukleotid unter die Kontrolle eines starken pol-III- oder pol-II-Promotors gestellt wird. Die Verwendung eines solchen Konstrukts zum Transfizieren von Zielzellen in dem Patienten wird in der Transkription ausreichender Mengen einzelsträngiger RNAs resultieren, die mit den endogenen humanen Claudin-21-Gentranskripten komplementäre Basenpaare bilden werden und dadurch die Translation der humanen Claudin-21-mRNA verhindern. Zum Beispiel kann ein Vektor derart in vivo eingeführt werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird und die Transkription einer Antisense-RNA steuert. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Solche Vektoren können mittels rekombinanter DNA-Technologie-Verfahren, die in der Technik der Standard sind, konstruiert werden. Die Vektoren können Plasmidvektoren, virale Vektoren oder andere in der Technik bekannte Vektoren sein, die zur Replikation und Expression in Säugetierzellen verwendet werden.
Ribozymmoleküle, die zum katalytischen Spalten humaner Claudin-21-Transkripte entworfen sind, können ebenfalls zum Verhindern der Translation humaner Claudin-21-mRNA und der Expression von Claudinpolypeptiden der Erfindung verwendet werden. (Siehe z. B. internationale PCT-Veröffentlichung WO90/11364 , veröffentlicht am 4. Okt. 1990; US-Patentschrift Nr. 5,824,519 ). Zu den Ribozymen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, zählen Hammerhead-Ribozyme (Haseloff und Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591), RNA-Endoribonukleasen (hierin im folgenden „Ribozyme des Cech-Typs"), wie das Ribozym, das von Natur aus in Tetrahymena thermophila vorkommt (als die IVS- oder L-19-IVS-RNA bekannt) und von Thomas Cech und Mitarbeitern (internationale Patentanmeldung Nr. Wo 88/04300; Been und Cech, 1986, Cell, 47:207-216) ausführlich beschrieben wurde. Wie im Antisense-Ansatz können die Ribozyme sich aus modifizierten Oligonukleotiden zusammensetzen (z. B. für eine verbesserte Stabilität, Targetierung usw.) und sollten an Zellen abgegeben werden, die das humane Claudin-21-Polypeptid in vivo exprimieren. Ein bevorzugtes Abgabeverfahren beinhaltet die Verwendung eines DNA-Konstrukts, das das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven pol-III- oder pol-II-Promotors „kodiert", so dass transfizierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms produzieren werden, um Messages von endogenem humanem Claudin-21 zu zerstören und die Translation zu hemmen. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch sind, ist aus Gründen der Wirksamkeit eine niedrigere intrazelluläre Konzentration erforderlich.
Alternativ kann die Expression von endogenem humanem Claudin-21-Gen durch Targetieren von Desoxyribonukleotidsequenzen, die zu der Regulationsregion des Zielgens (d. h. dem Zielgenpromotor und/oder den Zielgen-Enhancern) komplementär sind, um Tripelhelixstrukturen zu bilden, die die Transkription des humanen Claudin-21 Zielgens verhindern, verringert werden. (Siehe allgemein Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36; und Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815).
Antisense-RNA und -DNA, Ribozym und Tripelhelixmoleküle der Erfindung können mittels eines beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das in der Technik zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen bekannt ist. Zu diesen zählen Techniken zum chemischen Synthetisieren von Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, die in der Technik wohl bekannt sind, wie beispielsweise chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese. Oligonukleotide können mittels in der Technik bekannten Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. durch Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten (wie sie von Biosearch, Applied Biosystems, usw. im Handel erhältlich sind). Als Beispiele können Phosphorthioat-Oligonukleotide mit dem Verfahren von Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209, synthetisiert werden. Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch Verwendung von Controlled-Pore-Glass-Polymerträgern hergestellt werden (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451). Alternativ können RNA-Moleküle mittels In-vitro- und In-vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die das Antisense-RNA-Molekül kodieren, erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine große Vielfalt an Vektoren eingebunden werden, die geeignete RNA-Polymerase-Promotoren, wie die T7- oder SP6-Polymerase-Promotoren) integrieren. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, je nach dem verwendeten Promotor, stabil in Zelllinien eingeführt werden.
Die Expression von endogenem Zielgen kann auch reduziert werden, indem das Zielgen oder dessen Promotor unter Anwendung targetierter homologer Rekombination deaktiviert oder „ausgeknockt" („Knock-out") wird (z. B. siehe Smithies et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas und Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson et al., 1989, Cell 5, 313-321). Zum Beispiel kann ein mutiertes, nicht funktionelles Zielgen (oder eine vollständig unverwandte DNA-Sequenz), das von DNA flankiert wird, die zu dem endogenen Zielgen (entweder den kodierenden Regionen oder den Regulationsregionen des Zielgens) homolog ist, verwendet werden, mit oder ohne einen selektierbaren Marker und/oder einen negativen selektierbaren Marker, um Zellen zu transfizieren, die das Zielgen in vivo exprimieren. Die Insertion des DNA-Konstrukts mittels targetierter homologer Rekombination resultiert in der Deaktivierung des Zielgens. Solche Ansätze sind insbesondere für das Gebiet der Landwirtschaft, in dem Modifikationen von ES-Zellen (embryonale Stammzellen) zum Erzeugen von Tiernachkommenschaft mit einem inaktiven Zielgen (z. B. siehe Thomas und Capecchi, 1987, und Thompson, 1989, oben) verwendet werden können, oder in Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans, in denen die „RNA-Interferenz"-Technik („RNAi"-Technik) (A. Grishok, H. Tabara und C.C. Mello, 2000, Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans, Science 287 (5462):2494-2497) oder die Einführung von Transgenen (A.F. Dernburg, J. Zalevsky, M.P. Colaiacovo und A.M. Villeneuve, 2000, Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line, Genes Dev. 14 (13): 1578-1583) angewendet wird, um die Expression spezifischer Zielgene zu hemmen, geeignet. Dieser Ansatz kann jedoch zur Verwendung in Menschen angepaßt werden, vorausgesetzt, die rekombinanten DNA-Konstrukte werden direkt unter Verwendung adäquater viraler Vektoren in vivo an die erforderliche Stelle verabreicht oder diese wird direkt targetiert.
Organismen, die eine verstärkte, verringerte oder modifizierte Expression des Gens bzw. der Gene aufweisen, das bzw. die den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen entspricht bzw. entsprechen, werden bereitgestellt. Die gewünschte Änderung der Genexpression kann durch Verwendung von Antisense-Nukleinsäuren oder Ribozymen, die die mRNA, die von dem Gen transkribiert wird, binden und/oder spalten, erzielt werden (Albert und Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15(7): 250-254; Lavarosky et al., 1997, Biochem. Mol. Med. 62(1): 11-22; und Hampel, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1-39). Transgene Tiere, die mehrere Kopien des Gens bzw. der Gene, das bzw. die den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen entspricht bzw. entsprechen, aufweisen, die vorzugsweise mittels Transformation von Zellen mit genetischen Konstrukten produziert wurden und die in den transformierten Zellen und deren Nachkommenschaft stabil aufrechterhalten werden, werden bereitgestellt. Transgene Tiere, die modifizierte Regionen der genetischen Kontrolle aufweisen, die die Genexpressionsniveaus erhöhen oder verringern oder die Zeit- oder Raummuster der Genexpression ändern, werden ebenfalls bereitgestellt (siehe europäisches Patent Nr. 0 649 464 B1 ). Darüber hinaus werden Organismen bereitgestellt, in denen das Gen bzw. die Gene, das bzw. die den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen entspricht bzw. entsprechen, durch Insertion von Fremdsequenzen in das entsprechende Gen bzw. die entsprechenden Gene oder durch Deletion des gesamten oder eines Teils des entsprechenden Gens bzw. der gesamten oder eines Teils der entsprechenden Gene zum Teil oder vollständig deaktiviert wurde bzw. wurden. Eine partielle oder vollständige Deaktivierung kann durch Insertion von transposiblen Elementen, auf die vorzugsweise eine unpräzise Exzision dieser folgt (Plasterk, 1992, Bioessays 14(9): 629-633; Zwaal et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(16): 7431-7435; Clark et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(2): 719-722), oder durch homologe Rekombination, vorzugsweise mittels Strategien positiver/negativer genetischer Auswahl nachgewiesen (Mansour et al., 1988, Nature 336: 348-352; US-Pat. Nr. 5,464,764 ; 5,487,992 ; 5,627,059 ; 5,631,153 ; 5,614,396 ; 5,616,491 und 5,679,523 ), erzielt werden. Diese Organismen mit veränderter Genexpression sind vorzugsweise Eukaryonten und sind mehr bevorzugt Säugetiere. Solche Organismen sind zur Entwicklung von nichtmenschlichen Modellen zur Studie von Erkrankungen, die das entsprechende Gen bzw. die entsprechenden Gene beinhalten, und zur Entwicklung von Assaysystemen zur Identifizierung von Molekülen, die mit dem Polypeptidprodukt bzw. den Polypeptidprodukten des entsprechenden Gens bzw. der entsprechenden Gene interagieren, von Nutzen.
Die Claudinpolypeptide der Erfindung selbst können ebenfalls beim Hemmen einer biologischen Aktivität von humanem Claudin-21 in In-vitro- oder In-vivo-Verfahren eingesetzt werden. Von der Erfindung umfasst sind extrazelluläre Loop-Domänen von Claudinpolypeptiden der Erfindung, die als „dominant-negative" Inhibitoren der Funktion von nativem humanem Claudin-21-Polypeptid agieren, wenn sie als Fragmente oder als Bestandteile von Fusionspolypeptiden exprimiert werden. Zum Beispiel kann eine Domäne eines gereinigten Polypeptids der vorliegenden Erfindung zum Hemmen der Bindung von Claudinpolypeptiden der Erfindung an endogene Bindungspartner verwendet werden. Eine derartige Verwendung würde effektiv die Interaktionen von humanem Claudin-21-Polypeptid blockieren und die Aktivitäten von humanem Claudin-21-Polypeptid hemmen. In noch einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung wird eine lösliche Form des Bindungspartners von humanem Claudin-21, das auf Epithel- und/oder Endothelzellen exprimiert wird, dazu verwendet, an endogenes humanes Claudin-21-Polypeptid zu binden und die Aktivierung dieses kompetitiv zu hemmen. Des Weiteren hemmen Antikörper, die an Claudinpolypeptide der Erfindung binden, oftmals die Aktivität von humanem Claudin-21 und agieren als Antagonisten. Zum Beispiel können Antikörper, die ein oder mehrere Epitope von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Epitope konservierter Varianten von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Peptidfragmente des humanen Claudin-21-Polypeptids spezifisch erkennen, in der Erfindung zum Hemmen der Aktivität von humanem Claudin-21 verwendet werden. Solche Antikörper beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelkettenantikörper, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek produziert werden, antiidiotypische Antikörper (Anti-Id-Antikörper) und Epitop bindende Fragmente eines beliebigen der obigen. Alternativ können gereinigte und modifizierte Claudinpolypeptide der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, um Interaktionen zwischen Claudinpolypeptiden der Erfindung und Bindungspartnern von humanem Claudin-21, die nicht membrangebunden sind, zu modulieren. Ein solcher Ansatz wird ein alternatives Verfahren zur Modifikation der beeinflußten Bioaktivität von humanem Claudin-21 ermöglichen.
In einem alternativen Gesichtspunkt umfasst die Erfindung weiterhin die Verwendung von Agonisten der Aktivität von humanem Claudin-21 zum Behandeln oder Lindern der Symptome einer Erkrankung, für die eine erhöhte Aktivität von humanem Claudin-21 vorteilhaft ist. Solche Erkrankungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Entzündung, Asthma, Allergie, Metastasen von Krebszellen, Ionentransporterkrankungen wie Magnesiumtransportdefekte in der Niere, entzündliche Darmerkrankung, Kontakt mit Clostridium perfringens-Enterotoxin (CPE), plötzliches Kindstod-Syndrom (plötzlicher Kindstod, sudden infant death syndrome, SIDS), multiple Sklerose (MS), autoimmune Enzephalomyelitis, Optikusneuritis, progressive multifokale Leukoenzephalopathie (PML). In einem bevorzugten Gesichtspunkt bringt die Erfindung das Verabreichen von Zusammensetzungen, die eine humane Claudin-21-Nukleinsäure oder ein humanes Claudin-21-Polypeptid umfasst, an Zellen in vitro, an Zellen ex vivo, an Zellen in vivo und/oder an einen mehrzelligen Organismus mit sich. Bevorzugte therapeutische Formen von humanem Claudin-21 sind lösliche Formen, wie oben beschrieben. In noch einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung umfassen die Zusammensetzungen das Verabreichen einer humanes Claudin-21 kodierenden Nukleinsäure zur Expression eines humanen Claudin-21-Polypeptids in einem Wirtsorganismus zur Behandlung einer Erkrankung. In dieser Hinsicht ist die Expression in einem menschlichen Patienten zur Behandlung einer Dysfunktion, die mit abweichender (z. B. verringerter) endogener Aktivität eines humanen Claudin-21-Polypeptids assoziiert wird, besonders bevorzugt. Darüber hinaus umfasst die Erfindung die Verabreichung von Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie die endogene Aktivität von Claudinpolypeptiden der Erfindung erhöhen, an Zellen und/oder Organismen. Ein Beispiel von Verbindungen, die die Aktivität von humanem Claudin-21-Polypeptid erhöhen, sind agonistische Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, die an Claudinpolypeptide der Erfindung oder Bindungspartner binden, die die Aktivität von humanem Claudin-21-Polypeptid erhöhen können, indem sie eine konstitutive intrazelluläre Signalisierung (oder „Ligandennachahmung") bewirken oder indem sie die Bindung eines nativen Inhibitors der Aktivität von humanem Claudin-21-Polypeptid verhindern.
Antikörper zu Claudinpolypeptiden der Erfindung
Antikörper, die mit den Polypeptiden der Erfindung immunreaktiv sind, werden hierin bereitgestellt. Solche Antikörper binden über die Antigenbindungsstellen des Antikörpers spezifisch an die Polypeptide (im Gegensatz zu unspezifischer Bindung). In der vorliegenden Erfindung sind spezifisch bindende Antikörper jene, die Claudinpolypeptide der Erfindung, Homologa und Varianten, jedoch nicht andere Moleküle spezifisch erkennen und mit diesen spezifisch binden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung spezifisch und kreuzreagieren mit anderen Polypeptiden nicht. Auf diese Art und Weise können die Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente, Varianten, Fusionspolypeptide usw., wie oben dargelegt, als „Immungene" beim Produzieren von Antikörpern, die damit immunreaktiv sind, eingesetzt werden.
Genauer gesagt enthalten die Polypeptide, das Fragment, die Varianten, die Fusionspolypeptide usw. Antigendeterminanten oder Epitope, die die Bildung von Antikörpern auslösen. Diese Antigendeterminanten oder Epitope können entweder linear oder konformativ (diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope bestehen aus einer einzigen Sektion von Aminosäuren des Polypeptids, während konformative oder diskontinuierliche Epitope aus Aminosäurensektionen aus verschiedenen Regionen der Polypeptidkette bestehen, die bei der Polypeptidfaltung in unmittelbare Nähe gebracht werden (C.A. Janeway, Jr., und P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2. Ausg. 1996)). Da gefaltete Polypeptide komplexe Oberflächen aufweisen, ist die Anzahl verfügbarer Epitope recht zahlreich; aufgrund der Konformation des Polypeptids und sterischer Hinderungen ist die Anzahl der Antikörper, die tatsächlich an Epitope binden, jedoch geringer als die Anzahl verfügbarer Epitope (C.A. Janeway, Jr., und P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2. Ausg. 1996)). Epitope können mittels eines beliebigen der in der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden. Folglich betrifft ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung antigene Epitope der Polypeptide der Erfindung. Solche Epitope sind zum Züchten von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern von Nutzen, wie im Folgenden ausführlicher beschrieben. Darüber hinaus können Epitope von den Polypeptiden der Erfindung als Forschungsreagenzien, in Assays und zum Reinigen spezifisch bindender Antikörper aus Substanzen wie polyklonalen Seren oder Überständen aus kultivierten Hybridomen verwendet werden. Solche Epitope oder Varianten davon können unter Anwendung von in der Technik wohl bekannten Techniken, wie Festphasensynthese, chemische oder enzymatische Spaltung eines Polypeptids, oder unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie produziert werden.
Was die Antikörper angeht, die von den Epitopen der Polypeptide der Erfindung ausgelöst werden können, ob die Epitope nun isoliert wurden oder ein Teil der Polypeptide bleiben, können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mittels herkömmlicher Techniken hergestellt werden. Siehe beispielsweise Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York (1980); und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Land (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Kohler und Mistein ( US-Pat. Nr. 4,376,110 ); die Technik mit humanem B-Zellhybridom (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) und die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Hybridomzelllinien, die monoklonale Antikörper produzieren, die für die Polypeptide der Erfindung spezifisch sind, werden hierin ebenfalls in Erwägung gezogen. Solche Hybridome können mittels herkömmlicher Techniken produziert und identifiziert werden. Das Hybridom, das den mAb dieser Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen Titern von mAbs in vivo macht dies zu dem gegenwärtig bevorzugten Produktionsverfahren. Ein Verfahren zum Produzieren einer solchen Hybridomzelllinie umfasst das Immunisieren eines Tiers mit einem Polypeptid; das Ernten von Milzzellen aus dem immunisierten Tier; das Fusionieren der Milzzellen mit einer Myelomzelllinie, wodurch Hybridomzellen erzeugt werden; und das Identifizieren einer Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der das Polypeptid bindet. Zur Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere mittels Injektion mit einem oder mehreren der folgenden immunisiert werden: einem humanen Claudin-21-Polypeptid, einem Fragment eines humanen Claudin-21-Polypeptids, einem funktionellen Äquivalent eines humanen Claudin-21-Polypeptids oder einer mutierten Form eines humanen Claudin-21-Polypeptids. Solche Wirtstiere können Kaninchen, Mäuse und Ratten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Verschiedene Adjuvantien können zum Steigern der immunologischen Antwort verwendet werden, je nach der Wirtsspezies, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Freunds (komplettes und inkomplettes) Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Dinitrophenol und potentiell geeignete menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacillus Calmette-Guérin) und Corynebacterium parvum. Die monoklonalen Antikörper können mittels herkömmlicher Techniken gewonnen werden. Solche monoklonalen Antikörper können von einer beliebigen Immunglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgB, IgA, IgD und eine beliebige Unterklasse davon.
Darüber hinaus können Techniken, die zur Produktion von „chimären Antikörpern" (Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454) entwickelt wurden, indem die Gene von einem Maus-Antikörpermolekül mit adäquater Antigenspezifität zusammen mit Genen von einem humanen Antikörpermolekül mit adäquater biologischer Aktivität gespleißt werden, verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet sind, wie jene mit einer variablen Region, die von einem mAb vom Schwein abgeleitet sind, und einer konstanten Region von humanem Immunglobulin. Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung beinhalten auch humanisierte Versionen von murinen monoklonalen Antikörpern. Solche humanisierte Antikörper können mittels bekannter Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer verringerten Immunogenizität, wenn die Antikörper an Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform umfasst ein humanisierter monoklonaler Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur die Antigenbindungsstelle davon) und eine konstante Region, die von einem humanen Antikörper abgeleitet ist. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment die Antigenbindungsstelle eines murinen monoklonalen Antikörpers und ein Fragment einer variablen Region (dem die Antigenbindungsstelle fehlt), das von einem humanen Antikörper abgeleitet ist, umfassen. Zu Verfahren zur Produktion von chimären und weiter gentechnisch manipulierten monoklonalen Antikörpern zählen die in Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989) und Winter und Harris (TIPS 14:139, Kan., 1993) beschriebenen. Verfahren zum transgenen Erzeugen von Antikörpern lassen sich in GB 2,272,440 , den US-Patentschriften Nr. 5,569,825 und 5,545,806 und verwandten Patenten, die davon Priorität in Anspruch nehmen, finden. Vorzugsweise sind die Antikörper zur Verwendung in Menschen human oder humanisiert; Techniken zum Erzeugen solcher humaner oder humanisierter Antikörper sind ebenfalls wohl bekannt und sind beispielsweise von Medarex Inc. (Princeton, NJ, USA) und Abgennix Inc. (Fremont, CA, USA) im Handel erhältlich.
Antigenbindende Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können mittels bekannter Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel beinhalten solche Fragmente, sind jedoch nicht darauf beschränkt: die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken der (ab')2-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281), um eine schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen. Für die Produktion von Einzelkettenantikörpern beschriebene Techniken ( US-Pat. Nr. 4,946,778 ; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; und Ward et al., 1989, Nature 334:544-546) können ebenfalls zum Produzieren von Einzelkettenantikörpern gegen humane Claudin-21-Genprodukte angepaßt werden. Einzelkettenantikörper werden durch Verknüpfen der Fragmente der schweren und der leichten Kette der Fv-Region über eine Aminosäurenbrücke gebildet, was in einem Einzelkettenpolypeptid resultiert. Darüber hinaus können Antikörper zu dem humanen Claudin-21-Polypeptid wiederum zum Erzeugen von Antiidiotypantikörpern, die das humane Claudin-21-Polypeptid „nachahmen" und die an das humane Claudin-21-Polypeptid binden können, unter Anwendung von Fachleuten wohl bekannter Techniken genutzt werden. (Siehe z. B. Greenspan & Bona, 1993, FASER J. 7(5):437-444; und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).
Screening-Verfahren, mit denen solche Antikörper identifiziert werden können, sind wohl bekannt und können beispielsweise Immunaffinitätschromatographie beinhalten. Antikörper können auf agonistische (La, Liganden nachahmende) Eigenschaften gescreent werden. Solche Antikörper induzieren bei Bindung an humanes Claudin-21 an der Zelloberfläche biologische Effekte (z. B. die Transduktion biologischer Signale), die den biologischen Effekten ähnlich sind, die induziert werden, wenn der Bindungspartner von humanem Claudin-21 an humanes Claudin-21 an der Zelloberfläche bindet. Agonistische Antikörper können zum Induzieren von durch humanes Claudin-21 vermittelten Stimulationswegen oder interzellulärer Kommunikation verwendet werden.
Diese Antikörper, die die Bindung der Claudinpolypeptide der Erfindung an Bindungspartner für humanes Claudin-21 blockieren können, können zum Hemmen von durch humanes Claudin-21 vermittelter interzellulärer Kommunikation oder Kostimulation, die aus derartiger Bindung resultiert, verwendet werden. Solche blockierenden Antikörper können unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Assayvorgangs identifiziert werden, wie durch Prüfen von Antikörpern auf die Fähigkeit, die Bindung von humanem Claudin-21 an bestimmte Zellen, die einen Bindungspartner von humanem Claudin-21 exprimieren, zu hemmen. Alternativ können blockierende Antikörper in Assays aufgrund der Fähigkeit, einen biologischen Effekt, der aus der Bindung von humanem Claudin-21 an Zielzellen resultiert, zu hemmen, identifiziert werden. Antikörper können beispielsweise auf die Fähigkeit, von einem Bindungspartner von humanem Claudin-21 vermittelte Stimulationswege zu hemmen, geprüft werden. Ein solcher Antikörper kann in einem In-vitro-Verfahren eingesetzt werden oder in vivo verabreicht werden, um eine biologische Aktivität zu hemmen, die von der Einheit vermittelt wird, die den Antikörper erzeugte. Von der Interaktion von humanem Claudin-21 mit einem Zelloberflächenbindungspartnerrezeptor (direkt oder indirekt) bewirkte oder verschlimmerte Erkrankungen können somit behandelt werden. Ein therapeutisches Verfahren beinhaltet die In-vivo-Verabreichung eines blockierenden Antikörpers an ein Säugetier in einer Menge, die zum Hemmen der von einem Bindungspartner von humanem Claudin-21 vermittelten biologischen Aktivität wirksam ist. Monoklonale Antikörper sind im Allgemeinen zur Verwendung in solchen therapeutischen Verfahren bevorzugt In einer Ausführungsform wird ein antigenbindendes Antikörperfragment eingesetzt. Zusammensetzungen, die einen Antikörper, der gegen humanes Claudin-21 gerichtet ist, und ein physiologisch unbedenkliches Verdünnungsmittel, ein physiologisch unbedenkliches Hilfsmittel oder einen physiologisch unbedenklichen Trägerstoff umfassen, werden hierin bereitgestellt. Geeignete Bestandteile solcher Zusammensetzungen sind im Folgenden für Zusammensetzungen, die Claudinpolypeptide der Erfindung enthalten, beschrieben.
Außerdem werden hierin Konjugate bereitgestellt, die ein nachweisbares Mittel (z. B. Diagnostikum) oder Therapeutikum umfassen, das an dem Antikörper angelagert ist. Beispiele solcher Mittel sind oben dargestellt. Die Konjugate finden in In-vitro- oder In-vivo-Verfahren Anwendung. Die Antikörper der Erfindung können auch in Assays verwendet werden, um das Vorliegen der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung nachzuweisen, entweder in vitro oder in vivo. Die Antikörper können auch beim Reinigen von Polypeptiden oder Fragmenten der Erfindung mittels Immunaffinitätschromatographie eingesetzt werden.
Rationa les Design von Verbindungen, die mit Claudinpolypeptiden der Erfindung interagieren
Das Ziel rationalen Arzneimitteldesigns besteht darin, Strukturanaloga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse oder kleiner Moleküle, mit denen sie interagieren, z. B. Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten usw., zu produzieren. Ein beliebiges dieser Beispiele kann dazu verwendet werden, Arzneimittel zu gestalten, die aktivere oder stabilere Formen des Polypeptids sind oder die die Funktion eines Polypeptids in vivo verstärken oder stören (J. Hodgson (1991), Biotechnology 9:19-21). In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur eines Polypeptids von Interesse oder eines Polypeptid/Inhibitor-Komplexes mittels Röntgenkristallographie, mittels Kernspinresonanz oder mittels Homologiecomputermodellbildung oder am typischsten mit einer Kombination dieser Ansätze ermittelt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur aufzuklären und eine aktive Stelle bzw. aktive Stellen des Moleküls zu ermitteln. Weniger häufig können nützliche Informationen in Bezug auf die Struktur eines Polypeptids durch Modellbildung auf Grundlage der Struktur homologer Polypeptide gewonnen werden. In beiden Fällen werden relevante Strukturinformationen dazu verwendet, analoge, serpinähnliche Moleküle zu entwerfen, effiziente Inhibitoren zu identifizieren oder kleine Moleküle zu identifizieren, die Serpine binden können. Nützliche Beispiele rationellen Arzneimitteldesigns können Moleküle beinhalten, die eine verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von S. Braxton und J.A. Wells (1992, Biochemistry 31:7796-7801), oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten nativer Peptide agieren, wie von S.B. Athauda et al. (1993, J. Biochem. 113:742-746) gezeigt. Die Verwendung von Strukturinformationen von humanem Claudin-21-Polypeptid in Softwaresystemen zur Molekülmodellbildung, um beim Inhibitordesign und der Interaktion von Inhibitor und humanem Claudin-21-Polypeptid zu helfen, ist ebenfalls von der Erfindung umfasst. Ein bestimmtes Verfahren der Erfindung umfasst das Analysieren der dreidimensionalen Struktur von Claudinpolypeptiden der Erfindung für wahrscheinliche Bindungsstellen von Substraten, das Synthetisieren eines neuen Moleküls, das eine prädiktive reaktive Stelle einbindet, und das Prüfen des neuen Moleküls, wie hierin weiter beschrieben.
Es ist auch möglich, einen zielspezifischen Antikörper zu isolieren, der mit einem funktionellen Assay ausgewählt wurde, wie hierin weiter beschrieben, und dann dessen Kristallstruktur zu lösen. Dieser Ansatz ergibt prinzipiell einen Pharmakophor, auf dem das anschließende Arzneimitteldesign basieren kann. Es ist möglich, die Polypeptidkristallographie ganz zu umgehen, indem antiidiotypische Antikörper (Anti-Ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als ein Spiegelbild eines Spiegelbilds würde von der Bindungsstelle der Anti-Ids erwartet, dass sie ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors ist. Der Anti-Id könnte dann zum Identifizieren und Isolieren von Peptiden aus Banken chemisch oder biologisch produzierter Peptide verwendet werden. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmakophor fungieren.
Assays von Aktivitäten von Claudinpolypeptiden der Erfindung
Die gereinigten Claudinpolypeptide der Erfindung (einschließlich Polypeptiden, Fragmenten, Varianten, Oligomeren und anderen Formen) sind in einer Vielfalt von Assays von Nutzen. Zum Beispiel können die humanen Claudin-21-Moleküle der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren von Bindungspartnern von Claudinpolypeptiden der Erfindung verwendet werden, die auch zum Modulieren der interzellulären Kommunikation oder Zellaktivität verwendet werden können. Alternativ können sie zum Identifizieren von Nicht-Bindungspartner-Molekülen oder Substanzen verwendet werden, die die interzelluläre Kommunikation oder Zellaktivität modulieren.
Assays zum Identifizieren von Bindungspartnern. Polypeptide des humanen Claudin-21 und Fragmente davon können zum Identifizieren von Bindungspartnern verwendet werden. Zum Beispiel können sie auf die Fähigkeit, einen Kandidatenbindungspartner in einem beliebigen geeigneten Assay, wie einem herkömmlichen Bindungsassay, zu binden, getestet werden. Zur Veranschaulichung kann das humane Claudin-21-Polypeptid mit einem nachweisbaren Reagenz (z. B. einem Radionuklid, Chromophor, Enzym, das eine kolometrische oder fluorometrische Reaktion katalysiert, und dergleichen) markiert werden. Das markierte Polypeptid wird mit Zellen in Kontakt gebracht, die den Kandidatenbindungspartner exprimieren. Die Zellen werden dann gewaschen, um ungebundenes markiertes Polypeptid zu entfernen, und das Vorliegen von zellgebundenem Marker wird mittels einer geeigneten Technik bestimmt, die gemäß der Beschaffenheit des Markers gewählt wird.
Ein Beispiel eines Bindungsassayvorgangs gestaltet sich wie folgt. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der die cDNA des Kandidatenbindungspartners enthält, wird konstruiert. CV1-EBNA-1-Zellen in 10-cm²-Schalen werden mit diesem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert. CV1-EBNA-1-Zellen (ATCC CRL 10478) exprimieren EBV-Zellkernantigen-I konstitutiv, von dem CMV-Immediate-Early-Enhancer/Promotor angetrieben. CV1-EBNA-1 wurde von der Zelllinie CV1 von Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (ATCC CCL 70) abgeleitet, wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben. Die transfizierten Zellen werden 24 Stunden kultiviert und die Zellen in jeder Schale werden dann auf eine 24-Well-Platte aufgeteilt. Nach Kultivieren für weitere 48 Stunden werden die transfizierten Zellen (etwa 4 × 10⁴ Zellen/Well) mit BM-NFDM gewaschen, bei dem es sich um Bindemedium (RPMI 1640, das 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2, enthält) handelt, dem 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch zugesetzt wurden. Die Zellen werden dann 1 Stunde bei 37 °C mit verschiedenen Konzentrationen beispielsweise eines löslichen Polypeptid/Fc-Fusionspolypeptids, das wie oben dargelegt hergestellt wurde, inkubiert. Die Zellen werden anschließend gewaschen und 1 Stunde bei 37 °C unter leichter Bewegung mit einer konstanten, sättigenden Konzentration eines ¹²⁵I-Maus-Anti-Mensch-IgG in Bindemedium inkubiert. Nach ausgedehntem Waschen werden die Zellen mittels Trypsinierung lösgelöst. Das oben eingesetzte Maus-Anti-Mensch-IgG ist direkt gegen die Fc-Region von humanem IgG gerichtet und kann von den Jackson Immunoresearch Laborstories, Inc., West Grove, PA, USA, bezogen werden. Der Antikörper wird unter Anwendung des Standard-Chloramin-T-Verfahrens radioiodiert. Der Antikörper wird an den Fc-Abschnitt eines beliebigen Polypeptids/Fc-Polypeptids binden, das an die Zellen band. In allen Assays wird die unspezifische Bindung von ¹²⁵I bei Abwesenheit des Fc-Fusionpolypeptids/Fc sowie bei Gegenwart des Fc-Fusionspolypeptids und einem 200-fachen molaren Überschuß unmarkierten Maus-Anti-Mensch-IgG-Antikörpers geprüft. Zellgebundener ¹²⁵I-Antikörper wird auf einem Packard Autogamma-Zählwerk quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) werden auf RS/1 (BBN Software, Boston, MA, USA), die auf einem Microvax-Computer ausgeführt wird, erstellt. Die Bindung kann auch unter Anwendung von Verfahren, die für Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz gut geeignet sind, wie Szintillationsproximitätsassays (S. Udenfriend, L.D. Gerber, L. Brink, S. Spector, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8672-8676), homogenen, zeitlich aufgelösten Fluoreszenzverfahren (Y.W. Park, R.T. Cummings, L. Wu, S. Zheng, P.M. Cameron, A. Woods, D.M. Zaller, A.I. Marcy, J.D. Hermes, 1999, Anal. Biochem. 269: 94-104), Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahren (FRET-Verfahren) (R.M. Clegg, 1995, Curr Opin Biotechnol. 6:103-110) oder Verfahren, die etwaige Veränderungen der Oberflächenplasmonresonanz messen, wenn ein gebundenes Polypeptid einem potentiellen Bindungspartner ausgesetzt wird, wobei solche Verfahren beispielsweise einen Biosensor verwenden, wie den von Biacore AB (Uppsala, Schweden) gelieferten, nachgewiesen werden.
Yeast-two-Hybrid- oder „Interaktion-Trap"-Assays. Wenn das humane Claudin-21-Polypeptid an ein anderes Polypeptid bindet oder potentiell an dieses bindet (wie beispielsweise bei einer Rezeptor/Ligand-Interaktion), kann die Nukleinsäure, die das humane Claudin-21-Polypeptid kodiert, auch in Interaktion-Trap-Assays (wie beispielsweise dem in Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993) beschriebenen) verwendet werden, um Nukleinsäuren zu identifizieren, die das andere Polypeptid kodieren, mit dem eine Bindung erfolgt, oder Inhibitoren der Bindungsinteraktion zu identifizieren. Polypeptide, die an diesen Bindungsinteraktionen beteiligt sind, können ebenfalls zum Screenen auf Inhibitoren oder Agonisten der Bindungsinteraktion in Form eines Peptids oder eines kleinen Moleküls verwendet werden.
Kompetitive Bindungsassays. Eine andere Art eines geeigneten Bindungsassays ist ein kompetitives Bindungsassay. Zur Veranschaulichung kann die biologische Aktivität einer Variante durch Prüfen auf die Fähigkeit der Variante, mit dem nativen Polypeptid um die Bindung an den Kandidatenbindungspartner zu konkurrieren, ermittelt werden. Kompetitive Bindungsassays können mittels herkömmlicher Methodik durchgeführt werden. Zu Reagenzien, die in kompetitiven Bindungsassays eingesetzt werden können, zählen radiomarkiertes humanes Claudin-21 und intakte Zellen, die humanes Claudin-21 (endogen oder rekombinant) auf der Zelloberfläche exprimieren. Zum Beispiel kann ein radiomarkiertes lösliches humanes Claudin-21-Fragment zum Konkurrieren mit einer Variante von löslichem Claudin-21 um die Bindung an Zelloberflächenrezeptoren verwendet werden. Anstelle von intakten Zellen könnte ein löslicher Bindungspartner/Fc-Fusionspolypeptid, das an eine feste Phase durch die Interaktion von Polypeptid A oder Polypeptid G (auf der festen Phase) gebunden ist, durch den Fc-Teil ersetzt werden. Zu Chromatographiesäulen, die Polypeptid A und Polypeptid G enthalten, zählen die von Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA, erhältlichen.
Assays zum Identifizieren von Modulatoren der interzellulären Kommunikation oder Zellaktivität. Der Einfluß von Claudinpolypeptiden der Erfindung auf die interzelluläre Kommunikation oder Zellaktivität kann manipuliert werden, indem diese Aktivitäten in Zielzellen gesteuert werden. Zum Beispiel können die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung, Nukleinsäuren, die die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, oder Agonisten oder Antagonisten solcher Polypeptide an eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen verabreicht werden, um die Zellkommunikation oder -aktivität in den Zielzellen zu induzieren, zu verstärken, zu unterdrücken oder anzuhalten. Die Identifizierung von Claudinpolypeptiden der Erfindung, Agonisten oder Antagonisten, die in dieser Art und Weise verwendet werden können, kann mittels einer Vielfalt von Assays ausgeführt werden, die Fachleuten bekannt sind. In derartigen Assays eingeschlossen sind jene, die die Fähigkeit eines humanen Claudin-21-Polypeptids, die interzelluläre Kommunikation oder Zellaktivität zu beeinflussen, beurteilen. Ein solcher Assay würde beispielsweise die Analyse der Zellinteraktion in Gegenwart eines humanen Claudin-21-Polypeptids beinhalten. In einem solchen Assay würde eine Rate der Kommunikation oder Zellstimulation in Gegenwart des humanen Claudin-21-Polypeptids bestimmt werden und dann ermittelt werden, ob eine solche Kommunikation oder Zellstimulation in Gegenwart eines Kandidatenagonisten oder -antagonisten oder eines anderen humanen Claudin-21-Polypeptids verändert wird. Zu beispielhaften Assays für diesen Gesichtspunkt der Erfindung zählen Cytokinsekretionassays, T-Zell-Kostimulationsassays und Lymphozytmischreaktionen, die antigenpräsentierende Zellen und T-Zellen beinhalten. Diese Assays sind Fachleuten wohl bekannt.
In einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer Testverbindung, sich auf die interzelluläre Kommunikation oder Kostimulationsaktivität einer Zelle auszuwirken, bereit. In diesem Gesichtspunkt umfasst das Verfahren: (1) Inkontaktbringen einer ersten Gruppe von Zielzellen mit einer Testverbindung, die ein humanes Claudin-21-Rezeptor-Polypeptid oder Fragment davon enthält, unter Bedingungen, die für den bestimmten verwendeten Assay adäquat sind; (2) Messen der Nettorate der interzellulären Kommunikation oder Kostimulation unter den Zielzellen und (3) Überwachen der Rate der interzellulären Kommunikation oder Kostimulation unter Kontrollzellen, die die humanen Claudin-21-Rezeptor-Polypeptide oder Fragmente davon enthalten, in Abwesenheit einer Testverbindung unter ansonsten identischen Bedingungen wie für die erste Gruppe von Zellen. In dieser Ausführungsform wird die Nettorate der interzellulären Kommunikation oder Kostimulation in den Kontrollzellen mit der der mit sowohl dem humanen Claudin-21-Molekül als auch einer Testverbindung behandelten Zellen verglichen. Der Vergleich wird einen Unterschied bei der Nettorate der interzellulären Kommunikation oder Kostimulation liefern, so dass ein Effektor der interzellulären Kommunikation oder Kostimulation identifiziert werden kann. Die Testverbindung kann als ein Effektor fungieren, indem sie die interzelluläre Kommunikation oder Kostimulation entweder aktiviert oder hochreguliert oder hemmt oder herunterreguliert, und kann über dieses Verfahren nachgewiesen werden.
Zellproliferations-, Zelltod-, Zelldifferenzierungs- und Zelladhäsionsassays. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann eine Cytokin-Aktivität zur Zellproliferation (entweder induzierend oder hemmend) oder Zelldifferenzierung (entweder induzierend oder hemmend) aufzeigen oder kann die Produktion anderer Cytokine in bestimmten Zellpopulationen induzieren. Viele bis zum heutigen Tag entdeckten Polypeptidfaktoren, einschließlich aller bekannten Cytokine, haben eine Aktivität in einem oder mehreren faktorabhängigen Zellproliferationsassays gezeigt und die Assays dienen daher als eine zweckmäßige Bestätigung der Cytokin-Aktivität. Die Aktivität eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung wird von einem beliebigen einer Reihe von routinemäßigen faktorabhängigen Zellproliferationsassays für Zelllinien, einschließlich, ohne Einschränkung, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mole und CMK, belegt. Die Aktivität eines humanen Claudin-21-Polypeptids der Erfindung kann, neben anderen Mitteln, mit den folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays auf Zellbewegung und -adhäsion beinhalten, ohne Einschränkung, die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines, 6.12.1-6.12.28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur. J. Immunol. 25: 1744-1748; Gruber et al., J. of Immunol. 152:5860-5867; 1994 Johnston et al., J. of Immunol. 153: 1762-1768, 1994, beschriebenen.
Assays auf adhäsive und invasive Suppressoraktivität von Cadherin beinhalten, ohne Einschränkung, die in: Hortsch et al., J. Biol. Chem. 270 (32): 18809-18817, 1995; Miyaki et al., Oncogene 11: 2547-2552, 1995; Ozawa et al., Cell 63:1033-1038, 1990, beschriebenen.
Diagnostische und andere Anwendungszwecke von Claudinpolypeptiden der Erfindung und Nukleinsäuren
Die Nukleinsäuren, die die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können für zahlreiche diagnostische oder andere nützliche Zwecke verwendet werden. Die Nukleinsäuren der Erfindung können dazu verwendet werden, rekombinantes Polypeptid zur Analyse, Charakterisierung oder therapeutischen Verwendung zu exprimieren; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Polypeptid vorzugsweise exprimiert wird (entweder konstitutiv oder in einer bestimmten Stufe der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in Krankheitszuständen); als Molekulargewichtsmarker auf Southern-Gelen; als Chromosommarker oder -tags (bei Markierung), um Chromosome oder kartenverwandte Genpositionen zu identifizieren; um endogene DNA-Sequenzen in Patienten zu vergleichen, um potentielle genetische Erkrankungen zu identifizieren; als Sonden zum Hybridisieren und somit Entdecken neuartiger, verwandter DNA-Sequenzen; als eine Informationsquelle zum Ableiten von PCR-Primern für einen genetischen Fingerabdruck; als eine Sonde zum „Subtrahieren" bekannter Sequenzen beim Vorgang des Entdeckens anderer neuartiger Nukleinsäuren; zum Auswählen und Herstellen von Oligomeren zur Anlagerung an einen „Genchip" oder einen anderen Träger, darunter zur Untersuchung von Expressionsmustern; um Anti-Polypeptid-Antikörper unter Anwendung von DNA-Immunisierungstechniken zu züchten; als ein Antigen, um Anti-DNA-Antikörper zu züchten oder eine andere Immunantwort auszulösen, und zur Gentherapie. Anwendungszwecke von Claudinpolypeptiden der Erfindung und fragmentierten Polypeptiden beinhalten die folgenden, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Reinigen von Polypeptiden und Messen der Aktivität dieser; Abgabemittel; therapeutische und Forschungsreagenzien; Molekulargewichtsmarker und Marker für die isoelektrische Fokussierung; Kontrollen für die Peptidfragmentierung; Identifizierung unbekannter Polypeptide und Herstellung von Antikörpern. Eine beliebige oder alle Nukleinsäuren, die für diese Anwendungszwecke geeignet sind, können zu einer analysenreinen Substanz oder einem Kitformat zum kommerziellen Vertrieb als Produkte entwickelt werden. Verfahren zum Durchführen der oben aufgeführten Anwendungen sind Fachleuten wohl bekannt. Referenzen, die solche Verfahren offenbaren, beinhalten, ohne Einschränkung, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Hrsg.: J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, und „Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Hrsg.: S.L. Berger und A.R. Kimmel, 1987.
Sonden und Primer. Zu den Verwendungen der offenbarten humanen Claudin-21-Nukleinsäuren und Kombinationen von Fragmenten davon zählt die Verwendung von Fragmenten als Sonden oder Primer. Solche Fragmente umfassen im Allgemeinen mindestens etwa 17 aufeinanderfolgende Nukleotide einer DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen umfasst ein DNA-Fragment mindestens 30 oder mindestens 60 aufeinanderfolgende Nukleotide einer DNA-Sequenz. Die grundlegenden Parameter, die die Wahl der Hybridisierungsbedingungen beeinflussen, und die Anleitung zum Festlegen geeigneter Bedingungen werden von Sambrook et al., 1989, ausgeführt und sind oben ausführlich beschrieben. Unter Anwendung der Kenntnis des genetischen Kodes in Kombination mit den oben dargelegten Aminosäuresequenzen können Sätze von degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden. Solche Oligonukleotide sind als Primer von Nutzen, z. B. in Polymerase-Kettenreaktionen (polymerase chain reactions, PCR), wobei DNA-Fragmente isoliert und amplifiziert werden. In bestimmten Ausführungsformen können degenerierte Primer als Sonden für nicht menschliche genetische Bibliotheken verwendet werden. Solche Bibliotheken würden cDNA-Bibliotheken, genomische Bibliotheken und sogar elektronische EST- („express sequence tag") oder DNA-Bibliotheken beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Homologe Sequenzen, die mit diesem Verfahren identifiziert wurden, würden dann als Sonden verwendet werden, um nicht menschliche Claudin-21-Homologa zu identifizieren.
Chromosomkartierung. Die Nukleinsäuren, die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, und die offenbarten Fragmente und Kombinationen dieser Nukleinsäuren können von Fachleuten unter Anwendung wohl bekannter Techniken zum Identifizieren des menschlichen Chromosoms, auf das diese Nukleinsäuren kartiert werden, verwendet werden. Geeignete Techniken beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die Verwendung der Sequenz oder von Abschnitten, einschließlich Oligonukleotiden, als eine Sonde in verschiedenen wohl bekannten Techniken wie Radiation-Hybrid-Mapping (Strahlungshybridkartierung) (hohe Auflösung), In-situ-Hybridisierung an Chromosom-Spreads (moderate Auflösung) und Southern-Blot-Hybridisierung an Hybridzelllinien, die einzelne menschliche Chromosome enthalten (niedrige Auflösung). Zum Beispiel können Chromosome mit Strahlungshybridisierung kartiert werden. Zunächst wird unter Verwendung der Auswahl von 93 Strahlungshybriden vom Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4 eine PCR durchgeführt: www.genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html. Primer werden verwendet, die innerhalb eines putativen Exons des Gens von Interesse liegen und die ein Produkt aus menschlicher genomischer DNA amplifizieren, jedoch nicht genomische DNA vom Hamster amplifizieren. Die Ergebnisse der PCRs werden in einen Datenvektor umgewandelt, der auf der Whitehead/MIT Radiation Mapping-Website im Internet eingegeben wird (www.seq.wi.mit.edu). Die Daten werden bewertet und die Chromosomzuordnung und -plazierung in Bezug auf bekannte STS-Marker (STS = Sequence Tag Site) auf der Strahlungshybridkarte werden geliefert. Die folgende Website liefert zusätzliche Informationen zur Strahlungshybridkartierung: www.genom.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/07-97.INTRO.html.
Diagnostik und Gentherapie. Die Nukleinsäuren, die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, und die offenbarten Fragmente und Kombinationen dieser Nukleinsäuren können von einem Fachmann unter Anwendung wohl bekannter Techniken zum Analysieren von Anomalien, die mit den Genen assoziiert werden, die diesen Polypeptiden entsprechen, verwendet werden. Dies ermöglicht es, Erkrankungen zu unterscheiden, bei denen dieser Marker neu angeordnet oder deletiert ist. Darüber hinaus können Nukleinsäuren der Erfindung oder ein Fragment davon als ein Positionsmarker zum Kartieren anderer Gene mit unbekannter Position verwendet werden. Die DNA kann beim Entwickeln von Behandlungen für eine beliebige Erkrankung verwendet wird, die von fehlerhaften oder unzureichenden Mengen der Gene, die den Nukleinsäuren der Erfindung entsprechen, (direkt oder indirekt) vermittelt werden. Die Offenbarung von nativen Nukleotidsequenzen hierin ermöglicht den Nachweis fehlerhafter Gene und deren Austausch durch normale Gene. Fehlerhafte Gene können in In-vitro-Diagnoseassays und mittels Vergleich einer hierin offenbarten nativen Nukleotidsequenz mit der eine Gens, das von einer Person stammt, von der vermutet wird, dass sie einen Defekt in diesem Gen aufweist, nachgewiesen werden.
Verfahren zum Screenen auf Bindungspartner. Die Claudinpolypeptide der Erfindung können jeweils als Reagenzien in Verfahren zum Screenen auf oder Identifizieren von Bindungspartnern verwendet werden. Zum Beispiel können die Claudinpolypeptide der Erfindung an einem Material eines festen Trägers angeheftet werden und können in einer Art und Weise an ihre Bindungspartner binden, die der Affinitätschromatographie ähnlich ist. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Polypeptid mittels herkömmlicher Verfahren an einen festen Träger angeheftet. Als ein Beispiel stehen Chromatographiesäulen, die funktionelle Gruppen enthalten, die mit funktionellen Gruppen an Aminosäurenseitenketten oder Polypeptiden reagieren werden, zur Verfügung (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). In einer Alternative wird ein Polypeptid/Fc-Polypeptid (wie oben erörtert) durch Interaktion mit dem Fc-Teil an Polypeptid A oder Polypeptid G enthaltende Chromatographiesäulen angebracht. Die Claudinpolypeptide der Erfindung finden auch beim Identifizieren von Zellen, die einen Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren, Anwendung. Polypeptide werden an eine feste Phase, wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnliches geeignetes Substrat, gebunden. Zum Beispiel können magnetische Mikrosphären mit den Polypeptiden beschichtet und durch ein Magnetfeld in dem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen, die Zellen enthalten, die potentielle Bindungspartner exprimieren, werden mit der festen Phase mit den Polypeptiden darauf in Kontakt gebracht. Zellen, die den Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren, binden an die fixierten Polypeptide und ungebundene Zellen werden weggespült. Alternativ können Claudinpolypeptide der Erfindung an einen nachweisbaren Teil konjugiert und dann mit auf Bindungspartnerexpression zu testenden Zellen inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes markiertes Material entfernt und das Vorliegen oder Fehlen des nachweisbaren Teils auf den Zellen wird ermittelt. In einer weiteren Alternative werden Mischungen von Zellen, von denen vermutet wird, dass sie den Bindungspartner exprimieren, mit biotinylierten Polypeptiden inkubiert. Die Inkubationszeiträume sind in der Regel über eine Dauer von mindestens einer Stunde, um eine ausreichende Bindung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule geleitet, die mit mit Avidin beschichteten Kügelchen gepackt ist, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin für die Bindung der gewünschten Zellen an die Kügelchen sorgt. Verfahren zur Verwendung von mit Avidin beschichteten Kügelchen sind bekannt (siehe Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). Ein Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und das Freisetzen der gebundenen Zellen werden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt. In einigen Fällen können die obigen Verfahren zum Screenen auf oder Identifizieren von Bindungspartnern auch zum Isolieren oder Reinigen solcher Bindungspartnermoleküle oder Zellen, die diese exprimieren, verwendet oder modifiziert werden.
Messen biologischer Aktivität. Polypeptide finden auch beim Messen der biologischen Aktivität von humanes Claudin-21 bindenden Polypeptiden bezüglich deren Bindungsaffinität Anwendung. Die Polypeptide können folglich von jenen eingesetzt werden, die „Qualitätssicherungsstudien" durchführen, z. B. um die Haltbarkeit und Stabilität von Polypeptid unter unterschiedlichen Bedingungen zu überwachen. Zum Beispiel können die Polypeptide in einer Bindungsaffinitätsstudie eingesetzt werden, um die biologische Aktivität eines Bindungspartnerpolypeptids zu messen, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder in unterschiedlichen Zelltypen produziert wurde. Die Polypeptide können auch dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach Modifikation eines Bindungspartnerpolypeptids (z. B. chemische Modifikation, Verkürzung, Mutation usw.) bewahrt wird. Die Bindungsaffinität des modifizierten Polypeptids wird mit der eines unmodifizierten bindenden Polypeptids verglichen, um einen etwaigen nachteiligen Einfluß der Modifikationen auf die biologische Aktivität des bindenden Polypeptids nachzuweisen. Die biologische Aktivität eines bindenden Polypeptids kann somit ermittelt werden, bevor es beispielsweise in einer Forschungsstudie verwendet wird.
Träger und Abgabemittel. Die Polypeptide finden auch als Träger zum Abgeben von Agenzien, die daran angeheftet sind, an Zellen, die identifizierte Bindungspartner tragen, Anwendung. Die Polypeptide können folglich dazu verwendet werden, Diagnostika oder Therapeutika an solche Zellen (oder an andere Zelltypen, von denen festgestellt wurde, dass sie Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren) in In-vitro- oder In-vivo-Verfahren abzugeben. Nachweisbare Mittel (Diagnostika) und Therapeutika, die an ein Polypeptid angelagert werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Toxine, andere zytotoxische Agenzien, Arzneimittel, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren, und dergleichen, wobei das bestimmte Agens gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt wird. Zu den Toxinen zählen Ricin, Abrin, Diphtherietoxin, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A, ribosomeninaktivierende Polypeptide, Mykotoxine wie Trichothecene, und Derivate und Fragmente (z. B. Einzelketten) davon. Radionuklide, die zur diagnostischen Verwendung geeignet sind, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ¹²³I, ¹³¹I, ⁹⁹mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Beispiele von Radionukliden, die zur therapeutischen Verwendung geeignet sind, beinhalten ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb^, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu. Solche Agenzien können mittels eines beliebigen geeigneten herkömmlichen Verfahrens an das Polypeptid angelagert werden. Das Polypeptid umfasst funktionelle Gruppen an Aminosäurenseitenketten, die mit funktionellen Gruppen an einem gewünschten Agens reagiert werden können, um beispielsweise kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ kann das Polypeptid oder Agens derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzulagern. Die Derivatisierung kann die Anlagerung eines der bifunktionellen Kopplungsmittel beinhalten, die zum Anlagern verschiedener Moleküle an Polypeptide zur Verfügung stehen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, USA). Eine Reihe von Techniken zum radioaktiven Markieren von Polypeptiden ist bekannt. Radionuklidmetalle können an Polypeptide angelagert werden, indem beispielsweise ein geeigneter bifunktioneller Chelatbildner verwendet wird. Daher werden Konjugate, die Polypeptide und ein geeignetes Diagnostikum oder Therapeutikum (vorzugsweise kovalent verbunden) umfassen, hergestellt. Die Konjugate werden in einer Menge, die für die bestimmte Anwendung adäquat ist, verabreicht oder anderweitig eingesetzt.
Behandeln von Erkrankungen mit Claudinpolypeptiden der Erfindung und Antagonisten davon
Es wird erwartet, dass die Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente, Varianten, Antagonisten, Agonisten, Antikörper und Bindungspartner der Erfindung zum Behandeln von medizinischen Zuständen und Erkrankungen von Nutzen sein werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Erkrankungen, die die Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion oder den Ionentransport einschließen, wie hierin weiter beschrieben. Das therapeutische Molekül oder die therapeutischen Moleküle, das bzw. die verwendet werden sollen, werden von Ätiologie der zu behandelnden Erkrankung und den beteiligten biologischen Stoffwechselwegen abhängen und Varianten, Fragmente und Bindungspartner von Claudinpolypeptiden der Erfindung können Auswirkungen haben, die denen von Claudinpolypeptiden der Erfindung ähnlich sind oder sich von diesen unterscheiden. Zum Beispiel kann ein Antagonist der Tight junction-Bildungsaktivität von Claudinpolypeptiden der Erfindung zur Behandlung von Erkrankungen, die die Tight junction-Bildung einschließen, ausgewählt werden, ein bestimmtes Fragment eines gegebenen humanen Claudin-21-Polypeptids kann jedoch auch als ein effektiver dominant-negativer Antagonist dieser Aktivität fungieren. Folglich bezieht sich „Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten" in den folgenden Absätzen auf alle Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente, Varianten, Antagonisten, Agonisten, Antikörper und Bindungspartner usw. der Erfindung und es versteht sich, dass ein spezifisches Molekül oder spezifische Moleküle von Fachpersonen gemäß der hierin beschriebenen biologischen und therapeutischen Erwägungen aus den als Ausführungsformen der Erfindung bereitgestellten ausgewählt werden kann bzw. können.
Die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kombinationstherapien sind in Medikamenten zum Behandeln von Bakterien-, Virus- oder Protozoeninfektionen und daraus resultierenden Komplikationen von Nutzen. Eine solche Erkrankung ist Mycoplasma pneumonia. Darüber hinaus wird hierin die Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten zum Behandeln von AIDS und verwandten Erkrankungen, wie AIDS-Dementia-Komplex, mit AIDS assoziierter Auszehrung, Lipodystrophie aufgrund von Therapie gegen Retroviren und Kaposi-Sarkom, bereitgestellt. Hierin wird die Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten zum Behandeln von Protozoenerkrankungen, einschließlich Malaria und Schistosomiasis, bereitgestellt. Des weiteren wird die Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten zum Behandeln von Erythema nodosum leprosum; bakterieller oder viraler Meningitis; Tuberkulose, einschließlich Lungentuberkulose; und zu einer Bakterien- oder Virusinfektion sekundärer Pneumonie bereitgestellt. Hierin wird ebenfalls die Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten zum Herstellen von Medikamenten zum Behandeln von Läuserückfallfiebern, wie dem von Borrelia recurrentis verursachten, bereitgestellt. Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten der Erfindung können auch zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Erkrankungen verwendet werden, die von Herpes-Viren verursacht werden, wie Herpes-Stromakeratitis, Hornhautläsionen und von einem Virus induzierte Hornhauterkrankungen. Darüber hinaus können Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten beim Behandeln von menschlichen Papillomavirusinfektionen verwendet werden. Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten der Erfindung werden auch zum Herstellen von Medikamenten zum Behandeln von Influenza verwendet.
Herz-Kreislauf-Erkrankungen können mit den offenbarten Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden, einschließlich Aortenaneurysmen; Arterienentzündung; Gefäßverschluß; einschließlich Hirnarterienverschluß; Komplikationen nach einem aorto-koronären Bypass; Ischämie/Reperfusionsverletzung; Herzerkrankung, einschließlich atherosklerotischer Herzerkrankung; Herzmuskelentzündung, einschließlich chronischer autoimmuner Myokarditis und viraler Myokarditis; Herzversagen, einschließlich chronischem Herzversagen (chronic heart failure, CHF), Kachexie nach Herzversagen; Myokardinfektion; Restenose nach Herzchirurgie; asymptomatischer Myokardischämie; Komplikationen nach der Implantation von linksventrikulären Hilfsgeräten; Raynaud-Phänomen; Thrombophlebitis; Gefäßentzündung, einschließlich Kawasaki-Vaskulitis; Riesenzellarteritis, Wegener-Granulomatose und Purpura Schönlein-Henoch.
Eine Kombination von mindestens einem humanen Claudin-21-Polypeptid oder Antagonisten und einem oder mehreren anderen Antiangiogenesefaktoren kann zum Behandeln von festen Tumoren verwendet werden, wodurch die Vaskularisation reduziert wird, die das Tumorgewebe nährt. Zu geeigneten Antiangiogenesefaktoren für solche Kombinationstherapien zählen IL-8-Inhibitoren, Angiostatin, Endostatin, Kringle 5, Inhibitoren von vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (wie Antikörper gegen vaskulären Endothelwachstumsfaktor), Angiopoietin-2 oder andere Antagonisten von Angiopoietin-1, Antagonisten von plättchenaktivierendem Faktor und Antagonisten von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor.
Darüber hinaus werden die betreffenden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien zum Behandeln von chronischen Schmerzzuständen verwendet, wie chronischer Beckenbodenschmerz, einschließlich chronischer Prostataentzündung/chronischer Beckenschmerzen. Als ein weiteres Beispiel werden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten und die Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung zum Behandeln von Post-Herpes-Neuralgie verwendet.
Ebenfalls bereitgestellt sind Verfahren zum Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien zum Behandeln verschiedener Erkrankungen des endokrinen Systems. Zum Beispiel werden die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten zum Behandeln von Typ-I-Diabetes (einschließlich autoimmuner und insulinabhängiger Typen von Diabetes) und auch zum Behandeln von Typ-II-Diabetes (einschließlich nicht-insulinabhängigem und durch Adipositas verursachtem Diabetes) verwendet. Darüber hinaus werden die betreffenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien zum Behandeln sekundärer Erkrankungen verwendet, die mit Diabetes assoziiert sind, wie diabetische Retinopathie, Nierentransplantatabstoßung bei Diabetespatienten, durch Adipositas verursachte Insulinresistenz und Nierenversagen, das selbst mit Proteinurie und Hypertonie assoziiert werden kann. Andere endokrine Erkrankungen können ebenfalls mit diesen Verbindungen, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden, einschließlich Polyzystisches Ovarialsyndrom, X-chromosomale Adrenoleukodystrophie, Schilddrüsenunterfunktion und Schilddrüsenentzündung, einschließlich Hashimoto-Thyreoiditis (d. h. autoimmune Thyreoiditis).
Erkrankungen des Gastrointestinal-Systems können ebenfalls mit Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden, einschließlich Zöliakie. Darüber hinaus werden die Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung zum Behandeln von Morbus Crohn; Colitis ulcerosa; idiopathischer Gastroparese; Pankreatitis, einschließlich chronischer Pankreatitis und Lungentrauma, das mit akuter Pankreatitis assoziiert ist; und Geschwüren, einschließlich Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, verwendet.
Beinhaltet sind auch Verfahren zum Verwenden der betreffenden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien zum Behandeln von Erkrankungen des Urogenitalsytems, wie Glomerulonephritis, einschließlich autoimmuner Glomerulonephritis, Glomerulonephritis aufgrund von Kontakt mit Toxinen oder zu Infektionen mit hämolytischen Streptokokken oder anderen infektiösen Agenzien sekundärer Glomerulonephritis. Ebenfalls mit den Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung behandelbar sind urämisches Syndrom und seine klinischen Komplikationen (beispielsweise Nierenversagen, Anämie und hypertrophische Kardiomyopathie), einschließlich uremischen Syndrom, das mit Kontakt mit Umweltgiften, Arzneimitteln oder anderen Ursachen assoziiert ist. Weitere Erkrankungen, die mit Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung behandelt werden können, sind Komplikationen von Hämodialyse; Prostataerkrankungen, einschließlich benigner Prostatavergrößerung, abakterieller Prostataentzündung und chronischer Prostataentzündung.
Ebenfalls hierin bereitgestellt sind Verfahren zum Verwenden von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien zum Behandeln verschiedener hämatologischer und onkologischer Erkrankungen. Zum Beispiel werden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten zum Behandeln verschiedener Formen von Krebs, einschließlich akuter myeloischer Leukämie, Epstein-Barr-Virus-positives nasopharyngeales Karzinom, Gliom, Kolon-, Magen, Prostata-, Nierenzell-, Gebärmutterhals- und Eierstockkrebs, Lungenkrebs (kleinzelliges Lungenkarzinom und nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom), einschließlich mit Krebs assoziierter Kachexie, Erschöpfung, Asthenie, paraneoplastischem Syndrom nach Kachexie und Hyperkalziämie. Weitere Erkrankungen, die mit den betreffenden Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden können, sind feste Tumore, einschließlich Sarkom, Osteosarkom und Karzinom, wie Adenkarzinom (beispielsweise Brustkrebs) und Plattenepithelkarzinom. Darüber hinaus sind die betreffenden Verbindungen, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien zum Behandeln von Leukämie, einschließlich akuter myeloischer Leukämie, chronischer oder akuter lymphoblastischer Leukämie und Haarzellenleukämie. Andere Malignome mit invasivem Metastasierungspotential können mit den betreffenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelt werden, einschließlich Kahler-Krankheit. Darüber hinaus können die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien zum Behandeln von Anämien und hämatologischen Erkrankungen verwendet werden, einschließlich Anämie nach chronischer Erkrankung, aplastischer Anämie, einschließlich Fanconi-Anämie; idiopathischer thrombozytopenischer Purpura (ITP); myelodysplastischen Syndromen (einschließlich refraktärer Anämie, refraktärer Anämie mit Ringsideroblasten, refraktärer Anämie mit überschüssigen Blasten, refraktärer Anämie mit überschüssigen Blasten bei Transformation); Myelofibrose/myeolischer Metaplasie und vasookklusiver Sichelzellkrise.
Andere Erkrankungen, die mit den offenbarten Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelt werden können, beinhalten jene, die aus Kopf- oder Rückenmarksverletzungen resultieren und beinhalten subdurales Hämatom aufgrund eines Schädeltraumas.
Die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien werden weiterhin dazu verwendet, Lebererkrankungen zu behandeln, wie Hepatitis, einschließlich akuter Alkoholhepatitis, akuter arzneimittelinduzierter oder viraler Hepatitis, Hepatitis A, B und C, primärsklerosierender Cholangitis und Leberentzündung aufgrund unbekannter Ursachen.
Eine Reihe von Lungenerkrankungen kann ebenfalls mit den offenbarten Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelt werden. Eine derartige Erkrankung ist akutes Lungenversagen (adult respiratory distress syndrome, ARDS), das von einer Vielfalt von Ursachen ausgelöst werden kann, einschließlich Kontakt mit toxischen Chemikalien, Pankreatitis, Trauma und andere Ursachen. Die offenbarten Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung sind ebenfalls zum Behandeln von bronchopulmonaler Dysplasie (BPD); Lymphangioleiomyomatose und chronischer fibrotischer Lungenerkrankung von Frühgeborenen von Nutzen. Darüber hinaus werden die Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung zum Behandeln arbeitsbedingter Lungenerkrankungen, einschließlich Asbestlunge, Kohlenstaublunge, Silikose oder ähnlicher Erkrankungen, die mit Langzeitkontakt mit feinen Teilchen assoziiert werden. In anderen Gesichtspunkten der Erfindung werden die offenbarten Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien zum Behandeln von Lungenerkrankungen verwendet, einschließlich chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), die mit chronischer Bronchitis oder Emphysem assoziiert wird; fibrotische Lungenerkrankungen, wie Mukoviszidose, idiopathischer Lungenfibrose und strahlungsinduzierter Lungenfibrose; Lungensarkoidose und Allergien, einschließlich allergischer Rhinitis, Kontaktdermititis, atopischer Dermatitis und Asthma.
Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten der Erfindung, gegebenenfalls mit dem Cytokin IFNγ-1b (wie ACTIMMUNE^®; InterMune Pharmaceuticals) kombiniert, können zum Behandeln von Mukoviszidose oder fibrotischen Lungenerkrankungen, wie idiopathischer Lungenfibrose, strahlungsinduzierter Lungenfibrose und bleomycininduzierter Lungenfibrose, verwendet werden. Darüber hinaus ist diese Kombination zum Behandeln anderer Erkrankungen von Nutzen, die durch Organfibrose gekennzeichnet sind, einschließlich systemischer Sklerose (auch „Sklerodermia" genannt), die oftmals eine Fibrose der Leber beinhaltet. Zum Behandeln von Mukoviszidose können Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten und IFNγ-1b mit PULMOZYME^® oder TOBI^® oder anderen Therapien für Mukoviszidose kombiniert werden.
Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten der Erfindung für sich oder in Kombination mit IFNγ-1b können zusammen mit anderen Therapien, die derzeit zum Behandeln von fibrotischer Lungenerkrankung angewendet werden, verabreicht werden. Solche weiteren Therapien beinhalten Glukokortikoide, Azathioprin, Cyclophosphamid, Penicillamin, Colchicin, Sauerstoffsupplementation und so weiter. Patienten mit fibrotischer Lungenerkrankung, wie IPF, weisen oftmals einen unproduktiven Husten, progressive Dyspnoe auf und zeigen in Lungenfunktionstests ein restriktives Atemmuster. Röntgenbilder des Brustkorbs offenbaren fibrotische Ansammlungen in den Lungen des Patienten. Wenn eine fibrotische Lungenerkrankung gemäß den offenbarten Verfahren behandelt wird, kann eine ausreichende Behandlung nachgewiesen werden, indem eine Verminderung des Hustens des Patienten (wenn Husten vorliegt) beobachtet wird oder indem Standardlungenfunktionstests angewendet werden, um Verbesserungen der Lungengesamtkapazität, der Vitalkapazität, des Restlungenvolumens nachzuweisen, oder indem eine Bestimmung der arteriellen Blutgase verschrieben wird, die die Desaturierung unter Belastungsbedingungen mißt, und gezeigt wird, dass die Lungenfunktion des Patienten sich gemäß einer oder mehrerer dieser Messungen verbessert hat. Darüber hinaus kann die Besserung des Patienten durch Ergebnisse aus Röntgenbildern des Brustkorbs bestimmt werden, die zeigen, dass der Fortschritt der Fibrose in den Lungen des Patienten aufgehalten oder reduziert wurde.
Darüber hinaus sind Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten (einschließlich löslicher Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antikörper gegen Claudinpolypeptide der Erfindung) zum Behandeln von Organfibrose von Nutzen, wenn sie in Kombination mit Relaxin verabreicht werden, einem Hormon, das die Kollagenproduktion herunterreguliert und folglich die Fibrose inhibiert, oder wenn sie in Kombination mit Mitteln gegeben werden, die die fibrogene Aktivität von TGF-β blockieren. Kombinationstherapien unter Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten und rekombinantem humanem Relaxin sind beispielsweise zum Behandeln von systemischer Sklerose oder fibrotischen Lungenerkrankungen, einschließlich Mukoviszidose, idiopathischer Lungenfibrose, strahlungsinduzierter Lungenfibrose und bleomycininduzierter Lungenfibrose, von Nutzen.
Andere Ausführungsformen stellen Verfahren zum Verwenden der offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien zum Behandeln einer Vielfalt von rheumatischen Erkrankungen bereit. Zu diesen gehören: adulte und juvenile rheumatoide Arthritis; systemischer Lupus erythematodes; Gicht; Osteoarthritis; Polymyalgia rheumatica; seronegative Spondylarthropathien, einschließlich Bechterew-Krankheit; und Reiter-Krankheit. Die betreffenden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien werden auch zum Behandeln von Arthritis psoriatica und chronischer Lyme-Krankheit verwendet. Ebenfalls mit diesen Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelbar sind Still-Syndrom und Uveitis, die mit rheumatoider Arthritis assoziiert wird. Darüber hinaus werden die Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung beim Behandeln von Erkrankungen verwendet, die in der Entzündung der willkürlichen quergestreiften Muskulatur resultiert, einschließlich Dermatomyositis und Polymyositis. Darüber hinaus werden die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Kombinationen zum Behandeln von multizentrischer Retikulohistiozytose verwendet, einer Erkrankung, bei der die Gelenkzerstörung und die papulösen Knoten des Gesichts und der Hände mit einer Überschußproduktion von proinflammatorischen Cytokinen durch multinukleäre Riesenzellen assoziiert werden.
Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung sind zum Behandeln primärer Amyloidose von Nutzen. Darüber hinaus kann auch die sekundäre Amyloidose, die für verschiedene Erkrankungen charakteristisch ist, mit Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, und den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelt werden. Zu solchen Erkrankungen zählen: Alzheimer-Krankheit, sekundäre reaktive Amyloidose; Down-Syndrom und mit Dialyse assoziierte Amyloidose. Ebenfalls mit den Verbindungen, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien der Erfindung behandelbar sind ererbte Syndrome periodischen Fiebers, einschließlich familiärem Mittelmeerfieber, Hyperimmunglobulinämie D und periodisches Fieber und mit TNF-Rezeptor assoziierte periodische Syndrome (TRAPS).
Erkrankungen, die mit Transplantation assoziiert sind, können ebenfalls mit den offenbarten Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden, wie Graft-versus-Host-Erkrankung und Komplikationen, die aus der Transplantation von festen Organen, einschließlich der Transplantation von Herz, Leber, Lunge, Haut, Niere oder anderer Organe, resultieren. Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten können beispielsweise verabreicht werden, um die Entwicklung von Bronchiolitis obliterans nach einer Lungentransplantation zu verhindern oder zu hemmen.
Augenerkrankungen können ebenfalls mit den offenbarten Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden, einschließlich rhegmatogener Netzhautablösung und entzündlicher Augenerkrankung und entzündlicher Augenerkrankung, die mit Rauchen und Makuladegeneration assoziiert ist.
Die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten der Erfindung und die offenbarten Zusammensetzungen und Kombinationstherapien sind auch zum Behandeln von Erkrankungen von Nutzen, die das weibliche Fortpflanzungssystem betreffen. Beispiele beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, mehrfaches Fehlschlagen einer Implantation/Unfruchtbarkeit; Abortsyndrom oder Verlust eines IVF-Embryos (Fehlgeburt); präeklamptische Schwangerschaften oder Eklampsie und Endometriose.
Die offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien sind des weiteren zum Behandeln von akuter Polyneuropathie; Anorexia nervosa; einseitiger Fazialislähmung; chronischem Ermüdungssyndrom; übertragbarer Demenz, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung; Entmarkungskrankheit; Guillain-Barre-Syndrom; Bandscheibenerkrankung; Golfkriegsyndrom; Myasthenia Gravis; asymptomatische zerebrale Ischämie; Schlafstörungen, einschließlich Narkolepsie und Schlafapnoe; chronische Neuronendegeneration und Schlaganfall, einschließlich zerebraler Ischämieerkrankungen.
Erkrankungen, die die Haut oder Schleimhäute betreffen, können ebenfalls unter Verwendung der offenbarten Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen oder Kombinationstherapien behandelt werden. Zu solchen Erkrankungen zählen akantholytische Erkrankungen, einschließlich Darier-Krankheit, Keratosis follicularis und Pemphigus vulgaris. Ebenfalls mit den betreffenden Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, Zusammensetzungen und Kombinationstherapien behandelbar sind Akne; Acne Rosacea; Alopecia areata; aphthöse Stomatitis; bullöses Pemphigoid; Verbrennungen; Ekzem; Erythem, einschließlich Erythema multiforme und Erythema multiforme bullosum (Stevens-Johnson-Syndrom); entzündliche Hauterkrankung; Lichen planus; lineare IgA-bullöse Erkrankung (chronische bullöse Dermatose im Kindesalter); Verlust der Hautelastizität; Geschwüre der Schleimhautoberfläche; neutrophile Dermatitis (Sweet-Syndrom); Pityriasis rubra pilaris; Psoriasis; Pyoderma gangrenosum und toxische epidermale Nekrolyse.
Verabreichung von Claudinpolypeptiden der Erfindung und Antagonisten davon
Diese Erfindung stellt Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln eines Patienten, vorzugsweise eines Säugetier-Patienten und am meisten bevorzugt eines menschlichen Patienten, der unter einer medizinischen Erkrankung und insbesondere einer von humanem Claudin-21 vermittelten Erkrankung leidet, bereit. Zu solchen von humanem Claudin-21 vermittelten Erkrankungen zählen Erkrankungen, die von der Bindung zwischen humanem Claudin-21 und einem Bindungspartner verursacht (direkt oder indirekt) oder verschlimmert werden. Zum Zwecke dieser Offenbarung werden die Ausdrücke „Krankheit", „Erkrankung", „medizinische Beschwerden", „anomaler Zustand" und dergleichen mit dem Ausdruck „medizinische Erkrankung" austauschbar verwendet. Die hierin verwendeten Ausdrücke „behandeln" und „Behandlung" beinhalten heilende, vorbeugende (z. B. prophylaktische) und Palliativ- oder bessernde Behandlung. Für solche therapeutischen Anwendungen können Claudinpolypeptide der Erfindung und Fragmente, humane Claudin-21-Nukleinsäuren, die die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, und/oder Agonisten oder Antagonisten des humanen Claudin-21-Polypeptids, wie Antikörper, dem bedürftigen Patienten über wohl bekannte Mittel verabreicht werden. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein Polypeptid in einer beliebigen hierin beschriebenen Form enthalten, wie native Polypeptide, Varianten, Derivate, Oligomere und biologisch aktive Fragmente. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ein lösliches Polypeptid oder ein Oligomer, das lösliche Claudinpolypeptide der Erfindung umfasst.
Therapeutisch wirksame Menge. Beim Ausüben des Verfahrens der Behandlung oder Verwendung der vorliegenden Erfindung wird einem Patienten mit einer zu behandelnden Erkrankung eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums der vorliegenden Erfindung verabreicht, vorzugsweise um Erkrankungen zu behandeln oder zu lindern, die mit der Aktivität eines humanen Claudin-21-Polypeptids assoziiert sind. „Therapeutikum" beinhaltet, ohne Einschränkung, ein beliebiges der Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente und Varianten; Nukleinsäuren, die die Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente und Varianten kodieren; Agonisten oder Antagonisten der Claudinpolypeptide der Erfindung, wie Antikörper; Bindungspartner von humanem Claudin-21-Polypeptid; Komplexe, die aus den Claudinpolypeptiden der Erfindung, Fragmenten, Varianten und Bindungspartnern usw. gebildet werden. Wie hierin verwendet, steht der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge" für die Gesamtmenge jedes Therapeutikums oder anderen Wirkbestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Verfahrens, die dazu ausreicht, einen bedeutenden Nutzen für den Patienten aufzuzeigen, d. h. Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Linderung des relevanten medizinischen Zustands oder einer Steigerung der Geschwindigkeit der Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Linderung solcher Zustände. Bei Anwendung auf ein einzelnes Therapeutikum oder einen einzelnen Wirkstoff, das bzw. der für sich verabreicht wird, bezieht sich der Ausdruck auf diesen Inhaltsstoff allein. Bei Anwendung auf eine Kombination bezieht sich der Ausdruck auf kombinierte Mengen der Inhaltsstoffe, die in der therapeutischen Wirkung resultieren, ob in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht. Wie hierin verwendet, bedeutet die Phrase „Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge" eines Therapeutikums, dass der Patient mit dem Therapeutikum in einer Menge und eine Zeitdauer lang behandelt wird, die dazu ausreichen, eine Verbesserung und vorzugsweise eine anhaltende Verbesserung in mindestens einem Indikator, der die Schwere der Erkrankung widerspiegelt, zu induzieren. Eine Verbesserung wird als „anhaltend" betrachtet, wenn der Patient die Verbesserung bei mindestens zwei Gegebenheiten, die durch eine oder mehr Wochen voneinander getrennt sind, aufzeigt. Der Grad der Verbesserung wird auf Grundlage von Anzeichen oder Symptomen bestimmt und die Bestimmungen können auch Fragebögen einsetzen, die dem Patienten gegeben werden, wie Fragebögen zur Lebensqualität. Verschiedene Indikatoren, die das Ausmaß der Krankheit des Patienten widerspiegeln, können zum Bestimmen, ob die Menge und die Dauer der Behandlung ausreichend sind, ausgewertet werden. Der Baseline-Wert für den gewählten Indikator oder die gewählten Indikatoren wird mittels Untersuchung des Patienten vor Verabreichung der ersten Dosis des Therapeutikums festgestellt. Vorzugsweise wird die Baseline-Untersuchung innerhalb von etwa 60 Tage vor Verabreichen der ersten Dosis vorgenommen. Wenn das Therapeutikum zum Behandeln akuter Symptome verabreicht wird, wird die erste Dosis so bald wie praktisch möglich, nachdem die Verletzung erfolgt ist, verabreicht. Eine Verbesserung wird durch Verabreichen von Therapeutika wie Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten induziert, bis der Patient eine Verbesserung gegenüber der Baseline für den gewählten Indikator oder die gewählten Indikatoren offenbart. Beim Behandeln chronischer Zustände wird dieser Grad der Verbesserung erlangt, indem dieses Medikament wiederholt über einen Zeitraum von mindestens einem Monat oder länger, z. B. einen, zwei oder drei Monate oder länger, oder auf unbestimmte Zeit verabreicht wird. Ein Zeitraum von einer bis sechs Wochen oder sogar eine einzige Dosis reicht oftmals zum Behandeln akuter Zustände aus. Für Verletzungen oder akute Zustände kann eine einzige Dosis ausreichen. Obwohl das Ausmaß der Krankheit des Patienten nach der Behandlung gemäß einem oder mehreren Indikatoren verbessert zu sein scheint, kann die Behandlung mit derselben Konzentration oder mit einer reduzierten Dosis oder Häufigkeit fortgesetzt werden. Sobald die Behandlung gedrosselt oder abgesetzt wurde, kann sie zu einem späteren Zeitpunkt mit der ursprünglichen Konzentration wiederaufgenommen werden, wenn die Symptome erneut auftreten sollten.
Dosierung. Ein Fachmann der einschlägigen Technik wird erkennen, dass geeignete Dosierungen in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Beschaffenheit und Schwere der behandelten Erkrankung, dem Körpergewicht, Alter, dem Allgemeinzustand und vorherigen Krankheiten und/oder Behandlungen des Patienten und dem Verabreichungsweg variieren werden. Vorläufige Dosen können gemäß Tierversuchen ermittelt werden und die Abgleichung von Dosierungen zur Verabreichung an Menschen wird gemäß in der Technik anerkannten Praktiken wie Standarddosierungsversuchen vorgenommen. Zum Beispiel kann die therapeutisch wirksame Dosis anfangs anhand von Zellkulturassays geschätzt werden. Die Dosierung wird von der spezifischen Aktivität der Verbindung abhängen und kann leicht mittels Routineversuchen bestimmt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich im Plasma zu erlangen, der die IC50 (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung der Symptome erzielt), wie in Zellkultur ermittelt, beinhaltet, während Toxizitäten minimiert werden. Solche Informationen können dazu verwendet, in Menschen geeignete Dosen präziser zu bestimmen. Schließlich wird der behandelnde Arzt die Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung festlegen, mit der jeder individuelle Patient zu behandeln ist. Anfangs wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Höhere Dosen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erzielt wird, und ab diesem Punkt wird die Dosierung nicht weiter erhöht. Es ist vorgesehen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zum Ausüben des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden, etwa 0,01 ng bis etwa 100 mg (vorzugsweise etwa 0,1 ng bis etwa 10 mg, mehr bevorzugt etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 mg) des Polypeptids der vorliegenden Erfindung pro kg Körpergewicht enthalten sollten. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten einmal wöchentlich verabreicht, um die verschiedenen hierin offenbarten medizinischen Erkrankungen zu behandeln, in einer anderen Ausführungsform wird mindestens zweimal wöchentlich verabreicht und in einer anderen Ausführungsform wird mindestens dreimal wöchentlich verabreicht. Bei Injektion reicht die wirksame Menge der Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten pro Erwachsenendosis von 1-20 mg/m² und macht vorzugsweise etwa 5-12 mg/m² aus. Alternativ kann eine Fixdosis verabreicht werden, deren Menge von 5-100 mg/Dosis reichen kann. Beispielhafte Dosisbereiche für eine Fixdosis, die mittels subkutaner Injektion verabreicht werden soll, sind 5-25 mg/Dosis, 25-50 mg/Dosis und 50-100 mg/Dosis. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die im folgenden beschriebenen verschiedenen Indikationen behandelt, indem ein zur Injektion akzeptables Präparat verabreicht wird, das Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten mit 25 mg/Dosis enthält oder alternativ 50 mg pro Dosis enthält. Die 25-mg- oder 50-mg-Dosis kann wiederholt verabreicht werden, insbesondere bei chronischen Erkrankungen. Wenn ein anderer Verabreichungsweg als Injektion angewendet wird, wird die Dosis entsprechend gemäß medizinischer Standardpraktiken angepaßt. In vielen Fällen wird eine Verbesserung des Zustands eines Patienten erzielt, indem eine Dosis von etwa 25 mg Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten ein- bis dreimal wöchentlich über einen Zeitraum von mindestens drei Wochen oder eine Dosis von 50 mg Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten ein- oder zweimal wöchentlich für mindestens drei Wochen injiziert wird, obgleich eine Behandlung über längere Zeiträume notwendig sein kann, um das gewünschte Ausmaß der Verbesserung zu induzieren. Bei unheilbaren chronischen Erkrankungen kann die Kur auf unbegrenzte Zeit fortgesetzt werden, wobei Anpassungen an der Dosis und der Häufigkeit vorgenommen werden, wenn solche von dem Arzt des Patienten als erforderlich erachtet werden. Die vorstehenden Dosen sind Beispiele für einen erwachsenen Patienten, bei dem es sich um eine Person handelt, die 18 Jahre alt oder älter ist. Bei pädiatrischen Patienten (Alter von 4-17) beinhaltet eine geeignete Kur die subkutane Injektion von 0,4 mg/kg bis zu einer Höchstdosis von 25 mg Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten, die mittels subkutaner Injektion einmal oder mehrmals wöchentlich verabreicht wird. Wenn ein Antikörper gegen ein humanes Claudin-21-Polypeptid als der Antagonist von humanem Claudin-21-Polypeptid verwendet wird, ist ein bevorzugter Dosisbereich 0,1 bis 20 mg/kg und mehr bevorzugt 1-10 mg/kg. Ein anderer bevorzugter Dosisbereich für einen Antikörper gegen humanes Claudin-21-Polypeptid ist 0,75 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht. Humanisierte Antikörper sind bevorzugt, das heißt, Antikörper, in denen nur der antigenbindende Abschnitt des Antikörpermoleküls von einer nicht menschlichen Quelle abgeleitet ist. Solche Antikörper können injiziert oder intravenös verabreicht werden.
Formulierungen. Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer humanen Claudin-21-Polypeptids der vorliegenden Erfindung (aus welcher Quelle auch stammend, einschließlich, ohne Einschränkung, aus rekombinanten und nicht rekombinanten Quellen) in Kombination mit anderen Bestandteilen, wie physiologisch unbedenklichem Verdünnungsmittel, Trägerstoff oder Hilfsmittel, umfasst, werden hierin bereitgestellt. Der Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklich" steht für ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe nicht beeinträchtigt. Zu Formulierungen, die zur Verabreichung geeignet sind, zählen wäßrige und nicht wäßrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen können, enthalten können; und wäßrige und nicht wäßrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel oder Verdickungsmittel enthalten können. Die Polypeptide können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, die zum Herstellen pharmazeutisch geeigneter Zusammensetzungen verwendet werden. Sie können unter Beimischung, entweder als die einzige Wirksubstanz oder mit anderen bekannten Wirksubstanzen, die für eine gegebene Indikation geeignet sind, mit pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln (z. B. Kochsalzlösung, Tris-HCl, Acetat und phosphatgepufferten Lösungen), Konservierungsstoffen (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Löslichkeitsverbesserern, Adjuvantien und/oder Trägern kombiniert werden. Zu geeigneten Formulierungen für pharmazeutische Zusammensetzungen zählen die in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschriebenen. Darüber hinaus können solche Zusammensetzungen mit Polyethylenglykol (PEG), Metallionen komplexiert werden oder in polymere Verbindungen, wie Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, Dextran usw. eingebunden werden oder in Liposome, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Blutkörperchenschatten oder Sphäroblaste eingebunden. Zu geeigneten Lipiden zur Liposomformulierung zählen, ohne Einschränkung, Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Die Herstellung solcher Liposomformulierungen liegt innerhalb des Könnens von Fachleuten, wie beispielsweise in US-Pat. Nr. 4,235,871 ; US-Pat. Nr. 4,501,728 ; US-Pat. Nr. 4,837,028 und US-Pat. Nr. 4,737,323 offenbart. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die Geschwindigkeit der Freisetzung in vivo und die Geschwindigkeit der Clearance in vivo beeinflussen und werden daher gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt, so dass die Charakteristika des Trägerstoffs von dem gewählten Verabreichungsweg abhängen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Formen von Claudinpolypeptiden der Erfindung mit anhaltender Freisetzung verwendet. Formen mit anhaltender Freisetzung, die zur Verwendung in den offenbarten Verfahren geeignet sind, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Claudinpolypeptide der Erfindung, die in einem sich langsam auflösenden biokompatiblen Polymer (wie den in U.S. Nr. 6,036,978 beschriebenen Alginatmikroteilchen) eingekapselt, mit einem solchen Polymer (einschließlich topisch angewendeter Hydrogele) vermischt und/oder in einem biokompatiblen halbdurchlässigen Implantat eingeschlossen werden.
Kombinationen von therapeutischen Verbindungen. Ein humanes Claudin-21-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann in Multimeren (z. B. Heterodimeren oder Homodimeren) oder Komplexen mit sich selbst oder anderen Polypeptiden aktiv sein. Infolgedessen können pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung ein Polypeptid der Erfindung in einer solchen multimeren oder komplexierten Form umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann in der Form eines Komplexes des Polypeptids bzw. der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zusammen mit Polypeptid- oder Peptidantigenen sein. Die Erfindung beinhaltet weiterhin die gleichzeitige Verabreichung von Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten mit einem oder mehreren anderen Arzneimitteln, die demselben Patienten mit den Claudinpolypeptiden der Erfindung oder Antagonisten verabreicht werden, wobei jedes Arzneimittel gemäß einer für dieses Medikament geeigneten Kur verabreicht wird. „Gleichzeitige Verabreichung" umfasst die simultane oder sequentielle Behandlung mit den Bestandteilen der Kombination sowie Kuren, in denen die Arzneimittel alterniert werden oder wobei ein Bestandteil über lange Zeit verabreicht wird und der andere bzw. die anderen periodisch verabreicht wird bzw. werden. Die Bestandteile können in derselben Zusammensetzung oder in getrennten Zusammensetzungen und mittels desselben Verabreichungswegs oder unterschiedlichen Verabreichungswegen verabreicht werden. Beispiele von Bestandteilen, die in die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung eingebunden werden können, sind: Cytokine, Lymphokine oder andere hämopoetische Faktoren wie M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, Thrombopoietin, Stammzellfaktor und Erythropoietin. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin andere Agenzien enthalten, die entweder die Aktivität des Polypeptids fördern oder dessen Aktivität oder Verwendung bei der Behandlung ergänzt. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Agenzien können in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebunden werden, um eine synergistische Wirkung mit dem Polypeptid der Erfindung zu produzieren oder Nebenwirkungen zu minimieren. Umgekehrt kann ein humanes Claudin-21-Polypeptid oder ein Antagonist der vorliegenden Erfindung in Formulierungen des bestimmten Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder Anti-Thrombosefaktor oder entzündungshemmenden Mittels eingebunden werden, um Nebeneffekte des Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder Anti-Thrombosefaktor oder entzündungshemmenden Mittels zu minimieren. Weitere Beispiele von Arzneimitteln, die gleichzeitig zu verabreichen sind, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, antivirale Substanzen, Antibiotika, Analgetika, Kortikosteroide, Antagonisten von entzündlichen Cytokinen, nicht-steroidale Antirheumatika (non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs), Pentoxifyllin, Thalidomid und den Krankheitsprozess beeinflussende Antirheumatika (disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs) wie Azathioprin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Hydroxychloroquinsulfat, Methotrexat, Leflunonud, Minocyclin, Penicillamin, Sulfasalazin und Goldverbindungen wie orales Gold, Goldnatriumthiomalat und Aurothioglukose. Darüber hinaus können Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten mit einem zweiten humanen Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptid/Antagonist, einschließlich eines Antikörpers gegen ein humanes Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptids, oder einem von humanem Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptid abgeleiteten Peptid, das als ein kompetitiver Inhibitor eines nativen humanen Claudin-19-, -21- und -22-Polypeptids fungiert, kombiniert werden.
Verabreichungswege. Ein beliebiger wirksamer Verabreichungsweg kann angewendet werden, um Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten davon, einschließlich jener Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren umfassen, therapeutisch zu verabreichen. Parenterale Verabreichung beinhaltet Injektion beispielsweise über intraartikuläre, intravenöse, intramuskuläre, intraläsionale, intraperitoneale oder subkutane Wege mittels Bolusinjektion oder Dauerinfusion und beinhaltet außerdem lokalisierte Verabreichung, z. B. an einer Erkrankungs- oder Verletzungsstelle. Zu anderen geeigneten Verabreichungsmitteln zählen anhaltende Freisetzung aus Implantaten; Aerosolinhalation und/oder -insufflation; Augentropfen; vaginal oder rektal verabreichte Suppositorien; bukkal verabreichte Präparate; oral verabreichte Präparate, einschließlich Pillen, Sirupe, Lutschpastillen oder Kaugummi; und topisch verabreichte Präparate wie Lotionen, Gele, Sprays, Salben oder andere geeignete Techniken. Alternativ können polypeptidhaltige Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten beispielsweise durch Implantieren kultivierter Zellen, die das Polypeptid exprimieren, durch Implantieren von Zellen, die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten exprimieren, verabreicht werden. Zellen können auch ex vivo in Gegenwart von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, um eine gewünschte Wirkung auf solche Zellen oder eine gewünschte Aktivität in solchen Zellen zu vermehren oder zu produzieren. Behandelte Zellen können dann zu therapeutischen Zwecken in vivo eingeführt werden. In einer anderen Ausführungsform werden die eigenen Zellen des Patienten mittels Transfektion in vivo oder ex vivo mit einer DNA, die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten kodiert, dazu gebracht, Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten zu produzieren. Diese DNA kann in die Zellen des Patienten eingeführt werden, indem beispielsweise nackte DNA oder in Liposomen eingekapselte DNA, die Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten kodiert, injiziert wird, oder über ein anderes Transfektionsmittel. Nukleinsäuren der Erfindung können ebenfalls mittels anderer bekannter Verfahren zur Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle oder einen Organismus (einschließlich, ohne Einschränkung, in der Form von viralen Vektoren oder nackter DNA) an Patienten verabreicht werden. Wenn Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten in Kombination mit einem oder mehreren anderen biologisch aktiven Verbindungen verabreicht werden, können diese mittels desselben Wegs oder mittels unterschiedlicher Wege verabreicht werden oder können gleichzeitig, getrennt oder sequentiell verabreicht werden.
Orale Verabreichung. Wenn eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird, wird das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der Form einer Tablette, einer Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers sein. Bei Verabreichung in Tablettenform kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zusätzlich einen festen Trägerstoff wie eine Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, die Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95% Polypeptid der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 25 bis 90% Polypeptid der vorliegenden Erfindung. Bei Verabreichung in flüssiger Form kann ein flüssiger Trägerstoff, wie Wasser, Erdöl, Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie Erdnußöl, Mineralöl, Sojaöl oder Sesamöl, oder synthetische Öle, zugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung oder Glykole, wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten. Bei Verabreichung in flüssiger Form enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% Polypeptid der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 1 bis 50% Polypeptid der vorliegenden Erfindung.
Intravenöse Verabreichung. Wenn eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mittels intravenöser, kutaner oder subkutaner Injektion verabreicht wird, wird das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der Form einer pyrogenfreien, parenteral unbedenklichen wäßrigen Lösung sein. Die Herstellung solcher parenteral unbedenklichen Polypeptidlösungen liegt, unter guter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität, der Stabilität und dergleichen, innerhalb des Könnens von Fachleuten. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion sollte neben dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein isotonisches Vehikel wie Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Dextrose-Injektionslösung, Dextrose- und Natriumchlorid-Injektionslösung, Laktat-Ringer-Injektionslösung oder ein anderes in der Technik bekanntes Vehikel. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisierungsmittel, Konservierungsstoffe, Puffer, Antioxidantien oder andere Fachleuten bekannte Zusatzstoffe enthalten. Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in Abhängigkeit von der Schwere der behandelten Erkrankung und des Zustands und der potentiellen idiosynkratischen Reaktion jedes individuellen Patienten abhängen. Es ist vorgesehen, dass die Dauer jeder Anwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegt. Schließlich wird der behandelnde Arzt die adäquate Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung festlegen.
Verabreichung an Knochen und Gewebe. Bei Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur Knochen-, Knorpel-, Sehnen- oder Bänderregeneration geeignet sind, beinhaltet das therapeutische Verfahren das Verabreichen der Zusammensetzung auf topischem, systemischem oder lokalem Weg als ein Implantat oder eine Vorrichtung. Bei Verabreichung ist die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung selbstverständlich in einer pyrogenfreien, physiologisch unbedenklichen Form. Des Weiteren kann die Zusammensetzung in wünschenswerter Weise zur Abgabe an die Stelle der Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschädigung eingekapselt oder in einer viskosen Form injiziert werden. Topische Verabreichung kann für Wundheilung und Gewebewiederherstellung geeignet sein. Therapeutisch geeignete Mittel, bei denen es sich nicht um ein Polypeptid der Erfindung handelt und die ebenfalls in die Zusammensetzung wie oben beschrieben eingebunden werden können, können alternativ oder zusätzlich simultan oder sequentiell mit der Zusammensetzung in den Verfahren der Erfindung verabreicht werden. Vorzugsweise würde die Zusammensetzung zur Knochen- und/oder Knorpelbildung eine Matrix enthalten, die die Polypeptid enthaltende Zusammensetzung an die Stelle der Knochen- und/oder Knorpelschädigung abgeben kann, eine Struktur für den sich entwickelnden Knochen und Knorpel bereitstellt und im besten Fall in den Körper resorbiert werden kann. Solche Matrizen können aus Materialien gebildet sein, die gegenwärtig für andere implantierte medizinische Anwendungen im Gebrauch sind. Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf der Biokompatibilität, der biologischen Abbaubarkeit, der mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinungsbild und der Grenzflächeneigenschaften. Die bestimmte Anwendung der Zusammensetzungen wird die entsprechende Formulierung definieren. Potentielle Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubar und chemisch definiertes Kalziumsulfat, Trikalziumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polyanhydride sein. Andere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizen setzen sich aus reinen Polypeptiden oder extrazellulären Matrixbestandteilen zusammen. Andere potentielle Matrizen sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramikmaterialien. Matrizen können sich aus Kombinationen beliebiger der oben erwähnten Materialarten zusammensetzen, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Trikalziumphosphat. Die Biokeramiken können in Bezug auf die Zusammensetzung, wie in Kalzium/Aluminat/Phosphat, und die Verarbeitung modifiziert werden, um die Porengröße, Teilchengröße, Teilchenform und biologische Abbaubarkeit zu modifizieren. Gegenwärtig ist ein Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure mit einer molaren Masse von 50:50 in der Form poröser Teilchen mit Durchmessern, die von 150 bis 800 Mikron reichen, bevorzugt. In einigen Anwendungen wird es von Nutzen sein, ein Maskierungsmittel zu nutzen, wie Carboxymethylcellulose oder ein autologes Blutgerinnsel, um zu verhindern, dass die Polypeptidzusammensetzungen sich von der Matrix ablösen. Eine bevorzugte Familie von Maskierungsmitteln ist Cellulosematerialien wie Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei die am meisten bevorzugten kationische Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) sind. Zu anderen bevorzugten Maskierungsmitteln zählen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglykol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die Menge an hierin nützlichem Maskierungsmittel ist 0,5-20 Gew.-%, vorzugsweise 1-10 Gew.-%, basierend auf dem Formulierungsgesamtgewicht, was der Menge entspricht, die erforderlich ist, um die Desorption des Polypeptids von der Polymermatrix zu verhindern und eine adäquate Verarbeitung der Zusammensetzung bereitzustellen, jedoch nicht so sehr, dass die Vorläuferzellen daran gehindert werden, in die Matrix einzudringen, wodurch dem Polypeptid die Gelegenheit verschafft wird, die osteogenetische Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen. In weiteren Zusammensetzungen können die Polypeptide der Erfindung mit anderen Mitteln kombiniert werden, die für die Behandlung des betreffenden Knochen- und/oder Knorpeldefekts, der betreffenden Wunde oder des betreffenden Gewebes vorteilhaft ist. Zu diesen Mitteln zählen verschiedene Wachstumsfaktoren wie epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF), Plättchenwachstumsfaktor (plateletderived growth factor, PDGF), von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktoren (transformed growth factors, TGF-alpha und TGF-beta) und insulinartiger Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor, IGF). Die therapeutischen Zusammensetzungen sind außerdem gegenwärtig für Anwendungen in der Tiermedizin wertvoll. Insbesondere Haustiere und Zuchtpferde sind neben Menschen erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Das Dosierungsschema einer Polypeptid enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Geweberegeneration verwendet werden soll, wird von dem behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, die die Wirkung der Polypeptide modifizieren, festgelegt, z. B. das Maß des gewünschten, zu bildenden Gewebegewichts, die Schädigungsstelle, der Zustand des geschädigten Gewebes, die Größe einer Wunde, die Art des geschädigten Gewebes (z. B. Knochen), das Alter, das Geschlecht und die Ernährungsweise des Patienten, die Schwere einer etwaigen Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der bei der Wiederherstellung verwendeten Matrix und mit dem Einbinden anderer Polypeptide in der pharmazeutischen Zusammensetzung variieren. Zum Beispiel kann die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren wie IGF I (insulinartiger Wachstumsfaktor I) zu der Endzusammensetzung ebenfalls die Dosierung beeinflussen. Der Fortschritt kann beispielsweise mittels periodischer Beurteilung des Gewebe-/Knochenwachstums und/oder der Gewebe-/Knochenwiederherstellung, Röntgenaufnahmen, histomorphometrischer Bestimmungen und Tetracyclin-Markierung überwacht werden.
Anwendungen in der Tiermedizin. Neben menschlichen Patienten sind Claudinpolypeptide der Erfindung und Antagonisten bei der Behandlung von Krankheitszuständen in nicht menschlichen Tieren, wie Haustieren (Hunden, Katzen, Vögeln, Primaten usw.), Nutztieren (Pferden, Rind, Schaf, Schweinen, Vögeln usw.) oder einem beliebigen Tier, das unter einer durch TNFα vermittelten entzündlichen oder arthritischen Erkrankung leitet, von Nutzen. In solchen Fällen kann eine adäquate Dosis in Abhängigkeit von dem Körpergewicht des Tiers bestimmt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis von 0,2-1 mg/kg verwendet werden. Alternativ wird die Dosis in Abhängigkeit von dem Oberflächenbereich des Tiers bestimmt, wobei eine beispielhafte Dosis von 0,1-20 mg/m² oder mehr bevorzugt von 5-12 mg/m² reicht. Für kleine Tiere wie Hunde oder Katzen ist eine geeignete Dosis 0,4 mg/kg. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Claudinpolypeptide der Erfindung oder Antagonisten (vorzugsweise aus Genen konstruiert, die von derselben Spezies wie der Patient stammen) oder mittels Injektion oder eines anderen geeigneten Weges einmal oder mehrmals wöchentlich verabreicht, bis sich der Zustand des Tiers gebessert hat, oder sie können auf unbegrenzte Zeit verabreicht werden.
Herstellung von Medikamenten. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Claudinpolypeptiden der Erfindung, Fragmenten und Varianten; Nukleinsäuren, die die Claudinpolypeptide der Erfindung, Fragmente und Varianten kodieren; Agonisten oder Antagonisten der Claudinpolypeptide der Erfindung wie Antikörper; Bindungspartner von humanem Claudin-21-Polypeptid; Komplexe, die aus den Claudinpolypeptiden der Erfindung, Fragmenten, Varianten und Bindungspartnern gebildet wurden, usw. bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder therapeutischen Behandlung jeder hierin offenbarten medizinischen Erkrankung.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, bestimmte Ausführungsformen zu veranschaulichen und nicht den Schutzumfang der Erfindung einzuschränken.
BEISPIEL 1
Identifizierung von humanen Claudinpolypeptiden
Ein Datensatz wurde von Celera Genomics (Rockville, Maryland, USA) erhalten, der eine Auflistung von Aminosäuresequenzen enthielt, von denen vorhergesagt wurde, dass sie von dem menschlichen Genom kodiert werden. Dieser Datensatz wurde mit einem BLAST-Algorithmus durchsucht, um Polypeptide der Claudin-Familie zu identifizieren. Zwei überlappende Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2) wurden als partielle Aminosäuresequenzen eines neuen humanen Claudinpolypeptids, Claudin-21, identifiziert. SEQ ID NO:1 wurde in einer TBLASTN-Suche in humanen genomischen DNA-Sequenzen verwendet, um zwei überlappende genomische DNA-Fragmente zu identifizieren; ein Contig, das von diesen zwei Fragmenten gebildet wird, ist als SEQ ID NO:3 gezeigt. Die Nukleotide 2 bis 592 der SEQ ID NO:3 kodieren eine Aminosäuresequenz, SEQ ID NO:4, die mit SEQ ID NO:1 überlappt und diese an beiden Enden erweitert. Ein Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 mit der von SEQ ID NO:2 und anderen Polypeptiden der Claudin-Familie legte jedoch nahe, dass in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 eine Rasterverschiebung vorlag. Wenn einer der „a"-Reste bei den Nukleotiden 40-42 von SEQ ID NO:3 deletiert wird, ist das Resultat SEQ ID NO:5; die Nukleotide 1 bis 405 von SEQ ID NO:5 kodieren die Aminosäuren 24 bis 158 der SEQ ID NO:2. Ein Erweitern der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 unter Verwendung der Aminosäuren, die von den Nukleotiden 406 bis 591 der SEQ ID NO:5 kodiert werden, produziert SEQ ID NO:6, bei der es sich um die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vollständigen Claudin-21-Polypeptids handelt. (Die Nukleotide 1 bis 591 der SEQ ID NO:5 kodieren die Aminosäuren 24 bis 220 der SEQ ID NO:6.) Der Unterschied zwischen den N-terminalen Regionen von SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 kann eine allelische Variation zwischen Nukleinsäuren, die diese Aminosäuresequenzen kodieren, darstellen. Eine Aminosäuresequenz der Maus (SEQ ID NO:7) wurde identifiziert, die ein hohes Ausmaß an Sequenzähnlichkeit zu sowohl dem humanen Claudin-21 (SEQ ID NO:6) und dem humanen Claudin-22 (SEQ ID NO:11) aufzeigt; dieses Polypeptid der Maus wird hierin als „marines Claudin-21" bezeichnet, da es dem humanen Claudin-21 etwas ähnlicher ist als dem humanen Claudin-22.
Wir identifizierten humanes Claudin-19 (SEQ ID NO:8) in den Daten, die automatisch vom Ensembl Project des Sanger Centre (ensembl.org) erzeugt wurden, als Gen ENSG00000066018 und es scheint, als seien wir die ersten, die dieses Polypeptid als ein humanes Claudinpolypeptid mit Claudinpolypeptid-Aktivität und das humane Homolog der partiellen Sequenz des murinen Claudin-19 (SEQ ID NO:9) identifiziert haben. Darüber hinaus wurde eine Variante der Sequenz des humanen Claudin-19-Polypeptids identifiziert (SEQ ID NO:10); diese Variante weist eine Sequenz der Aminosäuren 19 bis 33 der SEQ ID NO:10 anstelle der Aminosäuren 19 bis 38 der SEQ ID NO:8 auf, möglicherweise infolge einer allelischen oder Spleißvariation. Wir identifizierten Aminosäuresequenzen, die sich aus humanem Claudin-22 zusammensetzen (SEQ ID NO:11), in den Daten, die automatisch von Celera erzeugt wurden, und es scheint, als seien wir die ersten, die diese Polypeptidsequenzen als humane Claudinpolypeptide mit Claudinpolypeptid-Aktivität identifiziert haben.
Die Aminosäuresequenzen von humanem Claudin-19 (SEQ ID NO:8), murinem Claudin-19 (SEQ ID NO:9), der Variante von humanem Claudin-19 (SEQ ID NO:10), humanem Claudin-21 (SEQ ID NO:6), der Variante von humanem Claudin-21 (SEQ ID NO:4), murinem „Claudin-21" (SEQ ID NO:7) und humanem Claudin-22 (SEQ ID NO:11) wurden mit den Aminosäuresequenzen anderer Claudin-Familienmitglieder wie Claudin-1 (SEQ ID NO:12) und Claudin-7 (SEQ ID NO:13) verglichen, wie in Tabelle 1 unten gezeigt. Dieser Vergleich verwendete das GCG-„pretty"-Programm mit Alignment mehrerer Sequenzen, mit der Aminosäureähnlichkeitsbewertungsmatrix = blosum62, einem Gap-Erzeugungspenalty = 8 und einem Gap-Erweiterungspenalty = 2. Das Alignment dieser in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen zeigt großgeschriebene Consensus-Reste, die bei mindestens fünf der Aminosäuresequenzen in dem Alignment identisch sind. Humanes Claudin-21 zeigt eine Aminosäureidentität von etwa 36-40% zu anderen Claudinpolypeptid-Familienmitgliedern und eine Aminosäureähnlichkeit von etwa 54-57% (basierend auf der blosum62-Vergleichsmatrix).
Von Aminosäuresubstitutionen und anderen Veränderungen (Deletionen, Insertionen usw.) an den Claudinpolypeptiden der Erfindung wird vorhergesagt, dass sie Claudinpolypeptid-Aktivitäten wahrscheinlicher verändern oder stören, wenn sie in Veränderungen an den in Tabelle 1 gezeigten großgeschriebenen Resten resultieren und insbesondere wenn diese Veränderungen nicht einen Rest substituieren, der in anderen Claudinpolypeptiden an dieser konservierten Position vorliegt. Umgekehrt, wenn eine Veränderung an einer Claudin-Aminosäuresequenz vorgenommen wird, die in einer Substitution von einem oder mehreren Consensus-sequenz-Resten der Tabelle 1 durch den Claudinpolypeptid-Rest an dieser konservierten Position resultiert, ist es weniger wahrscheinlich, dass eine solche Veränderung die Claudinpolypeptid-Funktion beeinflussen wird. Zum Beispiel ist der Consensus-Rest an Position 50 in Tabelle 1 Tyrosin und einige Claudinpolypeptide haben ein Threonin oder ein Isoleucin an dieser Position. Die Substitution von Threonin oder eines Isoleucins oder chemisch ähnlicher Reste wie Serin oder einer der aliphatischen Aminosäuren an dieser Position wird derart betrachtet, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass sie die Funktion des Polypeptids zu verändern, als die Substitution von geladenen Resten wie Lysin oder Arginin usw.
Ausführungsformen der Erfindung beinhalten Claudinpolypeptide und Fragmente von Claudinpolypeptiden, die veränderte Aminosäuresequenzen umfassen. Veränderte Sequenzen von Claudin-19-, -21- oder -22-Polypeptid teilen mindestens 30% oder mehr bevorzugt mindestens 40% oder mehr bevorzugt mindestens 50% oder mehr bevorzugt mindestens 55% oder mehr bevorzugt mindestens 60% oder mehr bevorzugt mindestens 65% oder mehr bevorzugt mindestens 70% oder mehr bevorzugt mindestens 75% oder mehr bevorzugt mindestens 80% oder mehr bevorzugt mindestens 85% oder mehr bevorzugt mindestens 90% oder mehr bevorzugt mindestens 95% oder mehr bevorzugt mindestens 97,5% oder mehr bevorzugt mindestens 99% oder mehr bevorzugt mindestens 99,5% Aminosäureidentität mit einer in Tabelle 1 gezeigten Claudin-Aminosäuresequenz.
Nukleinsäuresequenzen, die humanes Claudin-19 kodieren, kartieren auf das menschliche Chromosom 1p32.3. Nukleinsäuresequenzen, die humanes Claudin-21 kodieren, kartieren auf das menschliche Chromosom 4q35.1. Nukleinsäuresequenzen, die humanes Claudin-22 kodieren, kartieren auf das menschliche Chromosom 11q23.2. Nukleinsäuren, die Claudinpolypeptide der Erfindung kodieren, können zum Analysieren genetischer Anomalien verwendet werden, die beispielsweise mit diesen Chromosomregionen assoziiert werden, was einem Fachmann ermöglicht, Patienten zu identifizieren, in denen Chromosomregionen, die Claudin kodierende Sequenzen umfassen, neu angeordnet oder deletiert werden. Nukleinsäuren, die zum Bestätigen oder Eliminieren eines bestimmten genetischen Locus als einem genetischen Faktor für ein Kindred, das eine Erbkrankheit aufweist, verwendet werden können, weisen einen erheblichen Nutzen auf.
BEISPIEL 2
Expression von humanen Claudin-21-Transkripten und -Proteinen
Die Expression von humanem Claudin-21 in unterschiedlichen Geweben wurde unter Anwendung von RT-PCR nachgewiesen. Claudin-21-Transkripte wurden in den folgenden Geweben vom Menschen nachgewiesen: Herz, Niere, Lunge, Magen, Plazenta, Thymus, Leber und Knochenmark, wobei erheblich höhere Expressionsniveaus in Niere, Plazenta, Magen und Herz als in anderen Geweben beobachtet wurden.
Ein Fusionsprotein, das humanes Claudin-21-Polypeptid und das FLAG-Epitop umfasst, wurde in COS-Zellen exprimiert, die mit NP-40 extrahiert wurden, um eine NP-40-lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion zu bilden. Die lösliche und die unlösliche Fraktion wurden in doppelter Ausführung einer Elektrophorese unterzogen und auf Western-Blots unter Verwendung von Antikörpern, die für entweder das FLAG-Epitop oder das Claudin-21-Polypeptid spezifisch sind, nachgewiesen. Beide Antikörper erkannten Banden von ähnlicher Größe in sowohl der lösliche als auch der unlöslichen Fraktion, wobei in der NP-40-löslichen Fraktion mehr Protein nachgewiesen wurde, aber in der unlöslichen Fraktion auch eine beträchtliche Proteinmenge nachgewiesen wurde. Die Unlöslichkeit in NP-40 ist für Proteine charakteristisch, die mit Zytoskelettstrukturen wie Tight junctions assoziiert werden. Eine Teilung von humanem Claudin-21 liegt in einer NP-40-unlöslichen Fraktion vor, auch wenn COS-Zellen keine Tight junctions bilden.
Das Fusionsprotein aus humanem Claudin-21 und FLAG wurde auch in CV1-Zellen exprimiert. Wenn COS-Zellen und CV1-Zellen, die das Fusionsprotein aus Claudin-21 und FLAG exprimieren, mit markierten Anti-FLAG-Antikörpern behandelt wurden, wurde in Regionen eines Zell-Zell-Kontakts in sowohl den COS- als auch den CV1-Zellkulturen eine Färbung nachgewiesen.
Die Expression von humanem Claudin-21 in T84-Darmepithelzellen vom Menschen wurde mittels Immunfluoreszenz unter Anwendung von Konfokalmikroskopie nachgewiesen. Die T84-Zellen wurden mit rot fluoreszierenden Antikörpern, die für Claudin-21 spezifisch waren, und grün fluoreszierenden Antikörpern, die für ZO-1 spezifisch waren, behandelt; die Kolokalisierung von Claudin-21 und ZO-1 erscheint unter Anwendung dieses Verfahrens gelb. Obwohl ein variierendes Ausmaß roter Fluoreszenz, die das Vorliegen von Claudin-21 anzeigt, in den Zellen vorlag, zeigte ein En-face-Bild der Zellen eine intensive gelbe Färbung an den Rändern der Zellen und ein senkrechter Schnitt durch die T84-Zellmonoschicht offenbarte eine Kolokalisierung von Claudin-21 und ZO-1 an Tight junctions, die als gelbe Punkte erschien.

Obwohl die vorstehende Erfindung mittels Veranschaulichung und Beispielen zum Zwecke des deutlichen Verständnisses in gewissen Einzelheiten beschrieben worden ist, wird es Fachleuten in Anbetracht der Lehren dieser Erfindung ohne weiteres ersichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen an dieser vorgenommen werden können. Im Sequenzprotokoll dargestellte Sequenzen

SEQ ID NO	Art der Sequenz	Beschreibung
SEQ ID NO:1	Aminosäure	Fragment von humanem Claudin-21
SEQ ID NO:2	Aminosäure	Fragment von humanem Claudin-21
SEQ ID NO:3	Nukleotid	Humane genomische DNA
SEQ ID NO:4	Aminosäure	Variante von humanem Claudin-21, die von SEQ ID NO:3 kodiert wird
SEQ ID NO:5	Nukleotid	Humane genomische DNA, SEQ ID NO:3 mit einem Rest deletiert
SEQ ID NO:6	Aminosäure	Humanes Claudin-21
SEQ ID NO:7	Aminosäure	Murines „Claudin-21" (GenBank AK008821)
SEQ ID NO:8	Aminosäure	Humanes Claudin-19
SEQ ID NO:9	Aminosäure	Murines Claudin-19 (partielle Sequenz, GenBank AAF98323)
SEQ ID NO:10	Aminosäure	Variante von humanem Claudin-19 (partielle Sequenz)
SEQ ID NO:11	Aminosäure	Humanes Claudin-22
SEQ ID NO:12	Aminosäure	Homo sapiens-Claudin-1
SEQ ID NO:13	Aminosäure	Homo sapiens-Claudin-7

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4 und Aminosäuren 1 bis 13 der SEQ ID NO:4; (b) SEQ ID NO:6; (c) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1 bis 33 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 11 bis 30 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 12 bis 26 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 25 bis 220 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 34 bis 81 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 101 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 102 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 103 bis 116 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 117 bis 145 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 118 bis 137 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 146 bis 161 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 181 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 191 der SEQ ID NO:6, and Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6; (d) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c) umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, und mit einer Claudinpolypeptid-Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung, und PDZ-Domänenbindungsaktivität; (e) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen des extrazellulären Loops; (f) Fragmenten einer der Aminosäuresequenzen aus (a)-(c), umfassend Aminosäuresequenzen der zytoplasmatischen Schwanzdomäne; (g) Aminosäuresequenzen mit Claudinpolypeptid-Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel- Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung, und PDZ-Domänenbindungsaktivität, und mindestens 30 Aminosäuren umfassend, und welche Aminosäureidentität mit einer der Aminosäuresequenzen von (a)-(f) teilen, wobei der Prozentsatz an Aminosäureidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mehr als 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99%, und mindestens 99,5%; und (h) einer Aminosäuresequenz von (g), wobei ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz von (g) an einen Antikörper bindet, der auch an ein Polypeptid, umfassend eine der Aminosäuresequenzen von (a)-(f), bindet.
Ein isoliertes Polypeptid mit PDZ-Domänenbindungsaktivität, und umfassend eine Aminosäuresequenz, die mehr als 90% Aminosäureidentität über ihre Länge mit Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6 teilt.
Eine isolierte Nukleinsäure bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die (i) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:4; (b) SEQ ID NO:6; (c) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 25 to 220 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 117 bis 145 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 118 bis 137 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 146 bis 161 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 181 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 162 bis 191 der SEQ ID NO:6, und Aminosäuren 192 bis 220 der SEQ ID NO:6; und (d) einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1 bis 33 der SEQ ID NO:6, Aminosäuren 82 bis 101 der SEQ ID NO:6, und Aminosäuren 82 bis 102 der SEQ ID NO:6; oder (ii) ein Polypeptid gemäß Anspruch 2 kodiert; und die mit 1 bis 100.000 zusätzlichen Nukleotiden kovalent an einem Ende, an jedem Ende oder an beiden Enden, verbunden ist.
Eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit Claudinpolypeptid-Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin-Bindung, und PDZ-Domänenbindungsaktivität, kodiert, und die eine Nukleotidsequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen der Nukleinsäuren gemäß Ansprüchen 3(i)(a)-(c) und 3(ii) teilt, wobei der Prozentsatz an Nukleotidsequenzidentität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99%, und mindestens 99,5%.
Die Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Nukleinsäure aus (i) SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5; oder (ii) SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 und kovalent verbunden 1 bis 100,000 zusätzlichen Nukleotiden an einem Ende, an jedem Ende oder an beiden Enden, besteht.
Ein Expressionsvektor, umfassend mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5.
Eine isolierte rekombinante Wirtszelle, umfassend mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 6.
Eine rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 7, wobei die Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, welches durch eine Nukleinsäure gemäß einem der Asprüche 3 bis 5 kodiert ist, umfassend das Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression dieses Polypeptids fördern, wobei die rekombinante Wirtszelle mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 umfaßt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, des weiteren umfassend das Reinigen dieses Polypeptids.
Ein Polypeptid hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Polypeptid das in Anspruch 3(i) oder 3(ii) genannte ist, und die rekombinante Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Ein isolierter Antikörper, welcher an ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11 bindet.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 12, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 12, wobei der Antikörper ein humaner Antikörper ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 12, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 12, wobei der Antikörper die Aktivität eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11 hemmt.
Ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Claudinpolypeptid-Aktivität verändern, umfassend (a) das Mischen einer Testverbindung mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11; und (b) das Feststellen, ob die Testverbindung die Claudinpolypeptid-Aktivität dieses Polypeptids verändert, wobei die Claudinpolypeptid-Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tight junction-Bildungsaktivität, Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion, Ionentransportaktivität, homotypischer Bindung, heterotypischer Bindung, Bindung an virales Protein, Enterotoxin Bindung, und PDZ-Domänenbindungsaktivität.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die PDZ-Domänenbindungsaktivität von Claudinpolypeptiden hemmen, unfassend (a) das Mischen einer Testverbindung mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11 und einem Bindungspartner dieses Polypeptids; und (b) das Feststellen, ob die Testverbindung die Bindungsaktivität dieses Polypeptids hemmt.
Das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11, oder ein Antagonist dieses Polypeptids, zur Verwendung in der Therapie, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-RNA, Antisense-DNA, Ribozymen wie Hammerhead-Ribozymen und RNA Endoribonuklease-Ribozymen, Antikörpern und Triele-Helix Antagonisten.
Ein Polypeptid gemäß Anspruch 19 zur darin angegebenen Verwendung, wobei die Verwendung zur Erhöhung der Tight junction Bildungsaktivität oder der Aktivität der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion in einem Patienten, oder zur Behandlung einer Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion dient.
Die Verwendung eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Tight junction Bildungsaktivität oder der Aktivität der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion in einem Patienten, oder zur Behandlung einer Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion.
Ein Antagonist gemäß Anspruch 19 zur darin angegebenen Verwendung, wobei die Verwendung zur Verminderung der Tight junction Bildungsaktivität oder der Aktivität der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion in einem Patienten, oder zur Behandlung einer Erkrankung, die Enterotoxin-Kontakt involviert, dient.
Die Verwendung eines Antagonisten von Polypeptiden gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verminderung der Tight junction Bildungsaktivität oder der Aktivität der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion in einem Patienten, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-RNA, Antisense-DNA, Ribozymen wie Hammerhead-Ribozymen und RNA-Endoribonuklease-Ribozymen, Antikörpern und Triele-Helix Antagonisten.
Die Verwendung eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 19 zur darin genannten Verwendung, oder die Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Erkrankung der Epithel- oder Endothel-Barrierefunktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Asthma, Allergie, Metastasen von Krebszellen, Ionentransporterkrankungen wie Magnesiumtransportdefekte in der Niere, und entzündlichen Darmerkrankungen.
Verwendung eines Antagonisten von Polypeptiden gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder gemäß Anspruch 11, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung, die Enterotoxin-Kontakt involviert, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-RNA, Antisense-DNA, Ribozymen wie Hammerhead-Ribozymen und RNA-Endoribonuklease-Ribozymen, Antikörpern und Triele-Helix Antagonisten.
Der Antagonist gemäß Anspruch 22 zur darin genannten Verwendung, oder die Verwendung eines Antagonisten gemäß Anspruch 26, wobei die Erkrankung, welche Enterotoxin-Kontakt involviert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Kontakt mit Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE) und plötzlichem Kindstod Syndrom (SIDS).