DE60128452T2

DE60128452T2 - Monoklonale antikörper gegen den menschlichen ldl-rezeptor, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60128452T2
Application number: DE60128452T
Authority: DE
Inventors: Nachum Yonah; Dany Suissa; Ilana Belzer; Moshe Smolarsky; Francesco Antonetti; Michel Dreano
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: SI1263790T1; YU68602A; US6849720B2; EA007494B1; US20030186343A1; CA2402593C; JP4768193B2; MXPA02009091A; CA2402593A1; EP1263790A1; EE200200517A; IL151713A0; IL139217A0; RS51406B; DK1263790T3; PL358381A1; HUP0300142A2; KR100882081B1; PT1263790E; CZ20023098A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, welche spezifisch den menschlichen Rezeptor für Lipoproteine mit geringer Dichte (LDLR, low-density lipoprotein receptor) erkennen. Diese Antikörper sind bedeutsam, beispielsweise zur Identifizierung und Aufreinigung von menschlichem löslichen LDLR (hsLDLR) in Produktionsprozessen, wie auch in der Identifizierung und Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. Hepatitis C-Infektionen (HCV).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Cholesterol ist eine Komponente, von allen eukaryontischen Plasmamembranen und ist essentiell für das Wachstum und die Überlebensfähigkeit von Zellen in höheren Organismen. Jedoch verursachen hohe Serum-Niveaus von Cholesterol Erkrankungen und Tod dadurch, dass sie zur Ausbildung von atherosklerotischen Plaquen in Arterien über den gesamten Körper hinweg beitragen. Die Hauptstelle der Cholesterolsynthese in Säugetieren ist die Leber. Merkliche Mengen von Cholesterol werden auch im Darm gebildet. Die Rate der Cholesterolausbildung durch diese Organe ist hoch responsiv auf die Menge an Cholesterol absorbiert aus Nahrungsquellen. Zellen außerhalb der Nähe des Darms nehmen Cholesterol aus dem Plasma auf, anstelle es de novo zu synthetisieren. Cholesterol und andere Lipide werden transportiert in Körperflüssigkeiten durch Lipoproteine, welche klassifiziert werden entsprechend zunehmender Dichte. Ein Lipoprotein ist ein Partikel, welcher aus einem Kern von hydrophoben Lipiden besteht, umgeben durch eine Schale von polaren Lipiden und Apoproteinen. Diese Lipoproteine spielen zwei Rollen. Sie lösen hochhydrophobe Lipide auf und sie enthalten Signale, welche die Bewegung von speziellen Lipiden in und aus spezifischen Targetzellen und Geweben regulieren. Cholesterol wird in Körperflüssigkeiten transportiert durch Lipoproteine von geringer Dichte (LDL), welche an einen spezifischen Rezeptor an der Plasmamembran von nicht hepatischen Zellen binden. Der Rezeptor-LDL-Komplex wird dann in die Zelle eingeschleust durch einen Transportmechanismus, welcher als Rezeptor mediatisierte Endocytose bezeichnet wird (Goldstein et al. 1979). Der low density lipoprotein (LDL)-Rezeptor ist der Prototyp einer Familie von strukturell verwandten Zelloberflächenrezeptoren, welche die Endocytose von multiplen Liganden in Säugetierzellen vermitteln.
Der LDL-Rezeptor besteht aus 822 Aminosäureresten und weist ein Molekulargewicht von 164.000 auf. Er besteht aus mehreren Domänen, wobei einige davon eine Sequenzhomologie mit anderen Proteinen zeigen. Seine NH₂-terminate Ligandenbindende Domäne besteht aus 292 Resten, angeordnet in 7 Cystein-reichen unvollständigen Wiederholungen. Jede Wiederholung enthält 6 Cystein-Reste, welche über Disulfid gebunden sind in dem Muster eins zu drei, zwei zu fünf und vier zu sechs (Bieri et al. 1995). Auf diese Domäne folgen vier weitere Domänen: die erste besteht aus 400 Aminosäureresten und ist homolog zum EGF-Rezeptor, die zweite besteht aus 58 Aminosäureresten, welche reich an O-verknüpften Zuckern sind, die dritte ist eine einzelne Transmembrandomäne von 22 Aminosäureresten und die vierte ist eine cytoplasmische Domäne von 50 Aminosäureresten (Sudhof et al. 1985), (Brown et al. 1986).
Die physiologische Bedeutung des LDL-Rezeptors wurde duch die Untersuchungen von Brown und Goldstein zur familiären Hypercholesterolemie (FH) begründet. Diese Erkrankung zeigte sich als ausgelöst durch einen molekulargenetischen Defekt, welcher von der Abwesenheit oder Effizienz von funktionellen Rezeptoren für LDL herrührte (Brown et al. 1976). Mehrere Klassen von FH-Mutationen wurden charakterisiert (Goldstein et al. 1975).
Eine lösliche Form des sLDLR, welche antivirale Aktivität zeigte, wurde identifiziert und isoliert aus Kulturüberstand von Interferon-induzierten Zellen (Fischer et al., 1993) und in Körperflüssigkeiten (Fischer et al.). Mehrere Interferon-induzierte Proteine wurden identifiziert, welche instrumentell in der Induktion des antiviralen Zustandes durch IFNs sind. Ein solches Protein, welches antivirale Aktivität zeigt, wurde produziert und akkumuliert in Kulturüberstand von menschlichem Amnion WISH-Zellen. Dieses Protein wurde zur Homogenität aufgereinigt und als der sLDLR identifiziert (siehe EP 0 553 667 und Fischer et al. 1993). Der sLDLR zeigte sich als in das Medium durch Säugetierzellen sekretiert, welche einen antiviralen Zustand als Antwort auf Interferon einleiten. Im Gegensatz zu Interferon induziert sLDLR nicht einen antiviralen Zustand in den Zellen, sondern ist selbst antiviral. Es zeigte sich, dass sLDLR offensichtlich über den Prozess der viralen Replikationsreifung und Knospung hinweg vorlag, was nahe legt, dass er in einen komplexen Prozess involviert ist, welcher zur Inhibierung von Virusanordnung und Knospung führt (nicht publizierte Daten). Endocytose von Hepatitis C-Virus wurde in jüngster Zeit gezeigt als ein Vorgang, der durch LDL-Rezeptoren in kultivierten Zellen mediatisiert wird (Agnello et al., 1999). Diese und andere Ergebnisse legen nahe, dass die Familie von LDL-Rezeptoren als viraler Rezeptor fungieren kann. Folglich können Antikörper, induziert gegen den sLDLR-Rezeptor den Eintritt und die Knospung von viralen Partikeln blockieren durch Binden an den zellulären LDL-Rezeptor.
Der einzig verfügbare monoklonale Antikörper gegen LDLR, der bislang bekannt ist, ist C7, ein Antikörper gegen LDLR aus Rindern (Beisiegel et al., 1981, kommerziell verfügbar von Amersham, UK), welcher hergestellt wurde durch Immunisierung von Mäusen mit dem adrenalen Cortex LDLR von Rindern, aufgereinigt zur Homogenität. Membrane aus dem adrenalen Cortex von Rindern wurde gelöst und der Rezeptor wurde teilweise aufgereinigt durch Eluieren aus einer DEAE-Cellulosesäure (Beisiegel et al. 1981). Der Antikörper gegen Rinder-LDLR ist nur schwach kreuzreaktiv mit menschlichem LDLR.
Tatsächlich fand sich, dass der C7 Mab gegen Rinder-LDLR signifikante Nachteile aufwies, wenn er zum Nachweis und zur Quantifizierung von rekombinantem menschlichem LDLR eingesetzt wurde:
er zeigt eine sehr geringe Affinität gegenüber menschlichem LDLR;
er reagiert signifikant über Kreuz mit Zellkultur-abgeleiteten Verunreinigungen.
Van Driel I. et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, no. 16, 5 June 1989 (1989-06-05), pp. 9533-9538 offenbart einen Festphasen-Liganden-Bindungsassay für LDLR-Rezeptoren, wobei Antikörper gerichtet auf eine entsprechende Domäne des LDLR-Rezeptors verwendet werden. Explizit erwähnt sind die monoklonalen Antikörper C7, 15C8, HL1, und 4A4, verwendet gegen den menschlichen LDL-Rezeptor.
Driel, I. et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 262, Nr. 33, 16127-16134, 1987 offenbart die Verwendung der monoklonalen Antikörper C7, 15C8, und HL1 in einer Untersuchung bezüglich der Rolle der cytoplasmischen Domäne des LDL-Rezeptors bei der Selbstassoziierung in Oligomere und beim Clustering in Coated Pits.
Driel, I. et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 262, Nr. 36, 17443-17449, 1987 offenbart das Binden der erste cysteinreichen Widerholung der Liganden-Bindungsdomäne von LDLR gegen Antikörper 15C8 und C7.
V. Agnello et al., Proceedings of the National Academy of the Sciences of the USA, vol. 96, no. 22, 26 October 1999 (1999-10-26), pp. 12766-12771 offenbart, dass die Endocytose des Hepatitis-C-Virus mediatisiert wird durch LDL-Rezeptoren in kultivierten Zellen. Innerhalb der präsentierten Untersuchungen wird ein monoklonaler Anti-LDL-Rezeptor-Antikörper, d.h. C7, verwendet, um die Endocytose zu inhibieren.
Neben diesen Antikörpern waren spezifische Antikörper gegen menschliches LDLR zuvor nicht verfügbar. Dies erscheint überraschend, da es sehr üblich ist, Antikörper gegen neue Proteine zu induzieren, sei es zur Aufreinigung, oder zur Identifizierung für die Assayentwicklung. Es ist möglich, dass solche Antikörper bislang nicht erzeugt worden sind, da eine Bedingung zum Erzeugen solcher monoklonaler Antikörper die Verfügbarkeit von hinreichend großen Mengen an hoch aufgereinigtem Antigen ist, was die effiziente Immunisierung von Mäusen ermöglicht. Ein hoch aufgereinigtes Antigen ist eines, welches in einem einzigen Hauptpeak in RP-HPLC erscheint. Desweiteren waren Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Antigen während Aufreinigungsprozessen nicht leicht zu etablieren. In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde ein antiviraler Aktivitätsassay, wie hier beschrieben, eingesetzt zur Identifizierung von LDLR während Aufreinigungsprozessen.
Es besteht ein Bedarf, spezifische Mabs gegenüber menschlichem LDLR zu erzeugen, um die Mittel zum Entwickeln eines effizienten Immunoassays (ELISA) bereitzustellen sowie für die Identifizierung des Proteins im Western Blot. Diese Antikörper sind nötig für das Studieren und die Quantifizierung des rekombinanten menschlichen löslichen LDLR während der Entwicklung der Produktions- und Aufreinigungsprozesse des rekombinanten Proteins sowie zum Nachweis des natürlichen Proteins.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erzeugung von Hybridoma-Zelllinien, welche monoklonale Antikörper erzeugen, die in der Lage sind, spezifisch den menschlichen LDLR-Rezeptor und Fragmente davon zu erkennen und zu binden.
Genauer gesagt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Hybridoma-Zelllinien, welche monoklonale Antikörper erzeugen, die in der Lage sind, spezifisch den menschlichen löslichen LDLR-Rezeptor zu erkennen und zu binden.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper, chimären Antikörper, vollständig humanisierten Antikörper, Anti-Anti-ID-Antikörper oder ein Fragment davon, welches spezifisch menschlichen löslichen LDL-Rezeptor erkennt und bindet sowie Fragmente davon, welcher in der Lage ist, die Replikation des Hepatitis-C-Virus zu inhibieren, und welcher erhältlich ist durch Immunisieren von Tieren mit menschlichem löslichen LDLR+291, d.h. der menschlichen löslichen Rezeptorform, welche die Aminosäuresequenz von Asp+4 bis Glu+291 der menschlichen löslichen LDLR-Sequenz einschließt, außer den monoklonalen Antikörper C7.
Die vorliegende Erfindung stellt solche Antikörper zur Verfügung, welche menschlichen löslichen LDLR erkennen und binden und die folgenden Anforderungen erfüllen:
Antikörper, welche als ein Paar in einem ELISA eingesetzt werden können, beispielsweise einem Sandwich-ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) zum Nachweis von menschlichem löslichen LDLR.
Mabs, welche verwendet werden können zur Identifizierung des LDLR in Wester Blot-Anaylse.
Mabs, welche verwendet werden können, um die antivirale biologische Aktivität des menschlichen löslichen LDLRs zu neutralisieren.
Mabs, welche verwendet werden können, um virale Infektion, wie z.B. von HCV, zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Verfügung zum Inhibieren der Replikation von Hepatitis-C-Virus umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper der Erfindung vor der Infektion durch den Hepatitis C-Virus, im die Replikation des Hepatitis C in der Zelle zu inhibieren, wie auch die Verwendung des monoklonalen Antikörpers der Erfindung zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung der Hepatitis-C-Infektion.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von menschlichem LDLR, welches die Verwendung des spezifischen monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung in einer bekannten Art und Weise für diesen Zweck involviert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch geklonte Hybridoma zur Verfügung, umfassend eine Milzzelle von einem Säugetier, immunisiert mit dem rekombinanten menschlichen LDLR sowie eine homogene oder heterogene Lymphoidzelle.
Ein monoklonaler Antikörper entsprechend der Erfindung wird hergestellt auf konventionelle Art und Weise, d.h. beispielsweise durch Kultivieren eines geklonte Hybridoms, umfassend eine Milzzelle von einem Säugetier, immunisiert mit hsLDL sowie eine homogene oder heterogene Lymphoidzelle in flüssigem Medium oder Säugetier-Abdomen, um zu ermöglichen, dass das Hybridom den monoklonalen Antikörper erzeugt und akkumuliert.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Verfügung, zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers umfassend das Kultivieren eines geklonten Hybridoms umfassend eine Milzzelle von einem Säugetier, immunisiert mit hoch aufgereinigten menschlichem löslichem LDLR+291, d.h. der menschlichen löslichen Rezeptorform, einschließend die Aminosäuresequenz von Asp+4 bis Glu+291 der menschlich löslichen LDLR-Sequenz und eine homogene oder heterogene lymphoide Zelle in flüssigem Medium oder Säugetier-Abdomen, um zu ermöglichen, dass das Hybridom den monoklonalen Antikörper erzeugt und akkumuliert. Desweiteren wird ein Verfahren zum Aufreinigen von menschlichem LDLR bereitgestellt, welches das Inkontaktbringen eines Materials, welches rohen menschlichen LDLR umfasst mit dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine Säule mit adsorbiertem LDLR-spezifischen monoklonalen Antikörper kann verwendet werden, als ein Affinitätsaufreinigungsschritt, in dem Aufreinigungsprozess des rekombinanten Proteins.
Ein Verfahren zum Nachweis und Messen von rekombinantem menschlichem LDLR, welches die Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung als Antikörperkomponente in einem ELISA-Assay umfasst, wird in Beispiel 5 beschrieben. Als den LDLR oder als Fragment eines LDLRs zum Immunisieren von Tieren kann irgendein LDLR verwendet werden, solange als er der LDLR eines Warmblut-Säugetiers ist. Eine mutierte Form von LDLR kann auch verwendet werden. Ein repräsentatives Beispiel eines solchen Säugetier-menschlichen, löslichen LDLRs ist die lösliche LDLR+291 Form, welche die Aminsoäuresequenz einschließt, die an der Aminosäure Asp an Position +4 beginnt und mit der Aminosäure Glu an Position +291 der Sequenz von menschlichem LDLR endet, wobei jede andere Form ebenso verwendet werden kann, wie z.B. die +292-Form etc.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Flussdiagramm, welches die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen r-hsLDLR zeigt.
2 zeigt eine Western Blot Analyse der +291-Form von r-hsLDLR in Zeile 1, den Urin-hsLDLR in Zeile 2 und dem rekombinanten menschlichen p55 TNF-Rezeptor als Negativkontrolle (r-hsTBP-1) in Zeile 3, wobei die monoklonalen Antikörper unter jedem Streifen angezeigt werden. Die Pfeile auf der linken Seite der Figur zeigen die Position der Molekulargewichtmarker und die Pfeile auf der rechten Seite der Figur zeigen die Position der hsLDLR-Form, welche oberhalb eines jeden Pfeiles angegeben wird.
3 zeigt die Effekte von Mabs 12.6, 28 und 29.8 auf die Produktion von HCV(+) und (-) Stämmen in Kultur FT167. Zellen wurden 30 Minuten vor der Infektion mit Mab Anti-LDLR (8 oder 2 μg/ml) behandelt. Anschließend wurden die Zellen über Nacht infiziert mit 25 μl von HCV(+) Serum (N°42;1b). Am Tag nach der Infektion wurden drei Waschungen durchgeführt und neues Medium wurde hinzugefügt und alle 48 Stunden verändert. Fünf Tage nach Infektion wurden die Hepatocyten geerntet, RNA wurde aufgereinigt und 1 μg zelluläre RNA wurde analysiert durch rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Die Assays wurden doppelt durchgeführt.

+SP: positiver Stamm: RNA-Assay; -SP: negativer Stamm: RNA-Assay; X: leer.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Monoklonale Antikörper (Mabs) gegen menschliches lösliches LDLR (hsLDLR) wurden erzeugt. Unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper wurden ein ELISA und eine Westernblot-Prozedur zur Identifizierung von hsLDLR sowie ein Neutralisierungsassay für die antivirale Aktivität von hsLDLR entwickelt.
Die Mabs wurden erzeugt in Mäusen, immunisiert mit der rekombinanten +291 Form von hsLDLR, welcher aus der N-terminalen liganden Bindungsdomäne des menschlichen löslichen LDLRs besteht, von Asp +4 bis Glu +291. Die rekombinante +291 Form von hsLDLR wurde erzeugt in CHO-Zellen und aufgereinigt zur Homogenität.
Die immunisierten Mäuse erzeugten signifikante Titer von spezifischen Antikörpern. Nach dem Screenen der Hybridomas wurden 5 Klone (Nummern 12, 28, 29, 30 und 50) identifiziert als diejenigen, welche die meisten Antikörper produzierten. Diese Klone wurden ausgewählt für weiteres Subklonieren. Nach dem Subklonieren wurden 29 Subklone, welche hohe Antikörperproduktivität aufwiesen, isoliert und Ampullen aus den Elternklonen, bzw. von Subklonen wurden gefroren.
Ein Paar von monoklonalen Antikörpern wurde ausgewählt für den ELISA für den r-hsLDLR. Mab 28 wurde ausgewählt als Coating-Antikörper und Mab 29.8, gelabelt mit Biotin, wurde als zweiter Antikörper ausgewählt. Mabs 12.6 und 29.8 zeigten sich als geeignet für die Identifikation des nativen und rekombinanten hsLDLR in Westernblotanalyse und die Mabs 28 und 30 zeigten sich als geeignet für die Identifizierung des rekombinanten hsLDLR in Westernblotanalyse. Mabs 12.6 und 50.30 zeigten sich als geeignet für die Inhibition der antiviralebn Aktivität von hsLDLR.
Es zeigte sich ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, dass Mabs 12.6, 28 und 29.8 die Replikation des viralen Genoms von Hepatitis C Virus (HCV) in menschlichen Hepatocyten Primärkulturen inhibierten. Folglich können diese Antikörper für die Behandlung von Hepatitis C Infektion (3) verwendet werden.
Der Subklassen-Isotyp des Mabs, erzeugt durch die Klone, wurde bestimmt. Klone 12.6, 28, 29.8 und 30 wurden identifiziert als IgG₁, wobei der Klon 50.3 als IgM identifiziert wurde.
Die Mabs, entwickelt gegen die +291 Form von hsLDLR, erkannten auch andere Formen des hsLDLR, d.h. die +292 Form und die +331 Form des r-hsLDLR, erzeugt in rekombinanten CHO-Zellen, in ELISA und Westerblotanalyse. Die +292 Form umfasst den N-terminalen Abschnitt des Rezeptors vom Aminosäurerest Asp +4 bis Cys +292 und die +331 Form umfasst den N-terminalen Abschnitt des Rezeptors von Aminosäurerest Asp +4 bis Cys +331.
Das Antigen, verwendet zum Immunisieren von Mäusen, zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern war die r-hsLDLR +291 Form, welche in CHO-Zellen produziert wurde. Die Produktion von r-hsLDLR wurde durchgeführt in Bioreaktoren unter Verwendung des stationären Phasenfibracel-Matrixsystems. Der r-hsLDLR wurde aufgereinigt zur Homogenität und zum Immunisieren von Mäusen verwendet.
Immunomilzzellen aus den besten Mausrespondern wurden zur Fusion und zur Erzeugung von Hybridomas verwendet.
Was die Antikörper anbelangt, die hier über die Beschreibung hinweg erwähnt sind, soll der Begriff "monoklonaler Antikörper" monoklonale Antikörper einschließen, chimäre Antikörper, vollständig humanisierte Antikörper, Antikörper gegen anti-Ideotyp-Antikörper (Anti-Anti-ID-Antikörper), welche in löslicher oder gebundener Form gelabelt werden können, sowie Fragmente davon, bereitgestellt durch irgendeine bekannte Technik, wie z.B., jedoch nicht limitiert auf enzymatisches Schneiden, Peptidsynthese oder rekombinante Techniken.
Ein monoklonaler Antikörper enthält eine substantiell homogene Population von Antikörpern, spezifisch für Antigene, wobei die Population substantiell ähnliche Epitopbindungsstellen enthält. Mabs können erhalten werden durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Siehe beispielsweise Kohler und Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U.S. Patent No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); and Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), wobei deren Inhalte per Verweis zur Gänze hier eingeschlossen sind. Solche Antikörper können irgendwelche der Immunoglobulinklasse sein, einschließend IgG, IgM, IgE, IgA, GILD bzw. irgendeine Subklasse davon. Ein Hybridom, welches einen Mab der vorliegenden Erfindung erzeugt, kann kultiviert werden in vitro, in situ oder in vivo. Die Erzeugung von hohen Titern von Mabs in vivo oder in situ macht dies zur derzeit bevorzugten Methode der Produktion.
Chimäre Antikörper sind Moleküle, aus welchen unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet sind, wie z.B. diejenigen, welche variable Regionen aufweisen, abgeleitet von einem murinen Mab und menschliche Immunoglobulin-konstante Regionen. Chimere Antikörper werden in erster Linie verwendet, um die Immunogenizität in der Anwendung zu reduzieren und die Ausbeute in der Produktion zu erhöhen, beispielsweise wo murine Mabs höhere Ausbeuten aus Hybridomas aufweisen, jedoch höhere Immunogenizität in Menschen, so dass menschlich/murine chimäre Mabs verwendet werden. Chimäre Antikörper und Verfahren für ihre Produktion sind im Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., European Patent Application 125023 (veröffentlicht am 14. November 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496 (veröffentlicht am 19. Februar 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Application WO 8601533, (veröffentlicht am 13. März 1986); Kudo et al., European Patent Application 184187 (veröffentlicht am 11. Juni 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., International Patent Application No. WO8702671 (veröffentlicht am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); Riechmann et al., Nature 332:323-327 und Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Diese Referenzen sind zur Gänze per Verweis hier eingeschlossen.
"Vollständig humanisierte Antikörper" sind Moleküle, welche sowohl variable als auch konstante Regionen von menschlichem Immunoglobulin enthalten. Vollständig humanisierte Antikörper können potentiell für therapeutische Anwendungen verwendet werden, wo wiederholte Behandlungen benötigt sind für chronische oder wiederkehrende Erkrankungen, wie z.B. Autoimmunerkrankungen. Ein Verfahren zum Herstellen von vollständigen menschlichen Antikörpern besteht aus der "Humanisierung" des humoralen Maus-Immunsystems, d.h. der Produktion von Mausstämmen, die in der Lage sind, menschliches Ig (Xenomaus) zu erzeugen, und zwar durch Einbringen von Immunoglobulin (Ig) Loc in Mäuse, in welchen die endogenen Ig-Gene inaktiviert wurden. Die Ig-Loci sind über alle Maßen komplex mit Blick sowohl auf ihre physikalische Struktur als auch ihre Genanordnung und Expressionsprozesse benötigt, um ultimativ eine breite Immunantwort zu erzeugen. Antikörperdiversität wird in erster Linie erzeugt durch die kombinatorischen Neuanordnungen zwischen den unterschiedlichen V, D und J-Genen, die in Ig-Loci vorliegen. Diese Loci enthalten auch die durchsetzten regulatorischen Elemente, welche die Antikörper-Expression die Allel-Exklusion, das Class-Switching und die Affinitätsreifung steuern. Das Einbringen von nicht neu angeordneten menschlichen Ig-Transgenen in Mäusen zeigte, dass die Maus-Rekombinationsmaschinerie kompatibel mit menschlichen Genen ist. Desweiteren können Hybridomas, welche antigenspezifische hu-mAbs sekretieren, von verschiedenen Isotypen erhalten werden durch Xenomaus-Immunisierung mit Antigen.
Vollständig humanisierte Antikörper und Verfahren für ihre Produktion sind bekannt im Stand der Technik (Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997): Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000), Patent WO98/24893.
Ein anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, welcher einzigartige Determinanten erkennt, die im allgemeinen assoziiert sind mit der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers. Ein ID-Antikörper kann hergestellt durch Immunisieren eines Tieres mit der gleichen Spezies und des gleichen genetischen Typs (beispielsweise Mausstamm) wie die Quelle des Mabs, für welchen ein Anti-Id hergestellt werden soll. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf antworten durch Produzieren eines Antikörpers gegen diese idiotypischen Determinanten (den Anti-Id-Antikörper). Dies offenbart beispielsweise U.S. Patent No. 4,699,880, welches hier vollständig per Verweis eingeschlossen ist.
Der Anti-Id-Antikörper kann auch verwendet werden als ein "Immunogen", um eine Immunantwort in einem weiteren Tier zu induzieren, welches einen so genannten Anti-Anti-Id-Antikörper erzeugt. Der Anti-Anti-Id kann epitopisch identisch mit dem ursprünglichen Mab sein, welcher den Anti-Id induzierte. Folglich ist es unter Verwendung von Antikörper gegen ideotypische Determinanten eines Mabs, möglich, andere Klone zu identifizieren, welche Antikörper von identischer Spezifität exprimieren.
Dementsprechend können Mabs, erzeugt gegen LDLR, ihre Isoformen, Analoge, Fragmente oder Derivate der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren, wie z.B. BALB/c-Mäusen zu induzieren. Milzzellen von solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um Anti-Id-Hybidomas zu erzeugen, welche Anti-Id-Mabs sekretieren. Desweiteren können Anti-Id-Mabs an einem Träger gekoppelt werden, wie z.B. das Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) und verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Seren aus diesen Mäusen werden Anti-Anti-Id-Antikörper enthalten, welche die Bindungseigenschaften des ursprünglichen Mabs aufweisen, spezifisch für ein Epitop des oben genannten LDLR-Proteins, oder von analogen Fragmenten oder Derivaten davon.
Die Anti-Id-Mabs haben folglich ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", welche strukturell ähnlich sind zu den zu untersuchenden Epitopen. Der Begriff "monoklonaler Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle, wie auch Fragmente davon einschließen, wie z.B. Fab und F(ab')2, welche in der Lage sind, an ein Antigen zu binden. Fab und F(ab')2-Fragmente weisen kein Fc-Fragment des intakten Antikörpers auf, entleeren sich schneller aus dem Kreislauf und können weniger nicht gewebsspezifisches Binden als intakte Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:136-325 (1983)).
Es wird eingesehen werden, dass Fab und F(ab')2 und andere Fragmente der Antikörper, die bedeutsam in der vorliegenden Erfindung sind, verwendet werden können für den Nachweis und die Quantifizierung des LDLR-Proteins entsprechend den Verfahren, die hier für intakte Antikörpermoleküle offenbart werden. Solche Fragmente werden typischerweise produziert durch proteolytisches Schneiden unter Verwendung von Enzymen, wie z.B. Papain, (um Fab-Fragmente zu erzeugen) oder Pepsin, (um F(ab')2-Fragmente) zu erzeugen.
Ein monoklonaler Antikörper wird also "in der Lage zum Binden" bezeichnet, für ein Molekül, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren und damit das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff "Epitop" soll sich auf den Abschnitt irgend eines Moleküls beziehen, der in der Lage ist, durch den Antikörper gebunden zu werden, welcher auch durch den Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder "antigene Determinanten" bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie z.B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und weisen spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristika auf, wie auch spezifische Ladungscharakteristika.
Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein Abschnitt eines Moleküls, welches in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, wobei das Antigen darüber hinaus in der Lage ist, in einem Tier die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die in der Lage sind, an das Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop aufweisen. Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, soll anzeigen, dass das Antigen in einer hochselektiven Art und Weise reagieren wird mit einem Epitop gegen seinen korrespondierenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl von anderen Antikörpern, welche durch andere Antigene induziert werden können.
Die Antikörper, die Fragmente von Antikörpern einschließen, die bedeutsam sind in der vorliegenden Erfindung, können verwendet werden zum quantitativen oder qualitativen Nachweis der LDLR-Proteine in einer Probe oder zum Nachweis des Vorliegens von Zellen, welche die LDLR-Proteine der Erfindung exprimieren. Dies kann realisiert werden durch Immunofluoreszenztechniken, welche fluoreszent gelabelte Antikörper einschließen (siehe unten), gekoppelt mit Fluoreszenzmikroskopie, oder Durchflusscytometrie oder fluorometrischer Detektion.
Die Antikörper (oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung bedeutsam sind, können histologisch eingesetzt werden in Form einer Immunofluoreszenz- oder Immunoelektronen-Mikroskopie, zur in situ-Detektion der LDLR-Proteine der vorliegenden Erfindung. Die in situ-Detektion kann realisiert werden durch Entfernen einer histologischen Probe aus einem Patienten und Bereitstellen des gelabelten Antikörpers der vorliegenden Erfindung für solch eine Probe. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise bereitgestellt durch Einbringen oder durch Überschichten des gelabelten Antikörpers (oder Fragments davon) in eine biologische Probe. Durch die Verwendung einer solchen Prozedur wird es möglich, das Vorliegen von LDLR-Proteinen zu bestimmen, sondern auch ihre Verteilung im untersuchten Gewebe. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung werden die Fachleute auf dem Gebiet leicht einsehen, dass irgendeines einer großen Vielzahl von histologischen Verfahren (wie z.B. Anfärbeprozeduren) modifiziert werden kann, um solch eine in situ-Detektion zu erzielen.
Solche Assays für die LDLR-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe, wie z.B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebsextraktes, frisch geernteter Zellen, wie z.B. Lymphozyten oder Leukozyten oder Zellen, welche inkubiert in Gewebskulturen wurden, in der Gegenwart eines gelabelten Antikörpers, der in der Lage ist, die LDLR-Proteine zu identifizieren sowie den Nachweis des Antikörpers durch irgendeine einer Vielzahl von Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Die biologische Probe kann an eine Festphasenunterlage oder einen Träger, wie z.B. Nitrozellulose gebunden sein, oder irgendeine andere feste Unterlage oder Träger, welcher in der Lage ist, Zellen zu immobilisieren, Zellpartikel oder lösliche Proteine. Die Unterlage oder der Träger können dann gewaschen werden mit geeigneten Puffern, gefolgt von Behandlung mit einem gelabelten Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt. Die Festphasen-Unterlagen oder der Träger können dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Die Menge an gebundenem Label oder an Festphasenunterlage oder Träger können dann nachgewiesen werden mit Hilfe von konventionellen Mitteln. Durch "Festphasenunterlage" oder "Festphasenträger", "feste Unterlage", "fester Träger", "Unterlage" oder "Träger" soll irgendeine Unterlage oder irgendein Träger bezeichnet werden, die in der Lage sind, Antigene oder Antikörper zu binden. Wohl bekannte Unterlagen oder Träger schließen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylonamilasen, natürliche oder modifizierte Zellulosen Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit ein. Die Natur des Trägers kann entweder löslich bis zu einem gewissen Grad sein oder unlöslich für den Zweck der vorliegenden Erfindung. Das Unterlagenmaterial kann virtuell irgendeine mögliche Strukturkonfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Folglich kann die Konfiguration der Unterlage des Trägers sphärisch sein, in Form eines Beads, zylindrisch, wie beispielsweise auf der inseitigen Oberfläche einer Testtube, oder eine äußere Oberfläche eines Stabes. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie z.B. ein Blatt, ein Teststreifen etc. Bevorzugte Unterlagen oder Träger schließen Polystyrol-Beads ein. Die Fachleute auf dem Gebiet werden mögliche andere geeignete Träger zum Binden von Antikörpern oder Antigenen kennen, oder werden in der Lage sein, zu solchen mit Hilfe von Routineexperimenten zu gelangen.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Menge von Antikörpern der Erfindung, wie oben erwähnt, kann bestimmt werden, entsprechend von wohl bekannten Verfahren. Die Fachleute auf dem Gebiet werden in der Lage sein, operative und optimale Assaybedingungen für jede Bestimmung durch Einsetzen von Routineexperimenten zu bestimmen. Andere solche Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren od. dgl., können ergänzt werden in den Assays, je nach Bedarf von Kunden oder Notwendigkeit für die vorliegende Situation.
Einer der Wege, auf welchem ein Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gelabelt werden kann, ist mit Hilfe von Binden desselben an ein Enzym verwendet in einem Enzym-Immunoassay (EIA). Dieses Enzym wird wiederum, wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, mit dem Substrat in einer solchen Weise reagieren, dass es eine chemische Gruppe erzeugt, welche nachgewiesen werden kann, beispielsweise auf spektrofotometrischem Weg, fluorometrischem Weg oder durch irgendwelche sichtbare Mittel. Enzyme, welche verwendet werden können, um nachweisbare Antikörper zu labeln, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Malat-Dehydrogenase, staphylococcale Nuklease, Delta-5-Sterotid-Isomerasen, Hefe-Alkohol Dehydrogenase, Alpha-Glycerophosphatnuklease, Trioasephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuklease, Unease, Catalase, Glukose-6-Phosphatase, Dehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholin-Esterase. Der Nachweis kann realisiert werden mit colormetrischen Verfahren, welche ein chromogenes Substrat für das Enzym einsetzen. Der Nachweis kann auch realisiert werden durch visuellen Vergleich des Ausmaßes einer enzymatischen Reaktion eines Substrates im Vergleich mit ähnlich hergestellten Standards.
Der Nachweis kann realisiert werden durch Verwendung von irgendeinem einer Vielzahl von anderen Immunoassays. Beispielsweise ist es mit Hilfe von aktivem Labeling der Antikörper oder der Antikörperfragmente möglich, R-PTPase durch die Verwendung eines Radioimmunoassay (RIA) nachzuweisen. Eine gute Beschreibung von einem RIA findet sich beispielsweise in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) mit speziellem Verweis auf das Kapitel mit dem Titel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniquest" von Chard. T., hier eingefügt per Verweis. Das radioaktive Isotop kann nachgewiesen werden mit Mitteln, wie der Verwendung eines G-Zählers oder eines Scintillationszählers oder einer Autoradiografie.
Es ist also möglich, einen Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu labeln mit einer fluoreszierenden Substanz. Wenn der Fuoreszent-gelabelte Antikörper gegen Licht in einer geeigneten Wellenlänge exponiert wird, kann sein Vorliegen dann aufgrund der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenz-Labelverbindungen sind Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Pycocyanin, Allophycocyanin, O-Phthaldehyd und Fluorescamine.
Der Antikörper kann auch nachweisbar gelabelt werden unter Verweis auf Fluoreszenzemittierende Metalle, wie z.B. ¹⁵²E, oder andere aus der Reihe der Lanthaniden. Diese Metalle können angebunden werden an den Antikörper unter Verwendung solcher Metall-Chelat-bildenden Gruppen, wie z.B. Diethylentriamin-Essigsäure (ETPA).
Der Antikörper kann auch nachweisbar gelabelt werden durch sein Koppeln an eine chemilumineszierende Verbindung. Das Vorliegen der chemilumineszierendengetaggten Antikörper wird dann bestimmt durch Nachweis des Vorliegens der Lumineszenz, welche auftritt, während dem Verlauf einer chemischen Reaktion. Beispiele von speziell bedeutsamen chemilumineszierenden Labelverbindungen sind. Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Desweiteren kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu labeln. Bioluminszenz ist ein Typ der Chemilumineszenz, die sich in biologischen Systemen findet, in welchem ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Das Vorliegen eines biolumineszenten Proteins wird bestimmt durch Nachweis des Vorliegens der Lumineszenz. Bedeutsame biolumineszente Verbindungen zum Zwecke des Labelns sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung kann zum Einsatz in einem immunometrischen Assay angepasst werden, auch bekannt als ein "zweiseitiger" oder "Sandwich"-Assay. In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge eines ungelabelten Antikörpers (oder ein Fragment eines Antikörpers) an eine feste Unterlage oder einen Träger gebunden und eine Menge von nachweisbar gelabeltem Antikörper wird hinzugefügt, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes zu ermöglichen, welcher zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem Antigen und dem gelabelten Antikörper ausgebildet wird.
Typischerweise schließen bevorzugte immunometrische Assays "Vorwärts"-Assays ein, in welchen der Antikörper, der an die feste Phase gebunden ist, zunächst mit der Probe, welche getestet werden soll, in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Ausbildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigenkomplexes zu extrahieren. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum wird die feste Unterlage oder der Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe zu entfernen, einschließend nicht reagiertes Antigen, falls irgendein solches vorliegt und anschließend mit der Lösung in Kontakt gebracht, welche eine unbekannte Menge des gelabelten Antikörpers enthält (welche als ein "Reportermolekül" funktioniert). Nach einer zweiten Inkubationsperiode, um zu ermöglichen, dass der gelabelte Antikörper mit dem Antigen, welches an die feste Unterlagen an den Träger durch den ungelabelten Antikörper gebunden ist, komplexiert, werden die feste Unterlage oder der Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht reagierten gelabelten Antikörper zu entfernen.
In einem weiteren Typ von "Sandwich"-Assay, welcher bedeutsam sein kann für die Antigene der vorliegenden Erfindung, werden die sogenannten "simultanen" und "reversen" Assays eingesetzt. Ein simultaner Assay involviert einen einzelnen Inkubationsschritt, da der Antikörper, der an die feste Unterlage oder den Träger gebunden ist, und gelabelte Antikörper jeweils zur Probe hinzugefügt werden, die getestet werden soll, und zwar zur selben Zeit. Nach Abschluss der Inkubation wird die feste Unterlage oder der Träger gewaschen, um den Rückstand von flüssiger Probe sowie unkomplexierten gelabelten Antikörper zu entfernen. Das Vorliegen des gelabelten Antikörpers, assoziiert mit der festen Unterlage oder dem Träger, wird dann bestimmt, wie dies auch der Fall sein würde in einem konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Assay.
In dem "reversen" Assay wird schrittweise die Zugabe zuerst einer Lösung von gelabeltem Antikörper zur Flüssigkeitsprobe, gefolgt von der Zugabe von ungelabeltem Antikörper, gebunden an die feste Unterlage oder den Träger, nach einem geeigneten Inkubationszeitraum eingesetzt. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase in konventioneller Art gewaschen, um sie vom Rückstand der Probe, welche getestet werden soll, und der Lösung von unreagiertem gelabeltem Antikörper zu befreien. Die Bestimmung des gelabeltem Antikörpers, assoziiert mit einer festen Unterlage oder einem Träger wird dann durchgeführt, wie in den "simultanen" und "vorwärts" Assays.
Die Erfindung wird nun illustriert durch die folgenden nicht limitierenden Beispiele.
BEISPIELE
Beispiel 1 Herstellung von CHO r-hsLDLR
Stabile rekombinante CHO-Zellen, welche menschlichen löslichen LDLR exprimieren, wurden erzeugt durch Co-Transfektion von CHO-DUKX-Zellen, welchen das Dehydrofolatreduktase (DHFR)-Gen fehlte (Urlaub, G. et al., 1980), mit den zwei Expressionsvektoren: psLDLR01, welcher die N-terminate Liganden-Bindungsdomäne des LDLRs enthält, beginnend am Aminosäurerest Asp (+4) bis zu Glu 291 (+291) und pDHFR, welche das murine Gen für DHFR enthält, beide unter der Steuerung durch den Promotor und die Transkriptions-Terminationselemente der frühen SV40-Region. Die Transfektion wurde durchgeführt durch kationische Liposome unter Verwendung von LipofectAmine (Gibco BRL) entsprechend dem Protokoll, beschrieben durch den Hersteller. 72 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in ein selektives Medium transferriert, welchem Deoxy- und Ribonukleoide fehlten und welches angereichert war mit 10% dialysiertem FCS. Zellen, welche DHFR-Aktivität exprimierten, waren in der Lage, Kolonien auszubilden, welche isoliert wurden durch Anheben der Zellen mit Trypsin-vollgesaugten Papierscheiben. Die Zellen wurden kultiviert und auf r-hsLDLR- Aktivität gescreent. Die transfizierten Zellen wurden dann einer Genamplifikation unterzogen durch MTX, gefolgt von Subklonieren und Auswahl der stabilen Producer-Klone.
r-hsLDLR (+291 Form) wurde erzeugt mit Zellen eines stabilen CHO-Producer-Klons, mit der Bezeichnung #33-10-29-21, in einem 5 l CelliGen-Bioreaktor in serumfreiem Medium (Gibco CHO-A-SFM Cat. No. 95-0091 DJ). Der Rohextrakt wurde geklärt durch Filtration durch eine 0,8 bis 2 μ Cartridge-Filter und (Gelman Cat. No. CSS92DSCCK) und hundertfach über eine 5-kDa-Membran aufkonzentriert. Die +291 Form des r-hsLDLR, verwendet für die ersten Immunisierungen, wurde aufgereinigt unter Verwendung eines Aufreinigungsprozesses im kleinen Maßstab. In diesem Prozess wurde eine DEAE-Sepharose Kationenaustauschsäule verwendet, gefolgt von einem hydrophoben Wechselwirkungsschritt auf einer Butyl-TSK-Säule, gefolgt von einer HTP-Säule und einer Größenausschluss-Chromatografie (SEC, size exclusion chromatography)-Schritt auf einer Sephacryl 100-Säule. Fraktion #27 des SEC wurde ausgewählt, da sie eine spezielle antivirale Aktivität von 780 Einheiten/Mikrogramm enthielt, nachgewiesen in dem antiviralen Assay, beschrieben in Beispiel 9 unten. Das Protein in dieser Fraktion wurde identifiziert als r-hsLDLR durch N-terminale Analyse.
Ein zweites Batch von CHO +291 r-hsLDLR wurde aufgereinigt und verwendet für Boost-Injektionen der Mäuse. Es wurde aufgereinigt unter Verwendung eines verfeinerten Prozesses mit einer verbesserten Ausbeute, welcher die folgenden Schritte umfasset: a) Klärung und Konzentration ×100 des Rohextraktes; b) eine HQ POROS-Anion-Austauschersäule und c) zwei hydrophobe Wechselwirkungs-(HIC)-Schritte; Einfangen auf einer Butyl-TSK-Säule und Fluss durch eine Phenyl 5PW-Säule. Die ungebundene Fraktion des letzten HIC-Schrittes wurde dialysiert und über eine HS-POROS-Kationenaustauschsäule gereinigt. Der letzte Schritt war eine Hydroxyapatit-(HTTP)-Säule. Der r-hsLDLR, der so erhalten wurde, wurde auf etwa 90% aufgereinigt, wobei ein einzelner Hauptpeak in RP-HPLC eluiert wurde.
Beispiel 2 Immunisierung von Mäusen
10 μg eines aufgereinigten r-hsLDLR von Fraktion #27 der SEC-Säule von Beispiel 1, oben bei einer Konzentration von 100 μg/ml wurden homogenisiert mit vollständigen Freud'schen Adjuvans (CFA, 50% v/v) und den Fußballen eines jeden von fünf 7 Wochen alten weiblichen Balb/C-Mäusen injiziert.
Vier Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die Mäuse geboostet, und zwar intramuskulär mit 10 μg der gleichen Fraktion an aufgereinigtem r-hsLDLR in einer 50% (v/v)-Lösung von CFA.
Zwei Wochen nach der zweiten Injektion wurden die Mäuse-Seren auf Antikörper gegen r-hsLDLR getestet unter Verwendung des direkten ELISAs, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Die beiden Mäuse M-1 und M-2 mit der am signifikantesten spezifischen Immunoreaktivität mit r-hsLDLR wurden desweiteren geboostet, zehn Wochen nach der zweiten Injektion, mit 10 μg des aufgereinigten r-hsLDLR, erhalten in dem verfeinerten Aufreinigungsprozeß, wie in Beispiel 1, oben beschrieben.
Den Mäusen wurde Blut 14 Wochen später abgenommen und auf Antikörper gegen r-hsLDLR in PBS getestet. Ihnen wurden zwei weitere Boosts von 50 μg r-hsLDLR in PBS der erste intraperitoneal als auch intravenös, verabreicht.
Den Mäusen wurde zwei Wochen nach der zweiten Injektion Blut abgenommen und das Antiserum wurde auf Anti-r-hsLDLR-Aktivität getestet durch unmittelbaren ELISA von Beispiel 3, unten. Jedes Antiserum wurde seriell verdünnt 1:100-1:32,000 und doppelt auf eine 96-Wellplatte, gecoatet mit 10U/Well von r-hsLDLR, aufgereinigt unter Verwendung des verfeinerten Aufreinigungsprozesses, wie in Beispiel, unten beschrieben, aufgebracht. Assay-Puffer und DMEM +10% HS, enthaltend PBS +1 % BSA oder Gelatin + 0,05% Tween 20 + 0,05% Thimerosal wurden als Kontrollen in dem ersten Well einer ersten Reihe eingesetzt. Normales Mausserum, (NMS) wurde im gleichen Verdünnungsbereich in den letzten beiden Reihen als negative Kontrollen eingesetzt. Der Absorptionsgrad der Enzymreaktion wurde gemessen mit einem ELISA-Lesegerät bei 492 und 405 nm.
Die Ergebnisse dieses Tests zeigten, dass Seren aus der Maus M-1 eine höhere spezifische Immunoreaktivität aufwiesen mit r-hsLDLR und diese wurde daher geopfert und Milzzellen wurden zur Fusion mit Myelon-Zellen gesammelt (Eshhar Z., 1985).
Beispiel 3 Direkter ELISA zum Antiserumtest und zum Screenen auf Hybridoma-Klonen
Der direkte ELISA zum Screenen auf positive Antiseren wurde durchgeführt wie folgt: 96 Well-Platten wurden gecoatet mit 100 μl an r-hsLDLR (aufgereinigt durch den verfeinerten Aufreinigungsprozess von Beispiel 1), 100 Einheiten/ml (10 U/well) in PBS + 1% Gelatine (Sigma, Cat. No. G-7765) +0,9mM Ca⁺² und 0,5mM Mg⁺², pH 5,6, im folgenden hier als Assaypuffer bezeichnet für 90 Min. bei 37°C unter Schütteln. Die Platten wurden sechsfach gewaschen in PBS + 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan Monolaurat-Sigma P-1379), im folgenden hier als Waschlösung bezeichnet.
Antiserum-Proben von den immunisierten Mäusen, seriell 1:100-1:32.000 verdünnt oder Überstand aus Hybridomzellkulturen wurde zu den Wells hinzuaddiert und für 90 Min. bei 37°C inkubiert unter Schütteln, gefolgt von sechs Waschungen in Waschlösung.
100 μl an Meerrettich-Peroxidase (HRP)-APA-konjugierter Ziege-Antikörper-gegen Maus-Fab (Sigma-Cat. NO. 4601-1 ), verdünnt 1:1,200, wurde zu den Wells hinzugegeben und für 90 Min. bei 37°C inkubiert unter Schütteln und anschließend sechsfach mit Waschlösung gewaschen.
100 μl an Substratlösung, (hergestellt durch Auflösen einer Tablette von OPD und einer Tablette of H₂O₂ in 20ml Wasser) wurden zu den Wells hinzugegeben und bei RT für 30 Min. inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl/Well von 4N HCL gestoppt.
Der Absorptionsgrad in den 96 Wellplatten wurde gelesen unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes bei 492 und 405 nm und die Ergebnisse wurden berechnet unter Verwendung der vier logistischen, parametrischen Algorithmen durch die MultiCalc-Software des PC-Computers, verbunden dem ELISA-Lesegerät.
Beispiel 4 Fusion, Hybridom-Herstellung, Auswahl der Klone und Aufreinigung von Antikörpern gegen Aszites-Flüssigkeiten
Der Fusionsprozess und die Hybridom-Zellauswahl wurden durchgeführt entsprechenden Protokollen in (Eshhar Z., 1985). Kurz gesagt wurden Milzzellen aus Maus-M1, welche 2-4 Tage vor Fusion geboostet wurde, mit Myelom-Zellen durch eine kurze Inkubation mit PEG fusioniert. Das PEG wurde zunächst kurzzeitig verdünnt mit DMEM und abschließend vollständig per Zentrifugation entfernt. Die Zellen wurden erneut suspendiert in DMEM-HAT-Medium, verteilt in 96-Wellplatten bei einer Konzentration von ungefähr 3,4 × 10^-4 Zellen/Well und inkubiert für 10-14 Tage in einem 8% CO₂-Inkubator bei 37°C. Das Medium in all den Hybridom-Wells wurde innerhalb von 10 Tagen verändert nach DMEM, angereichert mit 10% Pferde-Serum (HS). Hybridomkultur-Überstandproben wurden auf das Vorliegen von Mabs gegen r-hsLDLR gescreent durch den direkten ELISA, wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Assay-Puffer und DMEM+10% HS wurden verwendet als Kontrollen. Mab C7, (kommerziell verfügbar von Amersham) und M-1 Antiserum wurden verwendet als Positivkontrollen, während durch einen monoklonalen Antikörper gegen den lösliche p55 TNF- das Vorliegen von Antikörpern in dem Kulturüberstand nachgewiesen wurde, wurden auf 24 Wellplatten überführt und anschließend auf 25 cm² T-Kolben. Die ausgebreiteten Kulturen wurden auf Sekretion von Mabs gegen r-hsLDLR überwacht. Ampullen von Rezeptor verwendet wurde als Negativkontrolle. Zellen von Wells, mit Zellen aus positiven Kulturen wurden gefroren und gelagert in flüssigem Stickstoff.
Insgesamt etwa 1.000 Kulturen wurden gescreent auf den Nachweis von Antikörpern gegen r-hsLDLR. 54 Kulturen mit der höchsten Immunoaktivität wurden mehrere Male erneut getestet. Fünf Kulturen (12, 28, 29, 30 und 50) mit der höchsten Aktivität wurden kloniert durch begrenzende Verdünnung in 96 Wellplatten. Überstände von den wachsenden Klonen wurden mehrfach auf Antikörper gegen r-hsLDLR durch den direkten ELISA getestet.
Zellen von positiven Hybridom-Klonen wurden in Gewebskulturkolben in DMEM gezüchtet, enthaltend 15% Pferdeserum, und die Ampullen wurden aus Teilen der Kulturen eingefroren. Parallel wurden Zellen von unterschiedlichen Hybridom-Klonen injiziert jeweils in 2-4 Mäuse, um Aszites-Flüssigkeiten zu erhalten. Antikörper wurden aufgereinigt aus Aszites-Flüssigkeit, entweder durch Ammoniumsulfat-Fällung oder eine Protein-G-Säule. Kurz gesagt, wurden 7,5 mm an Aszites-Flüssigkeit 1:3 in 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7 verdünnt und auf eine 5 ml Protein-G-Säule (C10/10) beladen. Die Säule wurde gewaschen mit 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7 und die Mabs wurden eluiert mit 100 mM Glycinpuffer bei pH 2,7. Der pH der Elutionsfraktion wude eingestellt auf 7-7,5 mit 1M Tris-Puffer bei pH 9,3.
Beispiel 5 Screenen auf Paare von Mabs, welche in ELISA verwendet werden sollen und Optimierung der ELISA-Parameter
Die Mabs, aufgereinigt aus den Aszites-Flüssigkeiten, wie in Beispiel 4 oben wurden verwendet, um einen Satz von Experimenten in einem Matrixformal durchzuführen, um das beste geeignete Paar von Mabs auszuwählen, welche als erste und zweite Antikörper in dem Sandwich-ELISA für r-hsLDLR, beschrieben in Beispiel 6 unten, verwendet werden sollen. Kurz gesagt wurden 96-Well-Platten mit Aszites-Flüssigkeiten, abgeleitet aus fünf Hybridomas (#12, 28.28, 29.08, 30 und 50.05), gecoatet, aufgereinigt, entweder durch Ammonium-Sulfatfällung oder eine Protein-G-Säule. Die Antikörper wurden gescreent unter Verwendung der +291 Form, wie auch der +292 Form (vom Aminosäurerest Asp + 4 bis Cys + 292) sowie +331 Form (vom Aminosäurerest Asp + 4 bis Cys + 331) von r-hsLDLR, hergestellt in CHO-Zellen, als Antigene. 1 ml von jedem der oben teilweise aufgereinigten Mabs wurde mit Biotin für ein schnelles Screenen ihre Empfänglichkeit als zweite Antikörper in einem Sandwich-ELISA gelabelt. Kurz gesagt, wurden 1,5 mg an Ammoniumsulfat-Fällung-aufgereinigten Mabs auf pH 8,5 eingestellt mit 30 μl mit 0,5 M NaHCO₃. 0,75 mg von Biotin-Osu N-Hydroxysuccinimido-Biotin (Biotin-OSu, Sigma, Cat. #H1759, aus einer Lösung von 5 mg in 200 μl DMSO) wurden zur Antikörperlösung hinzugegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter mildem Schütteln inkubiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 2-8°C. Die Reaktionslösung wurde auf eine Sephadex G25M (Pharmacia Cat. #17-0851-01) PD10-Säule beladen, um zwischen den biotinylierten Mabs und dem Überschuss von nicht umgesetztem Biotin-OSU zu trennen.
Die ersten Vorabexperimente zeigten, dass Mabs 29.08 und 30 das höchste Signal über dem Untergrund erzeugten, wenn sie als zweite Antikörper in dem ELISA verwendet wurden.
Die Reaktion dieser beiden Klone wurde erneut gegen zweite Antikörper getestet mit den Antikörpern 12, 28, 29.08 und 50, verwendet zum Coaten von Platten. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten klar, das Mab 28 der Antikörper war, der am meisten zum Coaten geeignet war.
Die besten Ergebnisse mit Blick auf die Signalintensität und Spezifität wurden erhalten mit Mab 28, verwendet zum Coaten der Mikrotiterplatte und Mab 29,08 gelabelt mit Biotin aus einem zweiten Antikörper. Unter Verwendung dieser Mabs wurden gute Ergebnisse erhalten mit allen drei Formen (+291, +292 und +331) der r-hsLDLR. Mit allen Formen wurde der Absorptionsgrad bei 492/405 nm zu ungefähr 1,3 OD bestimmt.
Die drei Formen des r-hsLDLR-Antigens wurden analysiert in seriellen Verdünnungen in einem Konzentrationsbereich von 0,9-1000 ng/ml. Eine Dosis-Antwortkurve wurde erhalten mit Mab 28, verwendet zum Coaten und dem biotinylierten Mab 29.08 als einem zweiten Antikörper. Diese Kombination ergab eine lineare Antwort bei einem Konzentrationsbereich von 1-10 ng/ml von r-hsLDLR.
Die verschiedenen Parameter, welche den ELISA-Test beeinflussen könnten, wie z.B. Konzentration von Reagenzien, Inkubationszeiträume, Auswahl von Puffern und Platten, wurden optimiert durch Testen der folgenden Parameter:

– Coaten von Mikrotiterplatten-Wells mit 5-10 μg/ml von Mab28 in PBS.
– Pufferzusammensetzung:
a) PBS+ Tween 20
b) Tris+Ca⁺² + NaCl + Tween 20
– Blockierungslösungen:
a) 1 % Gelatine in PBS, 0,05% Tween, 0,005% Thimerosal
b) 1 % BSA in PBS, 0,05% Tween, 0,005% Thimerosal
c) 1 % FBS in PBS, 0,05% Tween, 0,005% Thimerosal
d) 1 % Milk in PBS, 0,05% Tween, 0,005% Thimerosal
e) 1 Block, Hy Pep und Hy Yeast
– Zweiter Mab 29,08, gelabelt mit Biotin, bei Konzentrationen von 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10,000 äquivalent zu einem Konzentrationsbereich von 10,74-0,537 μg/ml.
– Extravidin-Konzentrationen 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10,000, äquivalent zu einem Konzentrationsbereich von 4-0,2 μg/ml.

Auf der Basis dieser Experimente wurde die letztendliche Prozedur für den Sandwich-ELISA-Test, beschrieben in Beispiel 6, unten, etabliert.
Beispiel 6 Etablierung von Sandwich-ELISA für r-hsLDLR
Ein Sandwich-ELISA gegen den r-hsLDLR wurde etabliert unter Verwendung von Mabs 28 und 29,08. Kurz gesagt wurden 96 Wellplatten gecoatet mit 100 μl eines Protein G, aufgereinigten Mab 28 (5 μg/ml) über Nacht bei 28°C für 3 Stunden bei 37°C. Die Platten wurden dann gewaschen 5 mal mit PBS+0,05% Tween 20. Die Platten wurden inkubiert mit 200 μl an Blockierungslösung (PBS+1%BSA oder Gelatine + 0,05% Tween 20 + Thimerosal 0,05% für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°C und 5fach gewaschen mit PBS+0,05% Tween 20. 100 μl von Proben oder ein Kalibrationskurven-Antigen (CHO+291 r-hsLDLR, 0,5-32 ng/ml, verdünnt in Blockierungslösung), wurden für den Wells hinzugegeben und für 90 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Platten wurden anschließend fünffach gewaschen mit PBS+0,05% Tween 20.
100 μl/Well an biotinyliertem Mab 29,08 (0,67 μg/ml) in Blockierungslösung wurden hin zugegeben und unter Schütteln für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden fünffach gewaschen mit PBS+0,05% Tween 20. 100 μl an kommerziellem Extravidin-Peroxidase-Konjugat (ExtrAvidin TM-Peroxidase BioMakor, Cat.# 0645-1) verdünnt 1:10,000 wurden zu den Wells hinzugegeben und unter Schütteln für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden anschließend fünffach gewaschen mit PBS+0,05% Tween 20. 125 μl der oben genannten Substratlösung wurden zu jedem Well hinzugegeben und für zehn Minuten inkubiert, bis sich Farbe zur gewünschten Intensität entwickelte. Die Reaktion wurden gestoppt durch Zugabe von 125 μl aus 4N HCl. Der Absorptionsgrad in den 96 Wellplatten wurde gelesen unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts bei Wellenlängen von 492 und 405 nm und die Ergebnisse wurden berechnet durch die MultiCalc-Software des PC-Computers, der an das ELISA-Lesegerät angeschlossen war.
Beispiel 7 Monoklonale Antikörper-Isotypen
Der monoklonale Antikörper Ig-Isotyp wurde bestimmt unter Verwendung eines kommerziellen Isotypisierungskits (PharMingen International), entsprechend der Assayprozedur des Herstellers. Die Klone 12.6, 29.8 und 30 wurde identifiziert als IgG₁, wohingegen der Klon 50.30 sich als eine IgM-Klasse zeigte.
Beispiel 8 SDS-PAGE-Westernblot-Analyse
Die +291 Form des aufgereinigten r-hsLDLR und nativer LDLR, aufgereinigt aus menschlichem Urin wurden analysiert durch Westerblotanalyse mit den monoklonalen Antikörpern, entwickelt gegen r-hsLDLR. Kurz gesagt wurde ein 12% SDS Polyacrylamid-Gel mit 100 ng/Zeile der CHO +291-Form von r-hsLDLR beladen, oder mit nativem aus Urin erhaltenem hsLDLR oder TBP-1-Rohextrakt (als Negativkontrolle) unter reduzierenden Bedingungen (40mM DTT). Eine Zeile wurde mit Markern mit niedrigem Molekulargewicht (LMW; Low Molecular Weight Markers), beladen. Dieser Satz von Proben wurde fünffach laufengelassen. Die Proteine, die sich auf den Gelen trennten, wurden durch Elektroelution auf Nitrozellulosemembrane transferiert. Die Membrane wurden inkubiert in PBS, enthaltend 10% fettarme Milch, 0,1% Tween 20 für 16 Stunden. Die Membrane wurden in Streifen geschnitten und jeder Streifen wurde für zwei Stunden für Raumtemperatur inkubiert mit einem der fünf ausgewählten Mabs: 12.6, 30, 50.30, 28 oder 29.08 (Aszites-Flüssigkeit, verdünnt 1:4000).
Membranstreifen wurden gewaschen mit PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 (3 × 15 Min.) und inkubiert für eine Stunde mit dem zweiten Antikörper – Ziege-Anti-Maus, konjugiert an Meerretichperoxidase-alkalische Phosphatase (verdünnt 1:10.000 BioMakor) für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Streifen wurden gewaschen mit PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 (3 × 15 Min.). Die positiven Banden wurden nachgewiesen durch erhöhte Chemilumineszenz (ECL, Amersham).
Monoklonale Antikörper #12.6 und #29.8 erkannten sowohl die aus Urin gewonnene Form als auch die +291-Form des aufgereinigten r-hsLDLR in Westernblot-Analyse (2). Mabs 28 und 30 erkannten die +291 Form des aufgereinigten r-hsLDLR.
Beispiel 9 Inhibierung der r-hsLDLR-antiviralen Aktivität durch monoklonale Antikörper
Mabs, welche spezifisch mit r-hsLDLR reagierten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die antivirale Aktivität von r-hsLDLR (+291 Form) zu blockieren, unter Verwendung eines zytopatischen Effekts (CPE)-Inhibitionsassays in einem VSV/WISH-System.
WISH-Zellen (von menschlichem Amnion-Ursprung) wurden kultiviert in MEM, angereichert mit 10% FBS und 4 mM Glutamin in einem 37°C, 5% CO₂-Inkubator. Exponentiell wachsende Zellen wurden ausgesät in 96-Well-Gewebskulturplatten bei einer Dichte von 540.000 Zellen/Well, 25 Stunden vor Beginn des Assays. Proben, welche getestet werden sollten und entsprechende Standards wurden verdünnt und in die Wells verteilt, welche die Zellen enthielten. VSV wurde unmittelbar zu den Wells hinzugegeben bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,5 pfu/Zelle. Die Platten wurden inkubiert für 16-18 Stunden bei 37°C und anschließend mit Ethanol gewaschen. Die Monoschicht der überlebenden Zellen wurde durch Gram Kristallviolett-Färbung untersucht. Quantifizierung des zytopathischen Effekts relativ zum Standard wurde durchgeführt durch Plotten der Farbdichte gegen die Standardkonzentration Zur Analyse des neutralisierenden Effekts der Antikörper wurde r-hsLDLR für 30 Minuten bei 37°C prä-inkubiert unter wachsenden Konzentrationen von Aszites-Flüssigkeit des getesteten Mabs. Diese Lösungen wurden dann zu den Kulturen von WISH-Zellen in 96-Mikrotiterplatten addiert, gefolgt von der Zugabe von vesikularem Stomatitis-Virus (VSV). Nach 18 Std. Inkubation wurde die VSV-mediatisierte Zell-Lyse bestimmt durch Anfärben der verbleibenden Zellen mit Kristallviolett. Semi-Quantifizierung des zytopathischen Effekts, relativ zum Standard wurde durchgeführt durch Blotten der Farbintensität (bestimmt durch ein ELISA-Lesegerät) gegen Standardkonzentration.
Der Effekt der Mabs wurde getestet mit zunehmenden Konzentrationen von r-hsLDLR. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden zwei Antikörper (12.6 und 50.30) gefunden, welche neutralisierende Aktivität zeigten.
In dem Experiment, dargestellt in Tabelle 1, wurde der inhibitorische Effekt der beiden Antikörper bei einer 1:40-Verdünnung der Aszites-Flüssigkeiten getestet. Bei dieser Verdünnung zeigte Mab 12.6 eine etwas höhere Aktivität im Vergleich zu Mab 50:30.
In dem Experiment, dargestellt in Tabelle 1, wurde der inhibitorische Effekt der Antikörper bei einer 1:40 Verdünnung der Aszites der Flüssigkeiten getestet. Bei dieser Verdünnung zeigte Mab 12.6 eine etwas höhere Aktivität im Vergleich zu Mab 50:30. Dies kann das Ergebnis sein der Eigenschaften der Mabs, wie auch von den Unterschieden in ihrer Konzentration in der Aszites-Flüssigkeit herrühren.
Der inhibitorische Effekt der Mabs könnte beseitigt werden durch Erhöhen des hsLDLR relativ zur Mabs-Konzentration. Tatsächlich wurde bei r-hsLDLR-Kontrationen von 62.5 U/ml gefunden, dass keiner der Mabs irgendeinen Effekt auf die r-hsLDLR-Aktivität bei den analysierten Antikörper-Konzentrationen aufwies. Tabelle 1: Inhibition der r-hsLDLR der antiviralen Aktivität durch die Klone 12.6 und 50.30¹

¹Inhibierung von r-hsLDLR antiviraler Aktivität gegen VSV-mediatisierte Zell-Lyse von WISH-Zellen. Der inhibitorische Effekt der Mabs wurde bestimmt bei einer 1:40 Verdünnung der Aszites-Flüssigkeit. Die Anzahl der überlebensfähigen Zellen wird repräsentiert in der Tabelle in den OD-Werten. Die Zahlen in Klammern repräsentieren eine Wiederholung, durchgeführt bei den Konzentrationen 0 und 12,5 U/ml LDLR.

Die Inhibition der antiviralen Aktivität von r-hsLDLR wurde bestimmt unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen von Mabs 12.6 und 50.30. Mabs 12.6 inhibiert die antivirale Aktivität von r-hsLDLR um ungefähr 60% bei einer 1:40-Verdünnung (der Aszites-Flüssigkeit) und um ungefähr 35% bei einer 1:20.500-Verdünnung. Der Klon 50:30 inhibierte die r-hsLDLR-Aktivität um ungefähr 45% bei einer 1:40-Verdünnung und um ungefähr 15% bei einer 1:20.500-Verdünnung.
Die Dosisantwortkurve, erhalten mit beiden Mabs und die Beobachtung, dass ihr inhibitorischer Effekt durch einen Überschuss von r-hsLDLR verschlechtert wurde, legt nahe, dass die Mabs ihren Effekt durch Binden an r-hsLDLR verleihen.
Beispiel 10 Inhibition der HCV-Replikation durch monoklonale Antikörper
Mabs, spezifisch für r-hsLDLR wurden getestet auf Ihre Fähigkeit, die HCV-Replikation in menschlichen Hepatocyten einer primären Kultur zu inhibieren. Eine FT167-Zellkultur wurde abgeleitet von einem 57 Jahre alten männlichen Patienten, welcher eine Lobektomie-Resektion aus medizinischen Gründen benötigte (Metastase von Darmtumor, rechte Hälfte).
Primäre Kulturen von menschlichen Hepatocyten wurden hergestellt durch das zweischrittige Collagenase-Perfusionsverfahren (Maurel P. Adv. Drug Del.Rev. 22:105-132 (1996), Pichard L. et al. Mol. Pharmacol. 41:1047-1055 (1992), Ferrini JB. Et al. ChemBiol Interactions 107:31-45 (1997)). Die Überlebensfähigkeit der Zellen vor dem Plattieren wurde bestimmt unter Verwendung eines Trypan-Blau-Ausschlusstests. Vier Millionen Zellen in 3 ml an Kulturmedium wurden platziert in 60mm Plastikschalen, welche zuvor mit Kollagen gecoatet wurden. Das serumfreie Langzeitkulturmedium bestand aus Williams-E., angereichert, wie veröffentlicht (Lanford R. et al. In Vitro Cell Dev. Biol. 25:174-182 (1989)). Dieses Medium wurde nach und nach alle 48 Stunden erneuert. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre an Luft bei 5% Kohlendioxid beibehalten. Unter diesen Kulturbedingungen halten menschliche Hepatocyten ihren differenzierten Phenotypen für zumindest 35 Tage aufrecht (Ferrini JB. Et al. Chem-Biol. Interactons 107:31-45 (1997)) und sind sensitiv für eine HCV-Infektion und erlauben die Replikation des viralen Genoms (Fournier C: et al. J. Gen Viol. 79:2367-2374 (1998)).
HCV-positive Serumprobe: Eine Bank von menschlichen Seren aus Patienten, welche als Anti-HCV-Antikörper positiv getestet wurden, durch den EIA HCV 3.0 und Chiron RIBA HCV 3.0 SIA wurde etabliert. Keiner dieser Patienten war mit HBV oder HIV koinfiziert. Jede RNA von HCV aus der Serumprobe wurde quantifiziert durch den Roche-Monitor und genotypisiert durch einen Liniensondenassay (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Serumproben wurden bei -80°C gelagert in kleinen Aliquots, um Einfrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. In diesen Experimenten wurde die Probe S42 (Genotyp 1 b; virale Last: 410.000 Kopien/ml) verwendet.
Zur Infektion und für nachfolgende Behandlungen wurden Hepatocyten-Kulturen transfiziert unter sterilen Bedingungen für ein P3-Labor (hohe Beschränkung für menschliche infektiöse Mikroorganismen). Drei Tage nach dem Plattieren wurde, wenn die Zellen sich aus der Dramatisierung der Isolation erholt hatten, in vitro Infektion von Hepatocyten durchgeführt durch eine Übernacht-Inkubation mit 25 μl einer HCV-positiven Serum-Probe (s42) in 3 ml an Medium. Nach Infektion wurden die Zellen dreimal gewaschen mit 3 ml an frischem Medium und die Kultur wurde fortgeführt unter normalen Bedingungen in dem Langzeitkulturmedium.
Zellen wurden behandelt mit drei unterschiedlichen Mabs gegen r-hsLDLR, Mab 12.6, Mab 28 und Mab 29.8. Dreissig Minuten vor der Infektion wurden die Zellen gegen zwei oder 8 μg/ml der unterschiedlichen Mabs exponiert. Anschließend wurden die Zellen, wie oben beschrieben, infiziert.
Kontrollkulturen wurden unter ähnlichen Bedingungen infiziert, jedoch in der Abwesenheit der antiviralen Behandlung. In parallelen Experimenten wurden die gleichen Kulturen behandelt mit 5000 U/mL IFNα unter ähnlichen Bedingungen, aus Vergleichsgründen (IFNα inhibiert stark die HCV-Replikation in den Zellen ref). Alle Behandlungen wurden durchgeführt in zweifacher Ausführung.
Am Tag 5 nach der Infektion wurde das Medium entfernt und die Kulturen wurden dreifach gewaschen mit kalter Phosphat gepufferter Salzlösung. RNA wurde gereinigt aus 4 × 10⁶ Hepatozyten unter Verwendung einer Guanidinium-Isothiocyanat-Säure-Phenol-Extraktionsprozedur (Chomczynski PN, und Sacchi N, Analyt. Biochem. 162:156-159 (1987)). Die ausgefällte RNA wurde aufgelöst in 50 μl an Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser und anschließend quantizifiziert. Ein μg an zellulärer RNA wurde analysiert in dem Stamm-spezifischen rTth RT-PCR-Assay.
Um mögliche Kontamination zu vermeiden, wurde der Stamm-spezifische RT-PCR-Assay nach und nach durchgeführt unter Verwendung von drei unterschiedlichen Räumen: einem Prä-PCR-Raum, einem PCR-Raum und einen Post-PCR-Raum. RNA, aufgelöst in 10 μl an DEPC-behandeltem Wasser wurde mit Mineralöl bedeckt und bei 95°C für 1 Minute erhitzt. Die Temperatur wurde auf 70°C abgesenkt und 10 μl an vorher erhitzter cDNA-Reaktionsmischung wurden hinzugegeben. Die Temperatur wurde dann auf 60°C für zwei Minuten abgesenkt zum Annealen und die cDNA-Reaktion durchgeführt für 20 Minuten bei 70°C unter Verwendung der rTstdh DNA-Polymerase (Perkin-Elmer). Die Temperatur wurde bei 70°C beibehalten, während 40 μl an vorher erwärmtem Puffer, enthaltend EGTA als Chelatbildner von Mn²⁺ hinzugegeben wurden, um die rTth RT-Aktivität zu unterdrücken. Reaktionsgefäße wurden bei 70°C gehalten, während 40 μl an vorher erwärmter PCR-Mischung hinzugegeben wurden. Die PCR-Bedingungen, durchgeführt auf Gene Amp^® PCR-System 9600 (Perkin-Elmer) bestanden aus einem ersten Zyklus bei 94°C für eine Minute, 50 Zyklen bei 94°C bei 15 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und einem letztendlichen Extensionsschritt bei 72°C für 7 Minuten. Für den positiven Stamm-HCV-RNA-Assay ist die Sequenz des reversen Primers P3 wie folgt: 5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3', (nt 342-320) und diejenige des Vorwärtsprimers P4 ist: 5'-CACTCCCCTGTGAGGAGGAACT-3', (nt: 38-56), (Laskus T. et al. J. Gen. Virol. 78:2747-2750 (1997)). Die gleichen Primer wurden in ungekehrter Reihenfolge verwendet, um den negativen Strang nachzuweisen. Ein Zehntel des amplifizierten Produktes wurde durch Gel-Elektrophorese auf Agarose (2%) analysiert, gefolgt von Anfärben mit BET und Fotografie unter UV-Licht. In allen Serien der Experimente wurden Verdünnungen der synthetischen HCV RNA (+) und (-)-Stränge durchgeführt und 1 μg an Total-Leber-RNA wurde hinzugegeben, um die Bedingungen für die Analyse von kultivierten Hepatozyten nachzuahmen. Diese Mischungen wurden als positive Kontrollen für den RT-PCR-Assay und die Analyse verwendet.
3 zeigt, dass die Produktion des HCV-negativen Stranges in der Gegenwart von Mabs gegen LDLr vollständig inhibiert war in der Kultur FT167. Folglich war die Replikation des viralen Genoms stark inhibiert. Die Ergebnisse waren konsistent mit der Ansicht, dass LDLR ein Rezeptor für HCV sein könnte.
Beispiel 11 Herstellung von chimären Antikörpern gegen LDLR
mRNA wird aus einer Hybridomlinie aufgereinigt, welche mAb, spezifisch für LDLR produziert.
Spezifische cDNA wird synthetisiert mit Oligonukleotiden, welche komplementär für das 5'-Ende des Exons CH1 der variablen Domäne der schweren Kette (Oligo 1) ist, und von den 5'-Enden des C∝-Hexon der variablen Domäne der leichten Kette (Oligo 2) unter Verwendung von aufgereinigter mRNA als Templat.
Zwei cDNAs werden erhalten, wobei eines davon die variable Region (spezifische für LDLR) der schweren Kette kodiert, und die andere die variable Region (spezifisch für den LDLR) der leichten Kette. Die cDNAs werden kloniert und sequenziert.
Für die Konstruktion der chimären schweren Kette wird die variable Region eines klonierten menschlichen schweren Ketten-Ig-Gens ausgetauscht (unter Verwendung von genetischer Manipulation) gegen die geklonte DNA, welche die variable Maus-Domäne (spezifisch für LDLR) der schweren Kette kodiert. Die genetischen Manipulationen schließen das Ausschneiden der variablen Region von menschlichem Ig ein unter Verwendung von spezifischen Restriktionsenzymen und Ligation der variablen Maus-Region. Die gleiche Prozedur wird durchgeführt, um die chimäre leichte Kette zu erhalten.
Zwei Säugetier-Expressionsplasmide werden konstruiert, eines, welche das chimäre schwere Ketten-Gen einschließt und die andere, welche das chimäre leichte Ketten-Gen einschließt. Beide Vektoren werden verwendet, um die Hybridom-Zelllinie (SP6) zu cotransfizieren.
Die Produktion von LDLR-spezifischem Ig wird untersucht durch ELISA oder Western-Blots unter Verwendung von einer Kulturbrühe von transfizierten Zellen als sekundäre Antikörper. Die Affinität des chimären Antikörpers gegen seinen Liganden wird mittels Biacore überwacht.
Beispiel 12 Herstellung von transgenen Mäusen, welche konzipiert werden, so dass sie Stellen von menschlichen Immunoglobulin-Genen enthalten (Xeno-Mäuse) und Herstellen von menschlichem mAb gegen hLDLR.
Die Xenomaus-Herstellung wird beschrieben in WO 98/24893 und Mendez M.J., et al. Nature genetics 15:146-56 (1997)).
Künstliche Mensch-Hefe-Chromosom (YAC)-Bibliotheken werden gescreent auf YACs, welche die variable Region der menschlichen schweren Ketten enthalten (ungefähr 1000 kb) (das YAC-Klonierverfahren ist das Verfahren der Wahl, wenn Insertgrößen größer als 100 kb benötigt werden).
Die YACs werden charakterisiert durch Southern-Blot-Analyse und durch Pulsefeld-Elektrophorese (PFGE). Die YACs sollten die Cμ Cδ, Dh und Vh-Regionen in der Keimbahn-Konfiguration enthalten.
Durch Verwendung von überlappenden Sequenzen, enthalten in den YACs werden die YACs in Hefe durch schrittweise Rekombinationsstrategie rekombiniert. Vor der Rekombination wird das 3'-Ende von YAC (mit der V-Region) an den HPRT-auswählbaren Marker legiert. Die Struktur des rekombinierten YACs wird bestätigt durch PAGE und Southern-Blot-Analyse (Vorliegen der Stelle der menschlichen schweren Kette von der C-Region zur Vh-Region in der Keimbahn-Konfiguration).
Der akzentrische YAC-Arm ist Ziel für einen Vektor, welcher die vollständige γ2 konstante Region trägt, Maus-Enhancer, Neomycin-Resistenz-Gen, um die letztendliche schwere Kette zu ergeben, welche die vollständige variable Region enthält, d.h. 82 Vh-Gene, 6 Jh-Gene und drei unterschiedliche konstante Regionen Cμ Cδ Cγ mit ihren korrespondierenden regulatorischen Sequenzen. Dieses YAC wird als yH2 bezeichnet. Dieses Konstrukt wird verwendet zur Herstellung der Xeno-Maus.
Eine ähnliche Strategie zu der oben verwendeten wird eingesetzt für die Rekonstruktion der Kappa-Loci, nur dass: der Neomycin-Auswahlmarker an das rekonstruierte YAC ligiert wird, welches die vollständigen Kappastellen enthält. Dieses YAC wird als yK2 bezeichnet.
YACs, welche das YH2 enthalten, werden in eine ES-Zelle über Fusion von YAC eingebracht, welches Hefe-Spheroplast enthält, mit HPRT-defizienten E14-, TG3B-Maus-ES-Zellen. HPRT-positive Zellen werden ausgewählt. Positive Klone werden propagiert und durch Southern Blots analysiert, wie auch durch CHEF-Blotanalyse. Klone, welche das intakte yH2 YAC enthalten, werden ausgewählt.
Einbringen und Auswahl von yK2 YAC in ES-Zellen wird in ähnlicher Art und Weise durchgeführt, wie beschrieben für yH2 YAC.
YH2, enthaltend ES-Zellen, werden in die Maus C57BL/6J Blastozyten mikroinjiziert. Die chimären männlichen Vertreter, die erzeugt wurden, werden für Keimbahn-Transmission auf Nachkommen untersucht.
yH2 und/oder yK2-transgene Mäuse werden mit DI-Mäusen gekreuzt (homozygot für Gen-zielgerichtete inaktivierte Maus-Schwere und Kappa-Ketten-Stellen). Jede der yH2; DI transgenen Stämme werden gekreuzt mit yK2;DI transgenen Stämmen, um Xenomaus-Stämme zu erzeugen.
Die Rekonstitution der B-Zell-Entwicklung und der Antikörperproduktion in Xenomaus wird durch Flußzytometrie und ELISA ausgewertet.
Die Immunisierung der Xenomaus wird durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Verfahren für die Hymbridom-Herstellung und das Screenen auf positive Klone sind ähnlich zu denjenigen beschrieben in Beispielen 3 und 4.
Die Hybridom-Klone 12.6, 28, 29.8, 30 und 50.30 wurden hinterlegt am Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris gemäß dem Budapester Vertrag und wurden unter folgenden Hinterlegungsnummern eingeordnet 1-2390, 1-2391, 12392, 1-2393 und 1-2394.
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Claims

Ein monoklonaler Antikörper, chimärer Antiköper, vollständig humanisierter Antikörper, Anti-Anti-ID-Antikörper oder ein Fragment davon, welcher spezifisch den menschlichen löslichen LDL-Rezeptor erkennt und bindet sowie Fragmente davon, welcher in der Lage ist, die Replikation von Hepatitis C-Virus zu inhibieren und welcher erhältlich ist durch Immunisieren von Tieren mit menschlichem löslichen LDLR+291, d.h. der menschlichen löslichen Rezeptorform, welche die Aminosäuresequenz von Asp+4 bis Glu+291 der menschlichen löslichen LDLR-Sequenz einschließt, außer der monoklonale Antikörper C7.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper erzeugt wird durch den Hybridom-Klon 12.6, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2390, Klon 28, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2391, Klon 29.8, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2392.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, exprimiert durch Hybridom-Klon 12.6, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2390.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, exprimiert durch Hybridom-Klon 28, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2391.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, exprimiert durch Hybridom-Klon 29.8, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2392.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, exprimiert durch Hybridom-Klon 30, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2393.
Der monoklonale Antikörper entsprechend Anspruch 1, exprimiert durch Hybridom-Klon 50.30, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2394.
Der monoklonale Antikörper gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, welcher zum Immunoglobulin-Isotyp IgG₁, oder IgM gehört.
Ein Hybridom-Klon 12.6, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2390.
Ein Hybridom-Klon 28, hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2391.
Ein Hybridom-Klon 29.8 hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2392.
Ein Hybridom-Klon 30 hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2393.
Ein Hybridom-Klon 50.30 hinterlegt bei der CNCM unter Nr. 1-2394.
Ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von menschlichem löslichen LDLR, welches die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers umfassend Kultivieren eines klonierten Hybridoms umfassend eine Milzzelle aus einem Säugetier, immunisiert mit hoch aufgereinigtem menschlichem löslichen LDLR+291, d.h. der menschlichen löslichen Rezeptorform, welche die Aminosäurequenz von Asp+4 bis Glu+291 der menschlichen löslichen LDLR-Sequenz einschließt sowie eine homogene oder heterogene lymphoide Zelle in flüssigem Medium oder Säugetierabdomen, um zu ermöglichen, dass das Hybridom den monoklonalen Antikörper erzeugt und akkumuliert.
Ein Verfahren zum Aufreinigen vom menschlichem LDLR, welches das Inkontaktbringen eines Materials, welches rohen menschlichen LDLR enthält mit dem monoklonalen Antikörper gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder mit dem monoklonalen Antikörper, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 15, umfasst.
Ein in vitro-Verfahren zum Inhibieren der Replikation der Hepatitis C-Virus umfassend das Inkontaktbringen von Zellen mit dem monoklonalen Antikörper von Anspruch 1 bis 8 vor der Infektion durch den Hepatitis C-Virus, um die Replikation von Hepatitis C in den Zellen zu inhibieren.
Die Verwendung des monoklonalen Antikörpers gemäß den Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Hepatitis C-Infektion.
Der monoklonale Antikörper entsprechend den Ansprüchen 1 bis 8 zur Verwendung als ein Medikament.