DE60127982T2

DE60127982T2 - Transgene drosophila melanogaster, die beta-amyloid exprimiert

Info

Publication number: DE60127982T2
Application number: DE60127982T
Authority: DE
Inventors: Dalia Livingston COHEN; Uwe Jochen Dengler; Alyce Lynn Framingham FINELLI; Felix Freuler; Mary Westfield KONSOLAKI; Mischa Werner Reinhardt; Susan Sudbury ZUSMAN
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-10-02
Also published as: KR20030051664A; AU2001293858A1; PT1324652E; EP1324652B1; ATE359704T1; WO2002026820A2; EP1324652A2; ES2284697T3; US20050138676A1; CA2423613A1; US20020174446A1; JP2004509646A; US6900367B2; DE60127982D1; WO2002026820A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimersche Erkrankung (AD) ist eine neurologische Störung, die zur Degeneration und schließlich zum Tod von Neuronen in Hirnzentren führt, die das Gedächtnis, die Wahrnehmung und das Verhalten kontrollieren. Das Merkmal der Erkrankung ist die Bildung von unlöslichen Amyloidablagerungen (senile Plaques), deren Hauptkomponente das 40 bis 42 Aminosäuren lange Amyloid-β-peptid (Aβ) ist, ein proteolytisches Produkt des Amyloidvorläuferproteins (APP). Diese Plaques dürften die Hauptursache sein, die zur Degeneration und zum Tod von neuronalen Zellen führt.
Die 3 Hauptgene, die mit dem Vererben der familiären Alzheimerschen Erkrankung (FAD) bei Menschen assoziiert sind, sind der Transmembranrezeptor Amyloidvorläuferprotein (APP) und die zwei Präsenilingene (PS1 und PS2). Fehlerhafte Mutationen in diesen Genen führen zur erhöhten Bildung des Aβ Peptids, was die Wichtigkeit dieses Peptids als Beitrag zum Krankheitszustand unterstreicht. APP wird dann an zwei Stellen, nämlich beta und gamma gespalten, um ein 40 bis 42 Aminosäuren langes Peptid freizusetzen, nämlich Aβ (zusammengefasst in J. Mills und P. B. Reiner (1999), J. Neurochem 72: 443-460). Fehlerhafte Mutationen in APP nahe der gamma-Stelle (A. Goate et al., (1991), Nature 349: 704-706), worin das C-terminale Ende des Peptids abgespalten ist, führen zur Bildung von mehr Aβ 42 durch die Veränderung des 40/42 Verhältnisses (N. Suzuki et al., (1994), Science 264: 1336-1340). Mutationen um die beta-Stelle führen zu einer höheren Gesamtproduktion beider Formen (M. Mullan et al., (1992), Nat. Genet. 1: 345-347), M. Citron et al., (1995), Neuron 14: 661-670).
Die Präseniline sind mehrfach durchspannende Transmembranproteine, deren Funktionen derzeit diskutiert werden. Fehlerhafte Mutationen in den Präsenilinen erhöhen die Freisetzung der Aβ 42 Form (D. R. Borchelt et al. (1996), Neuron 17: 1005-1013), M. Citron, et al. (1997), Nat. Med. 3: 67-72, O. Murayama et al. (1999), Neurosci. Lett. 265: 61-63) und sind für den Hauptteil der FAD Fälle verantwortlich (R. Sherrington et al., (1995), Nature 375: 754-760).
Viele Studien haben die Rollen sowohl der löslichen als auch der unlöslichen (aggregierten) Formen von Aβ untersucht und es wird verbreitet angenommen, dass die aggregierte Form des Peptids für die beobachteten toxischen Effekte verantwortlich ist (C. J. Pike et al. (1993), J. Neurosci. 13: 1676-1687, A. Lorenzo und B. A. Yankner (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12243-12247, L. Giovannelli et al. (1998), Neurosci. 87: 349-357). Es existieren viele Mechanismen, die zum Aβ-induzierten Zelltod von Neuronen beitragen, einschließlich die Zerstörung der intrazellulären Calciumspiegel (für Zusammenfassungen siehe S. P. Fraser et al. (1997), Trends Neurosci. 20: 67-72, M. P. Mattson (1997), Physiol. Rev. 77: 1081-1132, C. M. Coughlan und K. C. Breen (2000), Pharmacol. and Ther. 86: 111-144), die Einführung einer entzündlichen Reaktion, die durch die Aktivierung von Mikrogliazellen verursacht wird (zusammengefasst in C. M. Coughlan und K. C. Breen (2000), Pharmacol. und Ther. 86: 111-144) und die ausgeprägte Degeneration und/oder Zerstörung des cholinergen Systems des basalen Großhirns, das beim Lernen und Gedächtnis involviert ist (zusammengefasst in Hellström-Lindahl und Court, 2000, Behav. Brain. Res. 113 (1-2): 159-168). Es ist klar, dass die schädlichen Effekte der Aβ Überproduktion und deren Beitrag zur AD vielschichtig und komplex sind.
Obwohl eine große Menge an Forschung der Untersuchung der Alzheimerschen Erkrankung und deren allgemeiner Pathologie gewidmet wurde, ist die genetische Analyse der humanen neurodegenerativen Störungen begrenzt. Als Ergebnis sind die Ereignisse, die die Akkumulation von beta-Amyloid wie auch die genaue Rolle von Genen, wie APP und anderen, die im Verdacht stehen, bei Alzheimerscher Erkrankung eine Rolle zu spielen, wenig verstanden.
Mehrere Beiträge zur Etablierung der zentralen Rolle von Aβ bei der Manifestierung und Progression von AD kamen von Untersuchungen in Modellsystemen. Transgene Mäuse, die entweder Wildtyp oder mutierte Formen von APP exprimieren, zeigen eine AD Pathologie, entwickeln in vielen Fällen auf eine altersabhängige Weise Amyloidplaques und zeigen in einigen Fällen verändertes Verhalten und Wahrnehmung (für Zusammenfassungen siehe D. L. Price et al. (1998), Annu. Rev. Genet. 32: 461-493, F. van Leuven (2000), Progress in Neurobiol. 61: 305-312). Transgene Mäuse, die nur das Aβ 42 Peptid exprimieren, zeigen eine ausgiebige neuronale Degeneration in Gehirnregionen, die normalerweise bei AD betroffen sind und 50 % sterben im Alter von 12 Monaten (F. M. LaFerla et al. (1995), Nature Genet. 9: 21-30). Die neuronalen Zellen in diesen Mäusen machen schießlich eine Apoptose durch, wonach eine Astrogliose und eine Spongiose erfolgt. Dies zeigt, dass die Aβ 42 Expression in vivo toxisch ist und zu einer neuronalen Degeneration und Apoptose führt.
Die Verwendung von Drosophila als Modellorganismus hat sich als wichtiges Werkzeug bei der Ermittlung von humanen neurodegenerativen Krankheitswegen herausgestellt (wie dies in M. Fortini und N. Bonini (2000), Trends Genet. 16: 161-167 zusammengefasst ist), da das Drosophila Genom viele relevante humane Orthologe enthält, die in der Funktion extrem gut konserviert sind (G. M. Rubin et al. (2000), Science 287: 2204-2215). Beispielsweise trägt Drosophila melanogaster ein Gen, das zum humanen APP homolog ist, welches bei der Funktion des Nervensystems involviert ist. Das Gen, das zu APP ähnlich ist (Appl), ist zu etwa 40 % zur neurogenen Isoform (695) des humanen APP Gens über drei große Domänen identisch (Rosen et al., PNAS USA 86: 2478-2482 (1988)) und wird wie humanes APP695 ausschließlich im Nervensystem exprimiert. Fliegen, denen das Appl Gen fehlt, zeigen Verhaltensdefekte, die durch das humane APP Gen aufgehoben werden können, was nahelegt, dass die zwei Gene ähnliche Funktionen in den zwei Organismen aufweisen (Luo et al., Neuron 9: 595-605 (1992)).
Zusätzlich ahmen Drosphila Modelle der Polyglutaminwiederholungserkrankungen (G. R. Jackson et al. (1998), Neuron 21: 633-642, P. Kazemi-Esfarjani und S. Benzer (2000), Science 287: 1837-1840, Fernandez-Funez et al. (2000) Nature 408 (6808): 101-106 und Parkinsonsche Erkrankung (MB. Feany und W. W. Bender (2000), Nature 404: 394-398) diesen Krankheitszustand bei Menschen sowohl auf zellulärer Ebene als auch auf physiologischer Ebene sehr eng nach und wurden erfolgreich zur Identifizierung von anderen Genen verwendet, die eine Rolle bei diesen Erkrankungen spielen. Daher wird die Leistungsfähigkeit von Drosophila als Modellsystem in der Fähigkeit gezeigt, den Krankheitszustand darzustellen und genetische Screenings im großen Maßstab auszuführen.
Die Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen und Genen, die auf den APP Weg in transgenen Drosophila melanogaster wirken, die ektopisch Gene exprimieren, die mit AD zusammenhängen. Die Expression dieser Transgene kann sichtbare Phänotypen induzieren und es wird hierin erwähnt, dass genetische Screenings, die hierin beschrieben sind, zur Identifizierung von Genen verwendet werden können, die im APP Weg beteiligt sind, indem Mutationen identifiziert werden, die die indizierten sichtbaren Phänotypen modifizieren. Die von diesen Mutationen betroffenen Gene werden hierin "genetische Modifizierer" genannt. Es wird hierin erwähnt, dass humane Homologe von so identifizierten genetischen Modifizierern, brauchbare Ziele zur Entwicklung von Therapeutika sein könnten, um Zustände zu behandeln, die mit den Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, wie unter anderem die Entwicklung von Therapeutika für Alzheimersche Erkrankung (AD). Es wird hierin auch erwähnt, dass einige dieser humanen Homologe in einem Bereich des humanen Chromosoms 10 auftreten können, von dem eine Verbindung zur Alzheimerschen Erkrankung gezeigt wurde (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000). Solche humanen Homologe können das Potential aufweisen, genetisch mit AD in Verbindung zu stehen und dienen als Marker für AD oder als Ziele für die Entwicklung von Therapeutika, zur Behandlung von Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP assoziiert sind, einschließlich unter anderem der Entwicklung von Therapeutika für Alzheimersche Erkrankung (AD). Solche humanen Homologe können auch in zellulären Wegen wirken, die mit AD in Verbindung stehende Gene umfassen und diese humanen Homologe können zur Identifizierung der Gene in diesen Wegen verwendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das aus dem Abeta-Teil von humanem APP besteht, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) kodiert, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz zu dieser Fliege führt, die einen veränderten Phänotyp zeigt. In einer bestimmten Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz für Abeta 42, die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz umfasst den für das Auge spezifischen Promotor GMR und die Expression der DNA Sequenz führt zu einem veränderten Phänotyp, der als Phänotyp des "rauen Auges" bezeichnet wird.
Ebenfalls wird eine transgene Fliege beschrieben, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den Wildtypteil C 99 des humanen APP (SEQ ID Nr. 3) oder den C 99 Teil des humanen APP mit der Londonmutation (SEQ ID Nr. 4) fusioniert an eine Signalsequenz umfasst, worin die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz fusioniert ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression dieser DNA Sequenz in der Fliege dazu führt, dass sie einen veränderten Phänotyp zeigt. In einer Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz den Wildtyp C 99, die gewebespezifische Expressionskontrollsequenz ist das UAS Kontrollelement, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, das im Gehirn durch das 7B-Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt zu einem veränderten Phänotyp, der zu einem lokomotorischen Defekt führt. In einer weiteren bestimmten Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz entweder den Wildtyp C 99 oder den C 99 Teil des humanen APP mit der Londonmutation, die gewebespezifische Expressionskontrollsequenz ist das UAS Kontrollelement, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, welches durch das apterous Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt zu einem veränderten Phänotyp, der als der Phänotyp des "konkaven Flügels" bezeichnet wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von genetischen Modifizierern des APP Wegs, wobei das Verfahren die Bereitstellung einer transgenen Fliege umfasst, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den Abeta Teil des humanen APP umfasst, worin die DNA Sequenz Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) fusioniert an eine Signalsequenz kodiert, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, Kreuzung der transgenen Fliege mit einer Fliege, die eine Mutation in einem bekannten oder abgeleiteten Gen enthält und Screenen der Nachkommen dieser Kreuzungen auf Fliegen, die die DNA sequenz und die Mutation tragen und eine modifizierte Expression des transgenen Phänotyps im Vergleich zu den Kontrollen ziegen. In einer Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz Abeta 42, die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz umfasst den Augen-spezifischen Promotor GMR und die Expression der DNA Sequenz führt dazu, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, der als Phänotyp des "rauen Auges" bezeichnet wird.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Identifizierung von genetischen Modifizierern des APP Wegs, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den Wildtypteil C 99 von humanem APP (SEQ ID Nr. 3) oder den C 99 Teil des humanen APP mit der Londonmutation (SEQ ID Nr. 4) fusioniert an eine Signalsequenz umfasst, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, Kreuzung der transgenen Fliege mit einer Fliege, die eine Mutation in einem bekannten oder abgeleiteten Gen enthält und Screenen der Nachkommen dieser Kreuzungen auf Fliegen, die die DNA Sequenz und die Mutation enthalten und eine modifizierte Expression des transgenen Phänotyps im Verglich zu den Kontrollen aufweisen. In einer Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz für den Wildtyp C 99, die Gewebe-spezifischen Expressionskontrollsequenz ist das UAS Kontrollelement, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, welches im Gehirn durch das 7B-Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt in der Fliege dazu, dass sie einen veränderten Phänotyp zeigt, der durch einen lokomotorischen Defekt gekennzeichnet ist. In einer anderen Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz entweder den Wildtyp C 99 oder den C 99 Teil des humanen APP mit der Londonmutation, wobei die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz das AUS Kontrollelement ist, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, welches durch das apterous Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt dazu, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, der als der Phänotyp des "konkaven Flügels" bezeichnet wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die auf Genprodukte wirken, die im APP Weg beteiligt sind, indem auf Verbindungen getestet wird, die die durch die Expression von Abeta induzierten Phänotypen modifizieren können, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den Abeta Teil des humanen APP umfasst, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) fusioniert an eine Signalsequenz kodiert, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, Verabreichung einer Kandidatenverbindung an die Fliege und Testen auf Veränderungen im Phänotyp der Fliege im Vergleich zum Phänotyp einer ähnlichen transgenen Fliege, der die Kandidatenverbindung nicht verabreicht wurde. In einer Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz für Abeta 42, die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz ist der Augen-spezifische Promotor GMR und die Expression der DNA Sequenz führt dazu, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, der als Phänotyp des "rauen Auges" bezeichnet wird.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die auf Genprodukte wirken, die im APP Weg beteiligt sind, indem auf Verbindungen getestet wird, die die Phänotypen modifizieren können, die durch die Expression von C99 induziert werden, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den C99 Wildtypteil des humanen APP (SEQ ID Nr. 3) oder den C99 Teil des humanen APP mit der Londonmutation (SEQ ID Nr. 4) fusioniert an eine Signalsequenz umfasst, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz zu einer Fliege führt, die einen veränderten Phänotyp zeigt, Verabreichung einer Kandidatenverbindung an die Fliege und Testen auf Veränderungen des Phänotyps der Fliege im Vergleich zum Phänotyp einer ähnlichen transgenen Fliege, der keine Kandidatenverbindung verabreicht wurde. In einer Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz für Wildtyp C99, die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz ist das UAS Kontrollelement, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, das im Gehirn durch das 7B-Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt dazu, dass die Fliege einen Phänotyp zeigt, der als lokomotorischer Defekt charakterisiert ist. In einer weiteren Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz entweder für Wildtyp C99 oder den C99 Teil von humanem APP mit der Londonmutation, die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz ist das UAS Kontrollelement, das durch das Gal4 Protein aktiviert wird, welches durch das apterous Gal4 Transgen gebildet wird und die Expression der DNA Sequenz führt dazu, dass diese Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, der als der Phänotyp des "konkaven Flügels" bezeichnet wird.
Die Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die beim Einsetzen oder der Progression von Zuständen beteiligt sind, welche mit der abnormalen Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf Alzheimersche Erkrankung und deren Proteinprodukte als potentielle Marker für die Alzheimersche Erkrankung dienen können, wobei das Verfahren die Identifizierung der humanen Homologe der Fliegengene umfasst, die als genetische Modifizierer gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
In einem weiteren Aspekt ermöglicht die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die beim Einsetzen oder der Progression von Zuständen beteiligt sind, welche mit der abnormalen Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, und dessen Proteinprodukte als potentielle Marker für die Alzheimersche Erkrankung dienen könnten, wobei das Verfahren die Identifizierung von humanen Homologen der genetischen Modifizierergene der Fliege umfasst, die nahe am Bereich des humanen Chromosoms 10 lokalisiert sind, von dem eine genetische Verbindung zur Alzheimerschen Erkrankung gezeigt wurde.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Identifizierung von Genen beschrieben, die beim Einsetzen oder der Progression der Alzheimerschen Erkrankung beteiligt sind und deren Proteinprodukte als potentielle Marker für AD dienen können, wobei das Verfahren die Identifizierung von Genen umfasst, die in den Wegen beteiligt sind, welche durch die Transkriptionsfaktoren reguliert werden, welche durch die humanen Sequenzen hCP50765 (SEQ ID Nr. 35, kodiert durch das EGR2 Gen) und hCP41313 (SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53, kodiert vom humanen Homolog des Drosophila nocA Gens) kodiert sind, wobei die humanen Sequenzen nahe dem Bereich des humanen Chromosoms 10 lokalisiert sind, vom dem gezeigt wurde, dass es eine genetische Verbindung zur Alzheimerschen Erkrankung aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Beschreibung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Behandlung, Prävention oder Linderung von pathologischen Zuständen brauchbar sind, die mit Defekten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimerscher Erkrankung, das umfasst die Verabreichung von Kandidatenverbindungen in einem in vitro oder in vivo Modell der Alzheimerschen Erkrankung und das Testen auf Veränderungen in der Expression eines genetischen Homologs eines genetischen Modifizierers, worin eine veränderte Expression des Homologs im Vergleich zu den Mengen in einer Kontrolle, in der keine Kandidatenverbindung verabreicht wurde, eine Verbindung mit einem potentiellen therapeutischen Wert anzeigt.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung, Prävention oder Linderung von pathologischen Zuständen, die mit Defekten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Funktion eines oder mehrerer der durch die humanen Homologe der hierin identifizierten genetischen Modifizierer kodierten Polypepzide hemmt oder fördert, an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung, Prävention oder Linderung von pathologischen Zuständen, die mit Defekten in der Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf, welche eine oder mehrere Substanzen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: Trippelhelix DNA, Antisense Oligonukleotiden oder Ribozymen, die alle komplementär zur geeigneten Sequenz einer mRNA sind, die von einem oder mehreren der humanen Homologe der genetischen Modifizierergene abgeleitet ist, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung, Prävention oder Linderung von pathologischen Zuständen, die mit der Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf, welche doppelsträngige RNA Moleküle umfasst, die gegen ein oder mehrere der humanen Homologe der genetischen Modifizierer gerichtet sind, welche gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung, Prävention oder Linderung von pathologischen Zuständen, die mit Defekten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf, welche einen oder mehrere Antikörper und/oder Fragmente hiervon umfasst, die gegen das Polypeptid gerichtet sind, das durch einen oder mehrere der humanen Homologe der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten genetischen Modifizierer kodiert wird.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Diagnose von pathologischen Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP Weg bei einem Patienten assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das das Messen der mRNA Menge oder des Aktivitätsniveaus der Polypeptide umfasst, die durch ein oder mehrere humane Homologe eines genetischen Modifizierers in einer biologischen Probe von einem Individuum kodiert werden, worin eine abnormale Menge relativ zu der Menge hiervon in einem Kontrollindividuum für diese Bedingungen diagnostisch ist.
Ebenfalls beschrieben wird ein Kit, der die Komponenten umfasst, welche zur Detektion der Expressionsmengen der Polypeptide erforderlich sind, die durch ein oder mehrere der humanen Homologe eines genetischen Modifizierers oder Fragmenten hiervon kodiert werden, oder von Polynukleotiden, die ein oder mehrere der Polypeptide oder Fragmente hiervon kodieren, in einer biologischen Probe aus einem Patienten, wobei solche Kits Antikörper umfassen, die an die Polypeptide oder Fragmente hiervon binden, oder Oligonukleotidsonden, die mit den Polynukleotiden oder den Fragmenten hiervon hybridisieren und Anleitungen zur Verwendung dieses Kits.
Ebenfalls beschrieben wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Substanzen enthält, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Antisense, Ribozym, doppelsträngiger RNA oder Trippelhelixnukleinsäuren, die gegen einen oder mehrere der humanen Homologe eines genetischen Modifizierers oder Fragmenten hiervon gerichtet sind, Polypeptide, die durch ein oder mehrere der humanen Homologe eines genetischen Modifizierers oder Fragmenten hiervon kodiert werden, Polynukleotide, die diese Polypeptide oder Fragmente hiervon umfassen und Antikörper, die an diese Polypeptide oder Fragmente hiervon binden, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel zur Behandlung von pathologischen Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimerscher Erkrankung.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von pathologischen Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, das umfasst die Einführung von Nukleinsäuren, die für einen oder mehrere der humanen Homologe eines genetischen Modifizierers kodieren, in ein oder mehrere Gewebe eines Patienten, der dessen bedarf, was dazu führt, dass ein oder mehrere Proteine, die durch die Nukleinsäuren kodiert werden, durch die Zellen im Gewebe exprimiert und/oder sekretiert werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden viele herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und der rekombinanten DNA verwendet. Diese Techniken sind gut bekannt und werden beispielsweise beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Bände I, II und III, 1997 (Herausgeber F. M. Ausubel), Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II, 1985 (Herausgeber D. N. Glover), A Practical Guide to Molecular Cloning aus der Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller und M. P. Calos, Herausgeber, Cold Spring Harbor Laborstory) und Methods in Enzymology, Band 154 und Band 155 (Herausgeber jeweils Wu und Grossman und Wu). Gut bekannte molekulare Gentechniken für Drosophila können beispielsweise in D. B. Robert, Drosophila, A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1986) gefunden werden. Beschreibungen der Fliegenstammsammlungen können in der Fliegendatenbank http://flybase.bio.indiana.edu gefunden werden.
Ein "transgener" Organismus, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Organismus, der zusätzliches genetisches Material in das Genom inseriert aufweist. Wie hierin verwendet umfasst eine "transgene Fliege" embryonale, larvenartige und ausgewachsene Formen von Drosophila melanogaster, die eine DNA Sequenz vom selben oder einem anderen Organismus zufällig in ihr Genom inseriert enthalten. Obwohl Drosphila melanogaster bevorzugt ist, wird ebenfalls hervorgehoben, dass jede Fliege der Gattung Drosophila in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Wie hierin verwendet bezieht sich "ektope" Expression des Transgens auf die Expression des Transgens in einem Gewebe oder einer Zelle oder bei einem spezifischen Entwicklungsstadium, wo es normalerweise nicht exprimiert wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Phänotyp" auf die zu beobachtenden physischen oder biochemischen Eigenschaften eines Organismus, wie dies sowohl durch genetische Ausstattung als auch Umwelteinflüsse bestimmt wird.
Wie hierin verwendet umfasst eine Verbindung, die "die Funktion eines oder mehrerer der durch das humane Homolog eines genetischen Modifizierers kodierten Polypeptids hemmen oder fördern kann" Verbindungen, die dies indirekt (über stromabwärts Effekte) oder direkt durch Bindung oder einer sonstigen Wechselwirkung mit dem Protein bewirken und umfasst unter anderem Antagonisten oder Agonisten des Proteins.
Wie hierin verwendet ist ein "stringentes Ortholog" so definiert, dass es die folgenden Kriterien erfüllt: Das Fliegenprotein X hat die beste Übereinstimmung mit dem humanen Protein Y und das Fliegenprotein X hat keine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Fliegenprotein als mit dem humanen Protein Y und das humane Protein Y hat die beste Übereinstimmung mit dem Fliegenprotein X und das humane Protein Y hat keine bessere Übereinstimmung mit einem anderen humanen Protein als mit dem Fliegenprotein X, worin "X" und "Y" für zwei beliebige Proteine aus der Fliege oder dem Menschen stehen, die verglichen werden.
Ein "putatives Ortholog", ist hierin so definiert, dass es nur die zwei folgenden Kriterien erfüllt: Das Fliegenprotein X hat die beste Übereinstimmung mit dem humanen Protein Y und das humane Protein Y hat die beste Übereinstimmung mit dem Fliegenprotein X ungeachtet davon, ob das Fliegenprotein X eine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Fliegenprotein aufweist und/oder ob das humane Protein Y eine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Humanprotein aufweist. Wie hierin beschrieben sind alle anderen Proteinübereinstimmungen Mensch/Fliege "Homologe".
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Expressionskontrollsequenz" auf Promotoren und Enhancer. Der Ausdruck "Promotor" bezieht sich auf DNA Sequenzen, die direkt oder indirekt von einer DNA-abhängigen RNA Polymerase während der Initiation der Transkription erkannt und gebunden werden und umfasst Enhancerelemente. Enhancer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen das UAS Element, das durch den Gal4 Hefetranskriptionsregulator aktiviert wird.
Der Ausdruck "Transkriptionsfaktor" bezieht sich auf jedes Protein, das zur Initiation oder Regulation der Transkription bei Eukaryonten erforderlich ist. Beispielsweise ist der Augen-spezifische Promotor GMR eine Bindungsstelle für den Augen-spezifischen Transkriptionsfaktor GLASS (K. Moses und G. M. Rubin, Genes Dev. 5 (4): 583-593 (1991)).
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Abeta" (Aβ) auf beta-Amyloidpeptid, das ein kurzes Peptid ist (40-42 Aminosäuren), das durch eine proteolytische Spaltung von APP durch beta- und gamma-Sekretasen gebildet wird. Es ist die primäre Komponente der Amyloidablagerungen, das Hauptmerkmal von AD und die Ursache des neuronalen Zelltods und der Degeneration. Das Abeta Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst unter anderem Peptide mit 40 und 42 Aminosäuren und diese werden jeweils als Abeta 40 (oder Aβ40) (SEQ ID Nr. 1) und Abeta 42 (oder Aβ42) (SEQ ID Nr. 2) bezeichnet.
"C99" bezieht sich auf ein Peptid, das die Abeta Region plus den cytoplasmatischen Schwanz von APP (SEQ ID Nr. 3) enthält. Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck auch die C99 Londonsequenz, die die London FAD Alzheimer-assoziierte Mutation enthält (SEQ ID Nr. 4) (A. Goate et al., (1991), Nature 349: 704-706). Abeta und C99 Peptide sind dem Fachmann gut bekannt (siehe beispielsweise Golde et al., Science 255: 728-730 (1992), C. M. Coughlan und K. C. Breen (2000), Pharmacol. and Ther. 86: 111-144).
Die "UAS" Region bezieht sich, wie sie hierin verwendet wird, auf eine stromaufwärts aktivierende Sequenz, die durch den GAL-4 Transkriptionsaktivator erkannt wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich eine "Signalsequenz" auf eine kurze Sequenz aus Aminosäuren, die die schließliche Lage eines Proteins in einer Zelle bestimmt, beispielsweise die N-terminale Sequenz oder etwa 20 Aminosäuren, die naszente Sekretions- und Transmembranproteine in das endoplasmatische Retikulum steuert. Es wird hierin darauf hingewiesen, dass jede herkömmliche Signalsequenz, die dem Fachmann bekannt ist, verwendet werden kann, um den Transfer der kodierten C99 oder Abeta Proteine über den Sekretionsweg zu transferieren, einschließlich unter anderem die Signalsequenz des endogenen Drosophila Appl oder Präsenilin oder des Windbeutel-Gens, das für ein im ER (endoplasmatischen Retikulum) vorkommendes Gen kodiert (Konsolaki und Schupbach, Genes & Dev. 12: 120-131 (1998)) oder des humanen Präproenkephalingensignals (SEQ ID Nr. 5).
Wie hierin verwendet bezieht sich eine "Kontrollfliege" auf eine Larve oder Fliege, die denselben Genotyp wie die Larven oder Fliegen aufweist, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, außer dass die Kontrolllarve oder -fliege nicht die Mutation aufweist, die auf die Modifikation des Phänotyps getestet wird oder ihr keine Kandidatenverbindungen verabreicht werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein "Kontrollsubjekt" auf einen Organismus, der nicht an einem Zustand leidet, der mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert ist.
Wie hierin verwendet ist ein "Drosophila Transformationsvektor" ein DNA Plasmid, das Transposonelementsequenzen enthält und die Integration eines DNA Stücks in das Genom des Organismus vermitteln kann. Diese Technologie ist dem Fachmann bekannt.
Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist der Phänotyp des "rauen Auges" durch die Disorganisation von Ommatidien und Interommatidienborsten gekennzeichnet und kann durch die Degeneration von neuronalen Zellen verursacht werden. Dieser Phänotyp ist durch ein Sektionsstereomikroskop sichtbar.
Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist der "konkave Flügelphänotyp" durch eine abnormale Faltung der Flügelfläche gekennzeichnet, so dass die Flügel entlang ihrer Ränder nach oben gebogen sind.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein "Iokomotorischer Defekt" auf einen Phänotyp, bei dem die Fliegen gestörte Reaktionen gegenüber einem mechanischen Reiz im Vergleich zu Wildtypfliegen in herkömmlichen lokomotorischen Aktivitätstests zeigen.
Wie hierin verwendet umfassen die folgenden und verwandte Ausdrücke, pathologische Zustände, die mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, Zustände, die mit einer abnormalen Regulation des APP Wegs assoziiert sind, Zustände, die mit der Alzheimerschen Erkrankung verwandt sind, pathologische Zustände, die mit Defekten im APP Weg assoziiert sind, unter anderem Alzheimersche Erkran kung und umfassen die Zustände, die durch die Degeneration und den schließlichen Tod von Neuronen in Gehirnclustern gekennzeichnet sind, die Gedächtnis, Wahrnehmung und Verhalten kontrollieren.
"Therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge des Wirkstoffs, beispielsweise der Verbindung oder des Genprodukts, die die Symptome des zu behandelnden Zustand lindert.
Verfahren zur Erlangung von transgenen Organismen, einschließlich transgener Drosophila, sind dem Fachmann gut bekannt. Beispielsweise ist eine herkömmlich verwendete Referenz für die P-Element vermittelte Transformation Spradling, 1986, P-Element mediated transformation, in Drosophila: A practical approach (Herausgeber D. B. Roberts), Seiten 175-197, IRL Press, Oxford, UK)). Die EP Elementtechnologie bezieht sich auf ein binäres System unter Verwendung des Hefe Gal4 Transkriptionsaktivators, das verwendet wird, um ektopisch die Transkription von endogenen Drosophila Genen zu regulieren. Diese Technologie ist beschrieben in: Brand und Perrimon, 1993, Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes, Development 118, Seiten 401-415 und in Rorth et al., 1998, Systematic gain-of-function genetics in Drosophila, Development, 125 (6), Seiten 1049-1057.
Die vorliegende Beschreibung beschreibt eine transgene Fliege, nämlich Drosophila melanogaster, die im Genom eine DNA Sequenz umfasst, die ein Polypeptid kodiert, das den beta-Amyloidteil (SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2) oder den C99 Teil des humanen APP Gens (SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4) umfasst, der an den N-Terminus gemäß herkömmlicher Verfahren an eine Signalpeptidsequenz fusioniert ist, beispielsweise SEQ ID Nr. 5, um den Transfer des kodierten Polypeptids über den Sekretionsweg sicherzustellen. Die fusionierten DNA Sequenzen werden operativ an Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenzen, wie Promotorregionen oder stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (UAS) in Abhängigkeit des verwendeten Expressionssystems gebunden. Die Expressionskontrollsequenzen umfassen jene, die für das Nervengewebe in der Fliege spezifisch sind und umfassen Organe, wie das Auge, den Flügel, das Notum, das Gehirn, das ZNS und das PNS. Unter der Kontrolle dieser Gewebe-spezifischen Kontrollsequenzen werden die kodierten Peptide unter Bildung von mRNA transkribiert, die in detektierbare Mengen an beta-Amyloid oder C99 Peptid translatiert wird und einen veränderten Phänotyp in den Fliegen verursacht. Durch Testen auf Veränderungen in diesen Phänotypen können diese Fliegen zur Identifizierung von Genen oder Verbindungen verwendet werden, die den APP Weg beeinflussen und können einen Einblick in die molekularen und biochemischen Mechanismen des APP Wegs und der Alzheimerschen Erkrankung liefern.
Es können herkömmliche Expressionskontrollsysteme verwendet werden, um eine ektope Expression von Proteinen von Interesse zu erreichen, einschließlich der beta-Amyloid und C99 Peptide der vorliegenden Erfindung. Eine solche Expression kann zu einer Störung der biochemischen Wege und der Erzeugung von veränderten Phänotypen führen. Ein solches Expressionskontrollsystem umfasst die direkte Fusion der DNA Sequenz an Expressionskontrollsequenzen von Gewebe-spezifisch exprimierten Genen, wie Promotoren oder Enhancern. Ein weiteres Expressionskontrollsystem, das verwendet werden kann, ist das binäre Gal4-Transkriptionsaktivierungssystem (Brand und Perrimon, Development 118: 401-415 (1993)).
Das Gal4 System verwendet den Hefetranskriptionsaktivator Gal4 zur Steuerung der Expression eines Gens von Interesse auf eine Gewebe-spezifische Weise. Das Gal4 Gen wurde zufällig in das Fliegengenom mittels eines herkömmlichen Transformationssytems inseriert, so dass es unter die Kontrolle der genomischen Enhancer kommt, die die Expression in einer temporären und Gewebe-spezifischen Weise steuern. Einzelne Fliegenstämme wurden etabliert, die "Treiber" genannt werden, welche diese Insertionen tragen (Brand und Perrimon, Development 118: 401-415 (1993)).
Im Gal4 System wird ein Gen von Interesse in einen Transformationsvektor kloniert, so dass dessen Transkription unter die Kontrolle der UAS Sequenz (stromaufwärts aktivierende Sequenz) kommt, dem Gal4-Reaktionselement. Wenn ein Fliegenstamm, der die UAS/Gensequenz von Interesse trägt, mit einem Fliegenstamm gekreuzt wird, der das Gal4 Gen unter der Kontrolle eines Gewebe-spezifischen Enhancers exprimiert, wird das Gen in einem Gewebe-spezifischen Muster exprimiert.
Um Phänotypen zu erzeugen, die leicht in ausgewachsenen Geweben sichtbar sind und daher als genetische Screenings verwendet werden können, können Gal4 "Treiber", die die Expression in späteren Stadien der Fliegenentwicklung steuern, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mittels dieser Treiber resultiert die Expression in möglichen Defekten in den Flügeln, den Augen, den Beinen, den unterschiedlichen sensorischen Organen und dem Gehirn. Die "Treiber" umfassen beispielsweise apterous-Gal4 (Flügel), elav-Gal4 (ZNS), sevenless-Gal4, eyeless-Gal4 und pGMR-Gal4 (Augen). Zusätzlich sind, da Appl, das Fliegenhomologe zu APP ausschließlich in Nervengewebe exprimiert wird, "Treiberstämme" bevorzugt, worin zumindest eine Untergruppe der Expression in Richtung des Nervensystems geht. Dies umfasst den Gehirn-spezifischen 7B-Gal4 Treiber. Beschreibungen der Gal4 Linien und Anmerkungen über ihr spezifisches Expressionsmuster sind in Flybase erhältlich (http://flybase.bio.indiana.edu).
Es können verschiedene DNA Konstrukte verwendet werden, um die erfindungsgemäße transgene Drosophila melanogaster zu erzeugen. Beispielsweise kann das Konstrukt das beta-Amyloid oder den C99 Teil des humanen APP Gens fusioniert an die Signalpeptidsequenz des Präproenkephalingens fusioniert enthalten und operativ an den Augen-spezifischen Promotor GMR gebunden sein. In einem anderen Beispiel kann das Konstrukt den beta-Amyloidteil oder C99 des humanen APP Gens fusioniert an die Signalpeptidsequenz des humanen Präproenkephalingens kloniert in den pUAST Vektor enthalten (Brand und Perrimon, Development 118: 401-415 (1993)), das die UAS Sequenz stromaufwärts der transkribierten Region plaziert. Die Insertion dieser Konstrukte in das Fliegengenom kann über eine P-Elementrekombination, eine Hobo-Elementrekombination (Blackman et al., EMBO J. 8: 211-217 (1989), eine homologe Rekombination (Rong und Golic, Science 288: 2013-2018 (2000)) oder anderen dem Fachmann bekannten Standardtechniken erfolgen.
Wie oben diskutiert kann das ektop exprimierte Gen zu einem veränderten Phänotyp durch die Zerstörung eines bestimmten biochemischen Wegs führen. Mutationen in den Genen, die im selben biochemischen Weg wirken, dürften eine Modifikation des geänderten Phänotyps verursachen. Daher können die Fliegen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Gene zu identifizieren, die im APP Weg wirken, indem man eine transgene C99 oder Abeta Fliege mit einer Fliege kreuzt, die eine Mutation in einem bekannten oder abgeleiteten Gen aufweist und man die Nachkommen dieser Kreuzungen auf Fliegen screent, die eine quantitative oder qualitative Modifikation des veränderten Phänotyps der transgenen C99 oder Abeta Fliege im Vergleich zu Kontrollen zeigen. Daher ist dieses System extrem nützlich für die Ermittlung der Funktion von prozessierten APP Genprodukten, wie auch zur Identifizierung von anderen Genen, die direkt oder indirekt mit ihnen Wechselwirken. Mutationen, die gescreent werden können, umfassen unter anderem Funktionsverlustallele bekannter Gene, Deletionsstämme, "Enhancerauf findungsstämme", die aus dem P-Element und Funktionsherstellenden Mutationen erzeugt werden, die durch zufällige Insertionen in das Drosophila Genom eines Gal4-induzierbaren Konstrukts erzeugt wurden, welche die ektope Expression von Genen in der Nachbarschaft der Insertion aktivieren kann. Es wird hierin erkannt, dass die im APP Weg beteiligten Gene auf diese Weise identifiziert werden können und dass diese Gene dann als Ziele zur Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung von Zuständen dienen können, die mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, welche zu Krankheiten führen, wie unter anderem Alzheimerscher Erkrankung.
Die transgenen C99 und Abeta Fliegen der vorliegenden Erfindung können auch in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die den APP Weg modifizieren können und so zur Behandlung von Zuständen brauchbar sein, wie sie oben diskutiert sind. Solche Verfahren können die Verabreichung von Kandidatenverbindungen an transgene C99 oder Abeta Fliegen und dann den Test auf Veränderungen im Phänotyp der transgenen C99 oder Abeta Fliege im Vergleich zum Phänotyp der transgenen C99 oder Abeta Kontrollfliegen umfassen, denen die Verbindung nicht verabreicht wurde. Beispielsweise können Kandidatenverbindungen mittels herkömmlicher Verfahren Larven gefüttert werden, die ein beta-Amyloid oder C99 exprimieren. Die Larven können dann bis zum erwachsenen Stadium angezogen werden und es wird der durch C99 oder Abeta-induzierte Phänotyp getestet. Kandidatenverbindungen können auch ausgewachsenen Fliegen gefüttert werden und Modifikationen des Phänotyps getestet werden.
Der Wirkmechanismus von so identifizierten Verbindungen kann durch den Vergleich der durch genetische Manipulation hergestellten Phänotypen mit denen untersucht werden, die durch die Verabreichung einer Verbindung von Interesse induziert werden. Solche Verbindungen umfassen jene, die den in den transgenen Fliegen veränderten Phänotyp lindern oder verschlimmern. Die Expression eines durch eine Verbindung induzierten Phänotyps, der zu einem ähnlich ist der mit einer bekannten genetischen Modifikation assoziiert ist, würde nahelegen, dass die Verbindung eine Wirkung auf denselben Weg hat, den die genetische Veränderung beeinflusst.
Zusätzlich zum Screening von Verbindungen in den transgenen Fliegen der vorliegenden Erfindung können solche Verbindungen auch weiter durch die Verwendung von in vitro oder anderen in vivo Modellen der AD mittels herkömmlicher Verfahren getestet werden. Beispielsweise können mehrere Zelllinien als in vivo Modelle der AD verwendet werden und sind dem Fachmann bekannt, einschließlich beispielsweise die Zelllinen, die in Xia et al., 1997 PNAS USA 94 (15): 8208-8213 beschrieben sind. Es existieren auch in vivo Modelle und umfassen beispielsweise das Mausmodell der AD, das in WO 94/00569 A beschrieben ist.
Die Ermittlung des Wirkmechanismus von Verbindungen, die die Wirkung von beta-Amyloid oder C99 in den hierin beschriebenen transgenen Fliegen beeinflussen, können auch mittels RNA Profilerstellung auf Chips (Affymetrix, Santa Clara) oder mittels anderer herkömmlicher Verfahren ausgeführt werden. Beispielsweise können RNA Profile von Fliegen, denen die Kandidatenverbindungen verabreicht wurden, getestet werden und mit den Fliegen verglichen werden, die genetisch modifiziert wurden. Ähnliche Profile legen nahe, dass die Verbindung auf eine Art auf den beta-Amyloid oder C99 beeinflussten Weg wirkt.
Es wird hierin mitberücksichtigt, dass die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Identifizierung von Genen betrifft, die beim Einsetzen oder der Progression von Alzheimerscher Erkrankung beteiligt sind und deren Proteinprodukte als potentielle Marker für AD dienen können, wobei das Verfahren die Identifizierung von Genen umfasst, die in den Wegen beteiligt sind, welche durch die Transkriptionsfaktoren reguliert werden, die durch die humanen Sequenzen hCP50765 (SEQ ID Nr. 35, kodiert durch das EGR2 Gen) und hCP41313 (SEQ ID Nr. 15, SEQ Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53, kodiert durch das Humanhomolog des Drosophila nocA Gens), wobei die Humansequenzen Homologe für genetische Modifizierer von Drosophila sind, wie dies hierin beschrieben identifiziert wurden und nahe an dem Bereich des humanen Chromosoms 10 liegen, von dem eine genetische Verbindung zur Alzheimerschen Erkrankung gezeigt wurde. Die Identifizierung solcher Gene, die durch die oben erwähnten Transkriptionsfaktoren reguliert werden, können mittels herkömmlicher Verfahren erreicht werden, einschließlich unter anderem einer SELEX genannten Technologie, wie dies in Tuerk und Gold, 1990, Science 249, 505-510 und Brown und Gold, 1995, Biochemistry 34, 14765-14774 beschrieben ist. Beispielsweise können Gene, die durch einen spezifischen Transkriptionsfaktor reguliert werden, durch die Bestimmung der DNA Zielsequenz des spezifischen Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Eine solche Zielsequenzidentifizierung kann durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden, einschließlich unter anderem SELEX. Wenn die Zielsequenz identifiziert ist, kann das Vorkommen der Sequenz in den stromaufwärts regulatorischen Regionen von bekannten und abgeleiteten Genen mittels Bioinformatikwerkzeugen bestimmt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Gene, die die Zielsequenz in ihren stromaufwärts liegenden regulatorischen Regionen enthalten, müssten durch den spezifischen Transkriptionsfaktor reguliert werden können.
Es wird mitberücksichtigt, dass Verbindungen, die die Funktion oder Expression von Proteinen beeinflussen (beispielsweise hemmen oder fördern) können, die durch die humanen Homologe der gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierten genetischen Modifizierer kodiert werden, zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung oder anderer Zustände brauchbar sein können, die mit Defekten der Regulation des APP Wegs assoziiert sind. Zusätzlich wird ebenfalls mitberücksichtigt, dass unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren Antisenseoligonukleotide, Ribozyme, Trippelhelix DNA und/oder doppelsträngige RNA mit therapeutischem Wert basierend auf den Nukleotidsequenzen dieser humanen Homologe von genetischen Modifizierern erzeugt werden können. Die therapeutische Verwendung von Antibiotika, die gegen die Polypeptide gerichtet sind, welche von den humanen Homologen der genetischen Modifizierer kodiert werden und mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, ist hierin ebenfalls mitberücksichtigt. Daher betrifft ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung und verwandter Zustände. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Verbindungen, Antisenseoligonukleotide, Ribozyme, Trippelhelix DNA, doppelsträngige RNA und/oder Antikörper umfassen, wie dies oben diskutiert ist. Die Zusammensetzungen können auch Expressionsprodukte humaner Homologe der genetischen Modifizierer (beispielsweise Polypeptide oder Fragmente hiervon) enthalten, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit zumindest einem anderen Mittel, wie einer Stabilisatorverbindung verabreicht werden, die in jedem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger verabreicht werden kann, einschließlich unter anderem Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser. Die Zusammensetzungen können einem Patienten alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen verabreicht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch mehrere Wege verabreicht werden, einschließlich unter anderem oral, intravenös, intramuskulär, intraartikulär, intraarteriell, intramedullär, inthrathekal, intraventrikulär, transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, topisch, sublingual oder rektal.
Zusätzlich zu den Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, die Hilfsstoffe und Zusatzstoffe enthalten, welche die Prozessierung der Wirkstoffe in Präparationen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Weitere Details bezüglich Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in der letzten Ausgabe von Remingtons Pharmaceutical Sciences (Maak Publishing Co., Esston, PA) gefunden werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können mittels pharmazeutisch annehmbarer Träger, die in der Technik gut bekannt sind, in Dosierungen formuliert werden, die zur oralen Verabreichung geeignet sind. Solche Träger ermöglichen den pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gelen, Sirupen, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur Aufnahme durch den Patienten formuliert zu werden.
Pharmazeutische Präparationen zur oralen Verwendung können durch die Kombination von Wirkstoffen mit festem Hilfsstoff, optionaler Vermahlung eines entstehenden Gemisches und Prozessierung des Gemisches aus Granula erforderlichenfalls nach der Zugabe von geeigneten Zusatzstoffen unter Bildung von Tabletten oder Drageekernen erhalten werden. Geeignete Hilfsstoffe sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Stärke von Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen, Cellulose, wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose, Gummis, einschließlich Arabicum und Traganth und Proteine, wie Gelatine und Kollagen. Falls gewünscht, können Zerfallshilfsmittel oder Löslichkeitsvermittler zugegeben werden, wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz hiervon, wie Natriumalginat.
Drageekerne können zusammen mit geeigneten Beschichtungen verwendet werden, wie konzentrierte Zuckerlösungen, die auch Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösemittel oder Lösemittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageeummantelungen zur Identifizierung zugegeben werden oder um die Menge an Wirkstoff zu charakterisieren, d.h. die Dosierung.
Pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, umfassen verschließbare Kapseln aus Gelatine, wie auch weiche, verschweißte Kapseln, die aus Gelatine und einer Beschichtung, wie Glycerin oder Sorbit hergestellt sind. Die verschließbaren Kapseln können die Wirkstoffe im Gemisch mit Füllstoffen enthalten, wie Lactose, Bindemittel, wie Stärkearten und/oder Gleitmittel, wie Talkum oder Magnesiumstearat und optional Stabilisatoren. Bei Weichkapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert werden, wie fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglycol mit oder ohne Stabilisatoren.
Pharmazeutische Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, können in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie Hank Lösung, Ringer Lösung oder physiologisch gepufferter Kochsalzlösung. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Carboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Träger umfassen fette Öle, wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Nicht-lipidartige polykationische Aminopolymere können ebenfalls für eine Abgabe verwendet werden. Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
Zur topischen oder nasalen Verabreichung werden Penetrationsmittel, die für die zu penetrierende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrationsmittel sind im allgemeinen in der Technik bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine Weise hergestellt werden, die in der Technik bekannt ist, beispielsweise durch herkömmliche Misch-, Löse-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Homogenisierungs-, Emulgierungs-, Verkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Salz bereitgestellt werden und kann mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich unter anderem Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure etc.. Salze tendieren dazu, in wässrigen oder anderen erotischen Lösemitteln besser löslich zu sein als die entsprechenden Formen der freien Base. In anderen Fällen kann die bevorzugte Präparation ein lyophilisiertes Pulver sein, das eines oder alle der folgenden Bestandteile enthält: 1 bis 50 mM Histidin, 0,1 % bis 2 % Saccharose und 2 bis 7 % Mannit in einem pH Bereich von 4,5 bis 5,5, das mit einem Puffer vor der Verwendung kombiniert wird.
Nachdem die pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt wurden, können sie in einen geeigneten Behälter gegeben werden und zur Behandlung für einen indizierten Zustand beschriftet werden. Zur Verabreichung der Verbindungen oder Genprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, umfasst eine solche Beschriftung die Menge, Häufigkeit und Art der Verabreichung.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, worin die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Bestimmung einer wirksamen Dosis liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns.
Es kann für jede Verbindung die therapeutisch wirksame Dosis zu Beginn entweder in Zellkulturtests, beispielsweise mit neoplastischen Zellen oder in Tiermodellen, gewöhnlich Mäuse, Kaninchen, Hunde oder Schweine abgeschätzt werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und den Verabreichungsweg zu bestimmen. Eine solche Information kann dann verwendet werden, um die brauchbaren Dosen und Wege zur Verabreichung beim Menschen zu bestimmen.
Eine "therapeutisch wirksame Dosis" bezieht sich auf die Menge eines Wirkstoffs, beispielsweise einer Verbindung oder eines Genprodukts, das die Symptome oder den Zustand lindert. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, beispielsweise ED50 (die Dosis, die therapeutisch bei 50 % der Population wirksam ist) und die LD50 (die Dosis, die für 50 % der Population letal ist). Das Dosisverhältnis zwischen den toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und kann hierin als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus den Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten werden bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs für die humane Verwendung verwendet. Die in einer solchen Zusammensetzung enthaltene Dosierung liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50 mit einer geringen oder keinen Toxizität umfassen. Die Dosis variiert in diesem Bereich in Abhängigkeit der verwendeten Dosis, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs.
Die exakte Dosis wird durch den Anwender in Anbetracht von Faktoren in Bezug auf den Patienten bestimmt, der die Behandlung benötigt. Dosierung und Verabreichung werden eingestellt, um ausreichende Mengen des Wirkstoffs bereitzustellen oder den gewünschten Effekt aufrechtzuerhalten. Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, umfassen die Schwere des Krankheitszustands, den allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, das Alter, das Gewicht und das Geschlecht des Patienten, die Nahrung, die Dauer und Häufigkeit der Verabreichung, die Arzneimittelkombination, die Reaktionssensitivitäten und die Toleranz/Reaktion auf die Therapie. Lang wirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle 2 Wochen in Abhängigkeit von Halbwertszeit und Clearancerate der bestimmten Formulierung verabreicht werden.
Normale Dosismengen können von 0,1 bis 100 000 Mikrogramm bis zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g in Abhängigkeit des Verabreichungswegs variieren. Es werden Anleitungen für bestimmte Dosierungen und Verabreichungsverfahren in der Literatur bereitgestellt und sind im allgemeinen für den Fachmann erhältlich. Der Fachmann verwendet unterschiedliche Formulierungen für Nukleotide als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Ähnlich ist die Abgabe von Polynukleotiden oder Polypeptiden für bestimmte Zellen, Bedingungen, Orte etc spezifisch. Pharmazeutische Formulierungen, die zur oralen Verabreichung von Proteinen geeignet sind, sind beispielsweise beschrieben in US 5 008 114 A , US 5 505 962 A , US 5 641 515 A , US 5 681 811 A , US 5 700 486 A , US 5 766 633 A , US 5 792 451 A , US 5 853 748 A , US 5 972 387 A , US 5 976 569 A und US 6 051 561 A .
Es wird hierin auch berücksichtigt, dass ein Verfahren zur Diagnose von pathologischen Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP Weg in einem Individuum assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung, durch die in Tabelle 1 angegebenen Daten möglich ist. Beispielsweise kann das Verfahren die Messung der Menge an Polypeptiden, die durch ein oder mehrere der humanen genetischen Homologe der Gene von Tabelle 1 kodiert sind, in einer biologischen Probe aus einem Patienten umfassen, worin ein abnormales Niveau eines oder mehrerer dieser Polypeptide relativ zu der Menge hiervon in einem normalen Patienten für diese Zustände diagnostisch ist. Ein solcher Test könnte mittels herkömmlicher Technologien ausgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
In einer weiteren Ausführungsform werden Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die für ein humanes Homolog eines genetischen Modifizierer oder ein funktionelles Derivat hiervon kodiert, verabreicht, um die Funktion des APP Wegs durch Gentherapie zu fördern. Gentherapie bezieht sich auf eine Therapie, die durch die Verabreichung einer Nukleinsäure an einen Patienten ausgeführt wird. In dieser Ausführungsform der Erfindung bildet die Nukleinsäure das durch sie kodierte Protein, das einen therapeutischen Effekt durch die Förderung der normalen Funktion des APP Wegs vermittelt.
Jedes der Verfahren zur Gentherapie, das in der Technik verfügbar ist, kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielhafte Verfahren sind später beschrieben.
In einem bevorzugten Aspekt umfasst die Therapie die Nukleinsäure für einen genetischen Modifizierer, der Teil eines Expressionsvektors ist, der ein genetisches Modifiziererprotein oder ein Fragment oder chimäres Protein hiervon in einem geeigneten Wirt exprimiert. Insbesondere hat eine solche Nukleinsäure einen Promotor, der funktionsfähig an die spezifische genetische kodierende Region für das Modifiziererprotein gebunden ist, wobei der Promotor induzierbar oder konstitutiv und optional gewebespezifisch ist. In einer anderen bestimmten Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül verwendet, worin die für das Modifiziererprotein kodierenden Sequenzen und alle anderen gewünschten Sequenzen durch Regionen flankiert sind, die eine homologe Rekombination an einer gewünschten Stelle im Genom fördern, was eine intrachromosomale Expression der Modifizierernukleinsäure liefert (Koller und Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935, Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
Die Abgabe der Nukleinsäure in einem Patienten kann entweder direkt erfolgen, wobei der Patient direkt der Nukleinsäure oder den Nukleinsäure-tragenden Vektor ausgesetzt wird oder indirekt, wobei die Zellen zuerst mit der Nukleinsäure in vitro transformiert und dann in den Patienten transplantiert werden. Diese zwei Ansätze sind jeweils als in vivo oder ex vivo Gentherapie bekannt.
In einer spezifischen Ausführungsform wird die Nukleinsäure direkt in vivo verabreicht, wobei sie unter Bildung des kodierten Produkts exprimiert wird. Dies kann durch eines von mehreren in der Technik bekannten Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch die Konstruktion als Teil eines geeigneten Nukleinsäureexpressionsvektors und einer Verabreichung, so dass sie intrazellulär wird, beispielsweise durch Infektion mittels eines defekten oder attenuierten Retrovirus oder anderen Virusvektors (siehe beispielsweise US 4 980 286 A und anderer später erwähnter Verfahren) oder durch die direkte Injektion von nackter DNA oder durch die Verwendung von Mikropartikelbeschuss (beispielsweise einem Gengewehr, Biolistic, DuPont) oder Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder transfizierender Mittel, Verkapselung in Liposomen, Mikropartikeln oder Mikrokapseln oder durch Verabreichung in einer Bindung an ein Peptid, von dem bekannt ist, dass es in den Kern eindringt, durch Verabreichung in Verbindung an einen Liganden, der eine Rezeptor-vermittelte Endozytose durchmacht (siehe beispielsweise US 5 166 320 A , US 5 728 399 A , US 5 874 297 A und US 6 030 954 A ) (die auf Zelltypen abzielen, die spezifisch diese Rezeptoren exprimieren) etc. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Nukleinsäure-Ligandenkomplex gebildet werden, worin der Ligand ein fusogenes Viruspeptid zur Zerstörung von Endosomen umfasst, was der Nukleinsäure erlaubt, den lysosomalen Abbau zu vermeiden. In einer weiteren Ausführungsform kann die Nukleinsäure in vivo für eine zellspezifische Aufnahme und Expression vorgesehen werden, indem auf einen spezifischen Rezeptor abgezielt wird (siehe beispielsweise WO 92 06 180 A , WO 92 22 635 A , WO 92 20 316 A , WO 93 14 188 A und WO 93 20 221 A ). Alternativ dazu kann die Nukleinsäure intrazellulär eingeführt werden und in die DNA der Wirtszelle zur Expression durch homologe Rekombination eingebaut werden (siehe US 5 413 923 A , US 5 416 260 A und US 5 574 205 A und Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Virusvektor, der eine Modifizierernukleinsäure enthält, verwendet. Beispielsweise kann ein Retrovirusvektor verwendet werden (siehe beispielsweise US 5 219 740 A , US 5 604 090 A und US 5 834 182 A ). Diese Retrovirusvektoren wurden modifiziert, um retrovirale Sequenzen zu deletieren, die nicht für die Verpackung des viralen Genoms und die Integration in die DNA der Wirtszelle erforderlich sind. Diese in der Gentherapie zu verwendende Modifizierernukleinsäure wird in den Vektor kloniert, der die Abgabe des gen an den Patienten erleichtert.
Adenoviren sind andere Virusvektoren, die in der Gentherapie verwendet werden können. Adenoviren sind speziell attraktive Vehikel für die Abgabe von Genen an Respirationsepithel. Adenoviren infizieren natürlicherweise Respirationsepithelien, wo sie eine milde Erkrankung hervorrufen. Andere Ziele für Adenovirus-basierte Abgabesysteme sind die Leber, das zentrale Nervensystem, Endothelzellen und Muskel. Adenoviren haben den Vorteil, dass sie zur Infektion von nicht-teilenden Zellen fähig sind. Verfahren zur Ausführungsform einer auf Adenovirus basierten Gentherapie sind beschrieben in US 5 824 544 A , US 5 868 040 A , US 5 871 722 A , US 5 880 102 A , US 5 882 877 A , US 5 885 808 A , US 5 932 210 A , US 5 981 225 A , US 5 994 106 A , US 5 994 132 A , US 5 994 134 A , US 6 001 557 A und US 6 033 843 A .
Adeno-assoziiertes Virus (AAV) wurde auch zur Verwendung in der Gentherapie vorgeschlagen. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von AAV sind beispielsweise beschrieben in US 5 173 414 A , US 5 252 479 A , US 5 552 311 A , US 5 658 785 A , US 5 763 416 A , US 5 773 289 A , US 5 843 742 A , US 5 869 040 A , US 5 942 496 A und US 5 948 675 A .
Ein weiterer Ansatz für eine Gentherapie umfasst die Überführung eines Gens in Zellen in Gewebekultur durch solche Verfahren, wie Elektroporation, Lipofektion, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion oder virale Infektion. Gewöhnlich umfasst das Transferverfahren den Transfer eines Selektionsmarkers in die Zellen. Die Zellen werden dann unter Selektion gestellt, um jene Zellen zu selektieren, die das transferierte Gen aufgenommen haben und exprimieren. Diese Zellen können dann einem Patienten verabreicht werden.
In dieser Ausführungsform wird die Nukleinsäure in eine Zelle vor der Verabreichung in vivo der enstehenden rekombinanten Zelle eingeführt. Eine solche Einführung kann durch jedes in der Technik bekannte Verfahren ausgeführt werden, einschließlich unter anderem Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem Virus- oder Bakteriophagenvektor, der die Nukleinsäuresequenzen enthält, Zellfusion, Chromosom-vermittelter Gentransfer, Mikrozell-vermittelter Gentransfer, Sphäroblastenfusion etc. Es sind mehrere Verfahren in der Technik zur Einführung von fremden Genen in Zellen bekannt und können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die erforderlichen Entwicklungsfunktionen und physiologischen Funktionen der Empfängerzellen nicht zerstört werden. Die Technik sollte einen stabilen Transfer der Nukleinsäure in die Zelle bereitstellen, so dass die Nukleinsäure durch die Zelle exprimierbar und vorzugsweise vererbbar und durch die Nachkommen der Zelle exprimierbar ist.
Die entstehenden rekombinanten Zellen können an einen Patienten durch verschiedene in der Technik bekannte Verfahren abgegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Epithelzellen injiziert, beispielsweise subkutan. In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante Hautzellen als Hauttransplantat auf den Patienten angewendet werden. Rekombinante Blutzellen (beispielsweise hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen) werden vorzugsweise intravenös verabreicht. Die Menge an Zellen, die zur Verwendung vorgesehen ist, hängt von dem gewünschten Effekt, dem Zustand des Patienten etc. ab und kann durch den Fachmann bestimmt werden.
Zellen, in die eine Nukleinsäure zum Zweck der Gentherapie eingeführt wird, umfassen jeden gewünschten, verfügbaren Zelttyp und umfassen unter anderem Epithelzellen, Endothelzellen, Keratino zyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatozyten, Blutzellen, wie T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryozyten, Granulozyten, verschiedene Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere hämatopoetische Stammzellen oder Vorläuferzellen, wie sie beispielsweise aus Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut, fetaler Leber etc. erhalten werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die für die Gentherapie verwendete Zelle zum Patienten autolog.
In einer Ausführungsform, worin die rekombinanten Zellen in der Gentherapie verwendet werden, wird eine Modifizierernukleinsäure so in die Zellen eingeführt, dass sie durch die Zellen oder ihre Nachkommen exprimierbar ist und die rekombinanten Zellen werden dann in vivo für einen therapeutischen Effekt verabreicht. In einer spezifischen Ausführungsform werden Stamm- oder Vorläuferzellen verwendet. Alle Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die isoliert und in vitro aufrechterhalten werden können, können potentiell gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Stammzellen umfassen unter anderem hämatopoetische Stammzellen (HSC), Stammzellen von Epithelgeweben, wie der Haut und der Auskleidung des Darms, nicht-humane embryonale Herzmuskelzellen, Leberstammzellen (siehe beispielsweise WO 94 08 598 A ), und neurale Stammzellen (Stemple und Anderson, 1992, Cell 71: 973-985).
Epithelstammzellen (ESCs) oder Keratinozyten können von Geweben erhalten werden, wie der Haut und der Auskleidung des Darms durch bekannte Verfahren (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21 A: 229). In gleichmäßigem Epithelzellgewebe, wie der Haut, tritt die Mitose von Stammzellen innerhalb der Keimschicht auf, der Schicht, die am nähesten an der basalen Lamina ist. Stammzellen innerhalb der Auskleidung des Darms liefern eine schnelle Erneuerungsrate des Gewebes. ESCs oder Keratinozyten, die von der Haut oder Auskleidung des Darms eines Patienten oder eines Donors erhalten werden, können in Gewebekultur angezogen werden (Pittelkow und Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771). Falls die ESCs durch einen Donor bereitgestellt werden, kann auch ein Verfahren zur Unterdrückung der Hostversus-Graft Reaktivität verwendet werden (beispielsweise Bestrahlung, Arzneimittel- oder Antikörperverabreichung zur Förderung einer moderaten Immunsuppression).
In Bezug auf die hämatopoetischen Stammzellen (HSC) kann jede Technik, die die Isolierung, Vermehrung und den in vitro Erhalt von HSC bereitstellt, in dieser Ausführungsform der Erfindung verwendet werden. Techniken, durch die dies erreicht werden kann, umfassen (a) die Isolierung und Etablierung von HSC Kulturen aus Knochenmarkszellen, die aus dem zukünftigen Wirt oder einem Donor isoliert wurden oder (b) Verwendung von vorher etablierten Langzeit-HSC Kulturen, die allogen oder xenogen sind. Nicht-autologe HSC werden vorzugsweise zusammen mit einem Verfahren zur Unterdrückung der Transplantationsimmunreaktionen des zukünftigen Wirt/Patienten verwendet. Humane Knochenmarkszellen können aus dem posterioren illiakalen Scheitel durch eine Nadelaspiration erhalten werden (siehe beispielsweise Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73: 1377-1384). Die HSC können stark angereichert oder in im wesentlichen reiner Form verwendet werden. Diese Anreicherung kann vorher, während oder nach der Langzeitkultur erreicht werden und kann durch alle in der Technik bekannten Verfahren ausgeführt werden. Langzeitkulturen von Knochenmarkszellen können beispielsweise mittels modifizierten Dexter-Zellkulturtechniken etabliert und erhalten werden (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91: 335) oder Witlock-Witte Kulturtechniken (Witlock und Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612).
In einer spezifischen Ausführungsform umfasst daher die für die Zwecke der Gentherapie einzuführende Nukleinsäure einen induzierbaren Promotor, der operativ an die kodierende Region gebunden ist, so dass die Expression der Nukleinsäure durch die Kontrolle der Anwesenheit oder Abwesenheit des geeigneten Transkriptionsinduktors kontrollierbar ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Beschreibung betrifft die therapeutische Verwendung eines gereinigten Antikörpers oder eines Fragments hiervon zur Behandlung von Zuständen, die mit Abnormalitäten im APP Weg assoziiert sind, einschließlich unter anderem AD. Es wird berücksichtigt, dass der gereinigte Antikörper oder ein Fragment hiervon, spezifisch an ein Polypeptid bindet, das die Aminosäuresequenz eines der humanen Homologe der in Tabelle 1 angegebenen genetischen Modifizierer umfasst, vorzugsweise die Polypeptide von humanen Homologen, die auf dem Chromosom 10 lokalisiert sind, wie dies hierin beschrieben ist, vor allem das durch die SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53 kodierte Polypeptid, das heißt die wiederhergestellten nocA Sequenzen oder ein Fragment dieser Polypeptide. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Fragment eines solchen Antikörpers, worin das Fragment ein Fab oder F(ab')₂ Fragment ist. Insbesondere kann der Antikörper ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein.
Hierin beschrieben sind Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die zur spezifischen Erkennung von einem oder mehreren unterschiedlich exprimierten Genepitopen fähig sind. Solche Antikörper können unter anderem umfassen polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einkettenantikörper, Fab Fragmente, F(ab')₂ Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab Expressionsgenbank gebildet werden, antiidiotypische Antikörper (anti-Id) und Epitop-bindende Fragmente jedes der obigen. Solche Antikörper können beispielsweise bei der Detektion eines Fingerabdrucks, Ziels, Gens in einer biologischen Probe oder alternativ dazu als Verfahren zur Hemmung der abnormalen Zielgenaktivität verwendet werden. Daher können solche Antikörper als Teil der Behandlungsverfahren der Alzheimerschen Erkrankung verwendet werden und/oder können als Teil von diagnostischen Techniken verwendet werden, wobei die Patienten auf abnormale Mengen eines Modifiziererpolypeptids oder auf das Vorkommen von abnormalen Formen eines Modifiziererpolypeptids getestet werden.
Zur Herstellung von Antikörpern gegen ein spezifisches Modifiziererpolypeptid können verschiedene Wirtstiere durch die Injektion mit dem Polypeptid oder einen Teil hiervon immunisiert werden. Solche Wirtstiere können unter anderen Kaninchen, Mäuse und Ratten umfassen, um einige zu nennen. Es können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Reaktion in Abhängigkeit der Wirtsspezies zu erhöhen, einschließlich unter anderem Freund (komplettes und inkomplettes), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanin, Dinitrophenol und potentiell brauchbare humane Adjuvantien, wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von Seren von Tieren abgeleitet wurden, die mit einem Antigen immunisiert wurden, wie dem Zielgenprodukt oder einem antigenen funktionellen Derivat hiervon. Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern können Wirtstiere, wie die oben erwähnten, durch die Injektion mit einem Modifiziererpolypeptid oder einem Teil hiervon immunisiert werden, das wie oben mit Adjuvantien supplementiert ist.
Monoklonale Antikörper, die homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können durch jede Technik erhalten werden, die für die Bildung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt. Diese umfassen unter anderem die Hybridomtechnik von Köhler und Milstein (1975, Nature, 256: 495-497 und US 4 376 110 A ), die humane B-Zellhybridomtechnik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72, Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. Seiten 77-96). Solche Antikörper können einer Immunglobulinklasse angehören, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder Unterklasse hiervon. Die Hybridome, die die mAb der Erfindung bilden, können in vitro oder in vivo hergestellt werden. Die Herstellung von hohen Titern von mAbs in vivo macht es zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren.
Zusätzlich können Techniken, die zur Herstellung von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855, Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608, Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454) durch Spleißen der Gene aus dem Mausantikörpermolekül mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, worin unterschiedliche Teile aus unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet sind, wie Gene, die eine variable oder hypervariable Region aufweisen, die von einem Maus mAb und einer konstanter Region des humanen Immunglobulins abgeleitet sind.
Alternativ dazu können Techniken, die zur Herstellung von Einkettenantikörpern beschrieben wurden ( US 4 946 788 A , Bird, 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 und Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) zur Herstellung von Einkettenantikörpern gegen differenziell exprimierte Gene verwendet werden. Einkettenantikörper werden durch die Verbindung der Fragmente der schweren und der leichten Kette der Fv Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was zu einem Einkettenpolypeptid führt.
Am bevorzugtesten können Techniken, die zur Herstellung von "humanisierten Antikörpern" brauchbar sind, zur Herstellung von Antikörpern gegen die hierin beschriebenen Polypeptide, Fragmente, Derivate und funktionalen Äquivalente angepasst werden, die hierin beschrieben sind. Solche Techniken sind in US 5 932 448 A , US 5 693 762 A , US 5 693 761 A , US 5 585 089 A , US 5 530 101 A , US 5 910 771 A , US 5 569 825 A , US 5 625 126 A , US 5 633 425 A , US 5 789 650 A , US 5 545 580 A , US 5 661 016 A und US 5 770 429 A beschrieben.
Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise können solche Fragmente unter anderem umfassen: Die F(ab')₂ Fragmente, die durch einen Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden können und die Fab Fragmente, die durch die Reduktion der Disulfidbrücken von F(ab')₂ Fragmenten hergestellt werden können. Alternativ dazu können Fab Expressionsbanken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281), um eine schnelle und leichte Identifizierung von monoklonalen Fab Fragmenten mit der gewünschten Spezifität zu erlauben.
Ein Antikörper kann vorzugsweise in einem Verfahren zur Diagnose eines Zustands verwendet werden, der mit einer abnormalen Regulation des APP Wegs und/oder Alzheimerscher Erkrankung bei einem Patienten assoziiert ist oder zur Identifizierung eines Individuums mit einer Prädisposition gegenüber diesen Zuständen, das umfasst: Messung der Menge eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz eines der humanen Homologe der genetischen Modifizierer umfasst, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, wobei die Polypeptide der humanen Homologe vorzugsweise auf Chromosom 10 liegen, wie dies hierin identifiziert wurde, vor allem das duch die SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ Nr. 52 kodierte Polypeptid, das heißt die wiederhergestellten nocA Sequenzen oder Fragmente hiervon in einem geeigneten Gewebe oder einer Stammzelle aus einem Individuum, worin die Anwesenheit einer erhöhten Menge dieses Polypeptids oder der Fragmente hiervon relativ zur Menge des Polypeptids oder der Fragmente hiervon in dem jeweiligen Gewebe aus einem Kontrollindividuum für diesen Zustand diagnostisch ist. Ein solches Verfahren bildet eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise umfasst der Detektionsschritt das Zusammenbringen von geeigneten Geweben oder Zellen mit einem Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid bindet, das die Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der oben diskutierten Polypeptide oder eines Fragments hiervon umfasst, und die Detektion der spezifischen Bindung dieses Antikörpers mit einem Polypeptid im geeigneten Gewebe oder der Zelle, worin die Detektion der spezifischen Bindung an ein Polypeptid das Vorkommen von einem oder mehreren Polypeptiden oder ein Fragment hiervon anzeigt.
Besonders bevorzugt zur leichten Detektion ist der Sandwichtest, von dem mehrere Variationen existieren, die alle von der vorliegenden Erfindung umfasst werden sollen.
Beispielsweise wird in einem typischen Test der unmarkierte Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert und die zu testende Probe wird mit dem gebundenen Molekül in Kontakt gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode ist die Zeit erreicht, die zur Bildung eines binären Antikörper-Antigenkomplexes ausreicht. Zu diesem Zeitpunkt wird ein zweiter Antikörper, der mit einem Reportermolekül markiert ist, das zur Induktion eines detektierbaren Signals fähig ist, zugegeben und für eine Zeit inkubiert, die zur Bildung eines ternären Komplexes aus Antikörper-Antigen-markiertem Antikörper ausreicht. Das gesamte nicht reagierte Material wird weggewaschen und das Vorkommen des Antigens wird durch die Beobachtung eines Signals bestimmt oder kann durch Vergleich mit einer Kontrollprobe quantifiziert werden, die bekannte Mengen des Antigens enthält. Variationen des Tests umfassen den simultanen Test, worin sowohl die Probe als auch der Antikörper gleichzeitig zum gebundenen Antikörper gegeben werden oder ein reverser Test, worin der markierte Antikörper und die zu testende Probe zuerst kombiniert, inkubiert und zum unmarkierten Antikörper gegeben werden, der an der Oberfläche gebunden ist. Diese Techniken sind dem Fachmann gut bekannt und die Möglichkeit von geringen Variationen ist leicht ersichtlich. Wie hierin verwendet soll "Sandwichtest" alle Variationen auf der grundlegenden Zweistellentechnik umfassen. Für die Immuntests der vorliegenden Erfindung ist der einzig limitierende Faktor, dass der markierte Antikörper ein Antikörper ist, der für das Modifiziererpeptid oder ein Fragment hiervon spezifisch ist.
Die am herkömmlichsten verwendeten Reportermoleküle in diesem Testtyp sind entweder Enzyme, Fluorophor- oder Radionuklid-enthaltende Moleküle. Im Fall eines Enzymimmuntests wird ein Enzym an den zweiten Antikörper gewöhnlich durch Glutaraldehyd oder Periodat konjugiert. Es wird leicht erkannt, dass jedoch eine große Vielzahl an unterschiedlichen Ligationstechniken existiert, die dem Fachmann gut bekannt sind. Herkömmlich verwendete Enzyme umfassen unter anderem Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, beta-Galaktosidase und alkalische Phosphatase. Die mit den spezifischen Enzymen zu verwendeten Substrate werden gewöhnlich nach der Bildung einer detektierbaren Farbänderung nach Hydrolyse durch das entsprechende Enzym ausgewählt. Beispielsweise ist p-Nitrophenylphosphat zur Verwendung mit alkalischen Phosphatasekonjugaten geeignet, wobei für Peroxidasekonjugate 1,2-Phenylendiamin oder Toluidin herkömmlich verwendet werden. Es ist auch möglich, fluorogene Substrate zu verwenden, die ein Fluoreszenzprodukt statt der oben angegebenen chromogenen Substrate ergeben. Eine Lösung, die das geeignete Substrat enthält, wird dann zum ternären Komplex gegeben. Das Substrat reagiert mit dem an den zweiten Antikörper gebundenen Enzym, was ein qualitatives Signal ergibt, das weiter gewöhnlich spektrophotometrisch quantifiziert werden kann, um eine Evaluierung der Menge an Modifiziererprotein zu ergeben, die in der Serumprobe vorhanden ist.
Alternativ dazu können fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein oder Rhodamin chemisch an Antikörper gebunden werden, ohne ihre Bindungskapazität zu verändern. Wenn sie durch Beleuchtung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge aktiviert werden absorbiert der mit einem Fluorochrom markierte Antikörper die Lichtenergie, was einen angeregten Zustand im Molekül erzeugt, wonach eine Emission des Lichts mit einer charakterischen längeren Wellenlänge erfolgt. Die Emission erscheint als charakteristische Farbe, die mit einem Lichtmikroskop visuell detektierbar ist. Immunfluoreszenz und EIA Techniken sind beide in der Technik sehr gut etabliert und sind für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Jedoch können andere Reportermoleküle, wie Radioisotope, chemolumineszente oder biolumineszente Moleküle ebenfalls verwendet werden. Dem Fachmann ist bekannt, wie er das Verfahren variieren muss, um es an die erforderliche Anwendung anzupassen.
Polynukleotide, die für humane Homologe von genetischen Modifizierern kodieren, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden können, können in einem Verfahren zur Diagnose von Bedingungen verwendet werden, die mit Defekten in der Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung oder zur Identifizierung von Individuen mit einer genetischen Prädisposition gegenüber solchen Bedingungen. Beispielsweise umfasst das Verfahren die Detektion der Transkriptionsmenge an mRNA, die von dem Gen transkribiert wird, welches ein humanes Homolog eines hierin beschriebenen genetischen Modifizierers kodiert, in einem geeigneten Gewebe oder einer Zelle von einem Menschen, worin die abnormale Transkription im Vergleich zu Kontrollmengen für diesen Zustand oder eine Prädisposition für diesen Zustand diagnostisch ist. Insbesondere umfasst der genetische Modifizierer die Nukleotidsequenz eines der humanen Homologe der in Tabelle 1 angegebenen genetischen Modifizierer, wobei die Polypeptide der humanen Homologe vorzugsweise auf dem Chromosom 10 lokalisiert sind, wie dies hierin beschrieben ist, vor allem die durch SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53, das heißt die wiederhergestellten nocA Sequenzen oder das durch die SEQ ID Nr. 35 kodierte Polypeptid, das heißt die EGR2 Sequenz oder die durch die SEQ ID Nr. 41 oder SEQ ID Nr. 43 kodierten Polypeptide, die Ankyrin-verwandten Sequenzen.
Die Detektion einer mutierten Form eines Gens, das für einen genetischen Modifizierer kodiert, der gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, der mit einer Dysfunktion assoziiert ist, stellt ein diagnostisches Werkzeug bereit, das zu einer Diagnose einer Erkrankung oder Empfindlichkeit gegenüber einer Erkrankung beitragen kann oder diese definieren kann, welche aus einer Unterexpression, Überexpression oder veränderten räumlichen oder zeitlichen Expression des Gens resultiert. Diese Erkrankungen können unter anderem Alzheimersche Erkrankung oder andere Zustände umfassen, die durch Fehler in der Regulation des APP Wegs charakterisiert sind. Individuen, die Mutationen in diesen Genen tragen, können auf DNA Ebene durch eine Vielzahl an Techniken detektiert werden.
Nukleinsäuren, insbesondere mRNA, können zur Diagnose aus den Zellen eines Individuums erhalten werden, wie aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie oder Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt zur Detektion verwendet werden oder kann enzymatisch mittels PCR oder anderen Amplifikationstechniken vor der Analyse amplifiziert werden. RNA oder cDNA kann auch auf ähnliche Weise verwendet werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp amplifiziert werden. Die Hybridisierung der amplifizierten DNA mit markierten Nukleotidsequenzen, die für das humane Homolog eines genetischen Modifiziererpolypeptids der vorliegenden Erfindung kodieren, können Punktmutationen identifizieren. Perfekt passende Sequenzen können von fehlerhaft paarenden Duplexen durch einen RNase Verdau oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen unterschieden werden. Die DNA Sequenzunterschiede können auch durch Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität der DNA Fragmente in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel oder durch direkte DNA Sequenzierung detektiert werden (beispielsweise Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Sequenzveränderungen an spezifischen Orten können auch durch Nukleaseschutztests ermittelt werden, wie RNase und S1 Schutz oder dem chemischen Spaltungsverfahren (siehe Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401). In einer anderen Ausführungsform kann eine Matrix an Oligonukleotidsonden, die die Nukleotidsequenz umfassen, die für ein genetisches Modifiziererpolypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert oder es können Fragmente mit einer solchen Nukleotidsequenz konstruiert werden, um ein effizientes Screening auszuführen, beispielsweise von genetischen Mutationen. Matrixtechnologieverfahren sind gut bekannt und haben eine allgemeine Anwendbarkeit und können verwendet werden, um eine Vielzahl an Fragen in der Molekulargenetik zu adressieren, einschließlich Genexpression, genetische Kopplung und genetische Variabilität (siehe beispielsweise: M. Chee et al., Science, Band 274, Seiten 610-613 (1996).
Die diagnostischen Matrices bieten ein Verfahren zur Diagnose oder Bestimmung einer Empfindlichkeit gegenüber der Erkrankung bis zur Detektion einer Mutation in einem humanen Homolog eines Modifizierergens durch die beschriebenen Verfahren. Zusätzlich können solche Erkrankungen durch Verfahren diagnostiziert werden, die die Bestimmung einer abnormal verringerten oder erhöhten Menge des Polypeptids oder der mRNA in einer Probe umfassen, die von einem Individuum stammt. Eine verringerte oder erhöhte Expression kann auf RNA Ebene mittels jedes der in der Technik gut bekannten Verfahren zur Quantifizierung von Polynukleotiden gemessen werden, wie beispielsweise Nukleotidamplifizierung, beispielsweise PCR, RT-PCR, RNase Schutz, Northern Blot und andere Hybridisierungsverfahren. Testtechniken, die zur Bestimmung der Mengen eines Proteins verwendet werden können, wie eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, in einer Probe, die von einem Wirt stammt, sind dem Fachmann gut bekannt. Solche Testverfahren umfassen Radioimmuntests, Kompetitionsbindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA Tests.
Solche Hybridisierungsbedingungen können hoch stringent oder weniger stringent sein, wie dies oben beschrieben ist. In Fällen, worin die Nukleinsäuremoleküle Desoxyoligonukleotide ("Oligos") sind, können sich hoch stringente Bedingungen beispielsweise auf das Waschen in 6 × SSC/0,05 % Natriumpyrophosphat bei 37°C (für Oligos mit 14 Basen), 48°C (für Oligos mit 17 Basen), 55°C (für Oligos mit 20 Basen) und 60°C für Oligos mit 23 Basen) beziehen. Geeignete Bereiche für solche Stringenzbedingungen für Nukleinsäuren verschiedener Zusammensetzungen sind in Krause und Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200: 546-556 zusätzlich zum oben zitierten Maniatis et al beschrieben.
Daher betrifft die vorliegende Beschreibung in einem weiteren Aspekt einen diagnostischen Kit, der umfasst:

(a) Ein Polynukleotid eines humanen Homologs eines genetischen Modifizierers, der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, vorzugsweise eines Polypeptids eines humanen Homologs, das auf dem Chromosom 10 lokalisiert ist wie dies hierin beschrieben ist, oder eines Fragments hiervon,
(b) eine Nukleotidsequenz, die zu der von (a) komplementär ist,
(c) ein Polypeptid eines genetischen Modifizierers der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise das Polypeptid eines humanen Homologs der in Tabelle 1 angegebenen genetischen Modifizierer, vorzugsweise das Polypeptid eines humanen Homologs, das auf Chromosom 10 lokalisiert ist, wie dies hierin beschrieben ist, oder ein Fragment hiervon, oder
(d) ein Antikörper gegen ein genetisches Modifiziererpolypeptid der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise gegen das Polypeptid eines humanen Homologs der in Tabelle 1 angegebenen genetischen Modifizierer, vorzugsweise das Polypeptid eines humanen Homologs, das auf Chromosom 10 lokalisiert ist, wie dies hierin beschrieben ist.

Es ist bekannt, dass in einem solchen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine substanzielle Komponente umfassen können. Es wird auch berücksichtigt, dass ein solcher Kit Komponenten umfassen kann, die gegen einen oder mehrere humane Homologe gerichtet sind. Ein solcher Kit ist bei der Diagnose einer Krankheit oder einer Empfindlichkeit gegenüber einer Krankheit, insbesondere einer Erkrankung oder eines Zustands brauchbar, welche mit Fehlern in der Regulation des APP Wegs assoziiert sind, einschließlich unter anderem Alzheimersche Erkrankung.
Die Nukleotidsequenzen der humanen Homologe der genetischen Modifizierer der vorliegenden Erfindung können auch zur genetischen Kopplungsanalyse verwendet werden. Da die vollständige humane Genomsequenz bekannt ist, kann die Nukleotidsequenz von Interesse spezifisch an einem bestimmten Ort auf einem individuellen humanen Chromosom an einem präzisen chromosomalen Ort kartiert werden. Die Kartierung der relevanten Sequenzen auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelierung dieser Sequenzen mit einer Gen-assoziierten Erkrankung. Wenn einmal eine Sequenz an einem präzisen chromosomalen Ort kartiert werden konnte, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit der genetischen Datenkarte korreliert werden. Solche Daten finden sich beispielsweise in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (erhältlich online über die John Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen den Genen und den Erkrankungen, die in derselben chromosomalen Region kartiert wurden, werden dann durch genetische Kopplungsanalyse identifiziert (Co-Vererbung von physisch benachbarten Genen). Jüngere Daten deuten darauf hin, dass eine Region auf dem humanen Chromosom 10 assoziiert ist, die mit der Alzheimerschen Erkrankung verbunden ist (Bertram et al. Ertekin-Taner et al. Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000) und so können die humanen Homologe der genetischen Modifizierer, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, einer chromosomalen Kartierungsanalyse mittels herkömmlicher Techniken unterzogen werden.
Ebenfalls beschrieben wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA Molekül, worin das Nukleinsäuremolekül die wiederhergestellten Sequenzen des humanen nocA Homologs sind, die in SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53 angegeben sind. Ähnlich bevorzugt ist ein iso liertes Nukeinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA Molekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Sequenz von EGR2 kodiert ist, die in SEQ ID Nr. 35 gezeigt ist. Ähnlich bevorzugt ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA Molekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches aus den Aminosäuresequenzen besteht, die durch eine der Sequenzen der Ankyrinwiederholungsproteine kodiert sind, die in SEQ ID Nr. 41 oder SEQ ID Nr. 43 angegeben sind.
Mittels herkömmlicher Techniken können Antisensemoleküle, doppelsträngige RNA, Trippelhelix DNA und Ribozyme, die gegen eine geeignete Nukleotidsequenz eines genetischen Modifizierers gerichtet sind, erzeugt werden. Modifikationen der Genexpression können durch den Entwurf von Antisensemolekülen, DNA oder RNA gegen die Kontrollregionen der Gene erhalten werden, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, das heißt die Promotoren, Enhancer und Introns. Oligonukleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle, beispielsweise zwischen den Positionen –10 und +10 von der Transkriptionsstartstelle abgeleitet sind, sind bevorzugt. Ähnlich kann die Hemmung mittels "Trippelhelix" Basenpaarungsmethodik erreicht werden. Die Trippelhelixpaarung ist brauchbar, da sie die Hemmung der Fähigkeit der Doppelhelix zur ausreichenden Öffnung für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Regulationsmolekülen verursacht. Kürzliche therapeutische Fortschritte mittels Triplex DNA wurden in der Literatur beschrieben (J. E. Gee et al., (1994) In: B. E. Huber und B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Die Antisensemoleküle können auch zur Blockierung der Translation von mRNA durch die Prävention der Transkription vor der Bindung an Ribosomen entworfen werden.
Ribozyme, enzymatische RNA Moleküle, können auch zur Katalyse der spezifischen Spaltung der RNA verwendet werden. Der Mechanismus der Ribozymwirkung umfasst die Sequenz-spezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an die komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung. Beispiele, die verwendet werden können, umfassen entworfene Hammerkopfmotivribozymmoleküle, die spezifisch sind und effizient die endonukleolytische Spaltung von Sequenzen katalysieren, die die Genprodukte von Tabelle 1 kodieren.
Spezifische Ribozymspaltstellen innerhalb des potentiellen RNA Ziels werden anfänglich durch Scannen des Zielmoleküls auf die Ribozymspaltstellen identifiziert, die die folgenden Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC. Einmal identifiziert, können kurze RNA Sequenzen zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die der Region des Zielgens entsprechen, das die Spaltstelle enthält, auf sekundäre Strukturmerkmale evaluiert werden, die das Oligonukleotid funktionsunfähig machen können. Die Eignung der Kandidatenziele kann auch durch Testen der Zugänglichkeit für die Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden mittels Ribonukleaseschutztests evaluiert werden.
Antisensemoleküle und Ribozyme können durch jedes in der Technik bekannte Verfahren zur Synthese der Nukleinsäuremoleküle hergestellt werden. Diese umfassen Techniken zur chemischen Synthese von Oligonukleotiden, wie chemische Festphasenphosphoramiditsynthese. Alternativ dazu können RNA Moleküle durch in vitro und in vivo Transkription von DNA Sequenzen erzeugt werden, die die Gene von Tabelle 1 kodieren. Solche DNA Sequenzen können in eine große Vielzahl an Vektoren mit geeigneten RNA Polymerasepromotoren eingesetzt werden, wie T7 oder SP6. Alternativ dazu können diese cDNA Konstrukte, die Antisense RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingeführt werden.
Es können Vektoren in Zellen oder Gewebe durch viele verfügbare Mittel eingeführt werden und können in vivo, in vitro oder ex vivo verwendet werden. Für eine ex vivo Therapie können die Vektoren in Stammzellen eingeführt werden, die aus dem Patienten entnommen wurden und klonal für eine autologe Transplantation zurück in denselben Patienten vermehrt werden. Die Abgabe durch Transfektion und durch Liposomeninjektionen kann mittels Verfahren erreicht werden, die in der Technik gut bekannt sind.
Eine Gen-spezifische Hemmung der Genexpression kann auch mittels herkömmlicher doppelsträngiger RNA Technologien erreicht werden. Eine Beschreibung einer solchen Technologie kann in WO 99 32 619 A gefunden werden.
Ferner können solche Moleküle als Komponenten diagnostischer Methoden und Kits verwendet werden, mit denen das Vorkommen eines Allels, das Erkrankungen verursacht, die mit Abnormalitäten im APP Weg und/oder der Alzheimerschen Erkrankung assoziiert sind, detektiert werden können.
Andere Ziele, Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung ersichtlich. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die folgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele nur zur Erläuterung angegeben werden, wobei bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angegeben sind.
Beispiele
Die folgenden Verfahren werden ausgeführt, um die Beispiele durchzuführen:
Transgene Fliegen:
Verfahren zur Erzeugung von transgenen Drosophila melanogaster Fliegen sind dem Fachmann gut bekannt. Es kann jedes herkömmliche Verfahren verwendet werden, beispielsweise sind die grundlegenden Labortechniken, die bei der Erzeugung der Fliegen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in der obigen Literaturangabe von Spradling beschrieben. Wie hierin erwähnt können die transgenen Fliegen durch die direkte Fusion von DNA Sequenzen von Interesse mit Expressionskontrollsequenzen erzeugt werden, wie dies im folgenden beschrieben ist. Beispielsweise werden transformierte Stämme mittels der oben diskutierten Konstrukte gemäß herkömmlicher Verfahren erzeugt. Es können mehrere unabhängige Insertionen für die Konstrukte UAS-Abeta 40, UAS-Abeta 42, UAS-C99wt, UAS-C99V7171 (London Mutation) und pGMR-Abeta 42 erhalten werden.
Fliegenstammhaltung
Gal4 Linien, die zur Expression der Transgene in den transgenen Fliegen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem apterous-Gal4 und 7B-Gal4. Beschreibungen der erwähnten Gal4 Linien und Anmerkungen über die spezifischen Expressionsmuster können in Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu) gefunden werden. Neue transgene Stämme, die erzeugt wurden, tragen UAS Abeta 40 und Abeta 42, UAS C99 Wildtyp und UAS C99 London (trägt die London FAD Alzheimer-assoziierte Mutation) und GMR Abeta 42 Transgene.
Der yw; BcEIp/CyOHop Stamm, der die Transposase exprimiert und die Stämme yw; Gla/SM6a und yw; Dr/TM3 Sb Ser werden von R. Padgett, Waksman Institute, Rutgers University erhalten. w¹¹¹⁸ Fliegen und GMR-GAL4 Fliegen werden vom Bloomington Stammhaltungszentrum erhalten. Der pGMR-1 Stamm ist ein frei erhältlicher Stamm und wird vom Labor von G. Rubin an der UC Berkeley erhalten.
DNA Konstrukte und Molekulartechniken
Ein DNA Fragment, das für das Aβ 42 Peptid kodiert und an das humane Präproenkephalinsignalpeptid fusioniert ist, wird durch PCR amplifiziert und in die BgIII Schnittstelle des Drosophila Augen-spezifischen P-Elementtransformationsvektor pGMR (Hay et al., 1994 Development 120: 2121-2129) kloniert und das Insert wird durch automatisierte Fluoreszenzsequenzierung (ACGT Inc.) sequenziert. Vom humanen Präproenkephalinsignalpeptid wurde gezeigt, dass es erfolgreich die Sekretion von Aβ 42 aus transfizierten Säugerzellen steuert. GMR setzt sich aus 5 Tandemkopien eines Reaktionselements zusammen, das vom Rhodopsin-1 Genpromotor abgeleitet ist, einer Bindungsstelle für den Augen-spezifischen Transkriptionsfaktor GLASS (Ellis et al., Development 119 (3): 855-865 (1993). Daher wird die Abeta Expression im Muster des GLASS Transkriptionsaktivators im Auge gesteuert. Das obige DNA Fragment wird anschließend in einen ein P-Element enthaltenden Vektor kloniert, der die Insertion des Transgens in das Drosophila Genom erleichtert. Alle molekularen Manipulationen werden gemäß Standardprotokollen ausgeführt. (Siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989).
Ein DNA Fragment, das für das C99 Peptid kodiert und an das humane Präproenkephalinsignalpeptid fusioniert ist, wird mit PCR amplifiziert und in den pUAST Transformationsvektor kloniert, wie dies in Brand und Perimmon beschrieben ist.
Die Konstrukte UAS-Abeta 40, UAS-Abeta 42, UAS-C99 wt und UAS-C99 V7171 enthalten das Präproenkephalingensignalpeptid, gefolgt von Fragmenten des humanen Abeta (40 oder 42) oder C99 (Wildtyp oder mit der London Mutation). Die humanen Fragmente werden in den pUAST Vektor kloniert, wie dies in Brand und Perrimon oben beschrieben ist. Die Klonierung in diesen Vektor platziert die UAS Sequenz stromaufwärts der transkribierten Region des inserierten Gens und erlaubt ebenfalls die Integration in das Fliegengenom durch die P-Elementrekombination.
Genetische Kreuzungen, Analysen und Visualisierung der Phänotypen
Die Fliegen werden gemäß bekannter Verfahren gekreuzt, außer dass dann alle Kreuzungen bei 29°C für die maximale Expression der Phänotypen gehalten werden. Im binären Gal4 Expressionssystem maximiert diese Temperatur die Aktivität des Gal4 Proteins. Im Fall von pGMR-Abeta 42 wird beobachtet, dass der Phänotyp bei 29°C stärker ist, so dass diese Fliegen bei dieser Temperatur gut gehalten werden.
Westernanalyse
Die ektope Genexpression kann durch Ausführung der Westernanalyse gemäß herkömmlicher Verfahren getestet werden. Antikörper, die verwendet werden können, umfassen den humanen monoklonalen 6E10 Antikörper, der gegen den beta-Amyloidteil des APP Gens erzeugt wurde und der auch den C99 Teil von APP erkennt (Senetek PLC, Napa, CA).
Westernprotokoll
Um die Expression des Aβ 42 Peptids zu detektieren, werden Fliegen der Genotypen K18.1/K18.1, K18.3/K18.3, K18.1/K18.1, K18.3/K18.3, KJ103/TM3Sb Ser, KJ103/KJ103, KJ54/CyO, KJ54/TM2 Ubx und pGMR-1 (Fliegen, die den pGMR Vektor ohne Insert enthalten) bei 29°C aufgezogen. 80 bis 90 Drosophila Köpfe der jeweiligen obigen Stämme werden gesammelt, in ein Eppendorfröhrchen auf Trockeneis gegeben, das 100 μl an 2 % SDS, 30 % Saccharose, 0,718 M Bistris, 0,318 M Bicin mit "kompletten" Proteaseinhibitoren (Boehringer Mannheim) enthält und werden mittels eines mechanischen Homogenisiergeräts vermahlen. Die Proben werden für 5 Minuten bei 95°C erhitzt, für 5 Minuten bei 12 000 Upm zentrifugiert und die Überstände werden in ein frisches Eppendorfröhrchen gegeben. 5 % β-Mercaptoethanol und 0,01 % Bromphenolblau werden zugegeben und die Proben werden vor dem Auftragen gekocht. Etwa 200 ng des Gesamtproteinextrakts werden für jede Probe auf einem 15 % Tricin /Tris SDS PAGE Gel aufgetragen, das 8 M Harnstoff enthält. Die Aβ 1-42 Peptidkontrolle ist humanes β Amyloid [1-42] (Biosource International, Nr. 03-111). Die Proben werden bei 40 V im Sammelgel und bei 120 V im Trenngel gefahren. Die Proben werden auf PVDF Membranen (BIO-RAD, Nr. 162-0174) für 1 Stunde bei 100 V übertragen und die Membranen werden anschließend für 3 Minuten in PBS gekocht. Die Antikörperhybridisierung läuft folgendermaßen: Der primäre Ab 6E10 (Seneteck PLC, Nr. 300-02), der die ersten 19 Aminosäuren des Aβ Peptids erkennt, wird zur Sondierung (mit einer Konzentration von 1:2000) in 5 % fettfreier Milch, 1 × PBS, worin 0,1 % Tween 20 enthalten sind, für 90 Minuten bei RT verwendet. Die Proben werden dreimal für jeweils 5 Minuten, 15 Minuten und 15 Minuten in 1 × PBS – 0,1 % Tween 20 gewaschen. Der sekundäre Ab ist anti-Maus HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Nr. NA 931) und wird bei 1:2000 in 5 % fettfreier Milch, 1 × PBS, worin 0,1 % Tween 20 enthalten sind, für 90 Minuten bei RT verwendet. Die Proben werden dreimal für jeweils 5 Minuten, 15 Minuten und 15 Minuten in 1 × PBS – 0,1 % Tween 20 gewaschen. Es wird ECL (ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Pharmacia Biotech, Nr. RPN 2209) zur Detektion verwendet.
Histologie
Verformbare Schnitte der Fliegenköpfe werden gemäß herkömmlicher Verfahren ausgeführt, beispielsweise gemäß den in Drosophila Protocols, Seite 236, Herausgeber W. Sullivan, M. Ashburner, S. Hawley, CSHL Press 2000 beschriebenen Protokollen.
Kryoschnitte
Ausgewachsene Augen werden gemäß Wolff in Drosophila Protocols, CSHL Press 2000, Abschnitte 13.1 und 13.2 Kryoschnitten unterzogen. Der primäre Antikörper ist der monoklonale 6E10 (Senetek), der das humane Aβ 42 Peptid erkennt und wird bei einer Verdünnung von 1:3000 verwendet. Das Detektionssystem ist der Vectastain ABC Kit (mit biotinylierten anti-Maus IgG als sekundärem Antikörper und Meerrettichperoxidase H) (Vector Laboratories). Die folgenden Modifikationen werden gemäß dem Protokoll von Wolff ausgeführt: Vor der Inkubation mit dem primären 6E10 Antikörper werden Kryoschnitte in Blockierungslösung, die normales Pferdeserum enthält, gemäß dem Vectastain ABC Kit Protokoll blockiert. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (voradsorbiert mit pGMR-1 Augengewebe) wird in PBS/1 % BSA, worin 1 bis 2 % normales Pferdeserum enthalten sind, gemäß dem Vectastain ABC Kit Protokoll ausgeführt. Es wird das Verfahren für den ABC Kit befolgt, wobei die Inkubationen mit dem ABC Reagenz in PBS/0,1 % Saponin ausgeführt werden, wonach 4 × 10 Minuten dauernde Waschschritte in PBS/0,1 % Saponin erfolgen. Die Schnitte werden dann in 0,5 ml pro Schnitt der Meerrettichperoxidase H Substratlösung, 400 μg/ml an 3,3'-Diaminobenziden (DAB), 0,006 % H₂O₂ in PBS/0,1 % Saponin inkubiert und die Reaktion wird nach 3 Minuten mit 0,02 % Natriumazid in PBS gestoppt. Die Schnitte werden mehrmals in PBS gewaschen und über eine Ethanolreihe dehydriert, bevor sie in DPX (Fluka) angebracht werden.
RNA Profilcharakterisierung für Verbindungsscreening
Die RNA Profile können gemäß bekannter Methodik getestet werden, einschließlich der Verwendung der traditionellen Northern Blot Analyse, wie auch der Mikrotestchiptechnologie (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, Affymetrix, Santa Clara, CA).
Beispiel 1
Der Phänotyp des "rauen Auges" wird durch ektope Expression von Aβ 42 induziert
Um die großteils unbekannten Wege und Mechanismen aufzuklären, durch die Aβ 42 eine Neurodegeneration verursacht, wird das Drosophila Auge, ein neuronales Gewebe, als Modell verwendet. In einem Ansatz zur Nachahmung der krankheitsspezifischen Überexpression von Aβ 42 werden transgene Fliegen, deren Genom das GMR-Abeta 42 Amyloidtransgen enthalten, mittels des oben beschriebenen GMR Fusionsexpressionssytems erzeugt, um das Transgen im entwickelnden Drosophila Auge zu exprimieren.
I. Aβ 42 Überexpresion verursacht raue Augen Phänotypen
Um das Aβ 42 Peptid im Drosophila Auge zu exprimieren, wird die Aβ 42 Sequenz in den pGMR Vektor kloniert. Der pGMR (Glass Multimer Reporter) Vektor enthält ein Pentamer der verkürzten Bindungsstellen für den Glass Transkriptionsfaktor. Glass wird verbreitet während der Augenentwicklung exprimiert, wobei es in den Augenscheiben beginnt, den Vorläufern von ausgewachsenen Drosophila Augen, wo es in differenzierenden Photorezeptorneuronen detektiert wird. Es wird weiter spezifisch im Auge während der Puppen- und Erwachsenenentwicklung exprimiert (Moses et al., 1989 Nature 340 (6234): 531-536, Moses und Rubin, 1991, Genes Dev. 5: 583-593). Die GMR-Elementexpression bei etwa 2 Wochen alten Fliegen wird mittels eines Reportergens untersucht und es wird eine gute Expression detektiert, was nahelegt, dass das GMR Element im Erwachsenenstadium gut aktiv ist. Daher wird die durch GMR regulierte Expression während der Entwicklung des Auges im Augengewebe gesteuert, wie auch während der ausgewachsenen Periode, was es zu einem geeigneten System für die Expression von Aβ 42 macht.
Es wurden ursprünglich 2 unabhängige transgene Linien mit dem pGMR-Aβ 42 Konstrukt etabliert, nämlich K18.1 und K18.3. Zusätzlich wird eine weitere transgene Linie, nämlich pGMR-1, die denselben Vektor ohne Insert enthält, als Negativkontrolle untersucht. Kontrollfliegen mit dem pGMR 1 Transgen und Fliegen, die nur eine Kopie von entweder K18.3 oder dem K18.1 Transgen enthalten, zeigen kein raues Auge. Ähnlich weisen Fliegen, die jeweils eine Kopie der beiden obigen Transgene (K18.3 und K18.1) oder zwei Kopien des K18.1 Transgens enthalten, ebenfalls Wildtypaugen auf. Im Gegensatz dazu haben Fliegen mit zwei Kopien von K18.3 einen leicht rauen Augenphänotyp, wobei eine Untersu chung der Fliegenaugen unter dem Lichtmikroskop zeigt, dass eine ektope Überexpression von Aβ 42 die reguläre trapezoidale Anordnung der Photorezeptorzellen der Ommatidien zerstört (identische einzelne Einheiten, die das Drosophilaverbundauge bilden). Die obigen Beobachtungen legen nahe, dass es eine dosisabhängige Reaktion des Phänotyps des rauen Auges auf die Kopiezahl der im Fliegengenom vorhandenen Transgene gibt. Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, wird die Anzahl der Transgene auf 3 erhöht (2 Kopien von K18.1 mit einer Kopie von K18.3 oder eine Kopie von K18.1 mit zwei Kopien von K18.3). Diese Stämme zeigen auch raue Augen. Wenn schließlich 4 Kopien des Transgens vorhanden sind (2 Kopien von K18.1 mit 2 Kopien von K18.3) zeigen die Fliegen einen viel stärkeren Phänotyp des rauen Auges, was die Dosis-Reaktions-Hypothese bestätigt. Die Penetranz der rauen Augen Phänotypen ist in allen genetischen Kombinationen 100 %. Es muss erwähnt werden, dass ein viel stärkerer Phänotyp beobachtet wird, wenn die Fliegen bei 29°C aufgezogen werden. Eine Temperaturerfordernis für die Expressivität der Augenphänotypen wurde kürzlich beschrieben (Karim und Rubin, 1998 Development 125 (1): 1-9) und kann für das Auge spezifisch sein, auch wenn es nicht auf GMR-enthaltende Expressionssysteme beschränkt ist. Eine solche Abhängigkeit kann höheren Transkriptions- und/oder Metabolismusraten zugeordnet werden oder einer veränderten Proteinkonformation bei der höheren Temperatur.
II. Aβ 42 Transgene zeigen Phänotypen des rauen Auges, deren Ausprägungen von der Kopiezahl des Transgens abhängen
Es ist gut bekannt, dass das Expressionsniveau von Transgenen in Drosophila von der chromosomalen Lage der spezifischen Insertionen abhängt, einem Phänomen, das als "Positionseffekt" bekannt ist (R. Kellum und P. Schedl (1991), Cell 64: 941-950). Es ist dann möglich durch die Erzeugung von zusätzlichen unabhängigen Insertionen mit demselben Transgen transgene Linien zu gewinnen, die unterschiedliche Mengen des transgenen Proteins exprimieren. Daher kann es möglich sein, transgene Linien zu isolieren, die das Aβ 42 Transgen in einer Menge exprimieren, die hoch genug ist, um einen Phänotyp bei einer geringeren Temperatur (25°C) zu verursachen, was physiologischere Bedingungen reflektiert. Um diese Hypothese zu testen, werden neue Insertionen des pGMR-Aβ 42 Transgens im Fliegengenom mittels "P-Element Hopping" erzeugt (H. M. Robertson et al., (1988). Genetics 118: 461-470).
Es wird eine Gesamtzahl von 19 unabhängigen Linien des pGMR-Aβ 42 Konstrukts in neuen chromosomalen Orten etabliert. Die neuen Stämme werden auf das Vorkommen neuer Insertionen basierend auf der chromosomalen Verbindung oder des homozygoten letalen Zustands des Transgens wie auch auf Unterschiede in der Augenfarbe (die durch unterschiedliche Expressionsmengen des "weiß" Gens verursacht werden, das als Transformationsmarker verwendet wird) beurteilt. Junge Larven der obigen neuen Stämme werden anschließend bei 29°C bis zum Schlüpfen angezogen und auf die Anwesenheit eines Augenphänotyps untersucht. Von den 19 neuen Linien zeigen 7 Linien oder 38 % einen Phänotyp des rauen Auges. Die Stämme, die einen Phänotyp des rauen Auges zeigen, werden anschließend bei 25°C angezogen und bezüglich des Augenphänotyps bewertet.
Die neuen transgenen Linien zeigen ein unterschiedliches Ausmaß der phänotypischen Ausprägung, wobei einige von ihnen einen ausgeprägteren Phänotyp zeigen, als er ursprünglich in der K18.1 und K18.3 Linie beobachtet wurde. Ein solches Beispiel ist die KJ.103 Linie, in der eine Kopie des Transgens die ausgewachsenen Augen leicht rau macht, die durch das Vorkommen von eingestreuten dunklen "Flecken" (entspricht tiefer rot pigmentierten Ommatidien) auf der ventralen Seite des Auges gekennzeichnet sind, wobei 2 Kopien des Transgens eine ausgiebige Disorganisation der Photorezeptoren verursachen. Noch wichtiger ist, dass diese spezifische Linie den Phänotyp des rauhen Auges sogar dann zeigt, wenn die Fliegen bei 25°C angezogen werden. Wenn KJ.103 Fliegen bei 29°C angezogen werden, wird das Ausmaß des Phänotyps, das durch entweder eine oder zwei Kopien des Transgens verursacht wird, dramatisch erhöht.
Zusammengefasst zeigen die Phänotypen des rauen Auges, die durch das Aβ 42 Peptid verursacht werden, einen Bereich an Ausprägungen. Die sehr milden Linien zeigen typischerweise mehrere dunkle/schwarze "Flecken" auf der ventralen Seite des Auges, während die milden Linien eine raueres, disorganisierteres Erscheinungsbild aufweisen, das den ventralen Teil des Auges bedeckt. Moderate Linien zeigen eine ausgeprägtere Rauhheit über das gesamte Auge, während in ausgeprägteren Linien das gesamte Auge viele der Ommatidien und interommatidialen Borsten verloren/fusioniert zu haben scheinen und das gesamte Auge eine glatte, glänzende Oberfläche aufweist. Interessanterweise wird die Größe des Auges nur moderat bei Fliegen mit dem höchsten Maß der Aβ 42 Expression (Stamm KJ54) beeinflusst. Dies stimmt mit Beobachtungen in Fliegen überein, die humanes α-Synuklein exprimieren (MB. Feany und W. W. Bender (2000), Nature 404: 394-398). Bei Fliegen, die durch Polyglutamin erweitertes humanes Huntingtin exprimieren, wird eine leichte Verringerung der Augengröße bei den am stärksten exprimierenden transgenen Linien (J. M. Warrick et al (1998), Cell 93: 939-949) beobachtet. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass eine durch Überexpression induzierte Neurodegeneration der humanen Krankheitsgene sich von den Phänotypen unterscheidet, die durch Überexpression von Genen verursacht werden, die in apoptotischen Wegen wirken (M. Grether et al. (1995), Genes Dev. 9, 1694-1708), worin die Größe des Auges primär beeinflusst wird.
Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wird die Hypothese aufgestellt, dass die Schwere des Phänotyps des rauen Auges von der Menge des vorkommenden Abeta Proteins abhängt. Als Konsequenz dieser Hypothese sollte es erwartet werden, dass das KJ.103 Transgen ein höheres Maß an Proteinexpression zeigt, als das K18.3 Transgen (siehe unten).
III. Die Expressivität des Phänotyps des rauhen Auges korreliert mit Aβ42 Proteinmengen
Um zu bestimmen, ob die Schwere des Phänotyps des rauen Auges mit den Expressionsmengen des Aβ 42 Peptids korreliert, wird eine Western Blot Analyse von Proteinextrakten aus Drosophila Köpfen ausgeführt (die verwendeten Stämme sind in den obigen Verfahren beschrieben). Die Ergebnisse zeigen, dass die Tiere mit zwei Kopien des Transgens etwa die doppelte Menge an Aβ 42 Peptid aufweisen, als Tiere mit einer Transgenkopie. Interessanterweise haben sie keinen sichtbaren Phänotyp im erwachsenen Auge, obwohl die Fliegen mit 2 Kopien von K18.1 des Aβ 42 Peptids in detektierbaren Mengen exprimieren. Fliegen mit 2 Kopien des stärker exprimierenden K18.3 Transgens, die insgesamt größere Mengen an Aβ 42 Peptid exprimieren, zeigen den Phänotyp des rauen Auges. Dies trifft auch auf Fliegen zu, die zwei Kopien von K18.1 und zwei Kopien der K18.3 Transgene exprimieren. Fliegen, die nur eine Kopie des KJ103 Transgens exprimieren, haben etwa gleiche Mengen an Protein, wie Fliegen, die zwei Kopien des K18.3 Transgens exprimieren, was die Hypothese bestätigt, dass das KJ103 Transgen größere Mengen der relativen Proteinexpression zeigt.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass es einen Bedarf für eine bestimmte Menge an Aβ 42 Protein gibt, um einen sichtbaren Phänotyp zu erzeugen. Es ist immer noch möglich, dass geringere Mengen der Aβ 42 Expression kleinere Zerstörungen verursachen, die nur auf der ultrastrukturellen Ebene sichtbar sein würden. Um dies zu testen werden dünne Schnitte (1,5 μm) von ausgewachsenen Fliegenköpfen untersucht. Diese Daten zeigen, dass im Vergleich zu Augen von einer Fliege, die den leeren pGMR Vektor trägt, worin die Toloudinblau färbenden Photorezeptoren regelmäßig angeordnet sind, Fliegen, die eine Kopie des moderat exprimierenden K18.3 Transgens tragen, kleine Abnormalitäten aufweisen, wobei einige Photorezeptoren fehlen, sich blau färbende Massen um die Ommatidien bilden und einige Lücken im Gewebe vorkommen. Diese Augen erscheinen makroskopisch normal.
Schnitte von Augen, die zwei Kopien des K18.3 Transgens exprimieren, zeigen in Übereinstimmung mit Beobachtungen auf der makroskopischen Ebene eine variable Disorganisation. Wenn der Phänotyp schlimmer wird, nimmt die Konzentration dieser dichten, färbenden Massen um die Ommatidien zu, wie auch die Lücken im Gewebe. Die Ommatidien sehen kleiner aus und ihnen fehlen Photorezeptoren. Zwei Kopien des stärker exprimierenden KJ103 Transgens zeigen einen Phänotyp, der in der Ausprägung ähnlich ist. Schließlich zeigen Augen von Drosophila, die 4 Kopien des stark exprimierenden KJ54 Transgens exprimieren, einen fast vollständigen Verlust von Photorezeptoren. Zusätzlich zeigen diese Augen ein Übermaß an dichten, färbenden Massen und Gewebelücken. Obwohl an dieser Stelle nicht klar ist, ob die dichten, färbenden Massen, die die Ommatidien umgeben, abnormale/sterbende Zellen sind oder ob sie aggregierendes Abeta Peptid enthalten, ist klar, dass ihre Ansammlung mit der beobachteten gesamten Degeneration des Auges zusammenhängt.
Um die Expression des β-Amyloids in den Augengeweben zu visualisieren, werden Schnitte der Aβ exprimierenden Augen mit einem Antikörper gefärbt, der das humane Aβ Peptid erkennt. Transverse Schnitte des Augengewebes zeigen eine punktuelle Färbung, die in den Kontrollen fehlt. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass diese punktuelle Färbung kleinen Aggregaten/Ablagerungen von beta Amyloid entspricht. Die zelluläre Lokalisation dieser Färbung wie auch die exakte Art des Aggregats/der Ablagerung befindet sich unter Verwendung von Aβ färbenden Farbstoffen in Untersuchung.
Zusammengefasst wird hierin beschrieben, dass die Einführung von mehreren Kopien des Aβ 42 Transgens in das Drosophila Auge, das durch die erhöhten Mengen an Aβ Protein reflektiert wird, einen additiven Effekt auf den Phänotyp des rauen Auges hat. Es ist möglich, dass eine bestimmte Konzentration des Aβ 42 Peptids erforderlich ist, um dessen Aggregation/Konformationszustand zu beeinflussen. Alternativ dazu können sättigende Mengen des Peptids zur Manifestierung des toxischen Effekts erforderlich sein. Die Tatsache, dass Aβ neurotoxische Effekte in mehreren Signalwegen beeinflusst (intrazelluläre Calciumspiegel, oxidativer Stress, entzündliche Reaktion, muskarinische und nikotinische Rezeptorsignalübertragung, zusammengefasst in S. P. Fraser et al. (1997), Trends in Neurosci. 20: 67-72, M. P. Mattson (1997), Physiol. Rev. 77: 1081-1132 und C. M. Coughlan und K. C. Breen (2000), Pharmacol. and Ther. 86: 111-144, Hellström-Lindahl und Court, 2000, Behav. Brain Res. 113 (1-2): 159-168) kann auf einen Bedarf für sättigende Mengen zur Verursachung von Zerstörungen hindeuten. Es ist jedoch klar, dass die Expression von moderaten Mengen des Peptids keine Konsequenz für die Struktur des ausgewachsenen Auges auf dem übergeordneten morphologischen Niveau hat.
IV. Der Phänotyp des rauen Auges, der durch Aβ 42 Peptid verursacht wird, verschlimmert sich mit dem Alter
Es ist gut etabliert, dass bei Alzheimer Patienten die chronische Akkumulation von Aβ Peptid zu einer initialen Manifestierung der Erkrankung führt und zur progressiven Verschlimmerung der Symptome. Um zu testen, ob man diesen Aspekt der Erkrankung im Drosophila Modell nachahmen kann, wird die Rauheit des Augenphänotyps bei ausgewachsenen Fliegen verfolgt.
Zwei Fliegenstämme, die pGMR1 (als Negativkontrolle) und K18.3 exprimieren, werden untersucht. Die K18.3 Fliegen werden verwendet, da in diesem transgenen Stamm ein Bereich an phänotypischer Ausprägung beobachtet wird und es daher einfacher ist, Veränderungen aufzuzeichnen. Fliegen aus den zwei Stämmen werden bei 25°C aufgezogen und 0 bis 2 Tage nach dem Ausschöpfen werden sie auf 29°C gebracht, um die höhere Expression des Transgens zu induzieren. Die Fliegen werden danach bezüglich dem Augenphänotyp etwa jede Woche für insgesamt 1 Monat bewertet. Die K18.3 Fliegen werden in 3 verschiedene Gruppen gemäß der beobachteten Stärke des Augenphänotyps klassifiziert (moderat, mild, mittelmäßig). Wie vorher erwähnt zeigen die pGMR1 exprimierenden Fliegen keinen Augenphänotyp.
Die Daten deuten auf eine Verschiebung der phänotypischen Ausprägung der Abeta exprimierenden Fliegen hin, wenn sie altern: Wenn die Fliegen schlüpfen werden keine Augen mit einem mittelmäßigen Phänotyp beobachtet, während 15 % der Population nach 7 Tagen einen mittelmäßigen Phänotyp aufweisen. Nach 7 Tagen zeigen alle Nachkommen ein Ausmaß des Phänotyps des rauhen Auges, während 42 % keinen Phänotyp nach dem Schlüpfen zeigen. Nach 32 Tagen hat sich, obwohl eine große Zahl an Fliegen gestorben ist, das Gesamtverhältnis an Fliegen mit mildem gegenüber mittelmäßigem Phänotyp nicht signifikant geändert, was nahelegt, dass der maximale Effekt der Abeta Expression erreicht ist.
Das hierin beschriebene Drosophilamodell scheint die progressive und altersabhängige Verschlimmerung der Symptome der Alzheimerschen Erkrankung, einen wichtigen Aspekt der Erkrankung, nachzuahmen. Die beobachtete Zunahme der Schwere des Augenphänotyps wenn die Fliegen altern, kann einer erhöhten Empfindlichkeit von neuronalen Zellen auf die Spiegel des Aβ Peptids zugeordnet werden. Tatsächlich wird, wie oben erwähnt, das Aβ Peptid während des ausgewachsenen Stadiums von Drosophila gebildet. Es ist daher möglich, dass die erhöhten Mengen an Aβ nicht effektiv umgewandelt werden können, was zu einer Akkumulierung des Peptids in den Drosophila Zellen führt. Alternativ dazu kann es möglich sein, dass gealterte Zellen gegenüber dem Vorkommen des Aβ Peptids empfindlicher sind.
V. Der Phänotyp des rauen Auges und das Ausmaß an apoptotischen Zellen in bildgebenden Scheiben bei Larvenaugen und ausgewachsenen Augen
Wie vorher erwähnt hat das Aβ 42 Peptid bekannte toxische Effekte und es wird vermutet, dass es eine Rolle bei der Apoptose spielt. Auf dieser Grundlage werden bildgebende Scheiben des Larvenauges im dritten Stadium, der Vorläufer des ausgewachsenen Auges, auf das Vorkommen von Apoptose oder programmiertem Zelltod untersucht. Herausgeschnittene bildgebende Scheiben aus den Augen von K18.1/K18.1, K18.3/K 18.3 Larven, die bei 29°C angezogen wurden, werden mit Acridinorange gemäß herkömmlicher Verfahren gefärbt, was eine Fluoreszenz von apoptotischen Zellen verursacht. Als Kont rolle werden die folgenden Stämme verwendet, von denen keiner Augenabnormalitäten zeigt: w¹¹¹⁸ (eine Wildtypkontrolle) und pGMR-1 (trägt den "leeren" pGMR Vektor), die bei 29°C angezogen wurden und GMR-Gal4 (exorimiert Gal4 unter der Kontrolle des GMR Elements), der bei 18°C angezogen wurde.
Die Ergebnisse zeigen, dass nur ein geringer oder kein Zelltod in der Wildtypkontrolle w¹¹¹⁸ beobachtet wird. Im Gegensatz dazu kann eine Menge an Zelltod in der K18.1/K18.1, K18.3/K 18.3 Linie detektiert werden. Wenn die Kontrollen, die den pGMR Vektor tragen, aber keinen Augenphänotyp zeigen (pGMR-1 und GMR-GAL4) untersucht werden, wird etwas Zelltod beobachtet, wobei das Ausmaß zu dem in den experimetellen Fliegen K18.1/K18.1, K18.3/K18.3 beobachteten vergleichbar ist. Daher scheint es wahrscheinlich, dass eine bestimmte Menge an Zelltod während der Augenentwicklung toleriert wird und keine Defekte im erwachsenen Auge verursacht, zumindest nicht auf der übergeordneten morphologischen Ebene. Zusätzlich wird hierin vorgeschlagen, dass falls die Apoptose eine Beteiligung bei der Erzeugung des Phänotyps des rauen Auges hat, dieser nicht während der frühen Entwicklung des Auges manifestiert wird.
Um zu testen, ob der beobachtete Phänotyp des rauen Auges durch Apoptose während der ausgewachsenen Stadien von Drosophila verursacht wird, wird der Apoptoseinhibitor DIAP1 im Drososphila Auge co-exprimiert. Die Co-Expression von DIAP1 in den Augen, die Abeta expimieren, dürfte zumindest teilweise den Phänotyp des rauen Auges unterdrücken (Daten nicht gezeigt). Da keine Suppression mit den zwei unterschiedlich DIAP-exprimierenden Stämmen beobachtet wird, kann es sein, das der beobachtete Phänotyp des rauen Auges nicht durch ektop induzierten apoptotischen Zelltod verursacht wird. Es werden dieselben Ergebnisse erhalten, wenn das antiapoptotische Baculovirus P35 Gen verwendet wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch das Aβ 42 Peptid verursachten Effekte im Drosophila Auge durch zelluläre Wege verursacht werden, die nicht zu Apoptose führen.
Die Wirkungen von Aβ 42 sind ziemlich komplex und können andere Proteine beeinflussen, von denen bekannt ist, dass sie Faktoren bei der AD Entwicklung sind. Es wurde gezeigt, dass PS1 und PS2 mit APP co-immunpräzipitieren (Xia et al., 1997 PNAS USA 94 (15): 8208-8213) und dass Aβ 42 in vitro direkt PS2 binden kann (Czech et al., 1999 Society for Neuroscience 25: 641.1). Es ist interessant festzustellen, dass die Überexpression von Wildtyp und mutierten PS Formen auch zur erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Apoptose in mehreren experimentellen Systemen führt, einschließlich dem Drosophila Auge (Y. Ye und M. Fortini (1999), J. Cell Biol. 146: 1351-1364). In diesen Studien wird vorgeschlagen, dass Drosophila Präsenilin (Dps) einen dominanten negativen Effekt ausübt, wenn es in großen Mengen exprimiert wird. Es ist unklar, wie Dps eine Apoptose von Zellen verursacht, aber der Mechanismus könnte die Dysregulation der Notch und/oder Wnt Entwicklungssignalwege miteinbeziehen (zusammengefasst in Anderton et al., 2000 Mol. Med. Today 6: 54-59). Es ist unklar, ob die Aβ 42 Überexpression im hierin beschriebenen System die Dps Funktion beeinflussen kann, indem sie möglicherweise mit einem oder mehreren der Signalwege wechselwirkt. Interessanterweise erhöht die Überexpression von Aβ 40 oder Aβ 42 einen durch Dps (Drosophila Präsenilin) induzierten Phänotyp im selben Gewebe (Daten nicht gezeigt), was die Beteiligung der zwei Proteine im selben Weg nahelegt.
Beispiel 2
Konkaver Flügelphänotyp, der durch die ektope Expression von C99 induziert wird
Transgene Drosophila, die eine Kopie von pUAS-C99 (entweder Wildtyp oder mit der London Mutation) und eine Kopie des apterous-Gal4 tragen, werden mittels Standardverfahren erzeugt und sind oben diskutiert. Die Daten legen nahe, dass diese Fliegen eine Missbildung ihrer Flügel zeigen, so dass die Flügelfläche auf eine konkave Art gebogen ist. Diese Effekte werden mit mehrfachen unabhängigen Insertionen des C99 Transgens bestätigt. Die Western Analyse bestätigt die Expression dieses Transgens. Proteinextrakte aus ganzen Larven, die das C99 (entweder den Wildtyp oder mit der Londonmutation) unter der Kontrolle der tochterlosen Gal4 (ein ubiquitär exprimierter Gal4 Treiber) exprimieren, zeigen eine Proteinbande der erwarteten Größe für C99, die mit dem 6E10 Antikörper reagiert (erzeugt gegen die ersten 16 Aminosäuren von C99). Es existieren Daten, dass wenn der Teil des humanen APP Gens, der als C100 bezeichnet wird, in das Genom von Drosophila inseriert und in der Flügelscheibe exprimiert wird, dies keinen sichtbaren Phänotyp erzeugt (Fossgfreen et al., PNAS 95: 13703-13708 (1998)). Im Gegensatz dazu legen hierin berichtete Daten nahe, dass Fliegen, die für die äquivalente C100 Region des humanen APP transgen sind (hierin C99 genannt), an ein unterschiedliches Signalpeptid fusioniert sind, eine Flügelmissbildung zeigen.
Beispiel 3
Kognitive Defekte, die durch ektope Expression von C99 induziert werden
Transgene Drosophila, die eine Kopie von UAS-C99 (entweder Wildtyp oder mit der London Mutation) und eine Kopie von 7B-Gal4 (das die Expression im Pilzkörper des Gehirns erlaubt) tragen, werden mittels Standardtechniken erzeugt. Kognitive Defekte dieser Fliegen können durch die Durchführung von olfaktorischen Tests, lokomotorischen Tests oder Lern- und Gedächtnistests gemäß herkömmlicher Verfahren untersucht werden. Beispielsweise wird ein verändertes lokomotorisches Verhalten in den obigen Fliegen beobachtet, wenn sie in der "dunklen Reaktionsumgebung" getestet werden, die von S. Benzer, PNAS 58: 1112-1119 (1967) beschrieben ist. Genauer gesagt reagieren Fliegen, die eine Kopie des UAS-C99 und eine Kopie des 7B-Gal4 enthalten, nicht so gut auf die mechanische Bewegung, wie dies Wildtypfliegen tun, gehen weniger schnell als Wildtypfliegen, nachdem man auf den Boden des Testgeräts geklopft hat. Der "dunkle Reaktionstest" ist auch in "Behavior, Learning and Memory" in: Drosophila, A practical Approach, Herausgeber D. B. Roberts (1998) Oxford University Press Inc. New York, Seite 273 beschrieben.
Beispiel 4
Gene, die Drosophila Phänotypen als Ziele für Alzheimer Erkrankungstherapeutika modifizieren
Wie später im Detail beschrieben werden genetische Screenings aufgesetzt, um genetische Modifizierer des in Beispiel 2 beschriebenen konkaven Flügelphänotyps zu identifizieren. Getestete Kandidatenmodifizierer umfassen bekannte Modifizierer der zwei Drosophila Phänotypen, die durch ektope Expression von Drosophila Präsenilin (Dps) im Flügel und im Scutellum (G. Boulianne, Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada, persönliche Kommunikation) induziert werden wie auch Mutationen in anderen Kandidatengenen. Basierend auf der kürzlichen Entdeckung eines Chromosom 10 AD Gen "Hot Spots" wird eine chromosomale Kartierung der humanen Homologe der oben erwähnten genetischen Drosophila Modifizierer ausgeführt. Später beschriebene Daten zeigen, dass die humanen Homologe von mehreren der hierin beschriebenen genetischen Modifizierer ebenfalls auf dem Chromosom 10 lokalisiert sind und es wird hierin erwähnt, dass diese Gene relevante Ziele für die Entwicklung von Pharmazeutika sind, die zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung brauchbar sind, wie auch anderen Zuständen, die mit Fehlern in der Regulation des APP Wegs assoziiert sind.
Es werden insgesamt 93 Mutationen gescreeent, um genetische Modifizierer des Phänotyps des konkaven Flügels zu identifizieren, der durch die ektope Expression von C99 im Flügel von Drosophila induziert wird. Das Screening basiert auf dem Messen der Veränderung der Durchsetzung des Flügelphänotyps, wenn die externe Mutation vorhanden ist. Genauer gesagt wird die Anzahl an Fliegen mit mutierten Flügeln im Vergleich zur Anzahl an Fliegen mit Wildtypflügeln in den experimentellen Gruppen (Fliegen, die sowohl C99 als auch die zu testende Mutation exprimieren) und der Kontrollgruppe (Fliegen, die nur C99 exprimieren) gezählt. Die Signifikanz der Veränderung in der Durchsetzung des Mutantenphänotyps wird durch Messung des P Werts durch einen T Test in den oben erwähnten 4 Gruppen evaluiert. Mutationen werden als signifikante Modifikation des C99 Phänotyps betrachtet, wenn P < 0,05.
Eine Liste an genetischen Modifizierern, die den C99 Überexpressionsphänotyp beeinflussen und die Drosophila Gene, die mit diesen genetischen Modifizierern assoziiert sind, sind in Tablle 1 angegeben.
Alle oben als Modifizierer von Präsenilin und C99 Überexpressionsphänotypen identifizierten Mutationen sind Insertionsmutationen (vermittelt durch Insertion des P-Retrovirus-ähnlichen Transposonelements in das Drosophila Genom). Die exakte chromosmale Lage jeder dieser Insertionen wurde vorher bestimmt (Drosphila Genom Project BDGP, http://www.fruitfly.org). Um die Transkripte zu identifizieren, die durch jede dieser Insertionen betroffen sind, wird ein 10 kb Genombereich auf der rechten und der linken Seite jeder Insertion auf bekannte oder abgeleitete Drosophila Transkripte gescanned. Es werden die folgenden Kriterien für eine Selektion des am wahrscheinlichsten durch eine gegebene Insertion betroffenen Transkripts angelegt:

a) Abstand von Transkripten von der Insertionsstelle und b) Orientierung eines Transkripts relativ zur Insertion.

Falls ein Genombereich mehr als ein Kandidatentranskript mit derselben Orientierung wie die Insertion enthält, werden die am nähesten zur Insertion liegenden für die weitere Analyse ausgewählt. Die translatierten Proteinsequenzen der Drosophila Transkripte von der obigen Analyse bilden "Satz A".
Es wird das Vorkommen der humanen Homologe der obigen Drosophila Proteine (in "Satz A") in einem AD-verbundenen Bereich des humanen Chromosom 10 untersucht. Es werden zwei Kandidatenregionen um Sequence Tagged Site (STS) Marker auf dem humanen Chromosom 10 durch Kupplungsanalyse identifiziert (Betram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000). Es werden STS Markersequenzen kartiert, die in diesen Kopplungsanalysestudien verwendet werden oder STS Sequenzen, die benachbart zu diesen Markern der Celera Genomdaten durch Blastn (Altschul et al., 1997) Sequenzvergleiche liegen. Auf der Grundlage der Kartierungsinformation wird eine Untereinheit des humanen Chromosoms 10 definiert, die die zwei Kandidatenregionen, welche eine signifikante Verbindung zeigen (Bertram et al., 2000, Ertekin-Taner et al., 2000, Myers et al., 2000) und die Region dazwischen umfasst. Die DNA Sequenz (Celera Fortsetzungen) und die entsprechende Liste der Celera Proteintranslationen werden für die definierte Untereinheit ermittelt und in Blastformatdatenbanken ein gegeben. Die DNA Sequenz und die Liste der Celera Proteintranslationen für die oben beschriebenen genomischen Regionen bilden jeweils "Satz B" und "Satz C".
Es wird dann eine Tblastn Suche mit "Satz A" gegen "Satz B" und eine Blastp Suche mit "Satz A" gegen "Satz C" ausgeführt. Es werden anfängliche Tblastn und Balstp Treffer mit E-Werten von weniger als 10^–5 ausgewählt. Dann wird die beste Übereinstimmung jedes Fliegenproteins aus diesen Suchen ausgewählt und die entsprechenden Fliegengene/Transkripte werden auf ihre Assoziation mit genetischen Modifizierern des Dps und C99 Phänotyps überprüft. Die entstehenden 14 Paare der Transkripte/Proteine aus der Fliege und dem Menschen bilden "Satz D".
Die 14 Proteinpaare in "Satz D" werden auf eine stringente oder putative Orthologie getestet. Dies wird durch Blastp Vergleiche mit einer kombinierten Datenbank aller Celera Proteine des Menschen und der Fliege erreicht. Zuerst werden die Fliegenproteine in "Satz D" mit jedem Protein in dieser Datenbank verglichen. Dann werden die entstehenden besten humanen Übereinstimmungen für jedes dieser Fliegenproteine erneut mit der kombinierten Mensch/Fliege Proteindatenbank verglichen. Eine humane Übereinstimmung wird als stringentes Ortholog klassifiziert, falls alle vier Kriterien erfüllt sind:

1. Das Fliegenprotein hat die beste Übereinstimmung mit dem humanen Protein Y.
2. Das Fliegenprotein X hat keine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Fliegenprotein als mit dem Humanprotein Y.
3. Das Humanprotein Y hat die beste Übereinstimmung mit dem Fliegenprotein X.
4. Das Humanprotein Y hat keine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Humanprotein als mit dem Fliegenprotein X.

Falls nur die Kriterien 1) und 3) erfüllt sind, wird die humane Übereinstimmung als putatives Ortholog klassifiziert unabhängig davon, ob das Fliegenprotein X eine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Fliegenprotein hat, das Humanprotein Y eine bessere Übereinstimmung mit einem anderen Humanprotein hat oder beides. Alle anderen Humanübereinstimmungen werden als Homologe betrachtet. Nach dem Orthologietest werden die humanen Kandidatengene gemäß dem folgenden priorisiert:

a) Das Humangen ist ein Homolog des Fliegengens, das durch den genetischen Modifizierer von Drosophila beeinflusst wird, der im genetischen Screening identifiziert wurde.
b) Das Ausmaß an Sequenzähnlichkeit des Humanproteins (kodiert durch das Humangen in a) zum Drosophila Protein (kodiert durch das Drosophila Gen in a).
c) Das Humanprotein ist ein stringentes oder putatives Ortholog des Fliegenproteins.
d) Die chromosomale Lage des Humangens in Bezug auf STS Marker, anderer Kandidatengene oder bekannter AD Gene.
e) Die putative Funktion des Humanproteins und/oder des homologen Drosophila Proteins
f) Evidenz, dass das abgeleitete Humangen exprimiert wird.
g) Vorkommen von validierten oder vorhergesagten kodierenden und/oder nicht-kodierenden SNPs in der kodierenden Region des Humangens.

Um zu überprüfen, ob das humane Homologgen exprimiert wird, wird die IncyteLifeSeq EST Datenbank mit den entsprechenden abgeleiteten humanen Transkripten durchsucht, die aus der Celera Datenbank mittels Blastn identifiziert wurden.
Auf der Grundlage dieser Kriterien wird hierin ermittelt, dass 4 unterschiedliche humane Gene mit AD zusammenhängende Gene sind, die auf dem humanen Chromosom 10 liegen. Im folgenden sind die putativen Proteine aufgeführt, die durch diese vorgeschlagenen Humangene kodiert sind.

(1) hCP50765 (EGR2) SEQ ID Nr. 35
(2) hCP41313 (homolog zum Fliegengen nocA) SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 53
(3) hCP33787 (Ankyrin-verwandtes Protein) SEQ ID Nr. 41
(4) hCP51594 (Ankyrin-3) SEQ ID Nr. 43

Das durch Celera abgeleitete Transkript hCT15097 wird manuell unter Bildung von zwei putativen Formen des Proteins hCP41313 korrigiert. Die Korrektur wird durch die Identifizierung der ESTs, die diesem Lokus entsprechen durch Blastn Suche der Incyte LifeSeq und der öffentlichen EST Datenbanken und Alignierung der identifizierten ESTs mit dem der durch Celera vorhergesagten Transkriptsequenz ausgeführt. Die Korrektur ruft leichte Veränderungen in der C-terminalen Aminosäuresequenz und putativ zusätzliche Reste am N-Terminus der vorhergesagten Aminosäuresequenz hervor. Die Veränderungen im C-terminalen Teil der humanen Proteinsequenz führen zu einer verbesserten Alignierung mit dem nocA der Fliege in dieser Region. Aufgrund der zusätzlichen Reste am N-Terminus entsprechen Met 64 und Met 100 in der Celera Proteinsequenz (hCP41313) jeweils Met 114 und Met 150 in der Translation der vollständigen korrigierten nocA Homologtranskriptsequenz. Es wurden anschließend cDNA Sequenzen aus der Novartis FGA cDNA Sammlung und der Incyte cDNA Sammlung analysiert und verglichen. Basierend auf diesen Analysen wird ein cDNA Klon kloniert und sequenziert, der dem humanen nocA Gen auf Chromosom 10 entspricht. Das 5' Ende dieses cDNA Klons besteht aus cDNA, die aus dem Novartis eigenen Klon fga 94341 und dem 3' Ende dieses Klons aus cDNA besteht, die vom Incyte Klon 242278.1 erhalten wurde (SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 53).
EGR2 ist ein putatives Ortholog des aus Celera abgeleiteten Fliegentranskripts CT23724 (siehe Tabelle 1), das dem Drosophila Stripe-Gen entspricht. Die Fliegenmutation P1505 (siehe Tabelle 1), die das Stripe-Gen beeinflusst, modifiziert nur den Präsenilinphänotyp.
Humanes nocA ist ein putatives Ortholog des durch Celera abgeleiteten Fliegentranskripts CT14619 (siehe Tabelle 1), das dem Drosophila nocA Gen entspricht. Die Fliegenmutation EP2173 (siehe Tabelle 1), die das nocA Gen beeinflusst, modifiziert sowohl das Präsenilin als auch die C99 Überexpressionsphänotypen.
EGR2 ist ein C2H2 Typ Zinkfingertranskriptionsfaktor, der die PNS Myelinierung reguliert. Es wurde in Mäusen gezeigt, dass es für die Hinterhirnentwicklung (Schneider-Maunoury et al., Cell 75, 1199-1214, 1993, Swiatek & Gridley, Genes Dev. 7, 2071-2084, 1993) wichtig ist. Es wurden vier Mutationen in EGR2 beschrieben, die mit angeborenen peripheren Neuropathien assoziiert sind (Warner et al., Nature Genet 18, 382-384, 1998, Timmerman et al., Neurology 52, 1827-1832, 1999).
Das humane nocA Homolog ist ein putativer Transkriptionsfaktor mit einer Zinkfingerdomäne vom C2H2 Typ. Während die exakte Funktion noch bestimmt werden muss, kann es gemäß der hierin beschriebenen Daten eine signifikante Rolle bei der Pathologie der Alzheimerschen Erkrankung spielen. Das durch das nocA Gen kodierte Drosophila Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der bei der Entwicklung des embryonalen Gehirns und der ocelaren Strukturen beim Erwachsenen beteiligt ist.
Ankyrin-3 existiert in zwei Gehirn-spezifischen Isoformen mit 480 und 270 kDa (Kordeli et al., J. Biol. Chem. 270, 2352-2359, 1995). Neural-spezifische Ankyrin-3 Polypeptide sind Kandidaten, um bei der Erhaltung und dem Hinführen von Ionenkanälen und Zelladhäsionsmolekülen zu Ranvier-Knoten und initialen Axonsegmenten teilzunehmen. Von Ankyrin-3 wurde gezeigt, dass es mit dem Spannungsabhängigen Natriumkanal in vitro assoziiert und mit diesem Molekül an den Ranvier-Knoten, initialen Axonsegmenten und der neuromuskulären Verbindung zusammen lokalisiert ist (Srinivasan et al., Nature 333, 177-180, 1988, Kordeli et al., J. Cell. Biol. 110, 1341-1352, 1990, Kordeli & Bennett, J. Cell. Biol. 114, 1243-1259, 1991, Flucher & Daniles, Neuron 3, 163-175, 1989).
Das zweite humane Homolog des Fliegentranskripts CT18415 gehört zur Familie der Ankyrin-verwandten Proteine (hCP33787). Das entsprechende Gen liegt 469 kbp vom Insulin-abbauenden Enzym (IDE) entfernt. Zusätzlich zu Ankyrinwiederholungen enthält hCP33787 eine sterile alpha Motifdomäne (SAM). Es wurde vorgeschlagen, dass die SAM Domäne bei der Regulation der Entwicklungsprozesse beteiligt ist (Shultz et al., Protein Sci. 6, 249-253, 1997), sie wurde als Mediator spezifischer Proteinprotein-Interaktionen beschrieben und es wurde vorgeschlagen, dass sie ausgedehnte polymere Strukturen bildet (Thanos et al., Science 283, 833-836). Die SAM Domäne wird bei der Alignierung zwischen dem Fliegentranskript CT188415 und hCP33787 einbezogen. Es wird spekuliert, dass es eine Rolle bei der Aggregation des β-Amyloids spielen könnte.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass γ-Synuklein bei AD beteiligt sein könnte (Luedecking et al., Neuroscience Letters 261, 186-188, 1999). Es wird postuliert, dass γ-Synuklein mit dem Ankyrinwiederholung-enthaltenden Protein hCP33787 Wechselwirken kann. Als Unterstützung hierfür wurde eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Synphilin, einem Ankyrinwiederholungs-verwandten Protein, und α-Synuklein gezeigt (Engelender et al., Nature Gen. 22, 110-114, 1999). Es ist auch bekannt, dass Vertreter der Synukleinfamilie ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit aufweisen (64 % Sequenzidentität zwischen α-Synuklein und γ-Synuklein, Lavedan, Genome Res. 8, 871-880, 1998). Da die Faltung einer Ankyrinwiederholungseinheit konserviert ist, geben die obigen Argumente eine weitere Unterstützung für eine putative Protein-Protein Wechselwirkung zwischen hCP33783 oder hCP51594 und γ-Synuklein. Es ist interessant zu erwähnen, dass eine kodierende SNP (E → K) für hCP33787 an der Sequenzposition 48 abgeleitet wird, die dem Start der Ankyrinwiederholungsregion entspricht. Diese Sequenzvariation könnte im Zusammenhang mit einer putativen γ-Synuklein-Ankyrin-Wechselwirkung relevant sein, da es entgegengesetzt geladene Aminosäureseitenketten umfasst. Die abgeleitete SNP im Ankyrin-verwandten Protein ist vor allem interessant, da γ-Synuklein eine bestätigte SNP (V → E) an der Position 110 aufweist (Ninkina et al., Hum Mol Genet 7, 1417-1424, 1998), die für den Austausch einer neutralen durch eine negativ geladene Aminosäureseitenkette kodiert. Es wird postuliert, dass diese Polymorphismen für eine putative Wechselwirkung von γ-Synuklein mit entweder hCP3378 oder hCP51594 relevant sein könnten.

Sequenzliste

Claims

Transgene Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das aus dem Abeta-Teil von humanem APP besteht, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) kodiert, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, worin die Expression der DNA Sequenz zu dieser Fliege führt, die einen veränderten Phänotyp zeigt.
Transgene Fliege nach Anspruch 1, worin die DNA Sequenz für Abeta 42 kodiert und worin die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz den für das Auge spezifischen Promotor GMR umfasst.
Transgene Fliege nach Anspruch 2, worin die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege den Phänotyp des "rauen Auges" zeigt.
Verfahren zur Identifizierung von genetischen Modifizierern des APP Wegs, wobei das Verfahren umfasst (a) Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das aus dem Abeta Teil des humanen APP besteht, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) kodiert, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, wobei die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, (b) Kreuzung der transgenen Fliege mit einer Fliege, die eine Mutation in einem bekannten oder vorhergesagten Gen enthält, und (c) Screening der Nachkommen dieser Kreuzungen auf Fliegen, die die DNA Sequenz und die Mutation tragen und eine modifizierte Expression des transgenen Phänotyps im Vergleich zu Kontrollen zeigen.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der genetische Modifizierer und/oder das humane Homolog ein Gen ist, das den Verlauf der Alzheimerschen Erkrankung beeinflusst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die DNA Sequenz für Abeta 42 kodiert und worin die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz den für das Auge spezifischen Promotor GMR umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Expression der DNA Sequenz zu der Fliege führt, die den Phänotyp des "rauen Auges" zeigt.
Verfahren zur Identifizierung von Zielen zur Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung, Prävention oder Linderung von Zuständen, die mit einer abnormalen Regulation des APP Wegs assoziiert sind, wobei das Verfahren umfasst (a) Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das aus dem Abeta Teil des humanen APP besteht, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) kodiert, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, wobei die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, (b) Kreuzung der transgenen Fliege mit einer Fliege, die eine Mutation in einem bekannten oder vorhergesagten Gen enthält, und Screening der Nachkommen dieser Kreuzungen auf Fliegen, die die DNA Sequenz und die Mutation tragen und eine modifizierte Expression des transgenen Phänotyps im Vergleich zu Kontrollen zeigen, und (c) Identifizierung der humanen Homologe der DNA Sequenz von (b).
Verfahren nach Anspruch 8, worin der Zustand Alzheimersche Erkrankung ist.
Verfahren nach Anspruch 8, das ferner die Identifizierung der humanen Homologe der genetischen Modifizierer umfasst, die in den Bereich auf dem humanen Chromosom 10 fallen, das eine genetische Verbindung zur Alzheimerschen Erkrankung gezeigt hat.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Behandlung, Prävention oder Linderung von Zuständen brauchbar sind, die mit einer abnormalen Regulation des APP Wegs assoziiert sind, das einen Test auf Verbindungen umfasst, die durch die Expression von Abeta induzierten Phänotypen modifizieren können, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung einer transgenen Fliege, deren Genom eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das den Abeta Teil des humanen APP umfasst, worin die DNA Sequenz für Abeta 40 (SEQ ID Nr. 1) oder Abeta 42 (SEQ ID Nr. 2) kodiert, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, wobei die DNA Sequenz operativ an eine Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz gebunden ist und Expression der DNA Sequenz, wobei die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege einen veränderten Phänotyp zeigt, (b) Verabreichung einer Kandidatenverbindung an diese Fliege, und (c) Test auf Veränderungen im Phänotyp der Fliege von Schritt (a) im Vergleich zum Phänotyp einer Fliege von Schritt (a), der die Kandidatenverbindung nicht verabreicht wurde.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Zustand Alzheimersche Erkrankung ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die DNA Sequenz für Abeta 42 kodiert und worin die Gewebe-spezifische Expressionskontrollsequenz der für das Auge spezifische Promotor GMR ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Expression der DNA Sequenz dazu führt, dass die Fliege den veränderten Phänotyp zeigt, der als Phänotyp des "rauen Auges" bezeichnet wird.