DE60126659T2

DE60126659T2 - Neue protease

Info

Publication number: DE60126659T2
Application number: DE60126659T
Authority: DE
Inventors: Noboru Chuo YAMAJI; Kouichi Chuo NISHIMURA; Kunitake Chuo ABE; Makoto Chuo OGINO
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2000-12-25
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: EP1347048A1; ES2280306T3; WO2002051998A1; ATE353961T1; US20030129658A1; EP1347048B1; EP1347048A4; DE60126659D1; JPWO2002051998A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Protease.
Stand der Technik
ADAMTS (ein Disintegrin und Metalloprotease mit Thrombospondin-Motiv) ist eine Gruppe von Molekülen, die eine Disintegrin-ähnliche Domäne, eine Metalloprotease-ähnliche Domäne und eine Thrombospondin-Typ I-Repeatsequenz (hiernach bezeichnet als TSP-1-Repeatsequenz) enthält. Bis jetzt wurde über neun menschliche ADAMTS-Moleküle berichtet.
Unter den menschlichen ADAMTS-Molekülen wurde gezeigt, dass ADAMTS4 (Aggrecanase-1) und ADAMTS11 (Aggrecanase-2) eine Aktivität eines selektiven Verdaus zwischen dem 373sten Glutaminsäurerest und dem 374sten Alaninrest (zwischen Glu³⁷³-Ala³⁷⁴) eines extrazellulären Substrats Aggrecan aufweisen und weiterhin eine Möglichkeit vorgeschlagen, dass sie essenzielle Enzyme sind, die das extrazelluläre Substrat Aggrecan im Knorpel bei Arthritis oder Osteoarthritis abbauen (Tortorella M. D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999; und Abbaszade I. et al., J. Biol. Chem., 274, 23443-23450, 1999). Weiterhin wurde gezeigt, dass ADAMTS2 (Procollagen I N-Proteinase) an der Umwandlung von Typ I-Procollagen in den reifen Typ davon als Enzym involviert ist, das den N-terminalen Teil von Typ I-Procollagen spaltet und entfernt und eine wichtige Rolle bei der Bildung von Collagenfasern spielt und dass eine Abweichung im Gen davon mit dem VIIC-Typ Ehlers-Danlos-Syndrom in Beziehung steht (Colige A. et al., Am. J. Hum. Genet., 65, 308-317, 1999).
Es wurde nämlich gezeigt, dass ADAMTS-Moleküle am Stoffwechsel, wie dem Abbau und der Reifung von einer extrazellulären Matrix (beispielsweise Aggrecan, Collagen oder ähnlichen) beteiligt sind.
Chronisches Nierenversagen ist eine Erkrankung, die durch eine Glomerulosklerose und Mesangialfibrose gekennzeichnet ist. Es wird angenommen, dass eine qualitative Veränderung und/oder ein quantitativer Anstieg von extrazellulären Matrixkomponenten die Hauptmechanismen einer Entwicklung oder eines Fortschreitens davon sind. In einem Experiment unter Verwendung eines Nierenversagensmodells wurde gezeigt, dass eine Gen-Einführung von Decorin [einem Protein, das spezifisch die Aktivität von transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β) unterdrückt) (Isaka Y. et al., Nature Med., 2, 418-423, 1996) und eine Verabreichung von anti-TGF-β (Ziyadeh F. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 8015-8020, 2000; Sharma K. et al., Diabetes, 45, 522-530, 1996; und Border W. A. et al., Nature, 346, 371-374, 1990) effektiv waren. Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, dass eine Unterdrückung oder Inhibition physiologischer Wirkungen von TGF-β zu einer Behandlung von chronischem Nierenversagen führt.
Unter den gegenwärtigen Umständen, unter denen ein effektives Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen nicht bekannt ist, ist ein Mittel zur Inhibition von TGF-β wünschenswert, wurde jedoch bis jetzt noch nicht einfach zur Verfügung gestellt.
Offenbarung der Erfindung
TGF-β ist ein Differenzierungs- und Wachstumsfaktor, der verschiedene physiologische Wirkungen zeigt. Daher ist es gefährlich, alle physiologischen Wirkungen von TGF-β bei einer Behandlung des chronischen Nierenversagens zu inhibieren, wobei eine langzeitige Verabreichung vorhergesehen wird und zwar im Hinblick auf die Nebenwirkungen. Es wird bevorzugt, nur den Teil der physiologischen Wirkungen von TGF-β zu unterdrücken oder zu inhibieren, der an einer qualitativen Veränderung und einem quantitativen Anstieg der extrazellulären Matrixkomponenten beteiligt ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Protease, die durch TGF-β induziert wird, am Stoffwechsel der extrazellulären Matrix beteiligt ist und als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen nützlich ist und ein neues Polynukleotid, das die Protease codiert.
Mit dem Ziel, die vorher erwähnten Probleme zu lösen, haben die gegenwärtigen Erfinder intensive Studien durchgeführt und haben im Ergebnis ein Polynukleotid gefunden, das eine neue Protease codiert, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, bestehend aus den lösen bis 1224ten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und bestehend aus 1224 Aminosäureresten von menschlicher fötaler Nieren-cDNA. Weiterhin haben die gegenwärtigen Erfinder festgestellt, dass ein Teilfragment, bestehend aus 750 Aminosäureresten am N-Terminus der neuen Protease eine effektive Proteaseaktivität aufweist. Weiterhin wurde festgestellt, dass (1) die Protease in ADAMTS-Proteasen klassifiziert wird und so als eine Protease betrachtet werden soll, die am Stoffwechsel der extrazellulären Matrix beteiligt ist, (2) die Protease tatsächlich in der menschlichen Niere exprimiert wird, (3) eine Expression davon durch TGF-β in einer primär kultivierten Zelle der Niere induziert wird und (4) eine Gen-Menge davon, die exprimiert wird in einem Nierenversagen-Modelltier ansteigt. Aus diesen Feststellungen haben die gegenwärtigen Erfinder gezeigt, dass die erfindungsgemäße Protease ein Polypeptid ist, das für Nierenversagen auslösend ist und das durch Screening unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids eine Substanz, die dessen Proteaseaktivität inhibiert, eine Substanz, die nur einen Teil unter den physiologischen Wirkungen von TGF-β unterdrückt oder inhibiert, der an einer qualitativen Veränderung und einem quantitativen Anstieg von extrazellulären Matrixkomponenten beteiligt ist, und als Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen nützlich ist, durch ein Screening gefunden werden kann und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung:

[1] ein Polypeptid, das eine Proteaseaktivität zeigt und umfassend (1) die Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, (2) eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, oder (3) eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 1224sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind;
[2] ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und das eine Proteaseaktivität zeigt;
[3] ein Polypeptid mit einer Proteaseaktivität und bestehend aus (1) einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, oder (2) einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 1224sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind;
[6] ein Polypeptid, bestehend aus (1) den 1sten bis 750sten Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder (2) den 1sten bis 1224sten Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
[7] ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß einem der Punkte [1] bis [6];
[8] einen Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Punkt [7];
[9] eine Zelle, transfiziert mit dem Expressionsvektor gemäß Punkt [8];
[10] einen Antikörper oder Fragment davon, der an das Polypeptid gemäß einem der Punkte [1] bis [6] bindet;
[11] ein Verfahren zur Erzeugung des Polypeptids gemäß einem der Punkte [1] bis [6], umfassend die Schritte der Kultivierung der Zelle gemäß Punkt [9] und der Gewinnung des Polypeptids gemäß einem der Punkte [1] bis [6];
[12] ein Verfahren zum Nachweis, ob oder nicht eine zu testende Verbindung eine Proteaseaktivität des Polypeptids gemäß einem der Punkte [1] bis [6] inhibiert, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren von (1) dem Polypeptid, (2) α₂-Makroglobulin und (3) der zu testenden Verbindung und Analyse, ob oder nicht das Polypeptid und α₂-Makroglobulin einen Komplex bilden, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel nicht dissoziiert wird;
[13] ein Screeningverfahren für eine Substanz, die eine Proteaseaktivität des Polypeptids gemäß den Punkten [1] bis [6] inhibiert, umfassend die Schritte von: Nachweis durch das Verfahren von Punkt [12] und Selektion einer Substanz, die die Proteaseaktivität inhibiert;
[14] ein Screeningverfahren für eine Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen durch das Verfahren von Punkt [13].

Die Bezeichnung "Proteaseaktivität", wie hier verwendet, bedeutet eine Eigenschaft, worin ein Komplex, der durch Natriumdodecylsulfat (SDS) und/oder ein Reduktionsmittel nicht dissoziiert wird, mit α₂-Makroglobulin, einem Protease inhibierenden Protein, das im Serum vorliegt, gebildet werden kann.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird hiernach im Detail erklärt.
[1] Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet

(1) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
(2) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren insgesamt deletiert, substituiert und/oder an ein oder mehreren Positionen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750ten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 inseriert sind und das eine Proteaseaktivität zeigt (hiernach bezeichnet als variationsfunktionelle Äquivalente) und
(3) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und das die Proteaseaktivität ausübt (hiernach bezeichnet als homologes Polypeptid).

Das "Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2" als Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist nicht begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid handelt, umfassend die Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und die Proteaseaktivität ausübt. Es beinhaltet beispielsweise

(1a) ein Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
(1b) ein Fusionspolypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zugefügt wurde und das eine Proteaseaktivität ausübt;
(1c) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den 751sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 473 Aminosäuren vom C-Terminus davon deletiert sind zu dem C-Terminus der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zugefügt wurden (d.h. die Aminosäure des C-Terminus ist irgendeine der 751sten bis 1224sten Aminosäuren; hiernach bezeichnet als "die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine C-Terminus-deletierte Sequenz davon");
(1d) ein Fusionspolypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder der C-Terminus-deletierten Sequenz davon zugefügt wurde und das die Proteaseaktivität ausübt und ähnliche.

Ein Verfahren zur Bestätigung, ob ein zu testendes Polypeptid (hiernach bezeichnet als Test-Polypeptid) "die Proteaseaktivität" ausübt oder nicht, wie hier verwendet (hiernach manchmal bezeichnet als "Verfahren zur Bestätigung der Proteaseaktivität") ist nicht besonders begrenzt, solange es bestätigen kann, ob oder nicht das Test-Polypeptid eine "Eigenschaft, worin ein Komplex, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel nicht dissoziiert werden kann, mit α₂-Makroglobulin gebildet werden kann, einem Protease-inhibierenden Protein, das im Serum vorliegt" ausübt. Es kann z.B. bestätigt werden, indem das Test-Polypeptid mit α₂-Makroglobulin, einem Protease-inhibierenden Protein, das im Serum vorliegt, kontaktiert wird und dann analysiert wird, ob oder nicht ein Komplex, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel [wie 2-Mercaptoethanol (2-ME)] nicht dissoziiert wird, gebildet wird, genauer gesagt durch ein Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 4.
Es ist bekannt, dass α₂-Makroglobulin ein Protease-inhibierendes Protein ist, das im Serum vorliegt und einen Komplex mit verschiedenen Proteasen bilden kann. Es ist bekannt, dass die Bildung des Komplexes von einer Proteaseaktivität abhängt und dass der gebildete Komplex durch eine Amidbindung von Protease und α₂-Makroglobulin gebildet wird und so nicht durch SDS oder ein Reduktionsmittel, wie z.B. 2-ME (Feinman R. D. et al., Ann. New York Acad. Sci., 737, 245-266, 1994; und Kuno K. et al., J. Biol. Chem., 274, 18821-18826, 1999) dissoziiert wird.
Das obige Polypeptid (1a), d.h. "das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2" ist eine neue Protease, bestehend aus 750 Aminosäureresten und das eine Proteaseaktivität ausübt. Das Polypeptid (1a) korrespondiert zu einem Teil-Polypeptid von "dem Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 1224sten Amino-säuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2".
Als Markersequenz in dem Polypeptid der gegenwärtigen Erfindung kann beispielsweise eine Sequenz zur einfachen Durchführung der Bestätigung der Polypeptidexpression, der Bestätigung der intrazellulären Lokalisierung davon, dessen Reinigung oder ähnliches verwendet werden. Als Sequenz können beispielsweise das FLAG tag, das Hexa-Histidin tag, das Hämagglutinin tag, das myc Epitop oder ähnliche erwähnt werden.
Die variationsfunktionelle Äquivalente der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid handelt, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 7, noch bevorzugter 1 bis 5 (beispielsweise ein bis etliche Aminosäuren) an ein oder mehreren Positionen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind und das die Proteaseaktivität ausübt. Weiterhin ist ein Ursprung der variationsfunktionellen Äquivalente nicht auf einen Menschen begrenzt.
Die variationsfunktionelle Äquivalente der vorliegenden Erfindung beinhaltet beispielsweise menschliche Variationen des Polypeptids, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und variationsfunktionelle Äquivalente, abstammend von anderen Organismen als dem Menschen (wie beispielsweise Maus, Ratte, Hamster oder Hund) und weiter Polypeptide, hergestellt unter Verwendung von Polynukleotiden, erhalten durch künstliche Modifikation von Polynukleotiden, die diese nativen Polypeptide codieren (d.h. menschliche Variationen oder variationsfunktionelle Äquivalente, abstammend von anderen Organismen als dem Menschen) oder Polynukleotide, codierend das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 durch genetische Manipulationsverfahren. Die Bezeichnung "Variation", wie hier verwendet, bedeutet individuelle Unterschiede zwischen denselben Polypeptiden in derselben Art oder Unterschiede zwischen homologen Polypeptiden in etlichen Arten.
Menschliche Variationen des Polypeptids, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder variationsfunktionelle Äquivalente, abstammend von anderen Organismen als einem Menschen, können von dem Fachmann auf dem Gebiet gemäß der Information einer Basensequenz (beispielsweise der Basensequenz von SEQ ID NO: 1) eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, erhalten werden. In diesem Zusammenhang können die genetischen Manipulationsverfahren allgemein gemäß den bekannten Verfahren (beispielsweise Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) durchgeführt werden.
Beispielsweise werden eine geeignete Sonde oder geeignete Primer gemäß der Information einer Basensequenz eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, entworfen. Ein Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Verfahren (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) oder ein Hybridisierungsverfahren werden unter Verwendung einer Probe (beispielsweise Gesamt-RNA oder eine mRNA-Fraktion, eine cDNA-Bibliothek oder eine Phagen-Bibliothek), hergestellt von einem Organismus (beispielsweise einem Säuger, wie z.B. einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Hamster oder einem Hund) von Interesse und von Primern oder einer Sonde durchgeführt, um ein Polynukleotid zu erhalten, das das Polypeptid codiert. Ein gewünschtes Polypeptid kann erhalten werden, indem das resultierende Polynukleotid in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird und bestätigt wird, dass das exprimierte Polypeptid die Proteaseaktivität zeigt, beispielsweise durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren.
Weiterhin kann ein Polypeptid, das durch genetische Manipulationsverfahren künstlich modifiziert wurde, beispielsweise durch das folgende Verfahren erhalten werden. Ein Gen, das das Polypeptid codiert, kann durch ein konventionelles Verfahren, z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese, erhalten werden (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984). Ein gewünschtes Polypeptid kann erhalten werden, indem das resultierende Polynukleotid in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird und bestätigt wird, dass das exprimierte Polypeptid die Proteaseaktivität ausübt, beispielsweise durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren.
Die variationsfunktionelle Äquivalente der vorliegenden Erfindung beinhaltet beispielsweise

(2a) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren insgesamt an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind und das eine Proteaseaktivität zeigt;
(2b) ein Fusionspolypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren insgesamt an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, und eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus zugefügt wurde und das die Proteaseaktivität zeigt;
(2c) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren insgesamt an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, und an den C-Terminus davon eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den 751sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäureseugenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 473 Aminosäuren vom C-Terminus davon deletiert sind, zugefügt ist und das eine Proteaseaktivität zeigt und
(2d) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren insgesamt an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, und zu dem C-Terminus davon eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den 751sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäureseuqenz von SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 473 Aminosäuren vom C-Terminus davon deletiert wurden, zugefügt wird und eine geeignete Markersequenz oder ähnliches weiter dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus zugefügt wird und das die Proteaseaktivität zeigt.

Wie oben wurde das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erklärt, jedoch als Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird "das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2", "das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2", "ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 (vorzugsweise 1 bis 7, noch bevorzugter 1 bis 5) insgesamt an ein oder mehr Positionen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, deletiert, substituiert, inseriert und/oder addiert sind und das die Proteaseaktivität zeigt"; oder "ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 (vorzugsweise 1 bis 7, noch bevorzugter 1 bis 5) insgesamt an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert, inseriert und/oder addiert und die Proteaseaktivität ausübt" bevorzugt und "das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 750sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2" oder "das Polypeptid, bestehend aus den 1sten bis 1224sten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2" wird mehr bevorzugt.
[2] Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung
Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange es das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Als Polynukleotid der vorliegenden Erfindung können beispielsweise ein Polynukleotid erwähnt werden, umfassend eine Basensequenz, bestehend aus den 1sten bis 2250sten Basen in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1. Ein Polynukleotid, bestehend aus den 1sten bis 2250sten Basen in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 wird besonders bevorzugt. In diesem Zusammenhang beinhaltet die Bezeichnung "Polynukleotid", wie hier verwendet, sowohl DNA als auch RNA.
Ein Verfahren zur Erzeugung des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, es können jedoch beispielsweise (1) ein Verfahren unter Verwendung von PCR, (2) ein Verfahren unter Verwendung konventioneller genetischer Manipulationstechniken (d.h. ein Verfahren zur Selektion einer Transformante, umfassend eine gewünschte cDNA von Stämmen, die mit einer cDNA-Bibliothek transformiert sind) oder (3) ein chemisches Syntheseverfahren erwähnt werden. Diese Verfahren werden in dieser Reihenfolge hiernach erklärt.
Bei dem Verfahren unter Verwendung von PCR von Punkt (1) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
mRNA wird aus menschlichen Zellen oder Gewebe extrahiert, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können. Ein Primerpaar, zwischen dem Gesamtlängen-mRNA, korrespondierend zu dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder eine Teilregion der mRNA lokalisiert ist, wird auf der Basis der Basensequenz eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, synthetisiert. Gesamtlängen-cDNA, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Teil der cDNA kann erhalten werden, indem eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung der extrahierten mRNA als Matrize durchgeführt wird.
Genauer gesagt wird Gesamt-RNA, enthaltend mRNA, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, durch ein bekanntes Verfahren aus Zellen oder Gewebe extrahiert, die dazu in der Lage sind, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Als Extraktionsverfahren können beispielsweise ein Guanidinthiocyanat-Heißphenolverfahren, ein Guanidinthiocyanatguanidin-Hydrochloridverfahren oder ein Guanidinthiocyanat-Cäsiumchloridverfahren erwähnt werden. Das Guanidinthiocyanat-Cäsiumchloridverfahren wird vorzugsweise verwendet. Die Zellen oder das Gewebe, die dazu in der Lage sind, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, können beispielsweise durch einen Northern-Blot unter Verwendung eines Polynukleotids oder eines Teils davon, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder eines Western-Blots unter Verwendung eines Antikörpers, der für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch ist, identifiziert werden.
Als nächstes wird die extrahierte mRNA gereinigt. Die Reinigung der mRNA kann gemäß einem konventionellen Verfahren geschehen. Beispielsweise kann die mRNA durch Adsorption und Elution unter Verwendung einer Oligo(dT)-Cellulosesäule gereinigt werden. Die mRNA kann weiter beispielsweise durch eine Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, falls nötig, fraktioniert werden. Alternativ kann eine kommerziell erhältliche extrahierte und gereinigte mRNA ohne Durchführung der Extraktion der mRNA verwendet werden.
Als nächstes wird die Erststrang-cDNA durch Durchführung einer reversen Transkriptasereaktion der gereinigten mRNA in Gegenwart eines Zufallsprimers, eines Oligo-dT-Primers und/oder eines angepassten Primers synthetisiert. Diese Synthese kann gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Die resultierende Erststrang-cDNA wird einer PCR unter Verwendung von zwei Primern unterworfen, zwischen denen eine Gesamtlänge oder ein Teilbereich des Polynukleotids von Interesse lokalisiert ist, wodurch die cDNA von Interesse amplifiziert wird. Die resultierende DNA wird beispielsweise durch eine Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Das DNA-Fragment von Interesse kann durch Durchführung eines Verdaus der DNA mit Restriktionsenzymen und darauffolgende Ligation, falls nötig, erhalten werden.
Bei dem Verfahren unter Verwendung konventioneller genetischer Manipulationstechniken gemäß Punkt (2) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
Zunächst wird einzelsträngige cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase aus mRNA, hergestellt durch das obige PCR-Verfahren, als Matrize synthetisiert und dann wird doppelsträngige cDNA aus der einzelsträngigen cDNA synthetisiert. Als dieses Verfahren kann beispielsweise ein S1-Nukleaseverfahren (Efstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), ein Land-Verfahren (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981), ein 0. Joon Yoo-Verfahren (Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983) und ein Okayama-Berg-Verfahren (Okayama, H. und Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982) erwähnt werden.
Als nächstes wird ein rekombinantes Plasmid, umfassend die doppelsträngige cDNA, hergestellt und in einen Escherichia coli-Stamm, wie z.B. DH 5α, HB101 oder JM109 eingeführt, wodurch der Stamm transformiert wird. Eine Transformante wird unter Verwendung einer Arzneimittelresistenz gegen beispielsweise Tetracyclin, Ampicillin oder Kanamycin als Marker selektiert. Wenn die Wirtszelle E. coli ist, kann die Transformation der Wirtszelle beispielsweise durch das Verfahren von Hanahan (Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983) durchgeführt werden; nämlich ein Verfahren, worin die rekombinante DNA zu kompetenten Zellen zugefügt wird, hergestellt in Gegenwart von CaCl₂, MgCl₂ oder RbCl. Weiterhin kann als anderer Vektor als ein Plasmid ein Phagenvektor, wie z.B. ein lambda-System verwendet werden.
Als Verfahren zur Selektion einer Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse aus den resultierenden Transformanten, können verschiedene Verfahren, wie z.B. (i) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde, (ii) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer Sonde, erzeugt durch PCR, (iii) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder (iv) ein Screeningverfahren für eine Transformante unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems verwendet werden.
Bei dem Verfahren von Punkt (i) zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Ein Oligonukleotid, das zu dem Ganzen oder einem Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung korrespondiert, wird synthetisiert (in diesem Fall kann es entweder eine Nukleotidsequenz sein, die die Kodonverwendung mit in die Betrachtung einbezieht oder eine Pluralität von Nukleotidsequenzen als Kombination möglicher Nukleotidsequenzen und im letzteren Fall können ihre Zahlen durch den Einschluss von Inosin reduziert werden) und unter Verwendung dieses Oligonukleotids als Sonde (markiert mit ³²P oder ³³P) wird mit einem Nitrocellulosefilter oder einem Polyamidfilter hybridisiert, worauf DNAs der Transformanten denaturiert und fixiert sind, um die resultierenden positiven Stämme einem Screening zu unterziehen und sie zu selektieren.
Bei dem Verfahren von Punkt (ii) zum Screenen einer Transformante unter Verwendung einer Sonde, die durch PCR erzeugt wurde, kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Oligonukleotide eines Sinnprimers und eines Antisinnprimers, korrespondierend zu einem Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung werden synthetisiert und ein DNA-Fragment, codierend das Ganze oder einen Teil des Polypeptids von Interesse wird durch Durchführung von PCR unter Verwendung dieser Primer in Kombination amplifiziert. Als bei diesem Verfahren verwendete Matrizen-DNA kann eine cDNA, die durch eine reverse Transkriptionsreaktion aus mRNA von Zellen synthetisiert wurde, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung produzieren können oder genomische DNA verwendet werden. Das resultierende DNA-Fragment wird mit ³²P oder ³³P markiert und eine Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse wird selektiert, indem eine Koloniehybridisierung oder eine Plaquehybridisierung unter Verwendung dieses Fragments als Sonde durchgeführt wird.
Bei dem Verfahren von Punkt (iii) zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird eine cDNA in einen Expressionsvektor integriert und Polypeptide werden in einem Kulturüberstand innerhalb der Zellen oder auf der Zelloberfläche der Transformanten erzeugt. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch Nachweis eines Stamms selektiert, der das gewünschte Polypeptid erzeugt, wobei ein Antikörper gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und ein zweiter Antikörper gegen den ersten Antikörper verwendet werden.
Bei dem Verfahren von Punkt (iv) zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird eine cDNA, die von jeder Transformante erhalten wurde, beispielsweise auf einen Nitrocellulosefilter geblottet und mit mRNA hybridisiert, die aus Zellen hergestellt wurde, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können und dann wird die an die cDNA gebundene mRNA dissoziiert und gewonnen. Die gewonnene mRNA wird in ein Polypeptid in einem geeigneten Polypeptid-Translationssystem translatiert, beispielsweise durch Injektion in Xenopus-Oozyten oder ein zellfreies System, wie z.B. einem Kaninchen-Retikulozytenlysat oder einem Weizenkeim. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch ihren Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung selektiert.
Ein Verfahren zum Sammeln des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung aus der resultierenden Transformante von Interesse kann gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt werden (z.B. Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Beispielsweise kann es durchgeführt werden, indem eine Fraktion, die zur Plasmid-DNA von Zellen korrespondiert, abgetrennt wird und die cDNA-Region aus der Plasmid-DNA ausgeschnitten wird.
Bei dem chemischen Syntheseverfahren von Punkt (3) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch Bindung von DNA-Fragmenten, erzeugt durch ein chemisches Syntheseverfahren, erzeugt werden. Jede DNA kann unter Verwendung eines DNA-Synthesizers [z.B. Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) oder eines 394 DNA/RNA-Synthesizers (Applied Biosystems)] synthetisiert werden.
Weiterhin kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung durch eine Nukleinsäure-chemische Synthese gemäß einem konventionellen Verfahren, wie z.B. einem Phosphit-Triester-Verfahren (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984), basierend auf den Informationen hinsichtlich des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. In diesem Zusammenhang sind Kodons für jede Aminosäure bekannt und können optional durch das konventionelle Verfahren selektiert und bestimmt werden, beispielsweise, indem man sich der Kodonverwendung von jedem zu verwendenden Wirt bedient (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Weiterhin kann eine teilweise Modifikation von Kodons dieser Basensequenzen gemäß einem konventionellen Verfahren, wie z.B. einer ortsgerichteten Mutagenese durchgeführt werden, wobei ein Primer verwendet wird, umfassend ein synthetisches Oligonukleotid, das eine gewünschte Modifikation codiert (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).
Die Bestimmung der DNA-Sequenzen, die durch die oben erwähnten Verfahren erhalten werden, kann beispielsweise durch ein Maxam-Gilbert chemisches Modifikationsverfahren durchgeführt werden (Maxam, A. M. und Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) oder durch ein Dideoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren (Messing, J. und Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).
[3] Der Expressionsvektor und die Zelle der vorliegenden Erfindung
Ein isoliertes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung wird in eine geeignete Vektor-DNA reintegriert und eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle kann durch den resultierenden Expressionsvektor transfiziert werden. Weiterhin ist es möglich, das Polynukleotid in einer gewünschten Wirtszelle zu exprimieren, indem ein geeigneter Promotor und eine Sequenz, die zu der Genexpression in Beziehung steht, in den Vektor eingeführt werden.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange er das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Als Expressionsvektor kann beispielsweise ein Expressionsvektor erwähnt werden, der durch Einführung des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung in einen bekannten Expressionsvektor erhalten wird, in geeigneter Weise gemäß einer zu verwendenden Wirtszelle selektiert.
Die Zelle der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange sie mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transfiziert wird und das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine Zelle sein, worin das Polynukleotid in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert wird oder eine Zelle, enthaltend das Polynukleotid als Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid. Weiterhin kann die Zelle der vorliegenden Erfindung eine Zelle sein, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert oder eine Zelle, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht exprimiert. Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Transfektion einer gewünschten Wirtszelle mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Bei den eukaryontischen Wirtszellen sind beispielsweise Zellen von Vertebraten, Insekten und Hefe beinhaltet. Als Vertebratenzellen können beispielsweise eine Affen-COS-Zelle (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), ein Dihydrofolatreduktase defekter Stamm einer chinesischen Hamster-Ovarzelle (CHO) (Urlaub, G. und Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), eine menschliche fötale Nieren-abgeleitete HEK293-Zelle oder eine 293-EBNA-Zelle (Invitrogen), erhalten durch Einführung eines EBNA-1-Gens des Epstein-Barr-Virus in HEK293-Zellen erwähnt werden.
Als Expressionsvektor für eine Vertebraten-Zelle kann allgemein ein Vektor, enthaltend einen Promotor, der stromaufwärts von dem zu exprimierenden Gen positioniert ist, eine RNA-Spleißing-Stelle, eine Polyadenylierungsstelle, eine Transkriptions-Terminationssequenz und ähnliches verwendet werden. Der Vektor kann weiterhin, falls nötig, einen Replikationsursprung enthalten. Als Expressionsvektor können beispielsweise pSV2dhfr erwähnt werden, enthaltend einen SV40 frühen Promotor (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS, enthaltend einen menschlichen Elongationsfaktorpromotor (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) oder pCEP4, enthaltend einen Zytomegalieviruspromotor (Invitrogen).
Wenn die 293-EBNA-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann beispielsweise pCEP4 (Invitrogen), enthaltend einen Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus und dazu in der Lage, eine autonome Replikation in der 293-EBNA-Zelle durchzuführen, als Expressionsvektor verwendet werden.
Wenn die COS-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann ein Vektor, der einen SV40-Replikationsursprung aufweist, eine autonome Replikation in der COS-Zelle durchführen und hat einen Transkriptionspromotor, ein Transkriptions-Terminationssignal und eine RNA-Spleißingstelle und kann als Expressionsvektor verwendet werden. Als Vektor können beispielsweise pME18S (Maruyama, K. und Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) oder pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987) erwähnt werden.
Der Expressionsvektor kann in COS-Zellen beispielsweise durch ein DEAE-Dextran-Verfahren (Luthman, H. und Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), ein Calciumphosphat-DNA Co-Präzipitationsverfahren (Graham, F. L. und van der Ed, A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), ein Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzes (z.B. FuGENE^TM6 Transfection Reagent; Boeringer Mannheim) oder ein Elektroporationsverfahren (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982) inkorporiert werden.
Wenn eine CHO-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann eine transfizierte Zelle, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung stabil erzeugen kann, durch Durchführung einer Co-Transfektion eines Expressionsvektors erhalten werden, umfassend das Polynukleotid, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, zusammen mit einem Vektor, der ein neo-Gen exprimieren kann, das als G418-Resistenzmarker wirkt, wie z.B. pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) oder pSV2-neo (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982) und durch Selektion einer G418-resistenten Kolonie.
Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann gemäß einem konventionellen Verfahren kultiviert werden [z.B. "Shin Seikagaku Jikken Koza 18, Saibou Baiyou Gijyutsu (Japanese Biochemical Society)", Tokyo Kagaku Dojin, 1990] und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird außerhalb der Zellen erzeugt. Als ein Medium, das bei der Kultivierung verwendbar ist, kann ein Medium, das üblicherweise für die gewünschte Wirtszelle verwendet wird, in geeigneter Weise selektiert werden. Im Fall der COS-Zelle kann beispielsweise ein Medium, wie das RPMI-1640-Medium oder ein Dulbecco-modifiziertes Eagles-Minimal-Essentialmedium (DMEM) verwendet werden, wobei dies mit einer Serumkomponente, wie z.B. fötalem Rinderserum (FBS), falls nötig, versetzt wird. Im Fall der 293-EBNA-Zelle kann ein Medium, wie z.B. Dulbecco- modifiziertes Eagles-Minimal-Essentialmedium (DMEM) mit einer Serumkomponente, wie z.B. fötalem Rinderserum (FBS) und G418 verwendet werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das außerhalb der Zelle der vorliegenden Erfindung durch Kultivierung der Zellen erzeugt wurde, kann daraus durch verschiedene bekannte Trennverfahren abgetrennt und gereinigt werden [z.B. Okada, M. und Miyazaki K., "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo-Ge (Revision, Notebook for Protein Experiments]", Yodo-sha 1999], wobei man sich seiner physikalischen Eigenschaften, chemischen Eigenschaften und ähnlichem bedient. Genauer gesagt kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch Behandlung einer Kulturflüssigkeit, enthaltend das Polypeptid der gegenwärtigen Erfindung, mit einer üblicherweise verwendeten Behandlung, beispielsweise einer Behandlung mit einem Proteinpräzipitanz, Ultrafiltration, verschiedenen Flüssigchromatographietechniken, wie z.B. einer Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder einer Dialyse oder einer Kombination davon gereinigt werden.
Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein mit einer Markersequenz im Rahmen exprimiert wird, kann die Identifizierung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, seine Reinigung oder ähnliches einfach durchgeführt werden. Als Markersequenz können beispielsweise ein FLAG tag, ein Hexa-Histidin tag, ein Hämagglutinin tag oder ein myc-Epitop erwähnt werden. Weiterhin kann durch Insertion einer spezifischen Aminosäuresequenz, die von einer Protease erkannt wird, wie z.B. Enterokinase, Faktor Xa oder Thrombin zwischen die Markersequenz und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Markersequenz durch die Protease entfernt werden.
[4] Das Nachweisverfahren und das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung
Es ist möglich nachzuweisen, ob oder nicht eine zu testende Verbindung die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, wobei das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Weiterhin ist es unter Verwendung dieses Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung möglich, eine Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der gegenwärtigen Erfindung inhibiert, einem Screening zu unterwerfen. MDTS9 (Metalloprotease und Disintegrin mit Thrombospondin Typ-1 Repeats 9), das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, wird als eine ADAMTS-Protease von der Sequenz her betrachtet und so als eine Protease, die am Stoffwech sel der extrazellulären Matrix beteiligt ist. MDTS9 ist ein Protein, das wie in Beispielen 5 und 8 dargestellt, in der Niere exprimiert wird und eine ADAMTS-Protease, die durch TGF-β induziert wird, wie in Beispiel 6 dargestellt. Daher ist eine Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der gegenwärtigen Erfindung inhibiert, als Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen nützlich, wobei eine Langzeitverabreichung vorhergesehen wird, da es sehr wahrscheinlich ist, dass die Substanz nur einen Teil unter den physiologischen Wirkungen von TGF-β unterdrückt oder inhibiert, der an einer qualitativen Veränderung und einem quantitativen Anstieg der extrazellulären Matrixkomponenten beteiligt ist. Weiterhin kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung per se als Mittel zum Screening einer Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder einer Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen verwendet werden.
Zu testende Verbindungen, die auf das Nachweisverfahren oder Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, sind nicht besonders begrenzt, jedoch können hier beispielsweise verschiedene bekannte Verbindungen (einschließlich Peptiden), die in chemischen Datenbanken hinterlegt sind, Verbindungen, die durch Kombinations-Chemietechniken erhalten werden (Terrett, N. K. et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) oder durch konventionelle Synthesetechniken oder statistische Peptide, hergestellt durch Verwendung eines Phagen-Displayverfahrens (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) oder ähnliche erwähnt werden. Diese bekannten Verbindungen beinhalten Verbindungen (einschließlich Peptiden), von denen bekannt ist, dass sie eine Aktivität zeigen, die die Protease inhibiert, jedoch von denen nicht bekannt ist, dass die die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibieren. Zusätzlich können Kulturüberstände von Mikroorganismen, natürliche Komponenten, abstammend von Pflanzen oder marinen Organismen oder tierische Gewebeextrakte als Testverbindungen für ein Screening verwendet werden. Weiterhin können Verbindungen (einschließlich Peptide), erhalten durch chemische oder biologische Modifikation von Verbindungen (einschließlich Peptiden), gewählt durch das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung, verwendet werden.
Das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
Kontaktieren von (1) dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, (2) α₂-Makroglobulin und (3) einer zu testenden Verbindung und Analyse, ob oder nicht das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und α₂-Makroglobulin einen Komplex bilden, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel (wie z.B. 2-ME) nicht dissoziiert wird.
Das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann durch ein ähnliches Verfahren wie dem oben erwähnten Verfahren zur Bestätigung der Proteaseaktivität durchgeführt werden, außer dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, α₂-Makroglobulin und die Testverbindung miteinander kontaktiert werden, anstatt eines Kontaktierens des Test-Polypeptids mit α₂-Makroglobulin. Bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung wird nämlich nachgewiesen, ob oder nicht die Testverbindung die Proteaseaktivität des Polypeptids der gegenwärtigen Erfindung inhibiert, indem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, α₂-Makroglobulin und das Test-Polypeptid kontaktiert werden und dann analysiert wird, ob oder nicht das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und α₂-Makroglobulin einen Komplex bilden, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel (wie z.B. 2-ME) in Gegenwart der Testverbindung nicht dissoziiert wird. Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und α₂-Makroglobulin keinen Komplex bilden, der nicht durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel (wie z.B. 2-ME) in Gegenwart der Testverbindung dissoziiert wird oder der Grad der Bildung vermindert ist, ist es möglich, zu bestätigen, dass die Testverbindung die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert.
Bei dem Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse selektiert, durch Nachweis ob oder nicht die Testverbindung die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, wobei das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Genauer gesagt kann beispielsweise, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, α₂-Makroglobulin und die Testverbindung miteinander kontaktiert werden, eine Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der gegenwärtigen Erfindung inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen auf der Basis der Gegenwart oder des Grads der Bildung des Komplexes des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und α₂-Makroglobulin in Gegenwart der Testverbindung gewählt werden. Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und α₂-Makroglobulin keinen Komplex bilden, der nicht durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel (wie z.B. 2-ME) in Gegenwart der Testverbindung dissoziiert wird oder der Grad der Bildung vermindert ist, ist es möglich zu bes tätigen, dass die Testverbindung eine Substanz ist, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen.
[6] Der Antikörper und das Fragment davon der vorliegenden Erfindung
Ein Antikörper, wie z.B. ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper, der mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung reagiert, kann durch direkte Verabreichung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines Fragments davon an verschiedene Tiere erhalten werden. Alternativ kann er durch ein DNA-Vakzin-Verfahren erhalten werden (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; oder Donnelly, J. J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996), wobei ein Plasmid verwendet wird, in das ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, inseriert wird.
Der polyklonale Antikörper kann von einem Serum oder Eiern eines Tiers, wie z.B. einem Kaninchen, einer Ratte, einer Ziege oder einem Huhn erzeugt werden, wobei das Tier durch das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon, emulgiert in einem geeigneten Adjuvans (beispielsweise Freunds komplettem Adjuvans) durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Verabreichung immunisiert und sensibilisiert wurde. Der polyklonale Antikörper kann aus dem resultierenden Serum oder Eiern gemäß konventionellen Verfahren für die Polypeptidisolierung und Reinigung getrennt und gereinigt werden. Beispiele für die Trenn- und Reinigungsverfahren beinhalten beispielsweise eine Zentrifugalabtrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder ein chromatographisches Verfahren unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein A-Agarose und ähnlichen.
Der monoklonale Antikörper kann einfach durch den Fachmann auf dem Gebiet gemäß beispielsweise dem Zellfusionsverfahren von Köhler und Milstein (Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975) erzeugt werden.
Eine Maus wird intraperitoneal, subkutan oder intravenös etliche Male in einem Abstand von einigen Wochen durch wiederholte Inokulation von Emulsionen, worin das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon in einem geeigneten Adjuvans, wie z.B. Freunds komplettem Adjuvans, emulgiert ist, immunisiert. Die Milzzellen werden nach der endgültigen Immunisierung entfernt und dann mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen.
Als Myelomzelle zum Erhalt eines Hybridoms kann eine Myelomzelle mit einem Marker, wie z.B. einer Defizienz in der Hypoxanthin-Guanin-Phospho ribosyl-Transferase oder Thymidinkinase (beispielsweise die Maus-Myelom-Zellinie P3X63Ag8.U1) verwendet werden. Als Fusionsmittel kann Polyethylenglycol verwendet werden. Als Medium zur Herstellung von Hybridomen kann beispielsweise ein üblicherweise verwendetes Medium, wie z.B. Eagles-Minimal-Essentialmedium, ein Dulbecco-modifiziertes Minimal-Essential-Medium oder ein RPMI-1640-Medium verwendet werden, indem in geeigneter Weise 10 bis 30 % fötales Rinderserum zugefügt werden. Die fusionierten Stämme können durch ein HAT-Selektionsverfahren selektiert werden. Ein Kulturüberstand der Hybridome wird durch ein wohlbekanntes Verfahren, wie z.B. ein ELISA-Verfahren oder ein immunhistologisches Verfahren einem Screening unterworfen, um die Hybrome zu selektieren, die den Antikörper von Interesse sezernieren. Die Monoklonalität des gewählten Hybridoms wird durch Wiederholung von Subklonierungen durch das limitierende Verdünnungsverfahren sichergestellt. Antikörper in einer Menge, die gereinigt werden kann, werden durch Kultivierung der resultierenden Hybridome in einem Medium für 2 bis 4 Tage erzeugt oder in der Peritonealhöhlung eines Pristan-vorbehandelten BALB/c-Mausstamms für 10 bis 20 Tage.
Die resultierenden monoklonalen Antikörper in dem Kulturüberstand oder dem Aszites können durch konventionelle Polypeptid-Isolations- und Reinigungsverfahren abgetrennt und gereinigt werden. Beispiele für die Trenn- und Reinigungsverfahren beinhalten beispielsweise eine Zentrifugalabtrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder chromatographische Verfahren unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein-A-Agarose oder ähnlichen.
Weiterhin kann der monoklonale Antikörper oder die Antikörperfragmente, enthaltend einen Teil davon, durch Insertion der Gesamtheit oder eines Teils eines Gens, das den monoklonalen Antikörper codiert, in einen Expressionsvektor und Einführung des resultierenden Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen (wie z.B. E. coli, Hefe oder tierische Zellen) erzeugt werden.
Antikörperfragmente, umfassend einen aktiven Teil des Antikörpers, wie z.B. F(ab')₂, Fab, Fab' oder Fv können durch ein konventionelles Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Verdau der abgetrennten und gereinigten Antikörper (einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper) mit einer Protease, wie z.B. Pepsin oder Papain und Trennung und Reinigung der resultierenden Fragmente durch Standard-Polypeptidisolierung und Reinigungsverfahren.
Weiterhin kann ein Antikörper, der mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung reagiert, in Form einer einzelkettigen Fv oder Fab gemäß einem Verfahren von Clackson et al. oder einem Verfahren von Zebedee et al. (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; oder Zebedee, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992) erhalten werden. Weiterhin kann ein humanisierter Antikörper durch Immunisierung einer transgenen Maus erhalten werden, worin Maus-Antikörper-Gene durch menschliche Antikörper-Gene ersetzt werden (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben, ist jedoch auf keine Weise darauf begrenzt. Die Verfahren werden gemäß den bekannten Verfahren (Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), falls nicht anders angegeben, durchgeführt.
Beispiel 1: Herstellung eines Expressionsvektors mit einem am C-Terminus hinzugefügten FLAG
Ein Expressionsvektor pCEP4d, worin die Epstein-Barr-Virus EBNA1-Expressionseinheit entfernt wurde, wird durch einen Verdau des Plasmids pCEP4 (hergestellt von Invitrogen) durch die Restriktionsenzyme ClaI und NsiI, Herstellung glatter Enden und dann Selbstligation konstruiert. Der resultierende Expressionsvektor pCEP4d wurde mit Restriktionsenzymen NheI und BamHI verdaut und das resultierende DNA-Fragment mit ungefähr 7,7 kbp wurde aus Agarosegel extrahiert, wozu das doppelsträngige Oligonukleotid, hergestellt durch Anhaften des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 4 dann inseriert wurden, um den Expressionsvektor pCEP4d-FLAG zu konstruieren. Die Basensequenz des resultierenden Expressionsvektors wurde analysiert um zu bestätigen, dass die gewünschte Sequenz darin beinhaltet war.
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei der Expressionsvektor pCEP4d-FLAG als Matrize verwendet wurde, das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 5 und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 6 als Primer und PyroBest DNA-Polymerase (PyroBest^TM; hergestellt von Takara-shuzo). Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde eine Zyklusreaktion, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 55°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 30 Sekunden 15mal wiederholt. Danach wurde eine Verlängerungsreaktion bei 72°C für 7 Minuten durchgeführt. Ein resultierendes DNA-Fragment mit ungefähr 0,4 kbp wurde mit einem Restriktionsenzym SpeI verdaut und in den Expressionsvektor pCEP4d-FLAG (ungefähr 7,7 kbp), der mit XbaI verdaut worden war, inseriert, um einen Expressionsvektor pCEPdE2-FLAG zu erhalten. In dem resultierenden Expressionsvektor pCEPdE2-FLAG waren die XbaI-Erkennungssequenz, die NheI-Erkennungssequenz, die NotI-Erkennungssequenz, die BamHI-Erkennungssequenz und das FLAG tag von dem Promotor stromabwärts davon hin arrangiert.
Beispiel 2: Klonieren des Gesamtlängen-ORF-Gens des neuen Proteasegens MDTS9
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 7 (mit einer SpeI-Erkennungssequenz und einer Kozak-Sequenz, die zum 5'-Terminus zugefügt wurde) und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 8 (mit einer NotI-Erkennungssequenz, die zum 5'-Terminus zugefügt wurde) als Primer, eine menschliche fötale Nieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready^TM cDNA; hergestellt von Clontech) als Matrize und DNA-Polymerase (TaKaRa LA Taq^TM; hergestellt von Takara-shuzo) als DNA-Polymerase verwendet wurden. Bei der PCR wurde zunächst eine thermische Denaturierungsreaktion bei 94°C für 2 Minuten durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden und 68°C für 2 Minuten und 30 Sekunden 40mal wiederholt. Danach wurde eine Verlängerungsreaktion bei 68°C für 7 Minuten durchgeführt. Ein resultierendes PCR-Produkt, ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,2 kbp (mit der SpeI-Erkennungssequenz und der Kozak-Sequenz, am 5'-Terminus zugefügt und der NotI-Erkennungssequenz am 3'-Terminus zugefügt) wurde in das Plasmid PCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) subkloniert, um einen Klon pMDTS9Cys1 zu erhalten.
Das resultierende Plasmid pMDTS9Cys1 wurde mit den Restriktionsenzymen SpeI und NotI verdaut und ein resultierendes DNA-Fragment mit ungefähr 2,2 kbp wurde in die Xbal- und NotI-Stelle des Plasmids pCEPdE2-FLAG, konstruiert in Beispiel 1, inseriert, um ein Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys1-FLAG zu konstruieren.
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 9 (mit einer SpeI-Erkennungssequenz und einer Kozak-Sequenz, zum 5'-Terminus zugefügt) und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 10 als Primer, eine menschliche fötale Nieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready^TM cDNA; hergestellt von Clontech) als Matrize und DNA-Polymerase (TaKaRa LA Taq^TM. hergestellt von Takara-shuzo) als DNA-Polymerase verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden und 68°C für 30 Sekunden 45mal wiederholt. Daraufhin wurde eine Verlängerungsreaktion für 7 Minuten bei 68°C durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt, ein DNA-Fragment mit ungefähr 0,2 kbp (mit der SpeI-Erkennungsstelle und der Kozak-Sequenz zugefügt zum 5'-Terminus und der NotI-Erkennungsstelle, zugefügt zum 3'-Terminus) wurde in das Plasmid PCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) subkloniert, um einen Klon pMDTS9(552-12) zu erhalten.
Ein SpeI-NcoI DNA-Fragment A mit ungefähr 0,2 kbp, erhalten durch Verdau des resultierenden Plasmids pMDTS9(552-12) mit den Restriktionsenzymen SpeI und NcoI und ein NcoI-NotI DNA-Fragment B mit ungefähr 2,0 kbp, erhalten durch Verdau des vorher sich ergebenden Plasmids pMDTS9Cys1 mit den Restriktionsenzymen NcoI und NotI, wurden in die XbaI- und NotI-Stelle des pCEPdE2-FLAG inseriert, konstruiert in Beispiel 1, um ein Plasmid pCEP-dE2-MDTS9Cys2-FLAG zu konstruieren. Auf ähnliche Weise wurden das DNA-Fragment A und das DNA-Fragment B in die SpeI- und NotI-Stelle eines Plasmids pZErO-2 (hergestellt von Invitrogen) zur Konstruktion eines Plasmids pZErO-MDTS9Cys2 inseriert.
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 11 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 12 als Primer, eine menschliche fötale Nieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready^TM cDNA; hergestellt von Clontech) als Matrize und DNA-Polymerase (TaKaRa LA Taq^TM; hergestellt von Takara-shuzo) als DNA-Polymerase verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden und 68°C für 2 Minuten 30 Sekunden 40mal wiederholt. Daraufhin wurde eine Verlängerungsreaktion für 7 Minuten bei 68°C durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt, ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,1 kbp wurde in das Plasmid PCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) subkloniert, um einen Klon pMDTS9-3H zu erhalten.
Ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,1 kbp, erzeugt durch Verdau des resultierenden Plasmids pMDTS9-3H mit den Restriktionsenzymen SphI und NotI wurde in ein DNA-Fragment mit ungefähr 9,3 kbp ligiert, erzeugt durch Verdau des vorher sich ergebenden Plasmids pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG mit den Restriktionsenzymen SphI und NotI zur Konstruktion eines Plasmids pCEPdE2-MDTS9Fu11-FLAG.
Das resultierende Plasmid pCEPdE2-MDTS9Fu11-FLAG enthält ein Gen, bestehend aus den 1sten bis 3672sten Basen in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1, d.h. die Basensequenz des neuen Proteasegens MDTS9. Ein Polypeptid mit der 1sten bis 1224sten Aminosäuresequenz in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 21, zugefügt zum C-Terminus davon kann aus einer tierischen Zelle als Wirt exprimiert werden.
Weiterhin enthält das vorher sich ergebende Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG ein Gen, bestehend aus den 1sten bis 2250sten Basen in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1, d.h. der Basensequenz des neuen Proteasegens MDTS9. Ein Polypeptid mit der 1sten bis 750sten Aminosäuresequenz in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 21 zugefügt zum C-Terminus davon kann aus einer tierischen Zelle als Wirt exprimiert werden. In diesem Zusammenhang wird betrachtet, dass das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 eine ADAMTS-Protease ist.
Beispiel 3: Expression des MDTS9-verkürzten Proteins (MDTS9Cys2) und des MDTS9-Gesamtlängen-Proteins (MDTS9Fu11)
Ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz (FuGENE^TM6-Transfektionsreagenz; hergestellt von Boehringer Mannheim) wurde gemäß dem beigefügten Protokoll verwendet, um das Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG oder das Plasmid pCEPdE2-MDTS9Fu11-FLAG, hergestellt in Beispiel 2 oder das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pCEPdE2-FLAG als Kontrolle in eine HEK293-EBNA-Zelle (hergestellt von Invitrogen), kultiviert in einem serumhaltigen Medium [DMEM (GIBCO-BRL), 10 % fötales Rinderserum, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 250 μg/ml G418 (hergestellt von Nakarai Tesque, Inc.)] einzuführen.
Nach der Plasmideinführung wurden die Zellen 48 Stunden kultiviert (hiernach bezeichnet als Kultivierung mit Serum). Alternativ wurden die Zellen nach der Plasmideinführung 16 Stunden kultiviert, zweimal mit PBS gewaschen und in serumfreiem Medium kultiviert [DMEM (GIBCO-BRL) 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 250 μg/ml G418 (hergestellt von Nakarai Tesque, Inc.)] und zwar für 32 Stunden (hiernach bezeichnet als Kultivierung ohne Serum).
Jede bei der Kultivierung mit Serum oder ohne Serum erhaltene Kulturflüssigkeit wurde bei 3000 Upm 10 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge (Type 8800; hergestellt von Kubota Corporation) zum Erhalt eines Kulturüberstands zentrifugiert. Jede verbleibende Zelle nach Entfernung des Kulturmediums wurde mit einer Extraktionslösung [20 mmol/1 HEPES (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 % Glycerin und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)] 15 Minuten behandelt und von einer Kulturplatte durch Pipettieren entfernt. Die resultierende Zellsuspension wurde bei 3000 Upm 10 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge (Typ 8800; hergestellt von Kubota Corporation) zum Abtrennen einer Zellmembran-gebundenen Fraktion (Überstand) aus einer Zellfraktion (Pellet) zentrifugiert.
Die Expression der gewünschten Proteine in den resultierenden Fraktionen (d.h. Kulturüberstand, Zellmembran-gebundene Fraktion und Zellfraktion) wurde durch einen Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers (Maus-anti-FLAG monoklonaler Antikörper M2; hergestellt von Sigma) gegen den FLAG tag, zugefügt zum C-Terminus, bestätigt. Genauer gesagt wurde jede Fraktion auf einem SDS/10 %-20 % Acrylamidgel (hergestellt von Daiichi Pure Chemicals) unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 2-ME elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran durch eine Blotvorrichtung übertragen. Zu der resultierenden PVDF-Membran wurde ein Blockiermittel (Block-ace, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical) zugefügt, um ein Blockieren durchzuführen. Dann wurden die Produkte auf der Membran sukzessiv mit dem Maus-anti-FLAG monoklonalen Antikörper M2 und einem Kaninchen-anti-Maus-IgG polyklonalen Antikörper, markiert mit Meerrettichperoxidase (hergestellt von Zymed oder TAGO) umgesetzt. Alternativ wurden die Produkte nach dem Blockieren auf der Membran sukzessiv mit einem biotinylierten Antikörper M2 (hergestellt von Sigma) und Streptoavidin, markiert mit Meerrettichperoxidase (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech), umgesetzt. Nach der Reaktion wurde eine Expression des gewünschten Proteins durch ein kommerziell erhältliches Western-Blot-Nachweissystem (ECL Western Blotting Detecting System; hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) bestätigt.
Ein anscheinendes Molekulargewicht auf der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) des nachgewiesenen Proteins (d.h. MDTS9 verkürztes Protein) in jeder durch die Kultivierung ohne Serum der Zelle erhaltenen Fraktion, worin das Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG eingeführt wurde, lag bei ungefähr 55 bis 65 kDa im Kulturüberstand, ungefähr 55 bis 65 kDa in der Zellmembran gebundenen Fraktion und ungefähr 80 bis 95 kDa in der Zellfraktion.
Weiterhin wurde das nachgewiesene Protein (d.h. MDTS9 Gesamtlängenprotein) in jeder durch Kultivierung ohne Serum der Zelle, in die das Plasmid pCEPdE2-MDTS9Fu11-FLAG eingeführt wurde, erhaltenen Fraktion, im wesentlichen in der Zellmembran gebundenen Fraktion und der Zellfraktion nachgewiesen. Ein anscheinendes Molekulargewicht auf SDS-PAGE lag bei ungefähr 130 bis 140 kDa in allen Fraktionen.
Beispiel 4: Bestätigung der Proteaseaktivität des MDTS9-verkürzten Proteins (1) Konstruktion des Plasmids pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG
Ein QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (hergestellt von Stratagene) wurde verwendet und zwar gemäß dem beigefügten Protokoll, um ein Plasmid pZErO-MDTS9Cys2E/Q, enthaltend ein Gen MDTS9Cys2E/Q zu konstruieren, worin Glu (Glutaminsäure) in His-Glu-Ser-Gly-His (SEQ ID NO: 22) durch Gln (Glutamin) ersetzt war. Glu wird als aktives Zentrum betrachtet. In dieser Konstruktion wurde das Plasmid pZErO-MDTS9Cys2, wie hergestellt in Beispiel 2, als Matrize verwendet und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 13 und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 14 wurden als Primersatz verwendet.
Ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,3 kbp, erzeugt durch Verdau des resultierenden Plasmids pZErO-MDTS9Cys2E/Q mit den Restriktionsenzymen SpeI und NotI wurde in die XbaI- und NotI-Stelle des Plasmids pCEPdE2-FLAG, konstruiert in Beispiel 1 inseriert, um ein Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG zu erhalten.
(2) Bestätigung der Proteaseaktivität auf der Basis der Komplexbildung mit α₂-Makroglobulin
Jeder Kulturüberstand (Kultivierung mit Serum) von jeder Zelle, transfiziert mit dem Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG, wie hergestellt in Beispiel 2 oder dem in Beispiel 4(1) hergestellten Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG oder dem in Beispiel 1 hergestellten Plasmid pCEPdE2-FLAG als Kontrolle wurde elektrophoretisch (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 2-ME aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran, wie in Beispiel 3 beschrieben, übertragen. Zu der resultierenden PVDF-Membran wurde ein Blockiermittel (Block-Ace, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical) zugefügt, um ein Blockieren durchzuführen. Dann wurden die Produkte auf der Membran sukzessiv mit dem Ziegen-anti-α₂-Makroglobulin-Antikörper (hergestellt von CEDARLANE) und einem Kaninchen-anti-Ziegen-IgG polyklonalen Antikörper, markiert mit Meerrettichperoxidase (hergestellt von Zymed Laboratories) umgesetzt. Nach der Reaktion wurde eine Expression des gewünschten Proteins durch ein kommerziell erhältliches Western-Blot-Nachweissystem (ECL Western Blotting Detecting System; hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) bestätigt.
In dem Kulturüberstand (Kultivierung mit Serum) von der Zelle, die mit dem Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG transfiziert war, wurde eine Bande von ungefähr 250 kDa nachgewiesen. Die Bande wurde nicht in jedem Kulturüberstand (Kultivierung mit Serum) bei der Zelle nachgewiesen, die mit dem Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG oder dem Plasmid pCEPdE2-FLAG transfiziert war. Dieses Ergebnis zeigt, dass das MDTS9-verkürzte Protein (MDTS9Cys2) einen Komplex mit α₂-Makroglobulin bildete und so wurde bestätigt, dass das MDTS9-verkürzte Protein (MDTS9Cys2) eine Proteaseaktivität aufweist.
Beispiel 5: Bestätigung der Gewebeverteilung der MDTS9-Genexpression
Eine Gewebeverteilung der MDTS9-Genexpression wurde gemäß den folgenden Verfahren analysiert, wobei ein kommerziell erhältliches cDNA-Panel [Human MTC Panel I (Katalog Nr. K1420-1), Human MTC Panel II (Katalog Nr. K1421-1), Human Fetal MTC Panel (Katalog Nr. K1425-1) und Human Tumor MTC Panel (Katalog Nr. K1422-1) in Multiple Tissue cDNA (MTC^TM) Panel, hergestellt von Clontech] verwendet wurden.
Genauer gesagt wurde eine PCR unter Verwendung einer Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 15 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 16 als Primer, des cDNA-Panels als Matrize und DNA-Polymerase (TaKaRa LA Taq^TM; hergestellt von Takara-shuzo) durchgeführt. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden und 68°C für 1 Minute und 30 Sekunden 44mal wiederholt. Jede Reaktionsflüssigkeit wurde auf einem Agarosegel zum Nachweis eines DNA-Fragments mit ungefähr 1,1 kbp, abstammend von der mRNA des MDTS9-Gens elektrophoretisch aufgetrennt. Im Ergebnis zeigte sich, dass die mRNA des MDTS9-Gens in der Niere exprimiert wurde.
Beispiel 6: Induktion der MDTS9-Genexpression durch TGF-β
(1) Herstellung von Matrizen-cDNA
Normale menschliche proximale Tubulus-Epithelzellen (5 × 10⁵ Zellen; hergestellt von Clonetics) wurden auf einer Platte mit 6 Vertiefungen (hergestellt von ASAHI TECHNOGLASS CORPORATION) ausgesät und einen Tag unter Verwendung des Renal Epithelial Cell Medium Kits (hergestellt von Clonetics) kultiviert. Das Medium wurde in ein serumfreies Renal Epithelial Cell Medium geändert und die Kultivierung wurde für einen Tag fortgesetzt. Das Medium wurde in serumfreies Renal Epithelial Cell Medium geändert, enthaltend 10 ng/ml (Endkonzentration) TGF-β1 (hergestellt von Sigma) und die Zellen wurden 24 Stunden kultiviert. In diesem Zusammenhang wurde das Medi um der Kontrollgruppe auf ein serumfreies Renal Epithelial Cell Medium ohne TGF-β1 geändert und die Zellen wurden 24 Stunden kultiviert.
Eine Gesamt-RNA wurde von jeder behandelten Gruppe unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gesamt-RNA-Reinigungsreagenz (ISOGEN; hergestellt von Nippon Gene) hergestellt. Die resultierende Gesamt-RNA wurde mit DNase (hergestellt von Nippon Gene) bei 37°C für 90 Minuten umgesetzt. Die DNase-behandelte Gesamt-RNA (0,5 μg) wurde durch das Superscript firststrand system (für RT-PCR; hergestellt von GIBCO-BRL) in cDNA umgewandelt.
(2) Quantitative Bestimmung von MDTS9 mRNA durch quantitative PCR
Eine Analyse einer Expressionsveränderung in der normalen menschlichen proximalen Tubulus-Epithelzelle wurde unter Verwendung der in Beispiel 6(1) hergestellten cDNA als Matrize und einem Sequenzdetektor (Prism7700 Sequence Detector; hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt. Eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 17 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 18 wurde als Primersatz verwendet. Eine PCR wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR-Reagenz (SYBR Green PCR core reagent; hergestellt von Applied Biosystems) durch Durchführung einer anfänglichen Denaturierungsreaktion bei 95°C für 10 Minuten und Wiederholung einer Zyklusreaktion, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 15 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden 40mal durchgeführt.
In diesem Zusammenhang wurde zur Berechnung einer Menge an menschlichem exprimiertem β-Actin als internem Standard eine PCR durchgeführt, wobei die obige cDNA als Matrize und eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 19 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 20 als Primersatz unter denselben Bedingungen durchgeführt wurde. Weiterhin wurde zum Erhalt einer Standardkurve zur Berechnung einer Menge an exprimierter mRNA eine PCR durchgeführt, wobei die cDNA [hergestellt in Beispiel 6(1)] von menschlichen proximalen Tubulus-Epithelzellen ohne Stimulierung durch TGF-β1 als Matrize und der obige Primersatz (d.h. eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 17 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 18 oder eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 19 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 20) unter denselben Bedingungen verwendet wurden. Eine Menge der exprimierten MDTS9 mRNA unter jeden Bedingungen wurde als Verhältnis zu einer Menge von mRNA des β-Actin-Gens dargestellt, exprimiert unter jeder Bedingung, um eine Menge der mRNA des MDTS9-Gens pro bestimmter Menge der Gesamt-RNA zu erhalten. Im Ergebnis zeigte sich, dass TGF-β1 die Genexpression von mRNA des MDTS9-Gens um das ungefähr 8fache induzierte.
Beispiel 7: Expressionsveränderung des MDTS9-Gens bei einem Ratten-Nierenversagen-Modell
(1) Herstellung von Matrizen-cDNA
cDNA wurde aus der Niere eines Ratten-5/6 Nephrektomie-Modells [Kenjiro Kimura, "jin to toseki (kidney und dialysis)", 1991 (suppl.), 431-439] hergestellt. Nach 1, 2, 3, 4, 6, 8 und 10 Wochen nach der 5/6-Nephrektomie wurden fünf 5/6 Nephrektomieratten und fünf scheinoperierte Ratten seziert, um die Nieren zu entfernen. Die Nieren wurden sofort eingefroren und bei –80°C gehalten. Die Nieren, die von jeder Gruppe abstammten, wurden unter Verwendung einer Zellverkleinerungsvorrichtung (CRYO-PRESS CP-100; hergestellt von Microtec Nition) zerkleinert, während sie in flüssigem Stickstoff eingefroren waren und dann wurde eine Gesamt-RNA unter Verwendung eines Gesamt-RNA-Reinigungsreagenz (ISOGEN; hergestellt von Nippon Gene) hergestellt. Die extrahierte Gesamt-RNA wurde mit DNase (hergestellt von Nippon Gene) bei 37°C für 90 Minuten umgesetzt. Die DNase-behandelte Gesamt-RNA (0,25 μg) wurde in eine cDNA durch ein Superscript firststrand system (für RT-PCR; hergestellt von GIBCO-BRL) umgewandelt.
(2) Quantitative Bestimmung von mRNA des Ratten-MDTS9-Gegenstücks durch quantitative PCR
Eine Analyse der Expressionsveränderung in einer Niere des Ratten-Nierenversagen-Modells wurde unter Verwendung der in Beispiel 7(1) hergestellten cDNA als Matrize und eines Sequenzdetektors (Prism7700 Sequence Detector; hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt. Das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 23 und dasjenige, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 24 wurden als Primersatz verwendet. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei ein kommerziell erhältliches PCR-Reagenz (SYBR Green PCR core reagent; hergestellt von Applied Biosystems) verwendet wurde, indem eine anfängliche Denaturierungsreaktion bei 95°C für 10 Minuten durchgeführt wurde und durch eine Wiederholung einer zyklischen Reaktion, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 15 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden 45mal.
Um eine Menge an exprimierter menschlicher Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH) als internen Standard zu berechnen, wurde eine PCR durchgeführt, wobei die obige cDNA als Matrize und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 25 und dasjenige, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 26 als Primersatz unter denselben Bedingungen verwendet wurden. Weiterhin wurde zum Erhalt einer Standardkurve zur Berechnung einer exprimierten mRNA-Menge eine PCR durchgeführt, wobei genomische Ratten-DNA (hergestellt von Clontech) als Matrize und der obige Primersatz unter denselben Bedingungen verwendet wurden. Eine mRNA-Menge des Ratten-MDTS9-Gens, exprimiert unter jeder Bedingung, wurde als Verhältnis zu einer mRNA-Menge des G3PDH-Gens, exprimiert unter jeder Bedingung, dargestellt, um eine Menge der mRNA des Ratten-MDTS9-Gens pro bestimmter Menge von Gesamt-RNA in jeder Gruppe zu vergleichen. Im Ergebnis wurde festgestellt, dass die mRNA des Ratten-MDTS9-Gens in der 5/6-Nephrektomie-Ratte um das ungefähr 5fache im Vergleich zu der scheinoperierten Ratte 1 Woche nach der Operation exprimiert wurde und dass es um das ungefähr 2fache nach 3 Wochen (eine Menge von Proteinen im Urin stieg deutlich an), 6 Wochen (das Nierengewicht begann im Vergleich zu einem normalen Nierengewicht anzusteigen) und 8 Wochen (erschwerte Symptome) nach der Operation exprimiert wurde.
Es ergibt sich aus diesem Beispiel, dass eine Expression des MDTS9-Gens bei dem Nierenversagen-Modell induziert wird.
Beispiel 8: Immunhistochemische Färbung von einer menschlichen Nierengewebesektion
(1) Herstellung eines anti-menschlichen MDTS9-Antikörpers
Ein Fusionsprotein (GST-MDTS9A) eines Peptids, bestehend aus den 280sten bis 410ten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und Glutathion-S-Transferase (GST) wurden unter Verwendung eines Plasmids pGEX-6P-1 (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) als Expressionsvektor und E. coli in einer Einschlusskörperfraktion gemäß einem Laborheft [Masato Okada und Kaoru Miyazaki, "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo (Revision, Notebook for Protein Experiments)", Yodo-sha, S.162-179] hergestellt. Eine präparative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde unter Verwendung der Einschlusskörperfraktion durchgeführt und dann wurde das gewünschte GST-MDTS9A-Protein aus dem Gel durch ein Diffusionsverfahren [Masato Okada und Kaoru Miyazaki, "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Ge (Revision, Notebook for Protein Experiments)", Yodo-sha, S.48-51] extrahiert.
Ein Kaninchen (japanisch weiß) wurde durch das resultierende GST-MDTS9A-Protein 5mal insgesamt in einem Intervall von 10 bis 14 Tagen zum Erhalt eines Antiserums immunisiert. Eine IgG-Fraktion wurde aus dem Antiserum durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein-G- Sepharose FF-Säule (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt. Dann wurde ein anti-menschlicher MDTS9-Antikörper aus der IgG-Fraktion durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule (MBP-MDTS9A-Säule) gereinigt, worin ein Fusionsprotein (MBP-MDTS9A) eines Peptids, bestehend aus den 280sten bis 410ten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und Mannose-Bindungsprotein (MBP) immobilisiert waren. Die Affinitätsreinigung durch die Protein-G-Sepharose FF-Säule, Immobilisierung von MBP-MDTS9A an eine CNBr-aktivierte Sepharose FF-Säule (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) und die Affinitätsreinigung durch die MBP-MDTS9A-Säule wurden gemäß den beigefügten Protokollen durchgeführt. Weiterhin wurde eine Präparation von MBP-MDTS9A in E. coli und Reinigung davon unter Verwendung von pMAL-c2E (hergestellt von New England Biolabs) als Expressionsvektor gemäß einer Anleitung "pMAL protein fusion and purification system", davon veröffentlicht, durchgeführt.
(2) Nachweis des MDTS9-Proteins in menschlicher Niere
Der in Beispiel 8(1) hergestellte anti-menschliche MDTS9-Antikörper wurde mit einer Gewebesektion umgesetzt, die durch Formalin fixiert und mit Paraffin auf einem Objektträger eingebettet war. Dann wurde die Gewebesektion unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Färbekits (VECTORSTAIN ABC-AP kit, Katalog Nr. AK-5000; hergestellt von VECTOR LABORATORIES) gemäß dem beigefügten Protokoll gefärbt. Bei diesem Verfahren wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der mit Biotin (Katalog Nr. BA-1000; hergestellt von Vector) war als zweiter Antikörper und ein alkalisches Phosphatasesubstrat-Kit I (Katalog Nr. SK-5100; hergestellt von Vector) als Farbentwicklersubstrat verwendet. Im Ergebnis wurde eine Färbung bei Epithelzellen (insbesondere Podozyten) von Nieren von einer gesunden Person und einem Patienten, der an einer Diabetes-Nephropathie litt (frühes Stadium oder spätes Stadium) beobachtet.
Aus diesem Beispiel wird deutlich, dass das MDTS9-Protein in der menschlichen Niere exprimiert wird.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist eine neue Protease, die in der Niere exprimiert wird, durch TGF-β induziert wird und am Stoffwechsel in einer extrazellulären Matrix beteiligt ist. Daher ist eine Substanz, die die Proteaseaktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, als Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen nützlich, worin eine Langzeitverabreichung vorhergesehen wird, da es sehr wahrscheinlich ist, dass die Substanz nur einen Teil unter den physiologischen Wir kungen von TGF-β unterdrückt oder inhibiert, der an einer qualitativen Veränderung und einem quantitativen Anstieg der extrazellulären Matrixkomponenten beteiligt ist. Das heißt, gemäß dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Screeningsystem für ein Mittel zur Behandlung von chronischem Nierenversagen bereitgestellt. Weiterhin sind das Polynukleotid, der Expressionsvektor, die Zelle und der Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nützlich.
Freier Text im Sequenzprotokoll
Die Merkmale der "künstlichen Sequenz" werden unter dem Zahlenidentifikator <223> im Sequenzprotokoll beschrieben. Genauer gesagt ist jede der Basensequenzen von SEQ ID NO: 3 und 4 eine künstlich synthetisierte Linkersequenz. Jede der Basensequenzen von SEQ ID NO: 5-9 und 12-14 ist eine künstlich synthetisierte Primersequenz. Die Basensequenz von SEQ ID NO: 21 ist eine Aminosäuresequenz, erhalten durch Expression von DNA, enthaltend eine Restriktionsenzym-NotI-Erkennungsnukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, die eine FLAG tag Aminosäuresequenz codiert.
Sequenzprotokoll

Claims

Polypeptid, das eine Proteaseaktivität zeigt und umfassend (1) die Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, (2) eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, oder (3) eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 1224sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus (1) einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 750sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, oder (2) einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz bestehend aus der 1sten bis 1224sten Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus (1) den 1sten bis 750sten Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder (2) den 1sten bis 1224sten Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.
Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Anspruch 5.
Zelle, transfiziert mit dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 6.
Antikörper oder Fragment davon, der an das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.
Verfahren zur Erzeugung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Schritte der Kultivierung der Zelle gemäß Anspruch 7 und der Gewinnung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren zum Nachweis, ob oder nicht eine zu testende Verbindung eine Proteaseaktivität des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 inhibiert, umfassend die folgenden Schritte: Kontaktieren von (1) dem Polypeptid, (2) α₂-Makroglobulin und (3) der zu testenden Verbindung und Analyse, ob oder nicht das Polypeptid und α₂-Makroglobulin einen Komplex bilden, der durch SDS und/oder ein Reduktionsmittel nicht dissoziiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, weiterhin umfassend den Schritt der Selektion einer Substanz, die die Proteaseaktivität inhibiert.
Verfahren zum Screening nach einer Substanz zur Behandlung von chronischem Nierenversagen durch das Verfahren gemäß Anspruch 11.