DE60121999T2

DE60121999T2 - Verfahren zur herstellung von zusammensetzungen mit geringer salzkonzentration

Info

Publication number: DE60121999T2
Application number: DE60121999T
Authority: DE
Inventors: Makonnen Belew; Bo-Lennart Johansson; Jean-Luc Maloisel
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2000-12-31
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2021-12-20
Also published as: ES2267840T3; EP1345694A2; EP1345694B1; US6852230B2; CA2431662A1; DE60121999D1; WO2002053288A3; WO2002053288A2; AU2002235795A1; ATE334746T1; US20040050784A1; JP2004532182A

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung eines Salzes aus einer Flüssigkeit (I), die eine Substanz enthält, die eine Peptidstruktur zusammen mit einem Salz zeigt, d. h. die Herstellung von entsalzten Zusammensetzungen der Substanz, oder Entsalzen der Substanz.
Das Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Inkontaktbringen einer Flüssigkeit (I) mit einem Ionenaustauscher (1) eines gemischten Modus, um ein Binden zwischen dem Ionenaustauscher und der Substanz herbeizuführen, wobei der Ionenaustauscher eine Basismatrix umfasst, die einen Ionenaustausch-Liganden (Ligand 1) trägt, der die entgegengesetzte Ladung im Vergleich zu der Substanz besitzt,
(ii) Desorbieren der Substanz von dem Ionenaustauscher durch Ersetzen der Flüssigkeit (I) durch eine Flüssigkeit (II),

(a) das Binden des Schritts (i) bei einer Ionenstärke ausgeführt wird, die einer NaCl-Konzentration von ≥ 0,1 M entspricht; und Ligand 1 ein Kationenaustausch-Ligand eines gemischten Modus ist;
(b) die Desorption des Schritts (ii) eine pH-Änderung umfasst; und
(c) mindestens eine Pufferkomponente (die Säure oder die Base) des in Schritt (ii) verwendeten Puffers flüchtig ist.

Die geladene Substanz ist typischerweise bio-organisch und/oder amphoter. In Bezug auf die Anzahl der geladenen Gruppen in der Substanz werden die größten Vorteile erhalten, falls es zwei oder mehr geladene Gruppen gibt, wie eine, zwei oder mehr positiv geladene Gruppen und/oder eine, zwei oder mehr negativ geladene Gruppen. In Bezug auf das Molekulargewicht der Substanzen werden die größten Vorteile erreicht, falls das Molekulargewicht oberhalb 1000 Dalton liegt, wie oberhalb 5000 Dalton oder oberhalb 10 000 Dalton.
Ein Ligand ist eine Gruppe, die mit der Basismatrix verbunden ist und eine anziehende Wechselwirkung mit der Substanz von Interesse während der Bedingungen, die durch die Flüssigkeit (I) bereitgestellt werden, ausübt. Der Begriff „Ligand" umfasst, dass es eine Mehrzahl von individuellen Ligandengruppen derselben Art gibt, die an die selbe Basismatrix gebunden sind. Mindestens ein Teil des Ionenaustausch-Liganden auf dem Ionenaustauscher besitzt eine Ladung, die entgegengesetzt zu der Ladung der Substanz unter den Bedingungen, die durch die Flüssigkeit (I) bereitgestellt wird, ist. Das Folgende gilt für Ionenaustausch-Liganden, die eine pH-abhängige Ladung besitzen:

a) Sowohl der Ionenaustausch-Ligand als auch seine entsprechende Base werden als Liganden derselben Art betrachtet, so lange wie der pH der Flüssigkeit (I) ≤ pKa + 2 ist.
b) Sowohl der Ionenaustausch-Ligand als auch seine entsprechende Säure werden als Liganden derselben Art betrachtet, solange der pH der Flüssigkeit (I) ≥ pKa – 2 ist.

pKa steht für den pKa des (a) Liganden (Alternative a) oder der Säure entsprechend dem Liganden (Alternative b). Falls der pH der Flüssigkeit (I) nicht diese Kriterien erfüllt, ist die geladene Form des Liganden in nicht wesentlichen Mengen vorhanden.
Falls nicht anders angezeigt, bezieht sich der Begriff „Ladung" auf die Nettoladung einer Substanz bzw. eines Liganden.
Mit dem Begriff „Salz" im Kontext der Erfindung ist eine Verbindung gemeint, die, wenn sie in entweder der Flüssigkeit (I) oder der Flüssigkeit (II) aufgelöst ist, positiv geladene Einheiten und negativ geladene Einheiten bildet. Die Einheit des Salzes, die dieselbe Ladung wie die zu entsalzende (adsorbierende) Substanz besitzt, ist bevorzugt nicht-polymer und trägt eine geringe Anzahl von Ladungen derselben Art, wie die Substanz (z. B. ein, zwei oder drei). Die andere Einheit des Salzes besitzt diese Beschränkungen nicht, obwohl meistens Salze in Betracht gezogen werden, die nur nicht-polymere Einheiten enthalten.
Die verschiedenen geladenen Einheiten eines Salzes können puffernd oder nicht-puffernd sein.
Hintergrund
Entsalzte Zusammensetzungen von geladenen bio-organischen Substanzen werden in vielen Fällen benötigt, in denen eine bio-organische Substanz weiter verarbeitet werden soll. Traditionelle Ionenaustauschchromatographie erfordert beispielsweise, dass die Ionenstärke der Lösung, aus der eine Substanz adsorbiert werden soll, eine Ionenstärke unterhalb eines bestimmten Wertes besitzen muss, der von der Substanz, anderen vorhandenen Ionen, dem zu verwendenden Ionenaustauscher etc. abhängt. Analytische Verfahren, die für bio-organische Substanzen verwendet werden, können durch das Vorhandensein von Salzen gestört werden, die zu ungenauen Ergebnissen führen. Typische Beispiele sind Massenspektrometrie, Elementaranalysen, etc. Entsalzen ist oft ein wichtiger Prozess bei der Herstellung von bio-organischen Substanzen einer pharmazeutisch annehmbaren Reinheit und/oder einer Reinheit, die für die Nahrungsmittelindustrie annehmbar ist.
Herkömmliche Entsalzungsprozeduren für bio-organische Substanzen waren Gelfiltration, Membranfiltration, Ultrafiltration, Dialyse etc. Es wurde auch vorgeschlagen, zu verwenden (a) Ionenaustauscher in Kombination mit einem pH-Schalter für die Desorption der bio-organischen Substanz, um die Ladungswechselwirkung der adsorbierten Substanz und des Ionenaustauschers zu verringern, und (b) starke Ammoniumionenaustauscher in Kombination mit einer Desorption mit flüchtigen Puffern. Siehe zum Beispiel Hirs et al., J. Biol. Chem 195 (1952) 669-683 und 219 (1956) 623-642; Hirs, Methods in Enzymology XI (Hsg. Hirs) (1967) 386-390; Dréze et al., und Analytica Chim Acta 11 (1954) 554-558, die das Entsalzen von Aminosäuren und kurzen Peptiden beschreiben. Siehe auch WO 9406822 (Upfront Chromatography) und WO 9965607 (Amersham Pharmacia Biotech AB), die das Entsalzen von Proteinen vorschlagen.
US 5652,348 (Burton et al.) schlägt vor, dass durch Nutzen von ladbaren Liganden unter hydrophoben Wechselwirkungsbedingungen eine Desorption herbeigeführt werden kann ohne Salzbildung oder Entsalzen. Hydrophobe Wechselwirkungsbedingungen bedeuten, dass der Ligand in einer ungeladenen Form vorliegt, und dass die Konzentration des Salzes hoch ist.
WO 99/65607 bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung einer Verbindung durch Kationenaustausch, wobei die Liganden von dem Typ eines gemischten Modus sein können. Das Verfahren wird z. B. für Proteinreinigung verwendet.
Die Aufgaben der Erfindung
Eine Hauptaufgabe ist es, ein einfaches und zuverlässiges Entsalzungsverfahren der Art bereitzustellen, wie unter dem Titel „Technisches Gebiet" angeben ist, und bei der mindestens eines der folgenden Merkmale vorhanden ist, wenn man vom Schritt (i) zum Schritt (ii) vorgeht:

(a) Einfachheit, Skalierbarkeit auf verschiedene Formate (z. B. auf ein Mikroformat), Reproduzierbarkeit etc;
(b) Milde Bedingungen derart, dass die primäre, sekundäre, tertiäre und/oder quaternäre Struktur der bio-organischen Substanz im Wesentlichen ungeändert beibehalten werden kann;
(c) Verringerung der Gesamtkonzentration von Salz um einen Faktor von mindestens 10, bevorzugt mindestens 100 (Molar/Molar), beispielsweise durch Ausgehen von einer Gesamtkonzentration des Salzes in der Flüssigkeit (I), die mindestens 0,1 M beträgt, wie mindestens 0,25 M oder mindestens 0,5 M und bis hinunter zu einer Gesamtkonzentration des Salzes, die höchstens 0,1 M beträgt, wie höchstens 0,05 M oder höchstens 0,01 M im Eluat des Schrittes (ii), das den Hauptteil der desorbierten Substanz enthält.
(d) Vergrößern der Konzentration der bio-organischen Substanz mit einem Faktor von mindestens 10, wie mindestens 10², oder mindestens 10³ oder mehr;
(e) Verringerung der Konzentration von nicht-puffernden Salzkomponenten auf im Wesentlichen null (mit Ausnahme für Gegenionen für puffernde Komponenten, die benötigt werden, um das elektrostatische Gleichgewicht beizubehalten);
(f) Verringerung der Menge anderer bio-organischer Verbindungen, z. B. derselben allgemeinen Struktur, mit einem Faktor von mindestens 10, wie mindestens 100 (g/g);
(g) Eine Ausbeute der bio-organischen Substanz von Interesse von höchstens 60%, wie höchstens 75% oder mindestens 80% oder mindestens 90%, mit einer Präferenz für im Wesentlichen 100%.

Eine zweite Aufgabe ist es, Entsalzungsprozeduren bereitzustellen, die beim Erhalten von bio-organischen Verbindungen einer pharmazeutisch annehmbaren Reinheit und/oder Reinheiten unterstützen, die für die Nahrungsmittelindustrie annehmbar sind.
Eine dritte Aufgabe ist es, ein Entsalzungsverfahren für eine bio-organische Verbindung bereitzustellen, die als solche wie oben diskutiert analysiert werden soll, d. h. analytische Verfahren, die für bio-organische Verbindungen der oben erwähnten Art beabsichtigt sind und die einen Entsalzungsschritt umfassen.
Eine vierte Aufgabe ist es, neue Entsalzungsprozeduren bereitzustellen, die auf Zusammensetzungen verwendet werden können, die eine geladene Substanz wie hier zuvor beschrieben enthalten,

(a) Umkehrphasenchromatographie, und/oder
(b) Ionenaustauschchromatographie auf herkömmlichen Ionenaustauschern mit der Hilfe einer Desorption durch einen Anstieg in der Konzentration des Salzes, zum Beispiel eine Änderung, die innerhalb von 0-0,5 M des Salzes stattfindet, zum Beispiel in einem Teil der Unterintervalle 0-0,1, 0,075-0,15 und/oder 0,125-0,5 M Salz, mit einer Präferenz dafür, dass die Änderung als ein schrittweiser oder kontinuierlicher Gradient stattfindet.

Diese Aufgabe umfasst auch die entsprechenden diskontinuierlichen Prozeduren. Ein verwendeter Salzgradient kann sich bis zu 2-3 M Salz erstrecken. Mit herkömmlichen Ionenaustauschern sind gemeint Ionenaustauscher, die eine Durchbruchskapazität unter der Durchbruchskapazität besitzen, die für die Ionenaustauscher erforderlich sind, die in der vorliegenden innovativen Entsalzungsprozedur verwendet werden. Siehe unten.
Die Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben erkannt, dass die oben erwähnten Aufgaben zumindest teilweise erreicht werden können, falls ein Ionenaustauscher ausgewählt wird, der eine ausreichend hohe Durchbruchskapazität bei einer ausreichend hohen Ionenstärke bei dem pH besitzt, der für den Adsorptionsschritt (Schritt (i)) verwendet wird.
Eine der Eigenschaften des vorliegenden innovativen Verfahrens ist es, dass es eine oder beide von zwei Schlüsselwörtern (A beziehungsweise B) enthält:
Merkmal A: Ionenaustauscher (1) ist ausgewählt aus Ionenaustauschern, die:

(a) fähig sind, die Substanz von Interesse in einer wässrigen Referenzflüssigkeit bei einer Ionenstärke zu binden, die 0,1 M NaCl, bevorzugt 0,25 M NaCl entspricht; und
(b) eine Durchbruchskapazität bei dem pH, der durch die Flüssigkeit (I) bereitgestellt ist, ermöglichen, die mehr als 2 mg/ml Gel (sedimentiert) beträgt, wie mehr als 4 mg/ml Gel, bei einem Durchbruch von 10% und einer Linearfliessgeschwindigkeit von 300 cm/h.

Ein alternatives Auswahlkriterium in Punkt (b) des Merkmals B ist, dass der Ionenaustauscher unter jenen ausgewählt wird, der eine maximale Durchbruchskapazität im pH-Intervall 2-12 für die Substanz ermöglicht, die ≥ 100% beträgt, wie ≥ 125% oder ≥ 200% oder ≥ 300% oder ≥ 500% oder ≥ 1000% der Durchbruchskapazität der Substanz für den entsprechenden Ionenaustauscher, in dem die Ionenaustausch-Liganden sind

(i) SP-Gruppen, wenn die Substanz eine positive Ladung (Referenzionenaustauscher 2a) besitzt, und
(ii) Q-Gruppen, wenn die Substanz eine negative Ladung (Referenzionenaustauscher 2b) besitzt;

Mit dem Begriff „SP-Gruppen" sind Sulfopropylgruppen gemeint, die erhalten werden durch Umsetzen einer Allylgruppe mit Bisulfit, d. h. SP-Gruppen umfassen -CH₂CH₂CH₂SO₃ ^– und seine Sulfonsäureisomere.
Mit dem Begriff „Q-Gruppen" sind quaternäre Ammoniumgruppen gemeint, die erhalten werden können durch Umsetzen von -OCH₂CH(OH)CH₂OCH₂CH=CH₂ mit Halogen, gefolgt von einer Reaktion mit Trimethylamin, d. h. Q-Gruppen umfassen -OCH₂CH(OH)CH₂OCH₂CH(OH)CH₂N+(CH₃)₃ und seine Isomere, die eine quaternäre Trimethylammoniumgruppe enthalten.
Die oben angegebenen Vergleiche beziehen sich auf Messungen, die unter im Wesentlichen den selben Bedingungen für Ionenaustauscher (1) und (2a) ausgeführt werden und für Ionenaustauscher (1) und (2b), d. h. pH, Temperatur, Lösungsmittelzusammensetzung, Fliessgeschwindigkeit etc. sind dieselben zwischen (1) und (2a) und zwischen (1) und (2b). Die Durchbruchskapazitäten werden bei derselben relativen Konzentration der Substanz in dem Durchfluss gemessen (zum Beispiel c/c₀ = 10%, für c/c₀ siehe den experimentellen Teil).
Der „entsprechende Ionenaustauscher" bedeutet, dass die Trägermatrix dieselbe ist, d. h. das Trägermaterial, die Kugelgröße, die Porengrößen, das Porenvolumen, die Packungsprozedur etc. sind dieselben. Der gesamte Grad der Substitution durch (einen) geladene(n) Liganden des Ionenaustauschers 1 ist/sind im Wesentlichen dieselben, wie auf dem Referenzionenaustauscher (2a oder 2b) (gemessen als Chlorid- bzw. Natriumionenkapazität). Das Gegenion sollte auch dasselbe sein. Die Spacer- und Kopplungschemie kann verschieden sein. Bestimmte Arten von Kopplungschemien können zum Vernetzen der Trägermatrix führen, was zu einer starreren Matrix führt. In diesem Fall sind die Fliessbedingungen, bei denen der Vergleich gemacht wird, bei einem Niveau ausgewählt, bei dem die Matrix im Wesentlichen nicht-komprimiert ist.
Typischerweise ist eine nützliche Durchbruchskapazität für die Substanz höher als diejenige, die die maximale Durchbruchskapazität der Substanz hat bei

(a) dem kommerziell erhältlichen Anionenaustauscher Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), der eine Chloridionenkapazität von 0,18-0,25 mmol/ml Gel besitzt und/oder
(b) dem kommerziell erhältlichen Anionenaustauscher SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), der eine Natriumionenkapazität von 0,18-0,25 mmol/ml Gel besitzt.

Die Basismatrix in diesen zwei Referenzionenaustauschern ist Epichlorhydrin-vernetzte Agarose in Kugelform. Die Kugeln besitzen Durchmesser im Intervall von 45-165 μm. Die Ausschlussgrenze für globulare Proteine beträgt 4 × 10⁶.
Alle Durchbruchskapazitäten beziehen sich auf Messungen, die bei Raumtemperatur gemacht wurden (ungefähr 25°C).
Die Verringerung der Ladungsdifferenz in Schritt (ii) kann ausgeführt werden durch ändern der Nettoladung der Substanz. Falls der Ligand eine pH-abhängige Ladung besitzt, kann die Änderung auch eine Änderung der Ladung des Liganden beinhalten. Der Ligand muss amphoter sein, falls man wünscht, zu einer entgegengesetzten Art von Ladung auf dem Liganden umzuschalten, beispielsweise, um dieselbe Art von Ladung auf der Substanz und auf dem Linganden zu erreichen.
Der Ligand
Der Ionenaustausch-Ligand kann ein Mischmodus-Anionen- oder ein Kationenaustausch-Ligand sein. Der Ligand kann beide Arten von Ladung enthalten, solange, wie die Nettoladung für einen Kationenaustausch-Liganden negativ und für einen Anionenaustausch-Liganden positiv ist.
Anionenaustausch-Liganden umfassen typischerweise eine geladene Gruppe, ausgewählt unter:

(a) Ammoniumgruppe, wie primäre Ammonium-, sekundäre Ammonuim-, tertiäre Ammonium-, quaternäre Ammonium- und Amidiniumgruppe;
(b) Sulfonium.

Heteroaromatische Gruppen, in denen sich ein Stickstoffatom in dem aromatischen Ring befindet, sind in dem Begriff „tertiäre Ammonium"-Gruppen eingeschlossen. Auf dieselbe Weise sind N-alkylierte Formen derartiger heteroaromatischer Gruppen in „quaternäre Ammonium"- Gruppen eingeschlossen.
Kationenaustausch-Liganden umfassen typischerweise eine geladene Gruppe, ausgewählt unter

(c) Carboxylat (-COO^–), Phosphonat oder Phosphat (-PO₃ ^2–, -P(OH)O₂ ^–, beziehungsweise -OP(OH)O₂ ^–, -OPO₃ ^2–) Sulfonat oder Sulfat (-SO₃ ^– beziehungsweise -OSO₃ ^–), -Aryl-O^– (Phenolat/Arylolat) etc.

Die freie Bindung (Valenz) bindet direkt an einen Kohlenstoff, der Teil einer Kette ist, die die Gruppe der Basismatrix bindet.
Es wurde kürzlich gefunden, dass Ionenaustausch-Liganden, die vom Mischmodus oder vom bimodalen Typ sind, extrem hohe Durchbruchskapazitäten bei relativ hohen Ionenstärken ergeben können. Siehe unsere parallel anhängigen internationalen Patentanmeldungen (PCT/EP00/11605 Amersham Pharmacia Biotech AB) und PCT/EP00/11606 (Amersham Pharmacia Biotech AB) (beide Anionenautauschliganden) und SE 0002688-0, eingereicht am 17. Juli 2000 (Kationenaustausch-Liganden). Siehe auch unsere parallel anhängige SE-Anmeldung „A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents", die auf sogenannte stochastische Ionenaustauscher fokussiert ist und parallel mit dieser Anmeldung eingereicht worden ist.
Mit den Begriffen „ein Mischmodusligand" und ein „bimodaler Ligand" ist gemeint, dass ein Ligand fähig ist, mindestens zwei verschiedene, aber kooperative Stellen bereitzustellen, die mit der zu bindenden Substanz wechselwirken. Die Stellen sind unterschiedlich im Hinblick auf Funktionalität und/oder die Art.
Typische Mischmodus-Ionenaustausch-Liganden besitzen ein, zwei, drei, vier oder mehr Atome oder Gruppen, die fähig sind, an anziehenden Wechselwirkungen mit der auf dem Ionenaustauscher zu adsorbierenden Substanz im Schritt (i) teilzunehmen. Diese Atome oder Gruppen sind bevorzugt höchstens in einer Distanz von sieben Atomen vom geladenen Atom oder der geladenen Gruppe angeordnet. Hydrophobe Wechselwirkungen und Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen sind Beispiele von anziehenden Wechselwirkungen.
Eine rein hydrophobe Wechselwirkung findet typischerweise zwischen einer Kohlenwasserstoffstruktur in dem Liganden und hydrophoben Bereichen in der Substanz statt. Typische hydrophobe Strukturen umfassen eine aromatische Struktur und/oder zwei, drei, vier oder mehr sp-, sp²- und/oder sp³-hybridisierte Kohlenstoffatome, die miteinander verbunden sind. In der letzteren Variante bindet jedes Kohlenstoffatom an ein anderes Kohlenstoffatom und möglicherweise auch an ein oder mehrere Wasserstoffatome. So sind die bevorzugten Strukturen dieser Art reine Alkylgruppen, reine Alkenylgruppen, reine Aryl-, reine Aralkyl-, reine Alkylarylgruppen, reine Alkenylgruppen etc, umfassend 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Kohlenstoffatome, und entsprechende Gruppen mit zwei oder mehr freien Bindungen (Valenzen).
Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen erfordern typischerweise ein/eine Elektronen-Akzeptoratom oder -Gruppe in dem Liganden und einen/eine Elektronen- Donatoratom oder -Gruppe in der Substanz, oder vice versa. Diese Art der Wechselwirkung umfasst Wasserstoffbrückenbindung, π-π, charge transfer, etc. Siehe Karger et al., „An Introduction into Separation Science", John Wiley & Sons (1973) Seite 42 für eine Diskussion über Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen.
Veranschaulichende Beispiele von Elektronen-Donator-Atomen/Gruppen sind:

(a) Sauerstoff mit einem freien Paar von Elektronen, wie in Hydroxy, Ethern, Carbonylen und Estern (-O- und -CO-O-) und Amiden,
(b) Schwefel mit einem freien Elektronenpaar, wie in Thioethern (-S-),
(c) Stickstoff mit einem freien Paar von Elektronen, wie in Cyano, Aminen, Amiden einschließlich Sufonamide, Carbamide, Carbamate, Amidine, etc,
(d) Halogen (Fluor, Chlor, Brom und Jod), und
(e) sp- und sp²-hybridisierte Kohlenstoffe.

Typische Elektronen-Akzeptor-Atome/Gruppen sind elektronenarme Atome oder Gruppen, wie Metallionen, Cyano, Stickstoff in Nitro etc, und umfassen auch eine Wasserstoffbrückenbindung an ein elektronegatives Atom, wie in HO- in Hydroxy und Carboxy, -NH- in Amiden und Aminen, HS- in Thiol etc.
Atome, oder Gruppen, die an einer Mischmoduswechselwirkung mit der zu adsorbierenden Substanz teilnehmen, können vorhanden sein in

– der Kette, die das/die geladene Atom oder Gruppe an die Basismatrix bindet,
– eine Verzweigung, die an diese Kette gebunden ist,
– ein getrennter Substituent, der direkt an das/die geladene Atom oder Gruppe gebunden ist (insbesondere für Anionenaustauschgruppen/Liganden).

Ein/Eine Elektronen-Donator-Akzeptor-Atom oder -Gruppe kann in einer Verzweigung vorhanden sein, die an die Kette gebunden ist, die den Liganden an die Basismatrix und in einer Entfernung von sieben oder mehr Atomen vom geladenen Atom oder der geladenen Gruppe bindet. In einen derartigen Fall wird die vollständige Verzweigung als ein getrennter Ligand betrachtet.
Besonders interessante geladene Mischmodus-Liganden besitzen ein Thioether (-S-) und/oder einen sp²-hybridisierten Kohlenstoff, wie ein aromatischer Kohlenstoff, innerhalb der oben erwähnten Abstände des geladenen Atoms oder Gruppen. Hier zum Beispiel unsere parallel anhängigen internationalen Patentanmeldungen PCT/EP00/11605 (Amersham Pharmacia Biotech AB) und PCT/EP00/11606 (Amersham Pharmacia Biotech AB) (von denen beide sich auf einen Ionenaustausch-Liganden beziehen), SE 0002688-0, eingereicht am 17. Juli 2000 (Kationenaustausch-Liganden) und WO 996507 (Amersham Pharmacia Biotech AB) (Kationenaustausch-Liganden). WO 9729825 ( US 6,090,288 ) (Amersham Pharmacia Biotech AB) offenbart Mischmodus- Anionenaustausch-Liganden, die zwei oder mehr Hydroxy und/oder Amino/Ammonium-Stickstoff an einer Position von 2-3 Kohlenstoffen von einem primären, sekundären oder tertiären Ammoniumstickstoff besitzen. Mischmodus-Ionenaustausch-Liganden, die gegebenenfalls in dem vorliegenden innovativen Verfahren nützlich sind, sind beschrieben in WO 9808603 (Upfront Chromatography), WO 9600735, WO 9609116 und US 5,652,348 (Burton et al).
In den Thioethern (-S-), die oben in Betracht gezogen wurden, bindet jede der freien Bindungen (Valenzen) an sp²- oder sp³-hybridisierten Kohlenstoff, der Teil einer zyklischen Struktur sein kann oder nicht sein kann, die aromatisch oder nichtaromatisch kann oder nicht sein kann. Der Begriff „Thioether", wie hier in Betracht gezogen, umfasst daher Thiophen und andere heteroaromatische Ringe, die Schwefel als ein Ringatom umfassen.
Die aromatische Ringstruktur, die oben in Betracht gezogen wurde, kann eine oder mehr aromatische Ringe umfassen, beispielsweise ein Phenyl, ein Biphenyl oder eine Naphthylstruktur oder andere aromatische Ringsysteme, die einzelne Ringe, kondensierte Ringe und/oder bizyklische Strukturen umfassen. Aromatische Ringe können heterozyklisch sein, d. h. sie können einen oder mehr Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome enthalten, und können Substituenten besitzen. Substituenten können eine reine Kohlenwasserstoffgruppe enthalten, wie oben diskutiert, und/oder ein/eine Elektronen-Donator- oder Akzeptor-Atom oder Gruppe, die beispielsweise die Wasserstoffbrückenbindung und/oder andere Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen ermöglicht. Veranschaulichende aromatische Ringstrukturen sind: Hydoxyphenyl (2-, 3- und 4-), 2-Benzimadozolyl, Methylthioxyphenyl (2-, 3- und 4-) 3-Indolyl, 2-Hydroxy-5-nitrophenyl, Aminophenyl (2-, 3- und 4-), 4-(2-Aminoethyl)phenyl, 3,4-Dihydroxyphenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 4-Imidazolyl, 4-Aminopyridine, 6-Aminopyrimidyl, 2-Thienyl, 2,4,5-Triaminophenyl, 4-Aminotriazinyl-, 4-Sulfonamidophenyl etc.
Der pKa der bevorzugten Anionenaustausch-Liganden und der entsprechenden Säuren für die bevorzugten Kationenaustausch-Liganden können in dem Intervall von 3 und aufwärts gefunden werden und liegt bevorzugt unter 11, bevorzugt im Intervall von 4-9, um ein geeignetes Entladen des Ionenaustausch-Liganden zu ermöglichen.
Besonders interessante Anionenaustausch-Liganden besitzen eine pH-abhängige Ladung und besitzen pKa-Werte, die ≤ 12,0, wie ≤ 10,5, betragen. Dies bedeutet, dass diese Liganden eine geladene Gruppe umfassen, die bevorzugt ausgewählt ist unter primären oder sekundären Ammoniumgruppen oder tertiären Ammoniumgruppen. Tertiäre Ammoniumgruppen, in denen der Stickstoff Teil einer aromatischen Struktur ist, und Ammoniumgruppen, die einen aromatischen Kohlenstoff in ihrer α- oder β-Position besitzen, können pKa-Werte unter 8 besitzen. Normalerweise beträgt der pKa von Anionenaustausch-Liganden ≥ 3, wie ≥ 4.
Besonders interessante negativ geladene Liganden tragen eine pH-abhängige Ladung. Die pKa-Werte für die entsprechenden Säuren betragen normalerweise ≥ 3, wie ≥ 4. Diese Typen von Liganden sollten daher geladene Gruppen umfassen, die ausgewählt sind unter Carboxylat (-COO-), Phosphonat oder Phosphat (-PO₃ ^2–, -P(OH)O₂ ^–, beziehungsweise -OP(OH)O₂ ^–, -OPO₃ ^2–), -Aryl-O^– (Phenolat/Aryloat) und andere schwache Säuregruppen.
Dieses schließt nicht aus, dass Ionenaustausch-Liganden, die entsprechen

– starken Säuren (pKa ≤ 3, wie ≤ 2 oder ≤ 0) (die entsprechende Base wirkt als ein Kationenaustausch-Ligand), und
– schwache Säuren (pKa ≥ 10, wie ≥ 12 etc.) oder Liganden, die eine Ladung tragen, die unabhängig ist von pH

Der pKa-Wert eines Liganden wird verstanden als der pH, bei dem 50% des Liganden, der in Frage steht, titriert sind.
Stochastische Ionenaustauscher
Geeignete Ionenaustauscher, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, können auch zwei oder mehr verschiedene Liganden (Ligand 1, Ligand 2 etc) enthalten. In diesem Fall ist mindestens einer der Liganden (Ligand 1) ein Ionenaustausch-Ligand, der von den anderen Liganden (Ligand 2, beispielsweise) verschieden ist. Dieser Typ von Ionenaustauscher wird stochastisch genannt und ist genau beschrieben in der SE-Anmeldung mit dem Titel „A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents", eingereicht parallel mit dieser Anmeldung.
Ligand 1 kann strukturelle Teile derselben Art wie oben für Ionenaustausch-Liganden im Allgemeinen diskutiert enthalten. Ligand 1 kann oder kann nicht eine pH-abhängige Ladung besitzen, wie oben diskutiert.
Ligand 2 kann ein Ionenaustausch-Ligand oder Ligand sein, der nur durch hydrophobe Wechselwirkung und/oder Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkung mit der zu entsalzenden Substanz wechselwirkt. Falls geladen, kann der Ligand 2 denselben oder den entgegengesetzten Typ von Ladung wie Ligand 1 besitzen.
Ligand 1 und Ligand 2 können sich in Bezug auf das Vorhandensein und die Kombination von Atomen oder Gruppen unterscheiden, die hydrophobe und/oder Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen mit der zu adsorbierenden Substanz ergeben. Siehe oben.
Ligand 2 kann bei den Bedingungen ungeladen sein, die durch die Flüssigkeit (I) bereitgestellt werden. Es gibt hauptsächlich zwei Arten von ungeladenen Liganden:

(a) Liganden, die durch einen pH-Schalter (Klasse I) geladen werden können und
(b) Liganden, die nicht durch einen pH-Schalter (Klasse II) geladen werden können.

Klasse I umfasst ungeladene Formen von Liganden, die eine pH-abhängige Ladung besitzen können. Siehe oben.
Ein KlasseII-Ligand enthält eines oder mehrere strukturelle Elemente, die zu hydrophoben Wechselwirkungen und Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen, wie oben diskutiert, Anlass geben können. In einem typischen KlasseII-Liganden gibt es zwei, drei, vier oder mehr Elektronen-Donator-Akzeptor-Atome oder -Gruppen, wie oben definiert. Jedes/jede der Atome oder Gruppen ist getrennt von anderen Elektronen-Donator-Akzeptor-Atomen oder -Gruppen durch zwei, drei, vier oder mehr sp³-hybridisierte Kohlenstoffatomen, die direkt aneinander gebunden sind. Ein Ligand der Klasse II ist definiert als der äußerste Teil einer Gruppe, der von der Basismatrix hervorsteht und mit der Definition in dem vorhergehenden Paragraph übereinstimmt. Mit dem Begriff „äußerst" sind Atome in Betracht gezogen, die sich in einer Entfernung von 1-7 Atomen vom äußersten Atom befinden, das fähig ist, an Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechelwirkungen oder an hydrophoben Wechsel-wirkungen teilzunehmen, die eine Alkylgruppe wie oben definiert beinhalten.
Alle Liganden der 2. Kategorie können daher verwendet werden als Ligand 2 in den Ionenaustauschern, vorrausgesetzt, dass der Ligand zwei oder mehr Atome umfasst, der Elektronen-Donator-Akzeptor-Wechselwirkungen und/oder hydrophobe Wechselwirkungen ermöglicht. Beispiele von Atomen und/oder Gruppen, die vorhanden sein können, sind: Aryle, die substituiert oder unsubstituiert sein können, einschließlich Phenylgruppen, reines Alkyl und reines Alkylen (C₃ und höher mit einer Präferenz für weniger als C₈), Thiother, Ether, ungeladenes Amino, Hydroxy, Amido (Carboxamido, einschließlich Sulfonamido, Carbamido, Carbamat etc), Nitro, Sulfon, ungeladenes Carboxy etc. In dieser Art von Liganden trennen zwei oder mehr sp³-hybridisierte Kohlenstoffatome, die direkt miteinander verbunden sind, oft die Atome oder Gruppen voneinander.
Die unterschiedlichen Liganden in stochastischen Ionenaustauschern können mehr oder weniger willkürlich in Relation zueinander in der Trägermatrix oder in einem Teil davon vorhanden sein. Abhängig von dem Verfahren des Einführens kann das Verhältnis zwischen Mengen der Liganden variieren, sollte aber immer 0,01-100 betragen, mit einer Präferenz von 0,02-50, für mindestens zwei Liganden in einem wesentlichen Teil der Matrix. Um eine ungleichmäßige oder geschichtete Verteilung verschiedener Liganden innerhalb eines Trägers zu erreichen, können die allgemeinen Prinzipien, die in WO 9839364 (Amersham Pharmacia Biotech AB) dargelegt sind, verwendet werden. Gebührende Sorgfalt muss ausgeübt werden im Hinblick auf Reaktivitäten, Diffusionsfähigkeiten und Konzentrationen von Liganden- bildenden Reagenzien, so dass die scharten Schichten, die das primäre Ziel in diesen zwei Patentveröffentlichungen sind, nicht eingeführt werden.
In stochastischen Ionenaustauschern gilt folgendes

– Liganden, die durch die Verwendung desselben Reagenz und derselben Bedingungen einführt werden, zum Beispiel parallel während derselben Bedingungen, werden als von derselben Art betrachtet, sogar falls sie strukturell unterschiedlich sind. Dies gilt insbesondere, falls unterschiedliche Isomere zur gleichen Zeit eingeführt werden.
– Liganden, die Restgruppen sind (nicht-reagierte Gruppen), sogar nach der Verwendung großer Überschüsse derivatisierender Reagenzien, um ihr Vorhandensein zu minimieren, werden als nichtexistierend betrachtet. Typische Restgruppen sind in molaren Mengen von weniger als 10%, wie beispielsweise weniger als 5%, im Vergleich zu der Ausgangsmenge der zu derivatisierenden Gruppe vorhanden.

Besonders interessante stochastische Ionenaustauscher umfassen als Ligand 1 einen starken Ionenaustausch-Liganden und als Ligand 2 einen Liganden, der geladen/entladen werden kann durch einen Schalter im pH. Zwei typische Kombinationen sind:

(a) Ein starker Kationenaustausch-Ligand als Ligand 1, kombiniert mit einem schwachen Anionenaustausch-Ligand als Ligand 2, oder
(b) ein starker Anionenaustausch-Ligand als Ligand 1 und ein schwacher Kationenaustausch-Ligand als Ligand 2.

In diesem Kontext besitzt ein starker Kationenaustausch-Ligand eine entsprechende Säure mit einem pKa < 3-4. Beispiele von starken Anionenaustausch-Liganden sind quaternäre Austauschliganden und Anionenaustausch-Liganden mit einem pKa > 10 wie ≥ 11 oder ≥ 12. Andere Arten von Ionenaustausch-Liganden werden als schwach betrachtet.
Andere interessante Kombinationen sind zum Beispiel stochastische Ionenaustauscher mit zwei verschiedenen schwachen Anionen- oder Kationenaustausch-Liganden von ähnlichem pKa auf derselben Basismatrix, oder einem schwachen Anionen- oder einem schwachen Kationenaustausch-Liganden, die an dieselbe Matrix gebunden sind. Die Liganden können derart ausgewählt sein, dass die Differenz in den pKas geringer ist als, größer ist als oder gleich ist zwei, drei oder vier pH-Einheiten.
Die größten Vorteile des Kombinierens von Liganden unterschiedlicher Art betreffen das Entsalzen von amphoteren Substanzen. Die Liganden werden typischerweise auf eine derartige Weise kombiniert, dass einer der Liganden geladen ist (Ligand 1), während der andere (Ligand 2) ungeladen ist während des Schrittes (i) und fähig ist, mit derselben Ladung wie die während des Schritts (ii) freizusetzende Substanz geladen zu werden. Es folgt, dass die genaue Kombination von dem isoelektrischen Punkt (pI) der zu entsalzenden Substanz abhängen wird. Siehe weiter unten.
Trägermatrix/Basismatrix
Die Trägermatrix umfasst die Basismatrix und einen beliebigen Spacer, der einen Liganden an die Basismatrix bindet.
Die Basismatrix basiert auf einem organischen und/oder anorganischen Material.
Die Basismatrix ist bevorzugt hydrophil und in der Form eines Polymers, das unlöslich und mehr oder weniger quellfähig in Wasser ist. Hydrophobe Polymere, die derivatisiert worden sind, um hydrophil zu werden, sind in dieser Definition eingeschlossen. Geeignete Polymere sind Polyhydroxypolymere, z. B. die auf Polysacchariden, wie Agarose, Dextran, Cellulose, Stärke, Pullulan, etc. basieren, und vollständig synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Poly(hydroxyalkylvinylether), Poly(hydroxyalkylacrylate) und Polymethacrylate (z. B. Polyglycidylmethacrylat), Polyvinylalkohole und Polymere, die auf Styrolen und Divinylbenzolen basieren, und Copolymere, in denen zwei oder mehr der Monomere, die den oben erwähnten Polymeren entsprechen, eingeschlossen sind. Polymere, die löslich im Wasser sind, können derivatisiert werden, um unlöslich zu werden, z. B. durch Vernetzen und durch Koppeln an einen unlöslichen Körper über Adsorption oder kovalente Bindung. Hydrophile Gruppen können auf hydrophoben Polymeren eingeführt werden (z. B. auf Copolymeren von Monovinyl- und Divinylbenzolen) durch Polymerisation von Monomeren, die Gruppen zeigen, die zu OH umgewandelt werden können, oder durch Hydrophilisierung des schließlichen Polymers, z. B. durch Adsorption geeigneter Verbindungen, wie hydrophile Polymere.
Geeignete anorganische Materialien, die in Basismatrizen verwendet werden sollen, sind Silica, Zirkoniumdioxid, Graphit, Tantaloxid etc.
Bevorzugten Matrizen fehlen Gruppen, die gegen Hydrolyse instabil sind, wie Silan, Ester, Amidgruppen und Gruppen, die in Silica als solche vorhanden sind. Dies gilt insbesondere im Hinblick auf Gruppen, die in direktem Kontakt mit den verwendeten Flüssigkeiten sind.
Die Matrize kann porös oder nicht-porös sein. Dies bedeutet, das die Matrix voll oder teilweise permeabel (porös) oder vollständig impermeabel für die zu entfernende Substanz sein kann (nicht porös), d. h. die Matrix sollte ein Kav im Intervall von 0,40-0,95 für zu entfernende Substanzen besitzen. Dies schließt nicht aus, dass Kav niedriger sein kann, zum Beispiel bis hinunter zu 0,10 oder sogar niedriger für bestimmte Matrizen, zum Beispiel mit Streckmitteln. Siehe zum Beispiel WO 9833572 (Amersham Pharmacia Biotech AB).
In einer besonders interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Matrix in der Form von unregelmäßigen oder kugelförmigen Teilchen vor mit Größen im Bereich von 1-1000 μm, bevorzugt 5-50 μm für Hochleistungsanwendungen und 50-300 μm für präparative Zwecke.
Alternativ kann die Matrix monolithisch sein, wie in der Form eines Röhrchens oder einer anderen Art von Gefäß, eines porösen Stoffes, einer porösen Membran oder eines Filters.
Die Matrix kann in der Form von Kugeln/Teilchen mit einer Dichte vorliegen, die größer ist als die in Schritt (i) verwendete Flüssigkeit. Diese Art von Matrizen ist speziell anwendbar in Betriebsweisen im großen Maßstab für Fließbett oder Expanded-Bed-Chromatographie, wie auch für verschiedene diskontinuierliche Prozeduren, z. B. in gerührten Kesseln. Fließbett- und Expanded-Bed-Prozeduren sind beschrieben in WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB) und WO 9200799 (Kem-En-Tek).
Der Begriff hydrophile Matrix bedeutet, dass die verfügbare Oberfläche der Matrix hydrophil in dem Sinne ist, dass wässrige Flüssigkeiten fähig sind, durch die Matrix zu dringen. Typischerweise zeigen die zugänglichen Oberflächen auf einer hydrophilen Basismatrix eine Mehrzahl von polaren Gruppen, zum Beispiel umfassend Sauerstoff- und/oder Stickstoffatome. Beispiele derartiger polarer Gruppen sind Hydroxyl, Amino, Carboxy, Ester, Ether von niederen Alkylen (wie (-CH₂CH₂O-)_nH, wobei n eine ganze Zahl ist).
Der Spacer beginnt an der Basismatrix und erstreckt sich zum Liganden wie oben definiert.
Der Spacer als solcher ist herkömmlich wie in traditionellen Ionenaustauschern und kann so lineare, verzweigte, zyklisch gesättigte, ungesättigte und aromatische Kohlenwasserstoffgruppen (z. B. mit bis zu 1-20, wie 1-10 Kohlenstoffatomen) umfassen, wie oben diskutiert. Diese Gruppen können reine Kohlenwasserstoffgruppen des oben diskutierten Typs, Hydroxygruppen, Alkoxy und Aryloxy und die entsprechenden Thio-Analoga und/oder Aminogruppen umfassen. Kohlenstoffketten in Kohlenwasserstoffgruppen können an einer oder mehr Positionen von Ethersauerstoff und Thioetherschwefel unterbrochen sein. Es kann auch Carbonylgruppen geben, wie in Amid- und Ketongruppen und andere Gruppen mit der vergleichbaren Stabilität gegen Hydrolyse. Höchstens ein Atom ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff ist bevorzugt gebunden an ein und dasselbe sp³-hybridisierte Kohlenstoffatom.
Es ist offenbar, dass der Spacer eines oder mehrere Elektronen-Donator- oder -Akzeptor-Atome oder Gruppen bereitstellen kann, die das Binden der erwünschten Substanz an den Ionenaustauscher wie oben erwähnt verstärken, zum Beispiel durch Teilnehmen an der Wasserstoffbrückenbindung. Aus Gründen der Einfachheit wird diese Art von Atomen oder Gruppen als Teil des Spacers betrachtet. Es kann auch mehr als ein Ligand an ein und dieselben Spacer gebunden sein. Siehe „Verzweigungen" oben.
Ligandendichte
Der Gehalt der Ionenaustausch-Liganden der in der Erfindung verwendeten Adsorbentien wird üblicherweise im Intervall von 0,001-4 mmol/ml der Matrix ausgewählt, wie 0,002-0,5 mmol/ml der Matrix, mit einer Bevorzugung von 0,005-0,3 mmol/ml der Matrix. Bevorzugte Bereiche sind unter anderem bestimmt durch die Art der Matrix, die Art des Liganden, die zu adsorbierende Substanz etc. Der Ausdruck „mmol pro ml der Matrix" bezieht sich auf vollständig sedimentierte Matrizen, die mit Wasser gesättigt sind. Der Ligandendichtebereich bezieht sich auf die Kapazität der Matrix in vollständig protonierter/geladener Form, um übliche Gegenionen, wie Natriumionen und/oder Chloridionen zu binden und hängt von der Art der anionischen und/oder kationischen Liganden ab, der vorhanden ist, unter anderem.
Bester Modus
Die Varianten des besten Modus der Erfindung variieren mit der Substanz von Interesse. Die besten Modi, die bisher erkannt wurden, werden im experimentellen Teil präsentiert.
Adsorption/Desorption
Die Adsorption- und/oder Desorptionsschritte (Schritt (i) und Schritt (ii)) können ausgeführt werden als eine chromatographische Prozedur, wobei die Ionenaustauschmatrix in einer monolithischen Form oder als Teilchen in der Form eines gepackten oder eines Fließbettes vorliegen. Für teilchenförmige Matrizen können diese Schritte auch in einem diskontinuierlichen Modus ausgeführt werden, wobei die Teilchen mehr oder weniger vollständig in der Flüssigkeit dispergiert sind.
Die in Schritten (i) und (ii) verwendeten Flüssigkeiten sind wässrig, d. h. Wasser, möglicherweise gemischt mit einem Wasser-mischbaren Lösungsmittel.
Adsorption (Schritt (i))
Während der Adsorption wird eine flüssige Probe, die die geladene Substanz enthält, mit dem oben definierten Ionenaustauscher unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Adsorption (Bindung) ermöglichen z. B. durch Ionenaustausch. In anderen Worten trägt die Substanz mindestens eine/ein Gruppe oder Atom, das gegensätzlich geladen ist im Vergleich zum Ionenaustausch-Liganden/Ionenaustauscher.
Bevorzugt ist die Nettoladung der Substanz entgegengesetzt zu der Nettoladung des Ionenaustauschers während des Schrittes (i). Für eine amphotere Substanz bedeutet dies, dass der pH für Ionenaustauschbedingungen ≥ pI – 0,5 beträgt, bevorzugt ≥ pI, und für Kationenaustauschbedingungen ≤ pI + 0,5, bevorzugt ≤ pI.
Einer der Nutzen der Erfindung ist, dass es möglich sein wird, eine Adsorption/Bindung auch bei erhöhten Ionenstärken im Vergleich dazu auszuführen, was normalerweise für herkömmliche Ionenaustauscher durchgeführt wurde (z. B. die Referenz-Anionenaustauscher wie oben definiert). In absoluten Zahlen bedeutet dies, dass eine Adsorbtion gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden kann bei Ionenstärken oberhalb oder unter 15 oder 20 mS/cm. Die Ionenstärke kann 30 mS/cm überschreiten und in einigen Fällen 40 mS/cm sogar überschreiten. Die Ionenstärke entspricht NaCl-Konzentrationen (reines Wasser) ≥ 0,1 M, wie ≥ 0,3 M oder sogar ≥ 0,5 M. Die zu verwendende/verwendenden Leitfähigkeit/Ionenstärken werden von den kombinierten Liganden, ihrer Dichten auf der Matrix, die zu bindende Substanz und ihrer Konzentration etc. abhängen.
Desorption (Schritt (ii))
Der Desorptionsprozess, d. h. das Ersetzen der Flüssigkeit (I) durch die Flüssigkeit (II), umfasst Ändern des pH, um die Wechselwirkung zwischen der erwünschten Substanz und den Liganden zu schwächen. Zur selben Zeit wird die Ionenstärke oder Salzkonzentration vermindert, bevorzugt auf ein Niveau derart, dass das einzige vorhandene Salz die Pufferkomponenten bildet und, falls benötigt, auch ihre nicht-puffernden Gegenionen.
Ein Schwächen der Wechselwirkung durch eine Änderung im pH umfasst (a) Vermindern der Ladung von Liganden, die über anziehende Ionen-Ionen-Wechselwirkung an die erwünschte Substanz binden, und/oder (b) Vermindern der Ladung einer Gruppe auf der erwünschten Substanz, die an einen Liganden mit der entgegengesetzten Ladung bindet. Die pH-Änderung kann viele Male unternommen werden soweit, dass der Ligand und die zu entsalzende Substanz dieselbe Ladung während des Schrittes (ii) besitzen.
Die Änderung im pH in Schritt (ii) bedeutet, das eine beträchtlich verringerte Ionenstärke erforderlich sein wird im Vergleich zur Ionenstärke der Flüssigkeiten (I) in Schritt (i). Die Substanz kann so in konzentrierter Form in einer Lösung niedriger Konzentration des Salzes eluiert werden, z. B. ≤ 100 mM oder sogar ≤ 10 mM. Der Konzentrationsfaktor kann von derselben Größe sein wie unter den Aufgaben der Erfindung angegeben.
Im Falle, dass der Adsorptionsschritt unter Anionenaustauschbedingungen ausgeführt worden ist, liegt der geeignete pH in Schritt (ii) unter pI + 2 oder unter pI + 1, mit einer Präferenz für pH ≤ pI.
Im Falle, dass der Adsorptionsschritt unter Kationenaustauschbedingungen ausgeführt worden ist, soll der geeignete pH in Schritt (ii) oberhalb pI – 2 oder oberhalb pI – 1 liegen, mit einer Präferenz für pH ≥ pI.
Der Begriff pI in den vorstehenden zwei Paragraphen bezieht sich auf den pI der zu desorbierenden (entsalzenden) Substanz.
Typische Salze, die zum Ändern der Ionenstärke verwendet werden sollen, sind ausgewählt unter Chloriden, Phosphaten, Sulfaten etc. von Alkalimetallen oder Ammoniumionen.
Typische Pufferkomponenten, die zum Ändern des pH verwendet werden sollen, hängen von der Art der involvierten Liganden ab. Zum Beispiel, falls der Ionenaustausch-Ligand kationisch ist, ist das puffernde Säure-Base-Paar bevorzugt unter Säure-Base-Paaren ausgewählt, in denen die Pufferkomponenten nicht an den Liganden binden können, d. h. Puffer, die auf Piperazin, 1,3-Diaminopropan, Ethanolamin etc. basieren. In der analogen Weise ist das puffernde Säure-Base-Paar im Falle des Ionenaustausch-Liganden anionisch und ist Phosphat, Citrat, Acetat, etc.
Die bevorzugten puffernden Säure-Base-Paare enthalten mindestens eine puffernde Komponente, die (die Säure oder die Base) die flüchtig und/oder ungeladen ist. Dies wird bedeuten, dass die Pufferkomponenten einfach durch Verdampfen nach dem Schritt (ii) entfernt werden können. Flüchtige Pufferkomponenten besitzen typischerweise einen Dampfdruck, der ≥ 1 mm Hg ist, wie ≥ 10 mm Hg, bei 25°C.
Desorption wird unterstützt durch Einstellen der Polarität der Flüssigkeit (II) auf einen Wert, der geringer ist als die Polarität der Adsorptionsflüssigkeit (I). Dies wird erreicht durch Einführen eines wassermischbaren und/oder weniger hydrophilen organischen Lösungsmittel in der Flüssigkeit (II). Beispiele derartiger Lösungsmittel sind Aceton, Metanol, Ethanol, Propanole, Butanole, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Acrylonitril etc. Eine Abnahme in der Polarität der Flüssigkeit (II) (im Vergleich zur wässrigen Flüssigkeit (I)) unterstützt wahrscheinlich die Desorption und verringert so auch wahrscheinlich die Ionenstärke, die zum Freisetzen der Substanz von der Matrix benötigt wird. Das organische Lösungsmittel ist flüchtig mit einem Dampfdruck ≥ 1 mm Hg, beispielsweise ≥ 10 mm Hg, bei 25°C.
Die Desorption kann auch unterstützt werden durch Einführen eines löslichen strukturellen Analogons von einem oder mehreren der verwendeten Liganden. Die Konzentration eines strukturellen Analogons in Flüssigkeit (II) sollte größer sein als seine Konzentration in der wässrigen Flüssigkeit (I). Ein „strukturelles Analogon des Liganden" oder ein „Ligandenanalogon" ist eine Substanz, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem Liganden besitzt und in löslicher Form fähig ist, ein Binden zwischen dem Liganden und der zu entfernenden Substanz zu inhibieren. Strukturelle Liganden-Analoga, wenn sie für die Desorption verwendet werden, sollten neutral und bevorzugt flüchtig sein, wie definiert für ein organisches Lösungsmittel.
Desorption durch eine pH-Änderung kann auch durch einen Anstieg in der Ionenstärke (Zugabe von Salz) unterstützt werden, vorrausgesetzt, dass er nicht die Hälfte der Ionenstärke der Flüssigkeit (I) überschreitet.
Die Änderung der Flüssigkeit (I) zur Flüssigkeit (II) kann erreicht werden in einem oder mehreren Schritten (schrittweise Gradient) oder kontinuierlich (kontinuierlicher Gradient). Die verschiedenen Variablen der Flüssigkeit, die in Kontakt mit der Matrix stehen, können eine nach der anderen oder in Kombination geändert werden. Dies bedeutet, dass die erwünschte Substanz viele Male eluiert werden kann frei von anderen adsorbierten Substanzen, die bei anderen pH-Werten und/oder Ionenstärken eluieren.
Wichtige Varianten, die stochastische Ionenaustauscher nutzen
Variante 1: Ligand 1 ist ein Kationenaustausch-Ligand, der eine pH-abhängige negative Ladung besitzt, und Ligand 2 ist entweder unladbar oder eine ladbare Base, für die ein beträchtlicher Teil beim pH des Schrittes (i) ungeladen ist. Der pKa der Säure, die dem Liganden 1 entspricht, ist niedriger als der pKa der Säure, die dem Liganden 2 entspricht (falls ladbar). Die zu adsorbierende Substanz hat einen pI, der oberhalb des pKa des Liganden 2 liegt. Der pH der Flüssigkeit (I) ist derart ausgewählt, dass die Substanz eine positive Nettoladung besitzt, d. h. auf dem Ionenaustauscher adsorbieren wird. Durch Verringern des pH wird die Substanz und möglicherweise auch der Ligand 2 protoniert werden und eine vergrößerte positive Ladung erhalten. Dies wird die Freisetzung des Substrats bei einem moderaten pH unterstützen und wird die Desorption bei einer verringerten Salzkonzentration in der Flüssigkeit (II) ermöglichen.
Variante 2: Ligand 1 umfasst einen Anionenaustausch-Liganden, der eine pH-abhängige positive Ladung besitzt, und der Ligand 2 ist entweder vollständig unladbar oder eine ladbare Säureform, für die ein beträchtlicher Teil bei dem pH des Schritts (i) ungeladen ist. Der pKa des Liganden 2 ist höher als der pKa des Liganden 1. Der pI der zu adsorbierenden (entsalzenden) Substanz liegt unterhalb sowohl dem pKa des Liganden 1 als auch dem pKa des Liganden 2. Der pH der Flüssigkeit (I) (Schritt (i)) ist derart, dass die Substanz eine negative Nettoladung und der Ligand 1 eine positive Ladung besitzt, während der Ligand 2 im Wesentlichen ungeladen ist. Die Substanz wird so im Schritt (i) adsorbiert werden. Durch Vergrößern des pH wird der Ligand 2 negativ geladen werden, was eine Desorption der Substanz bei einer verringerten Salzkonzentration in der Flüssigkeit (II) bedeutet.
Wiedergewinnung
Das vorliegende erfindungsgemäße Entsalzungsverfahren ermöglicht hohe Wiedergewinnungen einer adsorbierten Substanz, zum Beispiel Wiedergewinnungen oberhalb 60%, wie oberhalb 80% oder oberhalb 90% (Schritt (i) bis Schritt (ii)). Die Wiedergewinnung kann 95% überschreiten oder im Wesentlichen quantitativ sein. Typischerweise liegt die Menge der auf dem Ionenaustauscher aufgebrachten Substanz im Intervall von 10-80%, wie 20-60%, der Gesamtbindungskapazität des Ionenaustauschers für die Substanz.
Die von der Flüssigkeit (I) zu entfernende Substanz
Die vorliegende Erfindung ist vorwiegend gedacht für Substanzen eines großen Molekulargewichts, die mehrere strukturelle Einheiten besitzen, die mit den oben definierten Liganden wechselwirken können. Geeignete Substanzen besitzen ein Molekulargewicht, das oberhalb 1000 Dalton liegt, und sind bio-organisch und polymer. Die Anzahl von geladenen Gruppen pro Molekül beträgt typischerweise eins oder mehr und hängt vom pH ab. Weitere Bemerkungen betreffend des Molekulargewichts und die Anzahl von Ladungen sind gegeben unter dem Titel „Technisches Gebiet". Die Substanzen können amphoter sein. Die Substanzen umfassen typischerweise eine Struktur, ausgewählt unter einer Peptitstruktur (zum Beispiel Oligo- oder Polypeptidstruktur), Nukleinsäurestruktur, Kohlenhydratstruktur, Lipidstruktur, Steroidstruktur, Aminosäurestruktur, Nukleotidstruktur und eine beliebige andere bio-organische Struktur, die geladen ist oder durch einen pH-Schalter geladen werden kann.
Die Substanz kann in dem wässrigen Medium aufgelöst werden oder in der Form von kleinen Bio-Teilchen vorliegen, beispielsweise von kolloidalen Dimensionen. Veranschaulichende Beispiele von Bio-Teilchen sind Viren, Zellen (einschließlich Bakterien und andere einzellige Organismen) und Zellaggregate und Teile von Zellen, einschließlich Zellorganellen.
Es wird geglaubt, dass die Erfindung besonders anwendbar sein wird auf wässrige Flüssigkeiten, die von biologischen Fluiden abgeleitet werden, umfassend eine Substanz von Interesse zusammen mit hohen Konzentrationen von Salzen.
Typische Flüssigkeiten hoher Ionenstärke, die bio-organische Substanzen der oben diskutierten Art enthalten, sind Fermentationsnährlösungen/flüssigkeiten, zum Beispiel von der Kultivierung von Zellen, und Flüssigkeiten, die davon abgeleitet sind. Die Zellen können von einem Wirbeltier, wie einem Säugetier, oder einem wirbellosen Tier (zum Beispiel kultivierte Insektenzellen, wie Zellen von Schmetterlingen und/oder ihre Larven), oder einer Mikrobe (z. B. kultivierte Pilze, Bakterien, Hefe etc) stammen. Eingeschlossen sind auch Pflanzenzellen und andere Arten von lebenden Zellen, bevorzugt kultiviert.
In dem Falle, dass die Flüssigkeit (I) auch unerwünschte teilchenförmige Materie enthält, kann es günstig sein, eine Expanded-Bed-Technologie zu nutzen. Dies gilt insbesondere, wenn die Flüssigkeit (I) von (a) einer Fermentationsnährlösung/flüssigkeit von der Kultur von Zellen, (b) einer Flüssigkeit, die lysierte Zellen enthält, (c) einer Flüssigkeit, die Zell- und/oder Gewebehomogenate enthält, und (d) Pasten, die von Zellen erhalten sind, stammt.
Die nun beschriebene innovative Entsalzungsprozedur kann verwendet werden wie angegeben in der 2. bis 4. Aufgabe.
Die Erfindung wird nun veranschaulicht mit Patentbeispielen. Die Erfindung ist weiter definiert in den anhängenden Ansprüchen.
Experimenteller Teil
1. Synthese von Ionenaustauschern
Es gibt ein Vielfalt von Verfahren zum Immobilisieren von Liganden-bildenden Verbindungen an Oberflächen (Hermanson, G.T., Mallia, A. K. & Smith, P. K., (Eds.), Immobilisation Affinity Ligand Techniques, Academic Press, INC, 1992.], von denen viele für unseren Zweck anwendbar sind. Im Folgendem werden wir die Verfahren beschreiben, die wir zum Herstellen der neuen Serien schwacher Kationenaustauscher (basierend auf Carbonsäuren) herangezogen haben, um als Beispiele zu dienen. Als Basismatrix haben wir Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) verwendet, die kugelförmige Agarose ist, die mit Epichlorhydrin vernetzt worden ist.
1.1. Aktivierung von Sepharose 6 Fast Flow mit Allylgycidylether
Die Aktivierung wird ausgeführt durch Umsetzen von Allylglycidylether mit Sepharose 6 Fast Flow unter alkalischen Bedingungen, im Wesentlichen wie beschrieben in WO 97/29825 (Amersham Pharmacia Biotech AB). In einem geeigneten Reaktionsgefäß wurden 80g Sepharose 6 Fast Flow mit 0,5 g NaBH₄, 13 g Na₂SO₄ und 40 ml 50%-iger (g/g) wässriger Lösung von NaOH gemischt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 50°C gerührt und 100 ml Allylglycidylether wurde zugegeben. Die Suspension wurde für zusätzliche 18 h bei 50°C gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Gel sukzessive mit 500 ml destilliertem Wasser, 500 ml Ethanol, 200 ml destilliertem Wasser, 200 ml 0,2 M Essigsäure und schließlich mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Eine Analyse durch Titration führte zu einem Grad der Substitution von 0,3 mmol Allylgruppen/ml Gels. Im Folgenden wird die Allylderivatisierte Sepharose 6 Fast Flow als Produkt I bezeichnet werden.
1.2 Einführung von Carboxylgruppen (Alternative 1)
Die Einführung von Carboxylgruppen kann erreicht werden durch Koppeln reaktiver Nucleophile, die Carboxylgruppen enthalten (z. B. Mercaptopropionsäure), an Produkt I. Sie kann auch erreicht werden durch herkömmliche Carboxy-Methylierung von Sepharose 6 Fast Flow mit Chloressigsäure unter alkalischen Bedingungen. Das resultierende Produkt kann verwendet werden als ein Kationenaustauscher als solcher oder als eine Zwischenstufe zum Synthetisieren anderer Kationenaustauscher über eine Amidbindung. Die unten beschriebene Prozedur liefert ein Beispiel zum Koppeln von Mercaptopropionsäure an Produkt I (allylderivatisierte Sepharose 6 Fast Flow).
1.2.1 Aktivierung des Produkts I (allylierte Sepharose 6 Fast Flow)
In einer typischen Prozedur wurde Bromwasser zu einer gerührten Suspension von 100 ml des Produkts I, 4 g Natriumacetat und 100 ml destilliertes Wasser gegeben, bis eine beständige gelbe Farbe erhalten wurde. Die Reduktion von überschüssigem Brom wurde erreicht durch Zugeben von Natriumformiat zur Suspension, bis die matte gelbe Farbe verschwand. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das allyderivatisierte Gel mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen.
1.2.2. Koppeln von Mercaptopropionsäure an das aktivierte Produkt 1
Das aktivierte Gel (Produkt I) wurde in ein Reaktionsgefäß übertragen, gefolgt von einer Mischung von 17,5 ml Mercaptopropionsäure (6 Equivalente pro Allylgruppe) und 50 ml 4 M NaCl. Der pH der Mischung wurde eingestellt auf pH 11,5 mit 50%-iger (g/g) wässriger NaOH, bevor sie zu dem aktivierten Gel gegeben wurde. Die Suspension wurde 18 Stunde lang bei 50°C gerührt und dann filtriert. Das Gel wurde mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen und sein Gehalt von Carboxylgruppen wurde durch Titration bestimmt. Dies ergab einen Grad der Substitution von ungefähr 0,29 mmol COOH Gruppe/ml Gel. Dieses Produkt wird als Produkt II bezeichnet werden.
1.3. Einführung von Carboxylgruppen (Alternative 2)
Dies liefert ein alternatives Verfahren zum Koppeln von Liganden-bildenden Verbindungen (die sowohl Amino- als auch Carboxylfunktionen enthalten) an einen festen Träger über eine Amidbindung. Die Prozedur beinhaltet zwei Schritte und wird unten beschrieben.
1.3.1. Aktivierung von Mercaptopropionsäure-Sepharose 6 Fast Flow (Produkt II) mit N-Hydroxysuccinimid
100 ml Mercaptopropionsäure-Sepharose 6 Fast Flow (Produkt II) wurden sukzessive mit 300 ml 1 M NaCl, 500 ml 0,1 M HCl, 500 ml 50%-igem wässrigen Aceton und 500 ml Aceton gewaschen. Man ließ das Gel absetzen und der Überstand wurde abgesaugt. Das Gel wurde dann quantitativ in ein Reaktionsgefäß übertragen, gefolgt von einer Lösung von 15,2 g N-Hydroxysuccinimid in 80 ml Aceton und einer anderen Lösung von 29,9 g Dicyclohexylcarbodiimid in 80 ml Aceton. Die Aufschlämmung wurde 18 Stunden bei 30°C gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Gel gewaschen (durch Schwerkraftfluss) mit 10 Portionen von 150 ml Isopropanol, während einer Zeitdauer von ungefähr 8 Stunden.
Das Ausmaß der Aktivierung des Produkts II betrug annähernd 75%, wie geschätzt durch Reaktion mit NH₄OH. Das hier erhaltene Produkt (d. h. NHS-aktivierte Mercaptopropionsäure-Sepharose 6 Fast Flow) wird als Produkt III bezeichnet werden.
1.3.2. Koppeln von Thienylserin (Ligand 11) an Produkt III
Die hier dargelegte Prozedur liefert ein Beispiel eines allgemeinen Verfahrens zum Koppeln von Liganden-bildenden Verbindungen über eine Amidbindung. Eine Lösung von Thienylserin (2 g in 8 ml destilliertem Wasser) wurde mit 8 ml 1 M NaHCO₃ und 10 ml Ethanol gemischt und der pH auf pH 8,5 durch vorsichtige Zugabe von 50%-iger wässriger NaOH eingestellt. 25 ml des Produkts III (NHS-aktivierte Mercaptopropionsäure-Sepharose 6 Fast Flow) wurde schnell mit 50 ml eiskalter 1 mM Lösung von HCl auf einem gesinterten Glasstrichter gewaschen. Das Gel wurde dann in einen Erlenmeierkolben übertragen und die Lösung von Thienylserin wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann bei einer moderaten Geschwindigkeit 18 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt.
Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Gel sequenziell mit 100 ml destilliertem Wasser, 50 ml Ethanol, 50 ml 0,25 M wässrigem Ethanolamin, 50 ml destilliertem Wasser, 50 ml 1 M NaCl und schließlich 50 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Der Wirkungsgrad der Kopplung von Thienylserin wurde bestimmt als ungefähr 70% durch Elementarschwefelanalyse, was einem Grad der Substitution von 0,15 mmol Thienylserin pro ml Gel entspricht. Die meisten der verwendeten Kationenaustauscher zum Entsalzen wurden durch dieses Verfahren hergestellt.
2. Chromatographie
In dieser Untersuchung wurden zwei gereinigte Proteine, nämlich menschliches Immunoglobulin (IgG) und Rinderserumalbumin (BSA) verwendet, um die neuen Serien von Kationenaustauscher zum Entsalzen im Hinblick auf zwei wichtige Parameter zu charakterisieren. Diese waren die Durchbruchskapazität (Qb_10%) bei Hoch-Salzbedingungen und die Wiedergewinnung von Proteinen, die auf den erfindungsgemäßen Kationenaustauschern bei Niedrig-Salzbedingungen aufgebracht wurden. IgG wurde bei pH 4,5 unter Verwenden einer mobilen Phase gebunden, die zusätzlich zu den Pufferkomponenten eine relativ hohe Konzentration Salz (0,25 M) enthielt. IgG wurde dann mit 0,10 M Phosphatpuffer, eingestellt auf pH 7,0, eluiert. BSA wurde an pH 4,0 auch bei einer Hoch-Salzbedingung (siehe Pufferlösungen unten) gebunden und durch Anheben des pHs auf 7,0 eluiert, wie in dem Fall von IgG. Die Prozeduren, die zum Bestimmen der Durchbruchskapazitäten für die neuen Serien von Liganden zum Entsalzen verwendet wurden, und die Wiedergewinnung von Proteinen, die an sie gebunden waren, sind unten dargelegt.
2.1. Durchbruchskapazität (Qb_10%) bei „Hoch-Salz"-bedingungen
Eines der Hauptkriterien für einen Kationenaustausch-Liganden, der für eine Entsalzungsprozedur geeignet ist, ist seine Bindungskapazität für Proteine bei Vorhandensein von relativ hohen Konzentrationen von Salz (z. B. 0,25 M NaCl) im Vergleich zu einem Referenzionenaustauscher, der unter identischen Bedingungen betrieben wird. Dies wird bestimmt unter Verwenden des Verfahrens der Frontalanalyse wie unten beschrieben.
2.1.1. Experimentelles
Pufferlösungen

Puffer 1: 20 mM Natriumacetat, 0,25 M Natriumchlorid, pH 4,0
Puffer 2: 20 mM Natriumacetat, 0,25 M Natriumchlorid, pH 4,5
Puffer 3: 100 mM Natriumphosphat, pH 7,0 (für eine Elution von BSA und IgG)

Proteinlösungen

1. BSA: 4 mg/ml in Puffer 1
2. IgG: 4 mg/ml in Puffer 2

Alle Puffer- und Proteinlösungen wurden durch ein 0,45 μm Millipor Millex HA-Filter vor der Verwendung filtriert.
Chromatographiesystem
Alle Experimente wurden ausgeführt bei Raumtemperatur unter Verwenden eines Äkta Explorer 100-Chromatographiesystems, ausgerüstet mit einer Unicorn 3.1 Software. Proben wurden auf die Säulen über eine 150ml-Superloop aufgebracht. Eine Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/min (ca. 300 cm/h) wurde überall verwendet. Die Effluenten wurden kontinuierlich durch Absorbanzmessungen bei 280 nm unter Verwenden einer 10 mm Fließzelle überwacht.
2.1.2. Frontal-Analyse
Jeder Prototyp-Kationenaustauscher wurde in eine HR5/5-Säule (gepacktes Bettenvolumen = 1 ml, Amersham Pharmacia Biotech AB)) gepackt und mit einem Puffer eines/einer geeigneten pH und Salzkonzentration ins Gleichgewicht gebracht. Das Hohlraumvolumen des Systems wurde bestimmt durch Aufbringen einer Lösung eines geeigneten Proteins auf die Säule unter nichtbindenden Bedingungen. Die Zeit, die man brauchte, damit die A₂₈₀ des Effluenten 10% der A₂₈₀ der aufgebrachten Proteinlösung erreichte, wird als das Hohlraumvolumen des Systems (ausgedrückt in Minuten) genommen.
Zu einer Säule, die mit einem geeigneten Puffer (Puffer 1 oder 2) ins Gleichgewicht gebracht worden war, wurde das Probenprotein, aufgelöst in dem geeigneten Equilibrierungspuffer (siehe oben) kontinuierlich (z. B. über eine 150 ml-Superloop) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min (d. h. ca. 300 cm/h) kontinuierlich zugeführt. Die Aufbringung der Probe wurde fortgesetzt, bis die A₂₈₀ des Effluenten ein Niveau von 10% der A₂₈₀ der auf die Säule aufgebrachten Probe erreichte. Auf der Basis der so erhaltenen Daten können die Durchbruchskapazität des gepackten Gels, bei einem Niveau von 10% der Konzentration des darauf aufgebrachten Proteins (Qb_10%) berechnet werden. Die so erhaltenen Ergebnisse bildeten die Basis zum Screenen einer großen Anzahl von Kandidaten zum Entsalzen und werden unten für zwei Proteine präsentiert werden, nämlich Rinderserumalbumin (BSA) und menschliches Immunoglobulin (IgG).
Bewertung
Der Durchbruch bei einem Niveau von 10% des Absorbanzmaximums (Qb_10%) wurde berechnet unter Verwenden der folgenden Beziehung: Qb10% = (TR10% – TRD) × C/Vc

R10%: = Retentionszeit (min) bei 10% des Absorbandzmaximums
T_RD: = Hohlraumvolumen des Systems (in min)
C: = Konzentration des zugeführten Proteins (4 mg/ml)
V_C: = gepacktes Bettenvolumen (ml) der Säule

2.2. Wiedergewinnung von Proteinen, die an „Hoch-Salz"-Kationenaustauschliganden gebunden sind
Die Kationenaustausch-Liganden werden auch im Hinblick auf die Wiedergewinnung von Proteinen gescreent, die an sie bei Niedrig-Salzbedingungen gebunden sind. Dies ist ein zusätzliches und wichtiges Kriterium zum Auswählen der richtigen Arten von Liganden, die relativ hohe Adorptionskapazitäten bei Hoch-Salzbedingungen mit hohen oder quantitativen Wiedergewinnungen bei Niedrig-Salzbedingungen von darauf aufgebrachten Proteinen kombinieren. Die Wiedergewinnung wurde bestimmt wie unten dargelegt.
2.2.1. Experimentelles
Details, die den Typ der Säule, das gepackte Bettenvolumen, Puffer, Proteinlösungen, Fließgeschwindigkeit und den Typ der verwendeten Gerätschaft betreffen, sind dargelegt unter den Abschnitten 2.1.1. und 2.1.2. Für BSA wurde die Säule mit Puffer 1 ins Gleichgewicht gebracht und das gebundene Protein mit Puffer 3 eluiert, und für IgG wurde die Säule mit Puffer 2 ins Gleichgewicht gebracht und das gebundene Protein mit Puffer 3 eluiert.
Zu einer Säule, die mit dem geeigneten Puffer (Puffer 1 oder 2) ins Gleichgewicht gebracht war, wurde eine Lösung des Proteins (BSA oder IgG) von einer 50 ml/Superloop aufgebracht, bis eine Menge aufgebracht war, die 30% ihrer Durchbruchskapazität entsprach. Die Säule wurde dann mit zwei Bettenvolumina des Equilibrierungspuffers gewaschen und das gebundene Protein wurde mit dem geeigneten Desorptionspuffer (Puffer 3) eluiert. Das eluierte Protein wird quantitativ in einem 20 ml-Messkolben gesammelt und sein Volumen und die Absorbanz bei 280 nm (für BSA und IgG) wurde genau gemessen. Auf der Basis der totalen Absorbanz in jeder eluierten Probe wurde die Menge des Proteins in den Eluaten berechnet unter Verwenden einer geeigneten Kalibrierungskurve (siehe unten).
2.2.2. Bewertung
Standardlösungen für jedes Protein wurden hergestellt, die den Konzentrationsbereich von 0-10 mg/ml im Säulen-Equilibrierungspuffer abdeckten. Die A₂₈₀ (BSA oder IgG) der Serien von Verdünnungen wurden gemessen und eine Kalibrationskurve wurde hergestellt mit der Proteinkonzentration (mg/ml) auf der x-Achse und der Absorbanz auf der y-Achse. Die linearen Gleichungen und Regressionskoeffizienten von jeder der Kalibrationskurven wurden berechnet. Auf der Basis dieser Standardkurven wurde die Konzentration (in mg/ml) des Proteins in der eluierten Probe durch Messen der A₂₈₀ der Probe unter Verwenden folgender Beziehung berechnet:

C_S: = Konzentration des Proteins in der eluierten Probe (mg/ml)
A: = Absorbanz (bei A₂₈₀)
ε: = molares Absorbtionsvermögen bei einer spezifischen Wellenlänge (M^–1 cm^–1)
b: = Zellenweglänge (cm)

Die Wiedergewinnung des gebundenen Proteins wird dann berechnet unter Verwenden der folgenden Beziehung:

Vs: = Volumen der eluierten Proteinprobe (ml)
C_L: = Konzentration des Proteins in der aufgebrachten Probe (mg/ml)
V_L: = Volumen der aufgebrachten Probe (ml)

Ergebnisse
1. Durchbruchskapazität bei Hoch-Salzbedingungen.
Die für die Durchbruchskapazitäten und Wiedergewinnungen für eine Serie von repräsentativen Entsalzungs-Kationenaustausch-Liganden erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die in Tabelle 1 gezeigten Beispiele veranschaulichen einige spezifische Eigenschaften der verschiedenen Liganden und sollten nicht als Begrenzungen des Umfangs dieser Erfindung interpretiert werden. Der Grad der Liganden-Substitution auf der Mehrheit dieser neuen Kationenaustauscher betrug ca. 0,18-0,20 mmol/ml des gepackten Gels. Ein paar Austauscher besaßen soviel wie 0,27 mmol/ml gepacktes Gel. Als ein Referenzkationenaustauscher wurde die kommerziell erhältliche SP Sepharose 6 Fast Flow verwendet, deren Ligandenkonzentration sich im selben Bereich wie die neuen Serien von Kationenaustauscher befindet (d. h. 0,18-0,25 mmol/ml gepacktes Gel). Die Ergebnisse zeigen die folgenden Trends:

1. Die neuen Entsalzungs-Kationenaustausch-Liganden besitzen ein viel höheres Qb_10% für beide Proteine im Vergleich zu dem Referenzkationenaustauscher SP Sepharose Fast Flow. Die Q_b10%-Werte für SP Sepharose Fast Flow betrugen 2,6 mg/ml und 0,8 mg/ml für BSA beziehungsweise IgG.
2. Der Ligand 13 ergab den höchsten Wert für BSA (57 mg/ml) und der Ligand 1 für IgG (33 mg/ml). Diese Werte entsprechen einem Anstieg der Durchbruchskapazität entsprechend 2192% und 4125% von BSA beziehungsweise IgG auf dem oben angegebenen zwei Liganden (13 und 1) relativ zum Referenz-Kationenaustauscher (SP Sepharose 6 Fast Flow).
3. Von den unten präsentierten 17 Liganden zeigten alle beträchtlich höhere Qb_10% für beide Proteine im Vergleich zum Referenzkationenaustauscher. Die zeigt an, dass diese Liganden die Basis für die Konstruktionen künftiger Entsalzungsliganden bilden können.
4. Einige Liganden zeigen relativ niedrige Qb_10%-Werte für IgG (niedriger als 8 mg/ml), aber hohe Qb_10%-Werte für BSA (z. B. Liganden 11, 12, 14, 15, 16 und 17). Diese Ergebnisse können so als Leitfaden für die Konstruktion „spezifischer" Typen von Entsalzungs-Kationenaustauschern in der Zukunft dienen.

2. Wiedergewinnung von Proteinen, gebunden an „Hoch-Salz"-Kationenaustauschliganden
Die Wiedergewinnungsdaten für BSA sind vollständig, während jene für IgG für ungefähr 50% der Liganden bestimmt werden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an:

1. All die Liganden ergeben eine Wiedergewinnung von BSA besser als 79%.
2. Ligand 1 ist der optimalste Ligand in dieser Hinsicht und zeigt eine Wiedergewinnung für BSA und IgG von 93% beziehungsweise 88%.
3. Die Ergebnisse zeigen auch, dass eine schrittweise Elution mit pH zu hohen Ausbeuten führt.

Struktur von Liganden
Kationenaustausch-Liganden (Tabelle 1) wurden erzeugt durch Umsetzen von

(a) der Ligand-bildenden Verbindungen 1-13, 15 und 17 mit der NHS-aktivierten Form des Produktes II oder
(b) der Ligand-bildenden Verbindungen 14 und 16 mit der Brom-aktivierten Form des Produktes I.

Variante (a) impliziert, dass die Liganden-bildende Verbindung an die Matrix über eine Amidgruppe gebunden war. Variante (b) bedeutet eine Bindung über einen Thioether.
Q_b steht für die Durchbruchskapazität bei 10% Durchbruch im Durchfluss. ml bezieht sich auf ml des Gels. Tabelle 1. Kationenaustausch-Liganden, die zum Ionenaustausch-Entsalzen verwendet werden.

Ligand 1. Q_b BSA = 50 mg/ml, Q_b IgG = 33 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 88%.

Ligand 2. Q_b BSA = 44 mg/ml, Q_b IgG = 20 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 86%, Wiedergewinnung IgG = 68%.

Ligand 3. Q_b BSA = 42 mg/ml, Q_b IgG = 27 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 79%.

Ligand 4. Q_b BSA = 44 mg/ml, Q_b IgG = 24 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 91%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 5. Q_b BSA = 41 mg/ml, Q_b IgG = 27 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 6. Q_b BSA = 50 mg/ml, Q_b IgG = 22 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 75%.

Ligand 7. Q_b BSA = 40 mg/ml, Q_b IgG = 23 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 76%.

Ligand 8. Q_b BSA = 38 mg/ml, Q_b IgG = 23 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 86%.

Ligand 9. Q_b BSA = 43 mg/ml, Q_b IgG = 14 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 79%, Wiedergewinnung IgG = 66%.

Ligand 10. Q_b BSA = 44 mg/ml, Q_b IgG = 11 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = 65%.

Ligand 11. Q_b BSA = 45 mg/ml, Q_b IgG = 5 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 92%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 12. Q_b BSA = 49 mg/ml, Q_b IgG = 6 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 92%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 13. Q_b BSA = 57 mg/ml, Q_b IgG = 10 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 14. Q_b BSA = 51 mg/ml, Q_b IgG = 4 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 92%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 15. Q_b BSA = 46 mg/ml, Q_b IgG = 3 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 87%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 16. Q_b BSA = 51 mg/ml, Q_b IgG = 4 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 91%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Ligand 17. Q_b BSA = 37 mg/ml, Q_b IgG = 7 mg/ml, Wiedergewinnung BSA = 93%, Wiedergewinnung IgG = nicht bestimmt.

Claims

Verfahren zum Entsalzen einer wässrigen Flüssigkeit, die eine Substanz enthält, die eine Peptidstruktur zeigt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Flüssigkeit (I) mit einem Ionenaustauscher (1) eines gemischten Modus, um ein Binden zwischen dem Ionenaustauscher und der Substanz herbeizuführen, wobei der Ionenaustauscher eine Basismatrix umfasst, die einen Ionenaustausch-Liganden (Ligand 1) trägt, der die entgegengesetzte Ladung im Vergleich zu der Substanz besitzt, (ii) Desorbieren der Substanz von dem Ionenaustauscher durch Ersetzen der Flüssigkeit (I) durch eine Flüssigkeit (II), wobei (a) das Binden des Schritts (i) bei einer Ionenstärke ausgeführt wird, die einer NaCl-Konzentration von ≥ 0,1 M entspricht; und Ligand 1 ein Kationenaustausch-Ligand eines gemischten Modus ist; (b) die Desorption des Schritts (ii) eine pH-Änderung umfasst; und (c) mindestens eine Pufferkomponente (die Säure oder die Base) des in Schritt (ii) verwendeten Puffers flüchtig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Änderung zu einer Ladung von 0 auf der Substanz und/oder dem Liganden 1/Ionenaustauscher oder zu einer Ladung derselben Art für beide davon (entweder negativ oder positiv) führt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand 1 eine pH-unabhängige Ladung besitzt oder durch einen pH-Wechsel entladen werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher stochastisch ist und auch einen zweiten Liganden (Ligand 2) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand 2 beim Zustand, der durch die Flüssigkeit (I) bereitgestellt wird, (a) ungeladen, aber ladbar durch einen pH-Wechsel ist, oder (b) ungeladen und nicht ladbar ist, oder (c) durch eine pH-unabhängige Ladung geladen ist, oder (d) durch eine pH-abhängige Ladung geladen ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand 2 ein Ligand eines gemischten Modus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand 1 und/oder der Ligand 2 durch die Formel definiert sind:
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zu entsalzende Substanz in der Flüssigkeit (II) nach dem Schritt (ii) in einer Konzentration vorhanden ist, die mindestens 10 mal die Konzentration in der Flüssigkeit (I) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die Substanz in der Flüssigkeit (I) zusammen mit anderen Substanzen vorhanden ist, die eine Struktur umfassen, die ausgewählt ist unter Peptidstruktur, Nukleinsäurestruktur, Kohlenhydratstruktur, Lipidstruktur, Steroidstruktur, Aminosäurestruktur, Nukleotidstruktur, und (b) dass die gesamte Menge dieser anderen Substanzen mit mindestens einem Faktor 10 nach dem Schritt (ii) in einer Fraktion der Flüssigkeit (II) verringert ist, die auch die zu entsalzende Substanz enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit (I) im wesentlichen aus der zu entsalzenden Substanz, Salzen und einem wässrigen Lösungsmittel besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit (II), die die Substanz nach dem Schritt (ii) enthält, weiter zu einer trockenen Form verarbeitet wird, entweder direkt oder indirekt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Teil einer analytischen Prozedur oder eines Prozesses zum Herstellen einer Zusammensetzung ist, die die entsalzte Substanz oder ein Derivat davon enthält, wobei beabsichtigt ist, dass die Substanz als ein Pharmazeutikum oder in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden soll.