DE60120220T2

DE60120220T2 - Screening-verfahren auf basis der siah-numb-wechselwirkung

Info

Publication number: DE60120220T2
Application number: DE60120220T
Authority: DE
Inventors: Robert Amson; Adam Telerman; Laurent Susini; Moshe Oren
Original assignee: Cerenis SA
Current assignee: Abionyx Pharma SA
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-09-18
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2021-09-19
Also published as: EP1346226B1; FR2818747B1; JP2004531216A; CA2432683A1; FR2818747A1; ATE328282T1; DE60120220D1; US20040175773A1; WO2002052273A1; EP1346226A1

Description

Die Erfindung hat Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder zum Screenen von Verbindungen, die insbesondere für die Behandlung von Krebserkrankungen oder von bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen, die mit Unregelmäßigkeiten bei der Regulation der Tumorsuppression und/oder der Apoptose, in dem biologischen p53-Stoffwechselweg verbunden sind, zum Gegenstand.
Die Apoptose oder der Zelltod ist ein komplexes Phänomen, welches durch zahlreiche Proteine reguliert wird, darunter das Protein p53. Dieses Protein wechselwirkt mit zahlreichen anderen Proteinen und seine Expression, die die Phänomene des Zelltods und der Tumorreversion induziert, kann mit der Induktion oder der Repression der Expression von anderen zellulären Genen korreliert werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben so Gene, die während der Kaskade, die zu Tumorrepression und/oder Apoptose führt (TSAP für „Tumor Suppressor Activated Pathway"), induziert und aktiviert werden, oder Gene, die reprimiert werden (TSIP für „Tumor Suppressor Inhibited Pathway"), nachgewiesen. Diese Gene haben insbesondere den Gegenstand der Patentanmeldungen WO 97/22695 oder WO 00/08147 gebildet.
Es ist wichtig, die Mechanismen der p53-Kaskade genau verstehen zu können, um neue Verbindungen, welche eine Antitumoraktivität aufweisen (welche insbesondere die Apoptose oder die Tumorsuppression induzieren können) oder für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden können, erzeugen zu können. Tatsächlich haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung gezeigt, dass das Presenilin 1 (PS1), für welches eine Rolle bei der Alzheimer'-Krankheit vermutet worden war, identisch war mit dem Protein TSIP2, welches in der Anmeldung WO 97/22695 beschrieben wird. So ist es legitim, nach Arzneimitteln zu forschen, welche im Rahmen der Apoptose interferieren können, um dieses Phänomen zu verringern, und die bei den neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden könnten.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Screenen und zur Identifizierung von Produkten, welche im Rahmen der p53-Kaskade interferieren können und so die Tumorreversion und/oder die Apoptose induzieren oder umgekehrt die Apoptose-Phänomene verringern können.
Die Erfindung beruht auf der Tatsache, dass das in der Patentanmeldung WO 97/22695 beschriebene Protein TSAP 3 sich an das Protein Numb (wie es in der Datenbank GenBank unter der Aufnahmenummer AF015040 beschrieben wird) bindet, das seinerseits Wechselwirkungen mit Mdm2, einem Protein, welches an dem Kontrollprozess von p53 beteiligt ist, zeigt.
Die Erfindung beruht gleichfalls auf der Tatsache, dass die Bindung von TSAP 3 (welches auch als das Protein Siah-1 identifiziert worden ist, welches so oder unterschiedslos als Siah bezeichnet wird) an Numb den Abbau des Numb-Proteins durch einen von dem Ubiquitin-Proteasom abhängigen Weg induziert.
So bezieht sich im Rahmen einer ersten Ausführungsweise die Erfindung auf Verfahren zum Screenen und/oder zur Selektion oder zur Identifizierung einer Verbindung, welche mit der Bindung von Siah an Numb interferiert, diese verringert oder hemmt, welche die Schritte aufweisen:

a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert;
b) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.

Bei einer zweiten Ausführungsweise ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Screening, zur Selektion oder zur Identifizierung einer Verbindung, die mit der Bindung von Siah an Numb interferiert, diese verringert oder hemmt, gerichtet, welches die Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt;
b) Identifizierung der Verringerung und/oder der Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb.

Bei einer anderen Ausführungsweise erlauben die Lehren der Erfindung, Verbindungen zu identifizieren, die, indem sie sich an Numb binden, gegebenenfalls anstelle von Siah, einen bedeutenderen Abbau von Numb als den durch das Siah-Protein induzierten Abbau induzieren werden. Folglich wird die Verringerung der Numb-Menge eine Erhöhung der vorhandenen p53-Menge und eine Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose) implizieren. Folglich ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Screenen, zur Selektion und/oder zur Identifizierung einer Verbindung für die Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose) gerichtet, welches die Schritte aufweist:

a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert;
b) Identifizierung der Verringerung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.

Umgekehrt hat die Erfindung gleichfalls ein Verfahren zum Screenen, zur Selektion oder zur Identifizierung einer Verbindung für die Verringerung und/oder die Hemmung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose) zum Gegenstand, welches die Schritte aufweist:

a) Inkontaktbringen von Verbindungen mit einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt;
b) Identifizierung der Verbindungen, welche die Verringerung und/oder die Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb induzieren;
c) Inkontaktbringen der in Schritt b) identifizierten Verbindungen mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert;
d) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.

Um Verbindungen zu bestimmen, welche die Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose) erlauben, ist es gleichfalls möglich, verschiedene Verfahren gemäß der Erfindung zu kombinieren; es ist insbesondere möglich, beispielsweise ein Verfahren zum Screenen, zur Selektion oder zur Identifizierung von Verbindungen, welche eine Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose) zur Funktion haben, zu erhalten, welches die Schritte aufweist:

a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt;
b) Identifizierung der Verbindungen, welche die Verringerung und/oder die Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb induzieren;
c) Inkontaktbringen der in Schritt b) ausgewählten Verbindungen mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert;
d) Identifizierung der Verringerung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.

Ein solches Verfahren ist folglich gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung nutzt folglich die Tatsache aus, dass die Proteine Siah und Numb sich aneinander binden können. Es ist folglich interessant, die Domänen von jedem Protein zu identifizieren, die effektiv in Kontakt mit dem anderen Protein stehen. Tatsächlich müsste dies erlauben, die so identifizierten Peptide als Köder („bait") oder Agonisten der vollständigen Proteine verwenden zu können. Dies kann so erlauben, Verbindungen zu definieren, die mit der Siah-Numb-Bindung interferieren werden und die entweder die Tumorsuppression und/oder die Apoptose induzieren (insbesondere wenn diese Peptide eine Wirkung auf den Abbau von Numb haben (von Siah abstammende Peptide)) oder im Gegenteil diese Phänomene verringern können (insbesondere wenn diese Peptide die Bindung von Siah an Numb verhindern (sei es, dass diese Köder-Peptide, die von Numb abstammen, sind oder dass diese von Siah abstammen: sie verhindern die Bindung von diesem Protein an Numb, insbesondere durch Kompetition).
Die Erfindung hat folglich insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung einer Region von Siah, die hinsichtlich der Erhöhung der Tumorsuppression und/oder der Apoptose aktiv ist, zum Gegenstand, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden mit einer Säugetierzelle, welche das Protein Numb exprimiert;
b) Identifizierung der Verringerung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle verglichen mit der Menge von Numb-Protein, welche in einer als Vergleich dienenden Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert, vorhanden ist.

Unter „Region von Siah" versteht man insbesondere Peptide mit einer Primärsequenz, welche von der Primärsequenz des Siah-Proteins abstammt.
Die Erfindung ist folglich gleichfalls auf ein Verfahren zur Identifizierung einer Region von Siah, die hinsichtlich der Verringerung und/oder der Hemmung der Tumorsuppression und/oder der Apoptose aktiv ist, gerichtet, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden mit einer Säugetierzelle, welche das Protein Numb exprimiert;
b) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle verglichen mit der Menge von Numb-Protein, welche in einer als Vergleich dienenden Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert, vorhanden ist.

Allgemeiner erlaubt die Erfindung die Identifizierung von Regionen von Siah, welche an der Bindung an das Numb-Protein beteiligt sind, durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden in einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt;
b) Identifizierung der Peptide, welche die Verringerung der Bindung zwischen Siah und Numb in dem System zur Folge haben.

Es ist evident, dass die Erfindung gleichfalls die Bestimmung der Regionen von Numb, welche an der Bindung an Siah beteiligt sind, gemäß zu den zuvor beschriebenen Verfahren ähnlichen Verfahren erlaubt und dass diese Regionen insbesondere als Köder („bait") eingesetzt werden können, wenn man wünscht, die Tumorrepression und/oder die Apoptose zu verringern.
Die Erfindung erlaubt folglich, Produkte zu identifizieren, welche erlauben, mit der Siah-Numb-Bindung zu interagieren, und folglich einen Nutzen bei der Regulation der Apoptose und/oder der Tumorrepression haben können. Es ist gleichwohl möglich, dass diese Produkte, um für eine therapeutische Behandlung, insbesondere Krebs oder neurodegenerative Erkrankungen, eingesetzt werden zu können, erfordern, optimiert zu werden, um eine höhere Aktivität und/oder eine geringere Toxizität zu haben.
Tatsächlich erfolgt die Entwicklung eines Arzneimittels häufig gemäß dem folgenden Prinzip:

– Screening von Verbindungen mit einer gewünschten Aktivität durch ein geeignetes Verfahren,
– Selektion von Verbindungen, die den „Rahmenbedingungen" (hier eine Wirkung auf die Apoptose- und Tumorreversionsphänomene) entsprechen,
– Bestimmung der Struktur (insbesondere der Sequenz (gegebenenfalls Tertiärstruktur), wenn es sich um Peptide handelt, der Formel und des Grundgerüsts, wenn es sich um chemische Verbindungen handelt) der ausgewählten Verbindungen,
– Optimierung der ausgewählten Verbindungen durch Modifizierung der Struktur (beispielsweise durch die Veränderung der stereochemischen Konformation (beispielsweise Übergehen der Aminosäuren in einem Peptid von L zu D), Hinzufügen von Substituenten an dem Peptid- oder chemischen Grundgerüst, insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das Gerüst, Modifizierung der Peptide (siehe insbesondere Gante, „Peptidomimetics", in: Angewandte Chemie-International Edition Engl., 1994, 33, 1699–1720);
– Durchschleusen und Screening der so erhaltenen Verbindungen durch bzw. in geeignete(n) Modelle(n), die häufig Modelle sind, die der untersuchten Pathologie recht nahe kommen. In diesem Stadium setzt man insbesondere oftmals Tiermodelle, im Allgemeinen in Nagetieren (Mäuse, Ratten ...) oder in Hunden, ja sogar Primaten, ein.

Die Tiermodelle, die eingesetzt werden können, sind beispielsweise für Krebs Modelle, die auf immunsupprimierten Mäusen (beispielsweise scid/scid basieren, denen man (insbesondere subkutan) Tumorzellen, die zu der Entwicklung von Tumoren führen werden, injiziert. Man untersucht die Wirksamkeit der potentiellen Antitumor-Verbindungen beispielsweise durch das Messen der Größe der gebildeten Tumore.
Man kann für die Untersuchung der neurodegenerativen Erkrankungen das von Amson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5346–50) beschriebene Modell, welches aus p53- defizienten Mäusen besteht, oder das in Chen et al., Janus et al. und Morgan et al. (2000, Nature, 408, S. 975–985) beschriebene Modell einsetzen.
So hat die Erfindung insbesondere zum Gegenstand, die Identifizierung von Verbindungen zu erlauben, die für die Behandlung von Krebs eingesetzt werden könnten, indem diese eine Aktivität hinsichtlich einer Erhöhung der Tumorrepression und/oder der Apoptose aufweisen. Einer der Gegenstände der Erfindung ist folglich ein Verfahren, welches die Schritte umfasst:

a) Ausführen eines Verfahrens gemäß der Erfindung, welches erlaubt, Verbindungen zu identifizieren, welche eine bestimmte Aktivität hinsichtlich einer Erhöhung der Tumorrepression und/oder der Apoptose aufweisen,
b) Modifizierung des in Schritt a) ausgewählten Produkts,
c) Test des in Schritt b) modifizierten Produkts in in vitro- und/oder in vivo-Verfahren mittels sachdienlicher Modelle von Tumorrepression und/oder Apoptose,
d) Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, eine Aktivität hinsichtlich Tumorrepression und/oder Apoptose, welche höher als die für das in Schritt a) ausgewählte Produkt erhaltene Aktivität ist, zu erhalten.

Der Schritt d) kann ersetzt werden durch einen Schritt d'), welcher darin bestünde: d') Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, die gesuchte biologische Wirkung mit einer geringeren Toxizität in einem Tiermodell zu erhalten (wenn eines der in Schritt c) eingesetzten Modelle in vivo ist).
Wenn man die Tests an Apoptose- oder Tumorrepressionsmodellen in vitro ausführt, kann man beispielsweise das von Tellerman et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702–6) beschriebene K256/KS-Modell einsetzen. Man kann gleichfalls die M1-LTR-Zellen, die von Amson et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3953–7) beschrieben worden sind, oder die U937/US3-US4-Zellen, die von Nemani et al., (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9039–42) beschrieben worden sind, einsetzen.
Die in vivo-Versuche können ausgeführt werden, indem diese Zellen Tieren, insbesondere immunsupprimierten Mäusen, injiziert werden und indem die Wirkungen der verschiedenen getesteten Verbindungen untersucht werden.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird die Bedingungen und die Schwellenwerte, die erforderlich sind für die Identifizierung eines Produkts, welches als Arzneimittel eingesetzt werden kann, gemäß den vorschriftsmäßigen Anforderungen (insbesondere hinsichtlich Toxikologie) bezogen auf den Nutzen, welchen das so identifzierte Produkt bringt, zu definieren wissen.
Auf die gleiche Weise betrifft die Erfindung gleichfalls Verfahren zur Optimierung der Produkte, welche die Tumorrepression und/oder die Apoptose reprimieren, die durch die weiter oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden, und die die Identifizierung von Produkten, die als Arzneimittel einsetzbar sind, erlauben.
So betrifft die Erfindung gleichfalls ein Verfahren zur Identifizierung eines Produkts mit einer Aktivität hinsichtlich der Verringerung und/oder Hemmung der Tumorrepression und/oder der Apoptose, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Ausführen eines Verfahrens gemäß der Erfindung, welches erlaubt, Verbindungen zu identifizieren, welche eine bestimmte Aktivität hinsichtlich einer Verringerung der Tumorrepression und/oder der Apoptose aufweisen,
b) Modifizierung des in Schritt a) ausgewählten Produkts insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst,
c) Test des in Schritt b) modifizierten Produkts in in vitro- und/oder in vivo-Verfahren mittels sachdienlicher Modelle von Tumorrepression und/oder Apoptose,
d) Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, eine Aktivität hinsichtlich Tumorrepression und/oder Apoptose, welche bezogen auf die für das in Schritt a) ausgewählte Produkt erhaltene Aktivität verringert ist, zu erhalten.

Der Schritt d) kann gleichfalls ersetzt werden durch einen Schritt d'), welcher darin bestünde: d') Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, die gesuchte biologische Wirkung mit einer geringeren Toxizität in einem Tiermodell zu erhalten (wenn eines der in Schritt c) eingesetzten Modelle in vivo ist).
Es handelt sich tatsächlich ferner darum, das Produkt erhalten zu können, welches das beste Verhältnis (biologische Aktivität und klinische Wirkung)/(potentielle Risiken bei einer Verwendung) aufweist.
Die Parameter, welche eingesetzt werden müssen, um diese Ergebnisse zu erhalten, sind allesamt bekannt und liegen im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet, welcher anstrebt, neue Arzneimittel zu entwickeln, und können beispielsweise in den Direktiven von Organisationen, wie der Agence du Médicament, der Europäischen Kommission oder der Federal Drug Agency, gefunden werden.
Das Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren erfordert Modelle, welche erlauben, die Bindung zwischen Siah und Numb zu bestimmen, wie auch eine leichte Messung der Erhöhungen oder Verringerung der Menge von Numb-Protein in einer eukaryotischen Zelle.
Die Menge von Numb-Protein kann durch Western-Blot untersucht werden, wobei die Sichtbarmachung durch Verwendung von einem gegen das Protein gerichteten Antikörper erfolgt. Solche Antikörper können insbesondere beim Weizmann Institute of Science, Rhovot, Israel, unter der Referenz WIS 3465 oder bei Transduction Laboratories (Referenz N80220) erhalten werden.
Um die erfindungsgemäßen Verfahren, welche die Untersuchung und das Screening mittels Säugetierzellen erfordern, auszuführen, kann es vorteilhaft sein, das eine oder das andere der Proteine Siah und Numb oder die beiden zusammen in den Zellen überzuexprimieren.
So ist es leichter, die Variationen bei der Menge von Numb-Protein untersuchen zu können, insbesondere durch Vergleich der Zellen, an welchen man die Verbindungen von Interesse testet, mit den gleichen Zellen, zu welchen man die Verbindungen, die man zu screenen wünscht, nicht hinzugesetzt hat, und Zellen, die Numb exprimieren, ohne Siah zu exprimieren (Positivkontrollen).
Es versteht sich, dass die Expression der beiden Proteine Siah und Numb durch die Einführung der Gene (insbesondere der cDNAs), welche diese beiden Proteine in den Zellen kodieren, entweder platziert auf Vektoren oder durch Einführung in das Chromosom, erhöht werden kann.
Wenn man eine episomale Expression wählt, wird die Säugetierzelle durch wenigstens einen Vektor transfiziert, welcher unter einem Vektor, welcher ein Siah kodierendes DNA-Fragment trägt, einem Vektor, welcher ein Numb kodierendes DNA-Fragment trägt, einem Vektor, welcher ein DNA-Fragment für Siah und ein Numb kodierendes DNA-Fragment trägt, ausgewählt wird. So kann ein und derselbe Vektor beide Proteine exprimieren; alternativ ist es möglich, zwei Vektoren einzuführen.
Es ist möglich, Vektoren einzusetzen, die die leichte Expression und Reinigung der Proteine Siah und Numb beispielsweise in prokaryotischen Zellen (E. coli, B. subtilis...) oder eukaryotischen Zellen (Hefen, wie Saccharomyces, Kluyveromyces..., Säugetierzellen (HeLa, Cos, Hep-2...) oder Insektenzellen (unter Verwendung eines Baculovirus-Systems) erlauben. So kann es vorteilhaft sein, dass die Proteine an ihrem N- oder C-terminalen Ende ein Etikett oder eine Markierung („tag") aufweisen, um die Reinigung zu erleichtern. Man wählt insbesondere einen Histidin-Tag oder GST-Tag. Diese Methoden sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt, der die geeigneten Plasmide in den Katalogen von Firmen, wie Stratagene, findet.
Wenn man die erfindungsgemäßen Verfahren an in vitro-Modellen ausführt, um die Bindung zwischen Numb und Siah zu untersuchen, gibt es mehrere Weisen, vorzugehen.
Ein einsetzbares Protokoll kann das Folgende sein:

– Expression und Reinigung der Proteine Siah und Numb, beispielsweise in prokaryotischen Zellen (E. coli, B. subtilis) oder eukaryotischen Zellen (Hefen, wie Saccharomyces, Kluyveromyces..., Säugetierzellen (HeLa, Cos, Hep-2...) oder Insektenzellen (unter Verwendung eines Baculovirus-Systems). Es kann vorteilhaft sein, dass die Proteine an ihrem N- oder C-terminalen Ende ein Etikett oder eine Markierung" („tag") aufweisen, um die Reinigung zu erleichtern. Man wählt insbesondere einen Histidin-Tag oder GST-Tag. Diese Methoden sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt, der die geeigneten Plasmide in den Katalogen von Firmen, wie Stratagene, findet.
– Bindung der Proteine an geeignete Kügelchen. Wenn man einen GST-Tag einsetzt, bindet man die exprimierten Proteine an Sepharose-Kügelchen, welche auf ihrer Oberfläche Glutathion aufweisen.
– Herstellung von Proteinen durch in vitro-Translation. Dies kann leicht bewerkstelligt werden durch Verwendung von kommerziellen Vektoren (die beispielsweise bei Promega erhältlich sind), die erlauben, die cDNAs unter der Kontrolle von wohlbekannten Promotoren (T7 oder T3) zu klonieren und die geeigneten RNA-Polymerasen einzusetzen, um die RNAs zu produzieren, dann die Expression der Proteine in vitro unter Verwendung der verfügbaren Kits, und indem den Anweisungen des Herstellers gefolgt wird, zu bewerkstelligen.
– Copräzipitation der Proteine, indem die durch in vitro-Translation erhaltenen Proteine zu den Sepharose-Glutathion-Kügelchen, an welche die Fusionsproteine mit dem GST gebunden worden sind, hinzugesetzt werden. Nach einer ausreichenden Kontaktzeit wäscht man die Kügelchen und man führt eine Analyse durch ein SDS-PAGE-Elektrophoresegel und Autoradiographie aus. Das Auftreten der den beiden Proteinen entsprechenden Banden zeigt gut die Bindung zwischen jenen an.

Die Verwendung von geeigneten Kontrollen erlaubt so, die Verringerung und/oder die Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb durch Vergleich der Mengen von nach Zugabe der getesteten Verbindung während des Copräzipitationsschritts freigesetzten Proteinen mit den in den Kontrollen freigesetzten Protein-Mengen zu definieren.
Man kann auch die Bindung der Proteine untersuchen, indem man das FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-System einsetzt, welches darin besteht, jedes der Proteine mit einem geeigneten Rest zu markieren, wobei die Bindung der beiden Proteine eine Reaktion zwischen jedem der beiden Reste und die Emission einer leicht detektierbaren Fluoreszenz induziert.
Es ist klar, dass der Begriff Peptidsequenz oder Nukleinsäuresequenz oder Nukleotidsequenz (wobei diese beiden letzteren Begriffe unterschiedslos verwendet werden) isolierte Sequenzen repräsentiert, d.h. außerhalb ihres natürlichen Zustands, und diese insbesondere durch den Ersatz von deren Grundeinheiten durch nicht-natürliche Einheiten oder durch die Modifizierung der Bindungen zwischen den Grundeinheiten (beispielsweise die Phosphorothioate (Nukleinsäure) oder die Peptid Nucleic Acids) modifiziert sein können.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, die Identifizierung von Verbindungen zu erlauben, welche mit der Bindung zwischen Siah und Numb interferieren, wobei bestimmte von diesen Verbindungen insbesondere Wirkungen auf die p53-Kaskade induzieren können. So sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen oder die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Arzneimittel gleichfalls Gegenstände der Erfindung.
Eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierte Verbindung kann eine Verbindung mit einer chemischen Struktur, ein Lipid, ein Zucker, ein Protein, ein Peptid, eine hybride Protein-Lipid-, Protein-Zucker-, Peptid-Lipid- oder Peptid-Zucker-Verbindung, ein Protein oder ein Peptid sein, an welche man chemische Verzweigungen hinzugefügt hat.
Im Rahmen der ins Auge gefassten chemischen Verbindungen können diese einen aromatischen oder nicht aromatischen Zyklus oder mehrere aromatische oder nicht aromatische Zyklen wie auch mehrere Reste jeglicher Art (insbesondere Niederalkyl, d.h. umfassend zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatome) enthalten.
Diese Verbindungen, Nukleinsäuresequenzen, Peptidsequenzen können so je nach der pro- oder anti-Apoptose/Tumorreversions-Wirkung für die Herstellung eines Arzneimittels, welches insbesondere für die Behandlung von Krebs oder einer neurodegenerativen Erkrankung bestimmt ist, eingesetzt werden.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erstmals die Tatsache nachgewiesen, dass das Protein Siah sich an das Protein Numb bindet. So betrifft die Erfindung gleichfalls einen Komplex, welcher aus einem Siah-Protein und einem Numb-Protein gebildet wird.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Hemmung der Bindung von Siah an Numb in einer Zelle, welches den Schritt umfasst:

a) Inkontaktbringen der Zelle mit einer durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierten Verbindung, welche die Siah-Numb-Bindung hemmt.

Die so ins Auge gefasste Verbindung kann gleichfalls ein „Köder" („bait")-Peptid sein, welches von dem Siah-Protein oder dem Numb-Protein abstammt. Das Verfahren kann in vitro oder in vivo ausgeführt werden.
Die Erfindung ist gleichfalls auf ein Verfahren für die Behandlung einer Krebserkrankung gerichtet, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man an einen Patienten eine gemäß der Erfindung identifizierte und die Apoptose und/oder die Tumorreversion verstärkende Verbindung verabreicht.
Ein Verfahren für die Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, welches darin besteht, einem Patienten eine Verbindung gemäß der Erfindung, und welche die Apoptose verringert oder hemmt, zu verabreichen, ist gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Wie in den Beispielen präzisiert und gezeigt, bindet sich das Protein Siah so nicht nur an das Protein Numb, sondern es induziert gleichfalls dessen Abbau gemäß dem mit Ubiquitin assoziierten Proteasom-Weg. Es ist bemerkenswert, festzuhalten, dass das Numb-Protein dafür bekannt ist, sich an das Mdm2-Protein zu binden, dessen Anwesenheit eine negative Regulation von p53 induziert. Es ist außerdem bekannt, dass die Expression von Siah in Zellen Apoptose-Phänomene induziert, wie dies die Erfinder zuvor gezeigt haben. So stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Hemmung der insbesondere mit Mdm2 über Numb verbundenen Verringerung von p53 in einer Zelle bereit, welches den Schritt umfasst:

a) Inkontaktbringen der Zelle mit einer erfindungsgemäßen Verbindung, die die Apoptose und/oder die Tumorreversion erhöht.

Umgekehrt kann man die Verringerung der Menge von p53-Protein in einer Zelle insbesondere aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Mdm2 und Numb erhöhen, umfassend den Schritt:

a) Inkontaktbringen der Zelle mit einer erfindungsgemäßen Verbindung, die die Apoptose und/oder die Tumorreversion hemmt oder verringert.

Diese beiden Verfahren können in vitro oder in vivo, insbesondere im Rahmen einer therapeutischen Behandlung, ausgeführt werden.
LEGENDEN DER FIGUREN
1: Analyse der in vitro-Wechselwirkung zwischen Siah-I und Numb. 1.A. Die Fusionsproteine GST-68 (wobei das Protein 68 das Leu82-Glu314-Fragment von BNIP2 ist) (Bahnen 1 und 2) und GST-Numb (Bahnen 3 und 5), die mit Coomassie-Blau beobachtet werden. 1.B. Autoradiographie der in vitro-Translationsprodukte der Proteine AIP1 (Bahn a) und Siah-1 (Bahn b), welche mit ³⁵S-Methionin markiert worden sind. Die Bahnen 1 bis 4 veranschaulichen die Präzipitation von AIP1 (1 und 3) oder Siah-1 (2 und 4) mit den angegebenen Produkten durch die GST-Fusionsproteine.
2: Analyse der Wirkung der in vivo-Wechselwirkung zwischen Siah und Numb auf die Expressionsniveaus der Proteine. 2.A. 293T-Zellen wurden durch einen leeren Expressionsvektor (Bahn 1) oder einen, der Numb (Bahn 2), Siah-1 (Bahn 3), Numb und Siah-1 (Spalte 4), Numb und Mdm2 (Bahn 5), Numb, Siah-1 und Mdm2 (Bahn 6) exprimiert, cotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde eine Analyse durch Western-Blot unter Verwendung eines anti-Numb-Antikörpers ausgeführt. Es wurde gleichfalls eine Kontrolle unter Verwendung eines anti-GFP (Green Fluorescent Protein)-Antikörpers als Standard für die Auftragung auf das Gel ausgeführt. 2.B. Die Western-Blot-Analyse wurde, wie zuvor beschrieben, in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Inhibitors des Ubiquitin-Proteasoms (MG 132) ausgeführt. Ohne MG 132 nimmt die Menge von Numb-Protein in Gegenwart von Siah-1 mit oder ohne Mdm2 ab (Bahnen 2, 3, 4). Mit MG 132 bleibt die Menge an Numb-Protein konstant (Bahnen 6, 7 und 8).
3: Analyse der in vivo- und in vitro-Wechselwirkung von Siah-1 und Numb

A. Zusammenfassung der Hefe-Doppelhybrid-Daten. Siah-1 und Numb wechselwirken durch einen Wechselwirkungsassay in einer Doppelhybrid-Hefe. Die LexA-Siah-1- und B42-Numb-Wechselwirkungen wurden entweder anhand der Vermehrung oder anhand der β-Galactosidase-Aktivität getestet. In Gegenwart von Galactose (Gal) werden die B42 enthaltenden Ziele, die für die Aktivierung markiert wurden, exprimiert, wohingegen sie auf Glucose (Glu) reprimiert werden. Hefen, welche als Negativkontrolle dienende Kombinationen von Ziel-Plasmiden und von Köder-Plasmiden LexA-RFHM1/B42-Cdi3, Lex A-Siah-1/B42-Cdi3, LexA-RFHM1/B42-Numb oder als Positivkontrollen dienende Kombinationen LexA-RFHM12/Cdi3 und LexA-Siah-1/B42-Siah-1 enthielten, wurden parallel dazu getestet. Wie erwartet, zeigten die Hefen, welche die Ziel- und Köder-Plasmide als Positivkontrolle enthielten, eine Vermehrung und waren β-gal⁺ in Gegenwart von Galactose, nicht aber von Glucose. Außerdem zeigten die LexA-Siah-1 und B42-Numb enthaltenden Hefen gleichfalls eine starke Galactose-abhängige Vermehrung und eine β-gal-Aktivität.
B. In vitro-Wechselwirkung von GST-Siah-1 und radioaktiv markiertem Numb. Numb und die Negativkontrolle AIP1 wurden durch in vitro-Translation (IVT) in einem Kaninchen-Retikulozytenlysat in Gegenwart von mit ³⁵S markiertem Methionin und Cystein erzeugt. Gleiche Mengen von radioaktiv markierten Produkten wurden entweder mit GST-Siah-1 oder GST-NKTR-Fusionsproteinen als Negativkontrolle, die auf Glutathion-Kügelchen eingefangen waren, inkubiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden in einen Proteinprobenpuffer eluiert, unter Reduktionsbedingungen (0,7 mM 2-β-Mercaptoethanol) durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) (10%) aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
C. Umgekehrte Beziehung zwischen GST-Numb und Siah-1. AIP1 oder Siah-1, gewonnen aus einer in vitro-Translation (IVT), wurden erzeugt und es wurden entweder mit GST-NKTR oder GST-Numb GST-Verringerungsversuche ausgeführt, wie oben beschrieben. Die Darstellung des Beitrags des angegebenen GST ist in den linken Feldern von B und C beschrieben. Es ist festzustellen, dass GST-Numb teilweise abgebaut wird.
D. In vivo-Wechselwirkung von Flag-Numb und Siah-1. Ein Siah-1m-Konstrukt, welches 3 falsche Sinn-Mutationen (Cys→Ser) im Bereich der Aminosäurepositionen 129, 131 und 135 in Siah-1 trägt, wurde derart erzeugt, dass ein stabileres Protein erzeugt wurde. 293T-Zellen wurden vorübergehend mit entweder Flag-AIP1 und Siah-1 m oder Flag-Numb und Siah-1 m durch die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode cotransfiziert. Die Expressionsniveaus von Flag-AIP1 und Flag-Numb in den Gesamtzelllysaten (TL) wurde durch Immunmarkierung mit einem anti-flag-Antikörper (D, linkes Feld) bestimmt. Die Ausdehnungen der Siah-1-Numb-Kombination wurden durch Immunpräzipitation von Flag-Numb mit einem Flag-Antikörper, gefolgt von einer Immunmarkierung mit einem gegen Siah-1 gerichteten Antiserum, bestimmt (D, rechtes Feld). Es ist anzumerken, dass die monomere Form von Siah-1 als ein Peptid von ungefähr 32 kDa wandert. Die Proteinbande von ungefähr 60 kDa in dem Gesamtlysat von Siah-1 repräsentiert wahrscheinlich Dimere von Siah-1.
E. Endogene Wechselwirkung von Siah-1 und Numb in U937-Zellen und Jurkat-Zellen. 2,5 × 10⁸ Zellen wurden chemisch durch Kombination mit dem reduzierbaren DTBP-Linker verknüpft. Die von Zellen abgeleiteten Lysate wurden über Nacht mit entweder einem anti-IgG, welches mit diesen Spezies Komplexe bilden kann, als Negativkontrolle oder einem anti-Numb-Antikörper inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit G-Protein-Agarose. Die Immunkomplexe wurden in einem 12%-igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und dann mit einem anti-Siah-1-Antikörper markiert. Es ist festzustellen, dass der anti-Numb-Antikörper die monomere 32 kDa-Form von Siah-1 zugleich in den U937-Zellen wie in den Jurkat-Zellen (E, rechtes Feld) coim munpräzipitiert. Das rechte Feld zeigt die endogene Expression von Numb in den 2 Zelllysaten (TL).

4: Kartierung der Wechselwirkungsdomänen von Siah-1 und Numb

A.–C. GST-Verringerungsassays wurden durch Inkubation der angegebenen Fragmente von Siah-1, welche aus einer in vitro-Translation (IVT) abgeleitet und radioaktiv markiert worden sind (Δ1–10), oder der Negativkontrolle AIP1 mit GST-NKTR (Daten nicht gezeigt) oder mehreren GST-Fusionsproteinen von Numb (ΔA–C) ausgeführt. Proben wurden aufgetrennt, wie oben beschrieben. Es ist festzustellen, dass GST-Numb (zweites Feld) mit einem minimalen Siah-1-Fragment Δ10, welches aus den Aminosäuren 180–211 gebildet wird, wechselwirkt.
B. Eine Darstellung des Beitrags von GST.
C. und D. Diagramm, welches die Deletionsmutanten von Siah-1 bzw. Numb darstellt. Die bei Numb in seiner vollen Länge gezeigten schwarzen Balken kennzeichnen Motive, welche SH3 enthalten. (*) in C. gibt die Lage der 3 falschen Sinn-Mutationen an.

5: Wirkungen der Überexpression von Siah-1 auf den Abbau von Numb und die Ubiquitinierung.

A.–C. Siah-1 induziert den Abbau von Numb in vivo.
A. 293T-Zellen wurden vorübergehend mit den angegebenen Plasmiden durch die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode cotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Gesamtzelllysate hergestellt und durch eine SDS-PAGE-Analyse aufgetrennt, gefolgt von Antikörpern. Um den äquivalenten Auftrag der Proteinproben zu verifizieren, wurden die Membranen von den Antikörpern befreit und erneut mit einem Anti-Tubulin-Antikörper als Sonde untersucht (A., unteres Feld).
B. Die Niveaus des stabilen Zustands von Numb wurden durch Analyse durch Immunmarkierung entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit des Proteasom-Inhibitors MG132 (50 μM), welcher 3 h vor dem Ernten der Zellen zugesetzt wird, analysiert.
C. In vivo-Ubiquitinierung von Numb durch Siah-1. Die 293T-Zellen wurden vorübergehend mit Plasmiden, welche flag-Numb, HA-Polyubiquitin und variable Mengen von Siah-1 (10–30 μg) kodierten, transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem anti-flag-Antikörper inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden hinsichtlich Ubiquitinierung durch Immunmarkierung mit einem anti-HA analysiert. Es ist anzumerken, dass das MG132 (50 μM) zu den 293T-Transfektanten 6 h vor der Ernte zugesetzt worden war mit dem Ziel, den Abbau von Numb zu verhindern. HC kennzeichnet die schwere Kette des Immunglobulins (C, oberes Feld).

Mdm2 wurde als Referenzpunkt der Positivkontrolle verwendet. Das mittlere Feld zeigt die Expressionsniveaus von flag-Numb, wie durch den anti-Numb-Antikörper sichtbar gemacht. Das untere Feld zeigt das gesamte Schema der Ubiquitinierung, wie es durch den anti-HA detektiert wird, bei steigenden Mengen von Siah-1 oder Mdm2.
6: In vivo-Wirkungen von Siah-1 auf den endogenen Abbau von Numb

A.–D. Die durch p53 induzierte Potenzierung von Siah-1 begünstigt verringerte Niveaus von endogenem Numb.
A. 24 h, nachdem die LTR6 Zellen auf 32°C überführt worden waren, was zu einer Aktivierung von p53 führt, wurden die Zelllysate hergestellt und bezüglich der Expressionsniveaus von endogenem Siah-1 (A., unteres Feld) und endogenem Numb (oberes Feld) analysiert. Es ist festzuhalten, dass die erhöhten Niveaus von Siah-1-Proteinen gleichzeitig mit einer Verringerung der Expression von Numb auftreten.
B. Analyse der auf stabile Weise mit einem Anti-Sinn-Siah-1 transfizierten LTR6-Zellen. Bereits bei 37°C inhibierte das Anti-Sinn-Siah-1 die Expression des Siah-1-Proteins von 32 kDa (B., mittleres Feld, Bahn 2). Die Zunahme von Siah-1 nach der Aktivierung von p53 (B., mittleres Feld, Bahn 3) wurde in den mit einem Anti-Sinn-Konstrukt transfizierten Zellen auf signifikante Weise gehemmt. Dies hat die Expression von Siah-1 verringert, die aus dem erhöhten Niveau des Numb-Proteins resultierte (B., oberes Feld, Bahn 4).
C. Das linke Feld zeigt eine FACS-Analyse von Annexin-v-positiven Zellen nach der Aktivierung von p53 in den LTR6-Zellen, die entweder mit einem Vektor allein oder mit dem anti-Sinn-Siah-1 transfiziert worden sind. Es ist die signifikante Verringerung der durch p53 induzierten Apoptose mit dem anti-Sinn-Siah-1 festzustellen.
C. Rechtes Feld: Es wurden die zellulären LTR6-Gesamtlysate hergestellt und durch eine SDS-PAGE-Analyse aufgetrennt, gefolgt von einer Immunmarkierung mit entweder einem anti-PARP-Antikörper oder einem Anti-Tubulin-Antikörper.
D. Die U937-Zellen oder stabile U937-Transfektanten, welche entweder den Kontrollvektor oder Siah-1 exprimieren, wurden hinsichtlich endogenem Numb in den Gesamtzelllysaten analysiert. Außerdem wurde gleichfalls der Klon US4, welcher sich von U937-Zellen ableitet, hinsichtlich der endogenen Siah-1- und Numb-Proteinniveaus analysiert. Lysate wurden entweder mit den anti-Numb-Antikörpern (D., oberes Feld) oder den anti-Siah-1-Antikörpern (D., mittleres Feld) oder den Anti-Tubulin-Antikörpern (D., unteres Feld) als Sonden untersucht. Es ist die Verringerung der Numb-Proteinniveaus in Siah-1 überexprimierenden U937-Zellen festzustellen.

7: In vivo-Wirkungen der Überexpression von Siah-1 auf die Notch-Aktivität Umverteilung von endogenem Notch in den U937-Zellen, welche Siah-1 überexprimieren.

A. Stabile U937-Transfektanten, welche entweder den Kontrollvektor (Felder 1 bis 3) oder Siah-1 (Felder 4 bis 7) exprimieren, wurden durch ein konfokales Mikroskop hinsichtlich der endogenen Immunfluoreszenz von Notch1 analysiert. Die Zellen wurden mit einem Antikörper, welcher den zytoplasmatischen Abschnitt von humanem Notch1 erkennt, markiert, gefolgt von einem sekundären, mit FITC konjugierten Antikörper. Die Immunfluoreszenzanalyse von Notch ist entweder in geringer Vergrößerung (Felder 1 und 4) oder großer Vergrößerung (Felder 2, 3, 5, 6 und 7) angegeben. Es ist die randartige Markierung des Schemas von Notch1 in den U937-Zellen mit dem Kontrollvektor verglichen mit der nukleären und zytoplasmatischen Markierung in den Zellen, welche Siah-1 überexprimieren, festzustellen. Die Markierung mit Propidiumiodid wurde mit aufgenommen, um die nukleäre Markierung von Notch1 besser sichtbar zu machen (Felder 3, 6 und 7). Das Vorhandensein von Notch1 im Kern wurde durch das Z-Ebenen-Bild (Feld 7) bestätigt. Der Längenbalken repräsentiert 5 μm.
B. Die Felder 8 bis 10 zeigen die nukleäre Translokation von Notch1, die durch EDTA in den U937-Zellen mit dem Kontrollvektor (Felder 8 bis 10) induziert wird. Zellen wurden in 10 mM EDTA, enthaltend PBS, 30 min bei 37°C inkubiert, gewaschen und mit anti-Notch1 (intrazellulär)-Antikörpern entweder unverzüglich (T = 0) oder 30 min (T = 30 ) nach der Entfernung des EDTA markiert. Die Zellen wurden mit Propidiumiodid gegenmarkiert, um den Kern sichtbar zu machen. Es ist das Vorhandensein einer positiven Markierung von Notch1 in dem Kern bei T = 30 festzustellen. Das Feld 8 zeigt die nicht behandelten U937-Zellen.
C. Notch1-Aktivität. MCF-7-Zellen und stabile MCF-7-Transfektanten, die Siah-1 überexprimieren, wurden vorübergehend mit einem NICD-Reporterkonstrukt (pGA981-6) transfiziert und 48 h nach der Infektion wurden sie hinsichtlich NICD-Aktivität überwacht. Es ist die endogene NICD-Reporter-Aktivität, die in den auf stabile Weise mit Siah-1 transfizierten MCF-7-Zellen verstärkt ist, festzuhalten. Diese verstärkte NICD-Aktivität wurde wirksam durch eine Cotransfektion mit Numb gehemmt.

BEISPIELE
Beispiel 1: Expression der GST-Fusionsproteine
Herstellung einer Vorkultur ausgehend von einer isolierten Kolonie von B121 (DE3), die mit dem Plasmid pGEX-P-1-Siah oder pGEX-P-1-Numb transformiert ist, in einem SB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C.
Das Plasmid PGEX-P-1 ist bei Amersham Pharmacia Biotech AB erhältlich.
Die Proteine sind die humanen Proteine, die durch die komplementären cDNAs, welche den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 (Siah) und SEQ ID Nr. 2 (Numb) entsprechen, kodiert werden. Die Referenzen der verschiedenen Proteine in GenBank sind für humanes Siah HSU76247 und für humanes Numb AF015040.
Am nächsten Tag 250 ml SB+Amp mit 5 ml der Vorkultur animpfen.
Vermehrung bei 37°C für GST-Numb oder 28°C für GST-Siah bis zu einer optischen Dichte zwischen 0,5 und 0,7.
Zugabe von 0,1 mM IPTG, um die Synthese der Proteine zu induzieren.
Vermehrung bei 37°C für GST-Numb oder 28°C für GST-Siah während 1 h 30 (GST-Numb) oder 1 h (GST-Siah).
Zentrifugation 3000 Upm während 10 min (1800 g, 4°C).
Resuspendierung des Präzipitats in 10 ml Puffer A NP40 (NP40 1%; Tris, pH 7,4, 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; Glycerol 10%; DTT 1 mM; Aprotinin 2 μg/ml; Leupeptin 2 μg/ml; Pepstatin 2 μg/ml; AEBSF 1 mM).
Dreimaliges Beschallen während 15 s mit Leistung 50, auf Eis.
Zentrifugation bei 12000 Upm während 10 min (18000 g bei 4°C).
Den Überstand bei –80°C aufbewahren.
Beispiel 3 – Bindung an die Sepharose-Glutathion-Kügelchen
Die gesamte Herstellung der Kügelchen und die Inkubationen erfolgen bei 4°C.
Zugabe von 2 ml Überstand zu 200 μl Kügelchen (hergestellt nach dreimaligem Spülen in PBS, einmaligem Spülen in Puffer A NP40, Resuspendierung in einer Konzentration von 50% (Gew./Vol.) in Puffer A NP40, Zentrifugation bei 3000 Upm jedes Mai).
Man setzt die Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen, die von Amersham Pharmacia Biotech AB unter der Referenz 17.0756.01 geliefert werden, ein.
Wenigstens 1 h bei 4°C sanft bewegen.
Die Kügelchen dreimal in Puffer A NP40 ohne Proteaseinhibitor spülen.
Die Kügelchen in 1 ml Puffer A NP40 mit Proteaseinhibitor resuspendieren.
Für die Analyse durch SDS-PAGE-Elektrophorese 20 bis 40 μl resuspendierte Kügelchen nehmen, 5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen, die Kügelchen in 10 μl Auftragspuffer X resuspendieren, bei 97°C 7 min erwärmen. Auf das Gel auftragen und nach Sichtbarmachung durch Coomassie-Blau, um die zu verwendende Menge der Fusionsproteine zu normalisieren, analysieren.
Beispiel 3: In vitro-Translation
Es wurde der TNT Coupled Reticulocyte Lysate System-Kit von Promega mit der T7- oder T3-RNA-Polymerase abhängig von dem Vektor, welcher eingesetzt wurde, um die Proteine zu translatieren und zu exprimieren (T7 für AIPI und Siah1, T3 für Numb), eingesetzt. Der Kit wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Referenz L4610) verwendet.
In die Proteine wurde ³⁵S-Methionin (Amersham Pharmacia) eingebaut.
Die in vitro erhaltenen Produkte wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert.
Nach der Elektrophorese wird das Gel ½ h in Fixierungspuffer (5% Methanol, 15% Essigsäure, 80% Wasser) gelegt und das Signal wird durch Eintauchen des Gels in das Produkt Amplify von Amersham Pharmacia (Referenz NAMP 100) verstärkt.
Dann wird ein Kodak Biomax MR-Film auf dem getrockneten Gel während einer Dauer, welche von einer Stunde bis zu einer Woche variiert, exponiert, dann entwickelt.
Beispiel 4: Copräzipitation der Proteine
30 μl der mit den GST-Fusionsproteinen gekoppelten Sepharose-Glutathion-Kügelchen wurden nach Normalisierung der Mengen mit dem Puffer B (NP40 1%, TrisHCl 50 mM, NaCl 150 mM, Leupeptin 2 μl/ml, Aprotinin 1%, ABESF 1 mM) gespült. Man setzt dann 5 bis 10 μl des in vitro- Translationsprodukts, wie es in Beispiel 3 erhalten worden ist, abhängig von der durch Autoradiographie beobachteten Menge des Produkts zu.
Nach einer Nacht Kontakt wurden die Kügelchen zehnmal mit Puffer A NP40 ohne Antiproteasen gespült.
Man analysiert durch SDS-PAGE und Autoradiographie.
Die 1B zeigt folglich klar, dass das durch in vitro-Translation erhaltene Siah-Protein sich an das GST-Numb-Fusionsprotein bindet.
Man kann auf die gleiche Weise zeigen, dass das durch in vitro-Translation erhaltene Numb-Protein sich an das GST-Siah-Fusionsprotein bindet (nicht gezeigt).
Beispiel 5: Zellen und vorübergehende Transfektionen
Die humanen embryonalen Nierenzellen 293T (ATCC-Referenz: CRL 1573) werden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ gehalten. Die Zellen haben am Tag vor der Transfektion eine neuerliche Passage durchlaufen.
Die Transfektionen der 293T-Zellen erfolgten durch die Calciumphosphat-Prozedur in DMEM plus 10% FCS in Gegenwart von 20 μM Chloroquin. Acht Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsmedium durch DMEM plus 10% FCS ersetzt. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion geerntet.
Für die Tests mit MG132 wurden die transfizierten Zellen 6 h bei 37°C mit MG132 in einer Konzentration von 50 μM (Calbiochem-Novabiochem) in DMSO oder, als Kontrolle, mit DMSO allein behandelt. Die Plasmide, welche das humane Numb-Protein, das Mdm2-Protein aus der Maus und GFP exprimieren, waren pcDNA3-Plasmide von Invitrogen, San Diego, CA, USA.
Das Protein Siah-1 wurde ausgehend von der komplementären DNA, in dem Plasmid pBKRSV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) subkloniert ist, erhalten.
Beispiel 6: Western Blot
48 h nach der Transfektion der 293T-Zellen mit den Plasmiden wurden die Zellen in einem TBS-Triton-Lysepuffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung [TBS], [pH 8,0]; 1% Triton X-100, 10 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid; Aprotinin 5 mg/ml, Leupentin 5 mg/ml) lysiert.
Die Zelllysate wurden durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran (Biorad) transferiert, gefolgt von einer Analyse durch Western-Blot mit dem polyklonalen Numb-Antikörper (Institut Weizmann, Ref. 3465, oder Referenz N80220 bei der Firma Transduction Laboratories) und dem monoklonalen anti-GFP-Antikörper (Boehringer, Ref. 1814460), um die Normalisierung der auf das Gel aufgetragenen Mengen zu verifizieren. Die Signale wurden detektiert, indem ein mit einer Peroxidase und mit elektrochemolumineszierenden Reagenzien gekoppelter sekundärer Antikörper von Amersham Pharmacia Biotech AB eingesetzt wurde.
Die 2 zeigt gut, dass die Menge von Numb-Protein in Gegenwart von Siah abnimmt, in gleicher Weise wie in Gegenwart von Mdm2. Diese Wirkungen scheinen unabhängig voneinander zu sein, denn es existiert eine Addition der Wirkungen, wenn die Proteine Siah und Mdm2 alle beide in Gegenwart von Numb gebracht werden.
Die 2B zeigt, dass der Abbau von Numb durch das Siah-Protein durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg erfolgt, denn dieser wird durch die Verwendung eines Inhibitors dieses Weges gehemmt.
Die in der vorliegenden Anmeldung präsentierten Ergebnisse zeigen so die Bindung, die zwischen den Proteinen Numb und Siah existiert, und die Tatsache, dass das Siah-Protein seine Wirkung entfaltet, um das Protein Numb durch einen von dem Ubiquitin-Proteasom abhängigen Weg abzubauen.
Man kann gleichfalls die Bindung zwischen den Proteinen Siah und Numb durch Verwendung von anderen Techniken, insbesondere der Doppel-Hybrid-Technik, die von dem von Finley und Brent (Annu. Rev. Genet. 1997; 31:663–704) entwickelten System abgeleitet ist, zeigen.
Das Köder („bait")-Protein kann in das Plasmid pEG202, das dem Fachmann auf diesem Gebiet für eine solche Anwendung bekannt ist (Promotor 67-1511, IexA 1538-2227, ADH Ter 2209-2522, pBR remnants 2540-2889, 2 μ on 2890-4785, YSCNFLP 4923-5729, HIS3 7190-5699, TYIB 7243-7707, RAF_part 7635-7976, pBR-Grundgerüst 7995-10166, bla 8131-8988), kloniert werden.
Das Beute („prey")-Protein kann in das Plasmid pJG4-5, welches gleichfalls dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt ist (GAL-Promotor 1-528, Fusionskassette 528-849, ADH Ter 867-1315, 2 μ ori 1371-3365, TRP1 3365-4250, pUC-Grundgerüst 4264-6422, Ap 4412-5274), kloniert werden.
Man setzt gleichfalls das pSH18-34-Reporterplasmid, das dem Fachmann auf diesem Gebiet gleichfalls bekannt ist, ein. Dieses Plasmid ist insbesondere bei Invitrogen unter der Referenznummer V611-20 und gleichfalls in in den Stamm EGY48 (welcher auch als RFY 231 bezeichnet wird) durch Transformation eingeführter Form bei dem gleichen Lieferanten erhältlich (Referenz Stamm allein: C835-00, transformiert durch pSH18-34: C836-00).
Die Bindung wird in dem Hefestamm RFY 231 (beschrieben in Finley Jr., et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14266–71) gezeigt. Dieser Hefestamm weist den Genotyp (MATα trp1Δ::hisG his3 ura3-1 leu2::3Lexop-LEU2) auf und ist von EGY48 (Guris et al., 1993, Cell, 75, 791–803) abgeleitet.
Das Reportergen war das LacZ-Gen.
Man führt die Untersuchung auf einem Galactose enthaltenden Medium, welches kein Leucin enthält, aus und man untersucht das Vorhandensein von gefärbten Kolonien auf diesen Schalen.
Beispiel 7: Screening von Verbindungen, welche mit der Siah-Numb-Bindung und/oder der Menge von Numb-Protein interferieren
Man führt die in den Beispielen 1 bis 6 beschriebenen Versuche aus, indem die Verbindungen, die man zu untersuchen wünscht, zugesetzt werden, und man vergleicht mit den Ergebnissen, die erhalten werden, wenn die Verbindungen nicht zugesetzt werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Bindung von Siah an Numb hemmt, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Inkontaktbringen der Verbindung in vitro mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert; b) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Bindung von Siah an Numb hemmt, welches die folgenden Schritte aufweist: a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt; b) Identifizierung der Verringerung und/oder der Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung für die Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose), dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Inkontaktbringen der Verbindung in vitro mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert; b) Identifizierung der Verringerung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung für die Verringerung und/oder die Hemmung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose), dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Inkontaktbringen von Verbindungen mit einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt; b) Identifizierung der Verbindungen, welche die Verringerung und/oder die Hemmung der Bindung zwischen Siah und Numb induzieren; c) Inkontaktbringen der in Schritt b) identifizierten Verbindungen mit einer Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert; d) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle bezogen auf eine Vergleichszelle, mit welcher die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung für die Erhöhung der Tumorrepression und/oder des Zelltods (Apoptose), dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Identifizierung von Verbindungen, welche die Bindung zwischen Siah und Numb hemmen, durch ein Verfahren nach Anspruch 2; b) Ausführen eines Verfahrens nach Anspruch 3 mittels der in dem Schritt a) identifizierten Verbindungen.
Verfahren zur Identifizierung einer Region von Siah, die hinsichtlich der Erhöhung der Tumorsuppression und/oder der Apoptose aktiv ist, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden in vitro mit einer Säugetierzelle, welche das Protein Numb exprimiert; b) Identifizierung der Verringerung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle verglichen mit der Menge von Numb-Protein, welche in einer als Vergleich dienenden Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert, vorhanden ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Region von Siah, die hinsichtlich der Verringerung und/oder der Hemmung der Tumorsuppression und/oder der Apoptose aktiv ist, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden in vitro mit einer Säugetierzelle, welche das Protein Numb exprimiert; b) Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle verglichen mit der Menge von Numb-Protein, welche in einer als Vergleich dienenden Säugetierzelle, welche die Proteine Siah und Numb exprimiert, vorhanden ist.
Verfahren zur Identifizierung der Regionen von Siah, welche an der Bindung an das Numb-Protein beteiligt sind, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen von von dem Siah-Protein abstammenden Peptiden in einem System, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen Siah und Numb erlaubt; b) Identifizierung der Peptide, welche die Verringerung der Bindung zwischen Siah und Numb in dem System zur Folge haben.
Verfahren zur Identifizierung eines Produkts mit einer Aktivität hinsichtlich der Erhöhung der Tumorrepression und/oder der Apoptose, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 3, 5 oder 6, b) Modifizierung des in Schritt a) ausgewählten Produkts insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst, c) Test des in Schritt b) modifizierten Produkts in in vitro- und/oder in vivo-Verfahren mittels sachdienlicher nicht-humaner Modelle von Tumorrepression und/oder Apoptose, d) Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, eine Aktivität hinsichtlich Tumorrepression und/oder Apoptose, welche höher als die für das in Schritt a) ausgewählte Produkt erhaltene Aktivität ist, zu erhalten.
Verfahren zur Identifizierung eines Produkts mit einer Aktivität hinsichtlich der Verringerung und/oder Hemmung der Tumorrepression und/oder der Apoptose, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 7, b) Modifizierung des in Schritt a) ausgewählten Produkts insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst, c) Test des in Schritt b) modifizierten Produkts in in vitro- und/oder in vivo-Verfahren mittels sachdienlicher nicht-humaner Modelle von Tumorrepression und/oder Apoptose, d) Identifizierung des Produkts, welches erlaubt, eine Aktivität hinsichtlich Tumorrepression und/oder Apoptose, welche bezogen auf die für das in Schritt a) ausgewählte Produkt erhaltene Aktivität verringert ist, zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugetierzelle transfiziert ist durch wenigstens einen Vektor, welcher unter einem Vektor, welcher ein Siah kodierendes DNA-Fragment trägt, einem Vektor, welcher ein Numb kodierendes DNA-Fragment trägt, einem Vektor, welcher ein Siah kodierendes DNA-Fragment und ein Numb kodierendes DNA-Fragment trägt, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Erhöhung der Menge von Numb-Protein in der Säugetierzelle durch Western-Blot ausgeführt wird.
Komplex, welcher aus einem Siah-Protein und einem Numb-Protein gebildet wird.