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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Hautpräparation, enthaltend Derivate
der δ-Aminolävulinsäure (ALA)
und Substanzen, die UVA- und UVB-Strahlen absorbieren, ein Verfahren
zum Schutz der Haut von Säugern
und die Verwendung der Präparation
zum Sonnenschutz.
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Alle
drei Hautkrebstypen, Basal-Zell-Karzinom (BCC, 10.000 pro Jahr in
Norwegen), Squamosus-Zellkrebs (SCC, 6 bis 700 pro Jahr in Norwegen) und
malignes Melanom der Haut (CMM, 900 bis 1.000 pro Jahr in Norwegen)
werden im wesentlichen durch Sonnenbestrahlung ausgelöst. Dies
wird deutlich durch ihr Muster der Lokalisierung auf dem Körper und
durch den Nord-Süd-Gradienten
der Inzidenz demonstriert (z.B. dreimal häufiger an der Südküste von
Norwegen als im nördlichen
Norwegen). Jahrzehntelang ist das Auftreten von Hautkrebs schneller
angestiegen als das Auftreten der meisten anderen Krebsarten und
es gibt wenig Zweifel, dass dies an dem verstärkten Sonnenbaden liegt, häufigeren
Reisen in südliche
Gefielde und häufigere
Verwendung von Solarien. Ein ähnlicher
Anstieg wie der in Norwegen kann in den meisten westlichen Ländern mit
einer weißen
Bevölkerung
beobachtet werden. Das häufigere
Sonnenbaden ist wahrscheinlich im wesentlichen auf einen kulturellen
Druck zurückzuführen, wobei
eine gebräunte
Haut ein Zeichen von Überfluss,
Wohlstand und guter Gesundheit ist.
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Sonnencremes
mit zugefügtem "Sonnenfaktor", die UVB (Wellenlängen zwischen
280 und 320 nm) und UVA (Wellenlängen
zwischen 320 und 400 nm) absorbieren, werden in großen Teilen
der Welt weit verbreitet verwendet. Diese Sonnencremes stellen jedoch
keinen vollständigen
Schutz gegen eine solche Strahlung bereit, haben jedoch die Wirkung, dass
sie die Dosis in einem größeren oder
geringeren Ausmaß reduzieren.
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Die
Verwendung von Sonnencremes mit einem Sonnenfaktor scheint jedoch
das Auftreten von Hautkrebs nicht reduziert zu haben. Noch scheint
das Gegenteil der Fall zu sein. Es kann angenommen werden, dass,
da die Sonnencremes einen Schutz gegen einen Sonnenbrand bieten,
sie ein falsches Gefühl
der Sicherheit verleihen, mit dem Ergebnis, dass die Menschen dazu
verleitet werden, in der Sonne länger,
als sie sollten, zu bleiben. Dies verlagert den Schutz, der durch
die Sonnencreme bereitgestellt wird, zu einer erhöhten Aussetzungszeit.
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Kürzliche
Forschungen haben gezeigt, dass die Sonnencremes vermutlich keinen
so guten Schutz gegen eine Belastung des Immunsystems und eine Entwicklung
eines malignen Melanoms, wie gegen einen Sonnenbrand bereitstellen.
Dies ist mit der Tatsache assoziiert, dass während der Sonnenbrand (das
Erythem) im wesentlichen auf UVB zurückzuführen ist, dass die UVA-Strahlung,
wovon es 30- bis 50mal mehr gibt als UVB-Strahlung im Solarspektrum,
sowohl eine Beeinträchtigung
des Immunsystems als auch eine Entwicklung von Melanom auslöst. Dies
scheint für
das kurzwellige (blaue) sichtbare Licht zu gelten, das von den jetzt
sich in Verwendung befindenden Sonnencremes nicht gestoppt wird.
Da die Aktionsspektren für
die Pigmentierung, den Sonnenbrand und Hautkrebs im UVB-Bereich
fast identisch sind, während
UVA und sichtbares blaues Licht das Aktionsspektrum für das maligne
Melanom dominieren, ist es daher nicht möglich, eine Pigmentierung (eine
gelbbraune Hautfarbe) auf traditionelle Weise zu erreichen, selbst wenn
eine Creme mit einem "Sonnenfaktor" verwendet wird,
ohne sich einem erhöhten
Risiko für
einen Hautkrebs auszusetzen. Sowohl UVB als auch UVA induzieren
die Synthese von Melanin, dem Pigment, das die gelbbraune Hautfarbe
ausmacht. Melanin absorbiert sowohl UVB als auch UVA und hat so
eine schützende
Wirkung. Dieser Schutz ist jedoch nicht ausreichend, um bei Menschen
mit heller Haut (Typen I bis III) die Entwicklung von Hautkrebs
zu verhindern.
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Es
besteht daher ein großer
Bedarf an einer Hautcreme, die gegen die schädlichen Wirkungen der Sonne,
wie oben dargestellt, schützt,
während eine
akzeptable Pigmentierung der Haut bereitgestellt wird.
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Sowohl
aus dem US-Patent Nr. 5,520,905 als auch der
EP 0 633 017 A2 sind kosmetische
und dermatologische Zusammensetzungen bekannt, die absorbierende
Mittel für
UVA- und UVB-Strahlung
zusätzlich
zu einer Kombination aus δ-Aminolävulinsäure (ALA)
und mindestens einem Antioxidanz enthalten. Es wird gesagt, dass
diese Zusammensetzungen einen Schutz gegen Hautschäden aufgrund einer
Aussetzung gegenüber
Licht bereitstellt. Aus Photochemistry and Photobiology, 1997, 66(4): 493–496 ist
weiterhin bekannt, dass wenn ALA topisch auf Nacktmäuse aufgebracht
wird und diese einer Behandlung mit simulierter Solar-UV-Bestrahlung ausgesetzt
werden, die ausgesetzten Bereiche erythematös werden, wobei zusätzlich eine
fotoinduzierte Karzinogenese verzögert war. Darauffolgende Experimente
haben gezeigt, dass das Aussetzen gegenüber Licht von ALA, das die
Erzeugung des Protoporphyrins IX (PpIX) induziert, sich über Hautbereiche
verteilt, die deutlich größer sind
als ein Bereich, auf den ALA ursprünglich aufgebracht wurde (Proc. Photochemotherapy
of Cancer and Other Diseases, Band 3563, 1999). Zusammen mit der
Beobachtung, dass die Lichtaussetzung von Nacktmäusen in Photochemistry and
Photobiology (1997, 66(4): 493–496) deutlich
zu Unbehagen und Schmerzen führte,
bewertet auf der Basis der Irritation der Tiere, und den breiten
Bereich der Haut, der beteiligt ist, wenn ALA verwendet wird, scheint
die Verwendung von ALA in Hautcremes substanzielle Nebenwirkungen
zu haben.
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Wie
im folgenden dokumentiert, wird eine Anwendung von ALA-haltiger Sonnencreme über große Hautbereiche
zu einer breiten Verteilung der Verbindung im Körper führen. Es ist auf dem Gebiet der
Porphyrieerkrankungen wohlbekannt, dass die Anhäufung von ALA im Körper zu
Nebenwirkungen führen
kann, da es bekannt ist, dass ALA sowohl Leber- als auch neurotoxisch
sein kann.
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Sonnenschutzzusammensetzung
bereitzustellen, die die oben erwähnten Nebenwirkungen nicht
aufweist.
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Diese
Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung erreicht, die in den
beigefügten
Ansprüchen gekennzeichnet
ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Hautpräparation, die sich auf vorteilhafte
Weise der schützenden
Wirkung bedient, die ALA-Derivate im Zusammenhang mit Sonnenlicht
bereitstellen können. Die
Erfindung betrifft so eine Präparation,
basierend auf einer standardisierten kommerziellen Basis, wozu ein
UVB-absorbierendes Mittel, ein UVA-absorbierendes Mittel und ein
ALA-Derivat zugefügt
werden. Das Derivat ist gewählt
aus der Gruppe, umfassend Ester- und Aminoderivate von ALA. Kommerziell
erhältliche
und getestete UVB- und UVA-absorbierende Mittel werden in Konzentrationen
verwendet, die einen Schutzfaktor von mindestens 20 bereitstellen.
Von den ALA-Derivaten wird eine Konzentration verwendet, die 1000-
bis 50fach niedriger ist als die, die für die fotodynamische Behandlung
von Hautkrebs verwendet wird (20% auf Gewichtsbasis).
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Die
Creme gemäß der Erfindung
hat daher die folgende Wirkung:
- 1) Sie eliminiert
sowohl die UVB- als auch die UVA-Strahlung und verhindert die gewöhnliche Hautkrebsentwicklung.
- 2) Sie stimuliert die Melanogenese in der Haut durch Produktion
von PpIX aus dem ALA-Derivat und macht es so möglich, sich ohne ein Risiko
von Hautkrebs zu bräunen.
- 3) Sie hat eine anti-kanzerogene Wirkung (wirkt der Krebsentwicklung
entgegen).
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Die
Präparation
wird wie übliche
Sonnencreme/-ö1
angewendet, bevor man in die Sonne geht.
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Die
vorliegenden Erfinder haben Forschungen durchgeführt, die zeigen, dass die Melaninsynthese
weiter durch Anwendung der Derivate von δ-Aminolävulinsäure (ALA), insbesondere der
Ester- oder Aminoderivate auf die Haut stimuliert werden kann. ALA-Derivate
haben eine bräunende
Wirkung auf vollständig
unterschiedliche Weise als UVB und UVA. Die Porphyrinsynthese wird
stimuliert, indem man sich der Hautzellbiosynthese von Häm bedient. Geringe
Menge des Protoporphyrins IX (PpIX) häufen sich dadurch in den Hautzellen
an. PpIX ist eine fotosensibilisierenende Substanz, die während der Aussetzung
einen oxidativen Zellschaden auslöst. PpIX wird in den Mitochondrien
der Zellen gebildet, jedoch nicht in den Kern absorbiert. Während des Sonnenbads
wird daher PpIX keinerlei genetische Schäden auslösen, die die Basis für eine Krebsentwicklung
bilden können,
wie im Fall von UVB und UVA. Der oxidative Zellschaden, der sich
ergibt, wenn die Haut nach der Behandlung mit ALA-Derivaten ausgesetzt
wird, stimuliert die Melaninsynthese, d.h. die Pigmentierung. Die
detaillierte Biosynthese von Melanin ist nicht bekannt, weder für UVB, UVA noch
für ein
Aussetzen gegenüber
PpIX, es wird jedoch angenommen, dass UVB über einen DNA-Schaden arbeitet.
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Es
wurde gezeigt, dass die Gegenwart geringer Mengen von PpIX, erzeugt
durch ALA, in der Haut von Mäusen,
die mit UV bestrahlt wurden, eine anti-kanzerogene Wirkung aufweist.
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PpIX
inhibiert die Entwicklung von UV-induziertem Hautkrebs bei den Tieren.
ALA-Derivate erzeugen auch PpIX.
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ALA-Derivate
haben dadurch eine doppelt schützende
Wirkung:
- 1) Sie stimulieren, d.h. sie beschleunigen
die Pigmentierung (was eine schützende
Wirkung gegen UVB und UVA hat), ohne einen DNA-Schaden auszulösen, der
wiederum zu einer Krebsentwicklung führen könnte. So demonstrierten fluoreszenzmikroskopische
Experimente, dass die durch diese Cremes gebildete aktive Substanz,
PpIX, nicht in Zellkernen existiert, wo es DNA gibt, sondern im
Zytoplasma, im wesentlichen in den Mitochondrien (Daten nicht beigefügt). Weiterhin
haben Patienten mit der ererbten Erkrankung erythropoetische Protoporphyrie
(EPP) große
Mengen PpIX in ihrer Haut. Für
diese Patienten wurden keine Fälle
von Hautkrebs berichtet. Obwohl diese Erkrankung selten ist, sollte
man Berichte über Hautkrebs
bei EPP-Patienten über
eine längere Zeitspanne
und in vielen Ländern
erwarten, da ihre Haut mit besonderer Aufmerksamkeit überwacht
wird.
- 2) ALA-Derivate hatten eine inhibierende Wirkung auf die Entwicklung
von Hautkrebs. Geringe Mengen UVB und UVA werden jede Sonnencreme passieren,
unabhängig
vom Schutzfaktor. Das in der Haut durch die ALA-Derivate gebildete
PpIX wird die Haut gegen eine UVB- und UVA-induzierte Krebsentwicklung schützen. Zusätzlich hat
der vorliegende Erfinder beobachtet, dass die Hautreaktion gegenüber einem
Aussetzen gegenüber Licht
einer mit ALA-Derivaten behandelten Haut auf diejenigen Bereiche
begrenzt ist, die von der Zusammensetzung bedeckt sind. Dies ist
eine überraschende
und positive Wirkung im Vergleich mit der Wirkung von ALA. Außerdem haben ALA-Ester
eine vollständig
unterschiedliche Pharmakokinetik und sind im Vergleich mit ALA antikanzerogen.
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Zusammengefasst
haben ALA-Ester einige extrem überraschende
Vorteile gegenüber
ALA: Wenn ALA auf die Haut von Mäusen
angewandt wird, passiert es schnell in den Blutkreislauf und induziert PpIX
in der gesamten Maus, in der Haut und überall, in der Leber, im Verdauungstrakt
usw. ALA-Ester treten andererseits nicht in den Blutkreislauf ein
und erzeugen PpIX nur an der Hautlokalität, auf die sie aufgebracht
wurden. Dies ist überraschend,
das die Ester lipophiler sind als ALA selbst und man daher erwarten
könne,
dass sie einfacher durch die Epidermis und in den Blutkreislauf
eintreten würden.
Weiterhin unterscheidet sich die Kinetik der PpIX-Produktion von
derjenigen von ALA. Während
sie eine Pigmentierung während
der Lichtaussetzung induzieren, scheinen sie oberflächlicher
in der Haut zu wirken als ALA. Diese Unterschiede lassen sie für die Sonnencremeverwendung
besser geeignet erscheinen als ALA.
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Gemäß der Erfindung
wird eine Präparation oder
Zusammensetzung bereitgestellt, die auf die Haut im Zusammenhang
mit einem Sonnenbaden aufgebracht wird und die die Bildung von Hautpigmenten
unterstützt,
gegen die kanzerogenen Wirkungen von UVA und UVB-Strahlen schützt und
eine anti-kanzerogene Wirkung aufweist. Die Präparation umfasst UVA-absorbierende
Mittel, UVB-absorbierende Mittel, ALA-Derivat, pharmazeutisch annehmbare
Träger,
Emulgatoren, Verdünnungsmittel
und Konservierungsmittel, die für
eine dermale topische Anwendung geeignet sind.
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UVB-
und UVA-absorbierende Mittel werden aus bekannten, kommerziell erhältlichen
Substanzen gewählt,
die zur Verwendung in Sonnencremes zugelassen sind, wie z.B. Oxybenzolen,
Methoxycinnamaten, Salicylaten, Benzophenonderivaten, Phenylbenzidinderivaten
und Methoxybenzoylderivaten, zusätzlich
zu physikalischen Filtern wie Titandioxid, Zinkoxid, Calciumcarbonat,
Kaolin, Magnesiumoxid, Eisenoxid oder Talk. Es werden vorzugsweise Verbindungen
gewählt,
die in einem möglichst
geringen Ausmaß in
den Blutkreislauf eindringen und Konzentrationen, die einen Schutzfaktor
von mindestens 20 bereitstellen.
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Die
ALA-Derivate werden in Konzentrationen von 0,02% bis 0,4%, basierend
auf dem Gewicht der vollständigen
Zusammensetzung, angetroffen.
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Die
Zusammensetzung kann als Öl,
Gel, Creme, Salbe, Paste, Spray, Sticks oder in anderen auf dem
Gebiet bekannten Formen formuliert werden. Die Formulierungen enthalten
außerdem
die aktiven Verbindungen, Verdickungsmittel, Geliermittel, Suspendiermittel,
Emulgatoren, Dispersionsmittel und Farbstoffe, die dem Fachmann
auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
umfasst eine Präparation
auf üblicher
kommerzieller Basis, worin die Konzentrationen der UVA- und UVB-absorbierenden
Mittel einen Schutzfaktor von mindestens 20 bereitstellen und das
ALA-Derivat ein ALA-Ester ist, z.b. ALA-Methylester, mit einer Konzentration
von 0,02% bis 0,4%, basierend auf dem Gewicht der Creme.
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Die
Erfindung wird nun durch die Beispiele und Figuren gestützt, die
in keiner Weise den Umfang des Schutzes begrenzen sollen, der durch
die beigefügten
Ansprüche
definiert ist.
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1 Menschliche Hände mit einer ALA- und ALA-Methylester-haltigen
Creme, aufgebracht auf die Hautoberfläche (A:ALA; M:ALA-Methylester). Die
unteren Felder (B) sind Vergrößerungen
der korrespondierenden oberen Felder (A). In den linken Feldern
wurde die Haut gegenüber
Licht (350 bis 400 nm) für
5 min ausgesetzt, in den rechten Feldern betrug die Lichtaussetzungszeit
1 min. Die ausgesetzten Bereiche werden mit unterbrochenen Kreisen markiert.
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2 Lichtemission
(rel.u) gegen Wellenlänge
(nm) von dem in 1 verwendeten unsichtbaren Licht
(black light).
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3A,
B PpIX-Fotobleichen unter UV-Aussetzung bei 368 nm. ALA (A) und
ALA-Methylester (M) wurden topisch 2 Stunden auf die Haut der Nacktratte
aufgebracht. Eine Fluoreszenzkinetik für die Anregungswellenlänge war
410 nm. Das untere Feld zeigt normalisierte Intensitäten, worin
die Fluoreszenzintensität
bei der Zeit 0 auf 1 gestellt ist.
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4A,
B PpIX-Fotobleichen unter UV-Aussetzung wie in 3A,
B, wobei die ALA- und ALA-Methylester-haltige Creme 24 Stunden aufgebracht
wurde.
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5 Eine
haarlose Maus mit einer Creme, enthaltend ALA-Methylester, aufgebracht
zwischen den Pfeilen, nach einer Aussetzung gegenüber Laserlicht
für 1 min,
wobei das Lichtaussetzen 10mal in 2 Wochen wiederholt wurde.
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6 Obere Felder (A). Menschliche Arme mit
ALA-(A) und ALA-Methylester (M)-haltiger Creme, die 4 Stunden aufgebracht
wurde, woraufhin die Creme entfernt und der Arm 3 min Licht ausgesetzt wurde.
Unteres linkes Feld (B). Menschlicher Arm, eine Woche nach einer
einzelnen nicht-erythemogenen
Behandlung innerhalb der Pfeile. Unteres rechtes Feld (B). Menschlicher
Arm, 2 Wochen nach einer Lichtaussetzung (20% ALA; 1 min Licht).
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7 Gewebeverteilung
der PpIX-Fluoreszenzintensität
bei Mäusen
nach topischer 5-stündiger
Anwendung einer 20%igen ALA/ALA-Me/ALA-Hex-Creme.
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8 Gewebeverteilung
der PpIX-Fluoreszenzintensität
bei Mäusen
nach topischer 20-stündiger
Anwendung einer 20%igen ALA/ALA-Me/ALA-Hex-Creme. Die Fluoreszenz
wurde durch ein LS 50B-Spektrofluorimeter
gemessen.
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9 Konzentration
von PpIX im Plasma 20 Stunden nach der topischen Anwendung von 20% ALA,
ALA-Methylester
(Me) oder ALA-Hexylester (Hex).
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10 Nackte
BALB/c-Mäuse,
fotografiert 8 Stunden, nachdem Cremes, die ALA und ALA-Methylester
enthielten, auf die Bereiche der Haut aufgebracht wurden, die mit
unterbrochenen Kreisen markiert sind.
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Beispiel 1
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Tierexperimente
zeigen, dass die UV-Induktion von Hautkrebs durch ALA-Cremes verzögert wird,
die PpIX erzeugen (Photochemistry and Photobiology, 1997, 66(4):
493–496),
wie Cremes, die ALA-Ester enthalten.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass ALA tiefer in die menschliche Haut penetriert
und das resultierende Erythem eine größere Hautoberfläche bedeckt
als nach einer Anwendung von ALA-Methylester.
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Experimenteller
Teil
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Eine
hohe Konzentration von ALA und ALA-Methylester (20%, Sigma) in einer
Creme (Unguentum Merck) wurde auf einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser
von 1 cm für
5 Stunden auf beide Hände
einer Person aufgebracht, 1 (A, B).
A bedeutet ALA, M bedeutet ALA-Methylester. Die Bereiche des Aufbringens
sind durch die gepunkteten Kreise in der Figur dargestellt. Die
Creme mit den Arzneimitteln wurde vorsichtig abgewaschen und die
Bereiche wurden gegenüber üblichem
unsichtbarem Licht aus einem Fluoreszenzrohr ausgesetzt. Die Wellenlängen des
Lichts fallen in den Bereich von 350 bis 400 nm, 2.
Eine Aussetzung von 5 Minuten wurde auf die linke Hand und eine Aussetzung
von 1 Minute auf die rechte Hand angewandt. Diese Aussetzungen sind
beide sehr viel größer als
diejenigen, die ein Sonnencremeverwender erleben würde, wurden
jedoch gewählt,
um den Unterschied in der Penetrationstiefe zwischen ALA und dem
ALA-Methylester zu demonstrieren.
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Ergebnisse
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Die
hier verabreichten längeren
Aussetzungen induzieren, wie für
die Demonstration beabsichtigt, ein Erythem, das sich vom Bereich
der Anwendung her ausbreitet. Die Ausbreitung war bei ALA sehr viel
stärker
ausgeprägt
als bei dem ALA-Methylester. Bei ALA war das Erythem zirkulär und bedeckte
sowohl den oberen als auch den unteren Teil der Hand, während sich
bei dem ALA-Methylester das Erythem nur in einem Halbkreis im oberen
Teil der Hand entwickelte, wo die Haut gemäß gut etablierten physiologischen
Kenntnissen dünner
ist. Das Fluoreszenzmuster von PpIX wurde deutlich gesehen und stimmte
mit dem Erythem überein
(Daten nicht dargestellt).
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Schlussfolgerung
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ALA
scheint dickere Haut zu durchdringen und PpIX tiefer zu induzieren
als der ALA-Methylester dazu in der Lage ist. Dies ist im Hinblick
auf die Tatsache überraschend,
dass ALA-Methylester
das lipophilere der beiden Arzneimittel ist. Für die Anwendung in einer Sonnencreme
hat der ALA-Methylester daher einen starken Vorteil, da er ein niedrigeres
Potenzial zum Eindringen ins Blut aufweisen würde.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel demonstriert die Unterschiede in den Fotobleichraten von
PpIX, erzeugt in der Haut von Nacktratten nach Anwendung von ALA
und ALA-Methylester.
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ALA
und sein Methylesterderivat wurden auf die Haut von Nacktratten
(RWT Nu/Nu) für
2 (3a und b) und 24 Stunden (4a und
b) aufgebracht. Dann wurde die Haut gegenüber Licht in einem Wellenlängenbereich
um 368 nm ausgesetzt. Die Intensität lag in einer Größenordnung
von 20 W/m2. Es kann beobachtet werden,
dass das von ALA-Me erzeugte PpIX schneller gebleicht wird als von
ALA erzeugtes PpIX. Dies stimmt mit dem Ergebnis von Beispiel 2 überein und
zeigt an, dass ALA PpIX tiefer in der Rattenhaut erzeugt als dies
ALA-Me tut.
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Beispiel 4
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Dieses
Beispiel zeigt Beweise, die unterstützen, dass sowohl ALA als auch
ALA-Derivate eine Pigmentierung in der Maushaut und der menschlichen
Haut induzieren.
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Experiment
A
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ALA-Methylester
(1% in Unguentum Merck Creme) wurde auf die Haut von C3H/Tif haarlosen Mäusen aufgebracht.
Eine Stunde nach der Anwendung wurden die Mäuse Licht für 1 min ausgesetzt (rotes Laser-Licht,
100 m/Wcm2 633 nm). Es wurde kein Erythem
beobachtet. Die Behandlung wurde 10mal in 2 Wochen wiederholt.
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Experiment
B
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ALA
und ALA-Derivate in Cremes wurden auf unterschiedliche Bereiche
auf dem Vorderarm einer Person aufgebracht. Vier Stunden später wurde die
Creme entfernt und der Arm unsichtbarem Licht ausgesetzt, mit 380
nm für
1 bis 5 min. Die Haut des Arms wurde für zwei Wochen überprüft.
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Ergebnisse
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- A. Die Haut der Mäuse, die dem Arzneimittel und Licht
ausgesetzt wurden, pigmentierte graduell. Die Haut außerhalb
des Punkts der Aufbringung des Arzneimittels veränderte sich weder im Hinblick
auf Farbe noch im Hinblick auf die Morphologie (5).
- B. Hohe Dosen des Lichts (3 min) und des Arzneimittels (20%)
führten
zu einem Erythem, wie beispielhaft dargestellt für ALA (A) und ALA-Methylester
(M) in den oberen Feldern (A) von 6. Niedrigere
Dosen des Arzneimittels und von Licht ergaben kein beobachtbares
Erythem, jedoch trat eine Woche nach einer solchen niedrigen Dosis einer
einzelnen nicht-erythemogenen Behandlung von ALA eine deutlich sichtbare
Pigmentierung (Melanogenese) auf (6,
unterer linker Feldbereich, markiert durch Pfeile) (B). Eine leicht erythemogene
Lichtaussetzung (20% ALA, 1 min Licht) führte auch zu einer späteren Pigmentierung,
beispielhaft dargestellt auf dem unteren rechten Feld von 6, das 2 Wochen nach der Lichtaussetzung
genommen wurde (Bereiche, markiert mit A und Pfeilen). Die Lichtaussetzung ergab
keine Reaktion außerhalb
des Bereichs der Arzneimittelanwendung, wie durch die Pfeile dargestellt
ist. Außerdem
ergab die Arzneimittelanwendung allein keine Wirkung.
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Schlussfolgerung
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Die
topische Anwendung von ALA oder ALA-Derivaten auf Maus- und menschliche
Haut, gefolgt von einer Lichtaussetzung, führt zu einer Melanogenese (braune
Pigmentierung). Hohe Dosen von Arzneimittel und Licht ergeben ein
Erythem. Die Pigmentierung kann sowohl durch erythemogene Einzelaussetzungen
als auch wiederholte nicht-erythemogene Aussetzungen erreicht werden.
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Beispiel 5
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass die topische Anwendung von ALA zu einer
deutlich breiter verteilten Produktion von PpIX führt als
die topische Anwendung von ALA-Derivaten.
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ALA-,
ALA-Methylester- und ALA-Hexylester-haltige Cremes wurden lokal
auf die Hautoberfläche
von haarlosen Mäusen
aufgebracht. Fluoreszenzintensitäten
wurden als Anzeigen der Konzentration von PpIX auf der Anwendungsstelle
(Haut), in entfernten Hautstellen, in der Leber, den Verdauungsorganen,
der Lunge, den Muskeln und dem Gehirn und Plasma verwendet.
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5-Aminolävulinsäure (ALA)
und 5-Aminolävulinsäuremethylester
(ALA-Me) wurden von Sigma. St. Louis, Mo erworben. 5-Aminolävulinsäurehexylester
(ALA-Hex) wurde von PhotoCure ALS (Oslo, Norwegen) erhalten.
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Eine
Creme wurde unter Verwendung von 20% (G/G) ALA, ALA-Me oder ALA-Hex
in einer Salbe (Unguentum, Merck, Darmstadt, Deutschland) hergestellt.
Ungefähr
0,2 mg der frisch hergestellten Creme wurden auf einen einzelnen
Punkt mit einem Durchmesser von 1 cm auf eine normale Haut jeder Maus aufgebracht.
Ein Haftverband (OpSite Flexigrid, Smith and Nephew Medical, LTD,
Hull, England) mit einem eingestanzten Loch mit einem Durchmesser
von 1 cm wurde zunächst
auf die Haut gegeben. Dann wurde die Creme auf die Haut in dem ausgestanzten
Loch aufgebracht und mit einem anderen ähnlichen Verband abgedeckt.
Es wurden 20 Stunden Anwendungszeit verwendet.
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Weibliche
Balb/c-Athymus-Nacktmäuse
wurden von Bomholt Gaard (Ry, Dänemark)
erhalten. Zu Beginn jedes Experiments waren sie 7 bis 8 Wochen alt
und wogen 18 bis 25 g. Drei Mäuse
wurden in einem Käfig
beherbergt, und zwar mit autoklavierten Filterabdeckungen in einem
Raum mit abgedämpftem
Licht bei konstanter Temperatur (24 bis 26°C) und Luftfeuchtigkeit (30
bis 50%). Nahrungsmittel und Streu waren sterilisiert und den Mäusen wurde Leitungswasser
ad libitum in sterilisierten Flaschen verabreicht. Für die richtige
Anwendung der Creme wurde eine Anästhesie, hypnorm dormicum (ungefähr 4 ml/kg
Körpergewicht)
i.p. den Mäusen
injiziert. Die Mäuse
wachten innerhalb von 1 Stunde auf und erschienen während der
ALA-Anwendung normal
aktiv.
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Bestimmung
von PpIX-Konzentrationen in Geweben
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Das
Verfahren zur Bestimmung der Mengen von PpIX in Geweben wurde bereits
früher
beschrieben (Ma et al., 1998). Kurz gefasst wurden direkt nach der
Sammlung der Gewebe die frischen Gewebsproben zweimal in PBS gespült, auf
sauberem Papier trockengetupft, gewogen und dann in Suspension in
einer Lösung
von 1% SDS in 1 N Perchlorsäure/Methanol
(1:1 V/V) durch einen Ystral (Dottingen, Deutschland) mechanischem
Homogenisator gebracht. Nach dem Homogenisieren wurden die Gewebssuspensionen
eingefroren, getaut, beschallt, in demselben Lösungsmittel verdünnt und
zentrifugiert. Die PpIX-Niveaus
in den Überständen wurden
quantitativ durch Aufzeichnung der Fluoreszenz-Emissionsspektren
der Proben unter Verwendung eines Perkin-Elmer (Norwalk, CT) LS
50B Spektrofluorimeters bestimmt. Die Anregungswellenlänge war
407 nm, die Schlitzbreite korrespondierte zu einer Auflösung von
15 nm und die Emissionswellenlänge
wurde von 550 bis 700 nm gescannt. Ein Cut-Off-Filter wurde verwendet,
um gestreutes Licht von kürzeren Wellenlängen als
515 nm aus dem Licht zu entfernen, das das Nachweissystem des Spektrometers erreichte.
Die Konzentrationen von PpIX in den Proben wurden durch Zugabe einer
bekannten Menge des Arzneimittels (interner Standard), vergleichbar mit
dem, das bereits im Extraktionsmedium vorlag, und nochmaliges Aufzeichnen
der Emissionsspektren bestimmt. Die Konzentrationen werden in Mikrogramm
PpIX pro Gramm Feuchtgewebe angegeben.
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PpIX-Konzentrationen
im Plasma
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Direkt,
nachdem die Mäuse
getötet
worden waren, wurde Gesamtblut direkt aus dem rechten Atrium des
Herzen entnommen. Das Gesamtvolumen des erhaltenen Bluts von jeder
Maus betrug ungefähr 0,2
ml und wurde in EDTA-behandelten Mikroröhrchen selektiert. Die roten
Blutzellen wurden fluorimetrisch, wie oben beschrieben, bestimmt.
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Wie
in 7 und 8 demonstriert, erzeugte ALA
signifikant mehr PpIX außerhalb
der Anwendungsstelle, sowohl nach 5stündiger Anwendungszeit (7)
als auch nach 20stündiger
Anwendungszeit (8), im Vergleich mit dem ALA-Methylester. Dementsprechend
war die Konzentration von ALA im Plasma höher als sowohl beim ALA-Methylester
als auch beim ALA-Hexylester (9).
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass im Gegensatz zu ALA der angewandte ALA-Methylester auf
den Hautbereich begrenzt ist, auf den er aufgebracht wird.
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Creme,
die 20% ALA und 20% ALA-Methylester enthielt, wurde auf den Bereich
aufgebracht, der durch durchbrochene Kreise markiert ist (9) und
zwar auf die Haut von nackten BALB/c-Mäusen und Fotos wurden unter
UV-Lampenbeleuchtung nach 8 Stunden genommen. Die Fotos zeigten
einen deutlichen Unterschied in der Lokalisierung der Protoporphyrin
IX (PpIX) -Fluoreszenz. ALA-Methylester hatte PpIX nur in dem Bereich
erzeugt, auf den die Creme aufgebracht wurde, während PpIX, das von ALA erzeugt
wurde, auf der gesamten Haut lokalisiert ist. Dies demonstriert,
dass ALA durch das Blut (9) auf den ganzen Körper verteilt
wird, während das
ALA-Methylester erzeugte PpIX nur in dem Teil der Haut lokalisiert
ist, auf – den
der Ester aufgebracht wurde.
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Beispiel 7
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass ALA-Butylester und ALA-Hexylester, die auf
die Vorderarmhaut eines kaukasischen Mannes aufgebracht wurden,
weniger Erythem erzeugten als ALA.
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Eine
Creme (Unguentum, Merck), die 20% ALA, ALA-Butylester bzw. ALA-Hexylester
enthielt, wurde auf drei getrennte Bereiche auf die Haut des Vorderarmes
eines kaukasischen Mannes aufgebracht. Zwei Stunden später wurden
die Hautbereiche einem UVA-Licht aus einer Lampe für unsichtbares
Licht für
5 min ausgesetzt. Vierundzwanzig Stunden später wurde ein signifikant ausgeprägtes Erythem
in dem ALA-Bereich beobachtet, während
ein signifikantes, jedoch schwächeres
Erythem für
den ALA-Butylester und den ALA-Hexylester beobachtet wurde (Daten
nicht beigefügt).
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Der
in den Hautbereichen erzeugte Gehalt an PpIX wurde durch Messung
der Fluoreszenzemissionsspektren bewertet. Korrespondierend zu den beobachteten
Erythemen demonstrierte ALA die höchste Konzentration an PpIX,
während
sie bei dem ALA-Butylesterbereich kleiner war und am geringsten
im ALA-Hexylesterbereich.
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Beispiel 8
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass ALA-Methylester einen Hautkrebs verhindert,
der durch UV-Bestrahlung induziert wird.
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Die
Fähigkeit
multipler fotodynamischer Therapie (PDT) -Sitzungen mit topischem
ALA-Methylester (ALA-Me), um Hautkrebs zu verhindern, der durch ultraviolette
Bestrahlung (UV) induziert wird, wurde bei der SKH1-haarlosen Maus
untersucht. Gruppen von 20 Mäusen
wurden 5 Tage pro Woche gegenüber
UV aus FS20-Röhren
ausgesetzt. Eine Gruppe wurde wöchentlich
mit 8% topischem ALA-Me, gefolgt 2 Stunden später, von 1,2 J/cm2 Licht
aus einem Diaprojektor behandelt. Die Zahl, Lokalisierung und Größe von Hauttumoren
wurde wöchentlich
aufgezeichnet. Eine andere Studiengruppe beinhaltet: Mäuse, behandelt
mit 8% ALA-Me und nicht gegenüber
Licht ausgesetzt, Mäuse,
die gegenüber
UV und Vehikel ausgesetzt wurden, Mäuse, die gegenüber topischem
ALA-Me und Licht, aber noch nicht UV ausgesetzt wurden, wie auch
Mäuse,
die gegenüber UV
ausgesetzt wurden, wobei die Hälfte
ihrer Körper mit
8% ALA-Me und die Hälfte
ihrer Körper
mit dem Vehikel behandelt wurden. ALA-Me-PDT induzierte eine signifikante
Verzögerung
der Zeit, nach der der erste Tumor auftrat im Vergleich mit Mäusen, die
nur UV ausgesetzt wurden (p < 0,0001).
Nach 26 Wochen UV-Aussetzung waren große Tumoren (≥ 4 mm) bei
14 Mäusen
der UV-Gruppe vorhanden im Vergleich mit nur einer Maus in der UV-ALA-Me-Gruppe. Bei Mäusen, die
auf einer Seite mit ALA-Me und auf einer Seite mit dem Vehikel behandelt
wurden, wurde die Verzögerung
des Auftretens von Tumoren nur auf der Seite beobachtet, die mit
ALA-Me behandelt wurde, was eine lokale anstelle einer systemischen
Wirkung als Grund für
dieses Phänomen
nahe legt. Eine in-vivo-Fluoreszenzspektroskopie und eine quantitative
Fluoreszenzmikroskopie zeigten, dass es eine bevorzugte Anhäufung von
Protoporhyrin IX in den Tumoren gab, im Vergleich mit der benachbarten,
UV ausgesetzten Haut und normaler Haut zum Zeitpunkt der Lichtaussetzung.
Es wird daraus gefolgt, dass topisches ALA-Me-PDT das Auftreten
von UV-induzierten Hauttumoren wie auch die Inzidenz großer Tumoren ohne
Erhöhung
von Mortalität
oder Morbidität
verzögerte.