DE60120685T2 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF DIHYDROXYESTERS AND THEIR DERIVATIVES - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein stereoselektives Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyestern und Derivaten davon.The The present invention relates to a stereoselective process for Preparation of dihydroxy esters and derivatives thereof.
Die
mikrobielle Reduktion von 3,5-Dioxo-6-(benzyloxy)hexansäureethylester
zu 3,5-Dihydroxy-6-(benzyloxy)hexansäure ist in
Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung einer Verbindung der Formel (1) bereitgestellt
- a) eine
Verbindung der Formel (2) Formel 2 stereoselektiv zu einer Verbindung der Formel (3) reduziertFormel 3 und
- b) die Verbindungen der Formel (3) in Gegenwart einer Verbindung der Formel R''-O-COR' und eines Lipase- oder Hydrolaseenzyms unter Bildung der Verbindung der Formel (1) verestert; oder
- c) eine Verbindung der Formel (2) in Gegenwart einer Verbindung
der Formel R''-O-COR' und eines Lipase- oder
Hydrolaseenzyms unter Bildung der Verbindung der Formel (4) verestert Formel 4 und
- d) eine Verbindung der Formel (4) stereoselektiv zu einer Verbindung der Formel (1) reduziert,
X für eine gegebenenfalls substituierte Hydrocarbylverbindungsgruppe steht,
R und R'' jeweils unabhängig voneinander für eine gegebenenfalls substituierte Hydrocarbylgruppe stehen und
R' für eine gegebenenfalls substituierte Hydrocarbylgruppe, vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe, steht.According to a first aspect of the present invention, there is provided a process for producing a compound of the formula (1)
- a) a compound of the formula (2) Formula 2 stereoselectively reduced to a compound of formula (3)Formula 3 and
- b) esterifying the compounds of the formula (3) in the presence of a compound of the formula R '' - O-COR 'and of a lipase or hydrolase enzyme to give the compound of the formula (1); or
- c) esterifying a compound of the formula (2) in the presence of a compound of the formula R '' - O-COR 'and of a lipase or hydrolase enzyme to give the compound of the formula (4) Formula 4 and
- d) reducing a compound of formula (4) stereoselectively to a compound of formula (1),
X is an optionally substituted hydrocarbyl linking group,
R and R '' each independently represent an optionally substituted hydrocarbyl group and
R 'is an optionally substituted hydrocarbyl group, preferably an optionally substituted alkyl group.
Die durch X, R, R' bzw. R'' wiedergegebenen Hydrocarbylgruppen können durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein, und können persubstituiert, zum Beispiel perhalogeniert, sein. Beispiele für Substituenten schließen Halogen, insbesondere Fluor und Chlor, Alkoxy wie z.B. C1-4-Alkoxy und Oxo ein.The hydrocarbyl groups represented by X, R, R ', and R ", respectively, may be substituted by one or more substituents, and may be persubstituted, for example, perhalogenated. Examples of substituents include halogen, especially fluorine and chlorine, alkoxy such as C 1-4 alkoxy and oxo.
Vorzugsweise steht X für eine Gruppe der Formel -(CH2)n-, wobei n für 1 bis 4 steht, und ganz besonders bevorzugt steht X für eine Gruppe der Formel -CH2-.Preferably, X is a group of the formula - (CH 2 ) n -, where n is 1 to 4, and very particular X is preferably a group of the formula -CH 2 -.
R'' kann für eine Alkylgruppe wie z.B. eine C1-6-Alkylgruppe oder eine Alkylcarbonylgruppe wie z.B. eine C1-6-Alkylcarbonylgruppe, zum Beispiel eine CH3(C=O)- oder CF3(C=O)-Gruppe, stehen. R'' steht ganz besonders bevorzugt für eine Vinyl- oder Isopropenylgruppe.R "may represent an alkyl group such as a C 1-6 alkyl group or an alkylcarbonyl group such as a C 1-6 alkylcarbonyl group, for example a CH 3 (C = O) or CF 3 (C = O) group , stand. R '' most preferably represents a vinyl or isopropenyl group.
R steht vorzugsweise für eine C1-6-Alkylgruppe, die geradkettig oder verzweigt und durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein kann. Ganz besonders bevorzugt steht R für eine t-Butylgruppe.R is preferably a C 1-6 alkyl group which may be straight-chain or branched and substituted by one or more substituents. Most preferably, R is a t-butyl group.
R' kann für eine substituierte Alkylgruppe, häufig eine C1-6-Alkylgruppe wie z.B. eine CF3- oder CF3CH2-Gruppe, stehen, ist jedoch vorzugsweise eine unsubstituierte C1-6-Alkylgruppe und ganz besonders bevorzugt eine Methylgruppe.R 'may be a substituted alkyl group, often a C 1-6 alkyl group such as a CF 3 or CF 3 CH 2 group, but is preferably an unsubstituted C 1-6 alkyl group and most preferably a methyl group.
Bei
der stereoselektiven Reduktion der Verbindungen der Formeln (2)
und (4) bedient man sich vorzugsweise chemischer oder mikrobieller
Reduktionsverfahren wie der Hydrierung, der Transfer-Hydrierung, der
Metallhydridreduktion oder Dehydrogenasen. Beispiele für geeignete
Hydrierverfahren wie dem in Helv. Chim. Acta 69, 803, 1986 beschriebenen
schließen
die Verwendung von 0,01 bis 10 Gew.-% an Katalysatoren wie Platin,
Palladium oder Rhodium auf heterogenen Trägern wie Kohlenstoff, Aluminiumoxid,
Kieselgel unter Verwendung von zwischen 1 und 10 Bar molekularem
Wasserstoff in einem Lösungsmittel
wie Methanol, Ethanol, t-Butanol, Dimethylformamid, t-Butylmethylether,
Toluol oder Hexan ein. Alternativ dazu kann man homogene Hydrierkatalysatoren
wie die in
Beispiele für geeignete chemische Transfer-Hydrierverfahren schließen die in Zassinovich, Mestroni und Gladiali, Chem. Rev. 1992, 92, 1051 oder von Fuji et al. in J. Am. Chem. Soc. 118, 2521, 1996 beschriebenen ein. Bei bevorzugten chemischen Transfer-Hydrierverfahren bedient man sich Komplexen von Übergangsmetallen wie Ruthenium oder Rhodium mit chiralen Liganden, insbesondere neutralen aromatischen Rutheniumkomplexen mit chiralen Diaminliganden. Vorzugsweise verwendet man bei einer solchen chemischen Transfer-Hydrierung eine Säure, insbesondere ein Formiatsalz wie Triethylammoniumformiat, als Wasserstoffquelle.Examples for suitable chemical transfer hydrogenation process shut down in Zassinovich, Mestroni and Gladiali, Chem. Rev. 1992, 92, 1051 or by Fuji et al. in J. Am. Chem. Soc. 118, 2521, 1996 one. In preferred chemical transfer hydrogenation processes, complexes are used of transition metals such as ruthenium or rhodium with chiral ligands, especially neutral ones aromatic ruthenium complexes with chiral diamine ligands. Preferably one uses in such a chemical transfer hydrogenation Acid, in particular a formate salt, such as triethylammonium formate, as a source of hydrogen.
Es ist möglich, Metallhydridreagentien wie die in Tet. 1993, 1997, Tet. Asymm. 1990,1, 307 oder J. Am. Chem. Soc. 1998, 110, 3560 beschriebenen zu verwenden.It is possible, Metal hydride reagents such as those in Tet. 1993, 1997, Tet. Asym. 1990.1, 307 or J. Am. Chem. Soc. 1998, 110, 3560 described.
Beispiele für geeignete mikrobielle Reduktionen schließen das In-Kontakt-Bringen der Verbindung der Formel (2) bzw. (4) mit einem Organismus, der die Eigenschaften eines Mikroorganismus ausgewählt aus Beauveria, vorzugsweise Beauveria bassiana, Pichia, vorzugsweise Pichia angusta oder Pichia pastoris, trehalophila, haplophila oder membranefaciens, Candida, vorzugsweise Candida humicola, solani, guillermondii, diddenssiae oder friedrichii, Kluyveromyces vorzugsweise Kluyveromyces drosophilarum oder Torulaspora, vorzugsweise Torulaspora hansenii, aufweist, ein. Die Reduktion läßt sich durch das In-Kontakt-Bringen der Verbindung der Formel (2) bzw. (4) mit einem aus den oben genannten Mikroorganismen extrahierten Enzym durchführen. Ganz besonders bevorzugt bringt man die Verbindung der Formel (2) bzw. (4) mit einem Mikroorganismus ausgewählt aus Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum und Torulospora hansenii oder einem Extrakt aus den oben genannten Organismen in Kontakt.Examples for suitable close microbial reductions bringing the compound of formula (2) or (4) into contact an organism that selects the properties of a microorganism Beauveria, preferably Beauveria bassiana, Pichia, preferably Pichia angusta or Pichia pastoris, trehalophila, haplophila or membranefaciens, Candida, preferably Candida humicola, solani, guillermondii, diddenssiae or friedrichii, Kluyveromyces preferably Kluyveromyces drosophilarum or Torulaspora, preferably Torulaspora hansenii, has, a. The reduction can be achieved by contacting the compound of the formula (2) or (4) with one of the above-mentioned microorganisms perform extracted enzyme. Very particularly preferably, the compound of the formula (2) is brought or (4) with a microorganism selected from Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum and Torulospora hansenii or an extract from the above organisms in contact.
Die Erfindung umfaßt vorzugsweise die Herstellung einer Verbindung der Formel (3) durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel (2) mit ganzen Zellen oder Extrakten der oben erwähnten Mikroorganismen, vorzugsweise Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum und Torulospora hansenii.The Invention preferably the preparation of a compound of formula (3) selective reduction of a compound of formula (2) with whole cells or extracts of the above Microorganisms, preferably Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum and Torulospora hansenii.
Ganz besonders bevorzugt führt man die Erfindung mit ganzen Zellen der Organismen durch, da hierdurch die Erfordernis des Abtrennens des gewünschten Enzyms und der Bereitstellung von Kofaktoren für die Umsetzung entfällt.All particularly preferably leads the invention with whole cells of the organisms through, since thereby the requirement of separating the desired enzyme and providing of cofactors for the implementation is omitted.
Es ist möglich, jede der obigen Spezies zu verwenden, bei vielen Ausführungsformen wurde jedoch gefunden, daß sich hohe Umwandlungsraten und eine hohe Selektivität durch die Verwendung des Enzyms bzw. ganzer Zellen von Pichia angusta erzielen lassen.It is possible, using any of the above species, in many embodiments However, it was found that high conversion rates and high selectivity through the use of Enzyme or whole cells of Pichia angusta.
Im allgemeinen verwendet man zum Antreiben der Reaktion einen Kofaktor, normalerweise NAD(P)H (Nicotinamidadenindinukleotid oder Nicotinamidadenindinukleotidphosphat) und ein System zur Regeneration des Kofaktors, beispielsweise Glukose und Glukosedehydrogenase, mit den Enzymen. Da in den ganzen Zellen geeignete Kofaktoren und Reduktionsmechanismen vorhanden sind, verwendet man vorzugsweise ganze Zellen in einem Nährmedium, das bevorzugt eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, die eine oder mehrere der folgenden Verbindungen einschließen kann: einen Zucker, z.B. Maltose, Saccharose oder, vorzugsweise, Glukose, ein Polyol, z.B. Glyzerin oder Sorbit, Zitronensäure, oder einen niederen Alkohol, zum Beispiel Methanol oder Ethanol.In general, a cofactor is used to drive the reaction, usually NAD (P) H (nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and a system for regeneration of the cofactor, for example, glucose and glucose dehydrogenase, with the enzymes. Since suitable cofactors and reduction mechanisms are present throughout the cells, it is preferred to use whole cells in a nutrient medium, preferably containing a suitable carbon source, which may include one or more of the following compounds: a sugar, eg maltose, sucrose or, preferably, glucose , a polyol, eg, glycerin or sorbitol, citric acid, or a lower alcohol, for example, methanol or ethanol.
Wenn die ganzen Zellen während der Umsetzung wachsen sollen, so sollten im Medium Stickstoff- und Phosphorquellen und Spurenelemente vorhanden sein. Es kann sich hierbei um die normalerweise bei der Kultivierung der Organismen verwendeten handeln.If the whole cells during the implementation should grow, so should in the medium nitrogen and Phosphorus sources and trace elements may be present. It may be This is usually the case when cultivating the organisms used to act.
Das Verfahren läßt sich durchführen, indem man eine Verbindung der Formel (2) bzw. (4) zu einer Kultur der wachsenden Organismen in einem zur Unterstützung des Wachstums fähigen Medium oder zu einer Suspension der lebenden Zellen in einem Medium, das vorzugsweise eine Kohlenstoffquelle enthält, dem jedoch ein oder mehrere für das Wachstum erforderliche Nährstoffe fehlen, gibt. Man kann auch tote Zellen verwenden, vorausgesetzt die notwendigen Enzyme und Kofaktoren sind vorhanden; falls erforderlich, können sie den toten Zellen zugesetzt werden.The Procedure can be carry out, by adding a compound of the formula (2) or (4) to a culture of the growing organisms in a medium capable of supporting growth or to a suspension of the living cells in a medium containing preferably contains a carbon source, but one or more for the Growth required nutrients missing, there. One can also use dead cells, provided the necessary enzymes and cofactors are present; if necessary, can they are added to the dead cells.
Falls gewünscht kann man die Zellen auf einem Träger immobilisieren, der mit der Verbindung der Formel (2) bzw. (4) in Kontakt gebracht wird, vorzugsweise in Gegenwart einer geeigneten Kohlenstoffquelle wie oben beschrieben.If required you can put the cells on a carrier immobilized with the compound of formula (2) or (4) in Contact is brought, preferably in the presence of a suitable Carbon source as described above.
Der pH-Wert beträgt geeigneterweise 3,5 bis 9, zum Beispiel 4 bis 9, vorzugsweise höchstens 6,5 und besonders bevorzugt höchstens 5,5. Sehr geeignet verwendet man einen pH-Wert von 4 bis 5. Das Verfahren kann geeigneterweise bei einer Temperatur von 10 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C und besonders bevorzugt 25 bis 35°C durchgeführt werden. Sind ganze lebende Zellen der oben erwähnten Organismen vorhanden, so wird es vorzugsweise unter äroben Bedingungen durchgeführt. Bei den oben erwähnten pH-Wert- und Temperaturbedingungen verwendet man geeigneterweise eine Belüftungsrate, die 0,01 bis 1,0 Volumina an Luft, gemessen unter Normalbedingungen (STP), pro Volumen an Kulturmedium pro Minute beträgt, es versteht sich jedoch, daß beträchtliche Schwankungen möglich sind. Während des Wachstums der Organismen können ähnliche pH-Wert-, Temperatur- und Belüftungsbedingungen angewendet werden, wenn dies getrennt von dem Verfahren erfolgt.Of the pH is suitably 3.5 to 9, for example 4 to 9, preferably at most 6.5, and most preferably at most 5.5. Very suitable to use a pH of 4 to 5. The Method may suitably be at a temperature of 10 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C and more preferably 25 to 35 ° C carried out become. Are there whole living cells of the organisms mentioned above, so it is preferably under arousal Conditions performed. In the above mentioned pH and temperature conditions are suitably used a ventilation rate, the 0.01 to 1.0 volumes of air, measured under normal conditions (STP), per volume of culture medium per minute, it understands However, that considerable Fluctuations possible are. While The growth of organisms can be similar pH, temperature and aeration conditions applied separately from the process.
Aufgereinigte Enzyme lassen sich durch bekannte Maßnahmen isolieren, geeigneterweise, indem man eine Suspension desintegrierter Zellen zentrifugiert und eine klare Lösung von den Resten abtrennt, das gewünschte Enzym beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, geeigneterweise durch Eluieren von der Säule mit Flüssigkeit von zunehmender Ionenstärke und/oder durch selektives Ausfällen durch Zugabe eines ionischen Materials, beispielsweise Ammoniumsulfat, von der Lösung abtrennt. Zur Verbesserung der Reinheit können diese Schritte gegebenenfalls wiederholt werden.purified Enzymes can be isolated by known means, suitably, by centrifuging a suspension of the integrated cells and a clear solution separated from the residues, the desired Enzyme for example by ion exchange chromatography, suitably by eluting from the column with liquid of increasing ionic strength and / or by selective failure by adding an ionic material, for example ammonium sulfate, from the solution separates. To improve the purity, these steps may be appropriate be repeated.
Die Veresterung der Verbindungen der Formel (2) bzw. (3) erfolgt vorzugsweise durch Umestern mit einem anderen Ester, von dem, bezogen auf den Alkohol, wenigstens ein Moläquivalent vorhanden ist, und bei dem es sich geeigneterweise um einen Vinylester handelt (da das Nebenprodukt Acetaldehyd keine Rückreaktion eingeht). Alternativ dazu kann man ein Anhydrid wie Essigsäureanhydrid oder Trifluoressigsäureanhydrid oder einen Ester wie Essigsäureethylester oder einen fluorierten Ester wie Essigsäuretrifluorethylester verwenden. Die regiospezifische Veresterung erfolgt vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel, das weniger als 1 Gew.-% Wasser enthält, wie z.B. Acetonitril, Essigsäureethylester, Tetrahydrofuran, tert.-Butylmethylether, Toluol, Butanon, Pentanon oder Hexanon, bei einer Temperatur von vorzugsweise 20 bis 75°C, besonders bevorzugt 25 bis 50°C. Bei den Estern handelt es sich vorzugsweise um Ester niederer Alkansäuren mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder substituierten Derivaten davon. Gegebenenfalls kann man eine inerte Atmosphäre einsetzen, so kann man beispielsweise Stickstoff durch die Lösung strömen lassen.The Esterification of the compounds of the formula (2) or (3) is preferably carried out by transesterification with another ester, of which, referring to the Alcohol, at least one molar equivalent is present, and which is suitably a vinyl ester acts (since the by-product acetaldehyde does not undergo a reverse reaction). alternative this can be an anhydride such as acetic anhydride or trifluoroacetic anhydride or an ester such as ethyl acetate or use a fluorinated ester such as trifluoroethyl acetoacetate. The regiospecific esterification is preferably carried out in an organic Solvent, containing less than 1% by weight of water, e.g. Acetonitrile, ethyl acetate, Tetrahydrofuran, tert-butyl methyl ether, toluene, butanone, pentanone or hexanone, at a temperature of preferably 20 to 75 ° C, especially preferably 25 to 50 ° C. The esters are preferably esters of lower alkanoic acids 2 to 8 carbon atoms or substituted derivatives thereof. Possibly you can have an inert atmosphere For example, nitrogen can be allowed to flow through the solution.
Die Enzyme können als solche oder als ganze Zellen, die sie enthalten, bereitgestellt werden. Sie sind vorzugsweise immobilisiert, um ihre Trennung vom Produkt und, falls gewünscht, Wiederverwendung zu erleichtern.The Enzymes can as such or as whole cells containing them become. They are preferably immobilized to prevent their separation from Product and, if desired, To facilitate reuse.
Zu den bevorzugten Enzymen zählen Lipasen wie Schweinepankreaslipase, Candida cylindracea-Lipase, Pseudomonas fluorescens-Lipase, Candida antarctica-Fraktion B, wie die unter dem Warenzeichen Chirazyme L2 erhältliche, die von Humicola lanuginosa, beispielsweise die unter dem Warenzeichen Lipolase vertriebene oder die aus Pseudomonas, beispielsweise die unter dem Warenzeichen SAM II vertriebene und besonders bevorzugt die aus Candida antarctica, beispielsweise die unter dem Warenzeichen Chirazyme vertriebene.Preferred enzymes include lipases such as porcine pancreatic lipase, Candida cylindracea lipase, Pseudomonas fluorescens lipase, Candida antarctica fraction B, such as those available under the Chirazyme L2 trademark, those sold by Humicola lanuginosa, for example those sold under the trademark Lipolase, or those from Pseudomonas For example, the sold under the trademark SAM II and be especially preferred is that from Candida antarctica, for example those sold under the trademark Chirazyme.
Verbindungen der Formel (1), in denen R' für CH3, R für gegebenenfalls substituiertes Hydrocarbyl steht, X für -(CH2)n steht und n für 1 bis 4 steht, bilden einen dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung. R steht vorzugsweise für t-Butyl und ganz besonders bevorzugt steht X für -CH2-.Compounds of formula (1) in which R 'is CH 3 , R is optionally substituted hydrocarbyl, X is - (CH 2 ) n and n is 1 to 4, form a third aspect of the present invention. R is preferably t-butyl and most preferably X is -CH 2 -.
Bei
den Verbindungen der Formel (1) handelt es sich um wertvolle Zwischenprodukte
für die
Herstellung pharmazeutischer Verbindungen. Sie werden gewöhnlich,
wie in Synthesis 1998, 1713, beschrieben, unter Bildung eines Acetonids
mit einer Schutzgruppe für
1,3-Dihydroxyeinheiten wie 2,2-Dimethoxypropan umgesetzt. Die Gruppe
R'-(C=O)- kann dann
durch Behandeln mit einer schwach basischen alkoholischen Lösung, z.B.
einer K2CO3-Lösung wie
in
Beispiel 1example 1
Darstellung von (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylesterPreparation of (3R, 5S) -3,5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester
In einen gerührten 250-ml-Rundkolben wurden 20 ml Acetonitril, 0,405 g (0,662 mmol) Di-mu-chlorbis[(p-cumen)chlorruthenium(II)] und 0,492 g (1, 34 mmol) (1S,2S)-(+)-N-(4-Toluolsulfonyl)-1,2-diphenylethylendiamin gegeben. Die Lösung wurde durch Spülen mit Stickstoff und anschließendes Aufrechterhalten eines leichten Stickstoffstroms desoxygeniert. Eine desoxygenierte Lösung von 26 g (0,119 mol) optisch reinem (5S)3-Keto-5,6-dihydroxyhexansäure-t-butylester in 15 ml Acetonitril wurde in das Reaktionsgefäß gegeben, und die Lösung wurde 20 Min. lang bei Raumtemperatur gerührt. Im Verlauf von 10 Minuten wurden dann 65 ml einer 5:2 (mol/mol) Mischung von destillierter Ameisensäure und Triethylamin zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wurde langsam mit 80 ml Dichlormethan und 120 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit 70 g Ammoniumchlorid versetzt, und die organische Phase wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde noch dreimal mit jeweils 90 ml Essigsäureethylester gewaschen, die organischen Fraktionen wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt, wodurch man 21,1 g eines rohen Öls erhielt, das hauptsächlich aus (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylester bestand. Das Diastereomerenverhältnis wurde durch 13C-NMR als 5,2:1 (3R:5S):(3S:5S) bestimmt. Das Material wurde roh in die nächste Reaktion eingesetzt, konnte jedoch durch Säulenchromatographie aufgereinigt werden.Into a stirred 250 ml round bottom flask was added 20 ml of acetonitrile, 0.405 g (0.662 mmol) of di-mu-chlorobis [(p-cumen) chlororuthenium (II)] and 0.492 g (1.34 mmol) of (1S, 2S) - (+) - N- (4-toluenesulfonyl) -1,2-diphenylethylenediamine. The solution was deoxygenated by purging with nitrogen and then maintaining a gentle stream of nitrogen. A deoxygenated solution of 26 g (0.119 mol) of optically pure (5S) 3-keto-5,6-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester in 15 ml of acetonitrile was added to the reaction vessel and the solution was stirred at room temperature for 20 min. Then, over 10 minutes, 65 ml of a 5: 2 (mol / mol) mixture of distilled formic acid and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 48 hours. This solution was added slowly with 80 ml of dichloromethane and 120 ml of saturated sodium bicarbonate solution. The aqueous phase was treated with 70 g of ammonium chloride and the organic phase was separated. The aqueous phase was washed three more times with 90 ml each of ethyl acetate, the organic fractions were combined and dried over sodium sulfate, and the solvent was removed, yielding 21.1 g of a crude oil consisting mainly of (3R, 5S) -3, There was 5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester. The diastereomer ratio was determined by 13 C-NMR as 5.2: 1 (3R: 5S) :( 3S: 5S). The material was used crude in the next reaction but could be purified by column chromatography.
Herstellung von (3R,5S)-6-Acetoxy-3,5-dihydroxyhexansäure-t-butylesterPreparation of (3R, 5S) -6-acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester
In einen gerührten 1-l-Rundkolben wurden 700 ml Tetrahydrofuran, 70,7 g (0,32 mol) (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylester, 41 ml (0,46 mol) Essigsäurevinylester und 6,3 g der geträgerten Lipase Chirazyme L2TM gegeben. Nach 3 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lipase durch Sieben entfernt, und die flüchtigen Bestandteile wurden durch Vakuumdestillation abgetrennt. Die Masse des rohen Öls betrug 78,7 g, und die Hauptkomponente wurde als (3R,5S)-6-Acetoxy-3,5-dihydroxyhexansäure-t-butylester bestimmt. Dieses Material wurde direkt in den nächsten Schritt eingesetzt.Into a stirred 1 liter round bottom flask was added 700 ml of tetrahydrofuran, 70.7 g (0.32 mol) of (3R, 5S) -3,5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester, 41 ml (0.46 mol) of vinyl acetate and 6.3 g of the supported lipase Chirazyme L2 ™ . After stirring at room temperature for 3 hours, the lipase was removed by sieving and the volatiles were separated by vacuum distillation. The mass of the crude oil was 78.7 g and the major component was determined to be (3R, 5S) -6-acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester. This material was used directly in the next step.
Herstellung von (4R,6S)-6-[(Acetyloxy)methyl]-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-essigsäure-1,1-dimethylethylesterPreparation of (4R, 6S) -6 - [(acetyloxy) methyl] -2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester
In einen gerührten 1-Liter-Rundkolben wurden 78,7 g (3R,5S)-6-Acetoxy-3,5-dihydroxyhexansäure-t-butylester, 800 ml 2,2-Dimethoxypropan und 5,7 g p-Toluol-sulfonsäure gegeben. Nach 35 Minuten wurde die Reaktionsmasse auf die Hälfte ihres Volumens eingeengt, und 300 ml Dichlormethan und 300 ml 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung wurden zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase wurde dreimal mit jeweils 150 ml Essigsäureethylester gewaschen. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet, und die flüchtigen Bestandteile wurden durch Vakuumdestillation entfernt. Man erhielt 92 g eines rohen Öls. Dies wurde aufgereinigt, indem man es zunächst über eine kurze Säule mit Flash-Kieselgel gab, wobei mit Hexan und dann mit Hexan:Essigsäureethylester 85:15 (v/v) eluiert wurde, und das Material anschließend dreimal aus Hexan umkristallisiert wurde, was 22,17 g (4R,6S)-6-[(Acetyloxy)methyl]-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-essigsäure-1,1-dimethylethylester lieferte, der durch chirale GC als 99,9% de bestimmt wurde.In a stirred 1 liter round bottomed flask were added 78.7 g of (3R, 5S) -6-acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester, 800 ml of 2,2-dimethoxypropane and 5.7 g of p-toluenesulfonic acid given. After 35 minutes, the reaction mass was concentrated to half of its volume, and 300 ml of dichloromethane and 300 ml of 1 M sodium bicarbonate solution were added. The organic phase was separated and the aqueous phase was washed three times with 150 ml of ethyl acetate each time. The organic fractions were and dried over sodium sulfate, and the volatiles were removed by vacuum distillation. 92 g of a crude oil were obtained. This was purified by first passing it through a short column of flash silica gel, eluting with hexane and then hexane: ethyl acetate 85:15 (v / v), and then recrystallizing the material from hexane three times to give 22 , 17 g of (4R, 6S) -6 - [(acetyloxy) methyl] -2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester, which was obtained by chiral GC as 99.9%. de was determined.
Herstellung von (4R,6S)-6-(Hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-essigsäure-1,1-dimethylethylesterPreparation of (4R, 6S) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester
In einen gerührten 500-ml-Rundkolben wurden 22,17 g (4R,6S)-6-[(Acetyloxy)methyl]-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-essigsäure-1,1-dimethylethylester, 250 ml Methanol und 5,05 g zerstoßenes Kaliumcarbonat gegeben. Der Ansatz wurde 35 Minuten lang gerührt, bis die Hydrolyse beendet war, und dann wurde das Kaliumcarbonat durch Sieben entfernt, die Reaktionsmasse eingeengt und 150 ml 5 gew.-%ige Kochsalzlösung und 150 ml Toluol zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde noch zweimal mit jeweils 250 ml Toluol gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt und dreimal mit 15 gew.-%iger Kochsalzlösung gewaschen, und das Lösungsmittel wurde durch Vakuumdestillation entfernt, was 17,78 g eines klaren Öls lieferte, das als > 99% (4R,6S)-6-(Hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-essigsäure-1,1-dimethylethylester bestimmt wurde.In a stirred 500 ml round bottom flasks were 22.17 g of (4R, 6S) -6 - [(acetyloxy) methyl] -2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester, Added 250 ml of methanol and 5.05 g of crushed potassium carbonate. The reaction was stirred for 35 minutes until the hydrolysis ceased was, and then the potassium carbonate was removed by sieving, the Concentrated reaction mass and 150 ml of 5 wt .-% saline and Added to 150 ml of toluene. The organic phase was separated off, and the aqueous phase was washed twice with 250 ml of toluene. The organic ones Phases were combined and washed three times with 15% by weight sodium chloride solution, and the solvent was removed by vacuum distillation to yield 17.78 g of a clear oil, as> 99% (4R, 6S) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester was determined.
Beispiel 2Example 2
Herstellung von (5S)-6-Acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexansäure-tert.-butylesterPreparation of tert-butyl (5S) -6-acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexanoate
In einen gerührten 250-ml-Rundkolben wurden 2,32 g (0,0106 mol) (5S)-5,6-Dihydroxy-3-ketohexansäure-tert.-butylester, 40 ml Tetrahydrofuran, 0,98 ml (0,0106 mol) Essigsäurevinylester und 0,22 g der geträgerten Lipase Chirazyme L2TM gegeben. Nach 20 Minuten wurde die Lipase abgesiebt und die flüchtigen Bestandteile durch Vakuumdestillation entfernt, wodurch man 2,96 g eines rohen Öls erhielt, das durch NMR als (5S)-6-Acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexansäure-tert.-butylester charakterisiert wurde.Into a stirred 250 ml round bottomed flask were added 2.32 g (0.0106 mol) of tert-butyl (5S) -5,6-dihydroxy-3-ketohexanoate, 40 ml of tetrahydrofuran, 0.98 ml (0.0106 mol) of vinyl acetate and 0.22 g of the supported lipase Chirazyme L2 ™ . After 20 minutes, the lipase was screened off and the volatiles were removed by vacuum distillation to give 2.96 g of a crude oil which by NMR was t-butyl (5S) -6-acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexanoate was characterized.
Beispiel 3Example 3
Darstellung von (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylesterPreparation of (3R, 5S) -3,5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester
Pichia angusta NCYC R230 (gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 18. Mai 1995 hinterlegt) wurde in einem Braun Biostat Q Multifermentersystem in dem folgenden Medium (pro Liter) kultiviert: Glukose 40 g; MgSO4, 1,2 g; K2SO4, 0,21 g; KH2PO4, 0,69 g; H3PO4 (konzentriert), 1 ml; Hefeextrakt (Oxoid), 2 g; FeSO4·7H2O, 0,05 g; Entschäumer (EEA 142 Foammaster), Spurenelementelösung, 1 ml (diese Lösung enthielt pro Liter CuSO4·5H2O, 0,02 g; MnSO4·4H2O, 0,1 g; ZnSO4·7H2O, 0,1 g; CaCO3 1,8 g).Pichia angusta NCYC R230 (deposited under the terms of the Budapest Treaty of May 18, 1995) was cultured in a Braun Biostat Q multi-fermenter system in the following medium (per liter): glucose 40 g; MgSO 4 , 1.2 g; K 2 SO 4 , 0.21 g; KH 2 PO 4 , 0.69 g; H 3 PO 4 (concentrated), 1 ml; Yeast Extract (Oxoid), 2 g; FeSO 4 .7H 2 O, 0.05 g; Defoamer (EEA 142 Foammaster), trace element solution, 1 ml (this solution contained per liter of CuSO 4 .5H 2 O, 0.02 g; MnSO 4 .4H 2 O, 0.1 g; ZnSO 4 .7H 2 O, 0, 1 g, CaCO 3 1.8 g).
4 Fermenter wurden jeweils mit 250 ml Medium beschickt und durch Autoklavieren sterilisiert. Der pH-Wert wurde mit 7 molarer Ammoniumhydroxidlösung auf 4,5 eingestellt, die Temperatur wurde auf 28°C eingestellt, der Luftstrom wurde auf 300 ml/Minute eingestellt und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 1200 U/min eingestellt. Die Fermenter wurden mit aus Agarplatten (2% Agar), die das gleiche Medium wie oben beschrieben enthielten, wobei jedoch die Glukosekonzentration 20 g/Liter betrug, entnommenen Zellen inokuliert. Nach 22 Stunden Wachstum in den Fermentern wurde die Bioreduktionsreaktion durch Zugabe von (5S)-3-Keto-5,6-dihydroxyhexansäure-t-butylester gestartet; zwei der Fermenter wurden mit jeweils 3,75 ml beschickt und die anderen beiden wurden mit jeweils 5 ml beschickt.4 Fermenters were each charged with 250 ml of medium and autoclaved sterilized. The pH was with 7 molar ammonium hydroxide solution 4.5, the temperature was set to 28 ° C, the air flow was set to 300 ml / minute and the stirring speed was raised 1200 rpm. The fermenters were made with agar plates (2% agar) containing the same medium as described above, however, the glucose concentration was 20 g / liter Cells inoculated. After 22 hours of growth in the fermenters was the bioreduction reaction by adding (5S) -3-keto-5,6-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester started; two of the fermenters were each charged with 3.75 ml and the other two were each charged with 5 ml.
Die Umsetzung wurden weitere 78 Stunden lang fortgesetzt, bis zur 100%igen Umwandlung des Substrats. Während dieses Zeitraums wurde die Kultur mit einer Rate von 1–3 Gramm Glukose/Liter Kultur/Stunde mit einer 50%igen Glukoselösung gefüttert, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und eine Quelle für Reduktionsleistung zur Verfügung zu stellen. Die Umsetzungen wurden durch Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren beendet. Der gewonnene zellenfreie Überstand wurde bis zu einer Endkonzentration von 20% (w/v) mit Natriumchlorid versetzt, und die Mischung wurde dreimal mit gleichen Volumina Acetonitril extrahiert. Die vereinigten Acetonitrilextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum an einem Rotationsverdampfer abgezogen (Wasserbadtemperatur 45°C), wodurch man ein zähflüssiges hellgelbes Öl erhielt. Die Identität der Produkte aus den Umsetzungen wurde jeweils als (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylester bestimmt, und der Diastereomerenüberschuß der Proben ist jeweils in der Tabelle unten aufgeführt.The Reaction continued for a further 78 hours, up to 100% Transformation of the substrate. While This period was culture at a rate of 1-3 grams Glucose / liter culture / hour with a 50% glucose solution fed to the viability maintain the cells and provide a source of reduction performance put. The reactions were carried out by removing the cells Centrifuging stopped. The won cell-free supernatant was to a final concentration of 20% (w / v) with sodium chloride and the mixture was mixed three times with equal volumes of acetonitrile extracted. The combined acetonitrile extracts were washed with anhydrous Dried sodium sulfate and the solvent was in vacuo withdrawn on a rotary evaporator (water bath temperature 45 ° C), whereby you got a viscous pale yellow oil. The identity of the products from the reactions was determined in each case as (3R, 5S) -3,5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester, and the diastereomeric excess of the samples is listed in the table below.
Beispiel 4Example 4
Herstellung von (3R,5S)-3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylesterPreparation of (3R, 5S) -3,5,6-trihydroxyhexanoic acid t-butyl ester
Pichia angusta NCYC R320 (gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 18. Mai 1995 hinterlegt) wurde in einem Braun Biostat Q Multifermentersystem in dem folgenden Medium (enthaltend pro Liter) kultiviert: Glukose, 20 g; Ammoniumsulfat, 10 g; Hefeextrakt (Oxoid), 2 g; MgSO4·7H2O, 1,2 g; KH2PO4, 0,69 g; K2SO4, 0,21 g; FeSO4·7H2O, 0,05 g; H3PO4 (konzentriert), 1 ml; EEA 142 "Foammaster" Entschäumer, 0,5 ml; Spurenelementlösung, 1 ml (diese Lösung enthielt pro Liter Ca(CH3CO2)2, 2,85 g; ZnSO4·7H2O, 0,1 g; MnSO4·H2O 0,075 g; CuSO4·5H2O, 0,02 g; Schwefelsäure (konzentriert), 1 ml).Pichia angusta NCYC R320 (deposited under the terms of the Budapest Treaty on May 18, 1995) was cultured in a Braun Biostat Q multi-fermenter system in the following medium (containing per liter): glucose, 20 g; Ammonium sulfate, 10 g; Yeast Extract (Oxoid), 2 g; MgSO 4 .7H 2 O, 1.2 g; KH 2 PO 4 , 0.69 g; K 2 SO 4 , 0.21 g; FeSO 4 .7H 2 O, 0.05 g; H 3 PO 4 (concentrated), 1 ml; EEA 142 "Foammaster" defoamer, 0.5 ml; Trace element solution, 1 ml (this solution contained per liter Ca (CH 3 CO 2 ) 2 , 2.85 g, ZnSO 4 .7H 2 O, 0.1 g, MnSO 4 .H 2 O 0.075 g, CuSO 4 .5H 2 O, 0.02 g; sulfuric acid (concentrated), 1 ml).
Ein Fermenter wurde mit 250 ml Medium beschickt und durch Autoklavierung sterilisiert. Der pH-Wert wurde mit einer 2 molaren Natriumhydroxidlösung auf 5,0 eingestellt. Die Temperatur wurde auf 28°C eingestellt, der Luftstrom wurde auf 250 ml/Minute–1 eingestellt und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 1200 U/min eingestellt. Der Fermenter wurde mit 2,5 ml einer Suspension von Zellen in sterilem vollentsalztem Wasser, hergestellt aus einer Agarplatte von Pichia angusta NCYC R320, inokuliert. Nach 17 Stunden Wachstum wurde die Bioreduktion durch die Zugabe von 6,36 g (5S)-3-Keto-5,6-dihydroxyhexansäure-t-butylester als wäßrige Lösung gestartet. Gleichzeitig wurde dem Fermenter Glukose mit einer Geschwindigkeit von 2 g Glukose l–1h–1 zugeführt.A fermenter was charged with 250 ml of medium and sterilized by autoclaving. The pH was adjusted to 5.0 with a 2 molar sodium hydroxide solution. The temperature was adjusted to 28 ° C, the air flow was set to 250 ml / minute -1 and the stirring speed was set to 1200 rpm. The fermenter was inoculated with 2.5 ml of a suspension of cells in sterile deionized water prepared from an agar plate of Pichia angusta NCYC R320. After 17 hours of growth, the bioreduction was started by adding 6.36 g of (5S) -3-keto-5,6-dihydroxyhexanoic acid t-butyl ester as an aqueous solution. At the same time, glucose was fed to the fermenter at a rate of 2 g glucose -1 h -1 .
Die Reaktion wurde weitere 78 Stunden lang fortgesetzt, wobei zu diesem Zeitpunkt eine 96%ige Umwandlung des Substrats erzielt worden war. Ausgangsmaterial und Produkt wurden durch HPLC (Hichrom S5 CN-250A-Säule, Temperatur 35°C, mobile Phase: wäßrige TFA (0,1% Acetonitril 95:5, Fließgeschwindigkeit 1 ml/min–1, Injektionsvolumen 5 ml, Brechungsindexdetektor) nachgewiesen.The reaction was continued for a further 78 hours at which time a 96% conversion of the substrate was achieved. Starting material and product were detected by HPLC (Hichrom S5 CN-250A column, temperature 35 ° C, mobile phase: aqueous TFA (0.1% acetonitrile 95: 5, flow rate 1 ml / min -1 , injection volume 5 ml, refractive index detector) ,
Die Umsetzung wurde durch Entfernen der Zellen durch 20 minütiges Zentrifugieren bei 4000 × g beendet. Der pH-Wert des gewonnenen zellfreien Überstands wurde mit 2 M NaOH auf 7,5 eingestellt. MgSO4·1,6H2O (15%ig(w/v), bezogen auf die wasserfreie Substanz) wurde in dem zellfreien Überstand gelöst, und die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von 2-Pentanon extrahiert. Die Lösungsmittelphasen wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum an einem Rotationsverdampfer bei 45°C abgezogen, wodurch man ein orangefarbenes zähflüssiges Öl erhielt. Dieses wurde nochmals in 50 ml trockenem destilliertem 2-Pentanon gelöst, und das Lösungsmittel wurde abermals durch Rotationsverdampfen entfernt, was 3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylester (5,08 g, 80% isolierte Ausbeute) lieferte. Der Diastereomerenüberschuß wurde wie folgt bestimmt: eine Probe von 3,5,6-Trihydroxyhexansäure-t-butylester (30 mg) wurde durch wenigstens 10 minütige Umsetzung bei Raumtemperatur in einem Überschuß von Trifluoressigsäureanhydrid derivatisiert, überschüssiges Anhydrid wurde in einem Strom von trockenem Stickstoff entfernt und das verbliebene Öl wurde mit Dichlormethan (1 ml) verdünnt. Die Probe wurde mit einer Chiralcel Dex CB-Säule (25 Meter) bei einer Temperatur von 140°C (isothermal) analysiert. Die Diastereomere eluierten bei 14,4 Minuten (3R,5S-Diastereomer) und 15,7 Minuten (3S,5S-Diastereomer). Der durch dieses Verfahren bestimmte Diastereomerenüberschuß der Probe betrug 99,7%.The reaction was stopped by removing the cells by centrifuging at 4000 x g for 20 minutes. The pH of the recovered cell-free supernatant was adjusted to 7.5 with 2 M NaOH. MgSO 4 • 1.6H 2 O (15% w / v based on the anhydrous substance) was dissolved in the cell-free supernatant and the resulting solution was extracted twice with an equal volume of 2-pentanone. The solvent phases were collected and the solvent was removed in vacuo on a rotary evaporator at 45 ° C to yield an orange viscous oil. This was redissolved in 50 mL of dry distilled 2-pentanone and the solvent was again removed by rotary evaporation to yield t-butyl 3,5,6-trihydroxyhexanoate (5.08 g, 80% isolated yield). The diastereomeric excess was determined as follows: a sample of t-butyl 3,5,6-trihydroxyhexanoate (30 mg) was derivatized by reaction at room temperature in an excess of trifluoroacetic anhydride for at least 10 minutes, excess anhydride was removed in a stream of dry nitrogen and the remaining oil was diluted with dichloromethane (1 ml). The sample was analyzed with a Chiralcel Dex CB column (25 meters) at a temperature of 140 ° C (isothermal). The diastereomers eluted at 14.4 minutes (3R, 5S diastereomer) and 15.7 minutes (3S, 5S diastereomer). The diastereomeric excess of the sample determined by this method was 99.7%.
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