DE60117259T2

DE60117259T2 - Bioinsektizide-Trockenformulierung, bestehend aus Bacillus thuringiensis var. israelensis und Verfahren zu deren Herstellung

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Publication number: DE60117259T2
Application number: DE2001617259
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Recreio Rio de Janeiro GOMES SANCHES; Ana Cristina Piedade Rio de Janeiro BATISTA DA SILVA; Flávia Maria Tijuca Rio de Janeiro ABREU CAMPOS; Renata Alves Tijuca Rio de Janeiro PINHEIRO ROBERG; Fernando Justino Bangu Rio de Janeiro DE ASSUNCAO
Original assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Current assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-05-25
Also published as: BR0003314A; AU6367401A; OA11992A; BR0003314B1; AP1613A; AR028608A1; WO2001089297A2; MXPA02000866A; DE60117259D1; EP1283676A2; US20050191287A1; AP2002002398A0; US20040022776A1; WO2001089297A3; ZA200200513B; EP1283676B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Bioinsektizid-Trockenformulierung, bestehend aus der Biomasse und Endotoxinen von Bacillus thuringiensis var. israelensis, die eine praktische, ökonomische und wirksame larvizide Aktivität bzw. Wirksamkeit gegen zweiflügelige Insekten bereitstellt. Dieses Produkt hat eine gute Lagerfähigkeit, wenn es gelagert wird, und es enthält ökologisch sichere Additivmittel, während die wirksame Komponente in Mengen vorhanden ist, die stark genug sind, um eine larvizide Aktivität hervorzurufen.
Im Allgemeinen schließt die Vernichtung von Insekten, insbesondere von jenen, die für Landwirtschaft, Forstwirtschaft und öffentliche Gesundheit schädlich sind, die Verwendung von chemischen Insektiziden ein. Jedoch gibt es viele Nachteile, die mit der Verwendung dieser Art von Produkt verbunden sind.
Chemische Insektizide haben ein breites Wirkungsspektrum, wobei sie nicht nur für Zielinsekten tödlich sind, sondern auch für jene, die einen bestimmten Nutzen für Landwirtschaft, Forstwirtschaft und öffentliche Gesundheit darstellen. Zusätzlich sind solche Insektizide nicht nur für Tiere sondern auch für den Menschen recht oft toxisch und können auch die Umwelt verschmutzen. Zusätzlich entwickeln Insekten nach wiederholten Anwendungen chemischer Insektizide häufig eine organische Resistenz („organic resistance"), was die Vernichtung schwierig macht.
Die Verwendung von Bioinsektiziden ist gut bekannt. Bioinsektizide nützen natürliche pathogene Mittel oder Wirkstoffe, die durch diese pathogenen Mittel erzeugt werden, um Insekten in einer sehr viel wirksameren und selektiveren Weise als chemische Insektizide zu bekämpfen, und sie haben ein engeres Wirkungsspektrum, wobei sie nur Zielinsekten töten. Sie wer den auch natürlich abgebaut und sind daher nicht so schädlich für die Umwelt.
Ein verbreitet eingesetztes Bioinsektizid in der biologischen Kontrolle von Insekten, die Krankheiten hervorrufen, wird aus Bacillus thuringiensis (Bt) hergestellt. Bt ist ein mobiles, gram-positives Bakterium, das in der Natur in Form von kleinen Stäbchen („batonettes") gefunden werden kann. Dieser Mikroorganismus stellt Endotoxine bereit, die für einige Insekten tödlich sind, in der Form von kristallinen parasporalen Einschlüssen, die während der Sporulation produziert werden, die den Tod der Insekten nach Aufnahme verursachen.
Diese Einschlüsse können in Gestalt, Anzahl und Zusammensetzung variieren, wobei sie aus einem oder mehreren Protein(en), genannt Delta-Endotoxine, die zwischen 27-140 kDA variieren können, aufgebaut sind. Im Gastrointestinaltrakt der Insekten unterliegen diese Proteine einem alkalischen und enzymatischen Abbau und verursachen systemische und intestinale Parese, was den Tod des Insekts verursacht. Delta-Endotoxine werden leicht abgebaut und unterscheiden sich von anderen toxischen Substanzen, weil sie eine spezifische toxische Wirkung haben. In anderen Worten, sie beeinträchtigen keine anderen Organismen außer den Zielinsekten. (Heimpel, A.M.; ANn. Ver, Entomology 12, 287-322, 1967. Höfte und Whiteley, Microbiological Reviews 53, 242-255, 1989).
Unter den Stämmen von Bacillus thuringiensis, die aus der Natur isoliert wurden, wurde die Varietät Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) gemeinhin gegen zweiflügelige Insekten eingesetzt, deren Vernichtung für die öffentliche Gesundheit sehr wichtig ist (Payne et al., US 5,888,976 , 1999). Solche Insekten können Gelbfieber und Dengue übertragen, zum Beispiel Aedes aegypti.
Eine praktische, ökonomische und wirksame Nutzung von Bioinsektiziden (wie desjenigen, das von Bacillus thuringiensis var. israelensis erhalten wird) ist abhängig von der Menge an aktiver Komponente, die in der gesamten bioinsektiziden Formulierung vorhanden ist.
Gemeinhin verwendete bioinsektizide Formulierungen können eine Biomasse von Bti oder seine Sporen oder seine isolierten Endotoxine bereitstellen. Diese Formulierungen benötigen gute Stabilität (Lagerfähigkeit) und daher müssen sie in ihrer Zusammensetzung Substanzen einschließen, die den Abbau der aktiven Komponente durch chemische, biologische, physikalische oder natürliche Mittel (Sonnenlicht, zum Beispiel) verhindern können.
Das Dokument BR PI 8900938-0 offenbart bioinsektizide Zusammensetzungen, die aus einem amylolytischen und proteolytischen Bakterium des Genus Bacillus hergestellt sind, die für Insekten verschiedener Klassen tödlich sind. Sie schließen bioinsektizide Zusammensetzungen ein, hergestellt aus Bacillus thuringiensis var. israelensis, die für zweiflügelige Insekten toxisch sind, und inerten Flüssigkeiten, wie Sorbit, Glycerin, Toluol, die dem Produkt zusammen mit der aktiven Biomasse eine pastöse Konsistenz geben.
Jedoch hat eine pastöse Formulierung ein hohes spezifisches Gewicht bzw. eine hohe relative Dichte und sie neigt dazu auf dem Boden des Ausbringungsbereichs zu verbleiben. Dies ist ein Nachteil, insbesondere in dem Fall von Zielinsekten, die sich in oberflächennahen Bereichen (wie zweiflügelige Insekten) ernähren und reproduzieren, in dem Fall, dass die aktive Komponente nicht für eine genügende Zeit in dem Medium dispergiert bleibt, um wirksam zu sein.
WO-A-98/28984 schlägt eine Zusammensetzung vor, die für die Larven zweiflügeliger Insekten tödlich ist, wobei sie in einer gefrorenen granulierten Form verteilt wird. Da sie gefroren ist, ist eine solche Formulierung jedoch nicht an Orten mit heißem Wetter (wo es viele zweiflügelige Insekten gibt) wirksam, wenn sie schmilzt. Darüber hinaus ist diese Formulierung nicht praktisch, weil sie niedrige Temperaturen während der Lagerung und dem Transport benötigt.
Um eine wirksame larvizide Aktivität zu erhalten, ist es somit notwendig, bioinsektizide Formulierungen zu verwenden, die eine hohe Dispersion bzw. Verteilung der aktiven Komponenten in dem Ausbringungsbereich bereitstellen. Auf diese Art wird es einfacher, die korrekte Dosis auszubringen, d.h. die tödliche Dosis an Bioinsektizid.
Während dem Herstellen bioinsektizider Zusammensetzungen ist es auch sehr wichtig, nicht nur die Biologie des Zielinsekts sondern auch sein Habitat zu berücksichtigen, weil die Umweltbedingungen (Temperatur, pH, Vorhandsein von Metallen, Feststoffe in Suspensionen, spezifisches Gewicht bzw. relative Dichte usw.) die Leistungsfähigkeit dieser Zusammensetzungen verändern können. Daher sind die Merkmale einer Formulierung, wie die physikalische Form und das Abgabevehikel, sehr wichtig für die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes.
Zusätzlich benötig man bioinsektizide Formulierungen, die durch ein hohes Maß an Dispersion bzw. Verteilung der aktiven Komponente in den Reproduktions- und Ernährungsbereichen von Zielinsekten gekennzeichnet sind, während sie einfach gelagert, verpackt, transportiert und verwendet werden.
Trockene bioinsektizide Formulierungen sind ein alternativer Weg, diese Probleme zu lösen, da sie leicht zu lagern, zu verpacken, in die befallenen Bereiche (sogar jene, die schwierig zu erreichen sind) mitzunehmen und zu verwenden sind, während sie alle Anforderungen erfüllen, die damit verbunden sind, eine hohe Homogenisierung der aktiven Komponente in dem Ausbringungsbereich zu haben.
DE-A-41 33 889 bezieht sich auf ein trockenes Bioinsektizid, dass als schäumende bzw. sprudelnde Tabletten verteilt bzw. ausgebracht wird, die gegen zweiflügelige Insekten verwendet werden. Trotz der Tatsache, dass die aktive Komponente homogen abgegeben wird, gibt es jedoch keine Additive, um ihren Abbau über die Zeit zu verringern.
Eine Formulierung, die alle Larven über eine Zeitdauer abtöten kann, ist wichtig für eine wirksame larvizide Aktivität. Diese Langzeitwirkung der aktiven Komponente, zusammen mit einem hohen Grad an Dispersion bzw. Verteilung in dem Ausbringungsbereich, ermöglicht eine leichte Verabreichung der korrekten Dosis und weniger Ausbringungen. Dies ist von einem ökonomischen und praktischen Gesichtspunkt ein wichtiger Faktor, insbesondere für Orte, die schwierig zu erreichen sind.
EP-A-761 096, EP-A-0 236 875 und US-A-5,560,909 offenbaren Beispiele, wie trockene bioinsektizide Formulierungen, hergestellt aus einem Bakterium des Genus Bacillus, erhalten werden, die in den Ernährungs- und Reproduktionsbereichen der Zielinsekten (z.B. zweiflügelige Insekten) für eine lange Zeit aktiv bleiben, was sogar in dem Fall von Moskitolarven eine wirksame biologische Kontrolle der Insekten ergibt. Solche Formulierungen können jedoch Polymerverbindungen, die nicht bioabbaubar sind, oder andere umweltschädliche Verbindungen erfordern.
Somit ist es notwendig, eine Bioinsektizid-Trockenformulierung mit geeigneten Trägeradditiven herzustellen, die zu einer wirksamen biologischen Kontrolle von zweiflügeligen Insekten durch die Langzeitwirkung der aktiven Komponente führt, die in dem Ausbringungsbereich verteilt wird, die nicht schädlich für die Umwelt ist. Dieses Bioinsektizid sollte praktisch, ökonomisch, wirksam und auch ökologisch sicher sein.
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine trockene bioinsektizide Zusammensetzung zu ermöglichen, basierend auf der Biomasse und Endotoxinen von Bacillus thuringiensis var. israelensis, die durch ihre Anwendbarkeit, Ökonomie und Wirksamkeit bei der Kontrolle zweiflügeliger Insekten charakterisiert ist, wobei sie zur gleichen Zeit ökologisch sicher ist.
Von einem Aspekt her gesehen, stellt die vorliegende Erfindung eine Bioinsektizid-Trockenformulierung bereit, umfassend: die Biomasse und Endotoxine, erhalten von Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) mit toxischer Aktivität gegen zweiflügelige Insekten, wobei die Formulierung in der Form eines trockenen Pulvers mit einer toxischen Aktivität zwischen 500–1500 ITU (Internationale Toxische Einheiten)/mg trockenes Pulver vorliegt, wobei die Formulierung weiterhin Additive umfasst, die chemische Trockenmittel, Dispergiermittel, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel gegen Sonnenlicht sind.
Eine erste Ausführungsform dieser Erfindung betrifft eine bioinsektizide Formulierung, die als trockenes Pulver oder Tabletten verteilt wird, umfassend Additive, die die Endotoxine (ob rein oder nicht) tragen, ausgewählt in einer Weise, um eine hohe Dispersion bzw. Verteilung der aktiven Komponente in dem Ausbringungsbereich zu ermöglichen, aber keine Risiken für die Umwelt zu bewirken.
Von einem weiteren Gesichtspunkt her gesehen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer bioinsektiziden Formulierung mit toxischer Aktivität gegen zweiflügelige Insekten bereit, umfassend:

I. Wachstum von Bacillus thuringiensis var. israelensis mittels Fermentation in einem geeigneten Wachstumsmedium, in dem die nicht verbrauchten Metaboliten/Nährstoffe nicht schädlich für die Umwelt sind und sie in einem industriellen Maßstab verwendet werden können;
II. Gewinnung der toxischen Biomasse oder ihrer Sporen oder nur der Endotoxine aus Schritt (I) mittels eines geeigneten Verfahrens zur Rückgewinnung, das in der Lage ist, die toxischen Aktivitäten der Endotoxine beizubehalten, ob sie rein sind oder nicht;
III. sequentielle Zugabe von chemischen Trockenmitteln und anderen Additiven, die Dispergiermittel, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel gegen Sonnenlicht sind, zu der toxischen Biomasse oder zu ihren Sporen oder zu den Endotoxinen, die in Schritt (II) gewonnen wurden, und gegebenenfalls Dehydratation zwischen der Zugabe der chemischen Trockenmittel und der anderen Additive;
IV. Dehydratation des Gemischs aus Schritt (III) mittels eines Verfahrens, das in der Lage ist, die toxische Aktivität der Endotoxine, ob sie rein sind oder nicht, beizubehalten, um eine Formulierung als ein trockenes Pulver zu erhalten;
V. optionale Zugabe von Verdünnungsmitteln, Schmierbzw. Gleitmitteln und Neutralisierungsmitteln zu dem trockenen Pulver aus Schritt (IV) um Tabletten zu erhalten.

Das Hauptziel dieser Erfindung ist es, eine Trockenformulierung zu ermöglichen, bestehend aus Endotoxinen von Bacillus thuringiensis var. israelensis, die eine wirksame larvizide Aktivität gegen zweiflügelige Insekten präsentiert und dadurch gekennzeichnet ist, dass sie praktisch, ökonomisch ist und keinen Schaden an der Umwelt verursacht.
Für ein vollständigeres Verständnis werden wir unten die Bedeutungen der hierin verwendeten Begriffe darlegen:

1. Wirksame larvizide Aktivität: Befähigung 100% Larven innerhalb einer minimalen Aufenthaltszeit in dem Ausbringungsbereich zu töten; Vorhandensein einer guten Stabilität während der Lagerung (Lagerfähigkeit), wobei die anfängliche larvizide Aktivität praktisch unverändert erhalten wird, wobei Komponenten umfasst werden, die in der Lage sind, den Abbau der aktiven Komponente durch die physikalische, chemische und biologische Wirkung natürlicher Mittel im Ausbringungsbereich zu verhindern; Umfassen von Additiven, die eine Verfügbarkeit der aktiven Komponente in erforderlichen Leveln für solange wie möglich erzeugen (zum Beispiel Dispergiermittel, Substanzen, die die Netzmittelwirkung erhöhen).
2. Ökonomische larvizide Aktivität: Resultat der Wirksamkeit bei der biologischen Kontrolle zweiflügeliger Insekten, die die Verabreichung einer korrekten Dosis leichter machen würde, und der Langzeitwirkung der aktiven Komponente, die die Anzahl der erforderlichen Ausbringungen verringern würde.
3. Praktische larvizide Aktivität: Einsatz an Orten, die schwierig zu erreichen sind, und einfache Lagerung, Verpackung und Transport an die befallenen Orte.
4. Kein Schaden an der Umwelt (ökologisch sicher): bedeutet keine Veränderung am ökologischen Gleichgewicht, Wirken in einer selektiven Weise (tödlich nur für die Zielinsekten und

Isolierung und Wachstum von Bacillus thuringiensis var. israelensis und die Fermentationsphase können bei Bedingungen durchgeführt werden, die aus der technischen Literatur bekannt sind, um die aktive Biomasse zu erhalten.
Das Fermentationsmedium muss bereitstellen:

a) Stickstoffquelle-Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus industriellen Resten, die reich an Proteinen sind, Sojaproteine, Harnstoff, Hefeextrakt.
b) Kohlenstoffquelle-Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Dextrose und Saccharose.
c) Mikronährstoffquelle-Substanzen, ausgewählt aus Gemischen von Salzen, einschließlich MgSO₄, MnSO₄, ZnSO₄, FeSO₄ und CaCl₂.
d) Natriumchlorid, das eingesetzt wird, um die Zelllebensfähigkeit aufrechtzuerhalten.

Die Auswahl des am besten geeigneten Wachstumsmediums ist von primärer Wichtigkeit, um ein Bioinsektizid in einem industriellen Maßstab zu erhalten. Zusätzlich sollen im Fall von Formulierungen, deren Endotoxin nicht aufgereinigt (isoliert) ist, die Komponenten des Wachstumsmediums in einer solchen Weise ausgewählt werden, dass ihre Rückstände nicht schädlich für die Umwelt sind.
In der vorliegenden Erfindung sind die Komponenten des Wachstumsmediums in einer Weise ausgewählt, um das Verhältnis zwischen der Möglichkeit der Nutzung in einem industriellen Maßstab und der Minimierung der tödlichen Wirkungen, verursacht durch die Fermentationsrückstände, zu befriedigen.
Zur Ausführung dieser Erfindung wird das Wachstumsmedium der Wahl hergestellt aus: Amino-Fertile (1,5–3,0% G/G), Sojaprotein (1,0–1,5% G/G), Harnstoff (0,1–0,2% G/G), Mannit (0,6–0,8% G/G), Natriumchlorid (0,1–0,2% G/G), neben einem Gemisch aus Salzen (0,05–0,08% G/G) gemäß Tabelle 1.
Tabelle 1: Komponenten und ihre zugehörigen Konzentrationen:
Bei solchen Bedingungen ist die Zelllebensfähigkeit 1,8–3,8 × 10¹⁰ KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/ml.
Am Ende der Fermentation schließt die resultierende Trockenmasse, die die toxische Biomasse bildet, Endotoxine, Sporen, zerrissene und unveränderte Zellen von Bti ein, sowie feste Rückstände, die aus der Fermentation entstehen, und die resultierenden Metaboliten.
In der vorliegenden Erfindung können sowohl die toxische Biomasse von Bti und seine Sporen oder reine Endotoxine als Bioinsektizide Formulierungen (gewonnen durch gemeinhin verwendete Verfahren) verwendet werden, da sie nicht schädlich für die Wirksamkeit der aktiven Komponente (Endotoxin), ob rein oder nicht, sind.
Die toxische Biomasse kann zum Beispiel durch Zentrifugation unter Verwendung von Membranen (unter anderen) gewannen werden.
Nach der Gewinnung der Endotoxine von Bacillus thuringiensis var. israelensis, ob rein oder nicht, beginnt man die Bioinsektizid-Trockenformulierung (verteilt als trockenes Pulver) zu entwickeln, umfassend:

a) Endotoxine, ob rein oder nicht, von Bacillus thuringiensis var. israelensis.
b) chemische Trockenmittel.
c) Dispergiermittel.
d) Bindemittel/Netzmittel.
e) Schutzmittel gegen Sonnenlicht.

Auf diese Weise wird die aktive Biomasse von Bti oder seine gewonnenen Sporen oder sogar seine aufgereinigten Endotoxine mit chemischen Trockenmitteln (ausgewählt aus Diatomit, Bentonit, Calciumphosphat, calciniertem Siliciumdioxid (zum Beispiel Cab-o-sil^®), Diatomeenerde, Calcit, Ton, Siliciumdioxid, Kaolin, Dolomit, Leucit und Montmorillonit) gemischt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die gewählten chemischen Trockenmittel: Dolomit, Bentonit, Calciumphosphat und Cab-o-sil^®. Solche Trockenmittel sind bevorzugt in einem Verhältnis von 0,1–10% G/G.
Dispergiermittel, wie Methylcellulose, Ammonium- und Calciumalginat, Natriumalginat, Laktose und Carboxymethylcellulose, werden zusammen mit Bindemitteln/Netzmitteln (zum Beispiel Polyoxyethylenstearate (z.B. Mirj 45^®), Natriumlaurylsulfat und Monooleat von Polyoxyethylensorbitanen) eingesetzt.
Die aktive Komponente der vorliegenden Erfindung (Bti-Endotoxine, ob rein oder nicht) wird auch gegen Abbau, verursacht durch Sonnenlicht, geschützt. Ein solcher Schutz kann durch Mischen der aktiven Komponente mit wasserlöslichen Mitteln erhalten werden. Alternativ können die Partikel der aktiven Komponente mit schützenden Mitteln, wie TiO₂, wie in WO-A-98/15183 gezeigt, überzogen werden.
Die Dispergier- und Bindemittel, die in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind (entsprechend) Methylcellulose und Mirj 45^®. Vorzugsweise sind sie in einem Verhältnis von 0,1–10% G/G vorhanden.
Das Gemisch der aktiven Biomasse oder der Sporen oder reinen Endotoxine mit Additiven muss ausgeführt werden, nachfolgend gefolgt von Dehydratation. Zwischen den Stufen der Zugabe der chemischen Trockenmittel und der anderen Additive (Dispergier-, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel gegen Sonnenlicht) kann ein Dehydratationsschritt durchgeführt werden.
Die Dehydratation kann mittels bekannter Trocknungstechniken durchgeführt werden, die für industriellen Maßstab geeignet sind, wie Trocknen mit oder ohne Zwangsbelüftung, Trocknen mittels Rotationsverdampfer/-sprinkler („rotative vaporizer/sprinkler") und Gefriertrocknen, wodurch der Abbau der aktiven Komponente aufgrund hoher Temperaturen vermieden wird.
Das endgültige Gemisch wird dann gemahlen bis ein trockenes Pulver erhalten wird, dessen Partikelgröße zwischen 50–100 Mesh und dessen Feuchtigkeitsgrad etwa 5–15% G/G sein muss. Zur Ausführung dieser Erfindung sind die Bereiche der Wahl 60–80 Mesh und 9–11% G/G für Partikelgröße bzw. Feuchtigkeit.
In dieser Erfindung stellt die bioinsektizide Formulierung, verteilt als Pulver, eine toxische Aktivität zwischen 500–1000 TIU (Toxische Internationale Einheiten)/mg, ausgedrückt bei trockenem Pulver, bereit und ist eine der Anwendungen der Wahl für die biologische Kontrolle von zweiflügeligen Insekten. Ausgedrückt in Biomasse-Begriffen ist diese toxische Aktivität äquivalent zu 10⁸–10¹² KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/g toxische Biomasse.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden solche bioinsektizide Formulierungen als 100–200 mg-Tabletten (hergestellt aus dem trockenen Pulver) verteilt, umfassend:

a) Endotoxine, ob rein oder nicht, von Bacillus thuringiensis var. israelensis.
b) Chemische Trockenmittel.
c) Dispergiermittel.
d) Bindemittel/Netzmittel.
e) Schutzmittel gegen Sonnenlicht.
f) Verdünnungsmittel, Schmier- bzw. Gleitmittel und Neutralisierungsmittel.

Somit wird die Formulierung, verteilt als trockenes Pulver (d.h. die Formulierung, die durch Mischen der Komponenten a) bis e) gebildet wurde), mit mehreren Additiven, wie Neutralisierungs-, Verdünnungs- und Schmier- bzw. Gleitmitteln, zusammengesetzt. Unter den Neutralisierungs- und Verdünnungsmitteln findet man Natriumhydrogencarbonat, mikronisierte Cellulosen (Avicel^®), Laktose-Monohydrat, Apatit, granuliertes Mannit, calcinierten Ton, Kaolin, Leucit und Talk.
Schmier- bzw. Gleitmittel können Polyethylenglykole (PEG) mit Molekulargewicht zwischen 2000 und 6000 und Stearinsäure sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Neutralisierungs- und Verdünnungsmittel Natriumhydrogencarbonat, Avicel^® und Laktose-Monohydrat (vorzugsweise in einem Verhältnis von 10–70% G/G) und das Schmier- bzw. Gleitmittel entspricht PEG 6000 (vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von 1–5% G/G).
In der vorliegenden Erfindung liegen die aktiven Komponenten innerhalb 5–25% des Endgewichts der Formulierung, die als Tabletten verteilt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung haben die Tabletten eine Formulierung gemäß Tabelle 2.
Tabelle 2: Formulierung der Tabletten:
Die vorliegende Erfindung wird im Detail gemäß den folgenden Beispielen beschrieben, ist aber nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1:
Erzielung aktiver Biomasse von Bacillus thuringiensis var. israelensis:
Der Stamm Bacillus thuringiensis var. israelensis IPS 82 wurde eingesetzt, um aktive Biomasse zu erhalten.
Die Tabelle 3 zeigt das verwendete Fermentationsmedium.
Tabelle 3: Fermentationsmedium:

* Industrielle Reste, die reich an Proteinen sind.

Die Fermentation wurde bei 33°C 24 Stunden lang durchgeführt. Die Untersuchungen wurden in einem Maßstab von 50 ml in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben mittels Rühren in einem Schüttler, innerhalb eines Bereichs von 150–270 U.p.M., erstellt.
Die geeignete Zelllebensfähigkeit war 3,8 × 10¹⁰ KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/ml.
Beispiel 2:
Gewinnung aktiver Biomasse von Bacillus thuringiensis var. israelensis:
Nach dem Fermentationsschritt wurde die Trockenmasse (einschließlich Bti-Kristall-Protein), ihre Sporen, ihre zerrissenen und intakten Zellen sowie feste Rückstände, die aus dem Fermentationsmedium stammen, mittels eines Bioseparationsverfahrens mittels Membran-Vortex („membrane vortex") gewonnen. Die Betriebsbedingungen dieses Verfahrens sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: Betriebsparameter – Bioseparationsverfahren mittels Membran-Vortex.
Eine 20%-Ausbeute über das Ausgangsvolumen der aktiven Biomasse wird erhalten.
Beispiel 3:
Bioinsektizide Formulierung, verteilt als trockenes Pulver:
Die Biomasse, die gemäß der Vorgehensweise, die in dem vorigen Beispiel erwähnt wurde, gewonnen wurde, wurde mit den chemischen Trockenmitteln Diatomit, Bentonit, Tricalciumphosphat und Cab-o-sil^® in den Mengen, die in Tabelle 5 gezeigt sind, vermischt.
Tabelle 5: Menge an aktiver Biomasse und chemischen Trockenmitteln, eingesetzt in der Formulierung, die als trockenes Pulver verteilt wird.
Diatomit, Bentonit, Tricalciumphosphat und Cab-o-sil^® wurden gemahlen und homogenisiert. Dieses Gemisch wurde zu der aktiven Masse von Bti unter gleichmäßigem Rühren hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde in einem Ofen bei 37°C getrocknet.
Nach 36 Stunden wurde das trockene Pulver gemahlen, um ein feines und homogenes Pulver (genannt P) zu erhalten, das 27,29 g wog. Nach diesem Schritt wurden 0,5458 g (2% des Gewichts von P) einer zuvor gemahlenen Methylcellulose zu dem trockenen Pulver hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde dann homogenisiert.
Getrennt davon wurden 0,2729 g (1% des Gesamtgewichts von P) von Mirj^® in einem Wasserbad bis zum vollständigen Schmelzen erhitzt, während schrittweise 50 ml destilliertes Wasser unter heftigem Rühren hinzugefügt wurden. Zu dieser Lösung wurde dann der Sonnenfilter Eusolex 6007^® hinzugefügt.
Die vorige Lösung wurde dann langsam über das trockene Pulver P gegossen, das mit der Methylcellulose gemischt war. Das resultierende Gemisch wurde homogenisiert und bei 30°C 24 Stunden lang in einen Ofen eingebracht.
Das resultierende trockene Pulver (etwa 26,7 g) mit einem Feuchtigkeitsgrad von 10,83 % G/G wurde gemahlen und mittels eines 70-Mesh-Siebs (Tamis) gesiebt.
Die zelluläre Konzentration (bestimmt mittels der Technik der Plattenzählung) war 7 × 10¹¹ KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/g toxische Biomasse.
Somit wurde die bioinsektizide Formulierung, basierend auf Bacillus thuringiensis var. israelensis, die als trockenes Pulver (P₁) verteilt wird, erhalten.
Beispiel 4:
Bioinsektizide Formulierung, verteilt als Tabletten:
Das trockene Pulver (P₁), erhalten in dem vorigen Beispiel, wurde mit den Verdünnungsmitteln Avicel PH102 und Laktose-Monohydrat, mit Natriumhydrogencarbonat (Neutralisierungsmittel) und auch mit atomisiertem PEG 6000 (Schmier- bzw. Gleitmittel) vermischt. Dieses Gemisch von Pulvern wurde einer Drehungspressung unterzogen und als Bioinsektizid-Tabletten ausgeworfen.
Wir erhielten 20 oder 15 mg-Tabletten, umfassend trockenes Pulver P₁ als aktive Komponente.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Mengen an eingesetzten Mitteln, um 1 bzw. 600 Tabletten zu erhalten.
Tabelle 6: Eingesetzte Adjuvantien beim Herstellen von Tabletten, umfassend 20 mg aktive Komponente.
Tabelle 7: Eingesetzte Adjuvantien beim Herstellen von Tabletten, umfassend 15 mg aktive Komponente.
Beispiel 5:
Untersuchungen gegen Larven des Moskito Aedes aegypti:
Tabletten mit 20 und 15 mg der aktiven Komponente wurden auf lrvizide Aktivität gegen den Moskito Aedes aegypti getestet.
Eine Tablette wurde in jeweils 10 Liter Wasser platziert. Durch periodische Einführung von Larven von Aedes aegypti wurde ihre Mortalitätsrate bestimmt.
Die Ergebnisse für beide Tabletten machen deutlich, dass die entsprechenden Mengen an aktiver Komponente eine wirksame larvizide Aktivität zeigten, die eine 100%ige Mortalität der Larven ergab, während sie für bis zu 19 Tage in Bereichen unter Sonnenlicht und für 28 Tage in Bereichen im Schatten erhalten blieb.

Claims

Bioinsektizide Formulierung, umfassend die Biomasse und Endotoxine, erhalten von Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) mit toxischer Aktivität gegen Larven zweiflügeliger Insekten, die genannte Formulierung in der Form eines trockenen Pulvers mit einer toxischen Aktivität zwischen 500–1500 ITU (Internationale Toxische Einheiten)/mg trockenes Pulver und folgende Additive umfassend: chemische Trockenmittel, ausgewählt aus Diatomeenerde, Calcit, Ton bzw. Lehm, Siliciumdioxid, Kaolin, Diatomit, Bentonit, Dolomit, Calciumphosphat, Leucit, Montmorillonit und calciniertem Siliciumdioxid, Dispergiermittel, ausgewählt aus Calcium- und Ammoniumalginat, Natriumalginat, Lactose, Carboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Bindemittel/Netzmittel, ausgewählt aus Natriumlaurylsulfat, Monooleat von Polyoxyethylensorbitanen und Polyoxyethylenstearaten und ein Schutzmittel gegen Sonnenlicht, das Eusolex 6007^R ist.
Bioinsektizide Formulierung nach Anspruch 1, wobei die chemischen Trockenmittel 0,1–10 % (G/G) Diatomit, 0,1–10 % (G/G) Bentonit, 0,1–10 % (G/G) Calciumphosphat und 0,1–10 % (G/G) calciniertes Siliziumdioxid sind.
Bioinsektizide Formulierung nach Anspruch 1, wobei das Dispergiermittel Methylcellulose mit einem Gewicht im Bereich von 0,1–10 % (G/G) ist.
Bioinsektizide Formulierung nach Anspruch 1, wobei die Polyoxyethylenstearate in einem Bereich von 0,1–10 % (G/G) vorhanden sind.
Bioinsektizide Tablette, umfassend 5–25 % der Formulierung nach Anspruch 1 und Neutralisierungsmittel, Verdünnungsmittel und Schmier- bzw. Gleitmittel.
Tablette nach Anspruch 6, wobei die Neutralisierungs- und Verdünnungsmittel aus Natriumhydrogencarbonat, Apatit, granuliertem Mannit, mikronisierter Cellulose oder anderen Cellulosen, Lactose-Monohydrat, Kaolin, Leucit und Talk ausgewählt wurden.
Tablette nach Anspruch 7, wobei das Neutralisierungsmittel Natriumhydrogencarbonat ist, in einem Bereich von 10–70 % (G/G) und die Verdünnungsmittel mikronisierte Cellulose und Lactose-Monohydrat sind, beide in einem Bereich von 10–70 % (G/G) .
Tablette nach Anspruch 8, wobei das Schmier- bzw. Gleitmittel Polyethylenglykol 6000 ist, in einem Bereich von 1–5 % (G/G).
Verfahren zur Herstellung einer Bioinsektiziden Formulierung mit toxischer Aktivität gegen Larven zweiflügeliger Insekten, umfassend: I. Wachstum von Bacillus thuringiensis var. israelensis mittels Fermentation in einem Wachstumsmedium, in dem die nicht verbrauchten Metaboliten/Nährstoffe nicht schädlich für die Umwelt sind und sie in einem industriellen Maßstab verwendet werden können, wobei dieses Wachstumsmedium einschließt: 1,5–3,0 % (G/G) Amino-Fertile, 1,0–1,5 % (G/G) Soja-Protein, 0,1–0,2 % (G/G) Harnstoff, 0,6–0,8 % (G/G) Mannit, 0,1–0,2 % (G/G) Natriumchlorid und 0,05–0,08 % (G/G) eines Salzgemisches, zusammengesetzt aus 65,1 % (G/G) MgSO₄, 4,4 % (G/G) MnSO₄, 4,4 % (G/G) ZnSO₄, 4,4 % (G/G) FeSO₄, 21,7 % (G/G) CaCl₂, II. Gewinnung der toxischen Biomasse oder ihrer Sporen oder nur der Endotoxine aus Schritt (I), mittels eines geeigneten Verfahrens zur Rückgewinnung, das in der Lage ist, die toxischen Aktivitäten beizubehalten, ob sie rein sind oder nicht, III. Sequentielle Zugabe von chemischen Trockenmitteln und anderen Additiven, die Dispergiermittel, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel gegen Sonnenlicht sind, zu der toxischen Biomasse oder zu ihren Sporen oder zu den Endotoxinen, die in Schritt (II) gewonnen wurden und Dehydratation zwischen der Zugabe der chemischen Trockenmittel in Schritt (III) und der anderen Additive, IV. Dehydratation der Mischung aus Schritt (III) mittels eines Verfahrens, das in der Lage ist, die toxische Aktivität der Endotoxine beizubehalten, ob sie rein sind oder nicht, um eine Formulierung als ein trockenes Pulver zu erhalten, V. Optionale Zugabe von Verdünnungsmitteln, Schmier- bzw. Gleitmitteln und Neutralisierungsmitteln zu dem trockenen Pulver aus Schritt (IV), um Tabletten zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Wachstumsmedium einschließt: I. eine Stickstoffquelle, die eine oder mehrere Substanzen ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus industriellen Resten, die reich an Proteinen sind, Sojaprotein, Harnstoff, Hefeextrakt, II. eine Kohlenstoffquelle, die eine oder mehrere Substanzen ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Dextrose und Saccharose, III. eine Mikronährstoffquelle, die ein Salzgemisch ist, das MgSO₄, MnSO₄, FeSO₄, CaCl₂ ist, IV. Natriumchlorid, um die zelluläre Lebensfähigkeit beizubehalten.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Gewinnung der toxischen Biomasse in Schritt (II) durch Bioseparation mit einem Membran-Vortex durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Dehydratation in einem Ofen bei 30 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Tabletten durch Drehungspressung erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zugabe von Schutzmitteln gegen Sonnenlicht mittels eines einfachen Mischens oder durch Überziehen durchgeführt wird.