DE60115205T2

DE60115205T2 - Nitroreduktase reporter-gen assay mit fluoreszenz erhöhung

Info

Publication number: DE60115205T2
Application number: DE60115205T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Thomas; Nigel Paul Michael; Valerie Millar; Beth Davies; Mark Briggs
Original assignee: Amersham Biosciences UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 2000-02-02
Filing date: 2001-02-01
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2021-02-02
Also published as: CA2399368A1; AU3037601A; GB0002261D0; CA2399368C; EP1698900A1; EP1252520B1; AU782381B2; IL150947A0; ATE306669T1; WO2001057237A3; DK1252520T3; DE60115205D1; ES2250349T3; JP2007183284A; US20030186348A1; AU2005222569A1; JP2003522333A; US7662973B2; WO2001057237A2; EP1252520A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Erzeugen von Molekülen mit einer hohen Fluoreszenzleistung aus Molekülen mit einer niedrigeren oder vernachlässigbaren Fluoreszenz und die durch enzymatische Wirkung katalysiert werden können. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zum Erreichen der Fluoreszenzdetektion von Analyten durch Verwenden von enzymatischen Mitteln, um Fluoreszenzreporter-Moleküle zu erzeugen.
Die Verwendung von Fluoreszenz als eine Detektions-Modalität in biologischen Assays ist weit verbreitet, und eine mannigfaltige Vielfalt von Prozeduren ist verfügbar, um Fluoreszenz unter Assaybedingungen zur Detektion durch einen weiten Bereich von Techniken zu erzeugen. Diese Techniken umfassen Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzimmunoassay und Flow-Cytometry.
Unter den Verfahren, die zum Erzeugen eines Fluoreszenzsignals verwendet werden, sind jene, die chemische oder enzymatische Mittel verwenden, um ein nicht-fluoreszierendes Substrat in ein fluoreszierendes Produkt umzuwandeln. So setzt Katoh (Nippon Acta Radiologica, 1990, Band 50(6), Seiten 661–668), der sich auf canceröse Zellen bezieht, die chemische Reduktion eines Nitroacridinfarbstoffs ein, um eine Fluoreszenzsonde in hypoxischen Zellen als einen Indikator der Strahlungsempfindlichkeit zu erzeugen. Auf ähnliche Weise beschreibt Olive (Int. J. Radiation Oncology Biol. Phy., 1985, Band II(II), Seiten 1947–1954) die Verwendung von Nitroheterozyklen, die reduktiv in Tumorzellen metabolisiert werden, um Fluoreszenzsonden zu erzeugen.
Das Enzym kann an eine Assaykomponente gekoppelt sein, zum Beispiel an einen Antikörper in einem Immunoassay oder an ein Nukleinsäuremolekül in einem Nukleinsäurehybridisierungsassay, und wird typischerweise verwendet, um ein Fluo reszenzsignal von einem nicht-fluoreszierenden Substrat zu erzeugen. In derartigen Verfahren liefert die Fluoreszenzintensität des Produktes das Assaysignal und korreliert mit der Menge des Analyten im Assay (z.B. ein Antigen in einem Immunoessay oder eine komplementäre Nukleinsäuresequenz in einem Nukleinsäurehybridisierungsassay). Beispiele derartiger, auf Enzym basierender Fluoreszenzverfahrensassays sind beschrieben in „Applications of Fluorescence in Immunoassays", Kapitel 9, Seiten 223–232, I. A. Hemmila, John Wiley & Sons, New York, 1991 (Immunoassays) und „Nonisotopic DNA Probe Techniques", Kapitel 1, Seiten 3–23, L. J. Kricka, Academic Press Inc., New York, 1992 (Nukleinsäurehybridisierungsassays), und Enzyme, die in derartigen Verfahren verwendet werden, umfassen Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase.
Alternativ kann das Enzym durch Proteinsynthese im Verlauf des Assays erzeugt werden. Zum Beispiel wird in einem in-vivo-Genexpressionsassay das Enzym synthetisiert aus einem Gen, das üblicherweise ein Reportergen genannt wird und in eine Zelle oder einen Organismus eingesetzt ist, in der/dem es nicht natürlich auftritt und nur in geringen Gehalten gefunden wird, auf eine derartige Weise, dass die Expression des Reportergens an die Expression eines zellulären Gens von Interesse geknüpft ist. Konsequentes Verarbeiten des nicht-fluoreszierenden Substrats des Enzyms zu einem fluoreszierenden Produkt korreliert mit der Expression des Reportergens und liefert daher ein indirektes Maß für die Expression des zellulären Gens von Interesse.
Enzyme, die aus Reportergenen synthetisiert werden und gegenwärtig in Fluoreszenzassays für die Messung einer in-vivo-Genexpression verwendet werden, umfassen β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und β-Lactamase.
β-Galactosidase ist ein bakterielles Enzym und wurde zur Verwendung in derartigen Enzym-Reporter-Assays in Kombination mit Substraten, die durch Enzymaktivität fluoreszierend gemacht werden können, gut charakterisiert. Die Detektion der β-Galactosidase-Expression ist beschrieben in „Fluorescence Microcopy and Fluores cent Probes", Seiten 211–215, J. Slavik, Plenum Press, London, 1996. Hier wird ein nicht-fluoreszierendes Substrat, CMFDG, in Zellen mikroinjiziert, die das Enzym exprimieren, wo es in eine fluoreszierende Form hydrolysiert wird, die ein Maß der Enzymaktivität ergibt. Jedoch wird, da Säugerzellen etwas endogene β-Galactosidase-Aktivität zeigen, etwas Untergrundfluoreszenz des umgewandelten Substrats in in-vivo-Assays für die Genexpression sogar bei Nichtvorhandensein von Signalen, die zur Expression von β-Galactosidase von dem Reportergen führen, beobachtet.
Säugerzellen können auch etwas endogene alkalische Phosphatase-Enzymaktivität besitzen, die wieder zu einem Untergrund der Aktivierung eines nicht-fluoreszierenden Substrats in seine fluoreszierende Form führt, in in-vivo-Assays, die auf der Expression der alkalischen Phosophatase basieren. In diesem Fall ist das fluoreszierende Substrat typischerweise Fluoresceindiphosphat. Zusätzlich erfordert die optimale Aktivität der alkalischen Phosphatase einen pH von 9,8, der die Verwendung dieses Enzyms in in-situ-Assays begrenzt.
Kürzlich wurde ein fluoreszierendes Substrat für β-Lactamase dokumentiert (siehe US-Patent Nr. 5,955,604, Tsien et al). Das darin beschriebene Substrat, CCF2, ist zur Verwendung in einem auf FRET basierenden Assay (wie unten beschrieben) geeignet, in dem die Donor- und Akzeptormoleküle in dem fluoreszierenden Substrat durch die Enzymaktivität von β-Lactamase getrennt werden, um ein Fluoreszenzsignal vom Donormolekül zu erzeugen.
Jedoch sind die Fluoreszenzfarbstoffe, die in diesen Techniken verwendet werden, typischerweise Fluorescein und seine Derivate (Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6. Ausgabe, 1996 oder siehe www.probes.com). Auf Fluorescein basierende Fluoreszenzfarbstoffe besitzen typischerweise Anregungswellenlängen im UV bis blauen Bereich des Spektrums und Emissionswellenlängen im blauen bis grünen Bereich des Spektrums (d.h. Anregung bei annähernd 488 nm und Emission bei annähernd 510 nm). Diese Eigenschaften verleihen der Verwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe mit biologischen Materialien bestimmte Beschränkungen, da diese Wellenlängen mit den Anregungs- und Emissionsbereichen einer Anzahl biologischer Moleküle übereinstimmen. Dies kann eine hohe Untergrunds-Fluoreszenz in biologischen Assays mit einer daraus folgenden verringerten Detektionsempfindlichkeit ergeben.
Außerdem gibt es, da all diese bekannten Techniken Signale innerhalb desselben Bereichs des Spektrums ergeben, einen begrenzten Umfang dafür, dass mehrfache Signalgebungssysteme gleichzeitig eingesetzt und gelesen werden.
Farbstoffe, die auf Fluorescein basieren, besitzen eine Anzahl anderer Nachteile, einschließlich ihrer Tendenz zum Photobleaching, wenn sie mit starken Anregungsquellen bestrahlt werden. Außerdem sind einige Produkte von Enzymsubstraten, die auf diesen Fluoreszenzfarbstoffen basieren, pH-empfindlich, was zu einer Variation in der Fluoreszenz in unterschiedlichen Umgebungen führen kann. Probleme können bei Verwenden dieser Fluoreszenzfarbstoffe in intrazellulären Assays auftreten, da die Anregung im UV-Bereich, was eine hochenergetische Anregung bei einer kurzen Wellenlänge erfordert, zur Zellzerstörung Anlass geben kann, die wiederum zu irreführenden Ergebnissen führen kann.
Um diese Mängel existierender Enzymfluoreszenzsubstrate zu überwinden, gibt es ein Erfordernis für ein Molekül (oder Moleküle), das das Substrat für ein nicht-ubiquitäres Enzym ist und das keine oder eine niedrige Fluoreszenz in einer ersten Form besitzt, und das bei Reaktion mit dem Enzym ein auf die Umgebung bezogen stabiles fluoreszierendes Produkt ergibt, das Licht über einen breiten Bereich des Spektrums emittieren kann. Der Bereich der Emission könnte zum Beispiel im Bereich des 500–900 nm-Bereichs des Spektrums sein.
Die Cyaninfarbstoffe (manchmal als „Cy Dye^TM" bezeichnet), die zum Beispiel im US-Patent 5,268,486 beschrieben sind, sind eine Reihe biologisch kompatibler Fluorophore, die durch eine hohe Fluoreszenzemission, Umgebungsstabilität und einen Bereich von Emissionswellenlängen gekennzeichnet sind, die in das nahe Infra-Rot reichen und die durch Variieren des internen molekularen Skeletts des Fluorophors ausgewählt werden können.
Kürzlich wurden Cyaninfarbstoffe zur Verwendung in Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer-(FRET)-Assays entwickelt. Das Prinzip von FRET wurde in US 4,996,143 und kürzlich in PCT/GB99/01746 (Veröffentlichungsnummer WO99/64519) beschrieben. Kurz gesagt hängen FRET-Assays von einer Wechselwirkung zwischen zwei Fluorophoren ab, einem Donor-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor. Wenn die Donor- und Akzeptormoleküle in einer ausreichend nahen Nachbarschaft sind, wird die Fluoreszenz des Donormoleküls auf das Akzeptormolekül übertragen, mit einer daraus folgenden Abnahme in der Lebensdauer und einem Löschen der Fluoreszenz der Donorspezies und einem begleitenden Anstieg in der Fluoreszenzintensität der Akzeptorspezies. Die Verwendung von FRET-Markern in biologischen Systemen ist gut bekannt. Das Prinzip wurde bei der Detektion von Bindungsereignissen oder Spaltungsreaktionen in Assays verwendet, die FRET einsetzen. Im Falle von Peptid-Spaltungsreaktionen werden ein fluoreszierendes Donormolekül und ein fluoreszierendes Akzeptormolekül an ein Peptidsubstrat auf jeder Seite der zu spaltenden Peptidbindung und in einer derartigen Entfernung angebracht, dass ein Energietransfer stattfindet. Eine Peptid-Spaltungsreaktion wird die Donor- und Akzeptormoleküle trennen, und daher wird die Fluoreszenz des Donormoleküls wiederhergestellt werden.
In einem Format dieses Prinzips wird verursacht, dass eine Fluoreszenzeinheit in naher Nachbarschaft mit einem „Quencher"-Molekül derart ist, dass die Energie vom angeregten Donor-Fluorophor auf den Quencher übertragen wird und als Wärme, eher als als Fluoreszenzenergie, abgeführt wird. In diesem Fall wird die Restfluoreszenz minimiert, wenn die zwei Komponenten des Donor-Quencher-Paares in naher Nachbarschaft sind, und eine große Änderung im Signal kann erhalten werden, wenn sie getrennt werden.
Cyaninfarbstoffe, die zur Verwendung als Akzeptor- oder „Quencher"-Moleküle in einem FRET-Assay geeignet sind, wurden entwickelt (siehe PCT/GB99/01746) durch Durchführen bestimmter Modifikationen an Cyaninfarbstoffen durch Einführen von chemischen Gruppen, die den Effekt des Abschwächens oder der Beseitigung der Fluoreszenz des Moleküls besitzen. Ein Beispiel einer derartigen chemischen Modifikation ist die Einführung von -NO₂-Gruppen. Derart gelöschte Cy-Farbstoffe werden als Cy-Q-Farbstoffe oder „dark dyes" bezeichnet.
Es wurde gezeigt, dass die bakteriellen Enzyme, die Nitroreduktasen genannt werden, die allgemeine Reaktion katalysieren, die unten in Reaktionsschema 1 dargelegt ist: Reaktionsschema 1
wobei, bei Vorhandensein von NADH oder NADPH, eine oder mehrere -NO₂-Gruppen auf einem organischen Molekül zu einer Hydroxylamingruppe reduziert werden, die nachfolgend zu einer Amingruppe umgewandelt werden kann.
Bakterielle Nitroreduktasen wurden verwendet in Anti-Tumortherapie, um Prodrug-Moleküle in ihre entsprechenden zytotoxischen Formen umzuwandeln (Anlezark et al 1995, Biochem-Pharmacol 50(5), 609–18), durch Entfernen oder Reduzieren einer oder mehrerer NO₂-Gruppen auf dem Prodrug-Substrat. Derartige Substrate umfassen p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivate von zytotoxischen Verbindungen. Selektives Abtöten von Tumorzellen kann durch Targeting-Expression des Nitroreduktasegens auf Tumorzellen und Verabreichen des Prodrugs an das betroffene Gewebe erreicht werden (wie beschrieben zum Beispiel in US-Patent Nr. 5,780,585). Das Prodrug-Substrat wird in seine zytotoxische Form in den Tumorzellen umgewandelt, die die Nitroreduktase exprimieren, während die umgebenen Zellen (die nicht die Nitroreduktase enthalten) unbeeinflusst bleiben.
Nitroreduktasen wurden auch verwendet in Bio-Sanierungsprozessen zur Clearance von nitroaromatischen Verbindungen, die Umwelt- oder Gesundheitsschäden erzeugen können. US-Patent Nr. 5,777,190 beschreibt ein katalytisches Verfahren, das sauerstoff-empfindliche Nitroreduktasen zum Reduzieren von nitroaromatischen Verbindungen einbezieht, die durch die Zugabe von Sauerstoff gesteuert werden können, um zu verhindern, dass die Reaktion bis zum Abschluss fortschreitet. Vorgeschlagene Substrate umfassen Nitrobenzol, Trinitrotoluol und Orthochlornitrobenzol, wobei bevorzugte, sauerstoff-empfindliche Nitroreduktaseenzyme Ferredoxin NADP, Xanthinoxidase und Glutathionreduktase umfassen.
Bis heute scheint es keine Berichte zu geben, dass ein NO₂-enthaltendes modifiziertes Cyaninfarbstoffmolekül als ein Substrat für eine Nitroreduktase wirken könnte, um ein fluoreszierendes Molekül zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Vergrößern der Fluoreszenz eines modifizierten Cyaninfarbstoffs, der mindestens eine NO₂(Nitro)-Gruppe umfasst, zum Beispiel einen Cy-Q-Farbstoff in einem Reportergenassay.
Dies kann durch enzymatische Umwandlung einer NO₂-Gruppe in einem derartigen Cy-Q-Farbstoff zu einem NHOH oder NH₂ durch die Wirkung einer Nitroreduktase (NTR) erreicht werden. Anhängig von der Struktur des Cy-Q-Farbstoffs kann die Fluoreszenzemission von dem Produkt der Cy-Q/NTR-Reaktion quer über einen weiten Bereich von Wellenlängen auftreten, typischerweise 500–900 nm, im Gegensatz zu existierenden Reportern, die nur im blau-grünen Bereich des Spektrums emittieren. Diese Emission bei längeren Wellenlängen ist vorteilhaft beim Vermeiden von Untergrundfluoreszenz und Vergrößern der Empfindlichkeit in biologischen Systemen.
Außerdem können die Fluoreszenz-Emissionseigenschaften des Cy-Q/NTR-Reaktionsproduktes geändert werden, um für die Anwendung geeignet zu sein, durch Ausführen von Änderungen an der internen Struktur des Cy-Q-Moleküls, ohne die Ränder des Moleküls, z.B. die NO₂-Gruppen, zu ändern, die in die Reaktion mit Nitroreduktase einbezogen sind. So können Fluoreszenzreporter bereitgestellt werden, die zur Verwendung mit anderen, bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Farbstoffen in Multiplex-Systemen kompatibel sind.
Demgemäß stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Vergrößern der Fluoreszenz eines Farbstoffmoleküls, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, bereit, durch die Reduktion der mindestens einen NO₂-Gruppe zu NHOH oder NH₂, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem Nitroreduktasereportergenassay ausgeführt wird.
Geeignete NO₂-enthaltende Farbstoffe umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, wie Cyaninderivate, Cy-Q (beschrieben in PCT/GB99/017460), NO₂-Lanthanidenchelate (beschrieben zum Beispiel in Latra, M. J., Lumin. 1997, 75, 149–169 und Blasse, G., J. Phys. Chem. 1998; 92; 2419–2422) und NO₂ enthaltende Fluoresceine, Pyrene, Rhodamine, Coumarine oder BODIPY^TM-Farbstoffe.
In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist das Farbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung dient, eine modifizierte Cyaninfarbstoffverbindung mit der Formel I:
Formel I worin die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die Ringe, die X und Y enthalten, gebunden sind, oder gegebenenfalls an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome repräsentieren, die nötig sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, die aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls nicht mehr als 2 Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen ausgewählt sind;
X und Y dieselben oder verschieden sind und ausgewählt sind aus Bis-C₁-C₄-alkyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, -CH=CH- und N-W, worin N für Stickstoff steht und W ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, wo m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist, und R⁸ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halo, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulphonat, Sulphat, Carboxylat, Phosphonat, Polyethylenglycol, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reagieren;
die Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulphonat und Sulphat, wo R⁹ substituiert oder unsubstituiert ist und ausgewählt ist aus H, C₁-C₄-Alkyl, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halo, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulphonat, Sulphat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reagieren;
die Gruppen R¹ und R² ausgewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, das unsubstituiert oder substituiert sein kann;
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ mindestens eine Nitro-Gruppe umfasst, die die Fluoreszenzemission des Farbstoffs derart verringert, dass er im wesentlichen nicht fluoresziert.
Geeigneterweise kann die mindestens eine Nitrogruppe, die in den Farbstoffen der Formel I enthalten ist, direkt an die Ringe, die X und Y enthalten, gebunden sein. In der Alternative kann eine mono- oder di-nitro-substituierte Benzylgruppe an die Ringe, die X und Y enthalten, gebunden sein, die gegebenenfalls weiter mit einer oder mehreren Nitrogruppen, die direkt an die aromatischen Ringe gebunden sind, substituiert sein können.
In einer Ausführungsform können R¹ und R² aus C₁-C₁₀-Alkyl ausgewählt sein, die mit Gruppen substituiert sein können, die NH₂, OH, COOH, SO₃H, PO₄H, SH, Polyethylenglycol und Phenyl umfassen. Wenn Phenyl substituiert ist, kann es gegebenenfalls mit bis zu zwei Substituenten substituiert sein, die aus Carboxyl-, Sulphonat- und Nitro-Gruppen ausgewählt sind.
Beispiele der nicht-fluoreszierenden Cyaninfarbstoffmoleküle, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, besitzen sowohl die Formel II als auch die Formel III:
Formel II
Formel III
Speziell bevorzugt sind NO₂-enthaltende „dark dye"-Formen beliebiger der folgenden Cy-Farbstoffe. Die Anregungs(Abs)- und Emissions(Em)-Eigenschaften der nicht modifizierten Farbstoffmoleküle sind gezeigt:
In einer anderen Ausführungsform des ersten Aspektes wird die Reduktion einer NO₂-Gruppe durch eine bakterielle Nitroreduktase katalysiert.
Es ist wichtig, dass dies bedeutet, dass auf Cyanin basierende Farbstoffe in einer derartigen Enzym-Substrat-Reaktion zu denselben Zeiten wie beliebige der herkömmlichen Enzym-Substrat-Reaktionen verwendet werden können, die eine Fluoreszenz-Ablesung im blauen/grünen Bereich des Spektrums ergeben. Messungen können gleichzeitig unter Verwenden zweier verschiedener Wellenlängen gemacht werden; zum Beispiel könnten auf Fluorescein basierende Moleküle bei Abs 488/Em 510 detektiert werden, wohingegen reduzierte, auf Cyanin basierende Moleküle, wie jene, die auf Cy5 basieren, bei Abs 649/Em 670 detektiert werden könnten. Dies würde ein Multiplexing ermöglichen, d.h. das gleichzeitige Messen einer Anzahl verschiedener in-vitro- oder in-vivo-Effekte.
NO₂-enthaltende Cyaninmoleküle können als „nicht-fluoreszierende Farbstoffe" beschrieben werden, d.h. jene Farbstoffe, die einen intrinsischen niedrigen Wirkungsgrad zum Umwandeln absorbierten einfallenden Lichts zu Fluoreszenz besitzen. Die Wirksamkeit eines nicht-fluoreszierenden Farbstoffes als ein Nitroreduktasesubstrat ist das Ausmaß, in dem er einfallendes Licht zu Fluoreszenz nach einer Reduktionsreaktion umwandeln kann.
Einen Anstieg in der Fluoreszenz kann relativ zu einer Kontrollprobe gemessen werden, die ein NO₂-enthaltendes Cyaninfarbstoffmolekül-Substrat bei Nichtvorhandensein eines Nitroreduktaseenzyms umfasst.
Typische Bedingungen für die Nitroreduktase-Aktivität umfassen die Inkubierung der Zusammensetzung und eines Cyaninfarbstoffmoleküls, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, bei annähernd 37°C bei Vorhandensein von NADH und FMN.
Auf Zellen basierende Assays sind zunehmend attraktiv gegenüber biochemischen in-vitro-Assays zur Verwendung in High-Throughput-Screening (HTS). Dies beruht darauf, dass auf Zellen basierende Assays eine minimale Manipulation erfordern, und die Ablesungen in einem biologischen Kontext untersucht werden können, der zuverlässiger die normale physiologische Situation nachahmt. Derartige in-vivo-Assays erfordern eine Fähigkeit, einen zellulären Prozess zu messen, und ein Mittel, seine Leistung zu messen. Zum Beispiel kann eine Änderung im Muster der Transkription einer Anzahl von Genen durch zelluläre Signale induziert werden, die, zum Beispiel, durch die Wechselwirkung eines Agonisten mit seinem Zelloberflächen-Rezeptor oder durch interne zelluläre Ereignisse, wie DNA-Schädigung, getriggert werden. Die induzierten Änderungen in der Transkription können durch Assoziie ren eines Reportergens an einen Promotorbereich identifiziert werden, der dafür bekannt ist, dass er auf das spezifische Aktivierungssignal reagiert.
In auf Fluoreszenz basierenden Enzym-Substrat-Systemen ergibt ein Anstieg in der Fluoreszenz ein Maß der Aktivierung der Expression des Reportergens.
Demgemäß umfasst in einer Ausführungsform der Erfindung das Verfahren:

a) In Kontakt Bringen einer Wirtszelle mit einem Cyaninfarbstoffmolekül, das in Zellen eindringen kann und mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, wobei die Wirtszelle mit einem Nukleinsäuremolekül transfiziert worden ist, das Expressionskontroll-sequenzen umfasst, die funktionsfähig an eine Sequenz gekoppelt sind, die eine Nitroreduktase kodiert;
b) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenz, der aus der Reduktion des Cyaninfarbstoffmoleküls durch die Nitroreduktase folgt, als ein Maß für die Nitroreduktase-Genexpression.

Verfahren zum Verwenden einer Vielfalt von Enzymgenen als Reportergen in Säugerzellen sind gut bekannt (für einen Überblick siehe Naylor L. H. (1999) Biochemical Pharmacology 58, 749–757). Das Reportergen wird gewählt, um dem Produkt des Gens zu ermöglichen, bei Vorhandensein anderer zellulärer Proteine messbar zu sein, und wird in die Zelle unter der Steuerung einer gewählten Regulationssequenz eingeführt, die auf Änderungen in der Genexpression in der Wirtszelle reagiert. Typische Regulationssequenzen umfassen jene, die auf Hormone, Second Messengers und andere zelluläre Steuerungs- und Signalgebungsfaktoren reagieren. Zum Beispiel ist ein Agonist, der an sieben Transmembranrezeptoren bindet, dafür bekannt, Promotorelemente zu modulieren, einschließlich dem auf cAMP reagierenden Element, NFAT, SRE und AP1; Die MAP-Kinase-Aktivierung führt zur Modulation von SRE, was zu Fos- und Jun-Transkription führt; eine DNA-Schädigung führt zur Aktivierung der Transkription von DNA-Reparaturenzymen und dem Tumorsuppressorgen p53. Durch Auswahl einer geeigneten Regulationssequenz kann das Reporter gen verwendet werden, um den Effekt zugegebener Mittel auf zelluläre Prozesse einem Assay zu unterziehen, die die gewählte Regulationssequenz in der Studie beinhalten.
Zur Verwendung als ein Reportergen kann das Nitroreduktasegen durch allgemeine Verfahren isoliert werden, zum Beispiel durch Amplifizierung aus einer cDNA-Bibliothek durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCA) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, Seiten 14.5–14.20). Sobald es isoliert ist, kann das Nitroreduktasegen in einen Vektor eingeführt werden, der zur Verwendung mit Säugerpromotoren geeignet ist (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, Seiten 16.56–16.57), in Zusammenhang mit und unter der Steuerung der Genregulationssequenz in der Studie. Der Vektor, der den Nitroreduktasereporter und damit verbundene Regulationssequenzen enthält, kann in die Wirtszelle durch Transfektion unter Verwenden gut bekannter Techniken eingeführt werden, zum Beispiel durch Verwendung von DEAE-Dextran oder Calciumphosphat (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, Seiten 16.30–16.46). Andere geeignete Techniken werden den Fachleuten gut bekannt sein.
Es wurde gezeigt, dass die Nitroreduktase in Zellen gespeichert wird, wenn sie auf diese Weise exprimiert wird (siehe Bridgewater et al., Eur. J. Cancer 31a, 2362–70).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, in Zellen eindringen. Bevorzugt umfasst mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ des Cyaninfarbstoffmoleküls der Formel I eine Zellmembran-Permeabilisierungs-Gruppe. Membran-durchdringende Verbindungen können durch Maskieren hydrophiler Gruppen erzeugt werden, um hydrophobere Verbindungen bereitzustellen. Die maskierenden Gruppen können entworfen sein, um von dem fluorogenen Substrat innerhalb der Zelle abgespalten zu werden, um das erhaltene Substrat intrazellulär zu erzeugen.
Weil das Substrat hydrophiler ist als das die Membran durchdringende Derivat, wird es dann in der Zelle eingefangen. Geeignete Zellmembran-Permeabilisierungs-Gruppen können ausgewählt sein aus Acetoxymethylester, das einfach durch endogene, intrazelluläre Säuger-Esterasen gespalten wird (Jansen, A. B. A. und Russell, T. J., J. Chem. Soc. 2127–2132 (1965) und Daehne W. et al. J. Med-.Chem. 13, 697–612 (1970)) und Pivaloylester (Madhu et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 1998, 14, 5, Seiten 389–399), obwohl andere geeignete Gruppen einschließlich Delivery-Moleküle (wie Delivery-Peptide) durch jene Fachleute erkannt werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine NO₂-enthaltende Verbindung gemäß Formel I bereitgestellt, wobei die Verbindung so modifiziert ist, dass sie fähig ist, in eine Zelle einzutreten. Demgemäß wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine NO₂-enthaltende Verbindung bereitgestellt, ausgewählt aus Verbindungen der Formel IIIa oder Formel IIIb.
Formel IIIa
Formel IIIb
Typischerweise werden, um die Aktivität eines Mittels zum Aktivieren zellulärer Reaktionen über die Regulationssequenz in der Studie einem Assay zu unterziehen, Zellen, die mit dem Nitroreduktasereporter transfiziert sind, mit dem Testmittel inkubiert, gefolgt von Zugabe eines in Zellen eindringenden Cyaninfarbstoffsubstrats, wie ein Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst. Nach einer geeigneten Zeitdauer, die zur Umwandlung des Cyaninfarbstoffsubstrats zu einer Form, die höhere Fluoreszenz zeigt, erforderlich ist, wird die Fluoreszenzemission von den Fällen bei einer Wellenlänge gemessen, die für den gewählten Cyaninfarbstoff geeignet ist. Zum Beispiel würde für die Verbindung Cy-Q F (gezeigt in 1a) eine Fluoreszenzemission bei 690 nm mit einer Anregung bei 650 nm überwacht werden. Eine Messung der Fluoreszenz kann auf einfache Weise durch Verwenden eines Bereichs von Detektionsinstrumenten erreicht werden, einschließlich Fluoreszenzmikroskopen (z.B. LSM 410, Zeiss), Mikroplattenlesern (z.B. CytoFluor 4000, Perkin Elmer), CCD-Bildgebungssystemen (z.B. LEADseeker^TM, Amersham Pharmacia Biotech) und Flow-Cytometern (z.B. FACScalibur, Becton Dickinson).
Die gemessene Fluoreszenz wird mit Fluoreszenz aus Kontrollzellen verglichen, die dem Testmittel nicht ausgesetzt sind, und die Effekte, falls vorhanden, des Testmittels auf die Genexpression, die durch die Regulationssequenz moduliert ist, werden aus dem Verhältnis der Fluoreszenz in den Testzellen zur Fluoreszenz in den Kontrollzellen bestimmt.
Wo geeignet, kann ein Zellextrakt unter Verwenden herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Demgemäß umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Verfahren:

a) In Kontakt Bringen eines Wirtszellenextraktes mit einem Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, wobei die Wirtszelle mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert wurde, das Ex pressionskontrollsequenzen umfasst, die funktionsfähig an eine Sequenz gekoppelt sind, die eine Nitroreduktase kodiert; und
b) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenz, der aus der Reduktion des Cyaninfarbstoffmoleküls durch die Nitroreduktase folgt, als ein Maß für die Nitroreduktase-Genexpression.

Geeigneterweise ist der Cyaninfarbstoff eine Verbindung der Formel I wie zuvor beschrieben.
In einer Ausführungsform beliebiger der zuvor genannten Aspekte der Erfindung wird eine vergrößerte Fluoreszenz des Cyaninfarbstoffmoleküls durch Analyse der Fluoreszenzemission im Bereich 500–900 nm, bevorzugt 550–780 nm, und, am meisten bevorzugt 665–725 nm, identifiziert.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Kit für ein Reportersystem bereitgestellt, umfassend ein Mittel zum Exprimieren eines Nitroreduktasesystems und eines Farbstoffmoleküls, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst.
Geeignete Mittel zum Exprimieren eines Nitroreduktaseenzyms umfassen ein Expressionsplasmid oder andere Expressionskonstrukte. Verfahren zum Herstellen derartiger Expressionskonstrukte sind jenen Fachleuten gut bekannt.
Spezifische Beschreibung
Für die Zwecke der Klarheit werden nun bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Wege eines Beispiels mit Bezug auf die folgenden Figuren beschrieben:
1a zeigt die chemische Struktur der Verbindung der Formel II, genannt Cy-Q F.
1b zeigt ein Fluoreszenzemissionsspektrum von Cy-Q F, das für verschiedene Zeiten bei Vorhandensein von E. coli-B-Nitroreduktase inkubiert wurde.
2a zeigt die chemische Struktur der Verbindung der Formel III, genannt Cy-Q G.
2b zeigt ein Fluoreszenzemissionsspektrum von Cy-Q G, das für verschiedene Zeiten bei Vorhandensein von E. coli-B-Nitroreduktase inkubiert wurde.
3a zeigt eine HPLC-Analyse von Cy-Q G.
3b zeigt eine HPLC-Analyse von Cy-Q G, die mit Nitroreduktase behandelt ist.
4a zeigt eine MALDI-TOF-Massenspektrometrieanalyse von Cy-Q G.
4b zeigt eine MALDI-TOF-Massenspektrometrieanalyse von Cy-Q G, das mit Nitroreduktase behandelt ist.
5 zeigt eine Infrarot-Absorptionsspektroskopie von Cy-Q G und Cy-Q G, das mit Nitroreduktase behandelt ist.
6 zeigt die chemische Struktur von Cy5Q.
7 zeigt eine Fluoreszenzemission unterschiedlicher Konzentration von Cy5Q bei Vorhandensein von Nitroreduktase.
8 zeigt die Ergebnisse eines in-vitro-Bindungsassays mit Nitroreduktase.
9 zeigt eine Detektion der Nitroreduktase-Aktivität in Zell-Lysaten von transfizierten und Kontrollzellen durch Detektieren der Cy5-Fluoreszenz.
10 zeigt die Cy3-Fluoreszenz in Zellen, die Nitroreduktase exprimieren, und Kontrollzellen.
11 zeigt die Cy5-Fluoreszenz in Zellen, die Nitroreduktase exprimieren, und Kontrollzellen.
12 zeigt eine Messung der zellulären Nitroreduktase-Aktivität durch Flow-Cytometry.
13 zeigt ein Fluoreszenzemissionsspektrum einer Cy5Q-Cascade Blue-Kassette, a = 1 bei 649 nm im Wasser, dann verdünnte 100 Mikroliter + 3 ml Wasser, Anregung 450 nm.
14 zeigt das Fluoreszenzemissionsspektrum von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure, a = 0,2 bei 455 nm in Wasser, dann verdünnte 100 Mikroliter + 3 ml Wasser, Anregung 450 nm.
15 zeigt eine Cy5Q-Cascade Blue-Kassette nach der Behandlung mit NaOH-Lösung, a = 1 bei 650 nm im Wasser, dann verdünnte 100 Mikroliter + 3 ml Wasser, Anregung 450 nm.
16 zeigt die relative Fluoreszenz der Cy5Q-Cascade Blue-Kassette bei Vorhandensein oder bei Nichtvorhandensein von Lysat/NTR.
Beispiel 1
Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt, die 0,8 mg/ml E. coli-B-Nitroreduktase, 1 mM NADH, 0,4 μm FMN und 0,05 mM Cyanin-Q F (Cy-Q F, 1a) in mit Phosphat gepufferter Salzlösung auf Eis enthielt. Eine Probe wurde sofort für die Analyse durch Fluoreszenzspektroskopie entfernt, und weitere Proben wurden für die Analyse nach der Inkubation der Reaktionsmischung bei 37°C für 1, 2 und 5 Stunden entfernt.
Die Analyse der Fluoreszenzemission im Bereich 665 nm bis 725 nm, die sich aus der Anregung bei 650 nm ergab, zeigte einen merklichen Anstieg in der Fluoreszenz mit der Zeit der Inkubation von Cy-Q F mit Nitroreduktase (1b), mit einer maximalen Emission bei 690 nm.
Beispiel 2
Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt, die 0,8 mg/ml E. coli-B-Nitroreduktase, 1 mM NADH, 0,4 μm FMN und 0,05 mM Cyanin-Q F (Cy-Q G, 2a) in mit Phosphat gepufferter Salzlösung auf Eis enthielt. Eine Gruppe wurde sofort für die Analyse durch Fluoreszenzspektroskopie entfernt, und weitere Proben wurden für die Analyse nach der Inkubation der Reaktionsmischung bei 37°C für 1, 2 und 5 Stunden entfernt.
Die Analyse der Fluoreszenzemission im Bereich 660 nm bis 720 nm, die sich aus der Anregung bei 650 nm ergab, zeigte einen merklichen Anstieg in der Fluoreszenz mit der Zeit der Inkubation von Cy-Q G mit Nitroreduktase (2b), mit einer maximalen Emission bei 675 nm.
Proben von Cy-Q G, die bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein von Nitroreduktase inkubiert wurden, wurden durch HLPC analysiert. Die HLPC-Ergebnisse (3a und 3b) zeigen an, dass die Nitroreduktase-Behandlung des Cy-Q eine > 95%-ige Umwandlung des Cy-Q G zu einem Produkt mit einer HLPC-Retentionszeit von 30,5 Minuten ergibt, verglichen mit einer Retentionszeit von 43,2 Minuten für das Ausgangsmaterial. Die Hauptpeaks von der HPLC-Analyse wurden einer weiteren Analyse durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie unterzogen (4a und 4b). Diese Analyse zeigte eine Hauptmasse von 620,3 für das Reaktionsprodukt, verglichen mit 650,1 für das Cy-Q G-Ausgangsmaterial, wobei diese Massenänderung mit der Umwandlung einer -NO₂-Gruppe zu einer -NH₂-Gruppe konsistent ist und konsistent ist mit dem vorgeschlagenen Enzymreaktionsmechanismus. Dies wurde durch weitere Analyse unter Verwenden von Infrarot-Absorptionsspektroskopie bestätigt (5), die das Verschwinden eines starken N=O-Bindungs-Absorptionsbandes bei der Enzymbehandlung zeigte, konsistent mit der enzymatischen Reduktion der Cy-Q G-NO₂-Gruppe zu einer Amingruppe.
Beispiel 3
Nitroreduktase K_m-Messung für Cy5Q
E. coli-B-Nitroreduktase (500 ng) wurde bei Vorhandensein ansteigender Konzentrationen von Cy5Q (6) in 200 μl von 10 mM Tris·HCl pH 7,5, enthaltend 1 mM NADH, inkubiert und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert.
Die Fluoreszenz von jeder Reaktion wurde in einem CytoStar-Plattenleser (PerSeptive Biosystems) unter Verwendung von 610/20 nm-Anregungs- und 670/40 nm-Emissions-Filtern gemessen. Die Ergebnisse wurden auf Fluoreszenz bei Nichtvor handensein des Nitroreduktase-Enzyms (7) korrigiert und ein K_m-Wert von 8,6 ± 0,7 μM wurde unter Verwenden von Kurven-Fit-Software (Prisma) berechnet.
Beispiel 4
In-vitro-Bindungsassay mit Nitroreduktase
Nitroreduktase (400 ug, 16,7 nmol) wurde mit 334 nmol Sulpho-NHS-Biotin (Pierce) in PBS pH 8,0 zwei Stunden lang auf Eis markiert. Freies Biotin wurde durch Übernacht-Dialyse gegen PBS pH 7,4 bei 4°C entfernt.
Ansteigende Konzentrationen von Biotin (Sigma) von 0–100 nmol/Well wurden zu Wiederholungs-Wells einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (Pierce) in 100 μl PBS pH 7,4 gegeben, gefolgt von 100 μl PBS-enthaltender 0,5 μg-biotinylierten Nitroreduktase, und die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Platte dreimal mit PBS gewaschen, um ungebundenes Enzym zu entfernen, und 100 ul von 5 uM Cy5Q in PBS, das 1 mM NADH enthielt, wurde zu allen Wells gegeben.
Nach der Inkubation für 35 Minuten bei Raumtemperatur, um eine Reaktion zwischen gebundener Nitroreduktase und dem zugegebenen Cy5Q zu ermöglichen, wurde die Platte auf einem Cytofluor-Plattenleser (Perseptive) unter Verwenden eines 610/20 nm-Anregungsfilters und eines 670/40 nm-Emissionsfilters analysiert.
8 zeigt eine starke Fluoreszenz des Cy5 bei Vorhandensein gebundener Nitroreduktase. Das Binden der Nitroreduktase an die Platte wurde in hohen Konzentrationen freien Biotins gestört, so dass Cy5Q nicht reduziert war und eine geringe Fluoreszenz zeigt.
Beispiel 5
Transfektion von Nitroreduktase und Messung der Aktivität in Zell-Lysaten
Das E. coli-Nitroreduktase-B-Gen wurde in den p-Target-Säuger-Expressionsvektor (Promega) unter der Steuerung eines CMV-Promotors geklont und zu CHO-Zellen unter Verwenden von Effectene-Transfektionsreagenz (Qiagen) transfiziert, gemäß der Instruktionen der Lieferanten.
Nach dem Wachstum der Zellen für 24 Stunden wurden Zell-Lysate von transfizierten und nicht-transfizierten Kontrollzellen durch Beschallen in mit Phosphat gepufferter Salzlösung hergestellt. Die Nitroreduktase-Aktivität wurde durch Zugabe von 2 μM Cy5Q und Inkubieren bei Raumtemperatur für 90 Minuten bestimmt, gefolgt von Messung der Fluoreszenz in einem CytoStar-Plattenleser (PerSeptive Biosystems) (9) unter Verwenden von 610/20 nm-Anregungs- und 670/40 nm-Emissions-Filtern. Die Ergebnisse zeigten einen starken Anstieg in der Fluoreszenz in Lysat-Proben von Nitroreduktase-exprimierenden Zellen, der zu der Menge der dem Assay unterzogenen Zell-Lysaten proportional war.
Beispiel 6
Messung der zellulären Nitroreduktase-Aktivität unter Verwenden von in Zellen eindringenden Fluoreszenzsubstraten.
Zwei Ethylester-Derivate von nitro-gelöschten Cyaninfarbstoffen, Cy3Qee (Formel IIIa) und Cy5Qee (Formel IIIb) wurden synthetisiert.
Herstellung von 5-(Carboxymethyl)-1,2,3,3-tetramethyl-3H-indolium-iodid (1)
Methyliodid (3 ml, 48,19 mmol) wurde zu einer Lösung von 2,3,3-Trimethyl-3H-indol-5-yl-essigsäure (2,5 g, 11,52 mmol) in Sulfolan (15 ml) gegeben. Die Reaktion wurde bei 48°C 18 Stunden lang erwärmt, dann auf Raumtemperatur gekühlt. Die rohe Reaktionsmischung wurde tropfenweise zu einem Überschuss Diethylether gegeben und das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und in vacuo getrocknet, um das Produkt als einen beigefarbenen Feststoff zu erhalten (3,27 g, 79% Ausbeute). ¹H NMR (d₆-DMSO): δH 7,85 (d, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,50 (d, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,75 (s, 2H), 2,75 (s, 3H), 1,50 (s, 6H). MALDI-TOF, m/z = 232 (M⁺ = 232 für C₁₄H₁₈NO₂).
Herstellung von 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-(carboxymethyl)-3H-indolium-bromid (2)
3,5-Dinitrobenzylchlorid (12,46 g, 57,5 mmol) wurde zu einer Lösung von 2,3,3-Trimethyl-3H-indol-5-yl-essigsäure (2,5 g, 11,5 mmol) mit Natriumbromid (5,92 g, 57,5 mmol) in Sulfolan (10 ml) gegeben. Die Reaktion wurde auf 100°C 20 Stunden lang erwärmt, dann auf Raumtemperatur gekühlt. Die rohe Reaktionsmischung wurde tropfenweise zu einem Überschuss Ethylacetat gegeben und der dunkle braune Feststoff wurde abgefiltert und in Dimethylsulfoxid vor der Reinigung durch Umkehrphasenchromatographie aufgelöst. Das Produkt wurde als ein beigefarbener Feststoff isoliert (54% Ausbeute). ¹H NMR (d₆-DMSO): δH: 8,75 (s, 1H), 8,45 (s, 2H), 7,15 (s, 1H), 6,95 (d, 1H) 6,70 (d, 2H), 5,10 (s, 2H), 3,95 (s, 2H), 3,45 (s, 3H), 1,40 (s, 6H). MALDI-TOF, m/z = 398 (M⁺ = 398 für C₂₀H₂₀N₃O₆).
Herstellung von 5-(Carboxymethyl)-2-{(1E,3E)-5-[6-(carboxymethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium-Salz (3)
1,2,3,3-Tetramethyl-3H-indolium-iodid (1) (50 mg, 0,139 mmol) und 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-(carboxymethyl)-3H-indolium-bromid (2) (66 mg, 0,139 mmol) wurden in Essigsäure (3,15 ml), Pyridin (3,15 ml) und Essigsäureanhydrid (0,7 ml) mit Malon-aldehyd-bis(phenylimin)-monohydrochlorid (358 mg, 1,39 mmol) aufgelöst. Die Reaktion wurde auf 70°C 2 Stunden lang erwärmt. Die Lösung wurde dann tropfenweise zu einem Überschuß Diethylether gegeben und der blaue Feststoff wurde abgefiltert und durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (HPLC mit Wasser/0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als Eluent). Das Produkt wurde als ein dunkelblaues Pulver isoliert (33,3 mg, 31% Ausbeute). UV_max (H₂O) = 646 nm. ¹H NMR (d₆-DMSO): δH 8,75 (s, 1H), 8,45 (s, 2H), 8,35 (m, 2H), 7,5 (m, 6H), 6,55 (m, 2H), 6,25 (d, 1H), 5,6 (s, 2H), 3,7 (m, 7H), 1,8 (s, 3H), 1,7 (s, 2H). FAB⁺: m/z = 665 (M⁺ = 665 für C₃₇H₃₇N₄O₈).
Herstellung von 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-2-{(1E,3E)-5-[6-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadienyl}-3,3-dimethyl-3H-indolium-Salz (4) (Formel IIIa).
5-(Carboxymethyl)-2-{(1E,3E)-5-[6-(carboxymethyl)-1,1,3-timethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium (3) (4,5 mg, 0,0058 mmol) wurde in Ethanol (2 ml) mit konzentrierter Salzsäure (20 μl) aufgelöst und bei Raumtemperatur unter Stickstoff 16 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (HPLC mit Wasser/0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als Eluent), um das Produkt als einen blauen Feststoff zu isolieren (4,1 mg, 85% Ausbeute). UV_max (H₂O) = 647 nm. ¹H NMR (CDCl₃): δH 8,95 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 7,85 (m, 2H), 7,3 (m, 6H), 6,85 (d, 1H), 6,5 (m, 2H), 5,5 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,7 (s, 4H), 3,65 (s, 3H), 1,8 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,25 (t, 6H). FAB⁺: m/z = 721 (M⁺ = 721 für C₄₁H₄₆N₄O₈).
Herstellung von 5-{2-[(Acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl}-2-[(1E,3E)-5-(6-{2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl}-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene)-1,3-pentadienyl]-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium-Salz (5)
Zu einer Lösung von 5-(Carboxymethyl)-2-{(1E,3E)-5-[6-(carboxymethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadienyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium (3) (10 mg, 0,015 mmol) in wässrigem Acetonitril (2 ml) mit N,N-Diisopropylethylamin (4,7 mg, 0,0375 mmol) wurde Brommethylacetat (23 mg, 0,150 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre 24 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck verdampft und der blaue Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (HPLC). Das Produkt wurde als ein blaues Pulver isoliert (10,6 mg, 83% Ausbeute). UV_max (H₂O) = 643 nm. ¹H NMR (CDCl₃): δH 9,05 (s, 1H), 8,5 (s, 2H), 8,35 (m, 1H), 7,35 (m, 6H), 7,2 (m, 1H), 7,0 (m, 1H), 6,45 (m, 1H), 6,15 (m, 1H), 5,75 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,7 (s, 4H), 2,1 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,75 (s, 6H), 1,70 (s, 6H). FAB⁺: m/z = 809 (M⁺ = 809 für C₄₃H₄₅N₄O₁₂).
Herstellung von 5-(Carboxymethyl)-2-{(1E)-3-6-(carboxymethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1-propenyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium-Salz (6).
1,2,3,3-Tetramethyl-3H-indolium-iodid (1) (100 mg, 0,28 mmol) und 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-(carboxymethyl)-3H-indolium-bromid (2) (133 mg, 0,28 mmol) wurden in Essigsäure (2,25 ml), Pyridin (2,25 ml) und Essigsäureanhydrid (0,25 ml) mit N,N'-Diphenylformamidin (55 mg, 0,28 mmol) aufgelöst. Die Reaktion wurde bei 70°C 2 Stunden lang erwärmt. Die Lösung wurde dann tropfenweise zu einem Überschuss von Diethylether gegeben und der rote Feststoff wurde gefiltert und dann durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (HPLC mit Wasser/0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als Eluent). Das Produkt wurde als ein dunkles pinkfarbenes Pulver isoliert (16,5 mg, 8% Ausbeute). UV_max (H₂O) = 553 nm. MALDI-TOF: m/z = 640 (M⁺ = 639 für C₃₅H₃₅N₄O₈)_.
Herstellung von 1-(3,5-Dinitrobenzyl)-5-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-2-{(1E)-3-[6-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1-propenyl}-3,3-dimethyl-3H-indolium-Salz (7) (Formel IIIb).
5-(Carboxymethyl)-2-{(1E)-3-6-(carboxymethyl)-1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene]-1-propenyl}-1-(3,5-dinitrobenzyl)-3,3-dimethyl-3H-indolium (6) (4 mg, 0,00531 mmol) wurde in Ethanol (2 ml) mit konzentrierter Salzsäure (50 μl) aufgelöst und bei Raumtemperatur unter Stickstoff 20 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (HPLC mit Wasser/0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als Eluent), um das Produkt als einen pinkfarbenen Feststoff zu isolieren (3,2 mg, 74% Ausbeute). UV_max (H₂O) = 549 nm. ¹H NMR (CDCl₃): δH 9,0 (s, 1H), 8,4 (s, 2H), 8,45 (m, 1H), 7,3 (m, 6H), 6,9 (d, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,6 (s, 2H), 4,2 (q, 4H), 3,75 (s, 4H), 3,7 (s, 3H), 1,85 (s, 3H), 1,7 (s, 3H), 1,3 (t, 6H). MALDI TOF: m/z = 696 (M⁺ = 695 für C₃₉H₄₃N₄O₈).
Cy3Qee (Formel IIIa) und Cy5Qee (Formel IIIb) wurden als in Zellen eindringende Fluoreszenzsubstrate für die Nitroreduktase-Messung in lebenden Zellen bewertet. Nitroreduktase exprimierende Zellen und Kontrollzellen wurden bei 10000 Zellen/Well in 96 Well-Platten in Gewebekulturmedium, das 10% Kalbsfötusserum enthielt, kultiviert und bei 37°C bei Vorhandensein von 10 μM Cy3Qee oder 30 μM Cy5Qee inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwenden eines CytoStar-Plattenlesers (PerSeptive Biosystems) unter Verwenden von 530/25 nm-Anregungs- und 580/50 nm-Emissionsfiltern für Cy3Qee und 610/20 nm-Anregungs- und 670/40 nm-Emissionsfiltern für Cy5Qee erstellt.
Fluoreszenzmessungen zeigten einen signifikanten, zeitabhängigen Anstieg in der Fluoreszenz in Nitroreduktase exprimierenden Zellen mit minimalen Änderungen in der Fluoreszenz in Kontrollzellen, was anzeigte, dass sowohl Cy3Qee (10) als auch Cy5Qee (11) effektive, in Zellen eindringende Substrate für die Messung der Nitroreduktase-Aktivität in lebenden Zellen sind.
Beispiel 7
Messung zellulärer Nitroreduktase-Aktivität in lebenden Zellen durch Flow-Cytometry.
Nitroreduktase exprimierende Zellen und Kontrollzellen wurden zwei Stunden lang bei 37°C in Gewebekulturmedium, das 30 μM Cy3Qee enthielt, inkubiert. Nach der Inkubation wurden Zellen mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen und trypsiniert, um Zellsuspensionen für Flow-Cytometry zu erzeugen.
Die Zellen wurden unter Verwenden eines FACScalibur-Flow-Cytometers (Becton Dickinson) unter Verwenden einer 488 nm-Laseranregung und einem 585/42 nm-Emissionsfilter analysiert. Die Ergebnisse (12) zeigen einen signifikanten Anstieg in der Fluoreszenz in Nitroreduktase exprimierenden Zellen (mittlere Fluoreszenz von 169,9) im Vergleich zu Kontrollzellen (mittlere Fluoreszenz 18,2).
Beispiel 8 Herstellung einer Cy50^TM-Cascade Blue^®-Ester-gebundenen Kassette
Cy5Q-freie-Monosäure-Kaliumsalz (erhalten von Amersham Pharmacia Biotech Ltd) (5 mg, 0,006 mmol), Cascade Blue^® (Molecular Probes) (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäurenatriumsalz (8,8 mg, 0,018 mmol) (Fluka)), N,N-Diisopropylcarbodiimid (10 μl, 0,065 mmol), 1-Hydroxybenzotraizol (1 mg, 0,007 mmol), 4-(Dimethylamino)pyridin (0,9 mg, 0,007 mmol) und aktiviertes Molekularsiebpulver (250 mg) wurden zusammen in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (2 ml) bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Ein neuer Produkt-Spot wurde durch TLC (RP C₁₈ 1:1 MeOH:Wasser), rf = 0,8 (verglichen mit freiem Cy5Q; rf = 0,72) beobachtet. Die Molekularsiebe wurden abgefiltert und das Produkt präzipitierte in Diethylether. Das Präzipitat wurde abgefiltert, mit Ethylacetat gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde durch RP-C₁₈-Flash-Säulenchromatographie gereinigt. Nicht reagiertes 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäurenatriumsalz wurde aus der Säule mit Wasser eluiert und das Produkt eluierte dann mit 5% Acetonitril/Wasser. Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden gesammelt und das meiste des Lösungsmittels unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, um das Produkt als ein cyanfarbenes Pulver zu ergeben (1 mg, 11%).
λmax (Wasser) 648 nm (Cy5Q) 354, 372 nm (Pyren).
MALDI-TOF-MS; gefunden 1246 (MH⁺); [theoretisch (C₅₄H₄₄N₄O₂₁S₅) 1245].
Fluoreszenz; Cy5Q-Cascade Blue-Ester-gebundene Kassette besitzt eine vernachlässigbare Emission bei 510 nm (13); 510 nm ist das Emissionsmaximum für freies 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäurenatriumsalz in Wasser, (14). Dies zeigt einen effizienten Energietransfer vom Cascade Blue zum Cy5Q und das Löschen der Fluoreszenz der Cascade Blue-Einheit an, wenn sie an Cy5Q innerhalb der Kassette gebunden ist. Wenn sie mit Natriumhydroxidlösung behandelt ist, wird eine Fluoreszenzemission bei 510 nm beobachtet (15), was die chemische Hydrolyse der Esterbindung und die Freisetzung der fluoreszierenden 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure-Einheit anzeigt.
In-vitro-Bewertung
Cy5Q-Cascade Blue-Kassette (0,8 mM in Acetatpuffer pH 5,0) wurde auf 8 μM in PBS pH 7,4, das 1 mM NADH enthielt, verdünnt. Ein Zell-Lysat wurde aus 2 × 10⁷ SKOV-Zellen durch Resuspendieren von Abfall-Zellen in 5 ml PBS bei 4°C und wiederholten Durchlauf durch eine 25-Eichmaß-Spritzennadel hergestellt. Aliquote Mengen (1 ml) von Cy5Q-Cascade Blue wurden mit 500 μl des Zell-Lysats oder PBS 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl einer 1 ng/μl-Lösung von E. coli-B-Nitroreduktase zu einer Probe gegeben und die Inkubation 5 Minuten lang fortgesetzt. Aliquote Mengen (100 ml) wurden dann in vierfacher Ausführung von jeder Probe auf eine 96 Well-Platte für die Messung der Fluoreszenz auf einem Cytofluor-Plattenleser unter Verwenden von 450 nm-Anregungs-/530 nm-Emissions-Filtern für Cascade Blue und 610 nm-Anregung/670 nm-Emission für Cy5 abgegeben.
16 zeigt eine Vergrößerung der Fluoreszenzemission bei 530 nm (d.h. von Cascade Blue), wenn die Kassette bei Vorhandensein von Zell-Lysat inkubiert wurde, und einen Anstieg in der Fluoreszenzemission bei 670 nm (d.h. Cy5), wenn das Nitroreduktaseenzym vorhanden ist.

Claims

Verfahren zum Vergrößern der Fluoreszenz eines Farbstoffmoleküls, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, durch die Reduktion der mindestens einen NO₂-Gruppe zu NHOH oder NH₂, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem Nitroreduktase-Reporter-Gen-Assay ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Farbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, ein Cyaninfarbstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, die Formel I besitzt:
Formel I worin die Gruppen R³, R⁴, R⁵ und R⁶ an die Ringe, die X und Y enthalten, gebunden sind, oder gegebenenfalls an Atome der Z¹- und Z²-Ringstrukturen gebunden sind und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; Z¹ und Z² jeweils eine Bindung oder die Atome repräsentieren, die nötig sind, um einen oder zwei kondensierte aromatische Ringe zu vervollständigen, wobei jeder Ring 5 oder 6 Atome besitzt, die aus Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls nicht mehr als 2 Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen ausgewählt sind; X und Y dieselben oder verschieden sind und ausgewählt sind aus bis-C₁-C₄-Alkyl- und C₄-C₅-Spiroalkyl-substituiertem Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, -CH=CH- und N-W, worin N für Stickstoff steht und W ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer Gruppe -(CH₂)_mR⁸, wo m eine ganze Zahl von 1 bis 26 ist und R⁸ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halo, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulphonat, Sulphat, Carboxylat, Phosphonat, Polyethylenglycol, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reagieren; die Gruppen R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem C₁-C₄-Alkyl, OR⁹, COOR⁹, Nitro, Amino, Acylamino, quaternärem Ammonium, Phosphat, Sulphonat und Sulphat, wo R⁹ substituiert oder unsubstituiert ist und ausgewählt ist aus H, C₁-C₄-Alkyl, Amino, Aldehyd, Acetal, Ketal, Halo, Cyano, Aryl, Heteroaryl, Hydroxyl, Sulphonat, Sulphat, Carboxylat, substituiertem Amino, quaternärem Ammonium, Nitro, primärem Amid, substituiertem Amid und Gruppen, die mit Amino-, Hydroxyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Phosphoryl- und Sulfhydrylgruppen reagieren; die Gruppen R¹ und R² ausgewählt sind aus C₁-C₁₀-Alkyl, das unsubstituiert oder substituiert sein kann; dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ mindestens eine Nitro-Gruppe umfasst, die die Fluoreszenzemission des Farbstoffs derart verringert, dass er im wesentlichen nicht fluoresziert.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem das Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, eine Verbindung der Formel II oder Formel III oder Salzen davon ist.
Formel II
Formel III
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Nitroreduktase eine bakterielle Nitroreduktase ist.
Assay-Verfahren, umfassend: a) In Kontakt Bringen einer Wirtszelle mit einem Cyaninfarbstoffmolekül, das in Zellen eindringen kann und mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, wobei die Wirtszelle mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert worden ist, das Expressionskontrollsequenzen umfasst, die funktionsfähig an eine Sequenz gekoppelt sind, die eine Nitroreduktase kodiert; und b) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenz, der aus der Reduktion des Cyaninfarbstoffmoleküls durch die Nitroreduktase folgt, als ein Maß für die Nitroreduktase-Genexpression.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Cyaninfarbstoffmolekül eine Verbindung der Formel I ist.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem mindestens eine Gruppe von R¹ bis R⁷ des Cyaninfarbstoffsmoleküls der Formel I eine Zellmembranpermeabilisierungsgruppe aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei dem das Cyaninfarbstoffmolekül aus Verbindungen der Formeln IIIa oder IIIb oder Salzen davon ausgewählt ist.
Formel IIIa
Formel IIIb
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend: a) In Kontakt Bringen eines Wirtszellenextraktes mit einem Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst, wobei die Wirtszelle mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert wurde, das Expressionskontrollsequenzen umfasst, die funktionsfähig an eine Sequenz gekoppelt sind, die eine Nitroreduktase kodiert; und b) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenz, der aus der Reduktion des Cyaninfarbstoffmoleküls durch die Nitroreduktase folgt, als ein Maß für die Nitroreduktase-Genexpression.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die angestiegene Fluoreszenz des Cyaninfarbstoffmoleküls durch Analyse der Fluoreszenzemission im Bereich von 500 bis 900 nm gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die angestiegene Fluoreszenz des Cyaninfarbstoffmoleküls durch Analyse der Fluoreszenzemission im Bereich von 665 nm bis 725 nm gemessen wird.
Kit für ein Reportersystem, umfassend ein Mittel zum Exprimieren eines Nitroreduktaseenzyms und ein Cyaninfarbstoffmolekül, das mindestens eine NO₂-Gruppe umfasst.