DE60114217T2

DE60114217T2 - Trockenpulverzusammensetzung zur proteinmarkierung

Info

Publication number: DE60114217T2
Application number: DE60114217T
Authority: DE
Inventors: Mingde Zhu; Lee Olech
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-08-04
Also published as: DE60114217D1; AU7814101A; AU2001278141B2; WO2002016950A1; CA2420149C; EP1311859A1; US7435603B2; JP2004507741A; US20050287674A1; US6995023B2; CA2420149A1; US20030098235A1; US20060052279A1; EP1311859B1; JP3607695B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Analyse von biologischen Proben zum Bestimmen der Identität und der Mengen von verschiedenen Proteinen wird durch eine breite Vielzahl von Trennungstechniken durchgeführt, von denen viele die Verwendung von Farbstoffen einschließen, um dem Kliniker zu ermöglichen, die Proteine zu finden, zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Die Farbstoffe sind entweder durch visuelle Beobachtung oder durch Maschinenverfahren detektierbar und lesbar. Unter den vielen Arten von Farbstoffen, die für diese Zwecke verwendet werden, sind solche, die Farben im sichtbaren Bereich oder im ultravioletten Bereich ohne Behandlung oder Aktivierung zum Auge emittieren, und Fluoreszenzfarbstoffe eingeschlossen, welche bei Anregung emittieren.
Die Farbstoffe werden häufig auf die Proteine angewendet, nachdem die Trennung stattgefunden hat und während die Proteine in einzelne Punkte oder Banden im Gel isoliert werden. Das Aufbringen der Farbstoffe auf diese Art und Weise und das Entfernen von überschüssigem Farbstoff ist ein arbeitsintensives und zeitaufwendiges Verfahren, das Schwierigkeiten beim Handhaben, Bedienungsfehler und verschiedene Uneinheitlichkeiten unterworfen ist. Außerdem sind viele der Farbstoffe in Wasser unlöslich und müssen zuerst in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden, bevor sie auf die Proteinpunkte oder -banden im Gel aufgebracht werden. Als Alternative sind Vorschläge gemacht worden, um die Farbstoffe auf die Proteine in der Probe aufzubringen, bevor die Trennung durchgeführt wird. Bedenken, die bei diesen Vorschlägen auftreten, schließen die Wirkung der Farbstoffe auf die scheinbare Mobilität der Proteine, besonders wenn der Anteil des Farbstoffs zum Protein uneinheitlich ist, und die Instabilität der Farbstoffe in wässrigen Medien ein.
Einer der Bereiche, in welchen diese Farbstoffe verwendet werden, ist die Elektrophorese von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen. Denaturierende Elektrophorese und besonders SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Eletrophorese), ist ein hochwirksames und ein effizientes Mittel des Analysierens von Proteinen in einer Probe, weil es Proteine unabhängig von den möglicherweise behinderenden Einflüssen der tertiären oder quartären Form oder der Komplexität ihrer Untereinheiten identifiziert. Die Bedenken, die durch die Verwendung von Farbstoffen auftreten, treffen mit bestimmter Kraft auf die denaturierende Elektrophorese hinsichtlich ihrer weitverbreiteten Verwendung und Wirksamkeit zu.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist nun entdeckt worden, dass Farbstoffe auf biologische Proben auf eine ungewöhnlich effiziente Art und Weise aus einem Trockenpulvergemisch, welches einen typischen Proteinfarbstoff in Pulverform und ein pulverisiertes nichtnukleophiles Puffermittel, und in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, ebenso ein pulverisiertes Denaturierungsmittel enthält, aufgebracht werden können. Die Koppelung des Farbstoffs an die Proteine in der wässrigen biologischen Probe wird durch Kombinieren des Pulvergemisches mit der Probe und Erwärmen des Gemisches auf eine erhöhte aber nicht Siedetemperatur für einen Zeitraum, der ausreicht, die festen Materialien zu lösen, erreicht. Das Ergebnis ist ein im Wesentlichen gleichmäßiges relatives Färben der Proteine in der Probe, d.h. eine ungefähr gleichmäßige Menge von Farbstoff unter den verschiedenen Proteinen in der Probe, und im Wesentlichen keine Änderung in der scheinbaren Mobilität der Proteine, d.h. eine genügend kleine Menge von Farbstoff an jedem Protein beeinflusst seine Trennungseigenschaften im Verhältnis zu den anderen Proteinen in der Probe nur minimal. Die so hergestellte Lösung ist zum Laden auf ein Trennungsmedium bereit, wo sie durch herkömmliche Proteintrennungsverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, getrennt werden kann. Diese Verfahren schließen die verschiedenen Formen von Elektrophorese sowie andere Protokolle ein. Die einzelnen Proteinbanden oder -punkte, die aus der Trennung resultieren, werden entweder durch maschinelles Ablesen oder durch visuelle Beobachtung sichtbar.
Beschreibungen der spezifischen Ausführungsformen
Eingeschlossen unter den verschiedenen Farbstoffen, die bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet werden können, sind elektrophil-aktivierte Formen von Fluoreszenzfarbstoffen, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Succinimidylester, Vinylsulfone usw. von Xanthenen, Cyaninen, Cumarinen, Benzimiden, Phenanthridinen, Ethidiumfarbstoffen, Acridinfarbstoffen, Carbazolfarbstoffenn, Phenoxazinfarbstoffen, Porphyrinfarbstoffen und Chinolinfarbstoffen. Fluoresceine und Rhodamine sind bestimmte Arten von Xanthenfarbstoffen. Spezifische Beispiele sind 6-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin, 6-Carboxy-X-rhodamin, 5-Carboxyrhodamin-6G, 5-Carboxyrhodamin-6G, Tetramethylrhodamin, Rhodamingrün und Rhodaminrot. Umbelliferon ist ein Beispiel eines Cumarins. Hoechst 33258 ist ein Beispiel eines Benzimidfarbstoffs. Texasrot ist ein Beispiel eines Phenanthridinfarbstoffs. Beispiele von Cyaninsuccinimidylesterfarbstoffen sind Sulfoindocyaninsuccinimidylester, (Carboxyalkyl)Cyanine-Succinimidylester und BODIPY-Succinimidylester (Molecular Probes, Inc.).
Das Puffermittel dient dazu, die Geschwindigkeit der Hydrolyse des Farbstoffs zu beschränken und dadurch die Geschwindigkeit, bei welcher der Farbstoff für die Koppelung an das Protein erhältlich wird, wenn das pulverisierte Gemisch mit der biologischen Probe kombiniert wird. Geeignete Puffermittel sind solche, die nichtnukleophil sind und die nicht mit dem Protein für die Koppelung an den Farbstoff konkurrieren. Bevorzugte Mittel sind solche, die einen pH-Bereich von etwa 8,0 bis etwa 9,5 aufweisen, und solche, die keine Thiole oder primäre oder sekundäre Amine enthalten. Beispiele von geeigneten Puffermitteln sind Natriumtetraborat, Natriumcarbonat und N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES).
In der bevorzugten Ausübung der Erfindung schließt das Pulvergemisch ein Denaturierungsmittel (auch in Pulverform) ein. Dieses ermöglicht dem Kliniker, Proteindenaturierung und das Markieren in einem einzelnen Schritt durchzuführen. Herkömmliche Denaturierungsmittel können verwendet werden, von denen Natriumdodecylsulfat (SDS), Harnstoff und Guanidin Beispiele sind. Das am meisten bevorzugte ist SDS. Andere Stoffe können auf einer fakultativen Grundlage auch eingeschlossen sein. Beispiele sind Zucker (wie Saccharose) zur Dichteeinstellung und ein Verfolgungsindikator, um die Position der sich bewegenden Front des gelösten Stoffs während des Trennungsverfahrens anzuzeigt. Der Verfolgungsindikator kann irgendein Indikator sein, der im Hinblick auf die Proteine und andere Komponenten inert ist, die entweder im Pulvergemisch oder in der biologischen Probe eingeschlossen sind. Ein Beispiel solch eines Indikators ist Bromphenolblau. Ein Reduktionsmittel (in fester Form) kann auch eingeschlossen sein. Beispiele geeigneter Reduktionsmittel sind Dithiothreitol, Dithioerythritol und Tris(carboxyethyl)phosphin. Andere Beispiele von allen diesen Zusatzstoffen sind für den Fachmann leicht ersichtlich.

Die relativen Mengen jeder Komponente im Pulvergemisch sind für die Erfindung nicht kritisch und können variieren. In einer typischen Zusammensetzung, die sowohl den aktiven Farbstoff, (d.h. den Fluoreszenz-, ultravioletten oder sichtbaren Farbstoff, der an das Proteinen koppelt) als auch den Indikatortarbstoff (um die Position der sich bewegenden Ionenfront zu zeigen) plus SDS als Denaturierungsmittel, Saccharose als Dichte- einstellendes Mittel und Natriumtetraborat als Puffer enthält, sind die bevorzugten Mengen von jedem für ein Endvolumen von 1,0 ml, wie folgt:

aktiver Farbstoff	2–100 μg
Denaturierungsmittel, wie SDS	0–20mg
Dichte-einstellendes Mittel, wie Saccharose	0–100mg
Puffer, wie Natriumtetraborat	2–20mg
Indikatorfarbstoff	0–200 μg

Die Teilchengröße des Pulvergemisches ist für die Erfindung nicht kritisch und kann auch variieren. Ein bevorzugter Teilchengrößenbereich ist von etwa 5 μm bis etwa 500 μm. Die Herstellung und Größenkontrolle der Teilchen im Gemisch wird durch herkömmliche Verfahren erreicht, die Präzipitation, Mahlen, Sieben und andere Verfahren einschließen, die für den Fachmann leicht ersichtlich sind.
Bei der Verwendung wird das Pulvergemisch mit der biologischen Probe entweder sofort vor oder einen kurzen Zeitraum, bevor die Probe auf das Trennungsmedium zur Analyse aufgebracht wird, kombiniert. Das Pulvergemisch kann zuerst mit Wasser gemischt werden, um eine Vorlösung zu erzeugen, die anschließend mit der biologischen Probe kombiniert wird. In anderen Ausführungsformen der Erfindung, wird das Pulvergemisch direkt mit der Probe kombiniert, und das Pulver und die Probe werden auf eine Temperatur erwärmt, die hoch genug ist, um den Farbstoff nach und nach aufzulösen, aber niedrig genug, um das Kochen der Probe zu vermeiden. Bevorzugte Temperaturen liegen im Bereich von etwa 80°C aufwärts, stärker bevorzugt von etwa 90°C bis etwa 100°C und am stärksten bevorzugt von etwa 95°C. Das Gemisch wird dann für einen ausreichenden Zeitraum bei dieser Temperatur gehalten, damit sich die festen Komponenten lösen. In den meisten Fällen werden annehmbare Ergebnise in einigen Minuten, vorzugsweise etwa fünf Minuten erreicht. Die Lösung wird dann abgekühlt und auf das Trennungssystem geladen.
Das Pulvergemisch dieser Erfindung kann verwendet werden, um biologische Proben für eine breite Vielzahl von Trennungsverfahren herzustellen, die das Denaturieren der Proteine in den Proben und die Verwendung von Farbstoffen zur Unterscheidung und Identifizierung der verschiedenen Proteine einschließt. Unter diesen Verfahren eingeschlossen sind die Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Molekularsiebchromatographie, Adsorptionschromatographie, Ausschlusschromatographie und verschiedene Formen der Elektrophorese, einschließlich isoelektrische Fokkusierung und herkömmliche Elektrophorese entweder in einer Kapillar-, Schlauchgel- oder Plattengel-Konfiguration oder Mikrokanälen auf einem Chip ein. Die Erfindung ist in der zweidimensionalen Elektrophorese besonders nützlich, wobei die erste Dimension eine lineare Trennung in einem Stangen-förmigen oder Streifen-förmigen Gel ist, und die zweite durch Anordnen der Stange oder des Streifens entlang eines Rands eines Plattengels zur Migration der Banden seitlich aus der Stange oder dem Streifen heraus und in die Platte in einer Richtung senkrecht zur Achse der Stange oder des Streifens durchgeführt wird. Trennungsmedien für die verschiedenen Formen der Elektrophorese schließen Polyacrylamid, Cellulose, Agarose, Dextran, Polyvinylalkohol, Stärke, Kieselgel und Polymere von Styrol und Divinylbenzol sowie Kombinationen dieser Materialien ein. Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese ist von besonderem Interesse.
Das Vorhergehende ist hauptsächlich zu Zwecken der Veranschaulichung dargeboten. Weitere Änderungen und Veränderungen der verschiedenen Parameter der Zusammensetzung und des Verfahrens dieser Erfindung sind für den Fachmann leicht ersichtlich.

Claims

Trockenpulverzusammensetzung, umfassend: (a) einen Fluoreszenzfarbstoff, der bei Kontakt in wässriger Lösung an Proteine koppelt, (b) ein nichtnukleophiles Puffermittel, welches den pH-Wert innerhalb eines Bereichs von etwa 8,0 bis etwa 9,5 aufrechterhält, wenn es in einer wässrigen Lösung gelöst ist, (c) Natriumdodecylsulfat und (d) ein Verfolgungsfarbstoff, welcher zu den Proteinen inert ist.
Trockenpulverzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Puffermittel Natriumtetraborat ist.
Verfahren zur Herstellung einer Protein enthaltenden biologischen Probe zur elektrophoretischen Analyse der Proteinzusammensetzung der Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kombinieren der Probe mit einem Trockenpulvergemisch, umfassend (i) einen Farbstoff, der in der Lage ist, an ein Protein zu koppeln, (ii) ein nichtnukleophiles Puffermittel und (iii) Proteindenaturierungsmittel, um eine Suspension zu bilden, und (b) Erwärmen der Suspension, um wenigstens ein Teil des Gemisches zu lösen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Denaturierungsmittel Natriumdodecylsulfat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei Schritt (b) das Erwärmen der Suspension auf eine Temperatur von etwa 90°C bis etwa 100°C umfasst.