DE60109633T2

DE60109633T2 - Immunreaktive peptidische ctl-epitope aus dem menschlichen cytomegalovirus pp150

Info

Publication number: DE60109633T2
Application number: DE60109633T
Authority: DE
Inventors: J. Don DIAMOND
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-10-23
Also published as: EP1328540B1; JP2004512039A; WO2002034769A2; ATE291584T1; JP4099058B2; US20020146820A1; US6544521B2; EP1328540A2; AU2002214624A1; WO2002034769A3; CA2425202C; CA2425202A1; DE60109633D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft das menschliche Cytomegalovirus (HCMV) und insbesondere Peptidfragmente von einem Protein, das T-Zell-Epitope des HCMV im Menschen produziert. Die erfindungsgemäßen Peptidfragment-Epitope sind in der Lage, menschliche zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) zur Erkennung und Lyse von mit HCMV-infizierten menschlichen Zellen anzuleiten.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Das HCMV-Genom ist relativ groß (etwa 235.000 Basenpaare) und kann für mehr als 200 Proteine kodieren. HCMV umfasst einen nuklearen Komplex von mit Kapsidproteinen mit strukturellen oder enzymatischen Funktionen umgebener doppelsträngiger DNA und einer externen Glycopeptid- und Glycolipid-haltigen Membranhülle.
Die HCMV-Infektion ist relativ verbreitet und bei gesunden, immunkompetenten Kindern oder Erwachsenen üblicherweise selbstbegrenzend (L. Rasmusen, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154, 221–254 (1990)). Das Virus kann jedoch beim Fötus oder Kleinkind eine schwere Erkrankung verursachen. Zum Beispiel ist HCMV eine häufige Ursache für geistige Retardation bei Kindern, die die Infektion in utero von Müttern mit einer virulenten Infektion erwerben. Andere Neugeborene können das Cytomegalovirus für einige Zeit in sich tragen, bevor sie Symptome der Erkrankung zeigen. Etwa 10% aller Neugeborenen tragen HCMV.
Patienten mit einer virulenten HCMV-Infektion leiden häufig unter Beeinträchtigung mindestens eines ihrer lebenswichtigen Organe, einschließlich Speicheldrüsen, Gehirn, Niere, Leber und Lunge. Weiterhin ist HCMV mit einem breiten Spektrum klassischer Symptome assoziiert, einschließlich Mononukleose und interstieller Lungenentzündung. HCMV hat auch ein onkogenes Potential und eine mögliche Assoziation mit gewissen Typen maligner Erkrankungen einschließlich des Karposi-Sarkoms.
Eine persistierende und scheinbar asymptomatische HCMV-Infektion bei einem gesunden Erwachsenen kann ebenfalls bei gewissen Personen gesundheitliche Risiken bergen. So können z.B. Personen, die sich einer koronaren Angioplastie unterzogen haben, anschließend eine Restenose als Ergebnis der arteriellen Umgestaltung entwickeln. In einer Studie hatten etwa ein Drittel dieser Patienten mit Restenose nachweisbare HCMV-DNA in ihren arteriellen Läsionen (E. Speir et al., Science 265, 391–394 (1994)); wobei in einer arideren Studie die Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Restenose bei HCMV-seropositiven Patienten fünfmal höher war als bei seronegativen Vergleichspatienten (Y.F. Zhou et al., New England J. Med. 335, 624–630 (1996)). Diese Studien legen nahe, dass die Verminderung der Anzahl HCMV-infizierter Wirtszellen für bestimmte Personen von Nutzen sein kann.
HCMV ist ebenfalls mit Morbidität und Mortalität bei immunsupprimierten Patienten in Zusammenhang gebracht worden. HCMV ist eine wichtige Erwägung bei der Behandlung von am erworbenen Immunschwäche-Syndrom (AIDS) leidenden Patienten. Die HCMV definierende Komplikation ist virale Retinitis, die unbehandelt zur Erblindung führen kann. Weitere Krankheitsmanifestationen der HCMV-Viruserkrankung umfassen Enzephalitis, Enteritis und Pneumonie. Bei der Mehrzahl der AIDS-Patienten mit schwerer HCMV-Retinitis wird bei Autopsien eine schwere Multiorgan-Beteiligung der HCMV-Erkrankung gefunden. Historisch gesehen ist HCMV eine der verheerenderen opportunistischen Infektionen, die HIV-infizierte Personen befallen, deren CD4⁺ T-Zellzählung unter 100/mm³ gesunken ist.
HCMV kann opportunistische Infektionen zum Beispiel bei Organtransplantations-Patienten verursachen. Vor der Verwendung antiviraler Chemotherapie war die HCMV-Infektion für einen wesentlichen Anteil der Komplikationen nach Knochenmarkstransplantation verantwortlich (J. Meyers et al., J. Infect. Dis. 153, 478–488 (1986)): Die Verwendung von Arzneimitteln wie Ganciclovir mit erheblicher anti-HCMV-Aktivität hat die HCMV-assoziierten Komplikationen nach Knochenmarkstransplantationen reduziert (G. Schmidt et al., New England J. Med. 324, 1005–1011 (1991); J.M. Goodrich et al., New England J. Med. 325, 1601–1607 (1991)). Jedoch hat die prophylaktische Verabreichung von Ganciclovir mehrere negative Folgen einschließlich Neutropenie und eine erhöhte Zahl von tödlichen Bakterien- und Pilz-Erkrankungen. Gleichermaßen wichtig ist, dass Ganciclovir ebenfalls die Rekonstitution der zellulären Immunität sowie die spezifischen zellulären Reaktionen auf CMV verzögert. Dies führt zu einer als „CVM-Späterkrankung" bezeichneten Komplikation, die etwa 90 Tage nach Transplantation auftritt. Die CMV-Späterkrankung kann zu Morbidität und Mortalität führen und tritt am häufigsten bei Patienten auf, die kurz nach der Transplantation entweder eine prophylaktische oder eine therapeutische Ganciclovir-Behandlung erhalten haben.
Bei der Reaktion eines Säuger-Wirtes auf akute virale Infektionen wie die HCMV-Infektion wird eine CD8⁺-Reaktion für wichtig gehalten. Die Beobachtungen, dass die HCMV-Infektion weitverbreitet und persistent ist sowie auch reaktiviert werden kann und bei immunsupprimierten Patienten klinisch in Erscheinung tritt, legen nahe, dass Virus-spezifische T-Zellen ein wichtige Rolle bei der Kontrolle der persistierenden Infektion und der Erholung von der HCMV-Erkrankung spielen.
Beim Menschen ist der Schutz vor der Entstehung der HCMV-Erkrankung bei immunsupprimierten Empfängern einer Knochenmarkstransplantation mit dem Wiederauftreten messbarer CD8⁺-HCMV-spezifischer Klasse I-MHC-restringierter T-Zell-Reaktionen korreliert (Quinnan et al., N. Eng. J. Med. 307, 7–13 (1982); Reusser et al., Blood 78, 1373–1380 (1991)). Die Übertragung von vom Donor stammender HCMV-spezifischer CD8⁺-CTL-Klone auf allogene Empfänger einer Knochenmarkstransplantation führt zu nachweisbarer, auf CTL beruhender HCMV-Immunität und zu einer statistisch signifikanten Abnahme der HCMV-Erkrankung nach KMT (Walter et al., N. Eng. J. Med. 333, 1038–1044 (1995)). Obwohl erfolgreich in der Anwendung, hat dieser Ansatz den Nachteil, dass die in vitro Erzeugung HCMV-spezifischer CTLs eines hochentwickelten Laboraufbaus bedarf und überdies arbeitsintensiv und kostspielig ist.
Da das menschliche Cytomegalovirus relativ verbreitet, aber dennoch mit einigen äußerst schwerwiegenden gesundheitlichen Problemen assoziiert ist, wäre ein Impfstoff äußerst erstrebenswert, der das Auftreten und die Schwere der Erkrankung bei einem KMT-Empfänger, Organtransplantationsempfänger, Herzpatiente, AIDS-Patienten und einer Frau im gebärfähigen Alter herabsetzt. Mehrere HCMV-Impfstoffe sind in der Entwicklung, einschließlich lebender, abgeschwächter Cytomegaloviren, abgeschwächte CMV-Proteine tragender Pockenviren und lösliche Analoga von CMV-Membranproteinen. Leider hat die FDA trotz der großen zu ihrer Entwicklung unternommenen Anstrengungen bisher keinen dieser Impfstoffe als sicher und wirksam zugelassen.
Impfstoffentwicklung unter Verwendung von CTL-Epitopen ist eine weitgehend angepasste Strategie zur Immunisierung von Personen gegen infektiöse Erkrankungen und Krebs. Die Spezifität der CTL-Epitope und die Tatsache, dass eine intrazelluläre Protein-Prozessierung nicht erforderlich ist, macht es zu einer attraktiven Alternative zur Verwendung vollständiger Proteine als Immunogene. Zur Entwicklung solcher Impfstoffe müssen die viralen Proteine identifiziert werden, die im Wirt die CMV-Erkennung auslösen.
Eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Tumorantigenen, viralen Antigenen und Eigen-Proteinen werden zu Peptiden prozessiert, die zu MHC-Klasse-I-(Molekülen) zur Präsentierung auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen befördert werden (Reddehase et al., Nature 337, 651–653 (1989)); Rosenberg et al., Nat. Med. 4, 321–327 (1998); Visseren et al., J. Immunol. 154, 3991–3998 (1995)). Seit der Entdeckung, dass 8–12 Aminosäurefragmente zellulärer oder viraler Proteine in die Peptidbindungsfurche von MHC-Klasse-I eingebettet sind, bestand erhebliches Interesse an der Identifizierung der Aminosäuresequenz dieser Fragmente (Joyce und Nathenson, 1994, Rammensee et al. 1993). Einige dieser Peptide sind identifiziert, als Impfstoffe zubereitet und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegen bestimmte virale Erkrankungen und Krebs beurteilt worden (Vitiello et al. 1995; Wang et al., 1990).
Der virale Lebenszyklus gewährt Einblick hinsichtlich des wirksamsten Zeitrahmens, um einen Impfstoff gezielt so einzubringen, dass die Virusproduktion und -verbreitung maximal unterbrochen wird. Nach dem HCMV-Eintritt in die Wirtszelle und dem Abstreifen der Virushülle wird das virale Genom nacheinander über die unmittelbar frühen (0–2 h), frühen (2–24 h) und späten (> 24h) viralen Proteine exprimiert. Jedoch werden bestimmte virale Strukturproteine wie pp65 und pp150 wegen ihres Auftretens in großer Menge im Viruspartikel von Begleitmolekülen (chaperons) in die Wirtszelle eingeschleust.
Das virale Strukturprotein pp150 ist als Zielantigen für HCMV-spezifische MHC-Klasse I restringierte, aus peripherem Blut der meisten asymptomatischen HCMV-seropositiven Personen stammenden CTL identifiziert worden. CTL gegen pp150 oder pp65 (ein weiteres Matrix-Protein, das häufig erkannt wird) sind zur Erkennung und Lyse HCMV-infizierter Zellen in vitro innerhalb 1 h nach Infektion und in Abwesenheit viraler Genexpression in der Lage (Riddel und Greenberg, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 189. 9–34 (1994)). Daher sind CTL wichtige Effektorzellen bei der Eindämmung der HCMV-Reaktivierung und der Ausbreitung der Erkrankung. Die Fähigkeit zur Induktion einer solchen zellulären Immunreaktion sowohl in immunsupprimierten als auch in normalen Personen wäre bei der Herstellung eines wirksamen Impfstoffes äußerst wichtig (Li et al., Blood 83, 1971–1979 (1994)). Auf pp65 basierende, zur Herstellung von Impfstoffen nützliche Peptide sind in US-Patent 6 074 645 beschrieben worden.
Die WO 98/02746 offenbart von CMV pp150 abstammende Peptide zur Herstellung eines Impfstoffs und zum Nachweis von Antikörpern gegen CMV.
Einzelne MHC-Klasse-I-Moleküle binden bevorzugt Peptide eines gegebenen Motivs. Die Aminosäuresequenz spezifischer Positionen des Motivs ist invariant, was einem gegebenen Peptid gestattet, mit hoher Affinität an MHC-Klasse-I-Moleküle zu binden.
Diese invarianten Aminosäuren werden als „Ankerpositionen" bezeichnet (Falk et al., Nature 351, 290–296 (1991)). Spätere Studien legten nahe, dass noch weitere Aminosäurepositionen außer den Ankerpositionen ebenfalls zur Spezifität der Peptidbindung, an MHC-Klasse-I-Moleküle beitragen. Zusätzlich können Reste an nicht mit MHC-Klasse-I-Mokelülen interagierenden Positionen innerhalb des CTL-Epitops mit T-Zellen interagieren, vermutlich durch Bindung an den T-Zell-Rezeptor (TCR). Die Bindung von Aminosäureresten an MHC- oder TCR-Strukturen wird unabhängig geregelt, so dass Substitution von TCR-Bindungs-Aminosäureresten in vielen Fällen nicht mit der Bindung an das MHC-Molekül auf der Oberfläche der Antigen-präsentierende Zelle interferiert.
Edmann-Abbau gefolgt von N-terminaler Sequenzanalyse wurde ebenfalls zur Sequenzierung der Peptide verwendet, die an die MHC-Klasse-I-Peptidbindungsfurche binden. Massenspektroskopie von über HPLC aufgetrennten Peptidmischungen kann die Primärsequenz einzelner Peptide erhellen. In den meisten Fällen liegt die Länge dieser Peptide zwischen 9 und 11 Aminosäuren. An MHC bindende Peptidfragmente werden als „natürlich prozessierte Epitope" bezeichnet.
Einige Forscher haben allein auf der Grundlage ihrer Gleichartigkeit zu einem für dieses Allel spezifischen Motiv vorherzusagen versucht, welche Peptide einer gegebenen Länge von 9 bis 11 Aminosäuren optimal an einzelne HLA-Klasse-I-Allele binden (Falk et al., Natur 351, 290–296 (1991)). Dieses Verfahren sagt jedoch weder korrekte Bindung noch Erkennung durch Zellen als Ergebnis der endogenen Prozessierung viralen Proteins zuverlässig vorher.
Erfahrung mit einem weiteren HCMV-Protein, pp65, hat gezeigt, dass die verfügbaren Motivprogramme zur richtigen Vorhersage von Sequenzen zur Erkennung eines immunogenen viralen Proteins durch dafür spezifische humane T-Zellen nicht genügend ausgefeilt sind. Die Identifizierung natürlich prozessierter Epitope erfordert im Allgemeinen Versuchsansätze mit Brachialgewalt, einschließlich Trunkierungsanalyse, überlappende Peptide und Peptiddeletionen bestehend aus der Entfernung einzelner Aminosäuren entweder vom Amino- oder vom Carboxy-Terminus gefolgt von Erkennungs- und Bindungsassays. Deshalb ist Epitopkartierung fast vollständig empirisch. Anderson et al., Tissue Antigenes 55, 519–531 (2000).
Longmate et al. (Immunogenetics (2001) 52, 165–173) berichten über die Abdeckung NLA-Klasse-I restringierter zytotoxischer T-Lymphozyten-Epitope innerhalb einer Population. CTL-Epitope von CMV pp65 und pp 150 werden im Zusammenhang mit der Abdeckung einer multiethnischen Population für eine Peptidimpfstoffstrategie offenbart.
CTL ist ein wichtiges Hilfsmittel, durch das sich ein Säugerorganismus gegen Infektionen durch Viren und möglicherweise Krebs verteidigt. Eine prozessierte Form eines Antigens, wie zum Beispiel ein minimalzytotoxisches Epitop eines viralen Proteins, wird von T-Zellen in Kombination mit MHC-Klasse-I-Molekülen erkannt. Funktionsstudien viraler und tumorspezifischer T-Zellen haben bestätigt, dass ein aus einem Peptid von 8 bis 12 Aminosäuren bestehendes minimalzytotoxisches Epitod die Lyse einer Antigen-präsentierenden Zelle durch CD8⁺-CTL in Gang setzten kann, solange die Antigen-präsentierende Zelle das Epitop im Zusammenhang mit dem richtigen MHV-Molekül präsentiert.
Der Eintrittsweg eines Proteins in die Zelle bestimmt, ob es als entweder an MHC-Klasse-I- oder Klasse II-Moleküle gebundenes Antigen prozessiert wird. Der endogene oder Klasse-I-Stoffwechselweg des Proteinabbaus wird häufig von Zellen benutzt, wenn infektiöse Viren zugegen sind. Virale Nukleoproteine werden innerhalb der Zelle prozessiert und abgebaute Anteile durch MHC-Klasse-I-Moleküle an die Oberfläche transportiert. Vitale Hüllglycoproteine, vorwiegend in Form prozessierter Epitope, sind häufig die von CD8⁺-CTL erkannten Zielantigene (Townsend et. al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol). 323, 527–533 (1989)).
Durch exogene Stoffwechselwege (Pinozytose etc.) in die Zelle eindringende Antigene werden typischerweise nicht prozessiert und von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert. Verfahren zur Einschleusung von Proteinen direkt in das Zytoplasma sind deshalb in einem Blickpunkt für Impfstoffhersteller geworden. Rekombinante Impfstoffviren können zur Infektion von Zellen verwendet werden, wobei eine große Menge an intrazellulärem Antigen bereitgestellt wird, jedoch haben diese Viren selbst das Potential, bei immunsupprimierten Menschen wie zum Beispiel Empfängern einer Knochenmarkstransplantation oder AIDS-Patienten eine Erkrankung zu verursachen. Abgeschwächte Impfstoffviren, wie modifizierte Vaccinia-Ankara- oder Kanarienpocken-Viren bieten eine Alternative bei immunsupprimierten Individuen im Hinblick auf die Bereitstellung von Antigenen und Proteinen. Unlängst veröffentlichte Berichte haben die Verwendung von Epitopimpfstoffen in minimaler Form befürwortet, entweder durch Bereitstellung von aus Viren hergestellten Proteinen oder unter Verwendung von Minimalepitopen in Form von Peptiden. Ishioka et al., J. Immunol. 162, 3915–3925 (1999); Fu. J. Virol. 72 (2), 1469–1481 (1998); Rodriguez et al., J. Virol. 72 (6), 5174–5181 (1998). Ein weiterer Ansatz zur Impfung ist, ein antigenes Protein mit einem Adjuvans zu mischen und die Mischung durch subkutane Injektion unter die Haut einzubringen.
Ein weiterer potentieller Ansatz zur Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten ist die Verwendung minimalzytotoxischer, für dieses spezielle Virusantigen definierter Epitope im Zusammenhang mit einem bestimmten MHC-Restriktionselement, die T- die Zell-Gedächtnis(memory)-Reaktion auf das Virus zu steigern (boost). In der Literatur ist diskutiert worden, die Fähigkeit eines minimalzytotoxischen Epitops zur Verleihung schützender Immunität durch eine letale Dosis eines infektiösen Virus in Frage zu stellen. Impfstoffhersteller haben ein zunehmendes Interesse an der Verwendung minimalzytotoxischer Epitope als Impfstoff entwickelt, weil es zur Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle durch äußere Bindung an die Zelloberflächen-Moleküle ohne die Notwendigkeit zur Einschleusung ins Zellinnere oder zur Prozessierung in der Lage ist.
Minimalzytotoxische Epitope sind allgemein dann äußerst wirksam gewesen, wenn sie in Form eines Peptids mit (einem) Lipidrest(en) zusammen mit einem CD4-Helfer-Epitop verabreicht wurden (Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95, 341–349 (1995) und Livingston et al., J. Immuno. 159, 1383–1392, 1997)). Jedoch können auch allein verabreichte Peptide hochwirksam sein. Weitere diskutierte Impfstoffmodifikationen beinhalten den Einschluss einer Signalsequenz wie KDEL zur Retention im endoplasmatischen Retikulum und mit dem Ziel, maximale Aktivität zu erreichen. Es gibt ebenfalls Hinweise in der Literatur, dass ein von bestimmten Typen Antigenpräsentierender Zellen (z.B. dendritische Zellen) präsentiertes minimal-zytotoxisches Epitop bewirken kann, dass eine primäre Immunantwort in Abwesenheit einer viralen Infektion oder eines vorherigen Kontaktes mit dem Virus oder der Tumorzelle auftritt.
Die Peptide und funktionellen Sequenzvarianten davon können als Impfstoff, als ein chimäres Petid mit Lipidrest(en) oder als chimäres Peptid mit einem kovalent gebundenen HTL-Epitop am Aminoterminus zubereitet werden. Das HTL-Epitop kann jedes Peptid sein, das eine breitgefächerte Reaktivität auf menschliche MHC-Klasse-II-Moleküle zur Stimulierung einer klassischen Helfer-Reaktion hat. Solche Moleküle beinhalten, sind aber nicht beschränkt darauf, die Aminosäuren 830–843 des Tetanustoxins (P. Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immun. 19, 2237–2242 (1989)), HTL-Epitope des HIV-Hüllproteins (J.A. Berzofsky et al., J. Clin. Invest. 88, 876–884 (1991)) oder eine aus bekannten Ankerpositionen vorhergesagte synthetische Version (PADRE) (J. Alexander et al., Immunity 1, 751–761 (1994)).
Das Anhängen von einem/mehreren Lipidrest(en) am HTL+CTL-Epitop wird am Aminoterminus des HTL durchgeführt, wobei das HTL-Epitop N-terminal vom CTL-Epitop ist. Geeignete Lipidreste sind bekannt und in der Literatur beschrieben. (H. Schild et al., Eur. J. Immuno. 21, 2649–2654 (1991), A. Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95, 341–349 (1995), K. Deres et al., Nature 342, 561–564 (1989)). Alternativ kann/können an das CTL-Epitop an seinem Amino-Terminus ein/mehrere Lipidrest(e) angehängt werden, gefolgt entweder von einem/mehreren CTL- oder HTL-Epitop(en). Impfstoffe ohne Lipidreste sowie Impfstoffe mit einem, zwei oder drei Lipidresten werden bezüglich ihrer erfindungsgemäßen Verwendung eingehend betrachtet. Ein Abstandhalter (Spacer) von 3 Aminosäuren kann zwischen das HTL- und CTL-Epitop eingeschoben oder die Epitope können direkt im Takt mit dem Leserahmen fusioniert werden. Alternativ kann an das mit einem Lipidrest an seinem N-Terminus versehene CTL-Epitop ohne kovalente Bindung zusammen mit dem HTL-Epitop verabreicht werden.
Trotz der bedeutenden Anstrengungen zur Identifizierung des bestimmten HCMV-Epitops oder der -Epitope, die von CTL erkannt werden, sind dieses natürlich prozessierten Epitope zusammen mit wirksamen Verfahren zur Verhütung und Behandlung der HCMV-Infektion nicht kommerziell erhältlich. Deshalb wäre ein Impfstoff auf Pepidbasis gegen diese klinisch bedeutsame Erkrankung von enormem Wert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung Peptide gemäß den SEQ. ID-Nr. 1 und 2. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Impfstoffe gegen des menschliche Cytomegalovirus umfassend ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und 2 ausgewähltes Peptid.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst diese Erfindung einen zellulären Impfstoff gegen das menschliche Cytomegalovirus, der Antigen-präsentierende Zellen umfasst, die ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID-Nr. 1 und 2 ausgewähltes Peptide präsentieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung einen rekombinanten viralen Vektor, der ein für die Sequenz eines Peptids gemäß SEQ ID-Nr. 1 oder 2 kodierendes Gen exprimiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung die Verwendung eines Peptids gemäß SEQ ID-Nr. 1 oder 2 oder Antigen-präsentierende Zellen, die das Peptid von SEQ ID-Nr. 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Immunreaktion auf die menschliche Cytomegalovirus-Infektion präsentieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Peptids gemäß SEQ ID-Nr. 1 oder 2 oder Antigen-präsentierende Zellen bereit, die das Peptid von SEQ ID-Nr. 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung eines Säugers gegen das menschliche Cytomegalovirus präsentieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Impfstoffe gegen das menschliche Cytomegalovirus bereit, die ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID-Nr. 1 und SEQ ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid und ein Adjuvans, vorzugsweise ein DNA-Adjuvans, umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein diagnostisches Reagenz bereit, das ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID-Nr. 1 und SEQ ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid umfasst.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung ist auf Peptide gerichtet, die zur Erschaffung wirksamer Impfstoffe gegen HCMV nützlich sind. Diese Peptidimpfstoffe sind in der Lage, eine zelluläre Immunreaktion gegen HCMV-infizierte Zellen auszulösen, weil sie die exakten Epitope sind, die durch die Zellen des Immunsystems von Personen erkannt werden, die mit HCVM infiziert waren und eine erfolgreiche Reaktion gegen die Erkrankung in Gang gebracht haben. Diese Peptide sind deshalb in der Lage, das wirksame Abtöten HCMV-infizierter Zellen zu stimulieren und haben dies bei infizierten, asymptomatischen Personen auch getan. Die erfindungsgemäßen Peptide sind die Epitope, die routinemäßig und erfolgreich auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen bei einem menschlichen Wirt präsentiert werden, wodurch eine Bindung mit guter Ausbeute an MHC-Klasse-I und das Auslösen einer zellulären Immunreaktion auf HCMV bei Menschen garantiert ist.
Trunkierungsprodukte des in Vacciniavirus exprimierten pp150 Proteins wurden gegen pp150-spezifische T-Zellklone gescreent. Diese CTL-Klone wurden von HCMV-seropositiven Freiwilligen unter Verwendung etablierter Verfahren gewonnen (Walter et al., N. Eng. J. Med. 333 (16), 1038 – 1044 (1995), McLaughlin-Taylor et al., J. Med. Virol. 43, 103 – 110 (1994), Yee et al., J. Immunol. 157 (9), 4074 – 4086 (1996), Diamond et al., Blood 90, 1751 – 1767 (1997), LaRosa et al., Blood 97, 1776 – 1786, (2001)). Rekombinante Vacinia-Viren mit sukzessiven N- und C-terminalen Deletionen von etwa 100 bis 200 Nukleotiden über das gesamte pp150-Gen wurden auf ihre Fähigkeit gestestet, Zellen zum Abtöten durch die pp150-spezifischen T-Zellen zu sensibilisieren. Zunehmend kleinere, trunkierte, die Länge der identifizierten Sequenz abdeckende Peptide wurden getestet, bis ein enger Bereich des Proteins identifiziert wurde, der das die zytotoxische T-Zell-Reaktion dieses Klons vermittelnde Peptid enthielt. Nachdem ein Peptid mit einer Länge von unter 100 Aminosäuren identifiziert worden war, wurde eine Serie von überlappenden, die ganze Länge der identifizierten Sequenz abdeckenden Peptiden zur weiteren Analyse synthetisiert. Unter Verwendung dieser Verfahren erforderte ein sequentielles Abtasten (scanning) einer Sequenz von 100 Aminosäuren unter Verwendung von 15mer Peptiden mit jeweils drei überlappenden Peptiden insgesamt 20 Peptide.
Für den Test wurden autologe und HLA-nicht übereinstimmende (Kontroll-)-Lymphozytenzell-Linien mit den Scanning-Peptiden bei einer Konzentration von 50 μm während 1 bis 2 h sensibilisiert und gewaschen. Die relevanten CTL wurden dann mit gefärbtem, mit Peptid sensibilisiertem EBVLCL (mit Epstein-Bar-Virus transformierte Lymphozytenzell-Linien) inkubiert und ein Standard-Chromfreisetzungsassay durchgeführt. Die Empfindlichkeit der Lyse wurde bestimmt und jedes positive Peptid sowohl am N- als auch an den C-Terminus wurde weiter trunkiert, bis ein minimal-zytotoxisches, dem HLA-Allel dieses T-Zell-Klons entsprechendes Epitop bestimmt worden war. Tabelle I stellt natürlich prozessierte Peptidepitope des pp150 von Personen mit dem angegebenen HLA-Allel bereit.
Tabelle 1: HLA-Restriktion und Sequenz der CTL-Epitope von HCMV pp150
Die Impfstoff-Epitope können ungeachtet der Primärstruktur einmal subkutan in den Unterarm oder andere Körperteile in einer Zubereitung in Standardpuffer (PBS/10% DMSO oder höhere Konzentrationen/0,01% Trifluoressigsäure oder eine andere Säure oder ein Alkohol in derselben oder einer anderen Konzentration) injiziert werden. Impfstoffe können in PBS oder jedem anderen pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial verabreicht werden. Drei bis sechs Wochen später kann eine Booster-Injektion desselben Materials injiziert werden. Mehrere Booster-Injektionen im Abstand von drei bis sechs Wochen können – falls erforderlich – nachfolgend verabreicht werden.
Impstoffe können einem Patienten oder einer Person mit einem gesundheitlichen Risiko oder einem Knochenmarkspender, der entweder positiv oder negativ für das Virus ist, verabreicht werden. Impfstoffpeptide beinhalten:
Adjuvantien können einen Teil der Impfstoffzubereitung bilden. Adjuvantien wie komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, Aluminiumhydroxid oder dergleichen kommen in Betracht, jedoch ist das bevorzugte Adjuvans, insbesondere zur Verwendung beim Menschen, ein DNA-Adjuvans. Einzelsträngige DNA-Adjuvantien umfassend spezielle Sequenzen einschließlich Cytosinphosphatguanosin (CpG) sind dem Fachmann bekannt und kommen für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht. DNA-Adjuvantien, denen diese CpG-Sequenzen fehlen, sind ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung nützlich. Ein beispielhaftes DNA-Adjuvans kann ein 20mer Nukleotid mit 2 CpG-Motiven oder jedes DNA-Oligomer im Allgemeinen mit einer Länge von etwa 20 bis etwa 25 Nukleotiden umfassen. Erhöhte Stabilität der Sequenz kann durch Substitution von Phosphatgruppen im Nukleotidrückgrat durch Thioat-Gruppen um eher ein Phosphorthioat-Rückgrat als ein Phosphordiester-Rückgrat erhalten werden.
Erfindungsgemäße Impfstoffe können auch als DNA-Impfstoff zubereitet werden. Geeignete Impfstoffe beinhalten rekombinante virale Vektoren, zum Beispiel für ein oder mehrere HCMV-Peptide oder erfindungsgemäße Analoga kodierende Pockenviren. Diese Impfstoffe können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren konstruiert werden. Zusammenfassend können diese Peptide als Impfstoff, allein oder kombiniert mit anderen Peptidsequenzen in Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans verabreicht werden. Alternativ kann ein minimales CTL-Epitop aus einem immunogenen Protein, das unter Verwendung eines Virus oder eines DNA-Konstruktes bereitgestellt wird, ebenfalls eine CTL-Reaktion induzieren, für die gezeigt wurde, dass sie zur Virus-Reduzierung oder -Elimination wichtig ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide können ebenfalls bei immunologischen Verfahren zum Nachweis von pp150-CTL bei einem Patienten und in einer Probe von einem Patienten verwendet werden. Assays wie zum Beispiel der unten beschriebene Chrom-Freisetzungsassay oder jeder bekannte Assay sind geeignet. Spezifische pp150 erkennende T-Klone können unter Verwendung eines immunologischen Reagens umfassend die Peptide gemäß z.B. SEQ ID-Nr. 1 oder 2, Tetramer-Reagenzien wie zum Beispiel die bei Altman et al., Science 274, 94–96, 1996 oder US-Patent Nr. 5 734 023 oder Dimer-Reagenzien wie zum Beispiel die in Rosa et al., Blood 97 (6), 1776–1786, 2001 und Greten et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 7568–1786, 1998 beschriebenen, nachgewiesen werden.
MHC-Tetramere sind dem Fachmann im Allgemeinen bekannt und bestehen aus tetrameren Komplexen von β-2-Mikroglobulin, einem biotinylierten, mit an einen Fluoreszenzmarker gebundenen Streptavidin konjugierten MHC-Klasse-1-Molekül und einem antigenen Peptid wie zum Beispiel pp150 oder dergleichen. Die MHC-Klasse-I-Allele und die Peptide gestatten in Kombination eine spezifische Erkennung von T-Zellen, die dieses Peptid-Antigen im Zusammenhang mit dem Klasse-I-Allel erkennen. Viele Komplexe sind häufig zur Bindungsverstärkung miteinander verbunden, da die Affinität des Einzelkomplexes im Allgemeinen gering ist. Unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Tetramers können spezifisch bindende T-Zellen unter Verwendung bekannter Techniken, wie zum Beispiel Fluoreszenz-aktivierte Zelltrennung und dergleichen, getrennt werden. Dimere Komplexe derselben diagnostischen pp150-Peptid-Antigene nutzende Reagenzien können ebenfalls verwendet werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Gewinnung von HCMV-spezifischen T-Zell-Klonen
Von HCMV-seropositiven Freiwilligen (Nachweis durch Standard-Antikörperverfahren) wurden 40 bis 50 ml Proben peripheres Vollblut erhalten. Das Vollblut wurde während 10 min bei 1.400 rpm in einer Tischzentrifuge sedimentiert und die roten Blutzellen entfernt. Die weißen Blutzellen (WBZ) wurden wie folgt unter Verwendung von Ficoll-HyPaque (DuPont) Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt. Der Leukozytenfilm wurde mit PBS auf 12 ml verdünnt und 6 ml oben auf das Ficoll-HyPaque geschichtet. Nach Zentrifugation bei 2000 rpm in einer Tischzentrifuge während 15 bis 30 min wurde die die weißen Blutzellen enthaltende Zwischenphase entfernt, in PBS verdünnt und zum Sedimentieren während 8 bis 12 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Die Zellen wurden erneut in PBS resuspendiert und wie oben ein weiteres Mal gewaschen. Die weißen Blutzellen wurden in einer Konzentration von 4 bis 5 Millionen Zellen/ml in menschliches, von HCMV-seronegativen Spendern mit Blutgruppe AB⁺ stammendes, gepooltes Serum enthaltendem T-Zellmedium (TCM) resuspendiert.
Beispiel 2: Gewinnung von LCL-Antigen-präsentierenden Zellen
Gleichzeitig wurde eine autologe Antigen-präsentierende Zell-Linie durch Epstein-Barr-Immortalisierung aus peripheren Blutleukozyten gemäß einem Verfahren aus Current Protocols in Immunology, Unit 7.22, Wiley-Liss Press (1993) hergestellt. Die zytotoxischen T-Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen stammten zur Sicherstellung der HLA-Übereinstimmung zwischen den Zell-Linien von demselben Individuum.
Beispiel 3: In vitro-Stimulierung von T-Zell-Klonen durch HCMV
Zur Initiierung der in vitro-Stimulierung von T-Zellen wurde eine Einzelzellschicht (monolayer) von von denselben Freiwilligen wie die weißen Blutzellen stammenden autologen Hautfibroblasten durch Ausplattieren der Zellen in 12-Cavitäten-Platten mit 10⁵ Zellen/ml/Cavität in 10% menschliches AB⁺-Serum enthaltendem DMEM während 24 h etabliert. Nach 24 h in Kultur wurden die Fibroblasten während 2 h mit HCMV-Virionen (AD169 oder Towne-Stamm) mit einer Multiplizität der Infektion zwischen 1 und 5 infiziert. Das Medium und das Virus wurden von der Einzelzellschicht abgesaugt und 1 ml frisches Medium zugegeben. Die Einzelzellschicht wurde in dem Medium während weiterer 4 h inkubiert und nach dieser Zeit das Medium abgesaugt. 2 ml, 8 bis 10 Millionen weiße Blutzellen enthaltendes Medium wurden in jede HCMV-infizierte Fibroblasten enthaltende Cavität gegeben. Die weißen Blutzellen und Fibroblasten wurden in 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin, 25 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES und 10% menschliches AB⁺-Serum enthaltendem RPMI-1640 (Irvine Scientific) kultiviert. Die Zellen wurden während 7 Tagen co-inkubiert. Das Serum wurde ersetzt, wenn es verbraucht war oder bei kräftigem Zellwachstum die Kultur erweitert.
Die weißen Blutzellen wurden am Tag 7 durch Ausplattieren auf eine frische Einzelzellschicht HCMV-infizierter autologer wie oben hergestellter Fibroblasten restimuliert. Zusätzlich wurden γ-bestrahlte (2500 rad) autologe periphere Blutleukozyten (5-facher Überschuss gegenüber WBZ) als Nährzellen zugegeben und das Medium mit rekombinantem IL-2 (10 IU/ml, Chiron-Cetus) an den Tagen 2 und 4 dieser zweiten Stimulierung supplementiert. Die Cavitäten, in den sich rasches Zellwachstum zeigte, wurden mit neuem, IL-2 enthaltenden Medium versorgt, wenn das Medium verbraucht war. Nach 12 bis 16 Tagen in Kultur wurden die Zellen geerntet und im Chrom-Freisetzungsassay auf die Erkennung von HCMV-Matrixproteinen getestet.
Beispiel 4: Chrom-Freisetzungsassay
Es wurden autologe oder HLA-nicht-übereinstimmende (Kontrolle), das Zielantigen präsentierende Zellen durch Infektion mit die DNA für HCMV pp150 oder Wildtyp-Virus (Stamm WR) enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren hergestellt. Nach Infektion über Nacht wurden die Antigen-präsentierenden Zellen mit Chrom-51 inkubiert und der Assay nach bekannten Verfahren durchgeführt. Im Chrom-Freisetzungsassay wurden die Vaccinia-infizierten Zielzellen mit Chrom-51 beladen und dann mit T-Zellen (Effektorzellen) gemischt. Vorzugsweise wurden die Zellen mit einer Serie von Effektor:Zielzell-(E:T)-Verhältnissen gemischt. Nach einer 4 h Inkubationsphase wurde das Medium geerntet, in dem die Zellen inkubiert worden waren. Die Freisetzung von Radioaktivität in das Medium (R_e) wurde mit einem Gamma-Szintillationszähler quantifiziert. Das Ausmaß, in dem infizierte Antigenpräsentierende Zellen Spontanlyse zeigen und die Freisetzung von Radioaktivität (R_s) in Abwesenheit von zytotoxischen T-Lymphozyten wurden für jedes Virus bestimmt. Die maximale Menge an in die Zielzellen eingebauter und freisetzbarer Radioaktivität (R_max) in Abwesenheit zytotoxischer T-Lymphozyten wurde für jedes Virus bestimmt. Die maximale Menge in Zielzellen eingebauter und aus diesen freisetzbarer Radioaktivität (R_max) wurde durch Lyse von Zielzellen in einer Detergens-Lösung (1% Triton X100, Sigma) bestimmt. Der Prozentanteil der Zytotoxizität wurde ausgedrückt als 100 × ((Re) – (Rs))/((Rmax) – (Rs))
Assays wurden als nicht akzeptabel erachtet und wiederholt, wenn die spontane Freisetzung geringer als 30% war. Ein positives Ergebnis für pp150 zeigt, dass in der getesteten polyklonalen Population T-Zellen vorhanden sind, die das vom Virus exprimierte pp150-HCMV-Protein erkennen.
Beispiel 5: Gewinnung von CTL-Klonen unter Verwendung von pp150 infizierten Fibroblasten
Ein zusätzliches Verfahren zur Gewinnung von CTL ist die Herstellung autologer, eine rekombinante Form von HCMV-Proteinen einschließlich pp150 exprimierender Antigen-präsentierender Zellen. Eine Einzelzellschicht von Fibroblasten wie in Beispiel 1 beschrieben wird mit pp150 Vac infiziert und dem Virus gestattet, sich für mehrere Stunden in den Zellen zu vermehren. Die Einzelzellschicht wird gewaschen und unter Verwendung eines Stratalinker^TM-Apparates (Stratgene, LaJolla, CA) bestrahlt. Dieses Verfahren inaktiviert weiteres Wachstum des Vaccinia-Virus, gestattet aber die weitere Expression. Weiße Blutzellen werden zu der Einzelzellschicht, wie in Beispiel 3 beschrieben, gegeben. Diese Stimulierung ist auf ein HCMV-Protein gerichtet und richtet die Immunreaktion spezifisch auf pp150 aus.
Beispiel 6: Identifizieren des CTL-Epitops:
Zweifach mit HCMV auf Hautfibroblasten oder mit pp150Vac-infizierte Fibroblasten stimulierte weiße Blutzellen wurden durch limitierte Verdünnung in 96-Cavitäten Platten mit U-förmigen Boden kloniert. Die weißen Blutzellen wurden unter Verwendung von an anti-CD4-Antikörper konjugierter paramagnetischer Kügelchen einer CD4-T-Zell-Depletion unterzogen. Die resultierende Population enthielt, wie entweder mit Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie gezeigt, im Allgemeinen zwischen 90 bis 95% CD8⁺-Zellen, wobei dies ein zuverlässiger T-Zell-Unterarf-Marker ist, und im Allgemeinen 99% CD3⁺, ein Marker für die meisten peripheren Blutzellen. Diese Endpopulation wurde bei einer Konzentration zwischen 0,3 bis 3 Zellen pro Cavität in einer Endvolumen von 150 μl ausplattiert. Jede Cavität enthielt ebenfalls 1,0 bis 3,0 × 10⁵ γ-bestrahlte, allogene, periphere, mononukleäre Blutzellen in mit 50 bis 100 IU/ml rekombinantem IL-2 (Chiron-Cetus) und 0,5 μg/ml PHA (Murex) supplementierten, menschliches AB⁺-Serum enthaltendem T-Zellmedium.
Nach 3 Tagen in Kultur wurde PHA durch Austausch von 75 μl gegen frisches, mit rIL-2 supplementiertem Kulturmedium zweifach verdünnt. Die Cavitäten wurden alle 3 bis 4 Tage mit frischem IIL-2 supplementiert und das Medium wenn nötig ausgetauscht. Die Zellen wurden zwischen den Tagen 12 und 14 mit frischen allogenen peripheren mononukleären Blutzellen wie zuvor beschrieben restimuliert und die Platten bezüglich Wachstum in den einzelnen Cavitäten sorgfältig beobachtet. Durch sichtbares Zellwachstum wurde die Notwendigkeit angezeigt, die wachsenden T-Zellen in größere Cavitäten zu überführen. Die T-Zellen wurden alle 2 Wochen restimuliert und in zunehmend größere Cavitäten überführt.
Im Akkumulationsstadium von mehreren Millionen Zellen wurden einige kryokonserviert und andere für den Chrom-Freisetzungsassay verwendet. Die Zielzellen waren HCMV-infizierte Fibroblasten, nicht infizierte Fibroblasten oder autologe entweder mit Wildtyp-Vaccinia oder mit pp150 oder trunkuiertes pp150 exprimierendem Vaccinia-Virus infizierte Lymphozytenzell-Linien. HLA nicht-übereinstimmende Fibroblasten und Lymphozyten wurden als Kontrollen verwendet. Sowohl HCMV- als auch pp150-spezifische und nur bezüglich autologer Ziele reaktive T-Zellklone wurden als positiv ausgewählt. T-Zellklone mit verschiedenen HLA-Phänotypen wurden in der gleichen Weise unter Verwendung von Ausgangsproben aus peripherem Blut von Freiwilligen mit verschiedenem HLA-Genotypus isoliert. Das minimal zytotoxische Epitop für dieses bestimmte HLA-Allel wurde durch Wiederholung dieses Verfahrens unter Verwendung von kleiner und kleiner werdenden Anteilen von pp150 einschließlich synthetischer von pp150 abgeleiteter Peptide mit 15 bis 20 Aminosäuren und Deletionen davon entdeckt.
Die Reinheit aller Peptide wurde durch HPLC über eine Vydax C₁₈-Säule unter Verwendung von Acetonitril/TFA als mobile Phase bestätigt. Vorzugweise sollten die Peptide eine Reinheit von 70 bis 80% oder höher haben und der, die für Klasse-I- restringierte Peptide erkennenden CTL charakteristische CD8⁺-Status sollte bestätigt werden.
Beispiel 7: Immunisierung von Knochenmarkstransplantations-Patienten
Eine therapeutisch aktive Form eines erfindungsgemäßen antigenen Peptids wird einem HCMV-seropositiven Knochenmarksspender zu einem ausreichenden frühen Zeitpunkt vor der Gewebeentnahme (z. B. 6 bis 8 Wochen) in einer Einzeldosis oder in mehreren, durch eine bestimmte Anzahl von Tagen oder Wochen voneinander getrennten Dosen vor der Knochenmarkstransplantation verabreicht, um die Entwicklung einer anti-HCMV zellulären Immunreaktion zu ermöglichen. Das antigene Peptid kann gemäß den in der Beschreibung dargelegten Parametern oder nach jedem bekannten Verfahren hergestellt und mit oder ohne Adjuvans verabreicht werden. Falls dem Empfänger ein nicht vorbehandeltes Transplantat gegeben wird, enthält ein solches Transplantat 25% oder mehr reife T-Zellen. Die im Knochenmark des immunisierten Spenders vorhandenen T-Zellen verleihen dem Knochenmarksempfänger aktive Immunität. Alternativ kann bei Verwendung eines T-Zell-depletierten Knochenmarkstransplantats ein Aliquot T-Zellen vom Spender dem Patienten nach der Transplantation (z.B. etwa 21 bis 35 Tage) verabreicht werden, um diesem Empfängerpatienten Immunität zu verleihen.
Beispiel 8: Immunisierung gesunder erwachsener Frauen im gebärfähigen Alter
Eine therapeutische Form eines erfindungsgemäßen antigenen Peptids wird HCMV-negativen oder HCMV-positiven Frauen im gebärfähigen Alter entweder vor oder nach der Empfängnis verabreicht. Ein ein Einzel- oder Multi-Epitop umfassender Impfstoff verhindert oder reduziert die primäre HCMV-Infektion des Fötus und der Kinder, die mit der Frau in Kontakt kommen. Der Impfstoff wird verwendet, um neue HCMV-Infektionen zu verhindern oder bestehende, den sich entwickelnden Fötus möglicherweise schädigende Infektionen zu begrenzen.
Beispiel 9: Erkennung von modifizierten Vaccinia-Ankara (MVA) infiziertem EBV-LCL
Rekombinante modifizierte, HCMV pp150 exprimierende Vaccinia-Ankara(MVA)-Viren wurden zur Infektion von EBVLCL von Personen verwendet, die das HLAA*0301-Allel oder das A*68xx-Allel hatten. Für die Epitope von SEQ ID-Nr. 1 und 2 spezifische T-Zellklone waren in der Lage, diese Ziele in einem wie in Beispiel 4 durchgeführten Chrom-Freisetzungsassay zu erkennen. Ganz erhebliche Lyse (>60% spezifische Zytotoxizität) mit 5fach höherer Spezifität als mit Wild-Typ MVA-exprimierenden Zielen wurde beobachtet.
Beispiel 10: Screenen nach CMV-Immunität von mit CMV-Peptiden komplexierten HLA-Tetramer-Reagentien.
Peripheres Blut wird menschlichen Blutpendern und Empfängern einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) nach Erhalt von deren Einverständnis abgenommen. Studienteilnehmer können geeigneterweise verwandte Geschwisterspender und Empfänger sein, die wegen maligner hämatologischer Erkrankungen einschließlich Myelodysplasie mit HSCT behandelt werden. Die Spender und/oder Empfänger sind CMV-seropositiv und alle sind HIV-negativ. Spenderproben werden vor der Verabreichung von Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (GCSF) und 3 bis 5 Tage später zur Zeit der Zellernte für die Transplantation entnommen.
Blutproben von Empfängern werden 40, 90, 120, 150 und 180 Tage nach Transplantation (Stammzellinfusion) entnommen. Die Überwachung bezüglich CMV-Reaktivierung wurde zweimal wöchentlich sowohl als Teil der Routinepatientenbetreuung als auch im Blutkultur-Shell-Vial-Assay (Shell Vial Assay = spezielles Kurzkulturverfahren zum Nachweis von CMV) für Plasmaproben durchgeführt. Wenn CMV-Reaktivierung (definiert als zwei positive PCR-Assays oder als ein positives Blutkulturergebnis) nachgewiesen wurde, wurde der Patient prophylaktisch während 6 Wochen mit Ganciclovir behandelt.
Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) wurden über Standarddichtegradientenzentrifugation aus heparinisiertem Blut isoliert, gewaschen, in FCS mit 10% DMSO resuspendiert (Hyclone, Logan, TU), aliquotiert und in flüssigem N₂ kryokonserviert. Die Untersuchungen wurden mit PBMC durchgeführt, die aufgetaut und direkt ohne in vitro-Kultivierung oder -Stimulierung getestet worden waren. Die Zellen wurden mit wie nachfolgend beschrieben hergestellten tetrameren HLA A*0301 (A3)- oder HLA A*6801 (A68)-Reagenzien markiert. Die tetrameren Reagenzien wurden unter Verwendung bekannter Methoden erneut gefaltet und gereinigt. Bequemerweise können die Reagenzien nach dem Verfahren der NIAID Tetramer Core Facility (www.emory.edu/WHSC/YERKES/VRC/tetramer.html) unter Verwendung einer geringfügigen Modifikation hergestellt werden. Kurz umrissen werden die A3 oder A68 schweren Ketten und β-2-Mikroglobulin (β₂M) in den Vektor pHN1 kloniert, in E. coli XA90 exprimiert und mit den Peptiden SEQ ID-Nr. 1 bzw. 2 neu gefaltet. Die neu gefalteten NLA-A3- oder -A68/β₂M/Peptid-Komplexe werden unter Verwendung des Enzyms BirA (Avidity Inc.) biotinyliert und dann über FPLC unter Verwendung einer Sephacryl S300-Gelfiltrationssäule, gefolgt von einer MonoQ-Ionenaustauschersäule gereinigt. Die gereinigten, biotinylierten HLA-A3- oder -A68/β2M/Peptid-Komplexe werden entweder mit Streptavidin-PE (Pharmingen) oder mit Streptavidin-APC (Molecular Probes) konjugiert. Die Markierung von Zellen wird typischerweise unter Verwendung von 0,5 μg Tetramer zur Färbung von 0,5 –1,0 Millionen Zellen in einem Volumen von 50 bis 100 μl PBS/0,5% BSA während 20 min durchgeführt. Die Zellen werden dann gewaschen und in einem FACScalibur^TM (BDIS)-Durchflusszytometer analysiert. Ein Lymphozyten-Gate wird auf Vorwärts- und Seitwärtsstreuung eingestellt und ein Minimum von 30 000 Ereignissen innerhalb dieses Gates eingefangen. Quadranten werden auf der Grundlage von Negativkontrollen festgelegt und die Anzahl der Tetramer-positiven Zellen wird als prozentualer Anteil der Lymphozytenpopulation ausgedrückt.
Beispiel 11: Nachweis von IFN-γ-Produktion von Lymphozyten nach Peptid-Stimulierung
Aufgetaute Aliquots der PBMC werden mit kaltem Puffer gewaschen (PBS/0,5% BSA) und mit tetrameren, wie in Beispiel 10 oder mit anderen geeigneten Verfahren hergestellten Reagenzien während 20 min markiert. Die Zellen werden dann gewaschen, in 1 ml mit 10% FCS supplementierten RPMI-1640 (Irvine Scientific) resuspendiert und über Nacht bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Brefeldin A (GolgiPlug^TM, Pharmingen) wird nach 1 h bis zu 1 μM zugegeben. Zu einigen Aliquots werden bis zu 10 μg/ml virale Epitop-Peptide (SEQ ID-Nr. 1 oder 2) und zu anderen ein irrelevantes HLA-restringiertes Peptid als Negativkontrolle hinzugegeben. Am folgenden Tag werden die Zellen gewaschen und in einzelne 12 × 75 mm Röhrchen mit 1 × 10⁶ Zellen pro Aliquote subaliquotiert. Die Zellen werden durch Inkubation während 20 min mit FITC-konjugiertem Antikörper gegen CD8 (Pharmingen) bei 4°C in 50 μl Puffer markiert. Die Zellen werden dann gewaschen, fixiert und vor Markierung mit 5 μl APC-konjugiertem Antikörper gegen IFN-γ während 20 min bei 4°C durchlässig gemacht (Cytofix/Cytoperm, Pharmingen, La Jolla, Kalifornien). Die markierten Zellen werden gewaschen und durch Durchflusszytometrie analysiert.

Claims

Peptid gemäß SEQ. ID-Nr. 1 oder SEQ. ID-Nr. 2.
Impfstoff gegen das menschliche Cytomegalovirus, der ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und SEQ. ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 2, der weiterhin ein Adjuvans umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 3, worin das Adjuvans ein DNA-Adjuvans ist.
Impfstoff gegen das menschliche Cytomegalovirus, der ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und SEQ. ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid und ein DNA-Adjuvans umfasst.
Zellulärer Impfstoff gegen das menschliche Cytomegalovirus, der ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und SEQ. ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid präsentierende Antigen-präsentierende Zellen umfasst.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder von das Peptid nach Anspruch 1 präsentierenden Antigen-präsentierenden Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Immunantwort auf die menschliche Cytomegalovirus-Infektion.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder von das Peptid nach Anspruch 1 präsentierenden Antigen-präsentierenden Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung eines Säugers gegen das menschliche Cytomegalovirus.
Rekombinanter viraler Vektor, der ein für ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und SEQ. ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid kodierendes Gen enthält.
Diagnostisches Reagenz, das ein aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID-Nr. 1 und SEQ. ID-Nr. 2 ausgewähltes Peptid umfasst.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 10, das weiterhin einen Komplex aus β-2-Mikroglobulin und ein, mit an einen Fluoreszenz-Marker gekoppeltem Streptavidin konjugiertes, biotinyliertes MHC-Klasse I-Molekül umfasst.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 11, worin der Komplex ein tetramerer Komplex ist.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 11, worin der Komplex ein dimerer Komplex ist.