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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Inaktivierung von Mikroorganismen in Blut und Blutprodukten
unter Verwendung von Lichtbestrahlung und kontinuierlichem Fluss,
welche geeignet sind, auf individuelle Plasmaspenden oder Blutprodukte
kleinen Volumens angewendet zu werden.
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Entfernung
oder Inaktivierung von Mikroorganismen (insbesondere Viren und Bakterien)
aus Blut und Blutprodukten ist in zunehmendem Maße erforderlich, um höchste Standards
bezüglich
Sicherheit und Produktqualität
zu gewährleisten.
Die Labilität
vieler Blutkomponenten, Zellen und Proteine schränkt jedoch die schärferen Behandlungen
stark ein, die normalerweise angewandt werden, um Flüssigkeiten
zu sterilisieren. In Blut- und Blutprodukt verarbeitenden Laboratorien
sind verschiedene Behandlungen angewendet worden, wie etwa Filtration,
Wärme und
Röntgen-
und Gammastrahlen-Bestrahlung, organische Lösungsmittel und Detergenzien.
Wärme und
Bestrahlungsbehandlungen erfordern jedoch üblicherweise, dass Stabilisator
zugesetzt und später
entfernt wird. Lösungsmittel-
und Detergenz-Behandlung erfordern ebenfalls Entfernung dieser Materialien.
Es ist im Allgemeinen wünschenswert,
es zu vermeiden, Substanzen Blut oder Blutprodukten zuzusetzen oder
aus diesen zu entfernen. Darüber
hinaus inaktivieren existierende Verfahren, die gegenwärtig zur
Behandlung von Blutprodukten angewandt werden, lediglich einen Teil
der Virustypen, z.B. sind einige Viren extrem hitzeresistent, und
andere weisen keine Membranen auf und widersetzen sich somit Lösungsmittel-Detergenz-Behandlung.
Solche Viren könnten
durch Filtration entfernt werden, wenn sie groß genug wären, jedoch sind die wärmestabilen
und nichtumhüllten
Viren, wie etwa Parvovirus und Hepatitis, unglücklicherweise zu klein, um
effektiv durch Filtration entfernt zu werden. Ein zusätzliches
Problem besteht darin, dass auch unbekannte Viren existieren, und
ein ideales Inaktivierungsverfahren sollte diese ebenso inaktivieren.
Gegenwärtig
verlangen Regulierungsbehörden,
dass eine Kombination von zwei verschiedenen Inaktivierungstechniken
angewandt wird, welche orthogonal sein sollten oder auf unabhängigen physiko-chemischen
Prinzipien beruhen.
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Im
Prinzip wäre
Licht (insbesondere ultraviolettes Licht) eine exzellente Wahl,
da es nichts zufügt,
orthogonal zu existierende Methoden (wie etwa Wärme, Lösungsmittel-Detergenz, Filtration und γ-Strahlung)
ist und seit einiger Zeit erfolgreich sowohl bei Luft-, Oberflächen- und
Wassersterilisierung verwendet wird. Unglücklicherweise wurde dessen
Verwendung, auf Flüssigkeiten
wie etwa Blut und Blutprodukte angewandt, durch das hohe Maß an Lichtabsorption
durch diese vereitelt. Viele Blutprodukte absorbieren aufgrund der
Gegenwart von Hämoglobin
und Plasmaproteinen in hohen Konzentrationen Licht stark und Ultraviolettlicht
sogar noch stärker.
Das primäre
Resultat davon ist, dass Licht nur eine sehr geringe Distanz in
die Flüssigkeit
eindringt und deren Masse von einer jeglichen keimtötenden Einwirkung
abgeschirmt wird. Im Falle von ultraviolettem Licht, z.B. UV-C oder
254 nm-Wellenlängen-Licht, wie von der üblichen
Niederdruck-Quecksilberentladungslampe
emittiert, wird die Eindringtiefe (definiert als der Punkt, an dem
die Lichtintensität
auf ein Zehntel ihres anfänglichen
Werts verringert ist) in Blutprodukte, wie etwa Albumin- und Immunoglobulinlösungen,
in Abhängigkeit
von der Proteinkonzentration von etwa 1,0 mm bis hinunter zu so
geringen Werten wie 0,05 mm variieren. Daher wurde beim Großteil der
UV-Licht-Anwendungen auf Blutprodukte versucht, dieses Problem dadurch
zu lösen,
dass mit dünnen
Lösungsfilmen
von viel weniger als 1 mm Dicke gearbeitet wurde. Es ist von eingeschränktem Erfolg
berichtet worden, entweder weil das Verfahren ungenügend wirksam
ist und Viren überleben
und Krankheiten übertragen,
und/oder da die labilen Blutfaktoren inaktiviert werden und das
Produkt nicht nützlich
ist. In jüngerer
Zeit wurden Anstrengungen unternommen, chemische Additive zu identifizieren, die
verwendet werden können,
um die Wirkung des Lichts (durch Verstärkung seiner mikrobiellen Abtötungsleistung)
zu synergisieren und/oder es wurden andere Additive identifiziert,
welche den an labilen Blutfaktoren verursachten Schaden reduzieren,
ohne auch die mikrobielle Abtötungswirkung
zu verringern. Ein Problem besteht darin, dass viele dieser Additive
toxisch sind und nach Behandlung entfernt werden müssen. Unglücklicherweise
existieren keine verlässlichen
Verfahren, Plasma so zu behandeln, dass alle bekannten Viren inaktiviert
werden, unbekannte Viren noch viel weniger, während die labilen Faktoren
intakt und funktionell bleiben. Aufgrund der besonders strengen
Sicherheitsanforderungen, die an Blut und Blutprodukte gestellt
werden, und der relativ mühsamen
und komplexen Natur der gegenwärtig
verwendeten Sterilisiationsverfahren, ist, soweit uns bekannt ist,
von niemand anderem ernsthaft die Möglichkeit in Erwägung gezogen
wurde, außerhalb
des Labors eine wirksame Sterisilierung solcher Flüssigkeiten
zu erreichen. Auch war es aufgrund der relativen Größe der Vorrichtungen,
die in Blut- und Blutprodukt-verarbeitenden Laboratorien verwendet
werden, nicht praktikabel, kleine Mengen solcher Flüssigkeiten
zu sterilisieren, wie etwa Einzeleinheitsbeiträge in Volumina von typischerweise
250 bis 500 ml, was im Fall seltener Bluttypen oder besonders spezialisierter
Produkte erforderlich sein kann. Auch war keinerlei System zur schnellen,
verlässlichen
Sterilisierung solch kleiner Mengen an Blut oder Blutprodukten,
wie etwa Plasma, draußen
im Feld mehr oder weniger direkt nach der Blutabnahme von einem
Donor erhältlich.
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Detaillierter
betrachtet erfordern herkömmliche
Verarbeitungsverfahren für
Virus-Inaktivierung in Plasma- und
Blutprodukten üblicherweise
erhebliche Volumen vereinten (gepoolten) Produkts, um für Verarbeitung in
einem industriellen Maßstab
geeignet zu sein. Die Verwendung solcher Geräte von industriellem Maßstab zum
Verarbeiten von einzelnen Plasmaspenden oder kleiner Blutpools von
Blutprodukten (wie etwa spezifischen Immunoglobulinen) ist nicht
geeignet, da die damit verbundenen Verluste beträchtlich sein können. Beispielsweise
hat eine einzige Plasmaspende von einem individuellen Donor typischerweise
ein Volumen von 250 ml, und eine doppelte Plasmaspende von einem
individuellen Donor (z.B. durch Plasmapherese erhalten) wird immer
noch lediglich ein Volumen von etwa 500 ml haben. Diese Volumina
sind von der gleichen Größenordnung
wie die Hohlraumvolumina in Geräten
von Industrieverfahrensmaßstab,
und demgemäss
wären wesentliche
Verluste unvermeidbar. Ähnlich
können
Volumina von Pools spezifischer Antikörper für hochspezialisierte Anwendungen
(wie etwa Anti-Tollwut, Anti-Tetanus, Anti-Zoster und Anti-Rhesus)
von einem so geringen Volumen wie 1 l bis hin zu einigen wenigen
10 l reichen, was sie wieder unpraktisch zum Verarbeiten in Virus-Inaktivierungs-Geräten großen Maßstabs macht.
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Unser
eigenes, früheres
europäisches
Patent Nr. 0 422 007 B offenbart eine relativ kompakte Vorrichtung
zur Sterilisierung kleiner Mengen von Blut oder Blutprodukten im
Inneren eines im Allgemeinen zylindrischen Beutels oder Behältnisses
durch Rollen desselben, während
er bestrahlt wird. Die Möglichkeiten
zur Steuerung der Gleichmäßigkeit
der Bestrahlungsdosis, welche durch die Flüssigkeit hindurch angewandt
wird und zur Minimierung von Schaden durch lokalisiertes Überhitzen
und/oder Überbestrahlung
sind jedoch etwas eingeschränkt.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein oder mehr der obigen
Probleme oder Nachteile zu vermeiden oder zu verringern. Es ist
eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen,
durch welche(s) Mikroorganismus-Inaktivierung ohne Verlust von Produktaktivität erreicht
werden kann, ohne die Notwendigkeit, etwas zuzufügen oder zu entfernen.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf unseren detaillierten Untersuchungen
zur Verwendung von hocheffizientem Mischen, um das doppelte Problem
der Maximierung der Mikroorganismus-Inaktivierung bei gleichzeitiger
Minimierung von Produktschaden zu lösen. Eine bestrahlte, jedoch
intensiv absorbierende Flüssigkeit,
welche in einem Rohr fließt,
kann so betrachtet werden, als dass sie eine dünne "Abtötungszone" von veränderlicher
Dicke an der äußeren Oberfläche und
ein größeres Lumen
aufweist, welches das verbleibende zentrale Volumen einnimmt, welches
nicht bestrahlt wird und es damit jeglichen Mikroorganismen, z.B.
Viren, erlaubt, intakt zu bleiben. Durch effizienten Transport von
Flüssigkeit
aus der zentralen "dunklen" Zone zu der äußeren "Abtötungszone" und wieder zurück genügend Male
und in verlässlicher
und vorhersagbarer Art und Weise sollte es möglich sein, sicherzustellen,
dass kein Virus Empfang einer Bestrahlungsdosis vermeiden kann,
und dass eine solche Dosierung für
alle Partikel innerhalb der Flüssigkeit
gleich ist. Da Viren verglichen mit den Dimensionen eines Rohrs
sehr klein sind (≥20
nm) ist es leicht für
sie, es zu vermeiden, gleichmäßig bestrahlt
zu werden, und daher muss ein jegliches Mischsystem auf mikroskopischer
Ebene außerordentlich effizient
sein. Wir haben herausgefunden, dass statische Mixer solch zuverlässige und
vorhersagbare Leistung liefern können,
jedoch nur, wenn sie unter bestimmten, klar spezifizierten Bedingungen
betrieben werden. Solche statischen Mischer umfassen allgemein eine
Serie alternierender, links- und rechts-händiger, spiralförmiger Elemente,
welche den Flüssigkeitsfluss
abwechselnd nach links und rechts ablenken und die Flüssigkeit kontinuierlich
erneut unterschiedlich in zwei Hälften
teilen. Solche Teilungsvorgänge
können "n"-Male wiederholt werden durch serielle
Anordnung einer Serie von "n" Mischern, so dass
die Gesamtanzahl unterteilter Volumenelemente durch den Ausdruck
2n gegeben ist. Dieser scheinbar einfache
Ansatz kann zu astronomisch großen
Anzahlen von unterteilten Volumenelementen führen, z.B. kann man mit 266
Mischern 1080 unterteilte Volumenelemente
erhalten. Ein solches Mischsystem ist zweckmäßig und zuverlässig, da
es keine sich bewegenden Teile aufweist (außer der Verfahrensflüssigkeit),
und es minimiert für
labile biologische Flüssigkeiten, wie
etwa Blut und Plasma, die Wahrscheinlichkeit, durch Scherung, Erwärmung oder
mechanische Beanspruchung verursachten Schaden zu nehmen. Wir haben
jedoch überraschend
herausgefunden, dass eine Erhöhung
der Anzahl von Mischelementen per se nicht allein genügt, um Viren
zuverlässig
auf eine vorhersagbare Art und Weise zu inaktivieren. Insbesondere
führt eine
Erhöhung
der Zeit, die ein Virus in der bestrahlten Einrichtung verbringt,
oft nicht zu einer proportionalen Erhöhung der Menge an Virusabtötung. Stattdessen
verbleibt eine Restmenge Virus, ganz gleich wie lang die Exponierungszeit
ist. Dies ist ein ernsthaftes Problem (und es ist vielen verschiedenen
Inaktivierungsverfahren gemeinsam), da es nicht nur die Vorhersage
der Virusabtötung
erschwert, sondern ein verbleibender, infektiöser Virus in einem jeglichen
Blutprodukt einen Haftungsfall darstellen kann. Daher würde man
idealerweise danach streben, eine lineare Erhöhung der Virusabtötung mit
der Exponierungszeit oder Lichtenergiedosis zu erzielen. Es könnte angenommen
werden, dass eine Erhöhung
der Intensität
der Lichtquelle eine Lösung
dieses Problems darstellen würde.
Ein solcher Ansatz ist jedoch bis heute nicht erfolgreich gewesen
und Rechnungen, die auf dem Grad der Lichteindringung in stark absorbierenden
Flüssigkeiten
basieren, zeigen, dass beispielsweise bei einer "Abtötungszone" von 0,05 mm Dicke
in einem Rohr von 20 mm Durchmesser eine 200-fache Erhöhung der
Lichtintensität
zur Bestrahlung des Zentrums des Flüssigkeitslumens im Innern des
Rohres erforderlich wäre.
Eine solche Quelle ist nicht ohne weiteres erhältlich, und ein weiteres Problem
besteht bei diesem Ansatz im erhöhten
Risiko, labilen Molekülen
durch die intensive Bestrahlung an der Flüssigkeitsoberfläche und Überhitzung
verursachten Schaden zuzufügen. Überraschend
haben wir gefunden, dass es möglich
ist, Lichtquellen geringer Leistung zu verwenden und dennoch gute
Virusabtötung
zu erreichen, vorausgesetzt, dass die Mischelemente innerhalb eines
klar definierten, effizienten Flussregimes betrieben werden. Wir
haben kürzlich
Pilot- und Verfahrensmaßstabvorrichtungen
entwickelt (unveröffentlichte
Patentanmeldung PCT/GB99/03082), in welchen Rohre mit Durchmessern
im Bereich von 4 bis 25 mm verwendet werden. Diese sind geeignet,
gepoolte oder hergestellte Blutprodukte zu behandeln, typischerweise
im Bereich von 1 l bis 1000 l, sind aufgrund ihres großen Totvolumens
jedoch nicht geeignet, individuelle Blut- oder Plasmaspenden vor
dem Poolen zu behandeln. Solche Spenden haben üblicherweise Volumina im Bereich
von weniger als 100 bis 1000 ml oder ähnlichem und waren bis heute
keinerlei praktischer Form von Virus-Inaktivierung zugänglich,
welche universell gegen alle Viren aktiv ist (es sollte angemerkt
werden, dass das VIS-Licht-Methylenblau-Kombinations-Verfahren,
welches von Baxter unter dem Markennamen "PathInact" vermarktet wird, nur gegen umhüllte Viren
wirksam ist).
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Überraschend
haben wir herausgefunden, dass in Abhängigkeit von der Flüssigkeitsgeschwindigkeit oder
Flüssigkeitsflussrate
durch die optische Mischvorrichtung zwei verschiedene Betriebsmodi
existieren: Einen, welchen wir als "effizientes Mischen" beschreiben, welcher oberhalb einer
bestimmten Flüssigkeitsgeschwindigkeit
oder Flüssigkeitsflussrate
existiert, und einen anderen, welchen wir als "ineffizientes Mischen" beschreiben, welcher
unterhalb dieser Geschwindigkeit oder Flussrate vorliegt. Der Übergang
von einem zum anderen Mischregime findet über einen relativ kleinen Bereich
von Flüssigkeitsgeschwindigkeit
oder -flussrate statt und kann für
eine gegebene Kombination von Mischerdurchmessser, Schlauchlänge und
Ausgangsmaterialflüssigkeit
vorherbestimmt werden. Einmal bestimmt, kann dieses effiziente Mischregime
zuverlässig
verwendet werden, um Virusabtötung
als eine Funktion von Maschinenparametern und Ausgangsmaterialeigenschaften
vorherzusagen, und dies stellt eine wertvolle Eigenschaft bei der
Validierung eines Verfahrens oder einer Maschine für die Produktion
von sicheren Blutprodukten dar. Überraschend
haben wir auch herausgefunden, dass mit zunehmender Flüssigkeitsgeschwindigkeit
oder Flussrate die Effizienz der Virus-Inaktivierung (ausgedrückt als
Log Abtötung
pro Sekunde Exponierung) konstant gehalten wird oder sogar zunimmt,
während
das Ausmaß des
Schadens (ausgedrückt
als verbleibende Gerinnungsfaktor-Aktivität, welche im Plasma verbleibt)
abnimmt. Daher verbessert die Steuerung der Flussrate unerwartet
nicht nur die Vorhersagbarkeit und die Effizienz der Virusabtötung, sondern
sie verringert auch das Ausmaß an
Produktschaden. Dies ist ein ausgesprochen wertvolles und überraschendes
Resultat, da Blutprodukte, welche recht labil sind, nun effizienter
Virus-Inaktivierung
unterzogen werden können,
ohne die Notwendigkeit für
Additive, und noch spezifischer ist es nun möglich, individuelle Blut- und
Plasmaspenden in einer Art zu behandeln, die das Risiko einer Krankheitsübertragung
durch bekannte oder unbekannte Viren wesentlich reduziert. Dadurch
haben wir herausgefunden, dass es möglich ist, eine Vorrichtung
mit Flüssigkeits-Rohren im Größenbereich
von 1 bis 4 ml Innendurchmesser bereitzustellen, welche statische
Mischer in einer W-Bestrahlungs-Zone
enthalten, welche für
die wirksame Behandlung individueller Spenden von Blut oder Plasma
in kleinen Volumina von Blutprodukten im Bereich von 100 bis 1000
ml verwendet werden kann.
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Damit
stellt die vorliegende Erfindung ein tragbares Mikroorganismus-Inaktivierungssystem
bereit, welches für
die Verwendung von einzelnen Flüssigkeitseinheiten
geeignet ist, und welches umfasst: ein Gehäuse, welches eine UV-Bestrahlungsquelle
aufnimmt, Pumpmittel, und auslösbare
Schlauchhaltemittel; und
einen länglichen Schlauch mit:
einem
ersten Abschnitt mit Wandmitteln aus einem W-transparenten Material, und mit einem
Innendurchmesser von bis zu 4 mm, im Allgemeinen zwischen 0,1 und
4 mm, vorzugsweise von 1 bis 4 mm, und ein statisches Flussmischmittel
enthaltend, welches sich mit einer Mehrzahl von Mischelementen dort
entlang erstreckt, um einen dort hindurch verlaufenden Flüssigkeitsfluss,
bei Betrieb des Systems, wiederholt einem Mischvorgang zu unterwerfen,
welcher Teilen und erneutes Mischen des Flüssigkeitsflusses umfasst, im
wesentlichen ohne bei Betrieb des Systems Turbulenz im Flüssigkeitsfluss
zu erzeugen; einem zweiten Abschnitt, welcher mit dem Pumpmittel
verbunden ist, um bei Betrieb des Systems mittels des Pumpmittels
Flüssigkeit
dort durchzupumpen; Flussaufwärts-
und Flussabwärts-Enden,
die mit ersten bzw. zweiten Anschlussmitteln für eine auslösbare, flüssigkeitsdichte Verbindung
des länglichen
Schlauchs an einen einzelnen Flüssigkeitseinheitsbehälter für zu behandelnde
Flüssigkeit
bzw. an einen Behälter
für behandelte,
aufgenommene Flüssigkeit
bei Gebrauch des Systems bereitgestellt sind, und
der über ein
steriles Inneres verfügt,
wobei
die auslösbaren
Schlauchhaltemittel zum auslösbaren
Halten des länglichen
Schlauchs derart ausgebildet und angeordnet sind, dass sie einen
sich dort durch erstreckenden Flussweg definieren, welcher im wesentlichen
frei von wesentlichen Diskontinuitäten ist, um im wesentlichen
bei Verwendung des Systems Turbulenz in der dort entlang fließenden Flüssigkeit
zu vermeiden, und wobei sich im wesentlichen nur der erste Abschnitt
in nächster
Nähe zu
der UV-Strahlungsquelle innerhalb einer Bestrahlungszone von dieser
erstreckt, und wobei der zweite Abschnitt, der an das Pumpmittel
angeschlossen ist, welches mit einem Durchflussregler versehen ist,
der derart ausgebildet und angeordnet ist, den Fluss der Flüssigkeit
durch den Schlauch innerhalb vorbestimmter Flussratengrenzen zu
beschränken,
so dass bei Betrieb des Systems im wesentlichen die gesamte einzelne
Flüssigkeitseinheit
im wesentlichen einem gleichen, Mikroorganismus-inaktivierenden
Maß an
UV-Strahlung ausgesetzt wird, während
Schaden an den gewünschten
Komponenten dieser minimiert wird, und dann in dem Behälter für behandelte
Flüssigkeit
gesammelt wird.
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Unter
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Inaktivieren von Mikroorganismen in einer einzelnen Flüssigkeitseinheit
bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Koppeln eines Behälters
für eine
einzelne Flüssigkeitseinheit,
welcher eine solche einzelne Flüssigkeitseinheit
enthält,
und einen Behälter
mit einem sterilen Inneren zur Aufnahme der behandelten Flüssigkeit,
an die Flussaufwärts-
und Flussabwärts-Enden
des länglichen Schlauchs;
und Pumpen der Flüssigkeit
von dem Behälter
für die
einzelne Flüssigkeitseinheit
durch den länglichen
Schlauch in den Behälter
zur Aufnahme von behandelter Flüssigkeit,
während
der erste Abschnitt des Schlauchs mittels der UV-Bestrahlungsquelle bestrahlt wird.
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Vorzugsweise
umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung den vorausgehenden
Schritt des Anbringens eines zuvor unbenutzten, länglichen
Schlauchs in den auslösbaren
Schlauchhaltemitteln.
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Es
ist auch möglich,
die vorliegende Erfindung für
die Sterilisierung von Blut oder Blutprodukten im wesentlichen unmittelbar
folgend auf ihre Abnahme von einem Donor zu verwenden. Damit kann
eine erfindungsgemäße Bestrahlungsvorrichtung
in Kombination mit einer Blut- oder Blutproduktspendensammelvorrichtung verwendet
werden, ohne die Notwendigkeit, vor Sterilisierung in einen Beutel
zu sammeln, da die Spende direkt in einen Beutel für behandelte
Flüssigkeit
oder einen anderen Behälter
flussabwärts
von dem inaktivierten ersten Schlauchabschnitt gesammelt wird. Alternativ
könnte
die Bestrahlungsvorrichtung in Kombination mit einer Plasmapherese-Vorrichtung
zur Sterilisierung des aus einer Blutspende extrahierten Plasmas
vor Rückführung des
Spendenrückstands
(welcher üblicherweise
hauptsächlich
rote Blutzellen umfasst) an den Körper des Donors verwendet werden.
Es ist natürlich
einsichtig, dass in Fällen,
wo die Spendensammelvorrichtung selbst normalerweise ein Pumpmittel
umfasst, dann eine der Spendensammelvorrichtungs- und Inaktivierungsvorrichtungspumpen
normalerweise weggelassen werden würde. In Fällen, wo die letztere Pumpe
diejenige ist, die weggelassen wird, wäre es natürlich notwendig, dass die Erstere
so eingestellt werden kann, eine Flussrate innerhalb der effizienten
Mischungszone zu bereitzustellen, welche für die vorliegende Erfindung
erforderlich ist. Damit stellt die vorliegende Erfindung unter einem
weiteren Aspekt ein Verfahren zum Erhalten einer sterilisierten
Blut- oder Blutproduktspende von einem Donor bereit, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen einer Blut- oder
Blutproduktsspendensammelvorrichtung mit einem sterilen Behälter zur
Aufnahme von Blut oder Blutprodukt, und einer erfindungsgemäßen Mikroorganismus-Inaktivierungsvorrichtung;
Koppeln
der Flussaufwärts-
und Flussabwärts-Enden
des länglichen
Schlauchs der Mikroorganismus- Inaktivierungsvorrichtung
in Serie mit dem Blut- oder Blutproduktspendensammelgerät flussaufwärts von
dem Behälter
zur Aufnahme des Bluts oder Blutprodukts; und Pumpen der Flüssigkeit
von dem Donor durch den länglichen
Schlauch in den Behälter
zur Aufnahme von Blut oder Blutprodukt, während der erste Abschnitt des Schlauchs
mittels der UV-Bestrahlungsquelle bestrahlt wird.
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Es
sollte auch zur Kenntnis genommen werden, dass die erfindungsgemäßen Verfahren
und Vorrichtungen auch zur Sterilisierung einer größeren Bandbreite
von Flüssigkeiten
nützlich
ist, welche Behandlung in relativ kleinen Volumina außerhalb
einer dafür
vorgesehenen Sterilisationsanlage erfordern können. Solche Flüssigkeiten
können
einerseits Blut oder Blutprodukt, welches von transgenen Tieren
erhalten wurde, andere biologische Flüssigkeiten, welche unter Verwendung
von biotechnologischen Verfahren wie etwa Gentechnik erhalten wurden,
und andererseits Handschneide-Flüssigkeiten
umfassen, welche in Maschinenwerkzeugen wie etwa Drehbänken zum
Bohren, Malen, Schneiden und ähnlichen
Tätigkeiten
verwendet werden, und die vorliegende Erfindung umfasst auch die
Anwendung der hierein offenbarten neuen Verfahren und Vorrichtung auf
diese.
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Damit
ist es mittels der vorliegenden Erfindung möglich, bei kleinen Volumina
von Blut oder Blutprodukten hohe Grade von Mikroorganismus-Inaktivierung
bei minimalem Produktschaden zu erreichen, auf eine einfache und
wirtschaftliche Art und Weise außerhalb von für diese
Zwecke vorgesehenen Verarbeitungslaboratorien. Es ist ein weiterer
Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass Produkte, welche bisher
einer Virus-Inaktivierung nicht zugänglich waren, nun mit minimalen
Volumenverlusten verarbeitet werden können, z.B. kann das Hohlraumvolumen
in dem System oder der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung 1
bis 10 ml klein sein, was im Fall kleiner Flüssigkeitsmengen Volumenverluste
auf eine Größenordnung
von wenigen % oder weniger verringert. Noch ein weiterer Vorteil
der vorgeschlagenen Vorrichtung und Verfahrens besteht darin, dass die
mit dem Verarbeitungsschritt und der Gerätschaft verbundenen Kosten
minimal sind, was es ermöglicht, Rohmaterial,
wie etwa Plasma, in Einzel- oder Doppelspendenvolumina ohne größere zusätzliche
Kosten zu verarbeiten. Die Lichtquelle und Pumpe verwenden nur wenige
Watt Leistung, und das bestrahlte Mischerelement ist genügend klein
und besteht aus massenproduzierten Plastikteilen (welche ohne weiteres
beispielsweise durch einen Wärme-Schrumpf-Schritt
zusammengesetzt werden), was es ermöglicht, dass diese nur einmal
benutzt und nach Gebrauch entsorgt werden. Ferner enthält das wegwerfbare
Element keine scharfen Metall- oder Glaskomponenten, was deren Entsorgung
sicher macht, selbst bei Kontakt mit potentiell infektiösem Material.
Es ist ein weiterer Vorteil dieser Vorrichtung, dass das wegwerfbare
Element nach Gebrauch sterilisiert ist, und damit Infektionsrisiken
weiter reduziert werden.
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Verschiedene
Pumpmittel können
erfindungsgemäß verwendet
werden. Um Kontaminationsrisiken zu minimieren, wird vorzugsweise
eine Pumpe eines Typs verwendet, in welchem der Pumpenmotor und
Antriebsgetriebekomponenten von der Flüssigkeit isoliert sind. Damit
kann beispielsweise eine Membranpumpe verwendet werden, in welcher
der zweite Abschnitt des Schlauchs über Einwege-Einlass-und Auslassventile mit
einer Kammer verbunden ist, die einen Membranwandabschnitt aufweist,
welcher mittels eines Pumpenmotors und Kolbenantriebselements, welches
mit der Außenseite
der Membranwand verbunden ist, hin- und herverlagerbar ist. In dieser
Anordnung brauchen nur das Innere der Kammer und die Ventile steril
zu sein. Am günstigsten
wird jedoch eine peristaltische Pumpe verwendet, in welcher ein
Rotationsantriebsausgabeelement mit einer Serie von über den
Umfang verteilten, quer ausgerichteten Rollen oder Stangen verwendet
wird, um wiederholt eine Länge
des Schlauchs, welche dem zweiten Abschnitt von diesem entspricht,
zu verengen, wobei die Verengung entlang der Länge des zweiten Schlauchabschnitts
voranschreitet, wobei der Pumpenmotor und die Antriebsgetriebekomponenten
gänzlich
von dem Flüssigkeitsfluss
durch den zweiten Abschnitt des Schlauchs isoliert ist, wobei der
zweite Abschnitt integral mit anderen Teilen des länglichen
Schlauchs ausgebildet sein kann. Dies vereinfacht auch das Ersetzen
des Schlauchs nach jedem Gebrauch der Vorrichtung und minimiert
die Anzahl der Komponenten, die nach jedem Gebrauch ausgetauscht
werden müssen.
Nichts desto trotz ist es ersichtlich, dass prinzipiell andere Pumpenarten
verwendet werden könnten,
vorausgesetzt, dass alle mit Flüssigkeit
in Kontakt kommende Oberflächen
steril sind, die Ausgestaltung von Flüssigkeitsfluss-Passagen und
Flüssigkeitsfluss-Impellermitteln derart
ist, dass Turbulenz im Flüssigkeitsfluss
im wesentlichen vermieden wird, und die Kosten der Pumpe (oder relevanter
Komponenten davon) es erlauben, diese nach einem einzigen Gebrauch
wegzuwerfen.
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Wie
hierin zuvor angemerkt, haben wir herausgefunden, dass es durch
geeignete Steuerung der Flüssigkeitsflussrate
durch den ersten Abschnitt des Schlauchs möglich ist, hohe Grade von Mikroorganismus-Inaktivierung
zu erreichen, während
Schaden an den gewünschten
Komponenten der Flüssigkeit
minimiert wird. Damit ist in einem besonders bevorzugten Aspekt
der vorliegenden Erfindung das Pumpmittel derart ausgebildet und
angeordnet, eine Flüssigkeitsflussrate
bei einer Flüssigkeitsflussrate
von nicht weniger als einer Mindestflüssigkeitsflussrate bereitzustellen,
welche einer maximalen Flüssigkeitsverweilzeit
entspricht (innerhalb des Bestrahlungsbereichs), welche für effizientes
Mischen erforderlich ist, wie durch die Aufrechterhaltung eines
im wesentlichen linearen Verhältnisses
zwischen dem Log Abtötung
und der Verweilzeit angezeigt, welches oberhalb der genannten Mindestflussrate
und bei einer Flüssigkeitsflussrate
von höchstens
einer Maximalflüssigkeitsflussrate
erhalten wird, welcher eine Mindestverweilzeit in dem Bestrahlungsbereich
entspricht, die für
eine wirksame Inaktivierung des kontaminierenden Mikroorganismus
durch das Bereitstellen eines gewünschten Log Abtötung des
Mikroorganismus erforderlich ist (vorzugsweise nicht weniger als
für einen
4 Log Abtötung
des kontaminierenden Mikroorganismus erforderlich, im Allgemeinen
nicht weniger als 1 Sekunde, z.B. nicht weniger als 10 Sekunden),
wobei die Mindestverweilzeit in dem Bestrahlungsbereich gemäß dem nachfolgenden
Verhältnis
definiert ist, wonach: Log10 Abtötung = K × Strahlungsfluss × Verweilzeit/OD × Schlauchradius ist,
wobei:
der Strahlungsfluss die Menge an UV-Strahlung anzeigt,
die auf den Durchlass einfällt,
welcher den Flüssigkeitsfluss
in dem Strahlungsbereich enthält,
in mW cm–2;
OD die optische Dichte (Extinktion von 1 cm) der Flüssigkeit
bei der Wellenlänge
in dem Bereich ist, wo wesentliche Virus-Inaktivierung stattfindet (typischerweise im
Bereich von 250 bis 280 μm);
K eine empirisch abgeleitete Konstante darstellt; und der Schlauchradius
der Innenradius des im Bestrahlungsbereich befindlichen Behälters in
cm darstellt, wobei bei Gebrauch der Vorrichtung im wesentlichen
die gesamte Flüssigkeit
einem ähnlichen
Mikroorganismusinaktivierenden Maß an UV-Bestrahlung ausgesetzt
sein kann, während
Schaden an der(n) gewünschten
Komponente(n) der Flüssigkeit
auf ein Minimum beschränkt
wird.
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Es
ist ersichtlich, dass dies eine modifizierte Form des Bunsen-Roscoe-Reziprozitätsgesetzes
ist, abgeleitet für
Mikroben-Abtötung
auf einer Oberfläche,
welche aussagt, dass LRV = Konstante × Lichtfluss × Exponierungszeit.
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Die
zusätzlichen
Terme, welche benötigt
werden, um eine fließende
Flüssigkeit
in einer dicken, absorbierenden Schicht zu behandeln, sind die optische
Dichte der Verfahrensflüssigkeit
und der Rohrradius. Diese "ideale" Beziehung sagt eine
lineare Abhängigkeit
der Virusabtötung
von der Verweilzeit voraus, und dies stimmt nur in der Zone "effizienten Mischens", welche (für einen
besonderen Fall) in 3 angezeigt ist, in welcher
Log Abtötung
sich linear zur Verweilzeit verhält.
Bei Flussraten von weniger als einer definierten Menge wird das
Mischen ineffizient und die obige einfache Beziehung wird nicht
eingehalten. Damit ist es notwendig, im Regime "effizienten Mischens" zu arbeiten, um die Virusabtötung als
Antwort auf Gerätschafts-
und Verfahrensvariablen vorhersagen zu können. Der Wert der zusammengesetzten
Konstante K wird am leichtesten empirisch für einen Modellvirus, wie etwa
Bakteriophage Ø × 174, bestimmt.
Wenn dieser Wert einmal bestimmt ist, kann der Wert für andere
Viren unter Verwendung der veröffentlichten
Absolut/Relativ-Werte für
andere Mikroorganismen relativ zu Bakteriophage Ø × 174 geschätzt werden. Der Wert der effektiven
Lampenleistung (Strahlungsfluss) wird am leichtesten mittels Actinometrie
unter Verwendung des unten beschriebenen Actinometrie-Systems bestimmt.
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Der
längliche
Schlauch kann eine einfache, kontinuierliche Länge von Schlauch sein, welche
die für dessen
ersten Abschnitt erforderliche UV-Durchlässigkeit und die physikalischen
Charakteristika, z.B. Flexibilität
aufweist, welche bei dem zweiten Abschnitt zum effektiven Anschließen an einen
geeigneten Pumpenantriebsmechanismus vonnöten sind, wie etwa beispielsweise
eine peristaltische Pumpe. Üblicher
ist es jedoch, den längliche
Schlauch aus einzelnen Abschnitten verschiedenen Materials mit verschiedenen
Eigenschaften herzustellen, welche zu einem größeren oder kleinen Ausmaß für die jeweiligen
Anforderungen des ersten und zweiten Abschnitts optimiert sind,
und einem oder mehreren Verbindungsabschnitten, welche verwendet
werden, um diese miteinander zu verbinden (wenn auch einer oder
mehr dieser Verbindungsabschnitte und/oder der Kopplungsmittel integral
mit einem ersten und/oder zweiten Schlauchabschnitt ausgebildet
sein können).
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Der
erste Abschnitt des Schlauchs hat einen Innendurchmesser von bis
zu 4 mm und weist vorzugsweise eine Serie von spiralförmigen,
statischen Mischelementen auf, die innerhalb des Lumens angeordnet sind.
Vorteilhaft wird ein statisches Flussmischmittel verwendet, in der
Form eines länglichen
Schraubengewindeglieds, das aus alternierenden Mischelementen mit
entgegengesetzt händigen
Schraubengewinden gebildet ist. Statische Flussmischer dieser Art
sind seit vielen Jahren bekannt und werden für verschiedenartige Zwecke,
wie etwa Nahrungs- und Chemieproduktherstellung verwendet, und sind
inter alia von Chemineer Inc. in North Andover, MA, USA unter dem
Markennamen KENICS KM und Liquid Control Ltd, Wellingborough, England
unter dem Markennamen POSIMIXER kommerziell erhältlich, und stellen sehr intensives
Mischen als Ergebnis einer Kombination einer Anzahl verschiedener
Mischeffekte bereit, welche Flussteilung durch wiederholte Teilung
von zuvor geteilten Strömen
umfasst, wodurch ein geometrisches Fortschreiten von Flussteilung
gemäß der Formel
D = 2n erzeugt wird, wobei D die Anzahl von Flussteilungen und n
die Anzahl von Mischelementen ist; Flussumkehr, wodurch die Richtung
der Rotation um die Längsachse
des Mischers in jedem Mischelement umgekehrt wird (im Uhrzeigersinn – gegen
Uhrzeigersinn – im
Uhrzeigersinn etc.); radiales Mischen als Ergebnis von Flussumkehr
und Flussinversion, was stattfindet, wenn Flüssigkeit nahe dem Zentrum jedes
der einzelnen Flüsse
an einem Mischelement des Geräts
radial nach außen
gelenkt wird, wenn sie auf den Rand eines neuen Mischelements trifft;
und resultierende Inhibierung axialer Unterscheidung (entsprechend
der Herstellung axialer Flussprofile).
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Der
erste Schlauchabschnitt ist in der Nähe der Oberfläche einer
UV-Strahlungsquelle angeordnet, vorzugsweise einer UV-C-Strahlung
emittierenden, wie etwa einer Niederdruck-Quecksilberentladungslampe, welche Lichtenergie
primär
in der 254 nm Linie emittiert. Das Schlauchmaterial wird im Allgemeinen
so ausgewählt,
dass es eine vernünftige
Durchlässigkeit
für 254
nm Strahlung aufweist. Geeignete, kommerziell erhältliche
Materialien lassen typischerweise 50 bis 85 % solcher Strahlung
durch. Die Dicke der Schlauchwand kann auch verändert werden und für ein gegebenes
Material so ausgewählt
werden, dass es innerhalb dieses Durchlässigkeitsbereichs liegt, z.B.
ein Silica- Schlauch
von 1 mm Wanddicke oder ein PTFE-Schlauch von 0,2 mm Wanddicke.
Die Länge
des ersten Schlauchabschnitts wird günstigerweise so gewählt, dass
sie in etwa der Länge
der UV-Strahlungsquelle entspricht. Verschiedene geeignete UV-Lampen-Quellen können in
dem System und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. Im Allgemeinen wird es vorgezogen, eine relativ kompakte,
Niedrigleistungs-UV-Quelle zu verwenden. Im Falle einer Phillips
PS 11W TUV-Lampe ist die Länge
19 cm, während
sie für
eine Phillips 15W TUV-Lampe 45 cm ist. In der Bestrahlungszone angrenzend
an die UV-Strahlungsquellenlampe
kann mehr als eine Länge
des Schlauchs angeordnet werden, so dass der erste Abschnitt mehrere
Längen
von im wesentlichen UV-transparentem Schlauch umfasst, welcher statische
Mischelemente enthält,
wobei die Längen
durch flexible oder steife Verbindungsabschnitte seriell miteinander
verbunden sind, welche nicht notwendigerweise UV-transparent sein
müssen.
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Durch
Verwendung relativ kleiner, Niedrigleistungs-UV-Bestrahlungsquellen ist es möglich, tragbare Energiequellen
zu verwenden, wie etwa Batterien, zweckmäßig wiederaufladbare Batterien
und/oder Solarzellen, manuell angetriebenen Dynamos, zweckmäßig mit
Spiralfehler, Schwungrad etc. Energiespeichergeräte. Solche Mittel wirken sich
weiterhin positiv auf die Tragbarkeit und im-Feld-Gebrauchsfähigkeit
des Systems und der Vorrichtung aus, was diese(s) besonders geeignet
für Notfall,
Katastrophenhilfe und ähnliche
Anwendungen macht.
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Nichts
desto trotz können
die UV-Strahlungsquellen und Pumpmittel auch eines vom Stromnetz
angetriebenen Typs sein bei Anwendungen, wo Elektrizität aus einer Hauptstromleitung
erhältlich
ist und/oder zum Betrieb mit tragbaren Generatoren.
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Das
Regime "effizienten
Mischens" und die
minimale wünschenswerte
Flussrate können
ohne weiteres mittels einfacher experimenteller Verfahren bestimmt
werden, wie im Folgenden weiter beschrieben wird. Eine Menge von
Flüssigkeit
des Behandlung erfordernden Typs, welche mit einem Markervirus (z.B.
Bacteriophage Ø× 174) versetzt
auf einen hohen Titer (typischerweise 1:108)
gebracht ist, wird durch einen gegebenen Durchmesser und eine gegebene
Länge des
ersten Schlauchabschnitts gepumpt, während sie bestrahlt wird. Die
Flussrate wird von einem niedrigen Wert z.B. 2 ml/min, auf einen
hohen Wert z.B. 100 ml/min, unter Verwendung geeigneter Flussraten
zwischen diesen Grenzen variiert. Bei jeder Flussrate werden Proben
von bestrahltem Ausgangsmaterial gesammelt und der Grad der Virus-Inaktivierung gegen
die Verweilzeit (Rt) vom Partikel innerhalb der gemischten, bestrahlten
Zone aufgetragen. Der Rt-Wert kann am leichtesten durch Messen der
Flussrate und Teilen durch das vorbestimmte, gemischte, bestrahlte
Hohlvolumen bestimmt werden. Bei dieser Art der Auftragung wird
eine charakteristische Kurvenform erhalten (siehe 3),
Angaben in Klammern zeigen für
jeden Datenpunkt die Flussrate in ml/min an. Für kürzere Verweilzeiten (d.h. bei
schnelleren Flussraten) nimmt der Grad der Virusabtötung linear
vom Ursprung zu und steigt stark an, in einem gewissen, engen Flussratenbereich
(Verweilzeit) hört
die Virusabtötung
jedoch auf anzusteigen, und die Menge an verbleibendem, überlebendem
Virus bleibt trotz ansteigender Verweilzeit (und damit ansteigenden
Bestrahlungsdosen) konstant. Die anfängliche (steile) Steigung der
Kurve stellt den Bereich "effizienten
Mischens" dar, während der
spätere,
flache Abschnitt der Kurve den Bereich "ineffizienten" Mischens repräsentiert. Der Übergang zwischen
den beiden zeigt die Flussrate an, unterhalb welcher das Gerät nicht
mit diesem Ausgangsmaterial und dieser Schlauch-statischer-Mischer-Kombination betrieben
werden sollte. Diese Beobachtung hat mehrere wichtige und wertvolle
Implikationen. Erstens ist klar, dass es zum Erhöhen der Bestrahlungsdosis im
Allgemeinen besser ist, die Länge
des Rohres zu erhöhen
(oder mehrere Durchgänge
zu verwenden) als die Flussrate zu verringern (und die Verweilzeit
zu erhöhen).
Zweitens muss, wenn einmal ein bestimmtes Ausgangsmaterial und eine
bestimmte Mischelementgröße gewählt wurden,
immer eine Mindestflussrate für
diese Kombination beachtet werden, um hohe Effizienz der Virus-Inaktivierung
zu erreichen. Drittens wird, da der steilere Teil der Kurve im wesentlichen
linear ist, eine verlässlichere
Vorhersage der Virusabtötung
ermöglicht,
wenn Verfahrensparameter wie etwa OD, Flussrate, Lampenleistung,
Anzahl von Lampen, Rohrmaterial und -dicke und Rohrlänge und
-durchmesser verändert
werden, z.B. um Variationen im OD zwischen einzelnen Spenden leicht
Rechnung tragen zu können
und auch, um eine verlässlichere
Ausgestaltung der Vorrichtung zu ermöglichen, um einen vorgegebenes
Zielgrad an Virus-Inaktivierung
zu erreichen. Ein zusätzlicher
Vorteil des Betriebs im Bereich "effizienten
Mischens" besteht
darin, dass er Schaden an labilen Komponenten an der Oberfläche des
Schlauchs minimiert, welcher durch Über-Exponierung bei übermäßiger Bestrahlung
verursacht ist, und dass er lokale Überhitzung durch effizienten
und raschen Transport von Wärme
weg von der Schlauchwand und in die kühlere Hauptmenge der Flüssigkeit
minimiert.
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Wenn
die Mindestflussrate einmal bekannt ist, kann die gewünschte Virusabtötung entweder
durch Erhöhen
der Länge des
optischen Mischrohrs und/oder dadurch erreicht werden, dass die
Flüssigkeit
mehrere Male durch das Gerät
geleitet wird. Erhöhen
der Rohrlänge
wird primär
nur durch den Gegendruck begrenzt, welcher durch die Anzahl der
Mischelemente und die Viskosität
des Ausgangsmaterials verursacht wird. Wenn der Gegendruck die gewünschte,
durch die Pumpe, Schlauch und Verbindungen gesetzte Grenze überschreitet,
kann eine größere Virusabtötung durch
Verwendung der Strategie mehrmaliger Durchläufe erreicht werden, d.h. der
Batch der zu verarbeitenden Flüssigkeit
kann mehr als einmal hindurchlaufen gelassen werden. Im Allgemeinen
kann jedoch, da Plasma recht geringe Viskosität aufweist, eine Schlauchlänge derart
verwendet werden, dass ein einziger Durchgang genügt, um adäquate Virus-Inaktivierung bereitzustellen,
und dies wird angesichts der größeren Leichtigkeit
und Einfachheit des Betriebs und größeren Sicherheit und Verlässlichkeit
stark bevorzugt.
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Das
Ausmaß des
Schadens an labilem Plasmafaktor kann abgeschätzt werden durch Assay individueller
Koagulationsfaktoren unter Verwendung von Assays, welche Fachleuten
auf diesem Gebiet wohl bekannt sind. Solche Faktoren umfassen Fibrinogen,
Faktor V, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X und Faktor XI. Das Ausmaß der Retention
dieser Faktoren bei verschiedenen Bestrahlungsexponierungsgraden
kann verwendet werden, um eine Obergrenze für die Menge oder Bestrahlungsdosis
(Fluenz oder mJ/cm2) zu setzen, welche akzeptabel
ist. (Wo der Lampenfluss in mW/cm2 bekannt
ist, kann die Fluenz, oder an Einheitsfläche verrichtete Arbeit, des
Geräts
berechnet werden durch Multiplikation der Verweilzeit in Sekunden
mit dem Lampenfluss, die Einheiten der Fluenz sind demnach mJ/cm2. In vielen Fällen ist es realistischer,
die an der Verfahrensflüssigkeit
verrichtete Arbeit als Joules pro ml des Produkts zu berechnen.
Um von Fluenz (in mJ/cm2) in Joule/ml umzurechnen,
wird ein Faktor von 2/r verwendet, wobei "r" der
Rohrradius in Cm ist, ein Faktor von 1/1000 verwendet wird, um mJ
in Joule zu konvertieren, und auch ein Korrekturfaktor kA/V erforderlich
ist, um für
die Proportionen von Oberflächenbereich
und Volumen, welche durch die Gegenwart der Mischelemente innerhalb
des Rohrs verdeckt sind, zu konvertieren. Dieser Faktor ist typischerweise
1,275 für
den Fall eines 3 mm statischen Mischers des bevorzugten, zuvor hierin
beschriebenen Typs. Damit beträgt
der Gesamtkonvertierungsfaktor 2/r × 1/1000 × 1,275 = 0,017). Überraschend
haben wir herausgefunden, dass Schaden an labilen Faktoren minimiert
werden kann, indem bei oder über
der Mindestflussrate für "effizientes Mischen" gearbeitet wird,
und dass Additive nicht erforderlich sind, um die labilen Faktoren
vor Bestrahlungsschaden zu schützen. (Nichts
desto trotz kann, wenn es erforderlich ist, aus einem bestimmten
Grund zu ein Additiv verwenden, dies auch getan werden, ohne vom
Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, obgleich dies weniger
bevorzugt ist). Ein wahrscheinlicher Mechanismus für diesen
Selbstschutz ist, dass "hot
spots" an der Schlauchwand
minimiert werden und kein Molekül
einer größeren Bestrahlungsdosis
ausgesetzt wird als ein anderes. Damit verstärkt der Betrieb im Bereich "effizienten Mischens" gleichzeitig die
Virusabtötung
und minimiert Proteinschaden – wahrscheinlich
durch den gleichen Mechanismus von extrem gleichmäßigem Mischen
auf mikroskopischer Ebene.
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Es
ist oft wünschenswert,
die tatsächliche
Lichtenergiedosis zu messen, welche von einer fließenden Flüssigkeit
innerhalb des Lumens des optischen Elements absorbiert wird. Obwohl
dies mit Hilfe der bekannten Lampenleistung und der Verweilzeit
in dem Gerät
abgeschätzt
werden kann, beschränkt
eine Anzahl von Confounding-Faktoren
die Genauigkeit dieses Ansatzes erheblich, einschließlich heterogener
Lichtverteilung, variabler Durchlässigkeit der Wand des optischen
Element-Rohrs und Streuung und Reflektion. Damit wäre ein direkterer
Ansatz wünschenswert,
es ist jedoch nicht möglich,
elektronische Sensoren innerhalb des Lumens des verwendeten kleinen
Rohrdurchmessers anzuordnen, noch geben sie die extrem heterogene
Natur des Absorptionsprozesses wieder, welcher durch Selbst-Absorption
des Ausgangsmaterials verursacht wird.
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Wir
haben herausgefunden, dass geeignet formuliertes Natriumiodid als
ein actinometrisches Reagenz zum Messen der absoluten und relativen
Mengen von an der Arbeitsflüssigkeit
verrichteter Licht-Arbeit nützlich
sein kann. Ein solches Reagenz besteht typischerweise aus 1 Gew/Vol
NaI in 20 mM Tris-Puffer pH 7,50 + 0,01. Die genaue Einstellung
des pHs ist wichtig, da dies die Empfindlichkeit des Reagenzes steuert. Bei
sauren pH-Werten wird das Reagenz empfindlicher, und bei alkalischen
pH-Werten wird es
weniger empfindlich. Das Reagenz kann bei 20 °C in einem dunklen Schrank mehrere
Wochen aufbewahrt werden. Um absolute Einheiten (J/cm3)
der durch pro Volumeneinheit der Verarbeitungsflüssigkeit absorbierten Lichtenergie
verrichteten Arbeit zu erhalten, wurde das Reagenz in einer Silica-Kuvette
mit einem 10×10
mm Querschnitt in einer Entfernung von 50 mm von einer UV-C-Quelle angeordnet,
und in der gleichen Entfernung wurde auch ein integrierender UV-C
elektronischer Leistungssensor positioniert. Das Reagenz wurde mit
einem Magnetrührer
kräftig
gerührt,
während
es für
verschiedene Zeitspannen mit UV-C-Licht bestrahlt wurde. Die aufgrund
von Iod- Bildung
entstehende sichtbare, gelbe Farbe wurde mittels Spektrophotometrie
in einer Kuvette mit 1 cm Weglänge
bei 352 nm quantifiziert und gegen den integrierten Wert der Messanzeige
in mJ/cm3 aufgetragen. Für eine Kuvette mit 1 cm quadratischem
Querschnitt ist der numerische Wert von mJ/cm2 der gleiche
wie der Wert in mJ/cm3, da 1 cm2 Oberflächenbereich
1 ml Lösung
entspricht. Die Ergebnisse dieser absoluten Kalibrierkurve sind
in 4 aufgetragen. Wenn relative statt absoluter Vergleiche
der an der Verfahrensflüssigkeit
verrichteten Arbeit ausreichend sind, z.B. um zu validieren, dass
die Geräte
bei aufeinander folgenden Gelegenheiten gleiche Lichtdosis liefern,
kann dann geeignet nur den Extinktionswert A1cm angegeben werden,
welcher mit dem Actinometrie-Reagenz erreicht wird, wenn dies mit
der gleichen Flussrate durch das Gerät gepumpt wird wie das Verfahrensausgangsmaterial.
Für eine
gegebene Lampen-/Rohrkombination ist es möglich, von den beobachteten
Actinometrie-Extinktionswerten, der interpolierten Arbeitsdichte
(in J/ml) und der Verweilzeit (Rt) rückwärts zu arbeiten, um eine anscheinende
oder effektive Lampenleistung in mW/cm2 abzuleiten,
welche bei der Beobachtung der Lampenleistung oder beim Entwerfen
neuer Geräte
nützlich
sein kann, um einen besonderen, numerischen Wert der Virusabtötung zu
erreichen. Insbesondere ist eine Kenntnis der effektiven Lampenleistung
in absoluten Einheiten sehr wünschenswert,
um diese in eine Gleichung zur Berechnung oder Vorhersage der Virusabtötung einzusetzen.
Ein solcher absoluter Wert der effektiven Lampenleistung kann aufgrund
der oben erwähnten
Confounding-Faktoren (Heterogenität, Transmissionsverluste, Reflektion
und Refraktion) nicht direkt durch elektronische Sensoren gemessen
werden. Ein zusätzlicher
Vorteil des actinometrischen Reagenzes auf Iodid-Basis liegt in
seiner Unempfindlichkeit gegenüber sichtbarem
und nahem UV-Licht (die Absorption des Reagenzes ist bei einer Wellenlänge von über 300
nm im wesentlichen 0), wohingegen das Reagenz bei 254 nm stark absorbiert,
mit einer Extinktion A1cm von etwa 20 AU, und es ist in diesem Hinblick
ein nützliches
Analog zu einer jeglichen stark absorbierenden Verfahrensflüssigkeit,
welches den stark heterogenen Absorptionsprozess in einer dünnen Schicht
an der Oberfläche
des optischen Rohres nachahmt.
-
Weiter
bevorzugte Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
aus der folgenden, detaillierten Beschreibung offensichtlich, welche
anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispieles
gegeben wird, welches unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen
veranschaulicht ist, und aus den folgenden Beispielen für die Verwendung
und Kalibrierung dieser Ausführungsform.
-
In
den Zeichnungen ist
-
1 eine
schematische Seitenansicht eines erfindungsgemäflen Bestrahlungssystems (wobei
der erste Schlauchabschnitt der besseren Übersichtlichkeit halber versetzt
dargestellt ist);
-
2 eine
Teilquerschnittsansicht des Systems von 1; und sind
-
3 bis 6 Graphen
der in den folgenden Beispielen erhaltenen Messungen.
-
1 zeigt
ein erfindungsgemäßes Bestrahlungssystem 1,
welches ein Gehäuse 2 (siehe 2)
mit mehreren Schlauchhalteklemmen 2 (von denen nur einige
dargestellt sind) zum auslösbaren
Sichern eines länglichen
Schlauchs 4 mit einem ersten Abschnitt 5 hat,
welcher zwei Längen
UV-transparentem
Schlauchs 6 umfasst, welcher statische Mischelemente 7 enthält, und
einen zweiten Abschnitt 8 umfasst, welcher im Eingriff
mit einem peristaltischen Pumpengerät 9 gehalten wird.
(Es ist zu beachten, dass die zwei Längen UV-transparenten Schlauchs 6 tatsächlich wie
in 2 dargestellt angeordnet sind, um die darauffallende UV-Strahlungs-Dosierung
zu maximieren, sie sind in 1 nur der
besseren Übersichtlichkeit
halber außerhalb
ihrer Position dargestellt worden). Genauer wurde eine Serie von
acht 3 mm-Durchmesser statischen, spiralförmigen Mischformteilen (MeterMix
Company, Wellingborough, England, Teilnummer: MM0308) mit einer zusammengesetzten
Gesamtlänge
von 190 mm innerhalb einer Länge
eines wärme-schrumpfbaren PTFE-Schlauchs 6 (Adtech
Teilnummer: FHS 2,7) mit einer Wanddicke von 0,2 mm; ID vor Schrumpfen
3,6 mm; ID nach Schrumpfen 3,0 mm, angebracht, um den ersten Schlauchabschnitt 5 bereitzustellen.
Die tatsächliche
Schlauchlänge
nach Schrumpfen betrug 265 mm, was Verbindungen an beiden Enden
außerhalb eines
zentralen, bestrahlten Mischabschnitts ermöglicht. Jedes Mischelementformteil
besteht aus acht einzelnen, spiralförmigen Elementen, was zu einer
Summe von 64 binären
Misch-/Teil-Elementen oder 264 unterteilten
Volumenelementen, d.h. 1,8 × 1019 führt.
Das innere, gemischte, bestrahlte Volumen (Vo) wurde durch Injektion
von Wasser und Wiegen als 0,94 ml bestimmt. Die charakteristische
Dimension des schließlichen,
unterteilten Volumenelements ist damit definiert als 3√Vo/264 oder 30, 3√4/1, 8 × 1019 = 4 × 107 cm oder 4 × 10–09 m
oder 4 nm, was erheblich kleiner ist als die Ziel-Viren mit einem
Durchmesser von 20 nm.
-
Der
erste Schlauchabschnitt 5 wird unter Verwendung der auslösbaren Schlauchhalteklemmen 3 in großer Nähe zu einer
UV-Quelle 10 in Form einer Phillips PLS11W-TUV Niederdruck-Quecksilberentladungslampe
angebracht, welche aus zwei Lampenrohren 11 besteht, welche
in einer "U"-förmigen Ausrichtung
mit einer zentralen Furche zu jeder Seite zusammengefügt sind,
welche geeignete Haltepositionen für den ersten Abschnitt parallel
zu den Lampenrohren bereitstellen. Die Länge der Lampe beträgt 190 mm,
was die bestrahlte Länge
der ersten Schlauchabschnittssektionen 6 vorgibt. (Die
effektive Länge
des bestrahlten ersten Abschnitts ist etwa 2 × 190 mm). Die Flussaufwärts- und
Flussabwärts-Enden 12 des
ersten Schlauchabschnitts 5 werden geeignet mit männlichen
oder weiblichen Anschlussstücken 13 vom
Luer-Typ bereitgestellt, welche bequeme Anschlüsse an existierendes, steriles
Schlauchmaterial von medizinischer Qualität, Transferpacks, Pumpelemente
etc. erlaubt. Andere geeignete Arten von sterilen Verbindungsvorrichtungen
wird Fachleuten in diesem Bereich wohl bekannt sein. Eine Gilson
Minipuls III Pumpe (erhältlich
von Anachem Company, Luton, England), welche eine innerhalb des
Bereichs von 1 bis 100 ml/min (für
einen Schlauch-Innendurchmesser von etwa 3 mm) einstellbare Flussrate
hat, und welche mit einem zweiten Schlauchabschnitt von 3 mm Innendurchmesser
in Eingriff ist, wird geeignet als peristaltische Pumpe 9 verwendet.
Zweckmäßig werden
auch Temperaturmessfühler 14 an
dem Einlass- und Auslassende 12 des ersten Abschnitts 5 bereitgestellt,
und ein Druckfühler 15 am
Auslass 16 der Pumpe 9 bereitgestellt, zum Beobachten
des Systembetriebs während
des Vorgangs des Feststellens seiner Leistungsparameter, obwohl
diese während
normaler Verwendung der Vorrichtung nicht notwendig wären. Der
zweite Abschnitt 8 des Schlauchs 4 war aus einem
flexiblen Material wie etwa Marprene (Markenname) (erhältlich von
Watson-Marlow, Falmouth, England), welches üblicherweise für peristaltische
Pumpenanwendungen verwendet wird. Es wird natürlich auch ersichtlich sein,
dass für
eine Einzelverwendungsanwendung, wie von der vorliegenden Erfindung
beabsichtigt, ein Schlauchmaterial mit wesentlich kürzerer Verschleißdauer – wie etwa
Silikon, Polyurethan oder PVC recht akzeptabel sein würde. Ein
erster Beutel 17, welcher frisch gesammeltes Plasma 18 enthält, wird
unter Verwendung eines Verbindungsstücks 19 vom Luer-Typ
verbunden, welches an dem Flussaufwärts-Ende 20 des Schlauchs 4 bereitgestellt
ist, und ein steriler zweiter Beutel 21 zur Aufnahme des
sterilisierten Plasmas 22 wurde auf ähnliche Art und Weise unter
Verwendung eines Luer-Verbindungsstücks 23 am
Flussabwärts-Ende 24 des
Schlauchs 4 angeschlossen. Nachdem die Inhalte 18 des
ersten Beutels 17 verarbeitet waren, wird der zweite Beutel 21,
welcher das sterilisierte Plasma 22 enthält, von
dem Schlauch 4 getrennt und versiegelt. Bei normalem Gebrauch
wird dann der gesamte Schlauch 4 aus den auslösbaren Klemmen 3 zusammen
mit dem ersten Beutel 17 zur sicheren Entsorgung entfernt,
und ein frischer Schlauch 4 in Position angebracht und
ein neuer Beutel von Behandlung erforderndem Plasma kann dann mit
diesem verbunden werden, zusammen mit einem frischen, sterilen Beutel zur
Aufnahme von sterilisiertem Plasma.
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Beispiel 1 – Messung
von Schaden an Plasmabestandteilen und Actinometrie-Messung
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Beutel
mit Plasma (150 ml) wurden mit dem FlussaufwärtsEnde des länglichen
Schlauchs einer in 1 und 2 veranschaulichten
Vorrichtung verbunden, jedoch mit einer einzelnen, UV-transparenten Schlauchlänge 6 im
ersten Schlauchabschnitt 5. Plasma wurde mit verschiedenen
Flussraten durch die Vorrichtung gepumpt, und es wurden der Temperaturanstieg
des Ausgangsmaterials, Gegendruck und Flussrate beobachtet. Für jede Flussrate
wurden Plasmaproben gesammelt und nachfolgend auf Fibrinogen und
Koagulationsfaktoren V, VII, IX, X und XI analysiert. Nach Spülen mit
Salzlösung
zum Säubern
des Geräts
wurde ein actinometrisches Reagenz auf Iodid-Basis, wie zuvor hierin
beschrieben, bei den gleichen Pumpeinstellungen durch das Gerät gepumpt,
und nach Halten der Proben für
ein bis zwei Stunden wurden die Extinktionswerte A1cm bestimmt.
Die erhaltenen physikalischen Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst,
und die Werte aus den biologischen Assays sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Aus Tabelle 1 ist erkennbar, dass der maximale, beobachtete Temperaturanstieg
bei einer Verweilzeit von 28,1 Sekunden 20°C betrug. Daher würde dies,
unter der Annahme einer Ausgangsmaterial-Eingabetemperatur von 20°C, das Produkt
auf 40°C
erwärmen,
was für
labile Koagulationsfaktoren als zu hoch betrachtet werden könnte, daher
wäre eine
Verweilzeit von 14,3 Sekunden, welche zu einem Temperaturanstieg
von 14,7°C
und einer schließliche
Produkttemperatur von 35°C
führt,
akzeptabel, da sie innerhalb des physiologischen Bereichs liegt.
Der Druckabfall lag im Bereich von 1,3 bis 3,76 psi, was niedrig
ist und gut innerhalb der Grenzen für herkömmliche peristaltische Pumpen und
Schlauchverbindungsstücke
liegt. Die Actinometrie-Extinktionswerte
zeigen einen glatten Anstieg mit der Exponierungszeit und können in
einer Kalibrierkurve (siehe 4) interpoliert
werden, um absolute Werte der Bestrahlungsenergiemenge in Joules/ml
bereitzustellen und können
mittels einer Konstante für
die Vorrichtung, wie oben erwähnt,
in Fluenz oder mJ/cm2-Werte umgewandelt
werden. Diese beiden Datensätze
können wiederum
verwendet werden, um die scheinbare Lampenleistung (über die
einzelnen Werte der Verweilzeit) zu berechnen, welche in diesem
Fall in etwa 16 mW/cm2 beträgt.
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Die
Bioassay-Daten in Tabelle 2 zeigen, dass Plasma-Koagulationsfaktoren unterschiedliche
Empfindlichkeit gegenüber
UV-C induziertem Schaden aufweisen. Die Reihenfolge steigernder
Empfindlichkeit gegenüber
Schaden war Faktor V < Faktor
VIII < Fibrinogen < Faktor IX < XI. Damit würde Faktor
XI als der hinsichtlich Schaden empfindlichste Indikator erscheinen,
und wenn eine praktische Grenze von >/=0,70 internationaler Einheiten pro ml
Produkt erwünscht
wäre, dann
sollten die Bedingungen der Verwendung von Pumpeneinstellung P3
nicht überschritten
werden (d.h. eine Verweilzeit von 5,81 Sekunden oder Fluenz von
165 mJ/cm2). Unter diesen Bedingungen wäre die Ausbeute
(unbeschadet) anderer Faktoren dann: Faktor V 88 %, Faktor VIII
84 %, Fibrinogen 77 % und Faktor IX 74 %.
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Beispiel 2 – Inaktivierung
von Virus in Plasma
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Das
in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde erneut verwendet, mit
der Ausnahme, dass das Plasma-Ausgangsmaterial
mit dem Bacteriophagen-Virus Phi-X 174 versetzt auf einen Titer
von 1:108 eingestellt wurde, und das Plasma
mit Flussraten im Bereich von 2 ml/min bis 20 ml/min durch das Gerät gepumpt
wurde. Die optische Dichte (OD) des Ausgangsmaterials wurde gemessen
(nach 10-facher Verdünnung
zu Messzwecken) und wurde als 23,38 AU bei 254 nm in einer 1 cm-Kuvette
berechnet. Der Titer des Virus in dem bestrahlten Plasma wurde durch
serielle Verdünnung
auf Bakterien-Platten von E. coli bestimmt, und die Abnahme im log
Titer wurde berechnet, um den Wert des LRV (log reduction value)
zu berechnen. Die verschiedenen, aufgezeichneten Messungen sind
in Tabelle 3 zusammengefasst und sind im Allgemeinen den Daten in
Tabelle 1 ziemlich ähnlich.
Die Virusabtötung
(letzte Spalte von Tabelle 3) wurde in 3 gegen
die Verweilzeit (dritte Spalte von Tabelle 3) aufgetragen, wobei
die Angaben in Klammern bei jedem aufgezeichneten Punkt die Flussrate
für diese
Messung angeben. Auftragung von log Abtötung gegen Flussrate ist weniger
informativ als Auftragung gegen Verweilzeit. Die letztere Auftragung
zeigt klar (3), dass bei Flussraten von über 8 ml/min die
Steigung von Virusabtötung
gegen Verweilzeit 0,45 log Abtötungseinheiten
pro Sekunde ist, während
bei Flussraten unter 6 ml/min die Abtötung viel weniger effizient
ist, mit einer Steigung von nur 0,04 log Abtötungseinheiten pro Sekunde,
d.h. einer etwa 10-fachen
Verringerung der Effizienz. Aus den Daten in Tabelle 3 und 3 schließen wir,
dass es notwendig ist, oberhalb einer Mindestflussrate zu arbeiten,
welche experimentell für
einen bestimmten Mischerdurchmesser und eine bestimmte Ausgangsmaterialzusammensetzung
aus einer Auftragung von log Abtötung
gegen Verweilzeit abgeleitet werden kann.
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Beispiel 3 – Inaktivierung
von Virus unter Verwendung vergrößerter Bestrahlungsflussweglänge
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Es
wurde dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gefolgt, außer dass
zwei Längen
UV-transparenten Schlauchs an entgegengesetzten Seiten der Lichtquelle
angeordnet wurden und seriell derart verbunden wurden, dass der
gemischte, bestrahlte Weg eine Gesamtlänge von 380 mm mit 16 geformten
Mischelementen aufwies, welche zusammen 128 binäre Teil/Misch-Vorgänge und
ein Hohlvolumen von 1,88 ml aufwiesen. Dies würde zusammen 2128 oder
3,4 × 1038 unterteilte Volumenelemente bereitstellen,
mit einer charakteristischen Dimension von 1,8 × 10–8 nm
oder einige sieben Größenordnungen
kleiner als ein Virus. Das Ausgangsmaterial war Plasma, welches
mit Bacteriophage Phi-X 174 auf einen Titer von etwa 108 eingestellt
war; nach 10-fachem Verdünnen
wurde die (ursprüngliche)
optische Dichte als 23,5 bei 254 nm in einer 1 cm-Kuvette berechnet.
Die Flussrate wurde von 3,9 ml/min bis 18,8 ml/min variiert, was
zu Verweilzeiten von 6 bis 28 Sekunden führt. Die numerischen Ergebnisse
sind in Tabelle 4 zusammengefasst, und die log Abtötungs- gegen Verweilzeit-Darstellungen
sind in 5 aufgetragen, die in Klammern
angegebenen Zahlenwerte sind die Flussraten für jeden Datenpunkt. Betrachtung
der Auftragung in 5 zeigt, dass die Mindestflussrate
für effizientes
Mischen, wie nach dem steilsten Teil der Kurve beurteilt, in diesem
Fall etwa 13 ml/min war, mit einer entsprechenden Steigung von 0,43
logs Abtötung
pro Sekunde Verweilzeit. Damit hat die Verdopplung der Länge des
Rohrs verglichen mit Beispiel 2 zu der doppelten Flussrate (und
dementsprechend Produktivität) bei
der gleichen Menge Virusabtötung
geführt,
während
die Effizienz (Steigung) bei 0,43 logs/sec beibehalten wurde. Dies
zeigt, dass es möglich
ist, durch Erhöhung
der Länge
des bestrahlten Mischrohrs den Grad der Produktivität anzuheben,
und Virusabtötung
aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu wird eine Verringerung der
Flussrate unter einen kritischen Wert hinsichtlich Virusabtötung oder
Produktivität
keine Vorteile bieten. Ferner zeigen die Daten in Tabelle 4, dass
sowohl Gegendruck als auch Temperaturanstieg innerhalb akzeptabler
Grenzen gehalten werden können.
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Beispiel 4 – Inaktivierung
von Virus unter Verwendung einer erhöhten Flussrate
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Wie
für Beispiel
3, außer
dass die verwendete Flussrate im Bereich von 20 bis 100 ml/min variiert
wurde, und das Plasma (versetzt mit Bacteriophage Phi-X 174) bei
254 nm in einer 1 cm-Kuvette eine ursprüngliche optische Dichte von 24,32
hatte. Die numerischen Daten sind in Tabelle 5 zusammengefasst,
und die Werte für
log Virusabtötung
sind in 6 gegen die Verweilzeit aufgetragen,
die in Klammern angegebenen Zahlenwerte sind die Flussraten für jeden
Datenpunkt. Die Daten in Tabelle 5 zeigen, dass selbst bei diesen
hohen Flussraten der Gegendruck immer noch gut innerhalb der praktischen
Grenze zum Betrieb mit peristaltischen Pumpen und Schlauchmaterial
liegt, und der Temperaturanstieg klein ist. Actinometrie-Daten waren
mit einer effektiven Lampenleistung von 17 mW/cm2 konsistent.
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Die
Virus-log-Abtötungs-Daten
aus Tabelle 5 sind in 6 als eine Funktion der Verweilzeiten
aufgetragen, und zeigen, dass verglichen mit den niedrigeren Flussraten
in Beispiel 3 und 5 die schnelleren Flussraten
jetzt gewährleisten,
dass alle Datenpunkte auf den linearen und steilsten Teil der Kurve
fallen, welcher dem Bereich effizienten Mischens entspricht. Ferner
beträgt
die Effizienz, ausgedrückt
als Steigung dieser Linie, 0,46 logs pro Sekunde, und wird damit
im wesentlichen identisch zu der in Beispielen 2 und 3 erhaltenen gehalten.
Wir betrachten es als ein wertvolles Attribut des Arbeitens im Bereich
effizienten Mischens oberhalb der Mindestflussrate, da dies genaue
Vorhersage von Virusabtötung
und Erhöhung
des Grads der Leistung durch Erhöhung
der Rohrlänge
erlaubt.