DE600630C - Verfahren zur Gewinnung und Bestimmung der Wirksamkeit eines in der Hypophyse vorkommenden Pigmentzellenhormons - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung und Bestimmung der Wirksamkeit eines in der Hypophyse vorkommenden Pigmentzellenhormons Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Wirkungswerts eines in der Hypophyse neu aufgefundenen Pigmentzellenhormons sowie ein darauf gegründetes Verfahren zur Gewinnung dieses spezifischen Hormons aus der Hypophyse. Wie sich gezeigt hat, enthält die Hypophyse außer den bereits bekannten Hormonen, nämlich dem sog. Wachstumshormon nach E v a n s, dem übergeordneten Sexualhormon nach A s c h -h e i m und B. Z o n d e k, dem Oxytocin und Vasopressin noch ein Hormon, welches sich dadurch auszeichnet, daß es erweiternd auf die Pigmentzellen gewisser Tiere zu wirken vermag. Es wurde nämlich gefunden, daß dieses im nachfolgenden kurz als Pigmentzellenhormon bezeichnete, in der Hypophyse enthaltene Hormon bei Fischen aus der Familie der Karpfen, insbesondere bei der Elritze (phoxinus laevis), aber auch beim Bitterling, der jedoch viel schwächer, undeutlicher und nicht so spezifisch reagiert wie die Elritze, eine Erweiterung der roten Farbstoffzellen, der sogenannten Erythrophoren, verursacht, derart, daß % bis i Stunde nach der Injektion eine sehr augenfällige helle, purpurrote Verfärbung an den Ansatzstellen der Bauch-, Rücken- und Afterflossen auftritt, wie sie bei diesem Fisch sonst nur zur Laichzeit als sog. Hochzeitskleid zu beobachten ist.
• Man kann hiernach als eine Phoxinuseinheit (i PE) diejenige geringste Hormonmenge bezeichnen, die imstande ist, 1/2 bis i Stunde nach der Zufuhr an der Ansatzstelle der Bauch-, Rücken- und Afterflossen der Elritze eine mindestens linsengroße, ausgesprochen purpurrote Färbung zu verursachen.
• An Hand dieses neuen Testverfahrens gelingt es, das Pigmentzellenhormon aus der Hypophyse von Menschen und Tieren zu gewinnen. Man kann sich dafür gemäß der Erfindung der für die Hormongewinnung üblichen Methoden bedienen, indem man die Anreicherung der hergestellten Fraktionen an dem neuen Hormon mittels des angegebenen Tests feststellt und die es enthaltenden Fraktionen allein weiterbehandelt.
• Wie sich durch die Prüfung mit Hilfe des angegebenen Testobjekts weiterhin gezeigt hat, kommt das neue Hormon nicht nur im -Zwischen- und Hinterlappen, sondern auch im Vorderlappen der Hypophyse vor. Zwar erfolgt die Produktion dieses Hormons offenbar nur im Zwischenlappen, jedoch verbreitet sich das Hormon mittels Diffusion von dort durch die ganze Hypophyse. Da der Vorderlappen rund 7mal soviel wiegt wie der Hinterlappen, und etwa 8omal soviel wie der Zwischenlappen, so sind im Vorderlappen die besten Ausbreitungsmöglichkeiten gegeben. Wenn daher auch die Menge des in der Gewichtseinheit des Hypophysengewebes enthaltenen Hormons im Zwischen- oder Mittellappen bei weitem am größten ist, ist doch die im ganzen Vorderlappen enthaltene Menge wesentlich größer als diejenige im Mittellappen. So hats.ichbeispielsweise er,-eben, daßvon ein und derselben Hypophyse der Vorderlappen 4ooo PE, der Mittellappen 6oo PE und der Hinterlappen 25oo PE des neuen Hormons enthielt.
• Die Feststellung des reichlichen Vorkommens des Pigmentzellenhormons im Vorderlappen ist deswegen von Bedeutung, weil der Vorderlappen nur wenig Oxytocin und Vasopressin enthält und daher die Gewinnung des neuen Hormons aus dem Vorderlappen am leichtesten gelingt. Die Abtrennung des im Vorderlappen enthaltenen Pigmentzellenhormons von dem übergeordneten Sexualhormon ist dadurch leicht möglich, daß ersteres wesentlich andere chemische Eigenschaften besitzt als letzteres.
• Es ist aber auch gelungen, das neue Hormon von dem Oxytocin und Vasopressin aus dem Hinterlappen zu trennen und so Extrakte zu gewinnen, die reichliche Mengen des neuen Hormons, aber keine oder nur geringe Mengen von Vasopressin und Oxytocin enthalten.
• Die Trennung des, neuen Hormons von den Begleitsubstanzen und den im betreffenden Teil der Hypophyse mit enthaltenen anderen Hormonen gelingt auf Grund der im nachfolgenden angegebenen besonderen chemischen Eigenschaften des neuen Hormons. Es ist kochbeständig und verträgt Behandlung mit Säuren gut. Es ist in einigen organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Aceton und Essigester, unlöslich, in einigen anderen, wie Chloroform und Benzol, schwer löslich, in Äthyl-und Methylalkohol besser löslich, hingegen unlöslich in Propyl- und Butylalkohol.
• Unter Benutzung dieser besonderen chemischen Eigenschaften des neuen Hormons gelingt seine Gewinnung insbesondere in der Weise, daß aus der zerkleinerten Hypophysenmasse durch Auskochen mit Säuren, wie verdünnter Essigsäure, zunächst eine eiweißhaltige Lösung hergestellt wird, die im nachfolgenden als Stammlösung bezeichnet wird (z g Hypophysentrockenpulver - 30 ccm Stammlösung).
• Diese Stammlösung kann dann in irgendeiner bekannten Weise, z. B. durch Behandeln mit Sulfosalicylsäure,Trichloressigsäure,Ammoniumsulfat, durch Adsorption mittels Kieselgur, Kaolin, Kohle o. dgl., Fällung mittels löslicher oder unlöslicher Schwermetallsalze, unlöslicher Hydrate, wie Ferrihydroxyd, Aluminiumhydroxyd o. dgl., sowie durch Dialyse vom Eiweiß befreit werden. Das eiweißfreie Filtrat enthält dann das neue Pigmentzellenhormon.
• Geht man bei dieser Herstellung vom Hypophysenvorderlappen aus, so enthält das Filtrat im wesentlichen nur dieses Hormon neben verhältnismäßig geringen Mengen von Vasopressin und Oxytocin, da das ursprünglich im Vorderlappen noch enthalten gewesene übergeordnete Sexualhormon durch den vorangegangenen Kochprozeß bereits zerstört worden ist.
• Geht man hingegen für die Gewinnung des neuen Hormons vom Zwischen- und Hinterlappen bzw. von der ganzen Hypophyse aus, so enthält die vom Eiweiß befreite Lösung noch reichliche Menge Oxytocin und Vasopressin, deren Entfernung durch besondere Behandlung in der weiterhin angegebenen Weise vorgenommen werden kann.
• Da das neue Pigmentzellenhormon in Alkohol leichter löslich ist als Oxytocin und Vasopressin, so kann man durch Alkoholextraktion eine erhebliche Anreicherung an dem neuen Hormon gegenüber Oxytocin und Vasopressin erzielen. Da ferner das im Vorderlappen enthaltene übergeordnete Sexualhormon in Alkohol unlöslich ist, so läßt sich eine Trennung desselben von dem Pigmentzellenhormon auch durch Ausziehen der aus der Stammlösung zu gewinnenden Trockensubstanz mit absolutem Alkohol erreichen.
• Aus den gleichen Gründen ist es auch möglich, das neue Pigmentzellenhormon unmittelbar durch Extraktion der Drüsen mit Alkohol ohne vorhergehende Herstellung einer Stammlösung zu gewinnen.
• 1?ine weitere Reinigung des Pigmentzellenhormons von Vasopressin und Oxytocin gelingt durch das Entmischungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise durch Versetzen der alkoholischen Lösung mit Essigester und Wasser. Von den sich hierbei bildenden zwei Schichten enthält.die wäßrige die größere Menge des neuen Hormons, während die andere die größere Menge des Oxytocins und Vasopressins, in Alkoholessigester gelöst, enthält. Auch durch Behandeln mit z- bis 2°/oiger Natronlauge ist eine solche Reinigung möglich, da Oxytocin und Vasopressin im Gegensatz zu dem neuen Pigmentzellenhormon dabei vollständig zerstört werden.
• Schließlich läßt sich eine Reinigung und Anreicherung des neuen Hormons auch noch dadurch erzielen, daß man konzentrierte wäßrige Lösungen, welche es enthalten, in siedendes Aceton gießt, worin dieses Hormon unlöslich ist, während viele Begleitsubstanzen, wie Lipoide u. dgl., darin löslich sind. Das neue Hormon scheidet sich bei der Abkühlung des Acetons als Bodensatz aus.
• Wie die Untersuchungen ergeben haben, besitzt das neue Hormon auch therapeutische Bedeutung, insbesondere gegenüber Stoffwechselstörungen der Hypophyse. Ausführungsbeispiele i. Nach Entnahme aus dem Körper wird die Hypophyse in Aceton gelegt und nach 2-.stündigem Liegen in den Vorderlappen einerseits, den Zwischen- und Hinterlappen andererseits geteilt. Die Massen werden dann zerkleinert, mehrere Tage mehrmals mit Aceton gewaschen und hierauf getrocknet. Das so erhaltene Hypophysenpulver wird nun mit 1/,1 %oiger Essigsäure mehrmals, z. B. dreimal, jedesmal etwa 5 bis io Minuten, ausgekocht. Man erhält so aus ioo g der Trockensubstanz des Hypophysenvorderlappens 3000 ccm Stammlösung.
• Die Stammlösung wird zur Trockne eingedampft und der Trockenrückstand mit 300 ccm absolutem Alkohol extrahiert. Aus dem Extrakt wird der Alkohol abgedampft. Der Rückstand wird in ioo ccm Wasser aufgenommen. Er enthält das neue Hormon, das so in etwa 2o- bis 4o°/oiger Ausbeute gewonnen wird.
• Statt den Alkohol durch Abda-inpfen zu entfernen, kann man die gegebenenfalls eingeengte alkoholische Lösung auch in die etwa 20fache Menge siedenden Acetons gießen. Es entsteht dann beim Abkühlen ein feiner Niederschlag, der in Wasser gelöst wird und das neue Hormon enthält.
• Will man die Stammlösung zunächst vom Eiweiß befreien, so kann man ioo ccm davon mit so viel 2o°%iger Sulfosalicylsäure oder konzentrierter Trichloressigsäure oder konzentriertem Ammoniumsulfat versetzen, bis eine Eiweißflockung nicht mehr auftritt. Nach mehrstündigem Stehen erfolgt dann Filtration und Neutralisation, bis die Lösung beim Kochen schwach sauer reagiert.
• 2. Die gemäß Beispiel i erhaltene Stammlösung wird auf % ihres Volumens eingeengt und in die io- bis 20fache Menge kochenden Acetons gegossen. Es entsteht eine weißgelbliche, ziemlich grobflockige Fällung, die mehrmals mit Wasser ausgekocht wird. Die filtrierte Lösung enthält dann das neue Hormon in entsprechender Ausbeute wie gemäß Beispiel i.
• 3. Geht man vom Zwischen- bzw. Hinterlappen aus, so erfolgt die Bereitung der Stammlösung in der bei Beispiel i angegebenen.Weise, nur mit dem Unterschied, daß man sich hier eine Stammlösung herstellt, bei welcher o,i bis o,2 g Trockensubstanz auf 30 ccm der Stammlösung kommen. Diese Stammlösung ist wesentlich eiweißärmer als diejenige aus dem Vorderlappen, da nur 1/1o bis 1/5 der in jenem Falle verwandten Drüsenmenge benutzt wird. Beim Auskochen dieser Stammlösung mit Alkohol in der im Beispiel i angegebenen Weise, Abdampfen des Extrakts zur Trockne und mehrmaligen Auskochen des Trockenrückstandes mit Wasser erhält man eine Lösung, die pro ccm 300 PE des neuen Hormons enthält und frei ist von Oxytocin, Vasopressin u. dgl. Man kann zur Trennung des neuen Hormons vom Oxytocin und Vasopressin aber die alkoholische Lösung noch auf ein kleines Volumen (2- bis io ccm) einengen, mit der dreifachen Menge Essigester versetzen und dann 1/3 des Gesamtvolumens Wasser hinzufügen. Beim Schütteln findet dann Entmischung statt, und die wäßrige Schicht, welche das neue Hormon enthält, wird abgelassen, während der zurückbleibende Alkoholessigester die übrigen Hormone enthält.

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Bestimmung des Wirkungswerts von Zubereitungen eines in der Hypophyse vorkommenden Pigmentzellenhormons, dadurch gekennzeichnet, daß als Testreaktion die Erweiterung der Erythrophoren bei Fischen aus der Familie der Karpfen, insbesondere der Elritze (phoxinus laeo is), verwendet wird.
2. 2. Verfahren zur Gewinnung eines in der Hypophyse vorkommenden Pigmentzellenhormons, dadurch gekennzeichnet, daß die Hypophyse von Menschen oder Tieren nach für Hormongewinnung üblichen Methoden behandelt, die Anreicherung an dem Pigmentzellenhormon mittels des Tests gemäß Anspruch i festgestellt und die das Hormon enthaltenden Fraktionen allein weiterverwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Hypophysenvorderlappen unter Zerstörung der nicht hitzebeständigen Sexualhormone mit Wasser, gegebenenfalls in Gegenwart von Säuren, wie Essigsäure, auskocht, die Lösung erforderlichenfalls in bekannter Weise vom Eiweiß befreit und aus dem erhaltenen Hormongemisch das Pigmentzellenhormon mit Alkohol herauslöst, worauf man gegebenenfalls den erhaltenen alkoholischen Extrakt nach Zusatz von Wasser durch Ausschütteln mit Essigester weiterreinigt. q..
4. Verfahren nach Anspruch :2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls von Eiweiß befreite Lösung bzw. der daraus erhaltene alkoholische Auszug mit Aceton gefällt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch z, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Hypophysenmittellappen allein oder zusammen mit den Vorder-oder Hinterlappen bzw. beide verwendet.