DE60037133T2

DE60037133T2 - Enzymatisches substrat, verfahren zur herstellung und verwendung desselben

Info

Publication number: DE60037133T2
Application number: DE60037133T
Authority: DE
Inventors: Lyle Ashington ARMSTRONG; Arthur James
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2008-09-11
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: DE60037133D1; AU773596B2; CN1173987C; US7029886B1; EP1224196A1; ATE378346T1; BR0015163A; FR2800377A1; EP1224196B1; WO2001030794A1; CN1399641A; JP2003522736A; ES2295061T3; AU1034801A; FR2800377B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie enzymatischer Substrate und deren Anwendungen insbesondere zur Detektion von Mikroorganismen.
Die Detektion und Identifizierung von Bakterien ist in der Medizin oder in der Nahrungsmittelindustrie sehr wichtig, da bekanntermaßen diese Mikroorganismen sich nicht nur als pathogene Agenzien erweisen können, sondern auch auf bestimmte Arten einer Kontamination hinweisen können.
Neuere Verfahren, die mit diesem Ziel entwickelt wurden, machen von der Verwendung farbiger oder fluoreszierender Verbindungen Gebrauch, und die Verwendungen dieser Verbindungen wurden beispielsweise in den Übersichtartikeln von M. Manafi et al., Microbiological Reviews, 55(3), S. 335–348, 1991, oder kürzlicher, M. Manafi, De Ware(n) Chemicus, 28, S. 12–17, 1998 beschrieben.
Im Allgemeinen können vier Gruppen von Verbindungen unterschieden werden:

– fluoreszierende Marker, wie bspw. Akrindinorange, die ein Anstieg in der Fluoreszenz hervorrufen, wenn der Marker an Nukleinsäuren oder an Proteine der Zellen der Mikroorganismen absorbiert;
– pH-abhängige Indikatoren, wie bspw. Akridin oder 7-Hydroxycumarin, die in Abhängigkeit des pH-Wertes und daher in Abhängigkeit der biochemischen Aktivität der Mikroorganismen in der Intensität oder im Farb- bzw. Fluoreszenzspektrum variieren;
– Verbindungen, die gegenüber der oxido-reduktiven Natur eines Mediums sensitiv sind, wie bspw. Methylenblau, und welche aufgrund der Wirkung eines reduzierenden Mediums eine Farbe erzeugen;
– farbige oder fluoreszierende Substrate von Enzymen, die jeweils eine Farbe oder eine Fluoreszenz aufgrund einer hydrolytischen Wirkung in Gegenwart eines Enzyms erzeugen, welches für einen Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen spezifisch ist.

In letzterer Kategorie wurden eine gewisse Anzahl von Substraten beschrieben, die insbesondere die Detektion von β-D-Glucosidase oder β-D-Galactosidase ermöglichen, welche wichtige taxonomische Marker für Mikroorganismen darstellen, und insbesondere für Enterobacteriaceae. Bezüglich dieser Substrate können bspw. Ortho-Nitrophenyl-Derivate erwähnt werden, die nach Hydrolyse gelbes o-Nitrophenol produzieren, oder fluoreszierende Substrate, wie bspw. Derivate von Fluoreszin oder von 4-Methylumbelliferon, welche einen fluoreszierenden Marker produzieren. Eine beträchtliche Einschränkung dieser Substrate ist das Phänomen der Diffusion in das Kulturmedium, wodurch es schwerer wird, zwischen der Kolonie und einem Hintergrund zu unterscheiden.
Um dieses Problem zu lösen, wurden andere Substrate eingesetzt, die nach der Hydrolyse zu einem unlöslichen Produkt führen. Diese Substrate bleiben um die Bakterienkolonie herum lokalisiert, ohne in den Kulturträger zu diffundieren, was die Auswertung des Tests erleichtert.
Unter diesen Substraten wurden Indoxylderivate (siehe bspw. Kodaka et al., J. Clin. Microbiol., 33, S. 199–201, 1995 oder die Patente US 5,358,854 und US 5,364,767 ) oder Äsculetinderivate (siehe bspw. WO 97/41138 ) entwickelt. Zum einen steigert die schwierige Synthese die Kosten extrem, was die Entwicklung industrieller Anwendungen in großem Maßstab beschränkt, und darüber hinaus sind diese Substrate sensitiv gegenüber den Inkubationsbedingungen des Mediums. Zweitens ist die Notwendigkeit, einen Komplexbildner auf Eisenbasis zu dem Medium hinzuzufügen, um eine Farbreaktion zu erzielen, für bestimmte Mikroorganismen ein Problem, da dies deren Stoffwechsel stören kann, insbesondere derjenigen, die untersucht wurden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Familie enzymatischer Substrate, die die oben erwähnten Nachteile nicht aufweisen, da die Synthese dieser Verbindungen einfach auszuführen ist, die Substrate nach der Hydrolyse unlöslich sind, sie nicht in das Medium diffundieren und nicht die Hinzufügung eines Komplexbildners wie bspw. Eisen benötigen oder besondere Oxidations-Reduktions-Bedingungen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Familie von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zu beschreiben:
in welcher
X ein mit einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei die Phenylgruppe wahlweise in meta- oder para-Position substituiert ist,
Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom darstellt, oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether- oder eine Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert mit einer Alkyl- oder Arylgruppe;
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen;
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können;
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist.
Die Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, sind Enzyme, deren Vorliegen eine Information bereitstellt, durch welche die Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung von einem oder mehreren Mikroorganismen oder eines Analyten ermöglicht wird, wie bspw. einem Protein, einem Peptid oder einer Nukleinsäure. Insbesondere ist das Enzym aus der Familie der -Osidasen wie bspw. β-Glucuronidase, β-Galactosidase, 6-Phosphogalactohydrolase, α-Galactosidase, α-Amylase, α-Glucosidase, β-Glucosidase oder Hexosaminidasen, wie bspw. N-Acetyl-β-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-galactosaminidase, oder aus der Familie der Esterasen, der Lipasen, der Phosphatasen, der Sulfatasen, der DNasen, der Peptidasen und der Proteasen. Vorzugsweise ist das Enzym aus der Familie der -Osidasen, wie bspw. β-D-Glucosidase, β-Glucuronidase, oder β-D-Galactosidase, oder aus der Familie der Sulfatasen, Phosphatasen oder Esterasen.
Die Gruppe R ist als eine Funktion des zu detektierenden Enzyms ausgewählt. R ist bspw. ein Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers, wie bspw. die Derivate der Xylose, Glucose, Galactose, Glucuronsäure, Glucosamin oder ein Phosphat, ein Sulfat, ein Carboxylat (R₆COO^–), in welchem R₆ eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, ein Nukleotid oder ein Peptid. Die Gruppe R ist vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose, β-D-Glucuronat, ein Phosphat, ein Sulfat oder ein Acetat.
Wenn R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, ist die folgende Struktur (Ia) beabsichtigt, welche die entwickelte Formel für R₁ und R₂ zeigt:
Wenn Y und Z gemeinsam eine Ether-Bindung darstellen, ist eine Bindung wie in der allgemeinen Formel (Ib) dargestellt beabsichtigt:
Wenn Y und Z gemeinsam eine Thioether-Bindung darstellen, ist eine Bindung wie in der allgemeinen Formel (Ic) dargestellt, beabsichtigt:
Wenn Y und Z gemeinsam eine Amin-Bindung darstellen, die wahlweise mit einer Aryl- oder Alkylgruppe substituiert ist, ist eine Bindung wie in der allgemeinen Formel (Id) dargestellt, beabsichtigt:
in welcher A eine Aryl- oder Alkylgruppe darstellt.
Besondere Substrate der allgemeinen Formel (I) sind in den allgemeinen Formeln (II), (III), (IVa), (IVb) und (IVc) wie nachstehend gezeigt wiedergegeben:
Die allgemeine Formel (II), in welcher,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstel len, der wahlweise substituiert sein kann. R₁ und R₂ stellen vorzugsweise einen fusionierten Benzolring dar, der nicht substituiert ist,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar,
R₅ H, NO₂, CF₃, CN, OCH₃, F, I, Cl, Br, SO₃H, oder CO₂H in meta- oder para-Position darstellt. R₅ stellt vorzugsweise H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. Insbesondere stellt R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose, oder ein Acetat oder ein Sulfat.
Die allgemeine Formel (III), in welcher,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert sein kann. R₁ und R₂ stellen vorzugsweise einen fusionierten Benzolring dar, der nicht substituiert ist,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar,
R₅ H, NO₂, CF₃, CN, OCH₃, F, I, Cl, Br, CO₂H oder SO₃H, in meta- oder para-Position darstellt. R₅ stellt vorzugsweise H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. Insbesondere stellt R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Die allgemeine Formel (IVa), in welcher,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert sein kann. Vorzugsweise stellt R₁ H und R₂ Cl dar,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose oder ein Acetat oder ein Sulfat.
Die allgemeine Formel (IVb), in welcher,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert sein kann. Vorzugsweise stellt R₁ H und R₂ Cl dar,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose oder ein Acetat oder ein Sulfat.
Die allgemeine Formel (IVc), in welcher,
A eine Aryl- oder Alkylgruppe darstellt,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, der wahlweise substituiert sein kann. Vorzugsweise stellt R₁ H und R₂ Cl dar,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar,
R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist. R stellt insbesondere einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose oder ein Acetat oder ein Sulfat.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese des enzymatischen Substrats der allgemeinen Formel (I), in welchem eine Zwischenverbindung hergestellt wird, die die allgemeine Formel (V) aufweist
in welcher,
X ein mit einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei die Phenylgruppe wahlweise in meta- oder para-Position substituiert ist,
Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom darstellt, oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether- oder eine Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert mit einer Alkyl- oder Arylgruppe,
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen,
R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I oder Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können,
und an das Hydroxyl eine Gruppe R angefügt wird, passenderweise eine Schutzgruppe.
Das Anfügen findet insbesondere über eine Glycosylierungs-, Veresterungs- oder Phosphorylierungsreaktion statt.
Im Falle der Glycosylierung ist es notwendig, die Hydroxylgruppen des Zuckers zu schützen, wie bspw. mit einer Acetylgruppe. Die tetra-acetylierten Derivate des β-D-Glucosids oder β-D-Galactosids werden aus dem korrespondierenden α-Acetobromhexose-Derivat erhalten.
Die Deprotektion der Hydroxylgruppen des Zuckers wird – nach dem Anfügen – in Gegenwart eines alkalischen Agens durchgeführt, wie bspw. Natriummethoxid in Methanol für ein acetyliertes Derivat. Die Bedingungen für die Glycosilierung werden durch Fachleute bestimmt, und insbesondere durch die Wirkung des Kaliumhydroxids in Aceton.
Die Bildung von organischen Estern, wie bspw. Acetat, wird ausgeführt durch das Reagieren lassen – bezüglich des Derivats der allgemeinen Formel (V) – von Essigsäureanhydrid in Pyridin unter kalten Bedingungen. Die Bildung eines Esters vom Typ CH₃(CH₂)_n COOR wird durchgeführt durch Reagieren lassen eines Säurechlorids-Derivats in einer Lösungsmittelmischung vom Typ Pyridin/Dimethylformamid, wahlweise in Gegenwart eines Katalysators wie 4-Dimethylaminopyridin.
Die Phosphatbildung wird durchgeführt durch Behandeln des Derivats der allgemeinen Formel (V) in Gegenwart von POCl₃, in Gegenwart von Pyridin.
Die Sulfatbildung wird durchgeführt durch Behandeln des Derivats der allgemeinen Formel (V) mit Chlorsulfonsäure in Pyridin unter kalten Bedingungen. Die Substrate der vorliegenden Erfindung, im Falle der Phosphate und Sulfate, liegen in Form eines Salzes vor, wie einem Kalium- oder Natriumsalz.
Vorzugsweise wird eine Zwischenverbindung hergestellt, die irgendeiner der nachstehenden Formeln (Va), (Vb) und (Vc) entspricht:
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung zur Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung von zumindest einem Mikroorganismus, mit mindestens einem enzymatischen Substrat der allgemeinen Formel (I) und einem Reaktionsmedium für diesen Mikroorganismus oder diese Mikroorganismen.
In der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „Reaktionsmedium" ein Medium bedeuten, welches die Entwicklung zumindest einer enzymatischen Aktivität von zumindest einem Mikroorganismus zulässt, wie bspw. ein Kulturmedium.
Das Reaktionsmedium ist fest, halbfest oder flüssig. Der Ausdruck „festes Medium" soll bspw. ein Agarmedium bedeuten. Agar ist das übliche feste Medium in der Mikrobiologie zur Kultivierung von Mikroorganismen, es ist jedoch auch möglich, Gelatine oder Agarose zu verwenden. Eine gewisse Anzahl an Zubereitungen sind verfügbar, wie bspw. Columbia-Agar, Trypcase-Soja-Agar, Mac Conkey-Agar, Sabouraud-Agar, ferner diejenigen, die in „Livret technique MILIEUX DE CULTURE" [Technisches Handbuch KULTURMEDIEN] der Anmelderin beschrieben sind, oder, allgemeiner, diejenigen, die im Handbuch der Mikrobiologischen Medien (CRC Press) beschrieben sind.
Das Reaktionsmedium ist vorzugsweise ein Agar-Medium, welches zwischen 2 und 40 g/l, vorzugsweise zwischen 9 und 25 g/l Agar enthält.
Die Substrate der vorliegenden Erfindung können in einem breiten pH-Bereich eingesetzt werden, insbesondere zwischen pH 5,5 und 10,0, und vorzugsweise zwischen pH 6,0 und 8,5.
Das Reaktionsmedium kann ferner ein oder mehrere Elemente in Kombination miteinander enthalten, wie bspw. Aminosäuren, Peptone, Kohlenhydrate, Nucleotide, Mineralien, Vitamine, Antibiotika, Tenside, Puffer, oder Phosphat-, Ammonium-, Natrium- oder Metallsalze. Beispiele der Medien sind in den folgenden Patenten der Anmelderin beschrieben, EP 0 656 421 oder WO 99/09207 .
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das Reaktionsmedium zumindest zwei enzymatische Substrate auf: ein erstes enzymatisches Substrat aus der Familie der Erfindung und zumindest ein weiteres enzymatisches Substrat aus der Familie der Erfindung und/oder ein weiteres enzymatisches Substrat aus einer anderen Substratfamilie. Die enzymatische Hydrolyse des oder der weiteren Substrat(e) bewirkt ein detektierbares Signal, das von dem Signal, das durch das erste Substrat bewirkt wird, unterschiedlich ist, wie bspw. unterschiedlich farbige oder fluoreszierende Produkte, um ein Aufzeigen – wie die Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung – eines oder mehrerer Mikroorganismen zu ermöglichen.
Beispielhaft können die folgenden Kombinationen in Erwägung gezogen werden:

– ein β-Glucuronidase-Substrat gemäß der Erfindung und X-β-D-Glucosid (X ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl) für ein Medium für Urinproben (Typ CPS ID2, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich);
– ein β-Galactosidase-Substrat gemäß der Erfindung und X-β-D-Glucosid für ein Medium für Urinproben (Typ CHROMagar Orientation (eingetragene Marke), verkauft von der Firma CHROMagar, Paris, Frankreich oder Oxoid UTI, verkauft von der Firma OXOID, Hampshire, England);
– ein β-Glucuronidase-Substrat gemäß der Erfindung und X-β-D-Galactosid für ein Medium für Escherichia coli und Coliforme (Typ Coli ID, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich).

Als Beispiele kann ein Hexosaminidase-Substrat gemäß der Erfindung für Hefen und für die Identifizierung von Candida albicans verwendet werden.
Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung können insbesondere zu den Medien CPS ID2, SM ID, Albicans ID2, Coli DI und O157:H7 ID zugefügt werden, welche durch bioMérieux (Marcy l'Etoile, Frankreich) vertrieben werden und alle oder einige von deren enzymatischen Substraten aufweisen, und auch zu den Medien, die Äsculin aufweisen, wie Galle-Äsculin-Agar, mit oder ohne selektive Agenzien.
Die Konzentration des enzymatischen Substrats im Reaktionsmedium beträgt zwischen 0,02 imd 1 g/l, vorteilhafterweise zwischen 0,03 und 0,30 g/l und vorzugsweise zwischen 0,04 und 0,10 g/l.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Diagnosekit mit einer Zusammensetzung wie oben definiert und einem Behälter für das Reaktionsmedium. Der Ausdruck „Behälter" soll jeglichen festen Träger umfassen, wie bspw. eine Flasche, ein Röhrchen, eine Schale, eine Mikrotiterplatte oder ein Verbrauchsprodukt für automatische Maschinen, wie bspw. API Galeries oder VITEK-Karten (eingetragenen Marken, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich).
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung von zumindest einem Mikroorganismus in einer Probe, in welchem der aus der Probe stammende Mikroorganismus mit einem Reaktionsmedium in Kontakt gebracht wird, welches ein enzymatisches Substrat der allgemeinen Formel (I) enthält, und in welchem das farbige oder fluoreszierende Produkt, welches durch die Hypolyse des enzymatischen Substrats gebildet wird, detektiert wird.
Die Substrate der allgemeinen Formel (I) haben den Vorteil, dass sie unabhängig von den Bedingungen für die Atmosphäre der Inkubation verwendet werden können. Die Detektion kann daher dadurch ausgeführt werden, dass das Reaktionsmedium mit dem enzymatischen Substrat inkubiert und mit zumindest einem Mikroorganismus unter einer kontrollierten Atmosphäre beimpft wird, bspw. unter aeroben, anaeroben, microaerophilen Bedingungen oder unter einer CO₂-Atmosphäre, und vorzugsweise unter aeroben oder microaerphilen Bedingungen oder unter einer CO₂-Atmosphäre.
Die zu analysierende Probe ist eine klinische Probe, wie bspw. Speichel, Blut, Urin, eine Stuhlprobe oder irgendeine andere Probe, deren Analyse einem Mediziner bei der Diagnoseerstellung helfen kann. Die Probe kann auch eine Probe eines Produkts sein, welches ein Grundprodukt der Nahrungsmittel- und/oder pharmazeutischen Industrie ist, oder von diesem abstammt, bei welchem es notwendig ist, entweder die Abwesenheit von pathogenen Mikroorganismen zu garantieren, oder eine kontaminierende Flora auszuzählen oder spezifische Mikroorganismen zu detektieren. Die Probe kann entweder direkt auf einem Medium kultiviert werden, welches ein Substrat der allgemeinen Formel (I) enthält, oder aber nach einem Vorkultivierungsschritt, bspw. im Falle einer Nahrungsmittelprobe.
Der oder die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert, detektiert oder quantifiziert werden können, sind Bakterien, Hefen oder Pilze, und gehören insbesondere zu den folgenden Gruppen oder Taxa: Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Neisseriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae, Campylobacter, Micrococcaceae, Streptococcaceae, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Corynebacterium, Gardnerella, Nocardia, Candida, Cryptococcus, Aspergillus und genauer Escherichia coli, E. coli O157:H7, Shigella, Salmonella, Proteeae, Pseudo monas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Enterococcus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Hefen, wie Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans und Aspergillus fumigatus. Diese Mikroorganismen können aerob, aeroanaerob, micropaerophil oder anaerob sein.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die enzymatischen Substrate in Reaktionen zur Detektion eines Analyten eingesetzt, in welchen eine enzymatische Aktivität (insbesondere alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase) verwendet wird, wie bspw.: Reaktionen zur Detektion eines Antikörpers oder Antigens, oder einer Nukleinsäure, im Rahmen eines ELISA-Test (siehe bspw. „les immunodosages de la théorie la pratique") [Immunoessays, von der Theorie zur Praxis] gesammelt durch Y. Barbier, ACOMEN Veröffentlichungen, Lyon, S. 109–133, 1988); bei molekularbiologischen Techniken zum Nachweis eines Gens vom β-Galactosidase-Typ (siehe bspw. „Molecular cloning: a laboratory manual", 2. Ausgabe, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 16.56 und Kapitel 1.85, 1989); zur Detektion von Nukleinsäuren (siehe bspw. „DNA-Sonden", 2. Auflage, G. H. Keller, Manak, M. M., Stockton Press, Kapitel 5–9, 1993); oder bei histochemischen, cytochemischen oder durchflusszytometrischen Techniken.
Die folgenden Beispiele sollen einige Vorteile der Erfindung aufzeigen. Beispiel 1: Synthese von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid, PNB-gal-Produkt (1)
p-Naphtholbenzein wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) erworben. Die anderen Reagenzien wurden von Sigma Aldrich Chemie (St. Quentin Fallavier, Frankreich) erhalten. p-Naphtholbenzein (1,87 g, 5 mmol) wurde in 20 ml Aceton unter starkem Rühren gelöst. 5 ml Kaliumhydroxid mit einer Konzentration von 1,4 mol/l wurden zu dieser Lösung hinzugefügt, gefolgt von 10 ml Aceton. Anschließend wurden 5 ml Wasser tropfenweise hinzugefügt, um eine stark blaue Lösung zu bilden. 10 mmol α-Acetobromgalactose (4,1 g) in 10 ml Aceton wurden zu der Lösung hinzugefügt. Um den pH-Wert größer als 11 zu halten, wurden 2 ml einer Kaliumhydroxidlösung mit 20 mol/l zum ersten Mal nach 30 min Rühren hinzugefügt und ein weiteres Mal nach 90 min Rühren. Ein drittes Mal wurde die alkalische Lösung nach 3,5 Std. hinzugefügt, gefolgt von der Hinzufügung von 5 ml α-Acetobromgalactose in Aceton mit der gleichen Konzentration wie zuvor. Nach 4,5 Std. wurde die alkalische Lösung ein letztes Mal hinzugefügt und die Lösung über Nacht gerührt.
Das Aceton wurde unter reduzierendem Druck entfernt und die restliche Lösung in 300 ml einer Natriumkarbonatlösung mit 0,06 mol/l bei einer Temperatur von 0°C unter Rühren eingeführt. Das kastanienbraune Präzipitat wurde unter Vakuum filtriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Der Feststoff wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst und gründlich mit einer Kaliumhydroxidlösung bei 0°C gewaschen, um überschüssiges p-Naphtholbenzein zu entfernen. Das restliche p-Naphtholbenzein wurde durch Rühren auf einem Dowex Marathonharz in 100 ml Wasser bei pH 11 für 2 bis 3 Std. entfernt. Auf diesen Reinigungsschritt folgte eine Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung eines Ethylacetat/Toluol (3:1) Laufmittels, wobei für die Entwicklung wässriges Ammoniak verwendet wurde. Die dunkelgelbe Lösung wurde über Nacht auf wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter reduzierendem Druck verdampft, mit Methanol neu gebildet und anschließend wieder verdampft, um einen Schaum zu erhalten. Dieser Schaum wurde in 50 ml Methanol gelöst und das Produkt 5 Std. lang unter Verwendung von 20 ml Natriummethoxid in Methanol bei 0,4 mol/l deprotektiert. Die Lösung wurde dann unter Verwendung eines IR120 (H⁺) auf pH 6,5 gebracht, durch Absetzen getrennt, und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das gebildete Glycosid, p-Naphtholbenzein-β-D-galactosidase (1,5 g), liegt in Form eines gelbbraunen Pulvers vor.
Beispiel 2: Synthese des Acetatderivates von p-Naphtholbenzein
Das p-Naphtholbenzein wurde in wasserfreiem Pyridin gelöst und anschließend auf 0°C gekühlt, wonach zu dieser Lösung Essigsäureanhydrid (5facher molarer Überschuss), gelöst in Pyri din, unter kalten Bedingungen hinzugefügt wurde. Nach 24 Std. bei Raumtemperatur wurde kaltes Wasser tropfenweise unter Rühren hinzugefügt, um das überschüssige acetylierende Agens zu dissoziieren. Erhalten wurde ein Präzipitat in Esterform, welches durch Filtrierung unter Vakuum entfernt, mit Essigsäure gewaschen und in Essigsäure unter heißen Bedingungen umkristallisiert wurde.
Beispiel 3: Synthese des Sulfat-Derivat in Kaliumsalzform, von p-Naphtholbenzein.
Ein 1,2 molarer Überschuss an Chlorsulfonsäure wurde bei –15°C unter Rühren zu einer kalten Lösung von p-Naphtholbenzein in wasserfreiem Pyridin hinzugefügt. Nach 1 Std. bei –15°C und 30 min bei Raumtemperatur wurde das überschüssige Pyridin unter reduziertem Druck verdampft, und das Pyridiniumsalz wurde durch Lösen in Ethanol und Behandeln mit einer Natriumhydroxidlösung in Ethanol disoziiert, bis ein pH-Wert von 10 erreicht wurde. Das Kaliumsalz wurde unter Vakuum gefiltert und mit Ethanol und dann Diethylether gewaschen. Beispiel 4: Synthese von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-glucosid, (CBR-glu) Produkt (2).
6-Nitroso-4-chlorresocinol (2,94 g, 20 mmol) und 1,3-Dihydroxynaphthalen (3,20 g, 20 mmol) wurden jeweils getrennt in 1-Butanol (30 ml) gelöst und gemischt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen 50 und 60°C unter Verwendung eines Wasserbades erhitzt und anschließend Schwefelsäure (1,0 g) tropfenweise unter Rühren für 30 Sekunden hinzugefügt. Die Lösung wurde dunkelrot und es bildeten sich rasch Kristalle. Nach 15 min bei 50°C und einer 1 Std. bei Raumtemperatur wurde das Produkt unter Vakuum gefiltert und aus heißem 1-Butanol umkristallisiert, wodurch 2,8 g an leuchtenden dunkelroten Kristallen aus 8-Chlor-1,2-benzoresorufin gewonnen wurden.
Das Glucosid-Derivat (2) wurde durch eine Koenings-Knorr-Reaktion hergestellt, wie zuvor für das p-Naphtholbenzein-Derivat beschrieben. Das Glucosid in tetra-acetyliserter Schutzform wurde durch Rotationsverdampfung aus Dichlormethan isoliert und unter Verwendung einer katalytischen Menge an Natriummethoxid in wasserfreiem Methanol direkt deprotektiert. Das Glycosid lag in Form eines orangegelben Pulvers vor.
Beispiel 5: Synthese von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid, (CBR-gal) Produkt (3).
Das Verfahren zur Herstellung des β-D-Galactosids-Derivats (3) ist identisch mit dem in Beispiel 4 beschriebenen, wobei das β-D-Galactosid-Derivat in tetra-acetylierter Schutzform anstelle des Glucosid-Äquivalents verwendet wurde. Beispiel 6: Synthese von 3-Hydroxy-9-phenyl-1,2:7,8-dibenzo-6-fluoron-β-D-galactosid, Produkt (4).
3-Hydroxy-9-phenyl-1,2:7,8-dibenzo-6-fluoron wurde aus 1,3-Dihydroxynaphthalen (Aldrich, 14529-7) durch Kondensation unter heißen Bedingungen mit α,α,α-Trifluortoluol (Aldrich, T6370-3) in Gegenwart einer Lewis-Säure hergestellt, wie bspw. SnCl₄ oder ZnCl₂, und zwar in einen Lösungsmittel mit einem hohen Siedepunkt, wie bspw. Chlorbenzol oder Xylen. Nach Hydrolyse der Lewis-Säure und Reinigung der Zwischenverbindung, wurde das Galactosid-Derivat (4) wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Beispiel 6 bis: Synthese von Naphthosafranol (9-Hydroxy-7-phenol-5-benzo[a]phenazinon):
Eine Mischung aus 50 g Schwefelsäure und 130 ml Wasser wurden langsam unter Rühren zu einer bei 0°C gehaltenen Lösung aus Phenol (20 g), Natriumnitrit (18 g) und Natriumhydroxid (9 g) in 500 ml Wasser hinzugefügt. Nach 2-stündiger Reaktion wurde das Produkt gesammelt und mit eiskaltem Wasser gewaschen. Nach Umkristallisierung auf Wasser wurde das p-Nitrosophenol-Produkt in reiner Form isoliert (13,4 g).
Das auf diese Weise hergestellt p-Nitrosophenol (12,3 g, 0,1 mol) und auch N-Phenyl-2-naphthylamin (14,5 g, 0,067 mol, Aldrich, 17,805-5) wurden in Ethanol (400 ml) gelöst und die Mischung auf 15°C gekühlt. Anschließend wurde konzentriertes HCl (15 g) zu dieser Lösung hinzugefügt. Die Temperatur erhöhte sich spontan und das Isorosindon-Produkt (in Form eines Hydrochloridsalzes) wurde durch Filtration getrennt und aus einer Ethanol-Wasser-Mischung (50%–50%) umkristallisiert. Das Umkristallisierungsprodukt kann dadurch in seine freie Base umgewan delt werden, dass es zunächst in Ethanol gelöst wird, dann Ammoniumhydroxid hinzugefügt wird und schließlich die Lösung zu heißem Wasser zugefügt wird.
Die freie Base (Isorosindon) fällt nach Abkühlen der Lösung in Form dunkelbrauner Kristalle aus. Eine Filtration unter Vakuum führte zu 15 g des reinen Produkts.
Das Zielprodukt (5) wurde durch Reflux des Isorosindons in einer konzentrierten Lösung auf KOH in 1-Butanol gewonnen. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie auf Silikamaterial mit Ethylacetat als Eluierungsmittel gereinigt.
Beispiel 6 ter: Das Galactosid-Derivat von Naphthosafranol wurde nach dem gleichen Protokoll wie für Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Beispiel 7: Verwendung von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid (PNB-gal) zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität.
Ein festes Agar-Medium mit PNB-gal wurde wie folgt hergestellt: 41 g Columbia-Agar wurden zu 1 Liter destilliertem Wasser mit 100 mg PNB-gal und 30 mg IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) hinzugefügt, um die Induktion der β-Galactosidase-Aktivität zu erleichtern. Der Agar wurde durch Autoklavieren bei 116°C für 10 min sterilisiert. Das Medium wurde langsam auf 55°C abgekühlt, bevor es auf 20 ml Petrischalen verteilt wurde.

367 unterschiedliche Stämme, einschließlich 303 Enterobacteriaceae, wurden aus Klinik- und Umweltproben gesammelt und unter Verwendung der API 20E Galerie (bioMérieux, Frankreich) als Referenzverfahren identifiziert. Die Stämme wurden auf einen Columbia-Agar-Medium bei 37°C für 24 Std. kultiviert, anschließend wurden ungefähr 10⁸ Organismen/ml (entspricht einem McFarland-Standard von 0,5) je Stamm angeimpft. Unter Verwendung eines Denley-Inokulators wurden 1 Mikroliter jeder Suspension in das wie oben hergestellte PNB-gal-Medium angeimpft, mit 20 Stämmen/Petrischale. Alle Petrischalen wurden bei 37°C für 18 Std. inkubiert. Nach Inkubation wurden die Petrischalen auf Gegenwart einer purpurroten Kolonie untersucht, im Vergleich mit Wachstum auf dem Columbia-Agar-Medium. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle 1

Gramnegative Spezies	Anzahl der Stämme getestet für die Spezies	Positive Ergebnisse mit dem PNB-gal-Substrat (%)
Acinetobacter ssp.	53	0
Aeromonas caviae	7	86
Aeromonas hydrophila	3	100
Citrobacter diversus	9	89
Citrobacter freundii	16	100
Enterobacter aerogenes	9	100
Enterobacter agglomerans	1	100
Enterobacter cloacae	21	100
Escherichia coli	41	95
Escherichia hermannii	1	100
Hafnia alvei	10	30
Klebsiella oxytoca	13	100
Klebsiella ozaenae	3	67
Klebsiella pneumoniae	19	100
Morganella morganii	12	0
Proteus mirabilis	16	0
Proteus penneri	1	0
Proteus vulgaris	4	0
Providencia alcalifaciens	3	0
Providencia rettgeri	3	0
Providencia stuartii	10	0
Salmonella spp.	64	0
Serratia odorifera	1	100
Serratia spp.	14	79
Shigella boydii	1	0
Shigella dysenteriae	2	0
Shigella flexneri	2	0
Shigella sonnei	10	100
Vibrio cholerae	1	100
Yersinia enterocolitica	14	7
Yersinia pseudotuberculosis	3	0

Diese Tabelle zeigt, dass das Substrat als Indikator für die β-Galactosidase-Aktivität sehr effektiv ist. Es wurde kein Stamm ohne β-Galactosidase-Aktivität detektiert, was bedeutet, dass es keine Falsch-Positiven gibt, und die Sensitivität bezüglich der Enterobacteriaceae-Stämme liegt bei 95,1% im Vergleich mit der API 20E-Referenzmethode.
Beispiel 8: Einfluss des pH-Werts auf die Offenbarung der β-D-Galactosidase in Gegenwart des p-Naphtholbenzein-β-D-galactosids, PNB-gal.

Das hierbei verwendete Medium, Columbia-Basis mit einer Konzentration von 46,37 g/l, Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) mit 0,03 g/l, p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid mit 0,1 g/l, wurde bei 24°C auf verschiedene pH-Werte (5,5–6,0–6,5–7,0–7,5–8,0–8,5) eingestellt, nachdem das Medium autoklaviert worden war. Diese verschiedenen Medien wurden nach Aufteilung auf Petrischalen jeweils einzeln und als 3fach-Set unter Verwendung einer Suspension mit 0,5 McFarland beimpft, wobei die Suspension hinreichend charakterisierte Mikroorganismen auf der ATCC oder NCTC Artensammlung enthielt. Die Petrischalen wurden bei 37°C für 48 Std. inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden visuell nach 24 und nach 48 Std. Inkubation untersucht und die Farbe notiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II nachstehend wiedergegeben: Tabelle II

Getestete Stämme	TI	pH 5,7	pH 6,0	pH 6,5	pH 7,0	pH 7,5	pH 8,0	pH 8,5
E. coli	24 H	-	-	-	-	-	-	-
032	48 H	-	-	-	-	-	-	-
E. coli	24 H	orange	orange	orange	orange	orange	orange	orange
115	48 H	orange	orange	orange	orange	braun	braun	braun
S. marcescens	24 H	braun	braun	braun	braun	braun	braun	braun
217	48 H	braun	braun	braun	braun	grün	khaki	khaki
E. cloacae	24 H	orange	orange	orange	orange	braun	braun	braun
061	48 H	braun	braun	braun	grün	grün	khaki	khaki
S. typhimurium	24 H	-	-	-	-	-	-	-
010	48 H	-	-	-	-	-	-	-
E. faecalis	24 H	-	-	-	-	-	-	-
117	48 H	orange	orange	orange	orange	orange	orange	orange
S. agalactiae	24 H	-	-	-	-	-	-	-
015	48 H	-	-	-	-	-	-	-
S. aureus	24 H	-	-	-	-	-	-	-
008	48 H	-	-	-	-	-	-	-

„-" bedeutet eine fehlende Färbung, TI bedeutet die Inkubationszeit der Petrischalen.

Je nach Stamm und Dauer der Inkubation variiert die Farbe der Kolonien als Funktion des pH-Werts. Im Allgemeinen ist die Farbe bei einem sauren pH eher orange bis braun und bei einem alkalischen pH grün bis khaki. Dies ermöglicht es, verschiedene Gruppen von Mikroorganismen zu unterscheiden, die Farbe je nach Bedarf anzupassen (Kombination mit anderen enzymatischen Substraten, pH-Indikatoren), oder mehrere Stoffwechsel aufzuzeigen (enzymatische Hydrolyse und pH-Variierung), was ein Vorteil des PNB-gal-Substrats ist.
Beispiel 9: Einfluss des Reaktionsmediums auf die Offenlegung der β-D-Galactosidase in Gegenwart von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid, PNB-gal.
Die folgende Mischung wurde zu den Columbia, Trypticase Soja (GSA) und Sorbit MacConkey (SMAC)-Medien hinzugefügt:

Isopropyl-β-D-thio-galactosid 0,03 g/l

p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid 0,1 g/l

Nach dem Autoklavieren lag der pH-Wert der Medien bei 23°C bei 7,1, 7,1 und 7,2 in Bezug auf jeweils SMAC, GSA und das Columbia-Medium. Diese verschiedenen Medien wurden – verteilt auf Petrischalten – jeweils einzeln und mit 3fach-Proben mit einer Suspension mit 0,5 McFarland beimpft, mit hinreichend charakterisierten Organismen erhalten von der ATCC oder NCTC-Sortensammlung. Die Petrischalen wurden bei 37°C 48 Std. lang inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Std. Inkubation visuell untersucht und die Farbe notiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben: Tabelle III

Getestete Stämme	TI	SMAC-Medium	TSA-Medium	Columbia-Medium
E. coli	24 H	-	-	-
032	48 H	-	-	-
E. coli	24 H	orange	orange	braun-orange
115	48 H	orange	orange	braun
E. coli	24 H	orange	braun-orange	braun
206	48 H	orange	braun-orange	braun
S. marcescens	24 H	fuchsia	braun-orange	braun
217	48 H	fuchsia	braun	braun
E. cloacae	24 H	orange	braun-orange	braun
061	48 H	orange	braun	braun
S. typhimurium	24 H	-	-	-
010	48 H	-	-	-
E. faecalis	24 H	-	-	-
010	48 H	-	orange	orange
S. agalactiae	24 H	-	-	-
015	48 H	-	-	-
S. aureus	24 H	-	-	-
008	48 H	-	-	-

„-" zeigt eine fehlende Färbung an, TI bedeutet die Inkubationszeit einer Petrischale.

Je nach Stamm und Dauer der Inkubation variierte die Farbe der Kolonien als Funktion des Mediums. Allgemein ist sie orange auf dem SMAC-Medium und braun auf dem Columbia-Medium, wobei es nicht möglich war, diesen Unterschied in der Farbe mit dem pH-Wert des Mediums in Verbindung zu bringen. Auf dem SMAC-Medium ist es möglich, Serratia marcescens von den anderen Bakterien zu unterscheiden, was für die anderen beiden Medien nicht der Fall ist. Darüber hinaus kann es vorteilhaft sein, die Farbe der mit p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid erhaltenen Kolonien in Abhängigkeit von der Verwendung anderer enzymatischer Substrate, die zu anderen Farben führen (pink oder braun zum Beispiel,) einstellen zu können.
Beispiel 10: Einfluss der Inkubationsatmosphäre auf die Offenlegung der β-D-Galactosidase in Gegenwart von p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid, PNB-gal.
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-gal) oder p-Naphtholbenzein-β-D-galactosid (PNB-gal) wurde mit 0,1 g/l zu dem nachstehendem Medium hinzugefügt:

Hefeextrakt 6 g/l

Gelatinepepton 5 g/l

NaCl 8 g/l

Natriumkarbonat 0,1 g/l

Isopropyl-β-D-thio-galactosid 0,03 g/l

Agar 13 g/l

Diese verschiedenen Medien wurden – nach Verteilung auf Petrischalen – mit hinreichend charakterisierten Mikroorganismen aus der ATCC oder NCTC-Sortensammlung beimpft. Die Petrischalen wurden bei 37°C 48 Std. lang unter verschiedenen Atmosphären inkubiert: aerobe (AE), mikroaerophil (MAP), anaerob (ANA), CO₂, mit dem GENbox-System (bioMérieux, Frankreich), zur Kontrolle der Atmosphäre. Die gebildeten Kolonien wurden nach einer Inkubation von 24 bis 48 Std. visuell untersucht und die Intensität der Farbgebung notiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV wiedergegeben: Tabelle IV

		X-Gal				PNB-Gal
		AE	MAP	ANA	CO₂	AE	MAP	ANA	CO₂
Stämme	TI	Test 1	Test 2	Test 3	Test 4	Test 5	Test 6	Test 7	Test 8
E. Coli	24 H	3*	2	-	2	3	3	1	3
115	48 H	3	2	1	2	3	3	3	3
E. Coli	24 H	3	1	1	3	3	3	2	3
206	48 H	3	1	1	3	3	3	3	3
S. marcescen	24 H	-	-	-	-	-	-	-	-
042	48 H	1	1	-	2	3	1	-	3
E. cloacae	24 H	2	1	-	2	2	2	1	2
061	48 H	2	1	1	2	2	2	3	2
P. vulgaris	24 H	-	-	-	-	-	-	-	-
140	48 H	-	-	-	-	-	-	-	-
E. faecalis	24 H	-	-	-	-	-	-	-	-
117	48 H	-	-	-	-	-	-	-	-
E. faeci um	24 H	1	-	-	-	-	-	-	-
255	48 H	3	1	-	1	3	-	-	-
S. aureus	24 H	-	-	-	-	-	-	-	-
008	48 A	-	-	-	-	-	-	-	-

*: Farbintensität (willkürlicher Maßstab basierend auf visueller Beobachtung); „-" bedeutet fehlende Färbung; TI bedeutet Inkubationszeit.

Während es X-Gal im Unterschied zu PNB-Gal ermöglicht, bei dem E. faecium-Stamm eine Akvitität zu detektieren, ermöglicht es PNB-Gal bei Stämmen, die X-Gal unter Aerobinse (E. coli, E. cloacae) stark hydrolysieren, diese β-D-Galactosidase-Aktivität unabhängig von der Atmosphäre und intensiver zu detektieren. Denn wenn die Intensitäten unter den Bedingungen des Tests 3 schwach oder sogar sehr schwach sind, sind diese unter den Bedingungen des Tests 7 stark.
Beispiel 11: Verwendung von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid (CBR-gal) zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität in einem festen Medium.
Das CBR-gal-Substrat wurde in Columbia-Agar mit den folgenden Konzentrationen eingeführt: 2, 6, 10 und 20 mg/100 ml, und das so hergestellte Medium wurde auf Petrischalen verteilt. Jede Petrischale wurde mit den folgenden Organismen beimpft: E. coli (NCTC, 10418), K. pneumoniae (NCTC, 10896), P. rettgeri (NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC, 10211) und S. typhimurium (NCTC, 74). IPTG wurde zu all diesen Medien mit einer Konzentration von 3 mg pro 100 ml Columbia-Agar hinzugefügt. Alle Petrischalen werden bei 37°C über Nacht inkubiert.
Die für β-Galactosidase-Aktivität positiven Stämme (E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae und S. marcescens) hydrolysierten das Substrat nach der Über-Nacht-Inkubation sehr schnell, was zu einer Pinkfärbung führte, die nur auf die Bakterienkolonie beschränkt ist. Alle getesteten Konzentrationen ermöglichen es, die Spezies zu unterscheiden, jedoch beträgt die optimale Konzentration, um eine klar sichtbare Pinkfärbung ohne Hintergrundstörung zu erhalten, ungefähr 10 mg/100 ml. Eine Wachstumsinhibierung bezüglich der getesteten Konzentrationen konnte nicht beobachtet werden.
Beispiel 12: Verwendung von 8-Chlor-1,2-benzoresorufin-β-D-galactosid (CBR-gal) zur Detektion von Mikroorganismen mit β-Galactosidase-Aktivität in einem flüssigen Medium.
Das CBR-gal-Substrat wurde in einem flüssigen Medium mit verschiedenen Konzentrationen von 0,5 mg/ml bis 0,0078 mg/ml getestet. Das flüssige Reaktionsmedium, zu welchem das Substrat zugegeben wird, war aus einem Phosphatpuffer pH 7,4 mit 0,5% Nähstoffbrühe und 0,5% NaCl zusammengesetzt. 30 Mikroliter/ml IPTG wurden zu dem Medium bei allen Substratkonzentrationen hinzugefügt. Die getesteten Stämme sind E. coli (NCTC, 10418), K. pneumoniae (NCTC, 10896), P. rettgeri (NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC, 10211) und S. typhimurium (NCTC, 74) mit einer Beimpfung von 0,5 McFarland.

Alle Stämme mit β-Galactosidase-Aktivität bewirkten mit der Zeit eine Pinkfärbung, wie in der nachstehenden Tabelle V zusammengefasst ist. Tabelle V

		Konzentration des CBR-gal-Substrats
Organismen	0,5 mg/ml	0,25 mg/ml	0,125 mg/ml	0,0625 mg/ml	0,0313 mg/ml	0,0156 mg/ml	0,0078 mg/ml
E. coli	2*	2	4	4	24	-	-
K. pneumoniae	2	2	4	4	24	-	-
P. rettgeri	-	-	-	-	-	-	-
E. cloacae	2	2	4	4	24	-	-
S. marcescens	24	24	24	24	24	-	-
S. typhimurium	-	-	-	-	-	-	-

*: Die Ergebnisse sind in Stunden wiedergegeben.
„-" bedeutet fehlende Färbung, selbst nach 24 Std.

Claims

Enzymatisches Substrat mit der allgemeinen Formel (I):
in welcher X ein mit einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei die Phenylgruppe wahlweise in meta- oder para-Position substituiert ist; Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom darstellt, oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether- oder eine Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert mit einer Alkyl- oder Arylgruppe; R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen; R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können; R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist.
Enzymatisches Substrat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein Enzym der Familie der -Osidasen ist, wie β-Glucuronidase, β-Galactosidase, β-Glucosidase, 6-Phosphogalactohydrolase, α-Galactosidase, α-Amylase, α-Glucosidase, Hexosaminidasen wie N-Acetyl-β-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-galactosaminidase, ein Enzym der Familie der Esterasen, der Lipasen, der Phosphatasen, der Sulfatasen, der DNasen, der Peptidasen und der Proteasen.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R ein Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers ist, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose oder ein β-D-Glucuronat oder ein Phosphat, ein Sulfat, ein Acetat.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 der allgemeinen Formel (II):
in welcher R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ jeweils einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, R₅ H, NO₂, CF₃, CN, OCH₃, F, I, Cl, Br, SO₃H, CO₂H in meta- oder para-Position darstellt, und R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist.
Enzymatisches Substrat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, R₃ und R₄ ein Wasserstoffatom darstellen, R₅ ein Wasserstoffatom darstellt, R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers darstellt, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose, oder ein Sulfat oder ein Acetat.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 der allgemeinen Formel (III):
in welcher R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und welche identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ gemeinsam einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, R₅ H, NO₂, CF₃, CN, OCH₃, F, I, Cl, Br, SO₃H, CO₂H an meta- oder para-Position, und R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist.
Enzymatisches Substrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ gemeinsam einen fusionierten Benzolring darstellen, R₃ und R₄ ein Wasserstoffatom darstellen, R₅ H darstellt, R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers darstellt, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der allgemeinen Formel (IVa):
in welcher R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, vorzugsweise stellt R₁ H dar und R₂ Cl; R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar; R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist, insbesondere stellt R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 der allgemeinen Formel (IVb):
in welcher R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, vorzugsweise stellt R₁ H dar und R₂ Cl, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar; R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist, insbesondere stellt R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 der allgemeinen Formel (IVc):
in welcher A eine Aryl- oder Alkylgruppe darstellt, R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, vorzugsweise stellt R₁ H dar und R₂ Cl, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, vorzugsweise stellen R₃ und R₄ H dar; R eine Gruppe darstellt, derart, dass die O-R-Bindung durch ein Enzym hydrolysierbar ist, insbesondere stellt R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers dar, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Enzymatisches Substrat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ H darstellt und R₂ Cl, R₃ und R₄ H darstellen, R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers darstellt, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Enzymatisches Substrat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass R₁, R₃ und R₄ H darstellen, A ein Phenyl darstellt, R einen Rest vom Typ eines α- oder β-Zuckers darstellt, vorzugsweise β-D-Glucose oder β-D-Galactose.
Verfahren zur Synthese eines enzymatischen Substrats gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – Herstellen einer Zwischenverbindung mit der allgemeinen Formel (V),
in welcher X ein mit einer Phenylgruppe substituiertes Stickstoff- oder Kohlenstoffatom darstellt, wobei die Phenylgruppe wahlweise an meta- oder para-Position substituiert ist, Y und Z ein Wasserstoffatom darstellen, wenn X ein Kohlenstoffatom darstellt oder Y und Z gemeinsam eine Ether-, Thioether, oder Amin-Bindung darstellen, wahlweise substituiert durch eine Alkyl- oder Arylgruppe, R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, oder R₁ und R₂ einen substituierten oder unsubstituierten fusionierten Benzolring darstellen, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander H, Cl, F, I, Br darstellen und identisch oder unterschiedlich sein können, und – Anfügen einer Gruppe R, passenderweise einer Schutzgruppe, an die Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenverbindung der folgenden Formel (Va) entspricht
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenverbindung der folgenden Formel (Vb) entspricht
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenverbindung der folgenden Formel (Vc) entspricht
Zusammensetzung für die Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung von zumindest einem Mikroorganismus, wobei die Zusammensetzung zumindest ein enzymatisches Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 12 aufweist und ein für den oder die Mikroorganismen geeignetes Reaktionsmedium.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zumindest zwei Substrate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst und deren enzymati sche Hydrolyse zu Produkten führt, die sich hinsichtlich Farbe und/oder Fluoreszenz unterscheiden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein weiteres enzymatisches Substrat aufweist, welches sich von den Substraten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 unterscheidet und dessen enzymatische Hydrolyse zu einem Produkt führt, das sich hinsichtlich Farbe oder Fluoreszenz von demjenigen unterscheidet, welches durch enzymatische Hydrolyse des Substrats freigesetzt wird, welches gemäß Anspruch 17 verwendet wird, oder von denjenigen, die durch enzymatische Hydrolyse der Substrate freigesetzt werden, welche gemäß Anspruch 18 verwendet werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium fest, halbfest oder flüssig ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des enzymatischen Substrats in dem Reaktionsmedium zwischen 0,02 und 1 g/l beträgt, vorteilhafterweise zwischen 0,03 und 0,30 g/l, und vorzugsweise zwischen 0,04 und 0,10 g/l.
Diagnose-Kit mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 21 und mit einem Behälter für das Reaktionsmedium.
Verfahren zur Detektion und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung von zumindest einem Mikroorganismus in einer Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – In-Kontakt-Bringen des in einer Probe vorliegenden Mikroorganismus mit einem Reaktionsmedium, welches ein enzymatisches Substrat enthält, wie es in den Ansprüchen 1 bis 12 beschrieben ist, um ein beimpftes Medium zu erhalten, und – Detektieren des farbigen oder fluoreszierenden Produktes, welches durch Hydrolyse des enzymatischen Substrats gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das beimpfte Reaktionsmedium unter einer kontrollierten Atmosphäre inkubiert wird, wie bspw. unter aeroben, anaeroben, mikroaerophilen Bedingungen oder unter CO₂-Atmosphäre, vorzugsweise unter aeroben, mikroaerophilen und CO₂-Bedingungen.
Verwendung eines enzymatischen Substrats nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Detektion eines Analyten in Verfahren, bei welchen eine enzymatischen Aktivität zum Einsatz kommt, wie das ELISA-Verfahren, in welchem der Analyt ein Antikörper oder ein Antigen oder eine Nucleinsäure ist, oder molekularbiologische Verfahren, in welchen der Analyt ein Gen vom Typ der β-Galactosidase ist.