DE60037113T2

DE60037113T2 - Glycosyltransferase inhibitoren

Info

Publication number: DE60037113T2
Application number: DE60037113T
Authority: DE
Inventors: Shawn North Wales DeFREES
Original assignee: Abaron Biosciences Inc Del Mar; Abaron Biosciences Inc
Current assignee: Abaron Biosciences Inc Del Mar; Abaron Biosciences Inc
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: EP1185269A1; DE60037113D1; WO2001068095A1; EP1185269B1; ATE378421T1; EP1185269A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Glykosyltransferase-Inhibitoren. Verbindungen, die Glykosyltransferasen inhibieren, sowie Verfahren zu deren Identifizierung werden bereitgestellt. Es werden auch Verfahren zur Inhibierung von Glykosyltransferasen und Verfahren zur Modulation biologischer Prozesse, die eine Glykosylierung umfassen, bereitgestellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kohlenhydrate sind im Tier- und Pflanzenreich allgegenwärtig. Es ist bekannt, dass diese Strukturen in vielen biologischen Prozessen zahlreiche wichtige Rollen spielen. Kohlenhydrate sind beispielsweise an der interzellulären Erkennung in Säugetierzellen beteiligt. In Pilzen und Pflanzen stellen Kohlenhydrate eine wichtige Strukturkomponente in Zellwänden dar. Kohlenhydrate werden typischerweise von Enzymen synthetisiert, wie z. B. Glykosyltransferasen, bei denen es sich um eine Gruppe von Enzymen handelt, die ein Monosaccharid von einem aktivierten Zuckernucleotid zu Akzeptoroligosacchariden transferieren, die auf Glykoproteinen, Glykolipiden oder Polysacchariden zu finden sind. Aufgrund der Bedeutung der Glykosylierung in biologischen Systemen ist es höchst wünschenswert, wirksame Inhibitoren für Glykosyltransferasen und andere Enzyme zu entwickeln, die am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind. Während in den letzten Jahren der Entwicklung von Glykosyltransferase-Inhibitoren immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt wurde, wurde bisher noch über keine Glykosyltransferase-Inhibitoren berichtet, die die für eine therapeutische Verbindung erwünschten Eigenschaften aufweisen.
Der Großteil der Arbeit in Zusammenhang mit Glykosyltransferasen konzentrierte sich bisher auf hydrophile Analoga der Donor- und Akzeptorsubstrate dieser Enzyme (Hashimoto et al., J. Org. Chem. 62, 1914–1915 (1997); Hashimoto et al., J. Synth. Org. Ch. Japan 55, 325–333 (1997); Muller et al., Angewandte Chemie – International Edition 37, 2893–2897 (1998); Amann et al., Chemistry – A European Journal 4, 1106–1115 (1998); Murray et al., Biochemistry 36, 823–831 (1997); Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 5829–5830 (1999), Schmidt et al., Bioorg. Med. Chem. 3, 1747–1750 (1993); Miura et al., Bioorg. Med. Chem. 6, 1481–1489 (1998), und Palcic et al., J. Biol. Chem. 264, 17174–17181 (1989)). Die besten Inhibitoren liegen im Allgemeinen im μM-Bereich, aber für eine Sialyltransferase wurden Inhibitoren mit bis zu 14 nM erhalten (Muller et al., s. o.). Typischerweise sind die Inhibitoren negativ geladen, weshalb es unwahrscheinlich ist, dass sie oral verfügbar sind, es sei denn, eine geeignete Prodrugform wird identifiziert.
Die meisten Inhibitoren auf Akzeptorsubstrat-Basis sind synthetische Di- oder Trisaccharidakzeptoren, die an das Enzym binden, wobei die Hydroxylgruppe, zu der der Transfer gewöhnlicherweise erfolgt, entfernt (Desoxy-) oder substituiert (z. B. durch eine Aminogruppe) wird. Kajihara et al., Carbohydr. Res. 247, 179–193 (1993); Stults et al., Glycobiology 9, 661–668 (1999); Lu et al., Bioorg. Med. Chem. 4, 2011–2022 (1996); Lowary et al., Carbohydr. Res. 251, 33–67 (1994); Khan et al., J. Biol. Chem. 268, 2468–2473 (1993). Im Allgemeinen liegen die Ki-Werte der Inhibitoren im Bereich des Km-Werts des Akzeptorsubstrats, das sie ersetzen. Es wurde jedoch auch über Ki-Werte in einer Größenordnung von 10 μM für eine α-Galactosyltransferase (Lowary et al., s. o.) und für N-Acetylglucosaminyltransferase V (Khan et al., s. o.) berichtet.
Es wird nicht erwartet, dass die Klasse der Inhibitoren auf Oligosaccharid-Basis nach dem Stand der Technik Zellmembranen überwindet, und diese werden als mangelhafte Kandidaten für ein Therapeutikum erachtet. Verschiedene Gruppen haben jedoch gezeigt, dass Disaccharid-Akzeptorsubstrate, die auf geeignete Weise mit hydrophoben Aglykonen und/oder Acetylestern modifiziert wurden, leicht in Zellen eindringen und das Golgi-Kompartiment erreichen. Die terminale Glykosylierung von Glykoproteinen an der Zelloberfläche kann demnach aufgrund der kompetitiven Glykosylierung der Disaccharidsubstrate, die dann sekretiert werden, inhibiert werden (Neville et al., Biochem. J. 307, 791–797 (1995); Kuan et al., J. Biol. Chem. 264, 19271–19277 (1989); Sarkar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3323–3327 (1995); Sarkar et al., J. Biol. Chem. 272, 25608–25616 (1997)).
Es wurde gezeigt, dass es sich bei weiteren Verbindungen, wie z. B. N-Butyldesoxynojirimycin (NB-DNJ) und N-Butyldesoxygalactonojirimycin (NB-DGNJ), um Hemmer von Glucosylceramidsynthetase handelt. N-Butyldesoxynojirimycin ist besser als Glucosidase-Inhibitor bekannt, aber es wurde festgestellt, dass es das Enzym inhibiert, das die Synthese von Glucosylceramiden durch das Binden von Glucose an Ceramid initiiert (Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 8362–8365 (1994), und Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 27108–27114 (1994)). Es wurde gezeigt, dass NB-DNJ die Glykolipid-Synthese in Mäusen reduziert (Platt et al., J. Biol. Chem. 272, 19365–19372 (1997); Jeyakumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6388–6393 (1999), und Andersson et al., Biochem. Pharmacol. 59, 821–829 (2000)). Ähnliche Inhibitoren wurden für Fucosyltransferasen aufgezeigt, z. B. L. Qiao et al., JACS 118, S. 7653–7662 (1996).
Basierend auf den obenstehend beschriebenen Erkenntnissen ist klar, dass Verbindungen, die die Aktivität bestimmter Glykosyltransferasen spezifisch modulieren, nützlich sein können, um die Anzahl der biologischen Prozesse zu steuern. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an hochwirksamen Glykosyltransferase-Inhibitoren. Die vorliegende Erfindung wird diesem und anderen Bedürfnissen gerecht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Glykosyltransferase-Aktivität bereit, die vorzugsweise auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Kohlenhydratabschnitt der Enzymsubstrate, oder -produkte, und der Glykosyltransferase basieren. Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Inhibitoren können eingesetzt werden, um die Aktivität von Glykosyltransferasen zu inhibieren, die an der Synthese von Kohlenhydraten in Zusammenhang mit verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind. Es werden Verfahren offenbart, d. h. verschiedene Screening-Tests zur Identifizierung geeigneter Kandidaten.
Es werden therapeutische und weitere Anwendungen für diese Verbindungen bereitgestellt. Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Inhibitoren können beispielsweise zur Steuerung der Glykosyltransferase-Aktivität in vitro eingesetzt werden. Die Inhibitoren können beispielsweise eingesetzt werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zellkulturen zu inhibieren, die verwendet werden, um gewünschte Kohlenhydratstrukturen herzustellen. Die Inhibitoren können auch in geeigneter Weise zur Herstellung von Tiermodellen für Erkrankungen eingesetzt werden, indem die gewünschten Glykosyltransferasen in vivo selektiv inhibiert werden.
Die Erfindung stellt insbesondere Verfahren zum Design von Glykosyltransferase-Inhibitoren bereit. Die Verfahren umfassen die Bereitstellung einer Nichtkohlenhydrat-Testverbindung, die mit hydrophoben Gruppierungen (z. B. Aminosäureresten) an der aktiven Stelle der Glykosyltransferase in Wechselwirkung tritt. Die Testverbindung wird mit der Glykosyltransferase unter Bedingungen kontaktiert, die geeignet sind, damit die Glykosyltransferase ein Monosaccharid von einem Donorsubstrat zu einem Akzeptorsubstrat transferiert. Darauf folgt eine quantitative Detektion des glykosylierten Produkts zur Bestimmung des Ausmaßes der Senkung der Aktivität des Enzyms in Gegenwart der Testverbindung.
Gewöhnlicherweise umfasst die Verbindung eine Ringstruktur, die die Pyranoseringe des Akzeptorsubstrats, des Donorsubstrats oder des Reaktionsprodukts imitiert. Typischerweise handelt es sich bei dem Ring um eine planare Ringstruktur. Die Testverbindung kann beispielsweise einen aromatischen Ring, einen heteroaromatischen Ring oder eine aliphatische Ringstruktur aufweisen.
Eine beliebige Anzahl an Glykosyltransferasen aus eukaryotischen (z. B. Säugetieren, Insekten, Pflanzen oder Pilzen) oder prokaryotischen (z. B. Bakterien) Organismen kann in den Tests eingesetzt werden. Beispielsweise können Fucosyltransferasen (z. B. FTVII, FTIV oder FTIII), Sialyltransferasen (ST6Gal1 oder ST3Gal1) und Galactosyltransferasen (z. B. α(1,3)Gal T) eingesetzt werden. Die Glykosyltransferase kann in dem Test in Abhängigkeit von dem Testformat in einer Reihe verschiedener Formen vorhanden sein. Das Enzym kann beispielsweise in einer transgenen Zelle exprimiert werden, oder es kann in einer normalen Zelle konstitutiv exprimiert werden.
In den Tests ist das Mittel, durch welches Mittel das Produkt detektiert wird, nicht wesentlich, und die Wahl des Mittels hängt vom Testformat ab. Eines der Enzymsubstrate kann beispielsweise markiert sein (z. B. durch radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen und dergleichen), und das markierte Produkt wird detektiert. Alternativ dazu kann das Produkt unter Einsatz eines Antikörpers detektiert werden, der spezifisch mit dem Produkt immunreaktiv ist. Bevorzugte Testformate umfassen Hochdurchsatztests, die auf einem ELISA-Format basieren, radioaktive Säulentests und Zelltests.
Die in den Tests eingesetzten Testverbindungen sind, wie oben angemerkt, typischerweise so gestaltet, dass sie mit hydrophoben Resten an der aktiven Stelle der Zielglykosyltransferase in Wechselwirkung treten. Vorzugsweise werden Verbindungen oder Analoga davon mit zu diesem Zweck geeigneten Strukturen eingesetzt. Idealerweise weisen die Verbindungen einen IC50-Wert im nM-Bereich auf, wenn sie in den hierin beschriebenen Tests getestet werden. Demnach weisen die Inhibitoren gewöhnlicherweise einen IC50 von weniger als etwa 100 μM, gewöhnlicherweise von weniger als etwa 10 μM und oft von weniger als 100 nM, auf.
Definitionen
Die Bezeichnung Zucker bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine Kohlenhydratverbindung, die eine oder mehrere Saccharid-Einheiten und gewöhnlicherweise ein Aldehyd- oder Ketonderivat eines mehrwertigen Alkohols, insbesondere von fünf- und sechswertigen Alkoholen, umfasst. Für eine Beschreibung der Saccharidstruktur und deren Nomenklatur siehe Varki et al. (Hrsg.), Essentials of Glycobiology, Kapitel 2, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1999). Beispiele für Zucker und deren gewöhnlicherweise verwendete Abkürzungen lauten wie folgt:

Ara: = Arabinose
Fru: = Fructose
Fuc: = Fucose
Gal: = Galactose
GalNAc: = N-Acetylgalactosamin
Glc: = Glucose
GlcNAc: = N-Acetylglucosamin
Man: = Mannose
NeuAc: = N-Acetylneuraminsäure
Sia: = Sialsäure

Weitere Beispiele für Zucker umfassen Glucosamin, Galactosamin, Rhamnose, Ribose, Glucuronsäure, N-Acetylmuraminsäure, Xylose. Die Bezeichnung umfasst auch verschiedene Zuckerderivate, wie z. B. Desoxyderivate, Anhydrouronsäuren, Chlorderivate, Fluorderivate und Aminozucker (z. B. N-Butyldesoxynojirimycin).
Es wird angenommen, dass Oligosaccharide ein reduzierendes Ende und ein nicht reduzierendes Ende aufweisen, unabhängig davon, ob das Saccharid an dem reduzierenden Ende tatsächlich ein reduzierender Zucker ist. Gemäß der gültigen Nomenklatur werden Oligosaccharide hierin mit dem nicht reduzierenden Ende auf der linken und dem reduzierenden Ende auf der rechten Seite dargestellt.
Alle hierin beschriebenen Oligosaccharide werden mit dem Namen oder der Abkürzung für das nicht reduzierende Saccharid (z. B. Gal) gefolgt von der Anordnung der Glykosidbindung (α oder β), der Ringbindung, der Ringposition des an der Bindung beteiligten reduzierenden Saccharids und dem Namen oder der Abkürzung des reduzierenden Saccharids (z. B. GlcNAc) beschrieben. Die Bindung zwischen zwei Zuckern kann beispielsweise als 2,3, 2→3 oder (2,3) ausgedrückt werden. Bei allen Sacchariden handelt es sich um Pyranosen.
In der Beschreibung von chemischen Verbindungen werden die Bezeichnungen im Allgemeinen gemäß ihrer Standardbedeutung verwendet. Die Bezeichnung "Alkyl" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen verzweigten oder unverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, einwertigen oder zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, umfassend Niederalkyle mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Butyl, n-Hexyl und dergleichen, Cycloalkyle (3–7 Kohlenstoffatome), Cycloalkylmethyle (4–8 Kohlenstoffatome) und Arylalkyle.
Die Bezeichnung "Alkoxy" bezieht sich auf Alkylreste, die durch ein Sauerstoffatom an den Rest des Moleküls gebunden sind, z. B. Ethoxy, Methoxy oder n-Propoxy.
Die Bezeichnung "Acyl" bezieht sich auf einen Rest, der von einer organischen Säure durch die Entfernung der Hydroxylgruppe abgeleitet wird. Beispiele umfassen Acetyl, Propionyl, Oleoyl, Myristoyl.
Die Bezeichnung "Aryl" bezieht sich auf einen aromatischen einwertigen carbozyklischen Rest mit einem einzigen Ring (z. B. Phenyl) oder kondensierten Mehrfachringen (z. B. Naphthyl), die gegebenenfalls unabhängig voneinander mit Alkyl, Niederalkyl, Cycloalkyl, Hydroxyniederalkyl, Aminoniederalkyl, Hydroxyl, Thiol, Amino, Halogen, Nitro, Niederalkylthio, Niederalkoxy, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Acyl, Hydroxycarbonyl, Niederalkoxycarbonyl, Hydroxysulfonyl, Niederalkoxysulfonyl, Niederalkylsulfonyl, Niederalkylsulfinyl, Trifluormethyl, Cyano, Tetrazoyl, Carbamoyl, Niederalkylcarbamoyl und Diniederalkylcarbamoyl mono-, di- oder tri-substituiert sein können. Alternativ dazu können zwei benachbarte Positionen des aromatischen Rings mit einer Methylendioxy- oder Ethylendioxygruppe substituiert sein.
Die Bezeichnung "Heteroaryl" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf aromatische Ringe, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome des aromatischen Rings/der aromatischen Ringe durch ein Heteroatom, wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, substituiert sind. Heteroaryl bezieht sich auf Strukturen, bei denen es sich um einen einzelnen aromatischen Ring, einen aromatischen Mehrfachring/aromatische Mehrfachringe oder einen oder mehrere an einen oder mehrere nicht-aromatische Ringe gebundene aromatische Ringe handeln kann. In Strukturen mit Mehrfachringen können die Ringe kondensiert, kovalent gebunden oder an eine gemeinsame Gruppe, wie z. B. eine Methylen- oder Ethylengruppierung, gebunden sein. Die gemeinsame Linkergruppe kann auch ein Carbonyl sein, wie z. B. in Phenylpyridylketon. Wie hierin verwendet sind Ringe, wie z. B. Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan etc., oder benzokondensierte Analoga dieser Ringe durch die Bezeichnung "Heteroaryl" definiert. Geeigneterweise werden Verbindungen oder Analoga davon mit für diesen Zweck geeigneten Strukturen eingesetzt.
Beispiele für geeignete Klassen von Verbindungen, die Heteroaryl-Ringstrukturen aufweisen, umfassen Chinoline, Arylsulfonamide, Phenothiazine, Carbazole, Benzamide und Benzopyranone, sind aber nicht auf diese beschränkt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wechselwirkung der hydrophoben Oberfläche eines Akzeptorsubstrats mit hydrophoben Resten an der aktiven Stelle einer Glykosyltransferase:
1A zeigt die Wechselwirkung zwischen einem Monosaccharid und der aktiven Stelle einer Glykosyltransferase;
1B zeigt die Wechselwirkung zwischen einem Oligosaccharid und der aktiven Stelle einer Glykosyltransferase;
1C zeigt ein an eine Glykosyltransferase gebundenes Disaccharid;
1D zeigt das Inhibitor-Designkonzept der vorliegenden Erfindung;
1E zeigt Inhibitor-Glykosyltransferase-Wechselwirkungen.
2 zeigt die Schritte in einem erfindungsgemäßen Test des ELISA-Formats.
3 zeigt die Schritte in einem erfindungsgemäßen radioaktiven Säulentest.
4 zeigt die Schritte in einem erfindungsgemäß zellbasierten Test.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Glykosyltransferase-Inhibitoren bereit. Glykosyltransferasen katalysieren den Transfer eines Monosaccharids von einem Zuckernucleotid, dem Donorsubstrat, zu einem Akzeptorsubstrat. Bei dem Akzeptorsubstrat kann es sich im Wesentlichen um eine beliebige andere Gruppe handeln, die in der Lage ist, einen Glykosylrest, umfassend, aber nicht ausschließlich, Glykosylreste, Polypeptide und Lipide, zu akzeptieren. Die Wahl des geeigneten Substrats hängt typischerweise von der Spezifizität der Transferase ab. Für allgemeine Informationen siehe Beyer et al., Adv. in Enzym. 52, 24 (1981).
Die Strukturen derzeit bekannter Glykosyltransferase-Inhibitoren basieren hauptsächlich auf hydrophilen Strukturmotiven, die in dem Donorsubstrat zu finden sind (d. h. Hydroxylgruppen-Anordnungen). Im Gegensatz dazu basieren die Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden sollen, auf hydrophoben Strukturmotiven, die in dem Kohlenhydratabschnitt des Akzeptor- oder Donorsubstrats für die Enzyme und auch in den Produkten der enzymatischen Reaktion zu finden sind (siehe z. B. Bourne et al., Current Opinion in Structural Biology 3, 681–686 (1993), und Gabius et al., Pharm. Res. 15, 23–30 (1998)). Die identifizierten Inhibitoren und Testverfahren der vorliegenden Erfindung nutzen demnach die hydrophoben Wechselwirkungen, die in der Erkennung des Akzeptorsubstrats durch die Glykosyltransferase eine Rolle spielen. In der Folge weisen die Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden sollen, vorzugsweise hydrophobe Eigenschaften auf und sind Nichtkohlenhydrat-Verbindungen, die mit hydrophoben Aminosäuren an der aktiven Stelle des Zielenzyms in Wechselwirkung treten und mit dem Akzeptorsubstrat, dem Donorsubstrat oder dem Produkt konkurrieren. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass hydrophobe Reste an der aktiven Stelle signifikant zur Erkennung des natürlichen Akzeptorsubstrats oder des Produkts der enzymatischen Reaktion beitragen. Insbesondere treten sperrige aromatische Reste (z. B. Tyr, Trp und Phe) oder aliphatische Reste (z. B. Leu, Ile und Val) mit der hydrophoben Oberfläche der Zucker in dem Akzeptorsubstrat oder dem Produkt in Wechselwirkung (siehe 1).
Die Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden sollen, basieren zumindest teilweise auf der Erkenntnis, dass Zucker mit der aktiven Stelle von Glykosyltransferasen durch hydrophobe Wechselwirkungen in Wechselwirkung treten (siehe z. B. 1C). Wie in 1C dargestellt weisen Zucker, basierend auf der Ausrichtung der Hydroxylgruppen, typischerweise ein hydrophobes Strukturmotiv auf, das mit hydrophoben Aminosäureresten in dem Protein in Wechselwirkung tritt. Die Inhibitoren imitieren die hydrophobe Wechselwirkung oder die Struktur der Zuckersubstrate.
Diese Nichtkohlenhydrat-Inhibitoren werden somit aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, jene Abschnitte des Akzeptor- oder Donorsubstrats und/oder des enzymatischen Produkts zu imitieren, die mit den hydrophoben Resten an der aktiven Stelle in Wechselwirkung treten. Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Offenbarung können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung viele verschiedene potentielle Glykosyltransferase-Inhibitoren entwickeln und testen. Typischerweise werden die Inhibitoren aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die Struktur und die Anordnung der Pyranoseringe eines oder mehrerer Zucker in dem Donor- oder Akzeptorsubstrat zu imitieren. Wenn das Akzeptorsubstrat beispielsweise mehr als einen Zucker enthält, kann der Inhibitor so entwickelt werden, dass er die räumliche Ausrichtung zwischen den Zuckern in dem Substrat oder dem Produkt imitiert.
Da diese Inhibitoren auf hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Enzym basieren, kann die Gestaltung der Inhibitoren durch die Vorhersage der relativen Hydrophobie von Kandidatenverbindungen erleichtert werden. Mittel zur Bestimmung der Hydrophobie von Verbindungen sind bekannt. Typischerweise wird die Hydrophobie durch die Hansch-Konstante ausgedrückt. Die Hansch-Konstante ist ein Maß dafür, wie sehr ein gelöster Stoff zu hydrophoben Wechselwirkungen in der Lage ist, basierend auf dem Verteilungskoeffizienten P für die Verteilung des gelösten Stoffs zwischen Octanol und Wasser. Am allgemeinsten wird P als logP angewandt.
Selektivität und/oder eine gesteigerte Affinität der Inhibitoren in Bezug auf bestimmte Glykosyltransferasen kann durch die Zugabe von Substituenten, die die Hydrophobie der Testverbindung beeinflussen, zu einer Kernstruktur erreicht werden. Das Verhalten verschiedener Substituenten kann durch eine Substituentenkonstante π quantifiziert werden. In Abhängigkeit von der als Referenz herangezogenen Kernstruktur gibt es verschiedene Skalen für π. Tabellen, die π-Konstanten für Substituenten anführen, sind verfügbar (siehe z. B. Hansch und Leo, "Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology", Wiley, New York (1979); Hansch et al., J. Med. Chem. 20, 304 (1977); Hansch et al., J. Med. Chem. 16, 1207 (1973)). Unter Einsatz dieser Information kann die relative Hydrophobie verschiedener Substitutionen ermittelt werden und zur Entwicklung von Inhibitoren herangezogen werden.
Inhibitoren, die durch die Erfindung identifiziert werden sollen, umfassen typischerweise eine oder mehrere hydrophobe Gruppen. Gewöhnlicherweise umfassen die Verbindungen aromatische, heteroaromatische, aromatische Mehrfachring- oder aliphatische Ringstrukturen oder eine hydrophobe Gruppe, die mit den hydrophoben Resten an der aktiven Stelle in Wechselwirkung tritt. Basierend auf den oben beschriebenen hydrophoben Wechselwirkungen und den oben beschriebenen Substituentenkonstanten können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung eine Reihe von Testverbindungen identifizieren oder synthetisieren, die diese Kriterien erfüllen. Um Inhibitoren zu identifizieren, können die Testverbindungen auf geeignete Weise in Standardtests gescreent werden, um ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Aktivität des ausgewählten Enzyms zu bestimmen.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung erkennen, dass die Inhibitoren weiter modifiziert werden können, um verschiedene hydrophile oder geladene Gruppen zu umfassen, um ihre Potenz zu optimieren. Diese Gruppierungen können beispielsweise eingesetzt werden, um die Avidität, Löslichkeit, Bioverfügbarkeit oder andere Aspekte der Pharmakodynamik der Verbindungen zu optimieren.
Die Inhibitoren können zur Inhibierung der Aktivität von an der Synthese von Kohlenhydraten beteiligten Enzymen eines beliebigen Organismus eingesetzt werden. Geeignete Pilz-, Bakterien-, Insekten- und Pflanzenenzyme umfassen Chitinsynthase, Saccharosesynthase, Invertase und andere Enzyme, die im Kohlenhydratstoffwechsel und in der Kohlenhydratbiosynthese eine Rolle spielen. Veranschaulichende biosynthetische Wege umfassen die Zellwandbiosynthese, die Polysaccharidbiosynthese und die Lipopolysaccharidbiosynthese (siehe beispielsweise Alberts et al. (Hrsg.), Molecular Biology of the Cell (2. Aufl.), Garland Publishing, Inc., London (1989); Dey et al. (Hrsg.), Plant Biochemistry, Academic Press, San Diego (1997)).
In Säugetieren und anderen Organismen sind Glykosyltransferasen basierend auf der Art des transferierten Zuckerrests in Familien gruppiert. Enzyme, die Sialsäure transferieren, werden beispielsweise als Sialyltransferasen bezeichnet, jene, die Fucose transferieren, als Fucosyltransferasen und jene, die Galactose transferieren, als Galactosyltransferasen. In jeder Familie gibt es typischerweise 10–15 verschiedene Enzyme, die erforderlich sind, um verschiedene Kohlenhydratstrukturen, die auf Glykoproteinen und Glykolipiden tierischer Zellen vorhanden sind, zu entwickeln. Jedes Enzym stellt in Abhängigkeit von den Donor- und Akzeptorsubstraten, die es verwendet, und der bei der Transferreaktion gebildeten anomerischen Bindung eine definierte Struktur her.
Eine Reihe von Fucosyltransferasen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Kurz gesagt umfassen Fucosyltransferasen ein beliebiges der Enzyme, die L-Fucose von GDP-Fucose zu einer Hydroxyposition eines Akzeptorzuckers transferieren. In manchen Ausführungsform handelt es sich bei dem Akzeptorzucker beispielsweise um GlcNAc in einer Galβ(1→3,4)GlcNAc-Gruppe in einem Oligosaccharidglykosid. Geeignete Fucosyltransferasen für diese Reaktion umfassen die bekannte Galβ(1→3,4)GlcNAcα(1→3,4)-Fucosyltransferase (FucT-III E. C. Nr. 2.4.1.65), die aus menschlicher Milch erhalten wird (siehe z. B. Palcic et al., Carbohydrate Res. 190, 1–11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256, 10456–10463 (1981), und Nunez et al., Can. J. Chem. 59, 2086–2095 (1981)), sowie die βGal(1→4)βGlcNAcα(1→3)-Fucosyltransferasen (FucT-IV, FucT-V, FucT-VI und FucT-VII, E. C. Nr. 2.4.1.65), die in menschlichem Serum zu finden sind. Eine rekombinante Form von βGal(1→3,4)βGlcNAcα(1→3,4)-Fucosyltransferase ist ebenfalls verfügbar (siehe Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1, 425–428 (1991), und Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4, 1288–1303 (1990)). Weitere Beispiele für Fucosyltransferasen umfassen α1,2-Fucosyltransferase (E. C. Nr. 2.4.1.69). Eine α1,3-Fucosyltransferase IX (Nucleotidsequenzen von menschlicher und Maus-FucT-IX) sind in Kaneko et al., FEBS Lett. 452, 237–242 (1999), und die chromosomale Lokalisierung des menschlichen Gens ist in Kaneko et al., Cytogenet. Cell Genet. 86, 329–330 (1999), beschrieben. α1,3-Fucosyltransferasen, über die kürzlich berichtet wurde und die ein N-gebundenes GlcNAc als Akzeptor nutzen, von der Schnecke Lymnaea stagnalis und von der Mungobohne werden in van Tetering et al., FEBS Lett. 461, 311–314 (1999), bzw. Leiter et al., J. Biol. Chem. 274, 21830–21839 (1999), beschrieben. Zusätzlich dazu gibt es bakterielle Fucosyltransferasen, wie z. B. die α(1,3/4)-Fucosyltransferase von Helicobacter pylori, wie in Rasko et al., J. Biol. Chem. 275, 4988–4994 (2000), beschrieben, sowie die α1,2-Fucosyltransferase von H. pylori (Wang et al., Microbiology 145, 3245–3253 (1999)). Siehe auch E. Staudacher, Trends in Glycoscience and Glycotechnology 8, 391–408 (1996), für die Beschreibung von für die Erfindung nützlichen Fucosyltransferasen.
Beispiele für Galactosyltransferasen umfassen α1,3-Galactosyltransferasen (E. C. Nr. 2.4.1.151, siehe z. B. Dabkowski et al., Transplant. Proc. 25, 2921 (1993), und Yamamoto et al., Nature 345, 229–233 (1990), Rind (GenBank j04989), Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264, 14290–14297 (1989), Maus (GenBank m26925), Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8227–8231 (1989), Schwein (GenBank L36152), Strahan et al., Immunogenetics 41, 101–105 (1995)). Eine weitere α1,3-Galactosyltransferase ist an der Synthese des Antigens der Blutgruppe B (EC 2.4.1.37) beteiligt, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265, 1146–1151 (1990) (menschlich). Weitere umfassen α1,4-Galactosyltransferasen, zu denen beispielsweise EC 2.4.1.90 (LacNAc-Synthetase) und EC 2.4.1.22 (Lactosesynthetase) (Rind (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183, 211–217 (1989)), menschlich (Masri et al., J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 657–663 (1988)), Maus (Nakazawa et al., J. Biochem. 104, 165–168 (1988))) sowie EC 2.4.1.38 und die Ceramidgalactosyltransferase (EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38, 234–242 (1994)) gehören. Weitere geeignete Galacto syltransferasen umfassen beispielsweise α1,2-Galactosyltransferasen (beispielsweise von Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol. Biol. Cell 5, 519–528 (1994)).
Menschliche Serin/Threonin-gebundene Oligosaccharide (O-Glykane) werden gewöhnlicherweise mit der Golgi-Enzymkern-2-β-1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase (C2 GlcNAcT) synthetisiert. Es wird angenommen, dass Kern-2-O-Glykane wesentlich für die Mucin-Produktion und die Selectin-Ligandenbiosynthese ist. Mäuse, denen C2 GlcNAcT fehlt, wiesen einen eingeschränkten Phänotyp mit Neutrophilie und einen teilweisen Selectin-Liganden-Mangel auf. Studien deuten darauf hin, dass die Kern-2-Oligosaccharid-Biosynthese die physiologischen Rollen der Selectine segregiert, und zeigen eine Funktion von C2 GlcNAcT bei der Myeloid-Homöostase und bei Entzündungen auf. Ellies et al., Immunity 9, 881–890 (1998), WO 99/27465 .
Sialyltransferasen umfassen ST3Gal III, ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNac I, ST6GalNAc II und ST6GalNAc III (die hierin verwendete Sialylstransferasen-Nomenklatur ist in Tsuji et al., Glycobiology 6, v-xiv (1996), beschrieben). Eine beispielhafte α2,3-Sialystransferase (EC 2.4.99.6) transferiert Sialsäure zu der nicht reduzierenden terminalen Gal von Galβ1-4GlcNAc-Disacchrid oder -Glykosid. Siehe Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256, 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257, 13845 (1982), und Wen et al., J. Biol. Chem. 267, 21011 (1992). Eine weitere beispielhafte α2,3-Sialyltransferase (EC 2.4.99.4) transferiert Sialsäure zu der nicht reduzierenden terminalen Gal eines Galβ1→3GalNAc-Disaccharids oder -Glykosids. Siehe Rearick et al., J. Biol. Chem. 254, 4444 (1979), und Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267, 12004 (1992). Weitere beispielhafte Enzyme umfassen Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-Sialyltransferase (siehe Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219, 375–381 (1994)).
Einige Immunantworten werden teilweise durch 2,6-Sialylgalactoside und 2,3-Sialylgalactoside vermittelt. Diese Sialylgalactoside sind Liganden für Zelloberflächenmoleküle, die an der interzellulären Haftung und Signalübertragung beteiligt sind, wie z. B. CD22. Die 2,6-Sialylgalactoside sind typischerweise an der Modulation von durch B-Zellen vermittelten Immunantworten beteiligt, während die 2,3-Sialylgalactoside im Allgemeinen an durch T-Zellen vermittelten Immunantworten beteiligt sind (siehe z. B. WO 98/54365 ).
Weitere Glykosyltransferasen umfassen beispielsweise Glucosyltransferasen, z. B. Alg8 (Stagljov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5977 (1994)) oder Alg5 (Heesen et al., Eur. J. Biochem. 224, 71 (1994)), N-Acetylgalactosaminyltransferasen, wie z. B. β(1,3)-N-Acetylgalactosaminyltransferase, β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferasen ( US-Patent Nr. 5.691.180 ; Nagata et al., J. Biol. Chem. 267, 12082–12089 (1992), und Smith et al., J. Biol. Chem. 269, 15162 (1994)), und Polypeptid-N-Acetylgalactosaminyltransferase (Homa et al., J. Biol. Chem. 268, 12609 (1993)). Geeignete N-Acetylglucosaminyltransferasen umfassen GnTI (2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176, 608 (1991)), GnTII und GnTIII (Ihara et al., J. Biochem. 113, 692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al., J. Biol. Chem. 268, 15381 (1993)), O-gebundene N-Acetylglucosaminyltransferase (Bierhuizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9326 (1992)), N-Acetylglucosamin-1-phosphattransferase (Rajput et al., Biochem. J. 285, 985 (1992)) und Hyaluronansynthase.
Enzyme, die an der Proteoglykan-Synthese beteiligt sind, beispielsweise N-Acetylgalactosaminyltransferase I (EC 2.4.1.174), sowie Enzyme, die an der Chondroitinsulfatsynthese beteiligt sind, wie z. B. N-Acetylgalactosaminyltransferase II (EC 2.4.1.175), sind ebenfalls von Interesse. Geeignete Mannosyltransferasen umfassen α(1,2)-Mannosyltransferase, α(1,3)-Mannosyltransferase, β(1,4)-Mannosyltransferase, Dol-P-Man-Synthase, OCh1 und Pmt1. Xylosyltransferasen umfassen beispielsweise Proteinxylosyltransferase (EC 2.4.2.26).
Derzeit bevorzugte Inhibitoren wirken auf aus FTIII, FTVII, α(1,3)-Galactosyltransferase, ST6Gal I, ST3Gal I, GlcNAc-Transferase, α(1,3)-Gal-Transferase und UDP-MurNAc-Transferase, UDPGlcNAc:MurNAc-Transferase ausgewählte Enzyme.
Glykosyltransferase-Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden können
Wie obenstehend angemerkt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Inhibierung von Glykosyltransferasen bereit. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren einer Glykosyltransferase mit einem Inhibitor, der ein hydrophobes Strukturmotiv eines Zuckers imitiert, das durch die Glykosyltransferase (z. B. in einem Akzeptor- oder Donorsubstrat) erkannt wird, wodurch die Glykosyltransferase inhibiert wird. In einem bevorzugten Aspekt handelt es sich bei dem Inhibitor um eine hydrophobe Nichtkohlenhydrat-Verbindung, die mit den hydrophoben Aminosäureresten der aktiven Stelle der Glykosyltransferase in Wechselwirkung tritt.
Die Inhibitoren umfassen gewöhnlicherweise eine carbozyklische (aliphatische oder aromatische) Ringstruktur. Typischerweise umfassen die Inhibitoren eine Aryl- oder Heteroaryl-Gruppierung, die die hydrophobe Struktur oder Oberfläche des Zuckers imitiert. Typischerweise weisen die Ringe der Inhibitoren eine ähnliche Größe auf wie die Ringstruktur des Zuckersubstrats. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Inhibitoren eine Heteroaryl-Gruppe, wie z. B., aber nicht ausschließlich, Chinoline, Phenylsulfonamide, Phenothiazine, Carbazole, Benzamide und Benzopyranone oder Derivate davon. Weitere bevorzugte Heteroaryl-Gruppierungen umfassen Carbazole und Phenothiazine oder Derivate davon. Weitere Inhibitoren umfassen Heteroaryl-Gruppierungen, wie z. B. Thiophen, Pyridine, Isoxazole, Phthalimide, Pyrazole, Indole und Furane oder Derivate davon.
Eine Reihe von Heteroaryl-Derivaten sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Diese Gruppen umfassen beispielsweise Derivate von 2-Azanaphthalenyl, Benzoxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 3-Pyrazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, Pyrazinyl, 2-Oxazolyl, 4-Oxazolyl, 2-Phenyl-4-oxazolyl, 5-Oxazolyl, 3-Isoxazolyl, 4-Isocazolyl, 5-Isoxazolyl, 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl, 5-Thiazolyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Pyrimidyl, 4-Pyrimidyl, 5-Benzothiazolyl, Purinyl, 2-Benzimidazolyl, 5-Indolyl, 1-Isochinolyl, 5-Isochinolyl, 2-Chinoxalinyl, 5-Chinoxalinyl, 3-Chinolyl, 6-Chinolyl, Thiobenzoxazolyl, Thiobenzothi azolyl und Thiobenzimidazolyl. Die Heteroaryl-Gruppe kann kovalent an andere funktionelle Gruppen gebunden sein, um ein hydrophobes Strukturmotiv zu bilden, das das Akzeptorsubstrat imitiert.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die Heteroaryl-Derivate der vorliegenden Erfindung unter Einsatz komplementärer funktioneller Gruppen hergestellt werden können. Die Reaktion dieser beiden funktionellen Gruppen, eine an der Heteroaryl-Gruppe und die andere an dem Derivat, stellt die gewünschte Bindung bereit. Die Heteroaryl-Gruppe kann beispielsweise eine Amin-funktionelle Gruppe aufweisen, und bei der funktionellen Gruppe an dem Derivat kann es sich um eine aktivierte Carboxylgruppe handeln, wie z. B. ein Acylchlorid oder einen NHS-Ester. Das Umsetzen von zwei komplementären funktionellen Gruppen miteinander führt zur Bildung einer Amidbindung zwischen der Heteroaryl-Gruppe und dem Derivat. Durch die geeignete Wahl der reaktiven Gruppen kann die gewünschte Bindung des Heteroaryl-Derivats erzielt werden.
In bestimmten Aspekten werden Inhibitoren aufgrund ihres logP-Werts ausgewählt. Der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient für Inhibitoren kann empirisch bestimmt oder unter Einsatz von Software-Programmen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, vorhergesagt werden. In einem Aspekt wird Software von Advance Chemistry Development (ACD) eingesetzt. Das ACD-Programm berechnet beispielsweise einen genauen logP (Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient) in ±0,3-logP-Einheiten (siehe www.acdlabs.com). In einem bevorzugten Aspekt liegen der logP des natürlichen Akzeptorsubstrats der Glykosyltransferase und der Inhibitor-Verbindung in Bezug aufeinander innerhalb von 3 Einheiten und weisen vorzugsweise einen Abstand von etwa 1 Einheit bis etwa 2 Einheiten.
Im Allgemeinen umfasst die Enzym-Inhibierung die Wechselwirkung einer Substanz mit einem Enzym, um die Geschwindigkeit der durch das Enzym katalysierten Reaktion zu reduzieren. Inhibitoren können gemäß verschiedener Kriterien klassifiziert werden. Sie können beispielsweise reversibel oder irreversibel sein. Ein irreversibler Inhibitor dissoziiert, wenn überhaupt, sehr langsam von seinem Zielenzym, da er, ko valent oder nicht kovalent, sehr fest an das Enzym gebunden wird. An einer reversiblen Inhibierung ist im Gegensatz dazu ein Enzym-Inhibitor beteiligt, der dissoziieren kann.
Inhibitoren könne auch danach klassifiziert werden, ob es sich um kompetitive, nicht-kompetitive oder unkompetitive Inhibitoren handelt. Bei der kompetitiven Inhibierung kinetisch einfacher Systeme mit einem einzigen Substrat kann das Enzym entweder an das Substrat oder den Inhibitor binden, aber nicht an beide. Typischerweise sind kompetitive Inhibitoren dem Substrat oder dem Produkt/den Produkten ähnlich und binden an die aktive Stelle des Enzyms, wodurch die Bindung des Substrats an die aktive Stelle blockiert wird. Ein kompetitiver Inhibitor senkt die Katalysegeschwindigkeit, indem er die Affinität des Substrats in Bezug auf das Enzym wirksam reduziert. Typischerweise kann ein Enzym aufgrund von Gleichgewichtsgründen durch sein eigenes Produkt kompetitiv inhibiert werden. Da es sich bei dem Enzym um einen Katalysator handelt, ist es grundsätzlich in der Lage, eine Reaktion vorwärts oder rückwärts zu beschleunigen. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform konkurrieren die Enzym-Inhibitoren mit dem Akzeptorsubstrat.
Nichtkompetitive Inhibitoren ermöglichen, dass das Enzym an das Substrat bindet, während es gleichzeitig an den Inhibitor bindet. Ein nichtkompetitiver Inhibitor wirkt durch die Senkung der Wechselzahl eines Enzyms anstatt durch die Reduzierung der freien Enzymmenge. Eine weitere mögliche Kategorie der Inhibierung ist die gemischte oder unkompetitive Inhibierung, bei der der Inhibitor die Bindungsstelle beeinflusst und somit die Wechselzahl des Enzyms verändert. Die Enzym-Inhibierung kinetisch komplexer Systeme mit mehr als einem Substrat, wie dies bei Glykosyltransferasen der Fall ist, ist in Segel, Enzyme Kinetics, Wiley, NY (1975), beschrieben.
Tests
Nachdem die Verbindungen synthetisiert oder identifiziert wurden, werden sie in Standardtests getestet, um das Ausmaß der durch jede Verbindung erzielten Inhibie rung der Aktivität der Ziel-Glykosyltransferase zu bestimmen. Die Glykosyltransferase-Aktivität und deren Inhibierung werden typischerweise gemäß Standardverfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität getestet. Für eine allgemeine Erläuterung der Enzymtests siehe Rossomando, "Measurement of Enzyme Activity", in: Deutscher (Hrsg.), Guide to Protein Purification, Band 182, Methods of Enzymology (1990), und Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2. Aufl. (1985).
Ein Test in Bezug auf die Glykosyltransferase-Aktivität enthält typischerweise eine gepufferte Lösung, die auf den physiologischen pH angepasst ist, eine Quelle zweiwertiger Kationen, ein Donorsubstrat, ein Akzeptorsubstrat, Glykosyltransferase und die Testverbindung. Nach einer vorbestimmten Zeit bei 23°C oder 37°C wird die Reaktion beendet, und das Produkt wird isoliert und gemäß Standardverfahren quantifiziert. Glykosyltransferase-Tests, bei denen ein UV-markierter Akzeptor eingesetzt wird, liefern beispielsweise ein UV-markiertes Produkt, das leicht durch Umkehrphasen-HPLC abgetrennt und mittels UV-Spektroskopie quantifiziert werden kann, wie in Schaub et al., Glycoconjugate J. 15, 345–354 (1998), beschrieben. Siehe auch Kajihara et al., Carbohydr. Res. 264, C1–C5 (1994); J. Org. Chem. 60, 5732–5735 (1995).
Um eine effiziente Identifizierung der Testverbindungen mit inhibierender Aktivität zu unterstützen, sind Testformate zu bevorzugen, die eine rasche Analyse einer großen Anzahl von Testverbindungen ermöglichen. Beispielsweise können Hochdurchsatztests auf Basis des ELISA-Formats eingesetzt werden (2). In diesen Tests wird eine der Komponenten des Tests (gewöhnlicherweise der Akzeptorzucker) auf einer festen Oberfläche (z. B. dem Well einer Mikrotiterplatte) immobilisiert. Ein Glykoprotein, das den Akzeptorzucker umfasst, kann auf geeignete Weise eingesetzt werden. Die anderen Komponenten werden zugesetzt, und das Gemisch wird unter Bedingungen, die für die Synthese des Endprodukts geeignet sind, inkubiert. Ein markierter Antikörper, der spezifisch mit dem Produkt reaktiv ist, wird eingesetzt, um das Vorhandensein des Endprodukts zu detektieren. Zur Quantifizierung des durch den markierten Antikörper erzeugten Signals können Standardmittel eingesetzt werden.
Alternativ dazu können radioaktive Säulentests auf geeignete Weise eingesetzt werden (3). Bei diesen Verfahren ist entweder der Donor- oder der Akzeptorzucker radioaktiv markiert (z. B. unter Einsatz von ¹⁴C oder ³H). Die anderen Komponenten werden zugesetzt und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Das Produkt wird dann aus den nicht umgesetzten Zuckern unter Einsatz einer Säulenchromatographie isoliert (z. B. anhand von Größe oder Ladung getrennt). Die Radioaktivität der Fraktionen, die das Produkt enthalten, wird gemessen, um die Menge des erzeugten Produkts zu bestimmen.
In manchen Ausführungsformen werden Tests auf Zellbasis eingesetzt (4). In diesen Tests wird eine Zelle, die das Endprodukt nicht natürlich erzeugt, mit Nucleinsäuren transfiziert, die für die gewünschte Glykosyltransferase kodieren. Die übrigen Komponenten, die nicht durch die Zelle bereitgestellt werden, werden zugesetzt, und die Fähigkeit der Zelle, das Produkt zu erzeugen, wird detektiert, typischerweise unter Einsatz eines markierten Antikörpers. Mittel zur rekombinanten Expression der gewünschten Glykosyltransferasen und zum Detektieren des Vorhandenseins neuer Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche sind bekannt (siehe US-Patente Nr. 5.324.663 und 5.595.900 ).
Testverbindungen, die gute inhibierende Eigenschaften aufweisen, können in In-vitro-Zelltests oder an Labortieren weiter in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung verschiedener Reaktionen (z. B. Immun- oder Entzündungsreaktionen) getestet werden. Tests, die zum Testen der Wirkung eines Glykosyltransferase-Inhibitors auf andere Arten von Immunreaktionen geeignet sind, umfassen beispielsweise B-Zell-Proliferationstests, CTL-Aktivierungstests und dergleichen. Solche Tests sind beispielsweise in Hennet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4504–4509 (1998), beschrieben. Zusätzlich dazu können weitere Untersuchungen durchgeführt werden, wie z. B. jene, die für die Analyse des zeitlichen Verlaufs von Arzneimitteln im Körper in Bezug auf deren Absorption, Verteilungsstoffwechsel und Eliminierung (ADME) gestaltet sind. Verschiedene Protokolle für solche Untersuchungen sind bekannt.
Einsatz von Glykosyltransferase-Inhibitoren
Die Offenbarung stellt auch Verfahren zur Inhibierung der Glykosyltransferase-katalysierten Synthese eines bestimmten Glykosids durch das Kontaktieren einer Glykosyltransferase mit einer durch die vorliegende Erfindung identifizierten Verbindung bereit. Die Verfahren können eingesetzt werden, um die Aktivität von Glykosyltransferasen in verschiedenen Zusammenhängen zu modulieren. Die identifizierten Inhibitoren können beispielsweise zur Steuerung der Glykosyltransferase-Aktivität in vitro eingesetzt werden. Die Inhibitoren können beispielsweise eingesetzt werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zellkulturen zu inhibieren, die eingesetzt werden, um die gewünschten Kohlenhydratstrukturen herzustellen. Die Inhibitoren können durch die selektive Inhibierung gewünschter Glykosyltransferasen in vivo auch auf geeignete Weise zur Herstellung von Tiermodellen einer Erkrankung eingesetzt werden.
Eine Reihe biologischer Prozesse hängt vom Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten Kohlenhydratstruktur ab. Die Verbindungen können beispielsweise als Antibiotika eingesetzt werden, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Krankheitserregern, wie z. B. Bakterien, Pilzen oder Hefe, zu inhibieren. Glykosyltransferasen spielen bei einer Reihe von Erkrankungen bei Menschen eine Rolle. Bei vielen Erkrankungszuständen (z. B. Entzündungs- oder Immunreaktionen) spielt die durch ein bestimmtes Oligosaccharid umfassende Zelloberflächenrezeptoren vermittelte interzelluläre Erkennung eine Rolle. ST6Gal-Sialyltransferase steuert beispielsweise die Produktion eines N-gebundenen Sialosids, das der Ligand für das Lectin CD22 ist. Untersuchungen unter Einsatz von transgenen Mäusen, in denen das Gen, das für ST6Gal-Sialyltransferase kodiert, ausgeschaltet wurde, deuten darauf hin, dass die Aktivität dieses Enzyms und die damit zusammenhängende Produktion des Oligosaccharids wesentlich für die Förderung der Aktivierung von B-Lymphozyten und für die Immunfunktion sind (Hennet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(8), 4504–4509 (1998)). Weitere Glykosyltransferasen, wie z. B. FTIII, FTVII, α(1,3)-Galactosyltransferase, ST6Gal I, ST3Gal I, GlcNAc-Transferase, UDPMurNAc-Transferase, UDPGlcNAc:MurNAc-Transferase, spielen auf ähnliche Weise eine Rolle in Erkrankungsprozessen.
Auf ähnliche Weise wurde über verschiedene und spezifische biologische Rollen von fucosylierten Glykanen berichtet. Die Kohlenhydrat-Liganden für die Lectin-Moleküle, die als Selectine bezeichnet werden, sind beispielsweise fucosyliert (A. Etzioni et al., Immunodeficiency 4, 307–308 (1993)). Für die Selectine kodieren drei Gene, die entweder E-, L- oder P-Selectin erzeugen. Diese wurden ursprünglich in Bezug auf ihre bevorzugte Expression auf Endothel (E-Selectin), Leukozyten (L-Selectin) und Plättchen (P-Selectin) definiert. Die Selectine binden an spezifische Glykane, die als Sialyl-Lewis-X bezeichnet werden und auf Glykoproteinen vorhanden sind, und möglicherweise an Glykolipide spezifischer Zellen und Gewebeoberflächen. Diese Struktur erfordert, dass sowohl Fucose als auch Sialsäure am äußeren Ende in einer bestimmten Bindungsstruktur vorhanden sind. Zusätzlich dazu hängt die epitheliale und gastrointestinale Expression von Fucose mit einer Anfälligkeit für bestimmte Erkrankungen und Krankheitserreger zusammen, in manchen Fällen im Zusammenhang mit Zugehörigkeit zu den Blutgruppen AB0. Es besteht ein geringer, aber signifikanter Anstieg der Anfälligkeit für Magenkrebs bei Individuen mit Blutgruppe A, während jene mit Blutgruppe 0 eine leicht höhere Inzidenz von Ulcus pepticum aufweisen. Beide Erkrankungen wurden mit einer Infektion in Zusammenhang gebracht, bei der die Spirochäte Helicobacter pylori eine Rolle spielt.
Es wurde gezeigt, das die Fucosyltransferase-Aktivität im Magenepithel in der Lage ist, eine Adhäsionsfunktion für Helicobacter pylori bereitzustellen. Die Fucosylierung des Magenepithels kann aus diesem Grund die Adhäsion und Besiedelung durch diesen Krankheitserreger in Menschen modulieren. H. pylori besiedelt den Magen zumindest der Hälfte aller untersuchten Menschen. Eine Unterpopulation der mit H. pylori infizierten Menschen entwickelt dann in der Folge Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre. Wie das Bakterium an Wirtszellen bindet, wurde umfassend untersucht. Zu den möglichen Adhäsionsrezeptoren, die an Darmentzündungskrankheiten beteiligt zu sein scheinen, gehört das fucosylierte Kohlenhydrat Lewis-b (Ilver et al., Science 279, 373–377 (1998)). Lewis-b (Fucα1,2Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc-R) ist das Produkt der beiden Fucosyltransferasen FucT-II und FucT-III (Falk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1515–1519 (1995), und Guruge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3925–3930 (1998)).
Zusätzlich dazu wurde die Beteiligung spezifischer Kohlenhydrate an der Angiogenese gezeigt ( WO 98/48817 ). Demnach kann die Steuerung der Synthese dieser Strukturen eingesetzt werden, um Angiogenese in Zusammenhang mit Krebs und anderen Erkrankungen zu behandeln. Auf ähnliche Weise können Glykosyltransferase-Inhibitoren als antibakterielle Verbindungen eingesetzt werden. Es ist beispielsweise bekannt, dass bekannte antibakterielle Verbindungen, wie z. B. Ramoplanin und Vancomycin, die an der Kohlenhydratsynthese beteiligten Enzyme inhibieren. Die Verbindungen können demnach als therapeutische Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen beim Menschen, als Antibiotika und Insektizide eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verbindungen zur therapeutischen Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren kommen in Therapie- und Diagnoseanwendungen zum Einsatz. Die Glykosyltransferase-Inhibitoren, die als Substrat-Analoga wirken können, werden beispielsweise für die In-vitro-Diagnose von Zellen (z. B. Krebszellen) eingesetzt, die die bestimmte Glykosyltransferase von Interesse exprimieren. Ferner können Inhibitoren von α(1,3)-Galactosyltransferasen eingesetzt werden, um die Abstoßung von Xenotransplantaten zu verzögern oder zu verhindern. Die Reaktion der Zellen auf eine biologisch wirksame Dosis des Mittels kann dann bestimmt werden.
Die Glykosyltransferase-Inhibitor-Verbindungen finden auch therapeutisch Anwendung, um die Glykosyltransferase-Aktivität in Zusammenhang mit verschiedenen Immunreaktionen selektiv zu inhibieren. Die Inhibitoren können beispielsweise eingesetzt werden, um schädliche Immunreaktionen in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen und Allergien zu hemmen. Die unangemessene Aktivierung des Immunsystems ist eine Komponente zahlreicher Immunpathologien, wie z. B. von Autoimmunerkrankungen, Allotransplantatabstoßungen und allergischen Reaktionen. Beispiele für Autoimmunerkrankungen umfassen rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Lupus, Sklerodermie und Myasthenia gravis (Goldflam-Krankheit). Allergische Reaktionen umfassen Allergien auf verschiedene Pollen, Staubmilben und dergleichen. Zusätzlich dazu können fremde Infektionskrankheiten eine Immunpathologie hervorrufen (z. B. Lyme-Borreliose, Hepatitis, LCMV, poststreptokokkale Endokarditis oder Glomerulonephritis). Nahrungsmittelallergien, wie z. B. Zöliakie und Morbus Crohn, sowie andere allergische Erkrankungen wurden mit unangemessenen Immunreaktionen in Zusammenhang gebracht, oder es wurde vermutet, dass diese eine Autoimmun-Komponente aufweisen.
Weitere durch die durch die vorliegende Erfindung identifizierten Zusammensetzungen behandelbare Erkrankungen umfassen z. B. rheumatoide Arthritis, post-ischämische Leukozyten-vermittelte Gewebeschäden (Reperfusionsverletzungen), akute Leukozyten-vermittelte Lungenverletzungen (z. B. akutes Lungenversagen), septische Schocks und akute und chronische Entzündungen, umfassend atopische Ekzeme und Psoriasis. Im Fall einer Reperfusionsverletzung werden die Blockiermittel idealerweise vor einem chirurgischen Eingriff am Herzen prophylaktisch eingesetzt, um die Erholung nach der Operation zu verbessern. Zusätzlich dazu kann das Metastasieren von Tumoren durch das Inhibieren der Adhäsion von im Blutkreislauf befindlichen Krebszellen verhindert werden. Beispiele umfassen Dickdarmkarzinome und Melanome.
In therapeutischen Anwendungen werden die Glykosyltransferase-Inhibitoren einem Individuum verabreicht, dass bereits an einer unangemessenen oder unerwünschten Immunreaktion leidet. Zusammensetzungen, die die Glykosyltransferase-Inhibitoren enthalten, werden einem Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die unerwünschte Immunreaktion zu unterdrücken und Symptome und/oder Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zu hemmen. Eine Menge, die zur Erreichung dieses Ziels ausreicht, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die Menge, die für diesen Zweck wirksam ist, hängt z. B. von der Inhibitor-Zusammensetzung, der Art der Verabreichung, dem Stadium und der Schwere der behandelten Erkrankung, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil des behandelnden Arztes ab.
Es muss beachtet werden, dass die Zusammensetzungen auch in ernsten Erkrankungsstadien, d. h. lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situatio nen, eingesetzt werden können. In solchen Fällen ist es in Anbetracht der Minimierung von Fremdsubstanzen und der relativ untoxischen Natur der Inhibitoren möglich und kann es vom behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden, einen deutlichen Überschuss dieser Zusammensetzungen zu verabreichen.
Die Dosis des Glykosyltransferase-Inhibitors zur Behandlung von Entzündungserkrankungen hängt z. B. vom jeweiligen Inhibitor, der Art der Verabreichung, der behandelten Erkrankung und deren Schwere, der Gesundheit und dem Zustand des Patienten im Allgemeinen und dem Urteil des behandelnden Arztes ab.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dienen zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung, wie z. B. unter Einsatz eines Aerosols oder zur transdermalen Verabreichung, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen behandlung. Zur topischen Anwendung werden typischerweise nicht aufsprühbare Formen, viskose bis halbfeste oder feste Formen eingesetzt, die einen Träger umfassen, der mit der topischen Anwendung verträglich ist, und die eine dynamische Viskosität aufweisen, die vorzugsweise höher ist als die von Wasser. Geeignete Formulierungen umfassen Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen, Salben, Pulver, Einreibemittel, Heilsalben, Aerosole etc., die nach Wunsch sterilisiert oder mit Hilfsstoffen gemischt sind, z. B. mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Puffern oder Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks etc., sind aber nicht auf diese beschränkt.
Zur Verabreichung in Form eines Aerosols werden die Verbindungen vorzugsweise in fein zerkleinerter Form gemeinsam mit einem Tensid und einem Treibmittel zugeführt. Typische Anteile von Blockiermitteln betragen 0,1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%. Das Tensid muss selbstverständlich untoxisch und vorzugsweise in dem Treibmittel löslich sein. Beispiele für solche Mittel umfassen Ester oder Partialester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Elaeostearin- und Ölsäure, mit einem mehrwertigen aliphatischen Alkohol oder seinem zyklischen Anhydrid, wie z. B. Ethylenglykol, Glycerin, Erythrit, Arbitol, Mannit, Sorbit, die von Sorbit stammenden Hexi tanyhdride, und die Polyoxyethylen- und Polyoxypropylenderivate von diesen Estern. Gemischte Ester, wie z. B. gemischte oder natürliche Glyceride, können eingesetzt werden. Das Tensid kann 0,1 bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen, vorzugsweise 0,25 bis 5 Gew.-%. Den Rest der Zusammensetzung bildet gewöhnlicherweise das Treibmittel. Bei verflüssigten Treibmitteln handelt es sich typischerweise um Gase bei Umgebungsbedingungen und werden unter Druck kondensiert. Zu den geeigneten verflüssigten Treibmitteln gehören Niederalkane mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Butan und Propan; und vorzugsweise fluorierte oder fluorchlorierte Alkane. Gemische der oben angeführten können ebenfalls eingesetzt werden. Zur Herstellung des Aerosols wird ein mit einem geeigneten Ventil ausgestatteter Behälter mit dem geeigneten Treibmittel, das die fein zerkleinerten Verbindungen und das Tensid enthält, gefüllt. Die Inhaltsstoffe werden so unter erhöhtem Druck gehalten, bis sie durch Betätigung des Ventils freigesetzt werden.
Die vorliegende Offenbarung beschreibt auch Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung, die eine Lösung des Glykosyltransferase-Inhibitors umfassen, der in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert ist. Verschiedene wässrige Träger können eingesetzt werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert oder sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können wie sie sind für die Anwendung verpackt werden oder gefriergetrocknet werden, wobei das gefriergetrocknete Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die zur Anpassung der physiologischen Bedingungen erforderlich sind, wie z. B. Substanzen zur Anpassung des pH-Werts und Puffermittel, Mittel zur Anpassung der Tonizität, Benetzungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc.
Die Konzentration des Glykosyltransferase-Inhibitors, der unter bestimmten Umständen zur Bildung eines "Cocktails" zur Steigerung der Wirksamkeit in den pharmazeu tischen Formulierungen kombiniert werden kann, kann in einem weiten Bereich variieren, d. h. von weniger als etwa 0,05 Gew.-% über gewöhnlicherweise von oder von zumindest etwa 1 Gew.-% bis zu 10 bis 30 Gew.-%, und wird primär in Abhängigkeit von den Flüssigkeitsvolumina, den Viskositäten etc. gemäß der speziellen gewählten Verabreichungsform ausgewählt.
Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse Infusionen könnte 250 ml sterile Ringerlösung und eine Einheitsdosierung, die 2–2.000 mg der Verbindung umfasst, enthalten. Die eigentlichen Verfahren zur Herstellung von Verbindungen zur parenteralen Verabreichung sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar oder bekannt und sind detailliert beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Aufl.), Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990), beschrieben. Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche untoxische feste Träger eingesetzt werden, die beispielsweise die pharmazeutisch annehmbare Formen von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen umfassen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare untoxische Zusammensetzung durch die Integration eines beliebigen der gewöhnlicherweise eingesetzten Arzneimittelträger, wie z. B. die zuvor angeführten Träger, und von im Allgemeinen 10–95%, vorzugsweise 15%, des Wirkstoffs, d. h. eines oder mehrerer Glykosyltransferase-Inhibitoren, hergestellt.
Die Glykosyltransferase-Inhibitoren können auch über Liposomen verabreicht werden, die dazu dienen, die Konjugate auf ein bestimmtes Gewebe, wie z. B. Lymphgewebe, zu richten, oder selektiv auf infizierte Zellen abgezielt werden sowie die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung steigern. Liposomen umfassen Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monolager, Flüssigkristalle, Phospholipiddispersionen, lamellenartige Schichten und dergleichen. In diesen Präparaten ist das Peptid, das zugeführt werden soll, als Teil eines Liposoms integriert, allein oder in Verbindung mit einem Molekül, das z. B. einen in Lymphzellen vorhandenen Rezeptor bindet, wie z. B. monoklonale Antikörper, die an das CD45-Antigen binden, oder in Verbindung mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen.
Liposomen, die mit einem gewünschten Peptid oder einem Konjugat der vorliegenden Erfindung gefüllt sind, können auf die Lymphzellstelle ausgerichtet werden, wo die Liposomen dann die ausgewählten Glykosyltransferase-Inhibitor-Zusammensetzungen zuführen. Liposomen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden aus herkömmlichen vesikelbildenden Lipiden gebildet, die im Allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterin, wie z. B. Cholesterin, umfassen. Die Wahl des Lipids wird im Allgemeinen durch die Berücksichtigung von beispielsweise Liposomengröße, Säurelabilität und Stabilität der Liposomen im Blutstrom geleitet. Verschiedene Verfahren stehen für die Herstellung von Liposomen zur Verfügung, wie z. B. die in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), und den US-Patenten Nr. 4.235.871 , 4.501.728 und 4.837.028 beschrieben.
Das Targeting von Liposomen unter Einsatz verschiedener Targeting-Mittel ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe z. B. US-Patente Nr. 4.957.773 und 4.603.044 ). Zum Targeting von Immunzellen kann ein Ligand, der in das Liposom integriert werden soll, z. B. Antikörper oder Fragmente davon enthalten, die für die Zelloberflächedeterminanten der gewünschten Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomensuspension, die ein Peptid oder Konjugat enthält, kann intravenös, lokal, topisch etc. in einer Dosis verabreicht werden, die unter anderem in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung, dem zugeführten Konjugat und dem Stadium der behandelten Krankheit variiert.
Die Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits an einer Erkrankung, wie oben beschrieben, leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Symptome der Erkrankung und deren Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zu hemmen. Eine Menge, die angemessen ist, um dies zu erreichen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Einheitsdosierungen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von der Schwere der Erkrankung und dem Gewicht und allgemeinen Zustand des Patienten ab, liegen aber im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa 10 g Glykosyltransferase-Inhibitor für einen Pa tienten mit 70 kg Körpergewicht, gewöhnlicherweise von etwa 10 mg bis etwa 5 g und vorzugsweise zwischen etwa 2 mg und etwa 1 g. Die therapeutische Verabreichung kann mit dem ersten Anzeichen einer Erkrankung oder dem Nachweis einer Erkrankung oder im Fall einer Immunstörung kurz nach der Diagnose beginnen. Darauf folgt oft eine wiederholte Verabreichung, bis die Symptome zumindest deutlich gelindert wurden, wobei die Verabreichung auch danach noch für einen gewissen Zeitraum fortgesetzt wird. Auf diese Dosen können in Abhängigkeit vom Ansprechen und dem Zustand des Patienten über Wochen bis Monate hinweg wiederholte Verabreichungen folgen.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, einem Patienten verabreicht, der anfällig für eine bestimmte Erkrankung ist oder bei dem sonst das Risiko besteht, dass er an dieser erkrankt. Eine solche Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis" bezeichnet. Zur prophylaktischen Anwendung werden die Inhibitor-Verbindungen Risikogruppen verabreicht. Bei dieser Anwendung hängen die genauen Mengen wiederum von Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten ab, liegen aber im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa 10 g Glykosyltransferase-Inhibitor für einen Patienten mit 70 kg Körpergewicht, gewöhnlicherweise von etwa 10 mg bis etwa 5 g und vorzugsweise zwischen etwa 2 mg und etwa 1 g.
Die einfache oder mehrfache Verabreichung der Zusammensetzungen kann mit Dosierungsausmaßen und in einem Muster erfolgen, die durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Inhibitor-Menge bereitstellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Die Wirkung der Verabreichung von Glykosyltransferase-Inhibitoren kann durch das Detektieren des Spiegels von Glykosid-Produkten in einer von einem Patienten gewonnenen Probe überwacht werden. Dies kann gemäß herkömmlichen Verfahren zur Detektion gewünschter Kohlenhydratstrukturen erfolgen. Spezifische Lectine oder Antikörper, die gegen den Liganden gebildet werden, können eingesetzt werden. Spezielle Lectine sind bekannt und im Handel erhältlich (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).
Glykosyltransferasen selbst, insbesondere die Akzeptor-Bindungsdomäne einer Glykosyltransferase, sind auch als Bindungsgruppierungen bei diagnostischen Tests der Erfindung nützlich. Bei Fehlen einer bestimmten Glykosyltransferase besteht beispielsweise die Tendenz, dass die Konzentration der Akzeptor-Gruppierungen ansteigt. Ein ST6Gal-Sialyltransferase-Mangel verursacht beispielsweise einen dramatischen Anstieg endständiger Galactose-Reste (d. h. Galβ1,4GlcNAc-) an B-Zellen. Demnach kann ST6Gal-Sialylstransferase als Detektionsgruppierung zur Bestimmung eines ST6Gal-Mangels in den Zellen eingesetzt werden. Eine ST3Gal-Transferase kann auf ähnliche Weise als Detektionsgruppierung eingesetzt werden.
In typischen Ausführungsformen werden die Detektionsgruppierungen mit einer detektierbaren Markierung markiert. Die detektierbaren Markierungen können primäre Markierungen (wobei die Markierung ein Element umfasst, das direkt detektiert wird oder das ein direkt detektierbares Element produziert) oder sekundäre Markierungen sein (wobei die detektierte Markierung an eine primäre Markierung bindet, wie es bei der immunologischen Markierung üblich ist). Eine Einführung in Bezug auf Markierungen, Markierungsverfahren und die Detektion von Markierungen ist in Polak und Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry (2. Aufl.), Springer Verlag, NY (1997), und in Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), einem kombinierten Handbuch und Katalog, herausgegeben von Molecular Probes, Inc., Eugene, Or., zu finden. Primäre und sekundäre Markierungen können nicht detektierte sowie detektierte Elemente umfassen. Nützliche primäre und sekundäre Markierungen in der vorliegenden Erfindung können spektrale Markierungen, wie z. B. fluoreszierende Farbstoffe (z. B. Fluorescein und Derivate, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Oregon Green^TM, Rhodamin und Derivate (z. B. Texas Red, Tetrarhodiminisothiocyanat (TRITC) etc.), Digoxigenin, Biotin, Phycoerytrhin, AMCA, CyDyes^TM und dergleichen), radioaktive Markierungen (z. B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ³³P etc.), Enzyme (z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase etc.), spektrale kolorimetrische Markierungen, wie z. B. Perlen aus kolloidalem Gold oder gefärbtem Glas oder Kunststoff (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex etc.), umfassen. Die Markierung kann gemäß Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, direkt oder indirekt an eine Komponente des Detektionstests (z. B. an das Detektionsreagens) gebunden werden. Wie oben angedeutet können viele verschiedene Markierungen eingesetzt werden, wobei die Wahl der Markierung von der erforderlichen Empfindlichkeit, von der Einfachheit der Konjugation mit der Verbindung, den Stabilitätsanforderungen, den verfügbaren Geräten und den Entsorgungsbestimmungen abhängt.
Bevorzugte Markierungen umfassen jene, die 1) Chemilumineszenz (unter Einsatz von Meerrettichperoxidase oder Luciferase mit Substraten, die Photonen als Zerfallsprodukte wie oben beschrieben erzeugen) unter Einsatz von Sets z. B. von Molecular Probes, Amersham, Boehringer-Mannheim und Life Technologies/Gibco BRL; 2) Farberzeugung (unter Einsatz von Meerrettichperoxidase und/oder alkalischer Phosphatase mit Substraten, die einen farbigen Niederschlag erzeugen [Sets von Life Technologies/Gibco BRL und Boehringer Mannheim erhältlich]); 3) Hemifluoreszenz z. B. unter Einsatz von alkalischer Phosphatase und dem Substrat AttoPhos [Amersham] oder anderen Substraten, die fluoreszierende Produkte erzeugen; 4) Fluoreszenz (z. B. unter Einsatz von Cy-5 [Amersham], Fluorescein und anderen fluoreszierenden Markierungen); 5) Radioaktivität nutzen. Weitere Verfahren zur Markierung und Detektion sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
Bevorzugte Enzyme, die an erfindungsgemäße Detektionsreagenzien konjugiert werden können, umfassen z. B. Luciferase und Meerrettichperoxidase. Das chemilumineszierende Substrat für Luciferase ist Luciferin. Ausführungsformen von Substraten für alkalische Phosphatase umfassen p-Nitrophenylphosphat (pNPP), das mit einem Spektralphotometer detektiert wird; 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT) und Echtrot/Naphthol-AS-TR-phosphat, die visuell detektiert werden; und 4-Methoxy-4-(3-phosphonophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan], das mittels eines Luminometers detektiert wird. Ausführungsformen eines Meerrettichperoxidase-Substrats umfassen 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS), 5-Aminosalicylsäure (5AS), o-Dianisidin und o-Phenylendiamin (OPD), die mit einem Spektralphotometer detektiert werden; und 3,3,5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) und 4-Chlor-1-naphthol (4C1N), die visuell detektiert werden. Weitere geeignete Substrate sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Im Allgemeinen wird ein Detektor, der eine bestimmte Markierung überwacht, eingesetzt, um die Markierung zu detektieren. Typische Detektoren umfassen Spektralphotometer, Photozellen und Photodioden, Mikroskope, Szintillationszähler, Kameras, Filme und dergleichen sowie Kombinationen von diesen. Beispiele für geeignete Detektoren sind verbreitet von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Herkömmlicherweise wird ein optisches Bild eines Substrats, das gebundene Markierungsgruppierungen umfasst, für folgende Computeranalysen digitalisiert.
Die Wirksamkeit des Behandlungsschemas wird durch eine deutliche Reduktion von Glykosid-Produkten in einer von einem Patienten erhaltenen Probe angezeigt. Alternativ dazu können Verfahren zur Detektion des Ausmaßes spezifischer Glykosyltransferase-Aktivitäten eingesetzt werden. Standardtests zur Detektion von Glykosyltransferasen, wie z. B. ST6Gal und ST3Gal I, sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Wiederum wird die Behandlungswirksamkeit durch eine deutliche Reduktion der Aktivität der jeweiligen Glykosyltransferase angezeigt. Wie hierin verwendet bezieht sich eine "deutliche Reduktion" der jeweiligen Sialylgalactosid-Spiegel oder Glykosyltransferase-Aktivität auf eine Reduktion von zumindest etwa 30% in der Testprobe im Vergleich mit einer nicht-immundefizienten Kontrolle. Vorzugsweise beträgt die Reduktion zumindest etwa 50%, noch bevorzugter zumindest etwa 75%, und besonders bevorzugt werden die Sialylgalactosid- oder Glykosyltransferasespiegel in einer Probe von einem behandelten Säugetier im Vergleich mit einer nicht behandelten Kontrolle um zumindest etwa 90% reduziert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele stellen Testprotokoll-Beispiele der vorliegenden Erfindung bereit.
FTVII-TESTPROTOKOLL
Fluoronunc-Maxisorp-Microtiterplate-Platten (Nunc Kat.-Nr. 437958) wurden mit 100 μl/Well des Akzeptor-Substrats, Sialyl-LNnt BSA (10 μg/ml in PBS), entweder über Nacht bei 4°C oder 2 h lang bei 37°C beschichtet. Die Platten wurden dann mit 100 μl/Well PBS gewaschen und dann mit Superblock (Pierce Kat.-Nr. 37535) (200 μl/Well) 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden dann mit 200 μl/Well TBS/Tween (Tris-gepufferte Salzlösung + Tween: 25 mM Tris, 0,1 M NaCl, 0,02% Tween 20, 0,02% Natriumazid, pH 7,5) gewaschen.
Das Testgemisch umfasste Folgendes:

TBS:Tween

GDP-Fucose 100 μM

MnCl₂ 10 μM

FTVII-Enzym 6,2 mEinheiten/ml
Das Testgemisch (100 μl/Well) wurde zugesetzt, und die Platten wurden 90 min lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurden die Platten 2-mal mit TBS:Tween und 1-mal mit TBS-10B (10fach mit H2O plus 0,25% BSA, 0,02% Tween 20 verdünnte TBS) gewaschen. Ein für das Produkt spezifischer Antikörper (der CSLEX-Antikörper) wurde dann in einer Verdünnung von 1:30 in TBS-10B zugesetzt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann erneut 3-mal mit TTBS-10B, 200 μl/Well, gewaschen. Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgM, das im Verhältnis von 1:1000 in TTBS-10B verdünnt war, wurde zu den Platten zugesetzt (100 μl/Well), und die Platten wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inku biert. Die Platten wurden dann 6-mal mit TTBS-10B (100 μl/Well) gewaschen. Das TMB-Substrat (100 μl/Well) wurde zu den Platten zugesetzt, und die Farbe wurde 15 min lang bei Raumtemperatur entwickeln gelassen. Phosphorsäure (1 M) wurde zu den Platten zugesetzt (100 μl/Well), um die Peroxidase-Reaktion zu beenden, und nach dem Mischen wurde das Absorptionsvermögen bei 450 nm abgelesen.
ST6-GAL-I-TESTPROTOKOLL
Immulon4-ELISA-Platten (96 Well, Dynex (Kat.-Nr. G2402-958)) wurden mit dem Akzeptorsubstrat Asialo-Fetuin in PBS (150 mM NaCl, 6,7 mM KH₂PO₄, 0,02% NaN₃, pH 7,4) in einer Konzentration von 20 μg/ml (100 μl/Well) beschichtet, und der Akzeptor wurde an die Platte über Nacht bei 4°C anhaften gelassen. Die Beschichtungslösung wurde durch Absaugen entfernt, und die Wells wurden mit 3 × 200 μl PBS gewaschen. Die Wells wurden dann mit 200 μl/Well PBS plus 1% Gelatine 45–60 min lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach dreimaligem Waschen der Wells mit PBS wurden 100 μl des Testgemischs, umfassend 250 μEinheiten/ml menschlicher ST6Gal-I in Reaktionspuffer (50 mM MES, pH 6,0, 100 μM CMP-Neu5Ac), zu den Wells zugesetzt und 45 min lang bei 37°C inkubieren gelassen. Die Enzyminkubation wurde durch das Absaugen der Well-Inhalte beendet. Die Wells wurden dann mit 3 × 200 μl PBS, umfassend 0,05% Tween 20 (PEST), gewaschen. Das α2,6-sialylierte Produkt wurde durch Emporium-markiertes Sambucus-nigra-Agglutinin (SNA) detektiert. Die Wells wurden mit 100 μl SNA in PEST in einer Konzentration von 1 μg/ml 45 min lang bei Raumtemperatur überschichtet, wonach sie 4-mal mit 100 μl PBST gewaschen wurden. Europium-Verstärkungsmittel (Naphthoyltrifluoraceton + 0,1% Triton-X-100) wurde in einer Menge von 50 μl/Well zugesetzt, und nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten unter Einsatz einer BMG-Fluostar-Plattenlesevorrichtung unter Anregung bei 340 ± 35 nm und einer Emission von 615 ± 10 nm gelesen. Um die Wirksamkeit des Detektionsreagens sicherzustellen, wurde Fetuin in einer Menge von 20 μg/ml als Kontrolle eingesetzt.

Claims

Verfahren zur Identifikation eines spezifischen Inhibitors einer Glykosyltransferase, die aus der aus Fucosyltransferase, Galactosyltransferase, Sialyltransferase, N-Acetylglucosaminyltransferase und N-Acetylgalactosaminyltransferase bestehenden Gruppe ausgewählt ist, die ein Monosaccharid von einem Donor-Nucleotidzucker zu einem Zuckermolekül transferiert, das an ein Akzeptorsubstrat gebunden ist, worin das native Akzeptorsubstrat ein Glykolipid oder ein Glykoprotein ist und wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (i) das Auswählen einer hydrophoben Nichtkohlenhydrat-Testverbindung, umfassend eine planare Ringstruktur, welche die hydrophobe Oberfläche eines Zuckers imitiert, der von der Glykosyltransferase erkannt wird, (ii) das Kontaktieren der Glykosyltransferase, eines Akzeptorsubstrats und eines Donorsubstrats mit der hydrophoben Nichtkohlenhydrat-Testverbindung und (iii) das Bestimmen des Ausmaßes der Inhibierung der Aktivität der Glykosyltransferase in Gegenwart der Testverbindung, worin es sich bei dem Akzeptorsubstrat um ein Glykolipid, Glykoprotein oder Oligosaccharid handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die hydrophobe Nichtkohlenhydrat-Testverbindung eine aromatische, heteroaromatische, aromatische Mehrfachring- oder aliphatische Ringstruktur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Verbindung eine Aryl-Gruppierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Verbindung eine Heteroaryl-Gruppierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Heteroaryl-Gruppierung aus der aus einem Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, aus Chinolinen, Phenothiazinen, Carbazolen, Benzopyranonen und aus einer Furan-Gruppe bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nichtkohlenhydrat-Testverbindung den Zucker auf dem Akzeptorsubstrat imitiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nichtkohlenhydrat-Testverbindung den Zucker auf dem Nucleotid-Donorsubstrat imitiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Aktivität der Glykosyltransferase unter Verwendung eines Antikörpers bestimmt wird, der spezifisch mit einem Produkt der Reaktion immunreaktiv ist, die durch die Glykosyltransferase katalysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin es sich um ein ELISA-Format handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Glykosyltransferase in einer rekombinanten Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Donorsubstrat oder das Akzeptorsubstrat markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin es sich bei der Markierung um eine radioaktive Markierung handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, worin es sich bei der Markierung um eine fluoreszierende Markierung handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, worin es sich um einen radioaktiven Säulentest handelt.