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DE60035589T2 - Viraler paramyxoviridae vektor mit einem defekten hüllprotein-gen - Google Patents

Viraler paramyxoviridae vektor mit einem defekten hüllprotein-gen Download PDF

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DE60035589T2
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virus
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Tsugumine Tsukuba-shi SHU
Hidekazu Ryugasaki-shi KUMA
Yasuji Tsukuba-shi UEDA
Makoto Toyonaka-shi ASAKAWA
Mamoru Tsukuba-shi HASEGAWA
Akihiro Tsukuba-shi IIDA
Fumino Tsukuba-shi TOKITOU
Takahiro Tsukuba-shi HIRATA
Tsuyoshi Tsukuba-shi TOKUSUMI
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Description

  • Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Hüllproteingen-defizienten viralen Vektor von Paramyxoviridae.
  • Stand der Technik
  • In vielen klinischen Herangehensweisen der Gentherapie wurden bisher virale Vektoren von Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierten Viren verwendet. Diese Gentherapie-Vektoren sind bei der Effizienz der Geneinführung und persistenten Expression eingeschränkt und weisen auch Zelltoxizität und Immunogenität auf, welche kritische Probleme sind, wenn es zu der medizinischen Anwendung dieser Vektoren kommt (Lamb, R.A. & Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: the viruses and their replication, in Field Virology, 3. Aufl., (Herausgegeben von B. N. Fields, D. M. Knipe & P. P. Howley) S. 1177-1204 (Philadelphia, Lippincott-Raven (1996)). Neue Vektoren auf der Grundlage von Lentiviren und HSV wurden als Gegenmaßnahmen vorgeschlagen, und ausführliche Forschung wird ausgeführt, um die existierenden Vektoren zu verbessern. Jedoch sind all diese Vektoren in Form von DNA innerhalb des Kerns während des ganzen Lebenszykluses vorhanden. Daher ist es schwierig, Bedenken hinsichtlich Sicherheit, bezogen auf zufällige Wechselwirkungen mit den Chromosomen des Patienten vollständig zu bewältigen.
  • Der kürzliche schnelle Fortschritt bei der Technologie der reversen Genetik macht es möglich, Vektoren auf der Grundlage von RNA-Viren zu entwickeln, deren Entwicklung lange verzögert wurde. Vektoren des rekombinanten RNA-Virus zeigen eine hohe Geneinführungseffizienz und Expressionsfähigkeit und zeigen so eine sehr hohes Potential als Vektoren für die Gentherapie (Roberts, A. & Rose, J. K., Virology 247, 1-6 (1998); Rose, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14998-15000 (1996); Palese, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11354-11358 (1996)). Jedoch wurde über praktisch brauchbarer Paramyxovirusvektoren, die aus dem defizienten Genomtyp der abgeschwächten Viren stammen, noch nicht berichtet.
  • Paramyxovirusvektoren, die eine Negativstrang-RNA als Genom haben, haben verschiedene Merkmale, die sich von Retroviren, DNA-Viren oder Positivstrang-RNA-Virusvektoren signifikant unterscheiden. Genome oder Antigenome der Negativstrang-RNA-Viren fungieren nicht direkt als mRNA, so können sie nicht die Synthese von viralen Proteinen und die Genomreplikation starten. Sowohl das RNA-Genom als auch das Antigenom dieser Viren sind immer in der Form eines Ribonucleoproteinkomplexes (RNP) vorhanden, so können sie kaum Probleme verursachen, die durch die Antisense-Stränge verursacht werden, wie die Störung der Anordnung des Genoms zum RNP infolge mRNA-Hybridisierung mit der nackten genomischen RNA, wie in dem Fall von Positivstrang-RNA-Viren. Diese Viren umfassen ihre eigenen RNA-Polymerasen, welche die Transkription der viralen mRNAs oder die Replikation der viralen Genome unter Verwendung des RNP-Komplexes als Matrize durchführen. Erwähnenswert ist, dass Negativstrang-RNA(nsRNA-) Viren sich nur in dem Zytoplasma der Wirtszellen vermehren, die keine Eingliederung davon in die Chromosomen verursachen, weil sie nicht durch eine DNA-Phase gehen. Darüber hinaus wurde keine homologe Rekombination unter RNAs erkannt. Von diesen Eigenschaften nimmt man an, dass sie einen großen Teil zu der Stabilität und Sicherheit der Negativstrang-RNA-Viren als Genexpressionsvektoren beitragen.
  • Unter den Negativstrang-RNA-Viren fokussierten die vorliegenden Erfinder ihre Aufmerksamkeit auf das Sendai-Virus (SeV). Das Sendai-Virus ist ein Negativstrang-RNA-Virus vom nicht segmentierten Typ, das zur Gattung Paramyxovirus gehört, und ist ein Typ des Maus-Parainfluenza-Virus. Das Virus heftet an die Membran der Wirtszelle über zwei Hüllglykoproteine an, der Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und dem Fusionsprotein (F), verursacht Membranfusion und setzt effizient seine eigene RNA-Polymerase und das RNA-Genom, welches als ein Ribonucleoproteinkomplex (RNP) vorhanden ist, in das Zytoplasma frei und führt die mRNA-Transkription des Virus und die Genomreplikation an der Stelle aus (Bitzer, M. et al., J. Virol. 71 (7): 5481-5486, 1997). Das virale Hüllprotein F wird als ein inaktives Vorläuferprotein (F0) synthetisiert, dann in F1 und F2 durch proteolytische Spaltung mit Trypsin gespalten (Kido, H. et al., Biopolymers (Peptide Science) 51(1): 79-86, 1999), und wird so ein Protein von aktiver Form, um die Membranfusion zu verursachen. Dieses Virus gilt gegenüber Menschen als nicht pathogen. Zusätzlich wurde ein abgeschwächter Laborstamm (Z-Stamm) des Sendai-Virus isoliert, welcher nur milde Pneumonie bei Nagern, den natürlichen Wirten, induziert. Dieser Stamm wurde weitgehend als ein Forschungsmodell für Studien des Transkription-Replikation-Mechanismus von Paramyxoviren auf molekularem Niveau verwendet und zum Präparieren von Hybridomen verwendet. Zusätzlich zu der voranstehend erwähnten hohen Sicherheit zeigt das Virus einen hohen Produktionstiter von 109-11 pfu/ml in Zelllinien oder Hühnereiern. In einem neulich erfolgreichen System zur Gewinnung des Negativstrang-RNA-Virusvektors von cDNA wurde eine besonders hohe Rekonstitutionseffizienz im Fall des Sendai-Virus gesehen. Die Fähigkeit von rekombinanten Wildtyp-Viren, die mit exogenen Genen eingeführt wurden, um exogene Gene effizient und stabil zu exprimieren, verdient weite Aufmerksamkeit.
  • So haben Negativstrang-RNA-Viren viele Vorteile als Gen-einführende Vektoren. Jedoch wird die Entwicklung von hoch sicheren Vektoren gewünscht, die keine infektiösen Partikel freisetzen, wenn sie mit Zellen infiziert werden, um sie für die Gentherapie anzuwenden. Für diesen Zweck ist eine Technik notwendig, die Viren in Massen herstellt, die defizient in der Produktionsfähigkeit des Wildtyp-Virus sind. Jedoch war die Entwicklung eines anwendbaren Vektors auf Grundlage eines Hüllproteingen-defizienten Genoms noch nicht erfolgreich.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist, einen Paramyxovirusvektor bereitzustellen, der in einem Hüllproteingen defizient ist.
  • Um einen für Gentherapie passenden Paramyxovirusvektor zu konstruieren, dem vollständig die Fähigkeit zur Ausbreitung fehlt, deletierten die vorliegenden Erfinder das F-Gen von SeV aus dem Genom, um ein Verfahren zu etablieren, um infektiöse Viruspartikel in Zellen, die das F-Protein des Sendai-Virus exprimieren, unter Verwendung von cDNA, in welcher das GFP-Gen als Reporter eingeführt wird, zu gewinnen. Durch diesen F-Gen-defizienten Virusvektor wird ein Gen in Ratten-Neuronenzellen bei Primärkulturen, primitiven Blutstammzellen der Maus, menschlichen normalen Zellen und verschiedenen anderen Zelltypen mit einer hohen Effizienz eingeführt, und eine hohe Expression wurde gesehen. Darüber hinaus wurde eine hohe Expression erhalten, wenn in Rattenhirn in vivo verabreicht wurde. Der F-Gen-defiziente SeV-Vektor exprimiert relativ persistent und stark in den infizierten Zellen ein Gen, ohne sekundäre infektiöse Viruspartikel herzustellen, und verbreitet sich nicht innerhalb der benachbarten Zellen. So wurde die Brauchbarkeit des Vektors für die Gentherapie vorgeschlagen.
  • Darüber hinaus stellten die vorliegenden Erfinder eine sowohl im F-Gen- als auch im HN-Gen-defiziente SeV-Vektor-cDNA her, um ein Verfahren zu etablieren, um infektiöse Viruspartikel in einer Zelllinie, die das F-Protein und das HN-Protein des Sendai-Virus exprimiert, zu gewinnen. Zusätzlich waren die vorliegenden Erfinder erfolgreich beim Konstruieren des in dem HN-Protein-defizienten SeV-Vektors durch Einführung der SeV-Vektor-cDNA in F-exprimierende Zellen.
  • So etabliert die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein anwendbares neues Hüllproteingen-defizientes Vektorsystem auf der Grundlage eines Negativstrang-RNA-Virus. Der Erfolg bei der Gewinnung von infektiösen defizienten Viruspartikeln aus F-Gen-defizienter oder FHN-Gen-defizienter genomischer cDNA unter Verwendung von Helferzellen ebnen den Weg für Forschung und Entwicklung von neuen Vektoren für die Gentherapie unter Ausnutzung der außergewöhnlichen Merkmale des Sendai-Virus.
  • Der defiziente Sendai-Virusvektor der vorliegenden Erfindung hat eine extrem hohe Effizienz ein Gen einzuführen gegenüber verschiedenen Zelltypen und eine enorme Fähigkeit, ein exogenes Gen zu exprimieren. Darüber hinaus exprimiert er in infizierten Zellen persistent und setzt keine sekundären infektiösen Viruspartikel frei, was belegt, dass er ein hoch sicherer Vektor vollständig ohne die Fähigkeit der Virus-Verbreitung ist.
  • Die Stabilität des Genoms wird als Problem während der Verwendung von RNA-Viren betont. Die heterologe Genexpression durch den SeV-Vektor zeigte kaum irgendwelche Basenmutationen nach mehrfachen kontinuierlichen Passagen, was zeigt, dass er das eingefügte heterologe Gen stabil für eine lange Zeitdauer exprimiert (Yu, D. et al. Genes cells 2, 457-466 (1997)). Vektoren auf der Grundlagen von Negativstrang-RNA-Virus-Replikons haben mehrere vorteilhafte Merkmale wie Genomstabilität oder Flexibilität der Größe des eingeführten Gens oder der Verpackung, denn sie haben nicht das strukturelle Protein des Kapsids, wenn sie mit Vektoren auf der Grundlage der Replikons des Semliki-Forest-Virus, eines bereits erfolgreichen Positivstrang-RNA-Virus, oder jenen des Sindbis-Virus verglichen werden. Mindestens 4 kbp von exogener DNA kann in den Wildtyp-Sendai-Virusvektor eingefügt werden, und eine viel längere kann in den defizienten Vektor eingefügt werden. Durch Hinzufügen einer Transkriptionseinheit können zwei oder mehr Arten von Genen gleichzeitig exprimiert werden. Persistente Expression wird in dem Vektor auf Grundlage des Replikons des Sendai-Virus erwartet, da theoretisch mehrfach kopierte RNPs, die in dem Zytoplasma repliziert wurden, in Tochterzellen verteilt werden, wenn die Zellteilung stattfindet. Tatsächlich wurde dies in einer in vitro-Studie in einer bestimmten Art von Blutzellen gezeigt. Da die vorliegenden Erfinder bestätigten, dass der Sendai-Virusvektor mit einer hohen Effizienz in Blutzellen eingeführt wird, besonders in granulozytären Zellen, und dass er auch in c-Kit-positive primitive Zellen eingeführt wird, wird darüber hinaus angenommen, dass der Vektor ein sehr weit anwendbarer Vektor mit einem sehr ausgedehntem Gewebe-Anwendungsbereich ist.
  • So bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Hüllproteingen-defizienten Sendai-Virusvektor, spezifischer auf:
    • (1) Virusvektor der Paramyxoviridae, umfassend einen Komplex, welcher (a) eine aus Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass zumindest das F-Protein oder das HN-Protein von Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert werden, und (b) NP-Protein, P-Protein und 1-Protein
    • (2) Vektor nach (1), wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA NP-Protein, P-Protein und L-Protein exprimiert und so modifiziert ist, dass F-Protein und/oder HN-Protein nicht exprimiert wird;
    • (3) Vektor nach (1) oder (2), umfassend zumindest eines der Hüllproteine, dessen Expression in der modifizierten Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt wurde;
    • (4) Vektor nach einem von (1) bis (3), umfassend VSV-G-Protein;
    • (5) Vektor nach einem von (1) bis (4), wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA aus Sendai-Virus stammt;
    • (6) Vektor nach einem von (1) bis (5), wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA zusätzlich ein exogenes Gen codiert;
    • (7) DNA, welche eine Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die in einem Vektor nach einem von (1) bis (6) enthalten ist oder der komplementäre Strang davon;
    • (8) Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem von (1) bis (6), umfassend die folgenden Schritte: (a) Expression einer Vektor-DNA, welche eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die so modifiziert ist, dass sie zumindest F-Protein oder HN-Protein von Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert oder den komplementären Strang, durch Einführung in Zellen, welche das Hüllprotein exprimieren, (b) Kultivierung der Zellen und (c) Erhalt von Viruspartikeln aus dem Kulturüberstand;
    • (9) Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem von (1) bis (6), umfassend die Schritte, (a) Einführung eines Komplexes, welcher eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass sie zumindest F-Protein oder HN-Protein von Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert, und NP-Protein, P-Protein und L-Protein, in Zellen, welche das Hüllprotein exprimieren (b) Kultivierung der Zelle, und (c) Erhalt von Viruspartikeln aus dem Kulturüberstand;
    • (10) Verfahren nach (8) oder (9), wobei die Zellkultur in (b) eine Co-Kultur mit Zellen ist, welche das Hüllprotein exprimieren;
    • (11) Verfahren nach (8) oder (9), wobei die Zellen in Zellkultur in (b) mit Zellen überschichtet sind, welche das Hüllprotein exprimieren;
    • (12) Verfahren nach einem von (8) bis (11), wobei zumindest ein Hüllprotein, welches von den Zellen exprimiert wird, mit wenigstens einem Hüllprotein identisch ist, dessen Expression in der oben beschriebenen Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt ist;
    • (13) Verfahren nach einem von (8) bis (12), wobei mindestens ein Hüllprotein, welches von den Zellen exprimiert wird, VSV-G-Protein ist.
  • In der vorliegenden Erfindung zeigt der Begriff „Vektor" Viruspartikel an, in welche Nucleinsäuremoleküle zur Expression des exogenen Gens in Wirte verpackt werden.
  • „NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene" von Viren, welche zur Familie Paramyxoviridae gehören, beziehen sich auf Gene, welche jeweils Nucleokapsid, Phospho-, Matrix-, Fusions-, Hämagglutinin-Neuraminidase und große Proteine codieren. Die jeweiligen Gene der Viren, welche zu Unterfamilien der Familie Paramyxoviridae gehören, werden im Allgemeinen dargestellt, wie folgt: Das NP-Gen wird allgemein auch als das „N-Gen" beschrieben.
    Gattung N P/C/V M F HN – L
    Respirovirus
    Gattung N P/V M F HN (SH) L
    Rubullavirus
    Gattung N P/C/V M F H – L
  • Morbillivirus
  • Die Datenbank-Zugangsnummern für die Nucleotidsequenzen der Gene des Sendai-Virus, welches in Respirovirus der Familie Paramyxoviridae eingeordnet wurde, sind
    Figure 00070001
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hüllproteingen-defiziente Virusvektoren von Paramyxoviridae. Der Virusvektor umfasst aus Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA, die so modifiziert ist, dass zumindest ein Hüllprotein nicht exprimiert wird. Das Paramyxovirus umfasst allgemein einen.
  • Komplex von RNA und Protein (Ribonucleoprotein; RNP) in der Hülle. Die im RNP enthaltene RNA ist eine Negativstrang- (Negativstrang-) Einzelstrang-RNA, welche das Genom des Paramyxovirus ist. Das Protein bindet an die RNA, um den Komplex zu bilden. Und zwar umfasst ein Virusvektor von Paramyxoviridae nach dieser Erfindung einen Komplex, welcher (a) eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass sie zumindest eines der Hüllproteine der Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert, und (b) ein Protein, welches an die Negativstrang-Einzelstrang-RNA bindet. Proteine, welche an eine Negativstrang-Einzelstrang-RNA binden, beziehen sich auf Proteine, welche direkt und/oder indirekt an die Negativstrang-Einzelstrang-RNA binden, um einen RNP-Komplex mit der Negativstrang-Einzelstrang-RNA zu bilden. Im Allgemeinen ist die Negativstrang-Einzelstrang-RNA (genomische RNA) von Paramyxovirus an NP-, P- und L-Proteinen gebunden. Die in diesem RNP enthaltene RNA fungiert als Matrize für Transkription und Replikation von RNA (Lamb, R. A., und D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication, S. 1177-1204. In Fields Virology, 3. Aufl. Fields, B. N., D. M. Knipe und P. M. Howley et al. (Hrsg.), Raven Press, New York, N.Y.). Die Komplexe dieser Erfindung beinhalten jene, welche Negativstrang-Einzelstrang-RNAs umfassen, die in Paramyxovirus entstehen, und Proteine, die auch in Paramyxovirus entstehen, welche an die RNAs binden. Vektoren dieser Erfindung umfasst RNP, welches zum Beispiel die Negativstrang-Einzelstrang-RNA von Paramyxoviren umfasst, an welche diese Proteine (NP-, P- und L-Proteine) gebunden werden. Im Allgemeinen sind RNP-Komplexe von Paramyxovirus in der Lage, in Wirtszellen autonom selbst zu replizieren. So vermehren zu Zellen übertragene Vektoren intrazellulär RNP, um die Kopiezahl des Gens (RNA, im Komplex enthalten) zu erhöhen, was dadurch zu einem hohen Expressionsniveau eines Fremdgens aus RNP, welches das Fremdgen trägt, führt. Die Vektoren dieser Erfindung sind vorzugsweise jene, welche in der Lage sind, in Komplexen enthaltene RNA (RNP) in tranfizierten Zellen zu replizieren.
  • Zusätzlich zu dem Sendai-Virus ist das Paramyxoviridae-Virus, für das die vorliegende Erfindung angewandt werden kann, zum Beispiel Masernvirus, Simian-Parainfluenza-Virus (SV5) und menschliches Parainfluenza-Virus 3, aber ist nicht darauf begrenzt.
  • Die Negativstrang-Einzelstrang-RNAs, welche in viralen Vektoren enthalten sind, werden normalerweise so modifiziert, dass sie NP-, P- und L-Proteine, aber nicht F- und/oder HN-Proteine exprimiert.
  • In dem Fall des Sendai-Virus (SeV) ist das Genom des natürlichen Virus ungefähr 15,000 Nucleotide groß und der Negativstrang umfasst sechs Gene, welche NP-(Nucleokapsid-), P-(Phospho-), M-(Matrix)-, F-(Fusions-), HN (Hämagglutinin-Neuraminidase-) und L-(große) Proteine codieren, aufgereiht in einer Linie, welche der 3'-Short-Leader Region und einer kurzen 5'-Trailerregion an dem anderen Ende folgt. In dieser Erfindung kann dieses Genom modifiziert werden, um Hüllproteine durch Entwerfen eines Genoms, das in einem der F- und HN-Gene oder einer Kombination davon defizient ist, zu exprimieren. Die Defizienz in entweder dem F-Gen oder dem HN-Gen oder beiden wird bevorzugt. Da diese Proteine für die Bildung von RNP überflüssig sind, können RNPs dieser Erfindung durch Transkribieren dieser genomischen RNA (entweder Positiv- oder Negativstrang) in der Anwesenheit von NP-, P-, und L-Proteinen hergestellt werden. Die RNP-Bildung kann zum Beispiel in LLC-MK2-Zellen oder dergleichen durchgeführt werden. NP-, P- und L-Proteine können durch Einführen von Expressionsvektoren, welche die jeweiligen Gene für diese Proteine tragen, den Zellen zugeführt werden (vgl. Beispiele). Jedes Gen kann auch in Chromosomen der Wirtszellen eingebaut werden. Die für die Bildung von RNP zu exprimierenden NP-, P- und L-Gene brauchen nicht vollständig identisch zu jenen Genen sein, welche in dem Genom des Vektors codiert werden. Das heißt, die Aminosäuresequenzen der von diesen Genen codierten Proteine können nicht identisch zu jenen der durch das RNP-Genom codierten Proteine sein, so lange sie an die genomische RNA binden können und in der Lage sind, RNP in Zellen zu replizieren, und diese Gene können mit Mutationen induziert oder mit homologen Genen aus anderen Viren ersetzt werden. Wenn erst einmal ein RNP gebildet wird, werden NP-, P- und L-Gene aus diesem RNP exprimiert, um autonom RNP in den Zellen zu replizieren und virale Vektoren herzustellen.
  • Wenn ein Hüllprotein zu Zellen während des Wiederherstellens eines Vektors innerhalb der Zellen infiziert wird, wird dieses Hüllprotein in die Zellen eingebaut werden, wobei es die Herstellung von infektiösen viralen Vektoren auf Grund des Hüllproteins befähigt. Wenn solch ein Vektor einmal in Zellen infiziert ist, kann er keine Viren herstellen, welche ein Hüllprotein umfassen, wie es das anfängliche Virus kann, weil er kein Hüllproteingen hat, obwohl er RNP innerhalb der Zellen verbreiten kann. Solch ein Vektor ist in Einsatzgebieten wie Gentherapie, wo außergewöhnlich hohe Sicherheit erfordert wird, sehr nützlich.
  • Virale Vektoren mit equivalenter Infektionsfähigkeit wie das Wildtyp-Virus können durch Expression des Hüllproteins, dessen Expression in modifizierter Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt wird, und zwar Hüllproteingen-defizient in dem Genom, zur Zeit der Virus-Rekonstitution hergestellt werden. Das Exprimieren eines Teils des Hüllproteingens, das in dem Genom defizient ist, ist auch denkbar. Wenn zum Beispiel das F-Protein alleine gegen das sowohl im F- als auch im HN-Gen-defiziente Genom exprimiert wird, wird ein Virusvektor mit F-Protein als Hülle hergestellt. Das Virus nur mit dem F-Protein, aber ohne HN-Protein, kann als Vektor verwendet werden, der spezifisch Leberepithelzellen infiziert, vermittelt durch den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASG-R). So werden virale Vektoren von Paramyxoviridae, die zumindest ein Hüllprotein umfassen, dessen Expression in modifizierter Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt wird, in die vorliegende Erfindung eingeschlossen.
  • Zusätzlich ist es auch möglich, den Vektor der vorliegenden Erfindung durch Verwendung von Hüllproteinen, die unterschiedlich sind von dem, dessen Expression durch Modifizieren der Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt wurde, wiederherzustellen. Es gibt keine besondere Begrenzung des Typs von solchen Hüllproteinen. Ein Beispiel von anderen viralen Hüllproteinen ist das G-Protein (VSVG) des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV). Der Virusvektor von Paramyxoviridae der vorliegenden Erfindung beinhaltet virale Vektoren vom Pseudotyp, welche das Hüllprotein umfassen, das aus einem Virus stammt, das unterschiedlich zu dem Virus ist, aus welchem das Genom stammt, so wie das VSV-G-Protein und dergleichen.
  • Virale Vektoren dieser Erfindung können gewöhnlich präpariert werden durch (a) Einführung einer Vektor-DNA, welche die von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die so modifiziert wurde, dass sie zumindest eines der viralen Hüllproteine der Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert, oder einen komplementären Strang der RNA in die Zellen (Helferzellen), welche die Hüllproteine exprimieren, um die RNAs zu exprimieren, und (b) Kultivierung der Zellen, um virale Partikel aus dem Kulturüberstand zu gewinnen. Durch Co- Expression von NP-, L- und P-Proteinen zur Zeit der Vektor-DNA-Expression, werden RNPs gebildet und ein Virus mit Hüllproteinen wird konstruiert.
  • Die in Helferzellen zu exprimierende Vektor-DNA codiert die Negativstrang-Einzelstrang-RNA (Negativstrang) oder den komplementären Strang davon (Positivstrang), die in Komplexen dieser Erfindung enthalten sind. Zum Beispiel wird die DNA, welche die Negativstrang-Einzelstrang-RNA oder den komplementären Strang davon codiert, stromabwärts des zu transkribierenden T7-Promotors mit RNA durch die T7-RNA-Polymerase verbunden. Die Vektor-DNAs können in Plasmide cloniert werden, um sie in E. coli zu amplifizieren. Obwohl der zu transkribierende Strang innerhalb der Zellen entweder ein Positiv- oder Negativstrang sein kann, ist es vorzuziehen, so anzuordnen, um den Positivstrang zur Verbesserung der Rekonstitutionseffizienz des Komplexes zu transkribieren.
  • Als Helferzellen werden Zellen, welche das Hüllprotein exprimieren, verwendet. Wie oben beschrieben, werden Helferzellen nicht auf Zellen begrenzt, welche alle Proteine der im Virusvektor defizienten Hüllproteingene exprimieren, zum Beispiel können für F-, HN-Gen-defiziente Sendai-Virusvektor-DNA Zellen, welche das F-Protein alleine exprimieren, als Helferzellen verwendet werden. Zusätzlich können auch Zellen, welche das Hüllprotein exprimieren, das unterschiedlich ist zu dem Protein, welches von dem in dem Virusvektor defizienten Hüllproteingen codiert wird, verwendet werden. Wie oben beschrieben, kann zum Beispiel ein Hüllprotein, das nicht das Hüllprotein eines Virus von Paramyxoviridae ist wie das VSV-G-Protein, auch als Hüllprotein verwendet werden.
  • Zum Beispiel kann ein viraler Vektor durch Transfizieren eines Plasmids, welches ein rekombinantes Sendai-Virusvektor-Genom exprimiert, das in Hüllproteingenen defizient ist, in Wirtszellen zusammen mit einem Vektor, welcher das defiziente Hüllprotein und Expressionsvektoren vom NP-, P/C- und L-Protein exprimiert, rekonstituiert werden. Alternativ kann der RNP-Komplex unter Verwendung von zum Beispiel Wirtszellen, welche mit dem F-Gen in die Chromosomen davon eingebaut sind, hergestellt werden. Die Aminosäuresequenzen dieser Proteingruppen, welche von außerhalb des viralen Genoms geliefert werden, brauchen nicht identisch mit jenen sein, welche aus dem Virus stammen. Solange diese Proteine gleichermaßen aktiv oder aktiver als Proteine vom natürlichen Typ beim Übertragen von Nucleinsäuren in die Zellen sind, können Gene, welche diese Proteine codieren durch Einfügen einiger Mutationen oder Ersetzen mit homologen Genen aus anderen Viren modifiziert werden. Da im Allgemeinen viele Hüllproteine Zytotoxizität zeigen, und deswegen angeordnet werden können, um nur exprimiert zu werden, wenn der Vektor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors rekonstituiert wird (vgl. Beispiele).
  • Wenn einmal das RNP oder das RNP enthaltende Virus gebildet wird, können Komplexe dieser Erfindung durch Einführung dieses RNP oder Virus wieder in die vorgenannten Helferzellen und durch deren Kultivierung amplifiziert werden. Dieser Prozess umfasst die Schritte von (a) Einführung eines Komplexes, welcher eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass sie zumindest ein Hüllprotein der Viren, welche zu Paramyxoviridae gehören, nicht exprimiert, und ein Protein, das an die Negativstrang-Einzelstrang-RNA an Zellen bindet, welche die Hüllproteine exprimieren, und (b) Kultivierung der Zellen und Gewinnen der Viruspartikel aus dem Kulturüberstand.
  • RNP kann in Zellen als ein Komplex, der zum Beispiel zusammen mit Lipofectamin und einem polykationischen Liposom gebildet wird, eingeführt werden. Speziell kann eine Vielfalt von Transfektionsreagenzien verwendet werden. Beispiele davon sind DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) usw. Chloroquin kann zugegeben werden, um RNP vom Abbau in Endosomen zu hindern (Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • Ist ein viraler Vektor in Wirtszellen einmal so konstruiert worden, kann er zusätzlich durch Co-Kultivierung dieser Zellen mit Zellen, welche Hüllproteine exprimieren, amplifiziert werden. Wie in Beispiel 12 beschrieben, ist ein bevorzugtes Beispiel das Verfahren der Überschichtung der Zellen, welche Hüllproteine exprimieren, über Virus produzierende Zellen.
  • Als Hüllprotein, neben einem viralen Hüllprotein, kann zum Beispiel ein chimäres Protein verwendet werden, welches in seiner extrazellulären Region ein aus einem Adhäsionsmolekül, einem Ligand, einem Rezeptorprotein abgeleitetes Polypeptid umfasst, und von solchen, die an spezifische Zellen anhaften können, und in seiner intrazellulären Region von der Virushülle abgeleitete Polypeptide umfasst. Hiermit können auf spezifische Gewebe gezielte Vektoren hergestellt werden. Virale Vektoren dieser Erfindung können zum Beispiel ein virales Gen umfassen, welches in dem Vektor enthalten ist, der modifiziert wurde, um die Antigenität zu reduzieren oder die RNA-Transkription und Replikationseffizienz zu verstärken.
  • Virale Vektoren dieser Erfindung können RNA beinhalten, welche ein Fremdgen in ihrer Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert. Irgendein Gen, von dem gewünscht wird, in den Zielzellen exprimiert zu werden, kann als Fremdgen verwendet werden. Wenn zum Beispiel Gentherapie beabsichtigt wird, kann ein Gen zur Behandlung einer objektiven Krankheit in die virale Vektor-DNA eingefügt werden. In dem Fall, wo ein Fremdgen in die virale Vektor-DNA, zum Beispiel die Sendai-Virus-Vektor-DNA eingefügt wird, ist es vorzuziehen, eine Sequenz, welche eine Nucleotidanzahl eines Vielfachen von sechs umfasst, zwischen der Transkriptionsterminationssequenz (E) und der Transkriptionsstartsequenz (S) einzufügen usw. (Journal of Virology, Bd. 67, Nr. 8, 1993, S. 4822-4830). Das Fremdgen kann vor oder nach jedem der Virusgene (NP-, P-, M-, F-, HN- und L-Gene) eingefügt werden (vgl. Beispiele). Die E-I-S-Sequenz (Transkriptionsstartsequenz-Intronsequenz-Transkriptionsterminationssequenz) oder ein Teil davon wird vor oder nach einem Fremdgen so eingefügt, dass die Expression der Gene vor oder nach dem Fremdgen nicht gestört wird. Das Expressionsniveau des eingefügten Fremdgens kann durch den Typ der Transkriptionsstartsequenz, angefügt stromaufwärts des Fremdgens, sowie durch die Stelle der Geninsertion und Nucleotidsequenzen vor und nach dem Gen reguliert werden. Je näher zum Beispiel im Sendai-Virus die Insertionsstelle an dem 3'-Ende der Negativstrang-RNA (in der Genanordnung auf dem viralen Genom des Wildtyps, je näher an dem NP-Gen) ist, desto höher ist das Expressionsniveau des eingefügten Gens. Um ein hohes Expressionsniveau eines Fremdgens zu sichern, ist es vorzuziehen, das Fremdgen in die Stromaufwärts-Region im Negativstrang-Genom wie stromaufwärts des NP-Gens (der 3'-Seite im Negativstrang) oder zwischen NP- und P-Genen einzufügen. Je näher umgekehrt die Insertionsposition an dem 5'-Ende der Negativstrang-RNA (in der Genanordnung auf dem viralen Genom des Wildtyps, je näher an dem L-Gen) ist, desto niedriger ist das Expressionsniveau des eingefügten Gens. Um die Expression eines Fremdgens auf ein niedriges Niveau zu unterdrücken, wird das Fremdgen zum Beispiel an die entfernteste 5'-Seite des Negativstrangs eingefügt, das heißt stromabwärts des L-Gens in dem viralen Genom des Wildtyps (die zum L-Gen im Negativstrang benachbarte 5'-Seite) oder stromaufwärts des L-Gens (die zum L-Gen im Negativstrang benachbarte 3'-Seite). Um die Insertion eines Fremdgens zu erleichtern, kann eine Clonierungstelle an der Insertionsposition angeordnet sein. Die Clonierungsstelle kann so gestaltet sein, dass sie zum Beispiel die Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme ist. Fremdgenfragmente können in die Restriktionsenzymstelle in der Vektor-DNA, welche das Genom codiert, eingefügt werden. Die Clonierungsstelle kann angeordnet werden, um eine so genannte Multicloning-Stelle zu sein, welche eine Vielzahl von Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen umfasst. Vektoren dieser Erfindung können an den Insertionsstellen Fremdgene außer jene, die oben beschrieben wurden, beherbergen.
  • Rekombinante Sendai-Virusvektoren, welche ein Fremdgen umfassen, können, wie folgt nach zum Beispiel der Beschreibung in „Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587" und „Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466" konstruiert werden.
  • Zuerst wird eine DNA-Probe hergestellt, welche die cDNA-Nucleotidsequenz eines gewünschten Fremdgens enthält. Es ist vorzuziehen, dass die DNA-Probe elektrophoretisch als ein einzelnes Plasmid bei Konzentrationen von 25 ng/μl oder mehr identifiziert werden kann. Unten wird ein Fall, wo ein Fremdgen an eine DNA, welche das virale Genom codiert, unter Verwendung der NotI-Stelle eingefügt wird, als Beispiel beschrieben werden. Wenn die NotI-Erkennungssstelle in die Nucleotidsequenz der Ziel-cDNA eingeschlossen wird, ist es vorzuziehen, die NotI-Stelle vorher durch Modifizieren der Nucleotidsequenz unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese und derartigen Verfahren zu deletieren, um nicht die Aminosäuresequenz zu ändern, welche durch die cDNA codiert wird. Aus dieser DNA-Probe wird das gewünschte Genfragment amplifiziert und durch PCR gewonnen. Um NotI-Stellen an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragments zu haben und zusätzlich eine Kopie der Transkriptionsterminationssequenz (E), des Introns (I) und der Transkriptionsstartsequenz (S) (EIS-Sequenz) des Sendai-Virus an einem Ende hinzuzufügen, werden eine synthetische DNA-Sequenz der Vorwärts-Seite und eine synthetische DNA-Sequenz der reversen Seite (Antisense-Strang) als Primerpaar, welches die NotI-Restriktionsenzym-Spaltungsstelle-Sequenz, die Transkriptionsterminationssequenz (E), das Intron (I), die Transkriptionsstartsequenz (S) und eine Teilsequenz des Zielgens enthält, hergestellt.
  • Um zum Beispiel die Abspaltung durch NotI zu sichern, wird die synthetische DNA-Sequenz der Vorwärts-Seite in einer Form angeordnet, in welcher zwei oder mehr beliebige Nucleotide (vorzugsweise 4 Nucleotide ausschließlich GCG und GCC, Sequenzen, welche in der NotI-Erkennungsstelle entstehen, bevorzugter ACTT) auf der 5'-Seite der synthetischen DNA ausgewählt werden, die NotI-Erkennungsstelle "gcggccgc" wird an ihre 3'-Seite hinzugefügt, und an die 3'-Seite davon werden beliebige gewünschte 9 Nucleotide oder Nucleotide von 9 plus einem Vielfachen von 6 Nucleotiden an die Spacer-Sequenz hinzugefügt, und an die 3'-Seite davon wird ein equivalenter ORF von etwa 25 Nucleotiden, einschließlich dem Startcodon ATG der gewünschten cDNA hinzugefügt. Vorzugsweise werden etwa 25 Nucleotide aus der gewünschten cDNA als synthetische DNA-Sequenz der Vorwärts-Seite so ausgewählt, dass sie G oder C als das letzte Nucleotid an ihrem 3'-Ende aufweisen.
  • In der synthetischen DNA-Sequenz der reversen Seite werden zwei oder mehr beliebige Nucleotide (vorzugsweise 4 Nucleotide ausschließlich GCG und GCC, Sequenzen, welche in der NotI-Erkennungsstelle entstehen, bevorzugter ACTT) aus der 5'-Seite der synthetischen DNA ausgewählt, die NotI-Erkennungsstelle "gcggccgc" wird an ihre 3'-Seite hinzugefügt und zu ihrer zusätzlichen 3'-Seite wird eine Oligo-DNA als Insertionsfragment hinzugefügt, um die Länge anzupassen. Diese Oligo-DNA wird so entworfen, dass die gesamte Nucleotidzahl einschließlich der NotI-Erkennungsstelle "gcggccgc", der komplementären Sequenz der cDNA und der EIS-Nucleotidsequenz des Sendai-Virus-Genoms, welche in dem unten beschriebenen Virus entsteht, ein Vielfaches von sechs wird (so genannte „Regel von sechs"; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998). Zusätzlich zu der 3'-Seite des eingefügten Fragments wird eine zur S-Sequenz des Sendai-Virus komplementäre Sequenz, vorzugsweise 5'-CTTTCACCCT-3', eine I-Sequenz, vorzugsweise 5'-AAG-3', und eine zur E-Sequenz komplementäre Sequenz, vorzugsweise 5'-TTTTTCTTACTACGG-3' hinzugefügt, und zusätzlich zu der 3'-Seite davon wird eine equivalente komplementäre Sequenz von etwa 25 Nucleotiden, abgezählt in der umgekehrten Richtung von dem Stoppcodon der gewünschten cDNA-Sequenz, deren Länge angepasst wird, um G oder C als letztes Nucleotid zu haben, ausgewählt und als 3'-Ende der synthetischen DNA der reversen Seite hinzugefügt.
  • Die PCR kann nach dem üblichen Verfahren mit zum Beispiel ExTaq-Polymerase (Takara Shuzo) ausgeführt werden. Vorzugsweise wird die PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (NEB) durchgeführt, und die so amplifizierten gewünschten Fragmente werden mit NotI verdaut, dann zur NotI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript eingefügt. Die so erhaltenen Nucleotidsequenzen der PCR-Produkte werden mit einem Sequenziergerät bestätigt, um ein Plasmid mit der richtigen Sequenz auszuwählen. Das eingefügte Fragment wird aus dem Plasmid unter Verwendung von NotI ausgeschnitten und zu der NotI-Stelle des Plasmids, welches die in Hüllproteingenen defiziente genomische cDNA trägt, cloniert. Alternativ ist es auch möglich, die rekombinante Sendai-Virus-cDNA durch direktes Einfügen des Fragments zur der NotI-Stelle ohne die Vermittlung des Plasmidvektors pBluescript zu erhalten.
  • Es ist auch möglich, eine virale Vektor-DNA der vorliegenden Erfindung in Reagenzgläsern oder Zellen zu transkribieren, RNP mit viralen L-, P- und NP-Proteinen wieder herzustellen und den Virusvektor, welcher dieses RNP umfasst, herzustellen. Die Rekonstitution des Virus aus der viralen Vektor-DNA kann nach den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung von Zellen, welche Hüllproteine exprimieren, ausgeführt werden:
    ( WO97/16539 und 97/16538 : Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell, M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et. al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. und Barrett, T., 1997, J. Virol, 71: 1265-1271; Bridgen, A. und Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404).
  • Wenn eine virale Vektor-DNA defizient in F-, HN- und/oder M-Genen gemacht wird, werden infektiöse Viruspartikel nicht mit solch einem defekten Vektor gebildet. Jedoch ist es möglich, infektiöse Viruspartikel durch separates Übertragen dieser defizienten Gene, Gene, welche andere virale Hüllproteine codieren, und ähnliche, zu Wirtszellen und durch deren Expression darin zu bilden.
  • Verfahren zum Übertragen der viralen Vektor-DNA in Zellen beinhalten das Folgende: 1) das Verfahren des Herstellens von DNA-Präzipitaten, die von Zielzellen aufgenommen werden können; 2) das Verfahren des Herstellens einer DNA, welche einen Komplex umfasst, welcher passend ist, um von Zielzellen aufgenommen zu werden und welcher auch nicht sehr zytotoxisch ist und eine positive Ladung hat, und 3) das Verfahren des sofortigen Rohrens von Poren auf der Zielzell-Membran, die weit genug sind, um den DNA-Molekülen zu ermöglichen, durch einen elektrischen Puls einzudringen.
  • Beim Verfahren 2) kann eine Vielfalt von Transfektionsreagenzien verwendet werden, Beispiele sind DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169), usw. Ein Beispiel von Verfahren 1) ist ein Transfektionsverfahren unter Verwendung von Calciumphosphat, bei welchem DNA, die in Zellen eindrang, in Phagosomen eingebaut werden, und eine ausreichende Menge wird auch in die Zellkerne eingebaut (Graham, F. L. und Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. und Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223). Chen und Okayama erforschten die Optimierung der Übertragungstechnik, wobei sie berichteten, dass optimale DNA-Präzipitate unter den Bedingungen erhalten werden können, wo 1) Zellen mit DNA in einer Atmosphäre von 2 bis 4% CO2 bei 35°C 15 bis 24 h inkubiert werden, 2) zyklische DNA mit einer höheren Präzipitat bildenden Aktivität als lineare DNA verwendet wird, und 3) die DNA-Konzentration in der Präzipitationsmischung 20 bis 30 μg/ml ist (Chen, C. und Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). Verfahren 2) ist passend für eine vorübergehende Transfektion. Ein altes Verfahren ist auf dem Fachgebiet bekannt, bei welchem eine Mischung von DEAE-Dextran (Sigma #D-9885, M.W. 5 × 105) in einem gewünschten DNA-Konzentrationsverhältnis hergestellt wird, um die Transfektion durchzuführen. Da die meisten der Komplexe innerhalb der Endosomen abgebaut werden, kann Chloroquin zugegeben werden, um die Transfektionseffekte zu verstärken (Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). Verfahren 3) wird als Elektroporation bezeichnet und ist vielseitiger, verglichen mit Verfahren 1) und 2), weil es keine Zellselektivität hat. Verfahren 3) gilt als effizient unter optimalen Bedingungen für Pulsstromdauer, Pulsform, elektrische Feldstärke (Abstand zwischen Elektroden, elektrische Spannung), Leitfähigkeit der Puffer, DNA-Konzentration und Zelldichte.
  • Unter den oben beschriebenen drei Kategorien sind Transfektionsreagenzien (Verfahren 2)) passend in dieser Erfindung, weil Verfahren 2) leicht betriebsfähig ist und das Prüfen von vielen Testproben unter Verwendung einer großen Zellmenge erleichtert. Vorzugsweise wird Superfect Transfection Reagent (QIAGEN, Kat. Nr. 301305) oder DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1811169) verwendet.
  • Speziell kann die Rekonstitution des viralen Vektors aus cDNA durchgeführt werden, wie folgt.
  • Von Affenniere abgeleitete LLC-MK2-Zellen werden in 24-Well bis 6-Well Plastikkulturplatten oder einer Kulturschale von 100 mm Durchmesser unter Verwendung eines Minimalmediums (MEM), welches 10% fötales Kalbserum (FCS) und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) enthält, zu 70 bis 80% Konfluenz kultiviert und mit zum Beispiel dem rekombinanten Vacciniavirus vTF7-3, welches T7-Polymerase exprimiert, bei 2 PFU/Zelle infiziert. Dieses Virus wurde durch eine Behandlung mit UV-Bestrahlung 20 min in der Anwesenheit von 1 μg/ml Psoralen inaktiviert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986; Kato, A. et al., Gene Cells 1: 569-579, 1996). Die Menge von zugegebenem Psoralen und die UV-Bestrahlungszeit kann geeignet angepasst werden. Eine Stunde nach der Infektion werden die Zellen mit 2 bis 60 μg, bevorzugter 3 bis 5 μg der oben beschriebenen rekombinanten Sendai-Virus-cDNA durch das Lipofektionsverfahren und ähnlichem unter Verwendung von Plasmiden (24 bis 0.5 μg pGEM-N, 12 bis 0.25 μg pGEM-P und 24 bis 0.5 μg pGEM-L, bevorzugter 1 μg pGEM-N, 0.5 μg pGEM-P und 1 μg pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996), welche trans-acting virale Proteine exprimieren, welche für die Herstellung des Sendai-viralen Genoms von ganzer Länge benötigt werden, zusammen mit Superfect (QIAGEN) transfiziert. Die transfizierten Zellen werden in einem serumfreien MEM kultiviert, welches jeweils 100 μg/ml Rifampicin (Sigma) und Cytosinarabinosid (AraC) enthält, wenn gewünscht, bevorzugter nur 40 μg/ml Cytosinarabinosid (AraC) (Sigma) enthält, und Konzentrationen der Reagenzien werden at Optima gesetzt, um die Zytotoxizität auf Grund des Vacciniavirus zu minimieren und die Gewinnungsrate des Virus zu maximieren (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1, 569-579). Nach der Kultivierung für etwa 47 bis 72 h nach der Transfektion werden die Zellen gewonnen, indem sie durch drei sich wiederholende Zyklen von Gefrieren und Tauen aufgebrochen werden, mit LLC-MK2-Zellen, welche die Hüllproteine exprimieren, transfiziert und kultiviert werden. Nach Kultivierung der Zellen für 3 bis 7 Tage wird die Kulturlösung gesammelt. Alternativ können die infektiösen Virusvektoren effizienter durch Transfizieren der LLC-MK2-Zellen, welche bereits Hüllproteine exprimieren mit Plasmiden, welche NP-, L- und P-Proteine exprimieren, oder durch Transfizieren zusammen mit einem Hüllprotein-exprimierenden Plasmid erhalten werden. Die viralen Vektoren können durch Kultivierung dieser Zellen, überschichtet auf LLC-MK2-Zellen, welche Hüllproteine exprimieren, amplifiziert werden (vgl. Beispiele). Der in dem Kulturüberstand enthaltende Virustiter kann durch Messung der Hämagglutinationsaktivität (HA) bestimmt werden, welche durch das „Endo-Point-Verdünnungsverfahren" untersucht werden kann (Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579). Der so erhaltene Virusstamm kann bei -80°C gelagert werden.
  • Die rekombinanten Sendai-Virusvektoren dieser Erfindung können geeignet verdünnt werden, zum Beispiel mit physiologischer Kochsalzlösung und mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), um eine Zusammensetzung herzustellen. Wenn die rekombinanten Sendai-Virusvektoren dieser Erfindung in Hühnereiern und ähnlichem vermehrt werden, kann die Zusammensetzung Chorioallantoisflüssigkeit beinhalten. Zusammensetzungen, welche rekombinante Sendai-Virusvektoren dieser Erfindung umfassen, können physiologisch verträgliche Medien wie deionisiertes Wasser, wässrige 5%ige Dextrose-Lösung und so weiter enthalten, und darüber hinaus können auch andere Stabilisatoren und Antibiotika enthalten sein.
  • Der Typ der für die Virus-Rekonstitution verwendeten Wirtszellen ist nicht besonders begrenzt, so lange der virale Vektor darin rekonstituiert werden kann. Zum Beispiel können bei der Rekonstitution des Sendai-Virusvektors oder des RNP-Komplexes Kulturzellen wie aus Affenniere abgeleitete CV-I-Zellen und LLC-MK2-Zellen, aus Hamsterniere abgeleitete BHK-Zellen und so weiter verwendet werden. Die infektiösen Viruspartikel mit der Hülle können auch durch Expression geeigneter Hüllproteine in diesen Zellen erhalten werden. Um den Sendai-Virusvektor in einer großen Menge zu erhalten, kann der Vektor zum Beispiel durch Infizieren des aus den oben beschriebenen Wirtszellen erhaltenen Virusvektor in Hühner-Bruteier zusammen mit Vektoren, welche Hüllproteingene exprimieren, amplifiziert werden. Alternativ können virale Vektoren unter Verwendung von transgenen Hühnereiern, eingebaut mit Hüllprotein-Genen, hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von viraler Flüssigkeit unter Verwendung von Hühnereiern wurden bereits entwickelt (Nakanishi, et al., (Hrsg.), 1993, "shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III (High Technology Protocol III of Neuroscience Research), Molecular Neurocyte Physiology, Koseisha, Osaka, S. 153-172). Speziell werden zum Beispiel befruchtete Eier in einen Inkubator gelegt und 9 bis 12 Tage bei 37 bis 38°C inkubiert, um Embryos zu züchten. Der Sendai-Virusvektor wird zusammen mit Vektoren, welche Hüllproteine exprimieren, in die Chorioallantois-Höhle der Eier geimpft und einige Tage kultiviert, um das Virus zu vermehren. Die Bedingungen so wie Züchtungsdauer können in Abhängigkeit von dem Typ des verwendeten rekombinanten Sendai-Virus variiert werden. Anschließend wird die Choriaollantoisflüssigkeit, welche das Virus umfasst, gewonnen. Die Trennung und Reinigung des Sendai-Virusvektors kann nach Standardverfahren durchgeführt werden (Tashiro, M., „Virus Experiment Protocols", Nagai und Ishihama (Hrsg.), Medicalview, S. 68-73 (1995)).
  • Als Vektor, um Hüllproteine zu exprimieren, können die viralen Vektoren selbst dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel, wenn zwei Typen von Vektoren, bei denen das vom viralen Genom defiziente Hüllproteingen unterschiedlich ist, auf dieselbe Zelle übertragen werden, wird das in einem RNP-Komplex defiziente Hüllprotein durch die Expression des anderen Komplexes geliefert, um einander zu ergänzen, was dadurch zu der Bildung von infektiösen Viruspartikeln und Aktivierung des Replikationszyklus führt, um die viralen Vektoren zu amplifizieren. Das heißt, wenn Zellen mit zwei oder mehr Typen von Vektoren in Kombination angeimpft werden, um jeweils die Hüllproteine des anderen zu ergänzen, können Mischungen von in den jeweiligen Hüllproteinen defizienten Virusvektoren im großen Maßstab und zu niedrigen Kosten hergestellt werden. So hergestellte gemischte Viren sind nützlich für die Herstellung von Impfstoffen und ähnlichem. Auf Grund der Defizienz der Hüllproteingene haben diese Viren eine kleinere Genomgröße, verglichen mit dem vollständigen Virus, so können sie ein langes Fremdgen beherbergen. Da diese ursprünglich nicht infektiösen Viren extrazellulär verdünnt werden und es schwierig ist, ihre Co-Infektion beizubehalten, werden sie auch steril, was günstig ist beim Bewältigen ihrer Freisetzung in die Umgebung.
  • Die Gentherapie wird durch Verabreichen von viralen Vektoren befähigt, wenn die viralen Vektoren durch Verwendung eines therapeutischen Gens als Fremdgen präpariert werden. Bei der Anwendung von viralen Vektoren dieser Erfindung für die Gentherapie ist es möglich, ein Fremdgen, mit dem Behandlungseffekte erwartet werden, oder ein endogenes Gen, dessen Versorgung in dem Körper des Patienten unzureichend ist, durch entweder direkte oder indirekte (ex vivo) Verabreichung des Komplexes zu exprimieren. Es gibt keine besondere Begrenzung auf den Typ des Fremdgens, und zusätzlich zu Nucleinsäuren, welche Proteine codieren, kann es Nucleinsäuren geben, welche keine Proteine codieren, wie ein Antisense oder Ribozym. Zusätzlich, wenn Gene, welche Antigene von Bakterien oder Viren codieren, die bei infektiösen Krankheiten einbezogen sind, als Fremdgene verwendet werden, kann die Immunität bei Tieren durch Verabreichen dieser Gene an die Tiere induziert werden. Das heißt, diese Gene können als Impfstoffe verwendet werden.
  • Wenn die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung als Impfstoffe verwendet werden, können sie beispielsweise anwendbar sein für Krebserkrankungen, infektiöse Erkrankungen und andere allgemeine Erkrankungen. Zum Beispiel ist es bei einer Krebsbehandlung möglich, Gene mit therapeutischen Effekten auf Tumorzellen oder Antigen präsentierenden Zellen (APC) wie DC-Zellen unter Verwendung der Vektoren der Erfindung zu exprimieren. Beispiele von solchen Genen sind jene, welche das Tumorantigen Muc-1 oder das Muc-1-ähnliche Mutin-Tandem-Repeat-Peptid ( US Patent Nr. 5,744,144 ), das Melanomantigen gp100 usw. codieren. Solche Behandlungen mit Genen wurden weithin bei Krebserkrankungen in der Brustdrüse, Dickdarm, Pankreas, Prostata, Lunge usw. angewandt. Die Kombination mit Zytokinen, um die adjuvanten Effekte zu verstärken, ist auch effektiv bei der Gentherapie. Beispiele von solchen Genen sind i) Einzelketten-IL-12 in Kombination mit IL-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15):8591-8596, ii) Interferon-y in Kombination mit IL-2 ( US Patent Nr. 5,798,100 ), iii) Granulozytenkolonie stimulierender Faktor (GM-CSF), allein verwendet, und iv) GM-CSF, abzielend auf die Behandlung von Hirntumor in Kombination mit IL-4 (J. Neurosurgery, 90 (6), 1115-1124 (1999)), usw.
  • Beispiele von für die Behandlung von infektiösen Krankheiten verwendeten Gene sind jene, welche das Hüllprotein des virulenten Stamms H5N1-Typ des Influenza-Virus codieren; das chimäre Hüllprotein des japanischen Enzephalitis-Virus (Vaccine, Bd. 17, Nr. 15-16, 1869-1882 (1999)), das HIV-Gag- oder SIV-Gag-Protein des AIDS-Virus (J. Immunology (2000), Bd. 164, 4968-4978), das HIV-Hüllprotein, welches als oraler Impfstoff, verkapselt in Polyacetat-Glycol-Copolymer-Mikropartikel zur Verabreichung, aufgenommen wird (Kaneko, H. et al., Virology 267, 8-16 (2000)), die B-Untereinheit (CTB) des Cholera-Toxins (Arakawa, T. et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8; Arakawa, T. et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (3): 292-297), das Glykoprotein des Rabiesvirus (Lodmell, D. L. et al., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52) und das Kapsidprotein L1 des menschlichen Papilloma-Virus 6, welches Gebärmutterhalskrebs verursacht (J. Med. Virol., 60, 200-204 (2000).
  • Gentherapie kann auch bei allgemeinen Erkrankungen angewandt werden. Zum Beispiel wurde in dem Fall von Diabetes die Expression des Insulin-Peptidfragments durch Impfung von Plasmid-DNA, welche das Peptid codiert, in Typ 1-Diabetes-Modelltieren durchgeführt (Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104 (2): 189-94).
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 ist eine Aufnahme, welche ein analytisches Ergebnis der Expression des F-Proteins über ein Cre-IoxP-induzierbares Expressionssystem durch Western-Blotting zeigt. Sie zeigt das Ergebnis des Nachweisens der Proteine auf einer Transfermembran, welche mit dem anti-SeV-F-Antikörper kreuzreagiert, durch das Chemilumineszenz-Verfahren.
  • 2 zeigt ein Diagramm an, welches ein analytisches Ergebnis der Zelloberflächendarstellung des F-Proteins zeigt, dessen Expression durch das Cre-IoxP-System induziert wurde. Es zeigt die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse für LLC-MK2/F7 mit dem anti-SeV-F-Antikörper.
  • 3 zeigt eine Aufnahme an, welche das Ergebnis zeigt, das die Abspaltung des exprimierten F-Proteins durch Trypsin unter Verwendung von Western-Blotting bestätigt.
  • 4 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das die Zelloberflächenexpression von HN in einem Experiment der Zelloberflächenadsorption auf Erythrozyten bestätigt.
  • 5 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch einen Versuch, die defizienten Viren durch Verwendung von Zellen zu ernten, welche das defiziente Protein exprimieren, erhalten wurde. Es wurde offenbart, dass die Expression des F-Proteins durch die Helferzelllinie schnell durch die bei der Rekonstitution des F-defizienten SeV verwendeten Vacciniaviren gestoppt wurde.
    • 1. LLC-MK2 und CV-1 repräsentieren Zelllysate aus den jeweiligen Zelltypen alleine.
    • 2. LLC-MK2/F+ad und CV-1/F+ad repräsentieren Zelllysate aus den jeweiligen Zellen, welche der Expressionsinduktion unterworfen wurden und zu denen Adenovirus AxCANCre hinzugefügt wurde.
    • 3. LLC-MK2/F-ad und CV-1/F-ad repräsentieren Zelllysate aus den jeweiligen Zelllinien, in welchen das F-Gen, aber nicht das Adenovirus AxCANCre eingeführt wurde.
    • 4. LLC-MK2/F+ad 3rd repräsentiert ein Zelllysat aus Zellen, in denen die Expression durch Adenovirus AxCANCre induziert wurde und welche dann zusätzlich 3-mal passagiert wurden.
    • 5. 1d bzw. 3d zeigen einen Tag und drei Tage nach der Induktion der Expression an.
    • 6. Vac1d bzw. Vac3d zeigen Zellen einen Tag und drei Tage nach der Infektion des Vacciniavirus an.
    • 7. AraC1d bzw. AraC3d zeigen Zellen einen Tag und drei Tage nach der Zugabe von AraC an.
    • 8. CHX 1d bzw. CHX 3d zeigen Zellen einen Tag und drei Tage nach der Zugabe des Proteinsynthesehemmers Cycloheximid an.
  • 6 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Beobachtung der GFP-Expression erhalten wurde, nachdem GFP umfassende F-defiziente SeV-cDNA (pSeV18/ΔF-GFP) in LLC-MK2-Zellen transfiziert wurde, in denen F nicht exprimiert wurde (Nachweis von RNP). In einer Kontrollgruppe wurde das F-Gen mit dem NP-Gen am 3'-Ende gemischt, und dann wurde die SeV-cDNA (F-gemischtes SeV) verwendet, in welcher GFP in die F-defiziente Stelle eingeführt worden war. Die Bezeichnung „alle" zeigt Zellen an, welche mit Plasmiden transfiziert wurden, welche die Expression des NP-Gens, P-Gens und L-Gens (pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L) zusammen mit der SeV-cDNA zur selben Zeit steuern; „cDNA" zeigt Zellen an, welche mit cDNA (pSeV18+/ΔF-GFP) alleine transfiziert wurden. Für die RNP-Transfektion, wurden P0-Zellen, welche GFP exprimieren, gesammelt; die Zellen (10 Zellen/ml) wurden in OptiMEM (GIBCO BRL) suspendiert; 100 μl Lysat, das nach dreimaliger Behandlung mit Gefrier-Tau-Zyklen präpariert wurde, wurden mit 25 μl kationisches Liposom DOSPER (Boehringer Mannheim) gemischt und ermöglicht, bei Raumtemperatur 15 Minuten stillzustehen; und die Mischung wurde zu Zellen (+ad) gegeben, in denen die Expression von F induziert worden war, um die RNP-Transfektion auszuführen. Zellen, welche die Cre-DNA-Rekombinase exprimieren, in denen kein rekombinantes Adenovirus eingeführt worden war, wurden als Kontrollgruppe der Zellen (-ad) verwendet. Das Ergebnis zeigte, dass GFP in Abhängigkeit von der RNP-Bildung von SeV in PO in LLC-MK2-Zellen exprimiert wurde; und das F-defiziente Virus wurde in Abhängigkeit von der Expressionsinduktion von F in P1 amplifiziert.
  • 7 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Prüfen erhalten wurde, ob funktionelles RNP, das mit F-defizienter genomischer cDNA wieder hergestellt wurde, durch F-exprimierende der Helferzellen geborgen werden konnte und die infektiösen Virionen des defizienten Virus gebildet wurden. RNP/o repräsentiert Zellen, überschichtet mit RNP; RNP/t repräsentiert Zellen, die mit RNP transfiziert wurden.
  • 8 zeigt Aufnahmen an, welche den Hinweis für das F-exprimierende zellspezifische Wachstum des F-defizienten Virus zeigt. Das Lysat, welches funktionelles RNP umfasst, das aus dem Genom, dem das Gen fehlt, konstruiert wurde, wurde mit den F-exprimierenden Zellen lipofiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben; und der Kulturüberstand wurde dann gewonnen. Dieser Kulturüberstand wurde zu dem Medium der F-exprimierenden Zellen gegeben, um die Infektion zu erreichen; am dritten Tag wurde der Kulturüberstand gewonnen und gleichzeitig zu sowohl F-exprimierenden Zellen als auch Zellen, die nicht F exprimierten, gegeben; und dann wurden die Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Trypsin drei Tage kultiviert. Das Ergebnis wird hier gezeigt. Die Viren wurden nur in Anwesenheit von Trypsin in den F-exprimierenden Zellen amplifiziert.
  • 9 zeigt Aufnahmen an, welche den Hinweis für die spezifische Freisetzung der F-defizienten Viren zu dem Kulturüberstand nach der Einführung in die F-exprimierenden Zellen zeigen. Das Lysat, welches funktionelles RNP, konstruiert aus dem Genom, dem das Gen fehlt, umfasst, wurde mit den F-exprimierenden Zellen lipofiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben, und dann wurde der Kulturüberstand gewonnen. Dieser Kulturüberstand wurde zu dem Medium der F-exprimierenen Zellen gegeben, um die Infektion zu erreichen; am dritten Tag wurde der Kulturüberstand gewonnen und gleichzeitig zu sowohl F-exprimierenden Zellen als auch zu Zellen, die nicht F exprimierten, gegeben; und dann wurden die Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Trypsin drei Tage kultiviert. Das untere Feld zeigt das Ergebnis mit dem Überstand der Zellen, die nicht F exprimierten.
  • 10 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Erhalt der Viren aus dem Kulturüberstand der F-exprimierenden Zellen, durch Extraktion der Gesamt-RNA und Durchführung der Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von F und HN als Sonden erhalten wurde, um die genomische Struktur des aus der F-defizienten cDNA gewonnenen Virions zu verifizieren. In den aus den F-exprimierenden Zellen gewonnenen Viren wurde das HN-Gen nachgewiesen, aber das F-Gen war nicht nachweisbar; und so wurde es verdeutlicht, dass das F-Gen in dem viralen Genom nicht vorhanden war.
  • 11 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der RT-PCR zeigen, welche zeigt, dass das GFP-Gen an dem Ort vorhanden ist, wo F deletiert worden war, wie in dem Konstrukt der cDNA. 1: +18-NP für den Nachweis der Anwesenheit der +18-NotI-Stelle. 2: M-GFP für den Nachweis der Anwesenheit des GFP-Gens in der F-Gen-defizienten Region. 3: F-Gen, für den Nachweis der Anwesenheit des F-Gens. Die genomischen Strukturen des Wildtyp-SeV und des F-defizienten GFP exprimierenden SeV werden in dem oberen Feld gezeigt. Es wurde verifiziert, dass das GFP-Gen in dem F-defizienten Ort vorhanden war, von +18 abgeleitete NotI-Stelle war bei dem 3'-Ende von NP vorhanden und das F-Gen fehlte in jedem Teil des RNA-Genoms.
  • 12 zeigt Aufnahmen an, die durch Immunelektronenmikroskopie mit an Goldkolloid gebundenem IgG (anti-F, anti-HN), welcher spezifisch mit F oder HN des Virus reagiert, erhalten wurden. Es wurde verdeutlicht, dass die stachelähnliche Struktur der Virushülle F- und HN-Proteine umfasste.
  • 13 zeigt Diagramme an, welche das Ergebnis der RT-PCR zeigen, welche zeigt, dass die Strukturen der Gene mit Ausnahme des GFP-Gens die gleichen wie jene von dem Wildtyp waren.
  • 14 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Untersuchung der Morphologie des F-defizienten Viruspartikels durch Elektronenmikroskopie erhalten wurde. Wie die Viruspartikel des Wildtyps hatten die F-defizienten Viruspartikel helicale RNP-Struktur und innen stachelähnliche Struktur.
  • 15 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der in vitro-Genübertragung zu einer Vielfalt von Zellen unter Verwendung eines F-defizienten SeV-Vektors mit einer hohen Effizienz zeigt.
  • 16 zeigt Diagramme an, welche das analytische Ergebnis zeigen, das nach der Einführung des F-defizienten SeV-Vektors in primäre Knochenmarkzellen von der Maus (BM c-Kit+/-) erhalten wurde. Leere Balken repräsentieren PE-positiv/GFP-negativ; ausgefüllte Balken repräsentieren PE-positiv/GFP-positiv.
  • 17 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der in vivo-Verabreichung des Vektors in das Hirnventrikel der Ratte zeigen.
  • 18 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Verwendung des Kulturüberstands erhalten wurde, welcher F-defiziente SeV-Viren umfasst, die aus den F-exprimierenden Zellen gewonnen wurden, um LLC-ML2-Zellen zu infizieren, die nicht F exprimieren, durch drei Tage Kultivieren der Zellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Trypsin, um die Anwesenheit der Viren in dem Überstand durch HA-Assay zu bestätigen.
  • 19 ist eine Aufnahme, welche das Ergebnis zeigt, das durch Durchführen des HA-Assays von Chorioallantoisflüssigkeiten nach 2 Tagen Inkubation von einem Hühner-Brutei, welches mit Chorioallantoisflüssigkeit (Spuren 11 und 12) von HA-positiven Bruteiern beimpft worden war, in 18B erhalten wurde.
  • 20 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Untersuchung der Virusflüssigkeit, welche HA-positiv ist und keine Infektiosität hat, durch Immunelektronenmikroskopie erhalten wurde. Die Anwesenheit der Viruspartikel wurde verifiziert und es wurde gefunden, dass die Virionenhülle reaktiv gegen den Antikörper war, welcher das mit Goldkolloid markierte HN-Protein erkennt, aber nicht reaktiv gegen den Antikörper war, welcher das mit Goldkolloid markierte F-Protein erkennt.
  • 21 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der Transfektion von F-defizienten Viruspartikeln in Zellen zeigt.
  • 22 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der Bildung von Zellen zeigen, welche F und HN co-exprimieren, welche durch Western-Blotting ausgewertet wurden. LLC/VacT7/pGEM/FHN repräsentiert Zellen, welche durch Transfektion von Vaccinia infizierten LLC-MK2-Zellen mit dem pGEM/FHN-Plasmid erhalten wurde; LLC/VacT7 repräsentiert Vaccinia infizierte LLC-MK2-Zellen. LLCMK2/FHNmix repräsentiert LLC-MK2-Zellen, bei denen die F- und HN-Gene eingeführt, aber nicht cloniert wurden. LLC/FHN repräsentiert LLC-MK2-Zellen, bei denen die F- und HN-Gene eingeführt wurden und die Expression durch Adenovirus (nach 3 Tagen) induziert wurde; 1-13, 2-6, 2-16, 3-3, 3-18, 3-22, 4-3 und 5-9 sind Zelllinie-Nummern (Namen) bei der Clonierung.
  • 23 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis für den Nachweis der Viruserzeugung in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von pGEM/FHN zeigt. Die FHN-defizienten GFP-exprimierenden SeV-cDNA, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L und pGEM/FHN wurde gemischt und in LLC-MK2-Zellen eingeführt. 3 Stunden nach der Genübertragung wurde das Medium mit MEM gewechselt, welches AraC und Trypsin enthält, und die Zellen wurden zusätzlich drei Tage kultiviert. 2 Tage nach der Genübertragung wurde die Beobachtung mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop ausgeführt, um den Unterschied in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von pGEM/FHN auszuwerten, und die Viruserzeugung wurde auf der Grundlage der Ausbreitung der GFP-exprimierenden Zellen verifiziert. Das Ergebnis wird hier gezeigt. Wenn pGEM/FHN zur Zeit der Rekonstitution hinzugefügt wurde, wurde die Ausbreitung von GFP-exprimierenden Zellen erkannt; aber wenn kein pGEM/FHN hinzugefügt wurde, war die GFP-Expression lediglich in einer Einzelzelle beobachtbar.
  • 24 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der Rekonstitution durch RNP-Transfektion und das Wachstum von FHN-defizienten Viren zeigt. Am dritten Tag nach der Expressionsinduktion wurden Zellen, welche FHN (12 Wells) co-exprimierten, unter Verwendung von PO RNP-Überschichtung oder DOSPER lipofiziert, und dann wurde nach 4 Tagen GFP beobachtet. Wenn die RNP-Transfektion durchgeführt wurde, war die Ernte der Viren erfolgreich für die P1 FHN exprimierenden Zellen, wie sie für die F-defizienten war (oben). Das Wachstum der FHN-defizienten Viren wurde nach Impfung einer Flüssigkeit, welche die Viren enthielt, zu den Zellen, in denen die Expression des FHN-Proteins 6 oder mehrere Stunden nach der Infektion mit Ade/Cre induziert wurde, verifiziert (unteres Feld).
  • 25 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das nach Impfung der Flüssigkeit, welche die Viren enthielt, die aus der FHN-defizienten GFP exprimierenden cDNA rekonstituiert wurden, zu LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/HN und LLC-MK2/FHN und deren Züchtung in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Trypsin erhalten wurde. Die Ausbreitung der Zellen, welche das GFP-Protein exprimieren, wurde 3 Tage nach der Züchtung verifiziert. Das Ergebnis wird hier gezeigt. Die Ausbreitung von GFP wurde nur mit LLC-MK2/FHN beobachtet, und so wurde bestätigt, dass das in der Flüssigkeit enthaltende Virus auf eine Weise, spezifisch zur FHN-Co-Expression und abhängig von Trypsin, gezüchtet wurde.
  • 26 ist eine Aufnahme, welche das Ergebnis zeigt, wo die Bestätigung für die genomische Struktur der RNA, die vom Überstand der FHN-exprimierenden Zellen stammt, ausgeführt wurde.
  • 27 ist eine Aufnahme, welche das Ergebnis zeigt, wo die Bestätigung für die genomische Struktur der RNA, die vom Überstand der F-exprimierenden Zellen stammt, welche mit den FHN-defizienten Viren sind, ausgeführt wurde.
  • 28 ist ein Diagramm, welches die Inaktivierung des Vacciniavirus und die T7-Aktivität zeigt, wenn die Psoralen-Konzentration bei der Psoralen/UV-Bestrahlung variiert wurde.
  • 29 ist ein Diagramm, welches die Inaktivierung des Vacciniavirus und die T7-RNA-Polymerase-Aktivität zeigt, wenn die Dauer der UV-Bestrahlung bei der Psoralen/UV-Bestrahlung variiert wurde.
  • 30 zeigt Aufnahmen an, welche eine Zytotoxizität (CPE) des Vacciniavirus nach der Psoralen/UV-Bestrahlung zeigen. 3 × 105 LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 6-Well-Platte plattiert. Nach Kultivierung über Nacht wurden die Zellen mit Vacciniavirus bei moi=2 infiziert. Nach 24 Stunden wurde CPE bestimmt. Das Ergebnis von CPE bei Pseudobehandlung des Vacciniavirus wird in A gezeigt; CPE nach der Behandlung mit Vacciniavirus 15, 20 oder 30 Minuten werden in B, C bzw.
  • D gezeigt.
  • 31 ist ein Diagramm, welches den Einfluss der UV-Behandlungsdauer des Vacciniavirus bei der Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virus anzeigt.
  • 32 ist ein Diagramm, welches den Titer des zur Replikation fähigen Vacciniavirus anzeigt, der in den Zellen nach dem Rekonstitutionsexperiment des Sendai-Virus blieb.
  • 33 ist eine Aufnahme, welche das Ergebnis der Western-Blot-Analyse unter Verwendung des anti-VSV-G-Antikörpers zeigt.
  • 34 zeigt ein Diagramm an, welches Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung des anti-VSV-G-Antikörpers zeigt. Es zeigt das Ergebnis der Analyse der LLC-MK2-Zelllinie (L1) für die Induktion der VSV-G-Expression am vierten Tag nach der AxCANCre-Infektion (moi = 0, 2.5, 5). Der verwendete primäre Antikörper war der anti-VSV-G-Antikörper (MoAb I-1); der sekundäre Antikörper war der mit FITC markierte anti-Maus-Ig.
  • 35 zeigt Aufnahmen an, welche ein Ergebnis zeigen, wo Überstände nach der Infektion mit geänderten Mengen von AxCANCre (MOI = 0, 1.25, 2.5, 5, 10) und einer konstanten Menge des Pseudotyp-Sendai-Virus mit einem F-Gen-defizienten Genom gewonnen wurden, und die Überstände zusätzlich verwendet wurden, um die Zellen vor der VSV-G-Induktion (-) und nach Induktion (+) zu infizieren, und Zellen, welche GFP exprimieren, nach 5 Tagen beobachtet wurden.
  • 36 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das für den Zeitverlauf der Virusproduktionsmenge erhalten wurde.
  • 37 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Untersuchung erhalten wurde, ob die Infektiosität durch die Behandlung des Pseudotyp-Sendai-Virus mit dem F-Gen-defizienten Genom, welches mit der VSV-G exprimierenden Zelllinie etabliert wurde, und durch das FHN-defiziente Sendai-Virus, welches mit anti-VSV-Antikörper behandelt wurde, beeinflusst wird.
  • 38 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, wo die Expression des GFP-Gens als Index für die Erzeugung des Pseudotyp-Virus, der VSV-G in seinem Kapsid nach der Infektion der VSV-G-Gen exprimierenden Zellen LLCG-L1 mit dem F- und HN-defizientem Sendai-Virus, welches das GFP-Gen aufweist, getestet wurde.
  • 39 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis zeigen, das durch Western-Analyse des Proteins in dem Extrakt der infizierten Zellen bestätigt, dass die in den VSV-G-Gen-exprimierenden Zellen gewachsene Viren defizient in F- und HN-Genen waren.
  • 40 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis für die Beobachtung der GFP exprimierenden Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen.
  • 41 ist ein Diagramm, welches die Verbesserung in der Effizienz für die Rekonstitution des SeV/ΔF-GFP durch die kombinierte Verwendung des Hüllproteinexprimierenden Plasmids und der Zellüberschichtung zeigt. Beachtliche Verbesserung wurde am d3 bis d4 (Tag 3 bis Tag 4) von PO (vor dem Passagieren) beobachtet.
  • 42 ist ein Diagramm, welches das Ergebnis zeigt, wo die Behandlungsbedingungen für die Rekonstitution von SeV/ΔF-GFP durch die kombinierte Verwendung des Hüllprotein-exprimierenden Plasmids und der Zellüberschichtung ausgewertet wurden. GFP-positive Zellen repräsentieren die Menge des rekonstituierten Virus.
  • 43 ist ein Diagramm, welches das Ergebnis zeigt, bei dem die Rekonstitution der F-defizienten Sendai-Viren aus der cDNA getestet wurde. Es zeigt die Verbesserung in der Effizienz für die Rekonstitution von SeV/ΔF-GFP durch die kombinierte Verwendung des Hüllprotein-exprimierenden Plasmids und der Zellüberschichtung.
  • Alle die Tests waren am siebten Tag positiv. Jedoch wurde die Effizienz am dritten Tag ausgewertet, wo die Erfolgswahrscheinlichkeit im mittleren Bereich war.
  • 44 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der IacZ-Expression durch den LacZ umfassenden F-defizienten Sendai-Virusvektor zeigt, welcher kein GFP umfasst.
  • 45 zeigt Diagramme an, welche die Subclonierung des genomischen cDNA-Fragments des Sendai-Virus (A) und die Strukturen von 5 genomischen cDNAs des Sendai-Virus, welche mit neu eingeführter NotI-Stelle (B) konstruiert wurden, zeigen.
  • 46 ist ein Diagramm, welches Strukturen von Plasmiden zeigt, die für die Clonierung zu verwenden sind, um die NotI-Stelle, das Transkriptionsstartsignal, das Intron und das Transkriptionsterminationssignal in SEAP hinzuzufügen.
  • 47 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der Plaquebestimmung von jedem Sendai-Virusvektor zeigen. Sie zeigt ein Teil-Fluoreszenzbild in der Plaquebestimmung, welches durch LAS1000 erhalten wurde.
  • 48 ist ein Diagramm, welches das Ergebnis zeigt, wo geänderte Expressionsniveaus des Reportergens (SEAP) mit einem anderen unter den jeweiligen Sendai-Virusvektoren verglichen wurden. Die Daten von SeV18+/SEAP wurde als 100 angenommen und die jeweiligen Werte wurden relativ dazu angezeigt. Es wurde gefunden, dass die Aktivität, und zwar das Expressionsniveau, erniedrigt wurde, als das SEAP-Gen mehr stromabwärts platziert wurde.
  • 49 zeigt mikroskopische Aufnahmen an, welche die Expression von GFP in P1-Zellen zeigt, welche FHN co-exprimieren.
  • 50 zeigt Aufnahmen an, welche das Ergebnis der Western-Blot-Analyse der Extrakte aus Zellen, welche mit VSV-G-Pseudotyp-SeV/ΔF:GFP infiziert wurden, unter Verwendung des anti-F-Antikörpers (anti-F), anti-HN-Antikörpers (anti-HN) und des anti-Sendai-Virus-Antikörpers (anti-SeV) zeigen.
  • 51 zeigt Aufnahmen an, welche die GFP-Fluoreszenz aus F- und HN-defizienten Zellen, welche mit VSV-G-Pseudotyp SeV infiziert wurden, in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines neutralisierenden Antikörpers (VGV-Antikörper) zeigen.
  • 52 zeigt Aufnahmen, welche die Ergebnisse der Western-Analyse für VSV-G-Pseudotyp-Sendai-Viren mit F-Gen-defizientem oder F-Gen- und HN-Gen-defizientem Genom zeigen, welche durch Dichtegradient-Ultrazentrifugation fraktioniert wurden.
  • 53 zeigt Aufnahmen an, welche den Hämagglutinations-Assay zeigen, der mit Sendai-Viren mit F-Gen-defizientem Genom oder VSV-G-Pseudotyp-Sendai-Viren mit F-Gen-defizientem oder F-Gen- und HN-Gen-defizientem Genom vermittelt wurde.
  • 54 zeigt Diagramme an, welche die Spezifität der Infektion mit Kulturzellen des Sendai-Virus mit dem F-Gen-defizienten Genom oder den VSV-G-Pseudotyp-Sendai-Virus zeigen.
  • 55 zeigt Aufnahmen an, welche die Bestätigung der Strukturen des NGF-exprimierenden F-defizienten Sendai-Virus (NGF/SeV/ΔF) zeigen.
  • 56 ist ein Diagramm, welches die Aktivität von NGF, exprimiert von den NGF umfassenden Zellen, welche mit F-defizientem SeV infiziert wurden, zeigt. Mit dem Beginn der Züchtung wurde verdünnter Überstand von mit SeV infizierten Zellen oder NGF-Protein (Kontrolle) zu einer dissoziierten Kultur von primären Spinalganglion- (DRG-) Neuronen des Huhns gegeben. Nach drei Tagen wurden die lebensfähigen Zellen unter Verwendung von mitochondrialer Reduktionsaktivität als Index (n = 3) gezählt. Die Menge des zugegebenen Kulturüberstands entsprach einer 1000-fachen Verdünnung.
  • 57 zeigt Aufnahmen an, welche die Aktivität von NGF, exprimiert von den NGF umfassenden Zellen, welche mit F-defizientem SeV infiziert wurden, zeigt. Mit dem Beginn der Züchtung wurde der verdünnter Überstand von SeV-infizierten Zellen oder NGF-Protein (Kontrolle) zu einer dissoziierten Kultur von primären Spinalganglion- (DRG-) Neuronen des Huhns zugegeben. Nach drei Tagen wurden die Proben unter einem Mikroskop beobachtet.
    • A) Kontrolle (ohne NGF);
    • B) Zugabe des NGF-Proteins (10 ng/mL);
    • C) Zugabe des Kulturüberstands (100-fach verdünnt) der mit NGF/SeV infizierten Zellen;
    • D) Zugabe des Kulturüberstands (100-fach verdünnt) der mit NFG/SeV infizierten Zellen;
    • E) Zugabe des Kulturüberstands (100-fach verdünnt) der mit NGF/SeV/ΔF infizierten Zellen, und;
    • F) Zugabe des Kulturüberstands (100-fach verdünnt) der mit NGF/SeV/ΔF-GFP infizierten Zellen.
  • 58 ist eine Aufnahme, welche moi von Ad-Cre und das Expressionsniveau des F-Proteins zeigt.
  • 59 zeigt Aufnahmen an, welche die Expression von LLC-MK2/F durch Adeno-Cre zeigen.
  • 60 ist eine Aufnahme, welche die Expressionsbeständigkeit über die Passagen zeigt.
  • 61 zeigt Aufnahmen an, welche die Lokalisierung des F-Proteins über die Passagen zeigt.
  • 62 ist ein Diagramm, welches die Korrelation zwischen GFP-CIU und anti-SeV-CIU zeigt.
  • Die beste Art zur Ausführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird unten ausführlich mit Bezugnahme zu Beispielen veranschaulicht, aber ist nicht so auszulegen, dass sie dadurch begrenzt ist.
  • [Beispiel 1] Die Konstruktion des F-defizienten Sendai-Virus
  • <1> Die Konstruktion der genomischen cDNA des F-defizienten SeV und des F-exprimierenden Plasmids.
  • Die genomische cDNA des Sendai-Virus (SeV) von ganzer Länge, pSeV18+b(+) (Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820) („pSeV18+b(+)" wird auch als „pSeV18+" bezeichnet) wurde mit SphI/Kpnl verdaut, und das resultierende Fragment (14673 bp) wurde gewonnen und in pUC18 cloniert, welches Plasmid pUC18/KS genannt wurde. Die F Spaltstelle wurde an diesen pUC18/KS konstruiert. Die F-Gen-Spaltung wurde durch die kombinierte Verwendung des PCR-Ligationsverfahren durchgeführt, und als Ergebnis wurde der ORF für das F-Gen (ATG - TGA = 1698 bp) entfernt; so wurde atctgccggcagatga (SEQ ID NO: 1) daran ligiert, um die genomische cDNA des F-defizienten SeV (pSeV18+/ΔF) zu konstruieren. Bei der PCR wurde ein PCR-Produkt, welches unter Verwendung eines Primerpaars (vorwärts: 5'-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO: 2, revers: 5'-tttgccggcatgcattttcccaaggggagagttttgcaacc/SEO ID NO: J) hergestellt wurde, stromaufwärts von F ligiert und ein anderes PCR-Produkt, welches unter Verwendung eines Primerpaars (vorwärts: 5'-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO: 4 revers: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO: 5) hergestellt wurde, wurde stromabwärts des F-Gens an die EcoT22I-Stelle ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit SacI und SalI verdaut, und dann wurde das Fragment (4931 bp), welches die Region überspannt, welche die Stelle umfasst, an der F gespalten wurde, gewonnen und in pUC18 cloniert, um pUC18/dFSS herzustellen. Dieses pUC18/dFSS wurde mit Dralll verdaut. Das resultierende Fragment wurde gewonnen und mit einem Dralll-Fragment aus der Region, welche das F-Gen von pSeV18+ umfasst, ersetzt; und die Ligation wurde ausgeführt, um das Plasmid pSeV18+/ΔF herzustellen.
  • Um eine cDNA (pSeV18+/ΔF-GFP) herzustellen, in welcher das EGFP-Gen an der Stelle eingeführt wurde, wo F aufgebrochen wurde, wurde zusätzlich das EGFP-Gen durch PCR amplifiziert. Um das EGFP-Gen mit einem Vielfachen von 6 zu setzen (Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033-1045 (1996)), wurde die PCR mit einem Nsil-Schwanz-Primer (5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac: SEQ ID NO: 6) für das 5'-Ende und einen NgoMIV-Schwanz-Primer (5'-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc: SEQ ID NO: 7) für das 3'-Ende ausgeführt. Die PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen Nsil und NgoMIV verdaut, und dann wurde das Fragment aus dem Gel gewonnen; das Fragment wurde an die Stelle von pUC18/dFSS zwischen die Restriktionsenzymstellen Nsil und NgoMIV ligiert, wan der das gespaltene F gelegen ist, und die Sequenz wurde bestimmt. Ein Dralll-Fragment, welches das EGFP-Gen umfasst, wurde entfernt und aus der Stelle gewonnen, und für ein Dralll-Fragment in der Region, welche das F-Gen von pSeV18+ umfasst, ersetzt; dann wurde die Ligation ausgeführt, um das Plasmid pSeV18+/ΔF-GFP zu erhalten.
  • Andererseits wurde das Cre/loxP-induzierbare Expressionsplasmid für die F-Gen-Expression durch Amplifizieren des SeV-F-Gens durch PCR konstruiert, was die Sequenz bestätigt, und in die einmal vorkommende SwaI-Stelle des Plasmids pCALNdlw eingefügt (Arai et al., J. Virology 72, 1998, S. 1115-1121), in welchem die Expression der Genprodukte so konstruiert wurde, dass sie durch Cre-DNA-Rekombinase induziert wird, um das Plasmid pCALNdLw/F zu erhalten.
  • <2> Die Herstellung von Helferzellen, welche die Expression des SeV-F-Proteins induzieren
  • Um infektiöse Viruspartikel aus dem F-defizienten Genom zu gewinnen, wurde ein Helferzell-Stamm, welcher das SeV-F-Protein exprimiert, etabliert. Die verwendete Zelle war die LLC-MK2-Zelle, die allgemein für das Wachstum von SeV verwendet wird, und ist ein Zellstamm, der aus der Affenniere stammt. Die LLC-MK2-Zellen wurden in MEM, welches 10% hitzebehandeltes inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Natrium-Penicillin G (50 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) enthielt, bei 37°C unter 5% CO2-Gas kultiviert. Weil das SeV-F-Gen-Produkt zytotoxisch ist, wurde das oben erwähnte Plasmid pCALNdLw/F, welches entworfen worden war, um die Expression des F-Genprodukts durch die Cre-DNA-Rekombinase zu induzieren, in LLC-MK2-Zellen durch das Calciumphosphatverfahren (Säuger-Transfektionskit (Stratagene)) nach dem Genübertragungsprotokoll eingeführt.
  • 10 μg Plasmid pCALNdLw/F wurden in LLC-MK2-Zellen eingeführt, welche gezüchtet wurden, um in einer 10-cm-Platte 40% konfluent zu sein, und die Zellen wurden in 10 ml MEM, welches 10%iges FBS enthielt, bei 37°C unter 5% CO2 24 Stunden in einem Inkubator kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen abgekratzt und in 10 ml Medium suspendiert, dann wurden die Zellen auf 5 Schalen mit 10 cm Durchmesser (eine Platte mit 5 ml; 2 Platten mit 2 ml; 2 Platten mit 0.2 ml) in MEM, welches 10 ml 10%iges FBS und 1200 μg/ml G418 (GIBCO-BRL) enthielt, für die Kultivierung plattiert. Die Züchtung wurde 14 Tage fortgesetzt, während das Medium in 2-Tages-Intervallen gewechselt wurde, um die Zelllinien auszuwählen, in denen das Gen stabil eingeführt wurde. 30 Zellstämme wurden als G418-resistente Zellen, welche in dem Medium gezüchtet wurden, unter Verwendung von Clonierungsringen gewonnen. Jeder Clon wurde in 10 cm-Platten konfluent kultiviert.
  • Nach der Infektion jedes Clons mit dem rekombinanten Adenovirus AxCANCre, welches die Cre-DNA-Rekombinase exprimiert, wurden die Zellen für die Expression des SeV-F-Proteins durch Western-Blotting unter Verwendung von monoclonalem anti-SeV-F-Protein-IgG getestet (f236; J. Biochem. 123: 1064-1072), wie folgt.
  • Nachdem sie in einer 6 cm Schale konfluent gewachsen waren, wurde jeder Clon mit Adenovirus AxCANCre bei moi = 3 nach dem Verfahren von Saito et al. infiziert, (Saito et al., Nucl. Acids Res. 23:3816-3821 (1995); Arai, T. et al., J Virol. 72, 1115-1121 (1998)). Nach der Infektion wurden die Zellen 3 Tage kultiviert. Der Kulturüberstand wurde verworfen und die Zellen wurden zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, mit einem Schaber abgekratzt und durch fünf Minuten Zentrifugation bei 1500x g gesammelt.
  • Die Zellen werden bei -80°C aufbewahrt und können aufgetaut werden, wenn sie gebraucht werden. Die gesammelten Zellen wurden in 150 μl PBS-Puffer suspendiert, und dann wurde eine gleiche Menge 2x Tris-SDS-BME-Probenauftragspuffer (0.625 M Tris, pH 6.8, 5% SDS, 25% 2-ME, 50% Glycerin, 0.025%BPB; Owl) dazu gegeben. Die Mischung wurde bei 98°C 3 Minuten hitzebehandelt und dann als eine Probe für die Elektrophorese verwendet. Die Probe (1 × 105 Zellen/Spur) wurde durch Elektrophorese in einem SDS-Polyacrylamamidgel (Multi Gel 10/20, Daiichi Pure Chemicals) fraktioniert. Die fraktionierten Proteine wurden auf eine PVDF-Transfermembran (Immobilon-P Transfermembranen; Millipore) durch Semi-Dry-Blotting übertragen. Die Übertragung wurde unter einem konstanten Strom von 1 mA/cm2 1 Stunde auf die Transfermembran, die 30 Sekunden in 100%igem Methanol und dann 30 Minuten in Wasser eingetaucht worden war, ausgeführt.
  • Die Transfermembran wurde eine Stunde in einer Blockierungslösung geschüttelt, welche 0.05% Tween20 und 1% BSA (BlockAce; Snow Brand Milk Products) enthielt, und dann wurde sie 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem anti-SeV-F-Antikörper (f236), welcher 1000-fach mit einer Blockierungslösung verdünnt worden war, welche 0.05% Tween 20 und 1% BSA enthielt, inkubiert. Die Transfermembran wurde 3-mal in 20 ml PBS-0.1% Tween20 gewaschen, während sie 5 Minuten geschüttelt wurde, und dann wurde sie in PBS-Puffer gewaschen, während sie 5 Minuten geschüttelt wurde. Die Transfermembran wurde eine Stunde bei Raumtemperatur in 10 ml Peroxidase-konjugiertem anti-Maus-IgG-Antikörper (Ziegen-anti-Maus-IgG; Zymed), welcher 2000-fach verdünnt war, mit der Blockierungslösung, welche 0.05% Tween 20 und 1% BSA enthielt, inkubiert. Die Transfermembran wurde 3-mal mit 20 ml PBS-0.1% Tween20 gewaschen, während sie 5 Minuten geschüttelt wurde, und dann wurde sie in PBS-Puffer gewaschen, während sie 5 Minuten geschüttelt wurde.
  • Die Nachweise wurden für Proteine, welche mit dem anti-SeV-F-Antikörper auf der Transfermembran kreuzreagierten, durch das Chemilumineszenz-Verfahren (ECL Western-Blotting-Nachweisreagenzien; Amersham) ausgeführt. Das Ergebnis wird in 1 gezeigt. Die zur AxCANCre-Infektion spezifische SeV-Expression wurde nachgewiesen, um die Herstellung von LLC-MK2-Zellen, welche die Expression eines SeV-F-Genprodukts induzieren, zu bestätigen.
  • Eine der verschiedenen resultierenden Zelllinien, LLC-MK2/F7-Zelle, wurde durch Durchflusszytometrie mit einem anti-SeV-F-Antikörper (2) analysiert. Speziell wurden 1 × 105 Zellen durch Zentrifugation bei 15,000 Upm bei 4°C 5 Minuten präzipitiert, mit 200 μl PBS gewaschen und in PBS für FACS (NIKKEN CHEMICALS), welches 100-fach verdünnten monoclonalen anti-F-Antikörper (f236), 0.05% Natriumazid, 2% FCS enthielt, bei 4°C 1 Stunde an einem dunklen Ort umgesetzt. Die Zellen wurden wieder bei 15,000 Upm bei 4°C 5 Minuten präzipitiert, mit 200 μl PBS gewaschen und dann mit FITC-markiertem anti-Maus-IgG (CAPPEL) von 1 μg/ml auf Eis 30 Minuten umgesetzt. Dann wurden die Zellen wieder mit 200 μl PBS gewaschen und dann durch Zentrifugation bei 15,000 Upm bei 4°C 5 Minuten präzipitiert. Die Zellen wurden in 1 ml PBS für FACS suspendiert und dann unter Verwendung von EPICS ELITE (Coulter) Argonlaser bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 525 nm analysiert. Das Ergebnis zeigte, dass LLC-MK2/F7 eine hohe Reaktivität mit dem Antikörper auf eine zur Induktion der SeV-F-Genexpression spezifische Weise aufwies und so wurde es verifiziert, dass das SeV-F-Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wurde.
  • [Beispiel 2] Die Bestätigung der Funktion des von Helferzellen exprimierten SeV-F-Proteins
  • Es wurde getestet, ob das SeV-F-Protein, dessen Expression von Helferzellen induziert wurde, die ursprüngliche Proteinfunktion beibehielt oder nicht.
  • Nach dem Ausplattieren auf eine 6 cm-Schale und nachdem sie konfluent gewachsen waren, wurden LLC-MK2/F7-Zellen mit Adenovirus ACCANCre bei moi = 3 nach dem Verfahren von Saito et al. infiziert (oben beschrieben). Dann wurden die Zellen in MEM (serumfrei), welches Trypsin (7.5 μg/ml; GIBCOBRL) enthielt, bei 37°C unter 5% CO2 in einem Inkubator drei Tage kultiviert.
  • Der Kulturüberstand wurde verworfen und die Zellen wurden zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, mit einem Schaber abgekratzt und wurden durch Zentrifugation bei 1500x g fünf Minuten gesammelt. Die Abspaltung des exprimierten F-Proteins durch Trypsin wurde durch Western-Blotting verifiziert, wie oben beschrieben ( 3). Das SeV-F-Protein wird als F0, das ein nicht aktiver Proteinvorläufer ist, synthetisiert, und dann wird der Vorläufer aktiviert, nachdem er in zwei Untereinheiten F1 und F2 durch Proteolyse mit Trypsin verdaut wurde. Nach der Induktion der F-Proteinexpression setzen somit LLC-MK2/F7-Zellen wie gewöhnliche Zellen die F-Protein-Expression fort, sogar nachdem sie passagiert wurden, und keine von dem exprimierten F-Protein vermittelte Zytotoxizität wurde beobachtet, ebenso wie keine Zellfusion der F-Protein exprimierenden Zellen beobachtet wurde. Jedoch wurde Zellfusion häufig beobachtet, wenn das SeV-HN-Expressionsplasmid (pCAG/SeV-HN) in F-exprimierende Zellen transfiziert wurde und die Zellen in MEM, welches Trypsin enthielt, 3 Tage kultiviert wurden. Die Expression von HN auf der Zelloberfläche wurde in einem Experiment unter Verwendung von Erythrozytenadsorption auf die Zelloberfläche (Hämadsorptionstest; Had-Assay) bestätigt (4). Speziell wurden 1% Hühnererythrozyten zu den Kulturzellen bei einer Konzentration von 1 ml/Schale zugegeben und die Mischung wurde bei 4°C 10 Minuten stehen gelassen. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS-Puffer gewaschen, und dann wurden die Erythrozytenkolonien auf der Zelloberfläche beobachtet. Die Zellfusion wurde für Zellen erkannt, auf welche Erythrozyten aggregierten; es wurde gefunden, dass die Zellfusion durch die Wechselwirkung des F-Proteins mit HN induziert wird; und so wurde gezeigt, dass das F-Protein, dessen Expression in LLC-MK2/F7 aufrecht erhalten wurde, die ursprüngliche Funktion davon beibehielt.
  • [Beispiel 3] Das funktionelle RNP mit F-defizientem Genom und die Bildung von Virionen
  • Um Virionen aus den defizienten Viren zu gewinnen, ist es notwendig, Zellen zu verwenden, welche das defiziente Protein exprimieren. So wurde versucht die Erhaltung der defizienten Viren mit Zellen zu erhalten, welche das defiziente Protein exprimieren, aber es wurde aufgedeckt, dass die Expression des F-Proteins durch die Helferzelllinie rasch auf Grund der Vacciniaviren stoppte, welche bei der Rekonstitution des F-defizienten SeV verwendet wurden (5), und so die Virus-Rekonstitution auf der Grundlage der direkten Zuführung des F-Proteins aus der Helferzelllinie versagte. Es wurde berichtet, dass die Repliaktionsfähigkeit des Vacciniavirus inaktiviert wird, aber die Aktivität der T7-Expression nicht durch die Behandlung des Vacciniavirus mit Ultraviolettlicht von langen Wellenlängen (langwelliges UV) in der Anwesenheit von zugegebenem Psoralen (PLWUV-Behandlung) nicht geschwächt wird (Tsung et al., J Virol 70, 165-171, 1996). So wurde die Virus-Rekonstitution durch Verwendung des mit PLWUV behandelten Vacciniavirus (PLWUV-VacT7) versucht. Der UV Stratalinker 2400 (Katalog Nr. 400676 (100V); Stratagene, La Jolla, CA, USA), ausgestattet mit fünf 15-Watt-Glühbirnen, wurde für die Ultraviolettlicht-Bestrahlung verwendet. Das Ergebnis zeigte, dass die Expression des F-Proteins aus den F-exprimierenden Zellen, welche bei der Rekonstitution verwendet wurden, gehemmt wurde, aber Vaccinia kaum in der Anwesenheit von araC gezüchtet wurde, nachdem das Lysat von den Zellen, welche mit diesem PLWUV-VacT7 rekonstituiert wurden, zu den Helferzellen infiziert wurde, und es wurde auch gefunden, dass die Expression des F-Proteins durch die Helferzelllinie kaum beeinflusst wurde. Zusätzlich befähigt diese Rekonstitution des Wildtyp-SeV unter Verwendung dieser PLWUV-VacT7 die Erhaltung der Viren aus sogar 103 Zellen, während durch frühere Verfahren dieses nicht möglich war, außer es gab 105 oder mehr Zellen, und so wurde die Effizienz der Virus-Rekonstitution außerordentlich verbessert. So wurde die Rekonstitution des F-defizienten SeV-Virus unter Verwendung dieses Verfahrens versucht.
  • <Die Rekonstitution und Amplifikation des F-defizienten SeV-Virus>
  • Die Expression von GFP wurde nach Transfizieren der LLC-MK2-Zellen mit dem oben erwähnten pSEV18+/ΔF-GFP beobachtet, bei welchem das verstärkte Gen des grünen fluoreszierenden Proteins (EGFP) als Reporter in die Stelle eingeführt worden war, wo F nach der 6n-Regel auf die Weise aufgebrochen worden war, wie unten beschrieben. Es wurde auch für den Einfluss der Anwesenheit der vom Virus abgeleiteten Gene NP, P und L getestet, die drei Komponenten sind, welche für die Bildung von RNP benötigt werden.
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf einer 100-mm-Petrischale bei einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/Schale plattiert und wurden 24 Stunden kultiviert. Nachdem die Züchtung beendet wurde, wurden die Zellen mit Psoralen und Ultraviolettlicht von langen Wellenlängen (365 nm) 20 Minuten behandelt, und die Zellen wurden mit rekombinanten Vacciniavirus, welcher T7-RNA-Polymerase exprimiert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) bei Raumtemperatur eine Stunde infiziert (moi = 2) (moi = 2 bis 3; vorzugsweise moi = 2). Nachdem die Zellen 3-mal gewaschen wurden, wurden jeweils die Plasmide pSEV18+/ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) in Mengen von 12 μg, 4 μg, 2 μg und 4 μg/Schale in OptiMEM (GIBCO) suspendiert; Superfect Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl SuperFect; QIAGEN) wurde dazu gegeben; die Mischung bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen gelassen; dann werden sie zu 3 ml OptiMEM gegeben, welches 3% FBS enthält; Zellen wurde dazu gegeben und kultiviert. Das gleiche Experiment wurde unter Verwendung der genomischen cDNA des Wildtyp-SeV (pSeV(+)) (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) als Kontrolle anstatt von pSeV18+/ΔF-GFP ausgeführt. Nach Kultivierung für 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM, welches kein Serum enthielt, gewaschen und dann in MEM, welches Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, 40 μg/ml; Sigma) und Trypsin (7.5 μg/ml; GIBCO) enthielt, 70 Stunden kultiviert. Diese Zellen wurden geerntet, und das Pellet wurde in OptiMEM (10 Zellen/ml) suspendiert. Nachdem die Gefrier- und Tau-Behandlung 3-mal wiederholt wurde, wurden die Zellen mit dem Lipofektionsreagenz DOSPER (Boehringer Mannheim) gemischt (106 Zellen/25 μl DOSPER) und bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Die F-exprimierende LLC-MK2/F7-Zelllinie (106 Zellen/ Well in der 12-Well-Platte) wurde transfiziert, und die Zellen wurden in MEM, welches kein Serum enthielt (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt), kultiviert.
  • Das Ergebnis zeigte, dass die Expression von GFP nur erkannt wurde, wenn alle drei Komponenten NP, P und L, welche aus dem Virus stammten, vorhanden sind und das RNP des defizienten Virus, welches Fremdgene exprimiert, hergestellt werden kann (6).
  • <Die Bestätigung von F-defizienten Virionen>
  • Es wurde getestet, ob das funktionelle RNP, welches von F-defizienter genomischen cDNA durch das Verfahren, wie oben beschrieben, rekonstituiert wurde, durch F-exprimierende Helferzellen geborgen werden konnte und infektiöse Virionen des F-defizienten Virus bilden konnte. Zelllysate wurde mit kationischem Liposom gemischt; die Lysate wurde durch Gefrieren/Tauen aus Zellen präpariert, welche unter Bedingungen rekonstituiert wurden, bei welchen das funktionelle RNP gebildet wird (Bedingung, unter welchen pSeV18+/ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L zur gleichen Zeit transfiziert werden) oder Bedingungen, unter welchen das funktionelle RNP nicht gebildet wird (Bedingungen, unter welchen die zwei Plasmide pSeV18+/ΔF-GFP und pGEM/NP transfiziert werden), wie oben beschrieben; die Lysate wurden in F-exprimierende Zellen und nicht exprimierende Zellen lipofiziert; die Herstellung der Viruspartikel wurde auf Grundlage der Ausdehnung der Verteilung von GFP-exprimierenden Zellen beobachtet. Das Ergebnis zeigte, dass die Ausdehnung der Verteilung der GFP exprimierenden Zellen nur erkannt wurde, wenn die Einführung zu den F-exprimierenden Zellen unter Verwendung eines Lysats ausgeführt wurde, welches unter der Bedingung erhalten wurde, bei welcher funktionelles RNP wieder hergestellt wird (7). Darüber hinaus wurde sogar beim Plaque-Assay die Plaque-Bildung nur unter den gleichen Bedingungen gesehen. Aus diesen Ergebnissen wurde offenbart, dass die aus F-defizientem Virusgenom hergestellten funktionellen RNPs zusätzlich zu infektiösen Viruspartikeln in der Anwesenheit von F-Protein, welches aus F-exprimierenden Zellen stammte, umgewandelt wurden, und die Partikel aus den Zellen freigesetzt wurden.
  • Die Demonstration der Anwesenheit von infektiösen F-defizienten Virionen in dem Kulturüberstand wurde durch das folgende Experiment ausgeführt. Das Lysat, welches das funktionelle RNP, konstruiert aus dem F-Gen-defizienten Genom, umfasst, wurde zu F-exprimierenden Zellen lipofiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben, und der Kulturüberstand wurde gewonnen. Dieser Kulturüberstand wurde zu dem Medium von F-exprimierenden Zellen gegeben, um die Infektion auszuführen; am dritten Tag wurde der Kulturüberstand gewonnen und gleichzeitig zu sowohl F-exprimierenden Zellen als auch zu Zellen, die F nicht exprimierten, gegeben; und dann wurden die Zellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Trypsin drei Tage kultiviert. In den F-exprimierenden Zellen wurden die Viren nur in der Anwesenheit von Trypsin amplifiziert (8). Es wurde auch offenbart, dass nicht infektiöse Viruspartikel in den Überstand von Zellen, die F nicht exprimieren (in dem unteren Feld von 9), oder von F-exprimierenden Zellen, welche bei Abwesenheit von Trypsin kultiviert wurden, freigesetzt wurden. Eine Zusammenfassung der Beschreibungen oben ist, wie folgt: das Wachstum von F-defizienten GFP-exprimierenden Viren ist spezifisch für F-exprimierenden Zellen und hängt von der Proteolyse mit Trypsin ab. Der Titer des so gezüchteten infektiösen F-defizienten Sendai-Virus reichte von 0.5 × 107 bis 1 × 107 CIU/ml.
  • [Beispiel 4] Die Analyse des F-defizienten GFP exprimierenden Virus
  • Um die genomische Struktur von aus F-defizienter cDNA gewonnenen Virionen zu bestätigen, wurden Viren aus dem Kulturüberstand der F-exprimierenden Zellen gewonnen, die Gesamt-RNA wurde extrahiert und dann wurde die Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von F und HN als Sonden durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass das HN-Gen nachweisbar war, aber das F-Gen war in den aus den F-exprimierenden Zellen geernteten Viren nicht nachweisbar, und es wurde verdeutlicht, dass das F-Gen in dem viralen Genom nicht vorhanden war (10). Zusätzlich wurde durch RT-PCR GFP bestätigt, dass das Gen in dem deletierten Ort für F vorhanden war, wie bei der Konstruktion der cDNA gezeigt (11) und dass die Strukturen von anderen Genen die gleichen waren wie jene aus dem Wildtyp. Auf Grundlage dieser Befunde oben wurde gezeigt, dass keine Umordnung des Genoms während der Virus-Rekonstitution stattgefunden hatte. Zusätzlich wurde die Morphologie der gewonnenen F-defizienten Viruspartikel durch Elektronenmikroskopie untersucht. Wie das Wildtyp-Virus hatten F-defiziente Viruspartikel die helicale RNP-Struktur und innen stachelähnliche Struktur (14). Zusätzlich wurden die Viren durch Immunelektronenmikroskopie mit an Goldkolloid konjugiertem IgG (anti-F, anti-HN), welches spezifisch mit F oder HN reagierte, untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass die stachelähnliche Struktur der Virushülle F- und HN-Proteine umfasste (12), welches zeigte, dass das durch die Helferzellen hergestellte F-Protein effizient in die Virionen eingebaut wurde. Das Ergebnis wird unten ausführlich beschrieben werden.
  • <Die Extraktion der Gesamt-RNA, Northern-Blot-Analyse und RT-PCR>
  • Die Gesamt-RNA wurde aus dem Kulturüberstand extrahiert, welcher 3 Tage nach der Infektion der F-exprimierenden Zelle LLC-MK2/F7 mit den Viren unter Verwendung von QlAamp Viral RNA Minikit (Qiagen) nach dem Protokoll erhalten wurde. Die gereinigte Gesamt-RNA (5 μg) wurde durch Elektrophorese in einem 1%igem denaturierendem Agarose-Gel, welches Formaldehyd enthielt, getrennt, und dann auf eine Hybond-N+-Membran in einer Vakuum-Blotting-Apparatur (Amershan-Pharmacia) übertragen. Die präparierte Membran wurde mit 0.05 M NaOH fixiert, mit 2-fach verdünnten SSC-Puffer (Nacalai tesque) gespült, und dann wurde eine Vorhybridisierung in einer Hybridisierungslösung (Boehringer Mannheim) 30 Minuten durchgeführt; eine Sonde für das F- oder HN-Gen, welche durch „random prime" DNA-Markierung (DIG DNA Labeling Kit; Boehringer Mannheim) unter Verwendung von Digoxigenin (DIG)-dUTP (alkaliempfindlich) präpariert wurde, wurde dazu gegeben und dann wurde die Hybridisierung 16 Stunden durchgeführt. Dann wurde die Membran gewaschen und ihr ermöglicht, mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-DIG-Antikörper (anti-Digoxigenin-AP) zu reagieren; die Analyse wurde unter Verwendung eines DIG-Nachweiskits ausgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass das HN-Gen nachweisbar war, aber dass das F-Gen nicht nachweisbar in den aus den F-exprimierenden Zellen geernteten Viren war, und es wurde verdeutlicht, dass das F-Gen in dem viralen Genom nicht vorhanden war (10).
  • Zusätzlich wurde eine ausführliche Analyse durch RT-PCR ausgeführt. Bei der RT-PCR wurde der erste cDNA-Strang aus der gereinigten Virus-RNA unter Verwendung von SUPERSCRIPTII Preamplification System (Gibco BRL) nach dem Protokoll synthetisiert; die folgende PCR-Bedingung wurde mit LA-PCR-Kit (TAKARA ver2.1) angewandt: 94°C/3 min; 30 Zyklen für die Amplifikation von 94°C/45 s, 55°C/45 s, 72°C/90 s; 10 Minuten Inkubation bei 72°C; dann wurde die Probe in einem 2%igem Agarosegel bei 100 v 30 Minuten elektrophoresiert, das Gel wurde mit Ethidiumbromid für ein photographisches Bild gefärbt. Die verwendeten Primer, um das in die F-defiziente Stelle eingefügte M-Gen und EGFP-Gen zu bestätigen, waren vorwärts 1: 5'-atcagagacctgcgacaatgc (SEQ ID NO: 8) und revers 1: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg (SEQ ID NO: 9); die verwendeten Primer, um das in die F-defiziente Stelle eingefügte EGFP- und das HN-Gen zu bestätigen, waren vorwärts 2: 5'-acaaccactacctgagcacccagtc (SEQ ID NO: 10) und revers 2: 5'-gcctaacacatccagagatcg (SEQ ID NO: 11); und die Verbindung zwischen dem M-Gen und dem HN-Gen wurde unter Verwendung des Vorwärts-3-Primers: 5'-acattcatgagtcagCtcgc (SEQ ID NO: 12) und des reversen 2-Primers (SEQ ID NO:11) bestätigt. Das Ergebnis zeigte, dass das GFP-Gen an dem F-defizienten Ort vorhanden war, wie bei der Konstruktion der cDNA gezeigt (11), und dass die Strukturen von anderen Genen die gleichen waren wie jene von dem Wildtyp (13). Aus den oben gezeigten Befunden wird es verdeutlicht, dass keine Umordnung des Genoms während der Virus-Rekonstitution resultiert hatte.
  • <Die elektronenmikroskopische Analyse mit an Goldkolloid konjugiertem IgG>
  • Die Morphologie der gewonnenen F-defizienten Viruspartikel wurde durch Elektronenmikroskopie untersucht. Zuerst wurde der Kulturüberstand von mit den defizienten Viren infizierten Zellen bei 28,000 Upm 30 Minuten zentrifugiert, um ein Viruspellet zu erhalten; dann wurde das Pellet in 10-fach verdünntem PBS bei einer Konzentration von 1 × 109 HAU/ml resuspendiert; ein Tropfen der Suspension wurde auf ein Mikroraster mit einem Hilfsfilter getropft und dann wurde das Raster bei Raumtemperatur getrocknet; das Raster wurde mit PBS, welches 3.7% Formalin enthielt, 15 Minuten für die Fixierung behandelt und dann mit PBS-Lösung, welche 0.1% BSA enthielt, 30 Minuten vorbehandelt; zusätzlich wurde monoclonaler anti-F-Antikörper (f236) oder monoclonaler anti-HN-Antikörper (Miura, N. et al., Exp. Cell Res. (1982) 141: 409-420), 200-fach mit der gleichen Lösung verdünnt, auf das Raster getropft und unter feuchten Bedingungen 60 Minuten reagieren gelassen.
  • Anschließend wurde das Raster mit PBS gewaschen, und dann wurde der an Goldkolloid konjugierte anti-Maus-IgG-Antikörper, 200-fach verdünnt, getropft und unter feuchten Bedingungen 60 Minuten reagieren gelassen. Anschließend wurde das Raster mit PBS und dann mit destilliertem sterilem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur luftgetrocknet; eine 4%ige Uranacetat-Lösung wurde auf das Raster für die Färbung 2 Minuten platziert und das Raster wurde getrocknet; die Probe wurde in einem JEM-1200EXII-Elektronenmikroskop (JEOL) beobachtet und fotografiert. Das Ergebnis zeigte, dass die stachelähnliche Struktur der Hülle des Virus F- und HN-Proteine umfasste (12), welches zeigte, dass das durch die Helferzellen hergestellte F-Protein effizient in die Virionen eingebaut wurde. Zusätzlich hatten die F-defizienten Viruspartikel wie das Wildtyp-Virus eine helicale RNP-Struktur und innen eine stachelähnliche Struktur (14).
  • [Beispiel 5] Die Genübertragung von hoher Effizienz zu einer Vielfalt von Zellen über den F-defizienten SeV-Vektor in vitro
  • <Die Einführung in primäre Kulturzellen der Hirnrindennervenzellen der Ratte>
  • Primäre Kulturzellen von Hirnrindenneuronen der Ratte wurden präpariert und kultiviert, wie folgt: eine SD-Ratte (SPF/VAF Crj: CD, weiblich, 332 g bis zu 9 Wochen alt; Charles River) wurde am achtzehnten Tag der Trächtigkeit durch Diethylether zutiefst betäubt, und dann durch Aderlass aus Achselarterien eingeschläfert. Die Feten wurden aus dem Uterus nach Bauchschnitt entfernt. Die Schädelhaut und Knochen wurden abgetrennt und die Gehirne wurden entnommen. Die Gehirnhälften wurden unter einem Stereomikroskop zu einer Arbeitslösung DMEM (welche 5% Pferdeserum 5% Kalbserum und 10% DMSO enthielt) übertragen; sie wurden in Scheiben geschnitten und eine eiskalte Papain-Lösung (1.5 U, 0.2 mg Cystein, 0.2 mg Rinderserumalbumin, 5 mg Glucose, DNase von 0.1 mg/ml) wurde dazu gegeben; die Lösung, welche die abgeschnittenen Gewebe enthielt, wurde 15 Minuten während des Schüttelns durch Umwenden des Fläschchens alle 5 Minuten bei 32°C inkubiert. Nachdem verifiziert wurde, dass die Suspension trüb genug wurde und die Gewebeschnitte durchscheinend wurden, wurden die Gewebeschnitte durch Pipettieren in kleine Stücke zermalmt. Die Suspension wurde bei 1200 Upm bei 32°C 5 Minuten zentrifugiert, und dann wurden die Zellen in mit B27 ergänztem neuralen Basalmedium (GibcoBRL, Burlington, Ontario, Kanada) resuspendiert. Die Zellen wurden auf einer Platte, beschichtet mit Poly-d-Lysin (Becton Dickinson Labware, Redford, MA, U.S.A), bei einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Schale plattiert und dann bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert.
  • Nachdem eine Primärkultur von Nervenzellen aus der Hirnrinde (5 × 105/Well) 5 Tage ausgeführt wurde, wurden die Zellen mit F-defizientem SeV-Vektor (moi = 5) infiziert und zusätzlich drei Tage kultiviert. Die Zellen wurden in einer Fixierungslösung, welche 1% Paraformaldehyd, 5% Ziegenserum und 0.5% Triton-X enthielt, bei Raumtemperatur fünf Minuten fixiert. Die Blockierungsreaktion wurde für die Zellen unter Verwendung von BlockAce (Snow Brand Milk Products) bei Raumtemperatur 2 Stunden ausgeführt, und dann mit 500-fach verdünntem Ziegenanti-Ratte-IgG des Mikrotubulus assoziiertem Protein 2 (MAP-2) (Boehringer) bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Zusätzlich wurden die Zellen dreimal mit PBS (-) alle 15 Minuten gewaschen und dann mit cys3 konjugiertem anti-Maus-IgG, 100-fach mit 5% Ziegenserum/PBS verdünnt, bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Nachdem die Zellen dreimal mit PBS(-) alle 15 Minuten gewaschen wurden, wurde zusätzlich das Vectashield-Mounting-Medium (Vector Laborstories, Burlingame, U.S.A.) zu den Zellen gegeben; die Zellen, welche mit MAP-2-Immunofärbung und GFP-Fluoreszenz doppelt gefärbt worden waren, wurden fluoreszierend unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Nippon Bio-Rad MRC 1024, Japan) und eines invertierten Mikroskops Nikon Diaphot 300, ausgestattet mit Anregungs-Bandpassfilter von 470-500-nm oder 510-550-nm, beobachtet. Das Ergebnis zeigte, dass GFP bei fast 100% Nervenzellen, die MAP2-positiv waren, eingeführt worden war (15).
  • <Die Einführung in normale menschliche Zellen>
  • Normale menschliche Zellen des glatten Muskels, normale menschliche Leberzellen und normale menschliche pulmonale Kapillar-Endothelzellen (Cell Systems) wurden von DAINIPPON PHARMACEUTICAL erworben und mit dem SFM CS-C- Mediumkit (Cell Systems) bei 37°C unter 5% CO2-Gas kultiviert.
  • Menschliche normale Zellen, wie normale menschliche Zellen des glatten Muskels (15, Muskel), normale menschliche Leberzellen (15, Leber) und normale menschliche pulmonale Kapillar-Endothelzellen (15, Lunge) wurden mit F-defizientem SeV-Vektor (m.o.i = 5) infiziert, und dann wurde die Expression von GFP beobachtet. Es wurde verifiziert, dass die Einführungseffizienz fast 100% war und das GFP-Gen bei sehr hohen Niveaus in allen Zellen exprimiert wurde (15).
  • <Die Einführung in primäre Knochenmarkzellen der Maus>
  • Zusätzlich wurde ein Experiment durchgeführt, bei welchem primäre Knochenmarkzellen der Maus durch Verwendung von Abstammungsmarkern getrennt wurden und mit F-defizientem SeV-Vektor infiziert wurden. Zuerst wurde 5-Fluorouracil (5-FU, Wako Pure Chemical Industries) der C57BL-Maus (6 Wochen alt, männlich) bei einer Dosis von 150 mg/kg durch intraperitoneale Injektion (IP Injektion) gegeben; 2 Tage nach der Verabreichung wurden Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen gesammelt. Die mononukleären Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Lympholyte-M (Cedarlane) getrennt. Eine Mischung (3 × 107) von Streptadivin magnetischen Kügelchen (Pharmingen; Funakoshi), welche mit Biotin markierten anti-CD45R (8220), anti-Ly6G (Gr-1), anti-Ly-76 (TER-119), anti-1 (Thy1.2) und anti-Mac-1 beschichtet worden waren, wurden zu den mononukleären Zellen (3 × 106 Zellen) gegeben und der resultierenden Mischung wurde ermöglicht, bei 4°C 1 Stunde zu reagieren; eine Fraktion, aus welcher Lin+-Zellen durch ein Magnet entfernt worden waren, wurde gewonnen (Lin--Zellen) (Erlich, S. et al., Blood 1999. 93 (1), 80-86). SeV von 2 × 107 HAU/ml wurde zu 4 × 105 Zellen der Lin--Zelle gegeben, und zusätzlich wurden rekombinantes Ratten-SCF (100 ng/ml, BRL) und rekombinantes menschliches IL-6 (100 U/ml) dazu gegeben. Zusätzlich wurde F-defizientes SeV von 4 × 107 HAU/ml zu 8 × 105 der gesamten Knochenmarkzellen, und GFP-SeV von 5 × 10 HAU/ml wurde zu 1 × 106 Zellen gegeben. GFP-SeV wurde durch Einfügen eines mit PCR amplifizierten NotI-Fragments, welches das Gen des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) (die Länge des Strukturgens ist 717 bp) enthält, zu welchem ein Transkriptionsstart- (R1), ein Terminationssignal (R2) und ein Intron (IG) hinzugefügt werden, an der NotI-Restriktionsenzym-Spaltungsstelle der SeV-Transkriptionseinheit pUC18/T7HVJRz präpariert. DNA (+18) (Genes Cells, 1996, 1: 569-579). Die Rekonstitution der Viren, welche das GFP-Gen umfassen, wurde nach einem bekannten Verfahren (Genes Cells, 1996, 1: 569-579) unter Verwendung von LLC-MK2-Zellen und einem Brutei durchgeführt, und dann wurden die Viren, welche das Gen des Interesses umfassen, gewonnen. Nach einer 48-Stunden-Züchtung nach der Infektion mit GFP-SeV, wurden die Zellen in zwei Gruppen geteilt; einer von ihnen wurde ermöglicht, mit Phycoerythrin(PE)-markiertem anti-CD117 (c-Kit; Pharmingen) 1 Stunde zu reagieren; die andere war eine Kontrollgruppe. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen, dann wurden sie in einem Durchflusszytometer (EPICS Elite ESP; Coulter, Miami, FL) analysiert.
  • Das Ergebnis zeigte, dass der F-defiziente SeV-Vektor auch zu Knochenmarkzellen, welche durch den anti-c-Kit-Antikörper angereichert sind, der als Marker für primitive Blutstammzellen verwendet wurde, infiziert wurde, und die Expression des GFP-Gens wurde beobachtet (16). Die Anwesenheit von infektiösen Partikeln in dem Kulturüberstand wurde durch Bestimmung der Anwesenheit der GFP exprimierenden Zellen drei Tage nach der Zugabe des Zellkulturüberstands, behandelt mit Trypsin, zu LLC-MK2-Zellen bestätigt. Es wurde verdeutlicht, dass keine dieser Zellen infektiöse Viruspartikel freisetzte.
  • [Beispiel 6] Die Verabreichung des Vektors in das Hirnventrikel der Ratte
  • Ratten (F334/Du Crj, 6 Wochen alt, weiblich, Charles River) wurden durch intraperitoneale Injektion von Nembutal-Natriumlösung (Dainabot), 10fach (5 mg/ml) mit physiologischer Kochsalzlösung (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd) verdünnt, betäubt. Das Virus wurde unter Verwendung eines stereotaxischen Hirn-Geräts für kleine Tiere (DAVID KOPF) verabreicht. 20 μl (108 CIU) wurden an dem Punkt 5.2 mm gegen das Bregma von der interauralen Linie, 2.0 mm gegen das rechte Ohr von Lambda, 2.4 mm unter der Hirnoberfläche unter Verwendung von 30G austauschbaren Nadeln (Hamilton) injiziert. Ein hohes Expressionsniveau des GFP-Proteins wurde in den Ependymzellen des Ventrikels beobachtet (17). Darüber hinaus wurde in dem Fall des F-defizienten SeV-Vektors die Expression des GFP-Proteins nur in Ependymzellen oder Nervenzellen um die Injektionsstelle beobachtet, welche in Kontakt mit dem Virus kommen, und keine Läsion wurde in dieser Region gefunden. Abnormität im Verhalten oder Änderungen im Körpergewicht wurden bei den Ratten mit der Verabreichung bis zur Zerlegung nicht beobachtet. Nach der Zerlegung wurde keine Läsion in dem Gehirn oder in einem der analysierten Gewebe und Organe, wie Leber, Lunge, Niere, Herz, Milz, Magen, Darm und so weiter gefunden.
  • [Beispiel 7] Die Bildung von F-freien Viruspartikeln aus dem F-defizienten SeV-Genom
  • <1>
  • F-nicht-exprimierende LLC-MK2-Zellen und F-exprimierende LLC-MK2-Zellen (LC-MK2/F7) wurden mit F-defizientem SeV-Virus infiziert und mit (+) und ohne (-) Trypsin kultiviert. Das Ergebnis des HA-Assays des Zellkulturüberstands nach 3 Tagen wird in 18A gezeigt. Die Kulturüberstände wurden zu Hühner-Bruteiern geimpft, und das Ergebnis des HA-Assays der Chorioallantoisflüssigkeiten nach 2 Tagen Züchtung wird in 18B gezeigt. „C" oben im Feld zeigt PBS an, verwendet als Kontrollgruppe. Die Zahlen, unter „Verdünnung" angezeigt, zeigen den Verdünnungsfaktor der Viruslösung an. Zusätzlich wurde die HA-positive Chorioallantoisflüssigkeit in Hühner-Bruteiern neu geimpft und nach Kultivierung für zwei Tage wurde die Chorioallantoisflüssigkeit mit dem HA-Assay untersucht (19C). Als Ergebnis wurde gefunden, dass F-nicht-exprimierende Zellen oder Hühner-Bruteier, infiziert mit dem F-defizienten Virus, HA-positiv sind. Jedoch hatten sich die Viren nach der Neu-Impfung zu Hühner-Bruteiern nicht verbreitet, was belegt, dass die HA-positive Viruslösung keine sekundäre Infektiosität hat.
  • <2>
  • Die nicht infektiöse Viruslösung, welche in F-nicht-exprimierenden Zellen amplifiziert wurde, wurde auf die Existenz von Viruspartikeln untersucht. Die Northern-Blot-Analyse wurde für die Gesamt-RNA, präpariert aus dem Kulturüberstand von F-exprimierenden Zellen, HA-positiver, nicht infektiöser Chorioallantoisflüssigkeit und Wildtyp-SeV durch QlAamp viralen RNA-Minikit (QIAGEN) unter Verwendung des F-Gens und des HN-Gens als Sonden durchgeführt. Als Ergebnis wurden Banden für RNA nachgewiesen, welche aus der Chorioallantoisflüssigkeit oder dem Virus im Kulturüberstand der F-exprimierenden Zellen stammte, wenn das HN-Gen als Sonde verwendet wurde, während bei Verwendung der F-Gensonde keine Banden nachgewiesen wurden (10). Es wurde belegt, dass die HA-positive, nicht infektiöse Flüssigkeit nicht infektiöse virusähnliche Partikel mit einem F-defizienten Genom hat. Zusätzlich offenbarte die Analyse der HA-positiven, nicht-infektiösen Viruslösung durch Immunelektronenmikroskopie die Existenz von Viruspartikeln, und die Hülle des Virions reagierte mit dem Antikörper, welcher das mit Goldkolloid markierte HN- Protein erkennt, aber nicht mit dem Antikörper, welcher das mit Goldkolloid markierte F-Protein erkennt (20). Dieses Ergebnis zeigte die Existenz von F-freien Virionen, was belegt, dass das Virus als ein Virion mit dem HN-Protein alleine sogar ohne die Existenz des F-Proteins gebildet werden kann. Es wurde gefunden, dass das SeV-Virion mit F alleine gebildet werden kann (Leger, S. et al., J Gen. Virol 79, 683-687 (1998)), und das vorliegende Ergebnis belegte zum ersten Mal, dass das SeV-Virion mit dem HN-Protein alleine gebildet werden kann. So zeigt die Tatsache, dass F-freie Virionen vorübergehend in großer Menge in Hühner-Bruteiern hergestellt werden können, dass Virionen, welche SeV-F-defizientes RNP verpacken, in großer Menge herstellt werden können.
  • <3>
  • Wie oben beschrieben, sind F-freie Virus-Virionen, welche vorübergehend in Hühner-Bruteiern amplifiziert werden, durchaus nicht infektiös gegenüber Zellen, welche von dem Sendai-Virus infiziert werden. Um zu bestätigen, dass Strukturen von funktionellem RNP in Hüllen verpackt werden, wurden F-exprimierende Zellen und nicht exprimierende Zellen mit kationischem Liposom (DOSPER, Boehringer mannheim) gemischt und durch Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur transfiziert. Als Ergebnis wurden GFP exprimierende Zellen durchaus nicht beobachtet, wenn die Zellen nicht mit dem kationischen Liposom gemischt werden, während alle Zellen GFP exprimierten, wenn sie mit dem kationischen Liposom gemischt wurden. In F-nicht-exprimierenden Zellen wurde die GFP-Expression nur in einzelnen Zellen gesehen und dehnte sich nicht zu benachbarten Zellen aus, während in F-exprimierenden Zellen sich GFP exprimierende Zellen ausdehnten, um Kolonien zu bilden (21). Daher wurde es deutlich, dass nicht infektiöse Virionen, vorübergehend in Hühner-Bruteiern amplifiziert, ein Gen exprimieren konnten, wenn sie in Zellen durch Verfahren wie die Transfektion eingeführt werden
  • [Beispiel 8] Die Rekonstitution und die Amplifikation des Virus aus FHN-defizientem SeV-Genom
  • <Die Konstruktion der FHN-defizienten genomischen cDNA>
  • Um FHN-defiziente genomische cDNA von SeV (pSeV18+/ΔFHN) zu konstruieren, wurde pUC/KS zuerst mit EcoRI verdaut, um pUC18/Eco zu konstruieren, und dann wurde die ganze Sequenz vom Startcodon des F-Gens zum Stoppcodon des HN-Gens (4866-8419) deletiert, dann wurde sie an der Bsiwl-Stelle (cgtacg) ligiert. Nachdem die Sequenz der FHN deletierten Region durch Basensequenzierung bestätigt wurde, wurde das EcoRI-Fragment (4057 bp) aus den Gelen gewonnen, um es für das EcoRI-Fragment von pUC18/KS zu ersetzen, um die Konstruktion zu bewerkstelligen. Ein Kpnl/Sphl-Fragment (14673 bp), welches die FHN deletierte Region umfasst, wurde aus den Gelen gewonnen, um es für das Kpnl/Sphl-Fragment von pSeV18+ zu ersetzen, um das Plasmid pSeV18+/ΔFHN zu erhalten.
  • Andererseits wurde die Konstruktion der cDNA des FHN-defizienten SeV, welche mit GFP eingeführt wurde, wie folgt, bewerkstelligt. Das SalI/XhoI-Fragment (7842 bp) wurde aus pSeV18+/ΔFHN gewonnen und in pGEM11Z (Promega) cloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pGEM11Z/SXdFHN bezeichnet. Zu der FHN-defizienten Stelle von pGEM11Z/SXdFHN wurde das PCR-Produkt mit BsixI-Stellen an beiden Enden von ATG-TAA (846 bp) von d2EGFP (Clontech) durch Verdau mit dem BsixI-Enzym ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pSEVi 8±/ΔFHN-d2GFP bezeichnet.
  • <Die Etablierung einer FHN-defizienten, Protein co-exprimierenden Zelllinie>
  • Das F-Gen exprimierende Plasmid ist zu dem identisch, welches für die Etablierung der F-defizienten, Protein co-exprimierenden Zelllinie verwendet wurde, und das HN-Gen exprimierende Plasmid wurde gleichermaßen konstruiert, und das Fragment, welches den ORF von HN umfasst, wurde zu der einzigartigen SwaI-Stelle von pCALNdlw eingefügt (Arai et al., oben beschrieben), um das Plasmid, pCALNdLw/HN genannt, zu erhalten.
  • Die LLC-MK2-Zellen wurden mit der gleichen Menge oder unterschiedlichem Verhältnis von pCALNdLw/F und pCALNdLw/HN gemischt, um unter Verwendung des Säugetier-Transfektionskits (Stratagene) nach dem Herstellerprotokoll Gene einzuführen. Die Zellen wurden nach einer dreiwöchigen Auswahl mit G418 cloniert. Die erhaltenen arzneistoffresistenten Clone wurden mit einem rekombinanten Adenovirus (Ade/Cre, Saito et al., oben beschrieben) (moi = 10), welches Cre-DNA-Rekombinase exprimiert, infiziert. Dann wurden die Zellen 3 Tage nach der Expressionsinduktion des F- und des HN-Proteins nach 3-mal Waschen mit PBS(-) gesammelt, und sie wurden mit monoclonalem IgG des anti-SeV-F-Proteins und des anti-SeV-HN-Proteins unter Verwendung des Western-Blotting-Verfahrens sondiert (22).
  • <Die Konstruktion von pGEM/FHN>
  • Die für die Konstruktion von pCALNdLw/F und pCALNdLw/HN verwendeten F-und HN-Fragmente wurden in pGEM4Z und pGEM3Z (Promega) cloniert, um pGEM4Z/F bzw. pGEM3Z/HN zu erhalten. Ein Fragment, welches durch Pvull-Verdauung der Region, welche den T7-Promotor und HN von pGEM3Z/HN umfasst, wurde gewonnen und in die stumpfen Enden an der einzigartigen SacI-Spaltstelle stromabwärts des F-Gens von pGEM4Z/F ligiert. Es wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von monoclonalen anti-F- oder anti-HN-Antikörpern bestätigt, dass F- und HN-Proteine gleichzeitig exprimiert werden, wenn sie in derselben Richtung angeglichen wurden.
  • <Die Rekonstitution des FHN-defizienten Virus>
  • Die Rekonstitution der FHN-defizienten Viren (P0) wurden auf zwei Wege ausgeführt. Einer war die Verwendung des RNP-Transfektionsverfahren, wie bei der Rekonstitution des F-defizienten Virus, und der andere war die Verwendung von T7, um co-exprimierende Plasmide zu liefern. Und zwar wurden unter der Regulation des T7-Promotors getrennt Plasmide konstruiert, welche F- und HN-Proteine exprimieren, und unter Verwendung jener Plasmide wurden F- und HN-Proteine für die Rekonstitution geliefert. Bei beiden Verfahren wurden die rekonstituierten Viren durch FHN-co-exprimierende Zellen amplifiziert. FHN-defiziente, GFP exprimierende cDNA von SeV (pSEV18+/ΔFHN-d2GFP), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L und pGEM/FHN wurden im Verhältnis von 12 μg/10 cm Schale, 4 μg/10 cm Schale, 2 μg/10 cm Schale, 4 μg/10 cm Schale und 4 μg/10 cm Schale (gesamtes Endvolumen, 3 ml/10 cm Schale) für die Geneinführung in LLC-MK2-Zellen auf dieselbe Weise wie die oben beschriebene F-defiziente SeV-Rekonstitution gemischt. Drei Stunden nach der Geneinführung wurden die Medien zu MEM gewechselt, welches AraC (40 μg/ml, SIGMA) und Trypsin (7.5 μg/ml, GIBCO) enthielt, und zusätzlich 3 Tage kultiviert. Die Beobachtung wurde durch ein Fluoreszenz-Stereo-Mikroskop 2 Tage nach Geneinführung ausgeführt. Der Effekt der pGEM/FHN-Zugabe wurde analysiert, und die Virusbildung wurde durch die Ausbreitung von GFP exprimierenden Zellen bestätigt. Als Ergebnis wurde eine Ausbreitung von GFP exprimierenden Zellen beobachtet, wenn pGEM/FHN bei der Rekonstitution hinzugefügt wurde, während die Ausbreitung nicht beobachtet wurde, wenn pGEM/FHN nicht hinzugefügt wurde, und die GFP-Expression wurde nur in einer Einzelzelle beobachtet (23). Es wurde gezeigt, dass die Zugabe bei der FHN-Protein-Rekonstitution die Bildung des Virus-Virions verursachte. Andererseits wurde in dem Fall der RNP-Transfektion die Viruserhaltung in FHN-exprimierenden Zellen von P1 erfolgreich bewerkstelligt, wie in dem Fall der F-Defizienz (24, oberes Feld).
  • Die Virusamplifikation wurde bestätigt nach der Infektion der Lösung des FHN-defizienten Virus zu Zellen, welche induziert wurden, 6 oder mehrere Stunden nach der Ade/Cre-Infektion das FHN-Protein zu exprimieren (24, unteres Feld).
  • Die Lösung der Viren, welche aus FHN-defizienter GFP exprimierender CDNA von SeV rekonstituiert wurde, wurde zu LLC-MK2-, LLC-MK2/F-, LLC-MK2/HN- und LLC-MK2/FHN-Zellen infiziert, und mit oder ohne Trypsin-Zugabe kultiviert. Nach 3 Tagen Züchtung wurde die Ausbreitung von GFP-Protein exprimierenden Zellen analysiert. Als Ergebnis wurde die Ausbreitung von GFP nur in LLC-MK2/FHN beobachtet, was bestätigt, dass die Viruslösung spezifisch durch FHN-Co-Expresssion und auf eine von Trypsin abhängige Weise amplifiziert werden kann (25).
  • Um das FHN-defiziente virale Genom zu bestätigen, wurde der aus den LLC-MK2/FHN-Zellen gewonnene Kulturüberstand zentrifugiert, und unter Verwendung von QIAmp Viral RNA-Minikit (QIAGEN) wurde RNA nach dem Herstellerprotokoll extrahiert. Die RNA wurde für Matrizensynthese von RT-PCR unter Verwendung von Superscript Preamplification System für die Synthese des ersten Strangs (GIBCO BRL) verwendet, und die PCR wurde unter Verwendung von TAKARA Z-Taq (Takara) durchgeführt. Das F-defiziente Virus wurde als Kontrollgruppe verwendet. PCR-Primer-Sätze wurden als Kombination von M-Gen und GFP-Gen oder als Kombination von M-Gen oder L-Gen ausgewählt (für die Kombination von M-Gen und GFP-Gen (M-GFP), vorwärts: 5'-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO: 13, revers: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg/SEQ ID NO: 14; für die Kombination von M-Gen und L-Gen (M-L), vorwärts: 5'-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO: 15, revers: 5'-gttatctccgggatggtgc/SEQ ID NO: 16). Als Ergebnis wurden spezifische Banden für sowohl F-defiziente als auch FHN-defiziente Viren bei RT-Bedingungen während der Verwendung der M- und GFP-Gene als Primer erhalten. In dem Fall der Verwendung der M- und L-Gene als Primer wurden die Banden mit gegebener Größe, welche GFP umfasst, für die FHN-defiziente Probe nachgewiesen, und die verlängerten Banden mit der Größe, welche das HN-Gen umfasst, wurden für die F-defiziente nachgewiesen. So wurde die FHN-Defizienz in der Genomstruktur belegt (26).
  • Andererseits wurde das FHN-defiziente Virus ähnlich zu F-exprimierenden Zellen infiziert, wie wenn unter Verwendung des F-defizienten Virus, und der Kulturüberstand wurde nach 4 Tagen gewonnen, um das Infektionsexperiment gegen LLC-MK2, LLC-MK2/F und LLC-MK2/FHN durchzuführen. Als Ergebnis wurde die GFP-Expressionszelle nicht in einerinfizierten Zelle beobachtet, was zeigt, dass das Virus keine Infektiosität zu diesen Zellen hat. Jedoch wurde bereits berichtet, dass das F-Protein alleine genug ist, um Viruspartikel zu bilden (Kato, A. et al., Gene cells 1, 569-579 (1996)) und dass der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASG-R) die spezifische Infektion zu Leberepithelzellen vermittelt (Spiegel et al., J. Virol 72, 5296-5302, 1998). So können Virionen, welche das FHN-defiziente RNA-Genom umfassen, mit einer Virushülle, welche nur mit F-Protein aufgebaut ist, in den Kulturüberstand von F-exprimierenden Zellen freigesetzt werden. Daher wurde der Kulturüberstand von F-exprimierenden Zellen, welche mit FHN-defizientem Virus infiziert waren, gewonnen, und nach der Zentrifugation wurde RNA extrahiert, wie oben beschrieben, und durch RT-PCR durch das oben beschriebene Verfahren analysiert. Als Ergebnis wurde die Existenz von RNA belegt, welche das FHN-defiziente Genom umfasst, wie in 27 gezeigt.
  • Die Western-Blotting-Analyse des Virus-Virions, welches mit VSV-G in den Pseudotypen verwandelt wurde, zeigt deutlich, dass F- und HN-Proteine nicht exprimiert werden. Es konnte hierin gesagt werden, dass das Herstellungssystem von FHN-defizienten Virus-Virionen etabliert wurde.
  • Außerdem wurden die aus dem F-Protein exprimierenden Zellen freigesetzten Virionen auf FHN-exprimierende oder nicht exprimierende LLC-MK2-Zellen mit oder ohne Mischen mit einem kationischen Liposom (50 μl DOSPER/500 μl/Well) überschichtet. Als Ergebnis wurde die Ausbreitung von GFP exprimierenden Zellen beobachtet, wenn sie als Mischung mit DOSPER überschichtet wurden, während das HN-freie Virion lediglich durchaus keine Infektiosität hat, was nicht GFP- exprimierende Zellen zeigt, wie in dem Fall von F-freien Partikeln, oben beschrieben, gesehen wurde. In FHN-nicht-exprimierenden Zellen wurde die GFP exprimierende Zelle beobachtet, aber kein Hinweis auf Virus-Neubildung und Ausbreitung wurde gefunden.
  • Diese aus F-exprimierenden Zellen gewonnenen virusähnlichen Partikel können fortlaufend Zellen, welche das ASG-R-Gen exprimieren, ASG-R nicht exprimierende Zellen oder Leberzellen infizieren, und ob die Infektion leberspezifisch oder ASG-R-spezifisch ist, kann durch das Verfahren von Spiegel et al. untersucht werden.
  • [Beispiel 9] Die Anwendung des RNA-Virusvektors des defizienten Genoms
    • 1. Das F-defiziente RNP, amplifiziert in dem oben beschriebenen System, wird von der F-freien Virushülle umhüllt. Die Hülle kann in Zellen durch Hinzufügen einer gewünschten Zell-einführenden Fähigkeit zu der Hülle durch chemische Modifikationsverfahren und dergleichen, oder durch Gen einführende Reagenzien oder Genkanonen oder dergleichen (RNP-Transfektion oder RNP-Injektion) eingeführt werden, und das rekombinanten RNA-Genom kann replizieren und autonom und fortlaufend Proteine in den Zellen herstellen.
    • 2. Ein Vektor, der zum spezifischen Targeting in der Lage ist, kann hergestellt werden, wenn die intrazelluläre Domäne des HN in der vorliegenden Form gelassen wird, und die extrazelluläre Domäne von HN mit Liganden fusioniert wird, welche zum Targeting anderer Rezeptoren auf eine spezifische Weise in der Lage sind, und ein rekombinantes Gen, welches in der Lage ist, das chimäre Protein herzustellen, in das virale Genom eingebaut wird. Zusätzlich kann der Vektor in Zellen präpariert werden, welche das rekombinante Protein herstellen. Diese Vektoren können für die Gentherapie, wie Impfstoffe oder dergleichen anwendbar sein.
    • 3. Da die Rekonstitution des SeV-Virus, der in beiden FHN defizient ist, erfolgreich bewerkstelligt wurde, kann der Targeting-Vektor durch Einführung von zum Targeting fähigen chimären Hüllproteingen anstelle des GFP-Gens in die FHN-Deletionsstelle hergestellt werden, was ihn durch das gleiche Verfahren wie in dem Fall des FHN-defizienten Vektors wiederherstellt, Amplifizieren des Resultierenden in FHN-exprimierenden Zellen, Infizieren des Resultierenden zu nicht exprimierende Zellen, und Rekonstruieren der Virionen, welche nur mit dem zum Targeting fähigen chimären Hüllprotein gebildet werden, welches aus dem viralen Genom transkribiert wird.
    • 4. Über ein Minigenom des Sendai-Virus und über ein Virion, welches nur mit dem F-Protein verpackendes Minigenom durch Einführung von NP-, P-, L- und F-Gen zu Zellen gebildet wird, wurde berichtet (Leger et al., J Gen. Virol 79, 683-687, 1998). Über einen Vektor, bei welchem das Leukämie-Virus der Maus durch das Sendai-F-Protein in den Pseudotypen umgewandelt wird, wurde auch berichtet (Spiegel et al., J. Virol 72, 5297-5302, 1998). Auch bislang berichtet wird über das spezifische Targeting von durch Trypsin abgespaltenem F-Protein zu Leberepithelzellen, was von ASG-R vermittelt wird (Bitzer et al., J. Virol. 71, 5481-5486, 1997). Die Systeme in früheren Berichten sind vorübergehende Partikel bildende Systeme, welche es schwierig machen, fortlaufend Vektorpartikel zu gewinnen. Obwohl Spiegel et al. über einen Retrovirus-Vektor berichteten, welcher vom Sendai-F-Protein in den Pseudotypen umgewandelt wurde, trägt dieses Verfahren wesentliche Probleme, wie das Retrovirus, das in der Lage ist, Gene nur zu Mitosezellen einzuführen. Die gewonnenen Viruspartikel in der vorliegenden Erfindung mit einem FHN-co-defizienten viralen Genom des SeV und nur das F-Protein wie das Hüllprotein sind effiziente RNA-Vektoren, welche zur autonomen Replikation in dem Zytoplasma unabhängig von der Zellmitose in der Lage sind. Sie sind neue Viruspartikel, und es ist ein praktisches System, welches die Massenherstellung erleichtert.
  • [Beispiel 10] Die Virus-Rekonstitution und die Amplifikation aus FHN-defizientem SeV-Genom
  • Die Rekonstitutionstechniken infektiöser Viruspartikel aus cDNA, die das virale Genom clonierte, wurden für viele Einzelstrang-Minusstrang-RNA-Viren wie dem Sendai-Virus, dem Masernvirus, etabliert.
  • In den meisten der Systeme wird die Rekonstitution durch Einführung von Plasmiden, welche mit cDNA, NP-, P- und L-Genen stromabwärts des T7-Promotors in Zellen eingeführt werden, und durch Expression von cDNA und jedem Gen unter Verwendung von T7-Polymerase ausgeführt. Um T7-Polymerase zu liefern, wird das rekombinante Vacciniavirus, welches T7-Polymerase exprimiert, hauptsächlich verwendet.
  • Das T7 exprimierende Vacciniavirus kann in den meisten Zellen effizient T7-Polymerase exprimieren. Trotzdem können wegen der durch Vacciniavirus induzierten Zytotoxizität infizierte Zellen nur 2 oder 3 Tage leben. In den meisten Fällen wird Rifampicin als ein Anti-Vaccinia-Reagenz verwendet. In dem System von Kato et al. (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)), wurde AraC zusammen mit Rifampicin für die Hemmung des Vacciniavirus-Wachstums zu einer Untergrenze und für die effiziente Rekonstitution des Sendai-Virus verwendet.
  • Jedoch ist die Rekonstitutionseffizienz des Minusstrang-RNA-Virus, repräsentiert von dem Sendai-Virus, einige Partikel oder weniger in 1 × 105 Zellen, weit geringer als von anderen Viren wie Retroviren. Die Zytotoxizität auf Grund des Vacciniavirus und das komplexe Rekonstitutionsverfahren (transkribiertes und translatiertes Protein heften getrennt an nackte RNA, um eine RNP ähnliche Struktur zu bilden, und danach findet Transkription und Translation durch eine Polymerase statt) können als Gründe für diese geringe Rekonstitutionseffizienz gegeben werden.
  • Zusätzlich zu dem Vacciniavirus wurde ein Adenovirus-System als Mittel zur Lieferung der T7-Polymerase untersucht, aber kein gutes Ergebnis wurde erhalten. Das Vacciniavirus codiert das RNA-Capping-Enzym, welches im Zytoplasma als das Enzym seiner selbst zusätzlich zur T7-Polymerase fungiert, und es wird gedacht, dass das Enzym die Translationseffizienz durch Capping der durch den T7-Promotor transkribierte RNA in dem Zytoplasma verstärkt. Die vorliegende Erfindung versuchte, die Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virus durch Behandlung des Vacciniavirus mit dem Psoarlen-Langwellen-UV-Verfahren zu verstärken, um die Zytotoxizität auf Grund des Vacciniavirus zu vermeiden.
  • Durch die DNA-Quervernetzung mit Psoralen und langwelligem Ultraviolettlicht kann der Zustand erhalten werden, bei welchem die Virus-Replikation mit dem DNA-Genom gehemmt wird, ohne im Besonderen die frühe Genexpression zu bewirken. Der beträchtliche Effekt, welcher durch Inaktivierung des Virus in dem System gesehen wird, kann auf dieses Vacciniavirus mit einem langen Genom zurückgeführt werden (Tsung, K. et al., J Virol 70, 165-171 (1996)).
  • In dem Fall des Wildtyp-Virus, das sich autonom verbreiten kann, macht sogar ein einzelnes Viruspartikel, welches durch Rekonstitution gebildet wird, es für das Sendai-Virus möglich, durch Impfung von transfizierten Zellen zu Hühner-Bruteiern verbreitet zu werden. Daher muss man nicht die Rekonstitutionseffizienz und das restliche Vacciniavirus ernsthaft beachten.
  • Jedoch kann man in dem Fall der Rekonstitution von verschiedenen mutierten Viren zur Erforschung der viralen Replikation, des Mechanismus der Partikelbildung und so weiter, verpflichtet sein, Zelllinien, welche ein Protein, das vom Virus stammt, exprimieren und dergleichen, unbefruchtete Hühnereier für die Verbreitung des Virus zu verwenden. Zusätzlich kann es sehr gut möglich sein, dass das mutierte Virus oder defiziente Virus sich ausgesprochen langsamer verbreitet als das Wildtyp-Virus.
  • Um das Sendai-Virus mit solchen Mutationen zu verbreiten, sollten tranfizierte Zellen auf Zellen der nächsten Generation überschichtet und für eine lange Zeitdauer kultiviert werden. In solchen Fällen können die Rekonstitutionseffizienz und der restliche Titer des Vacciniavirus problematisch sein. Bei dem vorliegenden Verfahren wurde der Titer von überlebendem Vacciniavirus bei Steigerung der Rekonstitutionseffizienz erfolgreich verringert.
  • Unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens wurde ein mutiertes Virus, das in dem früheren System unter Verwendung eines unbehandelten Vacciniavirus niemals erhalten wurde, durch Rekonstitution (F-, FHN-defizientes Virus) erfolgreich erhalten. Das vorliegende System würde ein bedeutendes Werkzeug für die Rekonstitution eines mutierten Virus sein, welches mehr in der Zukunft durchgeführt werden würde. Daher untersuchten die vorliegenden Erfinder die Menge von Psoralen und Ultraviolett-Licht (UV) und die Bedingungen der Inaktivierung des Vacciniavirus.
  • <Das Experiment>
  • Zuerst wurde die Psoralen-Konzentration mit einer festen Bestrahlungszeit von 2 min getestet. Die Inaktivierung wurde durch Messung des Titers des Vacciniavirus durch Plaque-Bildung und durch Messung der T7-Polymerase-Aktivität durch das pGEM-luci-Plasmid unter der Kontrolle des T7-Promotors und des Minigenoms des Sendai-Virus getestet. Die Messung der T7-Polymerase-Aktivität des Minigenoms des Sendai-Virus ist ein System, in welchem Zellen begleitend mit dem Plasmid des Minigenoms des Sendai-Virus und den Plasmiden pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L, welche das NP-, P- und L-Protein des Sendai-Virus durch T7 exprimieren, transfiziert werden, um die Transkription des Luciferase-Enzymproteins durch RNA-Polymerase des Sendai-Virus nach der Bildung des Ribonucleoprotein-Komplexes zu untersuchen.
  • Nach 2 min UV-Bestrahlung wurde eine Abnahme im Titer des Vacciniavirus in Abhängigkeit von der Psoralen-Konzentration gesehen. Jedoch war die T7-Polymerase-Aktivität für eine Psoralen-Konzentration bis zu 0, 0.3 und 1 μg/ml unverändert, aber ungefähr zu einem Zehntel bei 10 μg/ml verringert (28).
  • Darüber hinaus wurde durch Fixierung der Psoralen-Konzentration auf 0.3 μg/ml die Zeit der UV-Bestrahlung untersucht. In Übereinstimmung mit der Zunahme der Bestrahlungszeit wurde der Titer des Vacciniavirus verringert, obwohl kein Effekt auf die T7-Polymerase-Aktivität bis zu 30 min Bestrahlung gefunden wurde. In diesem Fall konnte unter den Bedingungen von 0.3 μg/ml und 30 min Bestrahlung der Titer zu 1/1000 ohne Beeinflussung der T7-Polymerase-Aktivität gesenkt werden (29).
  • Jedoch war in Vacciniavirus mit einem gesenkten Titer von 1/1000 CPE 24 Stunden nach Infektion bei moi = 2, kalibriert zur Titer-Vorbehandlung (moi = 0.002 als Resttiter nach Behandlung), nicht unterschiedlich von dem des unbehandelten Virus, welches bei moi = 2 infiziert wurde (30).
  • Unter Verwendung des Vacciniavirus, welches unter den oben beschriebenen Bedingungen behandelt wurde, wurde die Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virus untersucht. Die Rekonstitution wurde durch ein unten beschriebenes Verfahren ausgeführt, welches das oben erwähnte Verfahren von Kato et al. modifizierte. LLC-MK2-Zellen wurden auf 6-Well-Mikroplatten bei 3 × 105 Zellen/Well gesät, und nach einer Züchtung über Nacht wurde das Vacciniavirus zu dem Titer von 6 × 105 pfu/100 μl, welcher vor der PLWUV-Behandlung kalibriert wurde, verdünnt und zu mit PBS gewaschenen Zellen infiziert. Eine Stunde nach der Infektion, wurden 100 μl OPTI-MEM, mit 1, 0.5, 1 und 4 μg jeweils von Plasmid pGEM-NP, P, L und cDNA zugegeben, zusätzlich mit 10 μl Superfect (QIAGEN) und 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und nach Zugabe von 1 ml OPTI-MEM (GIBCO) (welches Rif. und AraC enthielt) auf die Zellen überschichtet.
  • Zwei, drei und vier Tage nach Transfektion wurden die Zellen gewonnen, zentrifugiert und in 300 μl/Well PBS suspendiert. 100 μl zellenthaltende Lösung, welche aus der Suspension selbst oder durch 10- oder 100-fache Verdünnung der Suspension gemacht wurde, wurden zu Hühner-Bruteiern am Tag 10 nach der Befruchtung geimpft, 4 Eier für jede Verdünnung (jeweils 1 × 105, 1 × 104 und 1 × 103 Zellen). Nach 3 Tagen wurde die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen und die Rekonstitution des Virus wurde durch den HA-Test untersucht (Tabelle 1). Die Eier mit HA-Aktivität wurden als 1 Punkt, 10 Punkte und 100 Punkte für Eier, welche jeweils mit 1 × 105, 1 × 104 und 1 × 103 Zellen geimpft wurden, bewertet, um die Trefferzahl der Rekonstitution zu berechnen (31). Die Formel ist, wie in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Effekt der Dauer der UV-Behandlung des Vacciniavirus auf die Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virus
    Figure 00600001
  • Auch die Resttiter des Vacciniavirus, welche 2, 3 und 4 Tage nach Transfektion innerhalb der Zellen gemessen wurden, waren in der behandelten Gruppe im Verhältnis zu dem vor der Transfektion gegebenen Titer kleiner (32).
  • Durch Inaktivierung des Vacciniavirus durch PLWUV konnte der Titer zu 1/1000 gesenkt werden, ohne die T7-Polymerase-Aktivität zu beeinflussen. Jedoch unterschied sich CPE, welches aus dem Vacciniavirus stammte, nicht von dem des unbehandelten Virus mit einem 1000fachen höheren Titer, wie durch mikroskopische Beobachtungen offenbart.
  • Unter Verwendung des Vacciniavirus, welches mit der oben beschriebenen Bedingung für die Rekonstitution des Sendai-Virus behandelt wurde, nahm die Rekonstitutionseffizienz von zehn- zu hundertfach zu (31). Zu der gleichen Zeit war der Resttiter des Vaccinaivirus nach der Transfektion nicht 5 pfu/105 Zellen oder mehr. So wurde das Überleben des replizierbaren Vacciniavirus bei 0.005% oder weniger gehalten.
  • [Beispiel 11] Die Konstruktion des Pseudotyp-Sendal-Virus
  • <1> Die Herstellung von Helferzellen, in welchen das VSV-G-Genprodukt induziert wird
  • Weil das VSV-G-Genprodukt eine Zytotoxizität hat, wurde eine stabile Transformante in LLC-MK2-Zellen unter Verwendung des Plasmids pCALNdLG (Arai T. et al., J. Virology 72 (1998) S 1115-1121) erzeugt, in welchem das VSV-G-Genprodukt durch Cre-Rekombinase induziert werden kann. Die Einführung des Plasmids in LLC-MK2-Zellen wurde durch das Calciumphosphat-Verfahren (CalPhosTMMammalian Transfection Kit, Clontech) nach dem begleitenden Handbuch bewerkstelligt.
  • Zehn Mikrogramm Plasmid pCALNdLG wurden in LLC-MK2-Zellen eingeführt, welche zu 60% Konfluenz in einer 10 cm Kulturschale gezüchtet worden waren. Die Zellen wurden 24 Stunden mit 10 ml 10 %igem MEM-FCS-Medium in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen abgekratzt und in 10 ml Medium suspendiert, und dann wurden unter Verwendung von fünf 10 cm Kulturschalen 1, 2 und 2 Schalen jeweils mit 5 ml, 2ml und 0.5 ml angeimpft. Dann wurden sie 14 Tage in 10 ml 10%igem MEM-FCS-Medium, welches 1200 μg/ml G418 (GIBCO-BRL) enthielt, mit einem Mediumwechsel an jedem zweiten Tag kultiviert, um stabile Transformanten auszuwählen. Achtundzwanzig zu G418 resistente Clone, welche in der Züchtung gewachsen waren, wurden unter Verwendung von Clonierungsringen gewonnen. Jeder Clon wurde in einer 10 cm Kulturschale zur Konfluenz ausgedehnt.
  • Für jeden Clon wurde die Expression von VSV-G durch Western-Blotting, unten beschrieben, unter Verwendung von monoclonalem anti-VSV-G-Antikörper nach der Infektion mit dem rekombinanten Adenovirus AxCANCre, welches Cre-Rekombinase enthielt, untersucht.
  • Jeder Clon wurde in einer 6 cm Kulturschale zu Konfluenz gezüchtet und danach wurde Adenovirus AxCANCre bei MOI = 10 durch das Verfahren von Saito et al. (s. oben) infiziert und 3 Tage kultiviert. Nach Entfernen des Kulturüberstands wurden die Zellen mit PBS gewaschen und von der Kulturschale durch Zugabe von 0.5 ml PBS, welches 0.05% Trypsin und 0.02% EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enthielt, und durch Inkubieren bei 37°C, 5 min abgetrennt. Nach Suspendieren in 3 ml PBS wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 1000x g, 5 min gesammelt. Die erhaltenen Zellen wurden in 2 ml PBS resuspendiert und dann wieder bei 1500x g, 5 min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln.
  • Die Zellen können bei -20°C gelagert werden und dann durch Auftauen nach Bedarf verwendet werden. Die gesammelten Zellen wurden in 100 μl Zelllyse-Lösung (RIPA-Puffer, Boehringer Mannheim) lysiert, und unter Verwendung des gesamten Proteins der Zellen (1 × 105 Zellen pro Spur) wurde Western-Blotting durchgeführt. Die Zelllysate wurden in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Probenpuffer (Puffer, welcher 6 mM Tris-HCl (pH6.8), 2% SDS, 10% Glycerol, 5% 2-Mercaptoethanol enthält) aufgelöst und als Proben für die Elektrophorese nach Erhitzen bei 95°C, 5 min unterworfen. Die Proben wurden durch Elektrophorese unter Verwendung des SDS-Polyacrylamidgels (Multigel 10/20, Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd) getrennt und das getrennte Protein wurde dann zur Transfermembran (Immobilon-P TransferMembranes, Millipore) durch das Semi-Dry-Blotting-Verfahren übertragen. Die Übertragung wurde unter Verwendung der Transfermembran, welche 20 s mit 100%igem Methanol und 1 Stunde mit Wasser durchtränkt wurde, bei einem konstanten Strom von 1 mA/cm2 1 Stunde ausgeführt.
  • Die Transfermembran wurde in 40 ml Blockierungslösung (Block-Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) 1 Stunde geschüttelt und einmal in PBS gewaschen.
  • Die Transfermembran und 5 ml anti-VSV-G-Antikörper (Clon P4D4, Sigma), mit PBS 1/1000 verdünnt, welches 10% Blockierungslösung enthielt, wurden in einem Vinylbeutel verschlossen und bei 4°C stehen gelassen.
  • Die Transfermembran wurde zweimal in 40 ml PBS-0.1% Tween 20 5 min durchtränkt und nach dem Waschen für 5 min in PBS zum Waschen durchtränkt.
  • Die Transfermembran und 5 ml anti-Maus-IgG-Antikörper, markiert mit Peroxidase (anti-Maus-Immunoglobulin, Amersham), zu 1/2500 in PBS verdünnt, welches 10% Blockierungslösung enthielt, wurden in einem Vinylbeutel verschlossen und wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde geschüttelt.
  • Nach Schütteln wurde die Transfermembran zweimal in PBS-0.1% Tween 20 5 min durchtränkt und nach dem Waschen für 5 min in PBS zum Waschen durchtränkt.
  • Der Nachweis der Proteine auf der Membran, welche mit dem anti-VSV-G-Antikörper kreuzreagiert, wurde durch das Lumineszenz-Verfahren (ECL Western-Blotting-Nachweisreagenzien, Amersham) ausgeführt. Das Ergebnis wird in 33 gezeigt. Drei Clone zeigten die AxCANCre-Infektion spezifische VSV-G-Expression, welche die Etablierung der LLC-MK2-Zellen bestätigte, in welchen das VSV-G-Genprodukt induziert werden kann.
  • Ein Clon unter den erhaltenen Clonen, bezeichnet als LLCG-L1, wurde der Du rchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung des anti-VSV-Antikörpers unterworfen (34). Als Ergebnis wurde die Reaktivität mit dem zur VSV-G-Geninduktion spezifischen Antikörper in LLCG-L1 nachgewiesen, was bestätigt, dass das VSV-G-Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird.
  • <2> Die Herstellung des Pseudotyp-Sendai-Virus, welches ein in dem F-Gen defizientes Genom umfasst, unter Verwendung von Helferzellen
  • Das Sendai-Virus, welches ein im F-Gen defizientes Genom umfasst, wurde zu VSV-G-Gen exprimierenden Zellen infiziert, und unter Verwendung des F-defizienten Sendai-Virus, welches das in den Beispielen oben beschriebene GFP-Gen umfasst, und der Expression des GFP-Gens als ein Anzeiger wurde untersucht, ob die Herstellung des Pseudotyp-Virus mit VSV-G als Kapsid gesehen werden kann oder nicht. Als Ergebnis wurde das Virusgen in LLCG-L1 ohne Infektion des rekombinanten Adenovirus AxCANCre, welches die Cre-Rekombinase umfasst, durch Infektion mit dem F-defizientem Sendai-Virus eingeführt und GFP exprimierende Zellen wurden nachgewiesen, obwohl die Anzahl der exprimierenden Zellen nicht erhöht wurde. In durch VSV-G induzierten Zellen wurde ein chronologischer Anstieg von GFP exprimierenden Zellen gefunden. Wenn 1/5 der Überstände zusätzlich zu neu durch VSV-G induzierten Zellen gegeben wurde, wurde keine Geneinführung in dem ersten Überstand gesehen, während der Anstieg von GFP exprimierenden Zellen sowie die Geneinführung in dem letzteren Überstand gefunden wurden. Auch in dem Fall, dass der letzte Überstand zu LLCG-L1-Zellen ohne Induktion des VSV-G-Gens zugegeben wird, wurde das Gen eingeführt, aber der Anstieg von GFP exprimierenden Zellen wurde nicht gesehen. Zusammengefasst wurde die für die VSV-G exprimierenden Zellen spezifische Virusverbreitung und die Bildung des Pseudotyp-F-defizienten Virus mit VSV-G gefunden.
  • <3> Die Auswertung der Bedingungen für die Herstellung des Pseudotyp-Sendai-Virus mit F-Gen-defizientem Genom
  • Eine bestimmte Menge der Pseudotyp-Sendai-Viren mit F-Gen-defizienten Genomen wurde unter Änderung der Menge der AxCANCre-Infektion (MOI = 0, 1.25, 2.5, 5 und 10) infiziert und der Kulturüberstand wurde am Tag 7 oder Tag 8 gewonnen. Dann wurde der Überstand zu den Zellen vor und nach der Induktion von VSV-G infiziert, und nach 5 Tagen wurde die Anzahl von GFP exprimierenden Zellen verglichen, um den Effekt der Menge der VSV-G-Expression zu sehen. Als Ergebnis wurde keine Viruserzeugung bei MOI = 0 gefunden, und maximale Erzeugung wurde bei MOI = 10 gefunden (35). Zusätzlich begann das Erzeugungsniveau von Tag 5 oder danach anzuwachen, welches bis Tag 8 fortbestand (36), wenn der Zeitverlauf der Viruserzeugung analysiert wurde. Die Messung des Virustiters wurde durchgeführt durch Berechnen der Anzahl von infizierten Partikeln zu Zellen in der Viruslösung (CIU), durch Zählen der GFP exprimierenden Zellen 5 Tage nach Infektion von serienmäßig (jede 10-fach) verdünnten Viruslösungen zu Zellen, die noch nicht mit VSV-G induziert wurden. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die maximale Virusherstellung 5 × 105 CIU/ml ist.
  • <4> Der Effekt des anti-VSV-Antikörpers auf die Infektiosität des Pseudotyp-Sendai-Virus mit F-Gen-defizientem Genom
  • Darüber, ob das Pseudotyp-Sendai-Virus mit F-Gen-defizientem Genom, welches durch Verwendung von VSV-G exprimierende Zellen erhalten wird, das VSV-G-Protein in dem Kapsid umfasst, ob die neutralisierende Aktivität der Infektiosität beeinflusst werden wird, wurde unter Verwendung des anti-VSV-Antikörpers ausgewertet. Die Viruslösung und der Antikörper wurden gemischt und bei Raumtemperatur 30 min stehen gelassen, und dann zu LLCG-L1-Zellen ohne VSV-G-Induktion infiziert. Am Tag 5 wurde die Fähigkeit der Geneinführung durch die Existenz von GFP-exprimierenden Zellen untersucht. Als Ergebnis wurde die perfekte Hemmung der Infektiosität durch den anti-VSV-Antikörper gesehen, während im Sendai-Virus mit dem F-Gen-defizienten Genom, welches das ursprüngliche Kapsid hat, die Hemmung nicht gesehen wurde (37). Daher wurde deutlich gezeigt, dass das vorliegende erhaltene Virus ein Pseudotyp-Sendai-Virus ist, welches das VSV-G-Protein in seinem Kapsid umfasst, in welchem die Infektiosität des Virus durch einen Antikörper spezifisch gehemmt werden kann.
  • <5> Der Nachweis für den Besitz des F-defizienten Genoms vom Pseudotyp-Sendai-Virus
  • Die Western-Blotting-Analyse des Zellextrakts von infizierten Zellen wurde ausgeführt, um zu untersuchen, ob das vorliegende Virus sich in den Zellen verbreitete, welche das VSV-G-Gen in dem F-defizienten Typ exprimieren. Die Western-Analyse wurde durch das oben beschriebene Verfahren bewerkstelligt. Als primäre Antikörper wurden der polyclonale anti-Sendai-Virus-Antikörper, präpariert aus dem Kaninchen, der monoclonale anti-F-Protein-Antikörper, präpariert aus der Maus, und der monoclonale anti-HN-Protein-Antikörper, präpariert aus der Maus, verwendet. Als sekundäre Antikörper wurden der anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, welcher mit Peroxidase in dem Fall des polyclonalen anti-Sendai-Virus-Antikörpers markiert wird, und der anti-Maus-IgG-Antikörper, welcher mit Peroxidase in dem Fall des monoclonalen anti-F-Protein-Antikörpers markiert wird, und der monoclonale anti-HN-Protein-Antikörper verwendet. Als Ergebnis wurde das F-Protein nicht nachgewiesen, während das Protein, welches vom Sendai-Virus stammt, und das HN-Protein nachgewiesen wurden, was bestätigt, dass es ein F-defizienter Typ ist.
  • <6> Die Herstellung des Pseudotyp-Sendai-Virus mit F- und HN-Gen-defizientem Genom unter Verwendung von Helferzellen
  • Ob die Herstellung des Pseudotyp-Virus mit VSV-G in seinem Kapsid nach der Infektion des Sendai-Virus mit F- und HN-Gen-defizientem Genom zu VSV-G-Gen exprimierende LLCG-L1-Zellen beobachtet wird, wurde unter Verwendung der GFP-Genexpression als Index und des F- und HN-Gen-defizienten Sendai-Virus, welches das in den Beispielen oben beschriebene GFP-Gen umfasste, durch ein ähnliches Verfahren, wie in den Beispielen oben beschrieben, analysiert. Als Ergebnis wurde die zu VSV-G exprimierenden Zellen spezifische Virusverbreitung beobachtet, und die Herstellung des F- und HN-defizienten Sendai-Virus, das ein Pseudotyp mit VSV-G ist, wurde beobachtet (38). Die Messung des Virustiters wurde durchgeführt durch Berechnen der Anzahl von infizierten Partikeln zu Zellen in der Viruslösung (CIU) berechnet, durch Zählen von GFP exprimierenden Zellen 5 Tage nach Infektion von serienmäßig (jede 10-fach) verdünnten Viruslösungen zu Zellen, welche noch nicht mit VSV-G induziert waren. Als Ergebnis war die maximale Virusherstellung 1 × 106 CIU/ml.
  • <7> Der Nachweis für den Besitz des F- und HN-defizientem Genoms vom Pseudotyp-Sendai-Virus
  • Das Western-Blotting der Proteine im Zellextrakt von infizierten Zellen wurde ausgeführt, um zu analysieren, ob das vorliegende Virus, welches in VSV-G exprimierenden Zellen verbreitet wurde, F- und HN-defizienter Typ ist. Als Ergebnis wurden F- und HN-Proteine nicht nachgewiesen, während Proteine, welche aus dem Sendai-Virus stammen, nachgewiesen wurden, was bestätigt, dass es ein F- und HN-defizienter Typ ist (39).
  • [Beispiel 12] Die Analyse des Virus-Rekonstitutionsverfahren
  • <Das konventionelle Verfahren>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf 100 mm Kulturschalen bei 5 × 106 Zellen/Schale gesät. Nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und dann mit rekombinanten Vacciniavirus, welches T7-RNA-Polymerase exprimiert (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 1986) (vTF7-3), bei Raumtemperatur 1 Stunde (moi = 2) (moi = 2 bis 3, vorzugsweise wird moi=2 verwendet) infiziert. Das hierin verwendete Virus wurde mit 3 μg/ml Psoralen und langwelligem Ultraviolettlicht (365 nm) 5 min vorbehandelt. Die Plasmide pSeV18+/ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) wurden in Opti-MEM-Medium (GIBCO) bei einem Verhältnis von jeweils 12 μg, 4 μg, 2 μg und 4 μg/Schale suspendiert. Dann wurde SuperFect Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl, QIAGEN) zugegeben und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen und 3 ml Opti-MEM-Medium, welches 3% FBS enthielt, wurden zugegeben. Danach wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und die DNA-SuperFect-Mischung wurde zugegeben. Nach einer Züchtung von 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und 70 Stunden in MEM-Medium kultiviert, welches 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) enthielt. Die Zellen und der Kulturüberstand wurden als P0-d3-Proben gesammelt. Die Pellets von P0-d3 wurden in Opti-MEM-Medium (10 Zellen/ml) suspendiert. Sie wurde dreimal gefroren/aufgetaut und dann mit dem Lipofektionsreagenz DOSPER (Boehringer Mannheim) (106 Zellen/25 μl DOSPER) gemischt und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen. Dann wurden F-exprimierende LLC-MK2/F7-Zellen mit der Mischung (106 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte) transfiziert und mit MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurde am Tag 3 und Tag 7 gewonnen und wurden als P1-d3- und P1-d7-Proben bezeichnet.
  • <Das Hüllproteinplasmid + das Überschichtungsverfahren für F-exprimierende Zellen>
  • Die Transfektion wurde gleichermaßen, wie oben beschrieben ausgeführt, außer dass 4 μg/Schale Hüllproteinplasmid pGEM/FHN zugegeben wurden. Nach einer Züchtung von 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und 48 Stunden in MEM-Medium kultiviert, welches 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt. Nach Entfernen des Kulturüberstands wurden die Zellen mit 5 ml Zellsuspensionslösung einer 100 mm-Schale von F-exprimierenden LLC-MK2/F7-Zellen überschichtet, welche mit MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) suspendiert waren. Nach einer Züchtung von 48 Stunden wurden die Zellen und Überstände gewonnen und als P0-d4-Proben bezeichnet. Die Pellets der P0-d4-Proben wurden in Opti-MEM-Medium (2 × 107 Zellen/ml) suspendiert und dreimal gefroren/aufgetaut. Dann wurden die F-exprimierenden LLC-MK2-Zellen mit der Suspension (2 × 106 Zellen/Well, 24-Well-Platte) überschichtet und in MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurden am Tag 3 und Tag 7 der Züchtung gewonnen als P1-d3-bzw. P1-d7-Proben bezeichnet. Als Kontrolle wurde das Experiment unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie oben beschrieben, aber ohne Überschichtung und Zugabe von nur dem Hüllproteinplasmid ausgeführt.
  • <Die CIU (Zell-infektiöse Einheiten)-Messung durch Zählen von GFP exprimierenden Zellen (GFP-CIU)>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 12-Well-Platte bei 2 × 105 Zellen/Well gesät, und nach 24 Stunden Züchtung wurden die Wells einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 100 μl/Well geeignet verdünnten Proben, oben beschrieben (P0-d3 oder PO-d4, P1-d3 und P1-d7), infiziert, in welchen die Proben verdünnt wurden, um 10 bis 100 positive Zellen in 10 cm2 zu enthalten. Nach 15 min wurde 1 ml/Well serumfreies MEM-Medium zugegeben, und nach einer zusätzlichen Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, um die GFP exprimierenden Zellen zu zählen.
  • <Die Messung von CIU (Zell-infektiöse Einheiten)>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 12-Well-Platte bei 2 × 105 Zellen/Schale gesät und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 100 μl/Well der oben beschriebenen Proben infiziert, in welchen der enthaltene Virusvektor als SeV/ΔF-GFP bezeichnet wird. Nach 15 min wurde 1 ml/Well MEM-Medium ohne Serum zugegeben und zusätzliche 24 Stunden kultiviert. Nach der Züchtung wurden die Zellen mit PBS (-) dreimal gewaschen und wurden durch Stehenlassen bei Raumtemperatur für ungefähr 10 min bis 15 min trocken gelegt. Um die Zellen zu fixieren, wurde 1 ml/Well Aceton zugegeben und sofort entfernt, und dann wurden die Zellen wieder durch Stehen lassen bei Raumtemperatur für ungefähr 10 min bis 15 min trockengelegt. 300 μl/Well polyclonaler anti-SeV-Antikörper (DN-1), präpariert aus dem Kaninchen, 100-fach mit PBS (-) verdünnt, wurden zu Zellen zugegeben, und wurden 45 min bei 37°C inkubiert. Dann wurden sie dreimal mit PBS (-) gewaschen und 300 μl/Well sekundärer Antikörper anti-Kaninchen-IgG (H + L), Fluoreszenz markiert (AlexaTM568, Molecular Probes), 200-fach mit PBS (-) verdünnt, wurden zugegeben und 45 min bei 37°C inkubiert. Nach dreimal Waschen mit PBS (-) wurden die Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie (Emission: 560 nm, Absorption: 645 nm Filter, Leica) beobachtet, um fluoreszierende Zellen zu finden (40).
  • Als Kontrollen wurden die oben beschriebenen Proben (SeV/ΔF-GFP) bei 100 μl/Well infiziert, und nach 15 min wurde 1 ml/Well MEM ohne Serum zugegeben, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie (Emission: 360 nm, Absorption: 470 nm Filter, Leica) beobachtet, um GFP exprimierende Zellen zu finden, ohne das Verfahren nach der Züchtung.
  • [Beispiel 13] Die Auswertung der passendsten PLWUV (Psoralen und langwelliges UV-Licht)-Behandlungsbedingungen für das Vacciniavirus (vTF7-3) für den Anstieg der Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virusvektors vom defizienten Typ
  • LLC-MK2 wurden auf 100 mm-Kultuschalen bei 5 × 106 Zellen/Schale gesät, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen. Dann wurden die Zellen mit rekombinanten Vacciniavirus (vTF7-3) (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)), welches die T7-RNA-Polymerase exprimiert, bei Raumtemperatur 1 Stunde (moi = 2) (moi = 2 bis 3, vorzugsweise wird moi = 2 verwendet) infiziert. Das hierin verwendete Virus wurde mit 0.3 bis 3 μg/ml Psoralen und langwelligem Ultraviolettlicht (365 nm) 2 bis 20 min vorbehandelt. Die Plasmide pSeV18+/ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) wurden in Opti-MEM-Medium (GIBCO) bei einem Verhältnis von jeweils 12 μg, 4 μg, 2 μg und 4 μg/Schale suspendiert. Dann wurde das SuperFect-Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl, QIAGEN) zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, und 3 ml Opti-MEM, Medium, welches 3% FBS enthielt, wurden zugegeben. Danach wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen, und dann wurde die DNA-SuperFect-Mischung zugegeben. Nach einer Züchtung von 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und 48 Stunden in MEM-Medium kultiviert, welches 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) enthielt. Ungefähr 1/20 des Sichtfeldes in einer 100 mm-Kulturschale wurde durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet und GFP exprimierende Zellen wurden gezählt. Um die Inaktivierung des Vacciniavirus (vTF7-3) zu testen, wurde die Titermessung durch Plaquebildung (Yoshiyuki Nagai et al., vrus experiment protocols, S 291-296, 1995) ausgeführt.
  • Zusätzlich wurden unter Fixierung der Zeitsteuerung der Gewinnung nach Transfektion zu Tag 3 Psoralen und die UV-Bestrahlungszeit untersucht. Unter Verwendung des Vacciniavirus (vTF7-3), welches mit jeder PLWUV-Behandlung behandelt wurde, wurde die Rekonstitutionseffizienz des Sendai-Virus untersucht. Die Rekonstitution wurde durch Modifizierung des Verfahrens von Kato et al., und zwar durch das unten beschriebene Verfahren ausgeführt. LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 6-Well-Mikroplatte bei 5 × 105 Zellen/Well gesät, und nach einer Züchtung über Nacht (Von den Zellen nimmt man an, dass sie zu 1 × 106 Zellen/Well wachsen) wurden die mit PBS gewaschenen Zellen mit verdünntem Vacciniavirus (vTF7-3) bei 2 × 106 pfu/100 μl, vor der PLWUV-Behandlung durch Titer kalibriert, infiziert. Nach einer Infektion von 1 Stunde wurden 50 μl Opti-MEM-Medium (GIBCO) mit jeweils 1, 0.5, 1 und 4 μg des Plasmids pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L und SeV-cDNA vom zusätzlichen Typ (pSeV18+b (+)) (Hasan, M. K. et al., J. General Virology 78:2813-2820, 1997) zugegeben. 10 μl SuperFect (QIAGEN) wurden zusätzlich zugegeben und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen. Dann wurde 1 ml Opti-MEM (welches 40 μg/ml AraC enthielt) zugegeben und auf die Zellen überschichtet. Die Zellen wurden 3 Tage nach Transfektion gewonnen, dann zentrifugiert und in 100 μl/Well PBS suspendiert. Die Suspension wurde 10-, 100- und 1000-fach verdünnt und 100 μl der resultierenden Zelllösung wurden in Hühner-Bruteier 10 Tage nach Befruchtung unter Verwendung von 3 Eiern für jede Verdünnung (jeweils 1 × 105, 1 × 104 und 1 × 103 Zellen) geimpft. Nach 3 Tagen wurde die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen und die Virus-Rekonstitution wurde durch den HA-Test untersucht. Eier, welche HA-Aktivität zeigten, welche mit 1 × 105 Zellen, 1 × 104 Zellen und 1 × 103 Zellen geimpft wurden, erreichten jeweils 1, 10 und 100 Punkt(e), um die Rekonstitutionseffizienz zu berechnen.
  • <Ergebnisse>
  • Die Ergebnisse der Beispiele 12 und 13 werden in den 40 bis 43 und Tabelle 2 gezeigt. Die Kombination von Hüllprotein-exprimierendem Plasmid und Zellüberschichtung erhöhte die Rekonstitutionseffizienz von SeV/ΔF-GFP. Eine bemerkenswerte Verbesserung wurde an d3 bis d4 (Tag 3 bis Tag 4) von PO (vor der Subkultur) erhalten (41). In Tabelle 2 wurden die Eier mit Zellen 3 Tage nach der Transfektion geimpft. Die höchste Rekonstitutionseffizienz wurde an Tag 3 erhalten, wenn mit 0.3 μg/ml Psoralen 20 min behandelt. So wurden diese Bedingungen als optimale Bedingungen genommen (Tabelle 2). Tabelle 2: Effekt der PLWUV-Behandlung des Vacciniavirus auf die Rekonstitution des Sendai-Virus
    Figure 00710001
  • [Beispiel 14] Die Herstellung des LacZ umfassenden, F-defizienten GFP nicht umfassenden Sendai-Virusvektors
  • <Die Konstruktion der LacZ-Gen umfassenden SeV-Vektor-cDNA vom F-defizienten Typ>
  • Um cDNA zu konstruieren, welche das LacZ-Gen an der NotI-Restriktionsstelle umfasst, welche an der Stromaufwärts-Region des NP-Gens von pSeV18+/ΔF vorhanden ist, in Beispiel 1 (pSeV (+18:LacZ)/ΔF) beschrieben, wurde PCR durchgeführt, um das LacZ-Gen zu amplifizifieren. Die PCR wurde durch Anpassen des LacZ-Gens zu Vielfachen von 6 (Hausmann, S et al., RNA 2, 1033-1045 (1996)) und unter Verwendung des Primers (5'-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3'/SEQ ID NO: 17), welcher die NotI-Restriktionsstelle für das 5'-Ende umfasst, und des Primers (5'-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCACTGGTA-3'/SEQ ID NO: 18), welcher das Transkriptionsterminationssignal von SeV (E), das Intron (I), das Transkriptionsstartsignal (S) und die NotI-Restriktionsstelle für das 3'-Ende umfasst, unter Verwendung von pCMV-β (Clontech) als Matrize ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren, wie folgt. 50 ng pCMV-β, 200 μM dNTP (PharmaciaBiotech), 100 pM Primer, 4 U Vent Polymerase (New England Biolab) wurden mit dem begleitenden Puffer gemischt, und 25 Reaktionstemperaturzyklen von 94°C 30 s, 50°C 1 min, 72°C 2 min wurden verwendet. Die resultierenden Produkte wurden mit Agarosegelelektrophorese elektrophoresiert. Dann wurde das 3.2 kb-Fragment ausgeschnitten und mit NotI nach der Reinigung verdaut. pSeV(+18:LacZ)/ΔF wurde durch Ligieren mit dem NotI verdauten Fragment von pSeVi 8+/ΔF erhalten.
  • <Das konventionelle Verfahren>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 100 mm-Kulturschale bei 5 × 106 Zellen/Schale gesät, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen. Dann wurden die Zellen mit rekombinanten Vacciniavirus (vTF7-3) (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)), welches die T7-RNA-Polymerase exprimiert, bei Raumtemperatur 1 Stunde (moi = 2) (moi = 2 bis 3, vorzugsweise wird moi = 2 verwendet) infiziert. Das hierin verwendete Virus wurde 5 min mit 3 μg/ml Psoralen und langwelligen Ultraviolettlicht (365 nm) vorbehandelt. Die Sendai-Virusvektor-cDNA vom F-defizienten Typ, welche LacZ umfasst, (pSeV(+18:LacZ)ΔF), pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L (Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) wurden in Opti-MEM-Medium (GIBCO) bei einem Verhältnis von jeweils 12 μg, 4 μg, 2 μg und 4 μg/Schale suspendiert, 4 μg/Schale Hüllproteinplasmid pGEM/FHN und SuperFect Transfektionsreagenz (1 μg DNA/5 μl, QIAGEN) wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen. Dann wurden 3 ml Opti-MEM-Medium, welches 3% FBS enthielt, zugegeben und die Zellen wurden zweimal mit MEM ohne Serum gewaschen, und dann wurde die DNA-SuperFect-Mischung zugegeben. Nach einer Züchtung von 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und 24 Stunden in MEM-Medium kultiviert, welches 40 μg/ml Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC, Sigma) und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt. Die Kulturüberstände wurden entfernt und 5 ml Suspension einer 100 mm-Kulturschale von F-exprimierenden LLC-MK2/F7-Zellen in MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) wurden auf die Zellen überschichtet. Nach einer zusätzlichen Züchtung von 48 Stunden wurden die Zellen und Überstände gewonnen und als P0-d3-Proben bezeichnet. Die P0-d3-Pellets wurden in Opti-MEM-Medium (2 × 107 Zellen/ml) suspendiert und nach 3-mal Gefrier-Tauen wurden sie mit dem Lipofektionsreagenz DOSPER (Boehringer Mannheim) (106 Zellen/25 μl DOSPER) gemischt und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen. Dann wurden die F-exprimierenden LLC-MK2/F7-Zellen mit der Mischung (106 Zellen/Well, 24-Well-Platte) transfiziert und mit MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurden an Tag 7 gewonnen und als P1-d7-Proben bezeichnet. Zusätzlich wurden die gesamten Volumina der Überstände zu F-exprimierenden LLC-MK2/F7-Zellen, welche auf 12-Well-Platten gesät worden waren, bei 37°C 1 Stunde infiziert. Nach einmal Waschen mit MEM-Medium wurden die Zellen dann in MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurden am Tag 7 gewonnen und wurden als P2-d7-Proben bezeichnet. Zusätzlich wurden die gesamten Volumina der Überstände zu F-exprimierenden LLC-MK2/F7-Zellen, welche auf 6-Well-Platten gesät worden waren, bei 37°C 1 Stunde infiziert. Nach einmal Waschen mit MEM-Medium wurden dann die Zellen in MEM-Medium ohne Serum (welches 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurden am Tag 7 gewonnen und wurden als P3-d7-Proben bezeichnet. Zusätzlich wurden die gesamten Volumina der Überstände zu F-exprimierende LLC-MK2/F7 Zellen, welche auf 10 cm-Platten gesät worden waren, bei 37°C 1 Stunde infiziert. Nach einmal Waschen mit MEM-Medium wurden dann die Zellen in MEM-Medium ohne Serum (welches 40 μg/ml AraC und 7.5 μg/ml Trypsin enthielt) kultiviert. Die Kulturüberstände wurden am Tag 7 gewonnen und wurden als P4-d7-Proben bezeichnet.
  • <Die Messung von CIU durch Zählen der LacZ exprimierenden Zellen (LacZ-CIU)>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 6-Well-Platte bei 2.5 × 106 Zellen/Well gesät, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und mit der 1/10-fach seriellen Verdünnungsreihe von P3-d7, welche unter Verwendung des MEM-Mediums hergestellt worden war, bei 37°C 1 Stunde infiziert. Dann wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium gewaschen, und 1.5 ml MEM-Medium, welches 10% Serum enthielt, wurden zugegeben. Nach einer dreitägigen Züchtung bei 37°C wurden die Zellen mit β-Gal färbendem Kit (Invitrogen) gefärbt. Das Ergebnis des dreimal wiederholten Experiments wird in 44 gezeigt. Als Ergebnis des Zählens der Zahl der LacZ färbenden positiven Zellen wurde 1 × 106 CIU/ml Virus in den P3-d7-Proben in irgendeinem Fall erhalten.
  • [Beispiel 15] Die Regulation der Genexpressionsniveaus unter Verwendung des Polaritätseffekts beim Sendai-Virus
  • <Die Konstruktion der genomischen SeV-cDNA>
  • Zusätzliche NotI-Stellen wurden in die genomische cDNA von ganzer Länge des Sendai-Virus (SeV), und zwar in pSeV(+) (Kato, A. et al., Genes to Cells 1: 569-579, 1996) zwischen dem Startsignal und dem ATG-Translationsstartsignal der jeweiligen Gene eingeführt. Spezifisch wurden die Fragmente von pSeV(+), welche mit SphI/SalI (2645 bp), ClaI (3246 bp) und ClaI/EcoRI (5146 bp) verdaut worden waren, mit Agarosegelelektrophorese getrennt und entsprechende Banden wurden ausgeschnitten und dann gewonnen und mit QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN) gereinigt, wie in 45(A) gezeigt. Das Sphl/Sal/ verdaute Fragment, das Clal verdaute Fragment und das ClaI/EcoRI verdaute Fragment wurden jeweils mit LITMUS38 (NEW ENGLAND BIOLABS), pBluescriptII KS+ (STRATAGENE) und pBluescriptII KS+ (STRATAGENE) für die Subclonierung ligiert. Der Quickchange Site-Directed Mutagenesis-Kit (STRATAGENE) wurde für die stufenweise Einführung von NotI-Stellen verwendet. Die synthetisierten und für jede Einführung verwendeten Primer waren der Sense-Strang: 5'-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3' (SEQ ID NO: 19), der Antisense-Strang: 5'-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3' (SEQ ID NO: 20) für NP-P, der Sense-Strang: 5'-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-3' (SEQ ID NO: 21), der Antisense-Strang: 5'-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3' (SEQ ID NO: 22) für P-M, der Sense-Strang: 5'-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3' (SEQ ID NO: 23), der Antisense-Strang: 5'-gggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3' (SEQ ID NO: 24) für M-F, der Sense-Strang: 5'-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3' (SEQ ID NO: 25), der Antisense-Strang: 5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3' (SEQ ID NO: 26) für F-HN, der Sense-Strang: 5'-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3' (SEQ ID NO: 27) der Antisense-Strang 5'-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3' (SEQ ID NO: 28) für HN-L.
  • Als Matrizen wurden das SalI/SphI-Fragment für NP-P, die Clal-Fragmente für P-M und M-F und die Clal-/EcoRI-Fragmente für F-HN und HN-L, welche wie oben beschrieben subcloniert wurden, verwendet, und die Einführung wurde nach dem Protokoll ausgeführt, welches dem Quickchange Site-Directed Mutagenesis-Kit beiliegt. Die Resultierenden wurden wieder mit dem gleichen Enzym, welches für die Subclonierung verwendet worden war, gewonnen und gereinigt. Dann wurden sie mit der genomischen cDNA des Sendai-Virus zusammengefügt. Als Ergebnis wurden 5 Arten von genomischer cDNA des Sendai-Virus (pSeV(+)NPP, pSeV(+)PM, pSeV(+)MF, pSeV(+)FHN und pSeV(+)HNL), bei welchen die NotI-Stellen zwischen jedem Gen eingeführt werden, konstruiert, wie in 45(B) gezeigt.
  • Als Reportergen, um das Genexpressionsniveau zu testen, wurde alkalische Phosphatase (SEAP) des menschlichen sezernierten Typs durch PCR subcloniert. Als Primer wurden der 5'-Primer: 5'-gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3' (SEQ ID NO: 29) und der 3'-Primer: 5'-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3' (SEQ ID NO: 30) welche mit den Ascl-Restriktionsstellen hinzugefügt waren, synthetisiert und die PCR wurde durchgeführt. pSEAP-Basic (CLONTECH) wurde als Matrize verwendet und Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (STRATAGENE) wurde als Enzym verwendet. Nach der PCR wurden die resultierenden Produkte mit Ascl verdaut, dann gewonnen und durch Elektrophorese gereinigt. Als Plasmid für die Subclonierung wurde pBluescriptII KS+ konstruiert, welches in seiner NotI-Stelle mit der synthetisierten Doppelstrang-DNA [Sense-Strang: 5'-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatCcgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3' (SEQ ID NO: 31), Antisense-Strang: 5'-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3' (SEQ ID NO: 32)] eingebaut wurde, welche die Multicloning-Stelle (PmeI-AscI-SwaI) und das Terminationssignal-Intron-Startsignal umfasste (46). Das gewonnene und gereinigte RCR-Produkt wurde zur Ascl-Stelle des Plasmids ligiert und cloniert. Das Resultierende wurde mit NotI verdaut und das SEAP-Genfragment wurde gewonnen und durch Elektrophorese gereinigt, um jeweils in 5 Typen der genomischen cDNA des Sendai-Virus und die NotI-Stelle von pSeV18+ zu ligieren. Die resultierenden Virusvektoren wurden jeweils als pSeV(+)NPP/SEAP, pSeV(+)PM/SEAP, pSeV(+)MF/SEAP, pSeV(+)FHN/SEAP, pSeV(+)HNL/SEAP und pSeV18(+)/SEAP bezeichnet.
  • <Die Rekonstitution des Virus>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf 100 mm-Kulturschalen bei 2 × 106 Zellen/Schale gesät, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen mit rekombinanten Vacciniavirus (PLWUV-VacT7) (Fuerst, T. R. et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996), welches die T7-Polymerase exprimiert, 1 Stunde (moi = 2) bei Raumtemperatur infiziert, in welcher das Virus mit Psoralen und UV vorbehandelt wurde. Jede Sendai-Virus-cDNA, welche mit SEAP, pGEM/NP, pGEM/P und pGEM/L eingebaut war, wurde in Opti-MEM-Medium (GIBCO) bei einem Verhältnis von jeweils 12 μg, 4 μg, 2 μg und 4 μg/Schale suspendiert, 110 μl SuperFect-Transfektionsreagenz (QIAGEN) wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 15 min stehen gelassen und 3 ml Opti-MEM-Medium, welches 3% FBS enthielt, wurden zugegeben. Dann wurden die Zellen gewaschen und die DNA-SuperFect-Mischung wurde zugegeben. Nach einer Züchtung von 3 bis 5 Stunden wurden die Zellen zweimal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und 72 Stunden in MEM-Medium, welches Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (AraC) enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden gewonnen und die Pellets wurden mit 1 ml PBS suspendiert, dreimal gefrier-getaut. Die 100 μl des Resultierenden wurden in Hühnereier geimpft, welche 10 Tage vorinkubiert wurden, und zusätzlich 3 Tage bei 35°C inkubiert, dann wurde die Allantoisflüssigkeit gewonnen. Die gewonnenen Allantoisflüssigkeiten wurden zu 10-5 bis 10-7 verdünnt und zu Hühnereiern neu geimpft, um es frei von Vacciniaviurs zu machen, dann gleichermaßen gewonnen und in Aliquots bei -80°C gelagert. Die Virusvektoren wurden als SeVNPP/SEAP, SeVPM/SEAP, SeVMF/SEAP, SeVHN/SEAP, SeVHNL/SEAP und SeV18/SEAP bezeichnet.
  • <Die Titermessung durch den Plaque-Assay>
  • CV-1-Zellen wurden auf 6-Well-Platten bei 5 × 105 Zellen/Well gesät und 24 Stunden kultiviert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen 1 Stunde mit rekombinanten SeV, durch BSA/PBS (1% BSA in PBS) als 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 und 10-7 verdünnt, inkubiert, wieder mit PBS gewaschen, dann mit 3 ml/Well von BSA/MEM/Agarose (0.2% BSA + 2 × MEM, gemischt mit equivalentem Volumen von 2%iger Agarose) überschichtet und bei 37°C, 0.5% CO2 6 Tage kultiviert. Nach der Züchtung wurden 3 ml Ethanol/Essigsäure (Ethanol:Essigsäure = 1:5) zugegeben und 3 Stunden stehen gelassen, dann mit Agarose entfernt. Nach dreimal Waschen mit PBS wurden die Zellen mit dem anti-Sendai-Virus-Antikörper des Kaninchens, welcher 100-fach verdünnt worden war, bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Nach dreimal Waschen mit PBS wurden die Zellen dann mit Alexa FlourTM markiertem anti-Kaninchen-Ig(G + H) der Ziege (Molecular Probe), 200-fach verdünnt, bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Nach dreimal Waschen mit PBS wurden Fluoreszenzbilder durch den Lumino-Image-Analyzer LAS1000 (Fuji Film) erhalten und die Plaques wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in 47 gezeigt. Zusätzlich werden die Ergebnisse von erhaltenen Titern in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Ergebnisse der Titer von jedem rekombinanten Sendai-Virus, gemessen aus den Ergebnissen des Plaque-Assays
    Rekombinantes Virus Titer (pfu/ml)
    SeV18/SEAP 3.9 × 109
    SeVNPP/SEAP 4.7 × 109
    SeVPM/SEAP 3.8 × 109
    SeVMF/SEAP 1.5 × 1010
    SeVFHN/SEAP 7.0 × 109
    SeVHNL/SEAP 7.1 × 109
  • <Der Vergleich der Reportergen-Expression>
  • LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 6-Well-Platte bei 1 bis 5 × 105 Zellen/Well gesät und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurde jeder Virusvektor bei moi = 2 infiziert. Nach 24 Stunden wurden 100 μl der Kulturüberstände gewonnen, und der SEAP-Assay wurde ausgeführt. Der Assay wurde mit dem Reporter Assay Kit – SEAP – (Toyobo) bewerkstelligt und durch den Lumino-Image-Analyzer LAS1000 (Fuji Film) gemessen. Die gemessenen Werte wurden als relative Werte durch den bezeichnenden Wert von SeV18+/SEAP als 100 angezeigt. Als Ergebnis wurde die SEAP-Aktivität nachgewiesen, ungeachtet der Position wo das SEAP-Gen eingefügt wurde, angezeigt in 48. Es wurde gefunden, dass die SEAP-Aktivität gegen stromabwärts des Genoms abnahm, und zwar nahm das Expressionsiveau ab.
  • Wenn das SEAP-Gen zwischen das NP- und P-Genen eingefügt wird, wurde zusätzlich ein dazwischenliegendes Expressionsniveau nachgewiesen, im Vergleich dazu, wenn das SEAP-Gen stromaufwärts des NP-Gens eingefügt wird und wenn das SEAP-Gen das SEAP-Gen zwischen dem P- und dem M-Genen eingefügt wird.
  • [Beispiel 16] Der Anstieg der Effizienz bei der Vermehrung des defizienten SeV durch das Überschichtungsverfahren des doppelt defizienten ΔF-HN
  • Da das nun verwendete Rekonstitutionsverfahren des SeV-Virus ein rekombinantes Vacciniavirus verwendet, welches T7-RNA-Polymerase (vTF7-3) exprimiert, wird eine Portion der infizierten Zellen durch die Zytotoxizität des Vacciniavirus abgetötet. Zusätzlich ist die Virusverbreitung nur in einem Teil der Zellen möglich, und es ist vorzuziehen, wenn die Virusvermehrung effizient und persistent in mehreren Zellen durchgeführt werden könnte. Jedoch findet in dem Fall von Paramyxovirus Zellfusion statt, wenn das F- und das HN-Protein derselben Virusart auf der Zelloberfläche zu derselben Zeit vorhanden ist, was Synctium-Bildung verursacht (Lamb und Kolakofsky, 1996, Fields virology, S 1189). Daher waren FHN co-exprimierende Zellen schwierig, zu subkultivieren. Daher dachten die Erfinder, dass die Effizienz den defizienten Virus zu erhalten durch Überschichtung von Helferzellen, welche das deletierte Protein (F und HN) exprimierten, zu den rekonstituierten Zellen zunehmen kann. Durch Untersuchung der überschichtenden Zellen mit verschiedenen Zeiten der FHN-Expression wurde die Effizienz der Viruserhaltung des FHN-co-defizienten Virus besonders erhöht.
  • LLC-MK2-Zellen (1 × 107 Zellen/Schale), welche zu 100% Konfluenz in 10 cm-Kulturschalen gezüchtet worden waren, wurden mit PLWU behandeltem Vacciniavirus bei moi = 2 1 Stunde bei Raumtemperatur infiziert. Danach wurden durch Mischen von 12 μg/10 cm Schale, 4 μg/10 cm Schale, 2 μg/10 cm Schale, 4 μg/10 cm Schale und 4 μg/10 cm Schale von FHN-defizienter cDNA, welche jeweils d2EGFP (pSeV18+/ΔFHN-d2GFP (Beispiel 8)), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L und pGEM/FHN umfasste (3 ml/10 cm Schale als Endvolumen), und unter Verwendung des Geneinführungsreagenz SuperFect (QIAGEN) wurden LLC-MK2-Zellen mit den Genen unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens zu dem, wie oben für die Rekonstitution des F-defizienten Virus beschrieben, eingeführt. Nach 3 Stunden wurden die Zellen dreimal mit Medium ohne Serum gewaschen, dann wurden die abgelösten Zellen durch Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit (1000 Upm/2 min) gewonnen und in serumfreien MEM-Medium, welches 40 μg/ml AraC (Sigma) und 7.5 μg/ml Trypsin (GIBCO) enthielt, suspendiert und zu Zellen gegeben und über Nacht kultiviert. FHN-co-exprimierende Zellen wurde separat präpariert, welche 100% konfluent auf 10 cm-Kulturschalen waren, wurden mit Adenovirus AxCANCre bei MOI = 10 induziert, und die Zellen wurden einmal mit 5 ml PBS(-) bei 4 Stunden, 6 Stunden, 8 Stunden, Tag 2 und Tag 3 gewaschen und durch die Zelldissoziationslösung (Sigma) abgelöst. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit (1000 Upm/2 min) gesammelt und in serumfreien MEM-Medium, welches 40 μg/ml AraC (Sigma) und 7.5 μg/ml Trypsin (GIBCO) enthielt, suspendiert. Dieses wurde dann zu Zellen gegeben, bei welchen das FHN-co-defiziente Virus rekonstituiert (P0) und über Nach kultiviert wurde. Zwei Tage nach Überschichtung der Zellen wurden die Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, um die Ausbreitung des Virus durch GFP-Expression innerhalb der Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in 49 gezeigt. Wenn mit dem konventionellen Fall (linkes Feld) ohne Überschichtung mit Zellen verglichen wird, wurden bemerkenswert mehr GFP exprimierende Zellen beobachtet, als wenn die Zellen mit Zellen überschichtet wurden (rechts). Diese Zellen wurden gewonnen, mit 107 Zellen/ml Opti-MEM-Medium (GIBCO) suspendiert, und 3-mal gefrier-getaut, um ein Zelllysat zu präparieren. Dann wurden FHN co-exprimierende Zellen 2 Tage nach Induktion mit dem Lysat bei 106 Zellen/100 μl/Well infiziert und 2 Tage in serumfreien MEM-Medium, welches 40 μg/ml AraC (Sigma) und 7.5 μg/ml Trypsin (GIBCO) enthielt, bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator kultiviert, und der Virustiter des Kulturüberstands der P1-Zellen wurde durch CIU-GFP (Tabelle 4) gemessen. Als Ergebnis wurde kein Virusamplifikationseffekt 4 Stunden nach FHN-Induktion nachgewiesen, und bemerkenswerte Amplifikationseffekte wurden 6 Stunden oder mehrere Stunden nach der Induktion auf Grund der Zellüberschichtung nachgewiesen. Insbesondere waren die Viren, welche in den P1-Zellkulturüberstand freigesetzt worden waren, 10-mal mehr nach 6 Stunden, wenn die Zellüberschichtung ausgeführt wurde, verglichen dazu, wenn die Zellüberschichtung nicht ausgeführt wurde. Tabelle 4: Amplifikation des defizienten SeV durch das Überschichtungsverfahren der doppelt-defizienten ΔF-HN-Zelle
    GFP-CIU × 103/ml
    PHN-Zelle+ ad/cre
    FHN-Zelle- 4h 6h 8h 2d 3d
    8-10 6-9 80-100 70-100 60-100 20-50
  • [Beispiel 17] Die Der Nachweis für den Besitz des F-defizienten Genoms vom Pseudotyp-Sendai-Virus
  • Die Western-Analyse der Proteine von Extrakten von infizierten Zellen wurde ausgeführt, um zu bestätigen, dass das Virus, welches durch die oben beschriebene VSV-G-Genexpression verbreitet wurde, ein F-defizienter Typ ist. Als Ergebnis wurden Proteine, welche aus dem Sendai-Virus stammten, nachgewiesen, während das F-Protein nicht nachgewiesen wurde, was bestätigt, dass das Virus ein F-defizienter Typ ist (50).
  • [Beispiel 18] Der Effekt des anti-VSV-Antikörpers auf die Infektiosität des Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F- und HN-Gen-defiziente Genom umfasst
  • Um herauszufinden, ob das Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F- und HN-Gen-defiziente Genom umfasst, welches durch Verwendung der VSV-G exprimierenden Linie erhalten wurde, das VSV-G-Protein in seinem Kapsid umfasst, ob oder nicht die neutralisierende Aktivität der Infektiosität beeinflusst wird, wurde unter Verwendung des anti-VSV-Antikörpers untersucht. Die Viruslösung und der Antikörper wurden gemischt und 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden LLCG-L1-Zellen, bei welchen die VSV-G-Expression nicht induziert wurde, mit der Mischung infiziert und die Gen einführende Fähigkeit am Tag 4 wurde durch die Existenz von GFP exprimierenden Zellen untersucht. Als Ergebnis wurde die perfekte Hemmung der Infektiosität durch den anti-VSV-Antikörper in dem Pseudotyp-Sendai-Virus gesehen, welches das F- und HN-Gen-defiziente Genom umfasste (VSV-G in der Figur), während keine Hemmung beim Sendai-Virus, welches das geeignete Kapsid umfasst (F, HN in der Figur), nachgewiesen wurde (51). So wurde belegt, dass das in dem vorliegenden Beispiel erhaltene Virus ein Pseudotyp-Sendai-Virus ist, welches das VSV-G-Protein als sein Kapsid umfasst, und dass seine Infektiosität spezifisch durch den Antikörper gehemmt werden kann.
  • [Beispiel 19] Die Reinigung der Pseudotyp-Sendai-Viren, welche die F-Gen-defizienten und die F- und HN-Gen-defizienten Genome umfasst, durch Dichtegradientenultrazentrifugation.
  • Unter Verwendung des Kulturüberstands der mit Virus infizierten Zellen wurde eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ausgeführt, um das Pseudotyp- Sendai-Virus, welches die defizienten Genome des F-Gen und der F- und HN-Gene umfasst, zu fraktionieren und zu reinigen. Die Viruslösung wurde auf eine Saccharose-Lösung mit einem 20 bis 60%igem Gradienten gegeben, dann 15 bis 16 Stunden bei 29000 Upm unter Verwendung eines SW41-Rotors (Beckman) ultrazentrifugiert. Nach der Ultrazentrifugation wurde ein Loch an dem Boden des Röhrchens gemacht, dann wurden 300 μl Fraktionen unter Verwendung eines Fraktionensammlers gesammelt. Für jede Fraktion wurde die Western-Analyse ausgeführt, um zu testen, dass das Virus ein Pseudotyp-Sendai-Virus ist, welches ein Genom, defizient in F-Gen oder F- und HN-Genen, und das VSV-G-Protein als Kapsid umfasst. Die Western-Analyse wurde durch das Verfahren, wie oben beschrieben, bewerkstelligt. Als Ergebnis wurden im F-defizienten Pseudotyp-Sendai-Virus Proteine, welche von dem Sendai-Virus stammten, HN-Protein und VSV-G-Protein in derselben Fraktion nachgewiesen, während das F-Protein nicht nachgewiesen wurde, was bestätigt, dass es ein F-defizientes Pseudotyp-Sendai-Virus ist. Andererseits wurden in dem F- und HN-defizientem Pseudotyp-Sendai-Virus Proteine, welche vom Sendai-Virus stammten, und das VSV-G-Protein in derselben Fraktion nachgewiesen, während das F- und das HN-Protein nicht nachgewiesen wurden, was bestätigt, dass es ein F- und HN-defizientes Pseudotyp-Sendai-Virus ist (52).
  • [Beispiel 20] Das Überwinden der Hämagglutination durch das Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F-Gen-defiziente und das F- und HN-Gen-defiziente Genom umfasst
  • LLC-MK2-Zellen wurde mit entweder Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F-Gen-defiziente oder das F- und HN-Gen-defiziente Genom umfasst, oder mit dem Sendai-Virus mit dem normalen Kapsid infiziert, und an Tag 3 wurde eine 1%ige rote Blutzell-Suspension des Vogels zugegeben und bei Raumtemperatur 30 min bei 4°C stehen gelassen. Danach wurde die Zelloberfläche von infizierten Zellen, welche GFP exprimierten, beobachtet. Als Ergebnis wurde für das Virus mit F-Gen-defizientem Genom und F-defizientem Pseudotyp-Sendai-Virus (SeV/ΔF und Pseudotyp-SeV/ΔF(VSV-G) durch VSV-G) die Agglutinationsreaktion auf der Oberfläche von infizierten Zellen, sowie für das Sendai-Virus mit dem ursprünglichen Kapsid beobachtet. Andererseits wurde keine Agglutinationsreaktion auf der Oberfläche von infizierten Zellen für das Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F-und HN-Gen-defiziente Genom (SeV/ΔF-HN(VSV-G)) umfasst, beobachtet (53).
  • [Beispiel 21] Die Infektionsspezifität des VSV-G-Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F-Gen-defiziente Genom umfasst, zu kultivierten Zellen
  • Die Infektionseffiezienz des VSV-G-Psuedotyp-Sendai-Virus, welches das F-Gen-defiziente Genom umfasst, zu kultivierten Zellen wurde durch das Ausmaß der GFP-Expression in überlebenden Zellen 3 Tage nach Infektion unter Verwendung der Durchflusszytometrie gemessen. LLC-MK2-Zellen, welche fast die gleiche Infektionseffizienz im Pseudotyp-Sendai-Virus, welcher das F-Gen-defiziente Genom umfasst, und im Sendai-Virus mit dem ursprüngliche Kapsid zeigten, wurden als Kontrollen für den Vergleich verwendet. Als Ergebnis wurde kein Unterschied in der Infektionseffizienz bei menschlichen Eierstockkrebs-HRA-Zellen gefunden, während in Jurkat-Zellen der T-Zell-Abstammung eine etwa 2-fache Zunahme in der Infektionseffizienz des VSV-G-Pseudotyp-Sendai-Virus, welches das F-Gen-defiziente Genom umfasste, verglichen zu den Kontrollen beobachtet wurde ( 54).
  • [Beispiel 22] Die Konstruktion des Sendai-Virus-Vektors vom F-defizienten Typ, welches NGF umfasst
  • <Die Rekonstitution von NGF/SeV/ΔF>
  • Die Rekonstitution von NGF/SeV/ΔF wurde nach dem oben beschriebenen „Das Hüllproteinplasmid + das Überschichtungsverfahren für F-exprimierende Zellen" bewerkstelligt. Die Titermessung wurde durch ein Verfahren unter Verwendung des polyclonalen anti-SeV-Antikörpers bewerkstelligt.
  • <Die Bestätigung des Virusgenoms von NGF/SeV/ΔF (RT-PCR>
  • Um das Virusgenom NGF/SeV/ΔF zu bestätigen (55, oberes Feld), wurde der aus LLC-MK2/F7-Zellen gewonnene Kulturüberstand zentrifugiert, und die RNA wurde unter Verwendung von QIAmp Viral RNA Minikit (QIAGEN) nach dem Herstellerprotokoll extrahiert. Unter Verwendung der RNA-Matrize wurde die Synthese und PCR von RT-PCR unter Verwendung von SUPERSCRIPTTM ONE-STEPTM RT-PCR SYSTEM (GIBCO BRL) ausgeführt. Als Kontrollgruppe wurde die cDNA des zusätzlichen SeV-Typs (pSeV18+b(+)) (Hasan, M.K. et al., J General Virology 78: 2813-2820, 1997) verwendet. NGF-N und NGF-C wurden als PCR-Primer verwendet. Für NGF-N wurde vorwärts: ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG (SEQ ID NO: 33) und für NGF-C wurde revers: ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC (SEQ ID NO: 34) verwendet. Wenn NGF-N und NGF-C als Primer verwendet wurden, wurde als Ergebnis eine NGF spezifische Bande für NGF/SeV/ΔF in den RT-Bedingungen nachgewiesen. Keine Bande wurde für die Kontrollgruppe nachgewiesen (55, unteres Feld).
  • [Beispiel 23] Die NGF-Protein-Quantifizierung und die Messung der in vitro-Aktivität, exprimiert nach Infektion des SeV vom F-defizienten Typ, welches das NGF-Gen umfasst
  • Die Infektion und die NGF-Protein-Expression wurden unter Verwendung von LLC-MK2/F- oder LLC-MK2-Zellen, welche bis fast konfluent auf Kulturplatten von 10 cm oder 6 cm Durchmesser gezüchtet worden waren, bewerkstelligt. NGF/SeV/ΔF und NGF/SeV/ΔF-GFP wurden zu LLC-MK2/F-Zellen infiziert, und NGF/SeV und GFP/SeV wurden zu LLC-MK2-Zellen bei m.o.i 0.01 infiziert und 3 Tage mit MEM-Medium ohne Serum, welches 7.5 μg/ml Trypsin (GIBCO) enthielt, kultiviert. Nach der Züchtung von 3 Tagen, bei welcher fast 100% der Zellen infiziert werden, wurde das Medium zu MEM-Medium ohne Trypsin und Serum gewechselt und zusätzlich 3 Tage kultiviert. Dann wurde jeder Kulturüberstand gewonnen und bei 48,000x g 60 min zentrifugiert. Dann wurden die Quantifizierung des NGF-Proteins und die Messung der in vitro-Aktivität für den Überstand ausgeführt. Wenn auch in den vorliegenden Beispielen, SeV vom F-defizienten Typ (NGF/SeV/ΔF, NGF/SeV/ΔF-GFP) (s. 55) zu LLC-MK2/F-Zellen infiziert werden, falls mit einem hohen m.o.i. (z.B. 1 oder 3) infiziert, und zwar zu Zellen infiziert, die vom Anfang fast 100% konfluent sind, kann das Experiment, welches ähnliche Ergebnisse gibt, unter Verwendung von F-nicht-exprimierenden Zellen durchgeführt werden.
  • Für die NGF-Protein-Quantifizierung wurden das ELISA-Kit NGF Emax Immuno Assay System (Promega) und das begleitende Protokoll verwendet. 32.4 μg/ml, 37.4 μg/ml und 10.5 μg/ml von NGF-Protein wurden im Kulturüberstand von jeweils NGF/SeV/ΔF, NGF/SeV/ΔF-GFP und NGF/SeV infizierten Zellen nachgewiesen. In dem Kulturüberstand von NGF/SeV/ΔF und NGF/SeV/ΔF-GFP infizierten Zellen ist eine hohe Konzentration von NGF-Protein vorhanden, ähnlich zu dem Kulturüberstand von NGF/SeV infizierten Zellen, was bestätigt, dass SeV vom F-defizienten Typ genug NGF exprimiert.
  • Die Messung der in vitro-Aktivität des NGF-Proteins wurde durch Verwendung einer dissoziierten Züchtung des primären Hühner-Spinatganglions (DRG; eine Sinnesnervenzelle des Huhns), welches eine Sinnesnervenzelle eines Huhns ist, unter Verwendung der Überlebensaktivität als Index (Nerve Growth Factors (Wiley, New York), S. 94-109 (1989)) bewerkstelligt. Das Spinalganglion wurde am Tag 10 aus einem Hühnerembryo entfernt und nach Behandlung mit 0.25%igem Trypsin (GIBCO) bei 37°C 20 min dispergiert. Unter Verwendung eines Hoch-Glucose-D-MEM-Medium, welches 100 Einheiten/ml Penicillin (GIBCO), 100 Einheiten/ml Streptomycin (GIBCO), 250 ng/ml Amphotericin B (GIBCO) 20 μM 2-Desoxyuridin (Nakarai), 20 μM 5-Fluorodesoxyuridin (Nakarai), 2 mM L-Glutamin (Sigma) und 5% Serum enthielt, wurden die Zellen auf eine 96-Well-Platte bei etwa 5000 Zellen/Well gesät. Die mit Polylysin vorbeschichteten 96-Well-Platten (Iwaki) wurden zusätzlich mit Laminin (Sigma) vor Verwendung beschichtet. Nach dem Startpunkt wurde das Kontroll-NGF-Protein oder der vorher präparierte Kulturüberstand nach der SeV-Infektion zugegeben. Nach 3 Tagen wurden die Zellen unter einem Mikroskop sowie unter Durchführung der Quantifizierung von überlebenden Zellen durch Zugabe von Alamer-Blau (CosmoBio) und unter Verwendung der Reduktionsaktivität durch Mitochondrien als Index (Messung der 590 nm-Fluoreszenz mit einer 530 nm-Anregung) beobachtet. Equivalente Fluoreszenzsignale wurden in der Kontrolle (ohne NGF-Zugabe) beobachtet und bei der Zugabe von 1/1000 verdünntem Kulturüberstand von Zellen, die mit SeV/zusätzlichem Typ GFP (GFP/SeV) infiziert wurden, zugegeben wurde, während die Zugabe von 1/1000 verdünntem Kulturüberstand von Zellen, welche mit NGF/SeV/ΔF, NGF/SeV/ΔF-GFP und NGF/SeV infiziert wurden, eine bemerkenswerte Zunahme in der Fluoreszenzintensität verursachte, was als Einschließen einer hohen Anzahl von überlebenden Zellen und Überlebensaktivität bewertet wurde (56). Der Wert des Effekts war vergleichbar mit der Zugabe der Menge von NGF-Protein, welche aus ELISA berechnet wurde. Die Beobachtung unter einem Mikroskop belegte einen ähnlichen Effekt. Und zwar wurde durch Zugabe des Kulturüberstands der Zellen, welche mit NGF/SeV/ΔF, NGF/SeV/ΔF-GFP und NGF/SeV infiziert waren, eine Zunahme an überlebenden Zellen und eine bemerkenswerte Neuritverlängerung beobachtet (57). So wurde bestätigt, dass NGF, welches nach Infektion von NGF umfassenden SeV vom F-defizienten Typ exprimiert wurde, eine aktive Form ist.
  • [Beispiel 24] Die ausführliche Analyse von F-exprimierenden Zellen
  • 1. moi und Induktionszeitverlauf von Adeno-Cre
  • Unter Verwendung unterschiedlicher moi von Adeno-Cre wurden LLC-MK2-Zellen infiziert und nach Induktion des F-Proteins wurden die Menge der Proteinexpression und die Änderung der Zellform analysiert.
  • Das Expressionsniveau war leicht höher in moi = 10, verglichen mit moi = 1 ( 58). Wenn die Expressionsmengen an den Zeitpunkten 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach Induktion analysiert wurden, wurde ein hohes Expressionsniveau des F-Proteins bei 48 h nach Induktion in allen Fällen nachgewiesen.
  • Zusätzlich wurden die Änderungen in der Zellform bei einem Zeitverlauf überwacht, als Zellen mit moi = 1, 3, 10, 30 und 100 infiziert wurden. Obwohl ein bemerkenswerter Unterschied bis zu moi = 10 gefunden wurde, wurde die Zytotoxizität für moi = 30 oder darüber beobachtet (59).
  • 2. Die Passage-Nummer
  • Nach der Induktion des F-Proteins zu LLC-MK2/F-Zellen unter Verwendung von Adeno-Cre wurden die Zellen 7-mal passagiert und das Expressionsniveau des F-Proteins und die Morphologie der Zellen wurden unter Verwendung mikroskopischer Beobachtung analysiert. Andererseits wurde die Lasermikroskopie für die Analyse der intrazellulären Lokalisierung des F-Proteins nach der Induktion des F-Proteins in den Zellen, welche bis zur 20. Generation passagiert wurden, verwendet.
  • Für die lasermikroskopische Beobachtung wurden LLC-MK2/F-Zellen, welche mit F-Protein-Expression induziert wurden, in eine Glaskammer gebracht und nach einer Züchtung über Nacht wurden die Medien entfernt und einmal mit PBS gewaschen, dann mit 3.7%igem Formalin-PBS 5 min fixiert. Nach einmal Waschen der Zellen mit PBS wurden die Zellen dann mit 0.1%igem Triton X100-PBS 5 min behandelt und mit monoclonalem anti-F-Protein-Antikörper (γ-236) (1/100-Verdünnung) und mit FITC markiertem anti-Kaninchen-IgG-Antikörper der Ziege (1/200-Verdünnung) in diesem Ablauf behandelt, und schließlich mit PBS gewaschen und unter einem Lasermikroskop beobachtet.
  • Als Ergebnis wurde kein Unterschied in den F-Protein-Expressionsniveaus in den Zellen, welche bis zu 7-mal passagiert wurden, gefunden (60). Kein bemerkenswerter Unterschied wurde bei morphologischer Änderung, Infektiosität von SeV und Produktivität beobachtet. Andererseits wurde kein großer Unterschied bis zu 15 Passagen gefunden, wenn die Zellen, welche bis zu 20-mal passagiert wurden, für die intrazelluläre Lokalisierung des F-Proteins unter Verwendung des Immunantikörper-Verfahrens analysiert wurden, aber eine Lokalisierungstendenz des F-Proteins wurde in Zellen beobachtet, welche mehr als 15 Male passagiert wurden (61).
  • Zusammengefasst werden Zellen vor 15 Passagen wünschenswert für die Herstellung des F-defizienten SeV gehalten.
  • [Beispiel 25] Die Korrelation zwischen GFP-CIU und anti-SeV-CIU
  • Die Korrelation der Ergebnisse der Messung der „zeltinfizierenden" Einheit (CIU) durch zwei Verfahren wurde analysiert. LLC-MK2-Zellen wurden auf eine 12-Well-Platte bei 2 × 105 Zellen/Schale gesät, und nach einer Züchtung von 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit MEM-Medium ohne Serum gewaschen und mit 100 μl/Well SeV/ΔF-GFP infiziert. Nach 15 min wurde 1 ml/Well serumfreies MEM-Medium zugegeben und zusätzlich 24 Stunden kultiviert. Nach der Züchtung wurden die Zellen dreimal mit PBS(-) gewaschen und trocken gelegt (bei Raumtemperatur ungefähr 10 bis 15 min stehen gelassen), und 1 ml/Well Aceton wurde zugegeben, um die Zellen zu fixieren, und wurde sofort entfernt. Die Zellen wurden wieder trocken gelegt (bei Raumtemperatur ungefähr 10 bis 15 min stehen gelassen). Dann wurden 300 μl/Well polyclonaler anti-SeV-Antikörper (DN-1), präpariert aus Kaninchen und 1/100 mit PBS(-) verdünnt, zu Zellen gegeben und bei 37°C 45 min inkubiert und dreimal mit PBS(-) gewaschen. Dann wurden zu den Zellen 300 μl/Well des Fluoreszenz markiertem zweiten Antikörpers anti-Kaninchen-IgG(H + D) (AlexTM 568, Molecular Probes), 1/200 mit PBS(-) verdünnt, zugegeben und bei 37°C 45 min inkubiert und dreimal mit PBS(-) gewaschen. Dann wurden die Zellen mit Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskopie (Emission: 560 nm, Absorption: 645 nm, Filter: Leica) beobachtet.
  • Als Kontrolle wurden die Zellen mit 100 μl/Well SeV/ΔF-GFP infiziert und nach 15 min wurde 1 ml/Well MEM ohne Serum zugegeben. Nach einer zusätzlichen Züchtung von 24 Stunden, wurden GFP exprimierende Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop (Emission: 360 nm, Absorption: 470 nm, Filter: Leica) ohne zusätzliche Manipulationen beobachtet.
  • Eine gute Korrelation wurde durch Auswertung der Fluoreszenzintensität durch Quantifizierung erhalten (62).
  • [Beispiel 26] Die Konstruktion der Multicloning-Stelle
  • Eine Multicloning-Stelle wurde zu dem SeV-Vektor hinzugefügt. Die zwei verwendeten Verfahren werden unten gelistet.
    • 1. Mehrere Restriktionsstellen in genomischer cDNA des Sendai-Virus (SeV) von ganzer Länge und in genomischer cDNA des pSeV18+ wurden gespalten, und eine andere Restriktionsstelle, welche die gespaltene Restriktionsstelle umfasste, wurde zwischen dem Startsignal und dem ATG-Translationsinitiationssignal von jedem Gen eingeführt.
    • 2. In eine bereits konstruierte SeV-Vektor-cDNA wurden die Sequenz der Multicloning-Stelle und das Transkriptionsstartsignal – Intron – Terminationssignal hinzugefügt und in die NotI-Stelle eingebaut.
  • In dem Fall von Verfahren 1 wurden als ein einführendes Verfahren das EagI-verdaute Fragment (2644 bp), das Clal-verdaute Fragment (3246 bp), das ClaI/EcoRI-verdaute Fragment (5146 bp) und das EcoRI-verdaute Fragment (5010 bp) von pSeV18+ durch Agarose-Elektrophorese getrennt und die entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten, dann wurde es gewonnen und durch das QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN) gereinigt. Das EagI-verdaute Fragment wurde ligiert und in LITMUS38 (NEW ENGLAND BIOLABS) subcloniert, und das ClaI-verdaute Fragment, das ClaI/EcoRI-verdaute Fragment und das EcoRI-verdaute Fragment wurden ligiert und in pBluescriptII KS+ (STRATAGENE) subcloniert. Der Quickchange Site-Directed Mutagenesis-Kit (STRATAGENE) wurde für das schrittweise Spalten und die Einführung der Restriktionsstellen verwendet.
  • Für das Spalten der Restriktionsstellen wurden SalI: (Sense-Strang) 5'-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3' (SEQ ID NO: 35), (Antisense-Strang) 5'-ctgatcgattatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3' (SEQ ID NO: 36), NheI: (Sense-Strang) 5'-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3' (SEQ ID ND: 37), (Antisense-Strang) 5'-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3' (SEQ ID NO: 38), XhoI: (Sense-Strang) 5'-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3' (SEQ ID NO: 39), (Antisense-Strang) 5'-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3' (SEQ ID NO: 40) und für das Einführen der Restriktionsstellen, NP-P: (Sense-Strang) 5'-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3' (SEQ ID NO: 41), (Antisense-Strang) 5'-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3' (SEQ ID NO: 42), P-M: (Sense-Strang) 5'-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3' (SEQ ID NO: 43), (Antisense-Strang) 5'-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3' (SEQ ID NO: 44), M-F: (Sense-Strang) 5'-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3' (SEQ ID NO: 45), (Antisense-Strang) 5'-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3' (SEQ ID NO: 46), F-HN: (Sense-Strang) 5'-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3' (SEQ ID NO: 47), (Antisense-Strang) 5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3' (SEQ ID NO: 48), HN-L: (Sense-Strang) 5'-cccagggtgaatgggaaggccggccaggtcatggatgggCaggagtcc-3' (SEQ ID NO: 49), (Antisense-Strang) 5'-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3' (SEQ ID NO: 50) synthetisiert und für die Reaktion verwendet. Nach Einführung wurde jedes Fragment gleichermaßen gewonnen und gereinigt, wie oben beschrieben, und die cDNA wurde zusammengefügt.
  • In dem Fall von Verfahren 2 wurden (Sense-Strang) 5'-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3' (SEQ ID NO: 51), (Antisense-Strang) 5'-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3' (SEQ ID NO: 52) synthetisiert und nach Phosphorylierung bei 85°C 2 min, 65°C 15 min, 37°C 15 min und Raumtemperatur 15 min annealt, um in die SeV-cDNA einzubauen. Alternativ werden die Multicloning-Stellen von pUC18 oder pBluescriptII oder dergleichen durch PCR unter Verwendung von Primer, welche das Terminationssignal – Intron – Startsignal umfassen, subcloniert, und dann das Resultierende in die SeV-cDNA eingebaut. Die VirusRekonstitution durch die resultierende cDNA kann, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung stellt Hüllproteingen-defiziente virale Vektoren von Paramyxoviridae bereit. Die vorliegende Erfindung etabliert zum ersten Mal ein praktisches, neues, Hüllproteingen-defizientes Vektorsystem auf der Grundlage eines Negativstrang-RNA-Virus. Das Ergebnis infektiöse defiziente Viruspartikeln aus der F-Gen-defizienten, FHN-Gen-defizienten genomischen cDNA unter Verwendung von Helferzellen zu erhalten, ebnete den Weg für die Forschung und Entwicklung von neuen Vektoren für die Gentherapie, welche die ausgezeichneten Merkmale des Sendai-Virus ausnutzen. Der Sendai-Virusvektor des defizienten Typs in der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, ein Gen in verschiedene Zelltypen mit einer extrem hohen Effizienz einzuführen, und das exogene Gen bei einem außerordentlich hohen Niveau zu exprimieren. Darüber hinaus wird der Vektor in infizierten Zellen persistent exprimiert und ist ein hoch sicherer Vektor, dem vollständig die Fähigkeit fehlt, Virusverbreitung zu verursachen, da er keine sekundären infektiösen Viruspartikel freisetzt. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (26)

  1. Virusvektor der Paramyxoviridae, umfassend einen Komplex, welcher (a) eine aus Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass zumindest das F-Protein oder das HN-Protein von Viren, welche zu den Paramyxoviridae gehören, nicht exprimiert werden, und (b) NP-Protein, P-Protein und L-Protein, wobei der Virusvektor nach der Einführung in eine Zelle nicht in der Lage ist, infektiöse virale Partikel freizusetzen und sich in benachbarten Zellen zu verbreiten.
  2. Vektor nach Anspruch 1, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA NP-Protein, P-Protein und L-Protein exprimiert und so modifiziert ist, dass F-Protein oder HN-Protein nicht exprimiert wird.
  3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, umfassend zumindest eines der Proteine, dessen Expression in der modifizierten Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt ist.
  4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, umfassend VSV-G-Protein.
  5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA aus Sendai-Virus stammt.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA zusätzlich ein exogenes Gen codiert.
  7. DNA, welche eine Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die in einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthalten ist oder der komplementäre Strang davon.
  8. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die folgenden Schritte: (a) Expression einer Vektor-DNA, welche (i) eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die so modifiziert ist, dass sie zumindest F-Protein oder HN-Protein von Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert oder (ii) den komplementären Strang der RNA, durch Einführung in Zellen, welche ein Hüllprotein exprimieren; (b) Kultivierung der Zellen; und (c) Erhalt von Viruspartikeln aus Kulturüberständen.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte (a) Einführung eines Komplexes, welcher eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass sie zumindest F-Protein oder HN-Protein von Paramyxoviridae-Viren nicht exprimiert, und NP-Protein, P-Protein und L-Protein, in Zellen welche ein Hüllprotein exprimieren; (b) Kultivierung der Zellen; und (c) Erhalt von Viruspartikeln aus Kulturüberständen.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zellkultur in (b) eine Co-Kultur mit Zellen ist, welche das Hüllprotein exprimieren.
  11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zellen in Zellkultur in (b) mit Zellen überschichtet sind, welche das Hüllprotein exprimieren.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei zumindest ein Hüllprotein, welches von den Zellen exprimiert wird, mit wenigstens einem Hüllprotein identisch ist, dessen Expression in der oben beschriebenen Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei mindestens ein Hüllprotein, welches von den Zellen exprimiert wird, VSV-G-Protein ist.
  14. Impfstoff, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  15. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Gentherapie.
  16. Ribonucleoproteinkomplex, welcher (a) eine von Paramyxovirus abgeleitete, Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, die so modifiziert ist, dass zumindest F-Protein oder HN-Protein von Viren, welche zu den Paramyxoviridae gehören, nicht exprimiert werden, und (b) NP-Protein, P-Protein und L-Protein, wobei der Komplex nach der Einführung in eine Zelle nicht in der Lage ist, infektiöse virale Partikel freizusetzen und sich in benachbarten Zellen zu verbreiten.
  17. Ribonucleoproteinkomplex nach Anspruch 16, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA NP-Protein, P-Protein und L-Protein exprimiert und so modifiziert ist, dass sie F-Protein oder HN-Protein nicht exprimiert.
  18. Ribonucleoproteinkomplex nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA von Sendai-Virus stammt.
  19. Ribonucleoproteinkomplex nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA zusätzlich ein exogenes Gen codiert.
  20. Verwendung (i) einer DNA, welche eine Negativstrang-Einzelstrang-RNA codiert, die so modifiziert ist, dass zumindest F-Protein oder HN-Protein von Viren, welche zu den Paramyxoviridae gehören, nicht exprimiert werden oder (b) den komplementären Strang der RNA, oder (ii) eines Ribonucleoproteinkomplexes, welcher (α) eine von Paramyxovirus abgeleitete Negativstrang-Einzelstrang-RNA umfasst, welche so modifiziert ist, dass zumindest F-Protein oder HN-Protein von Viren, welche zu den Paramyxoviridae gehören, nicht exprimiert werden und (β) NP-Protein, P-Protein und L-Protein, zur Herstellung eines Virusvektors, welcher nach der Einführung in eine Zelle nicht in der Lage ist, infektiöse virale Partikel freizusetzen und sich in benachbarten Zellen zu verbreiten.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA NP-Protein, P-Protein und L-Protein exprimiert und so modifziert ist, dass F-Protein oder HN-Protein nicht exprimiert werden.
  22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei der Virusvektor zumindest eines der Proteine umfasst, dessen Expression in der modifizierten Negativstrang-Einzelstrang-RNA unterdrückt war.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 21, wobei der Virusvektor VSV-G-Protein umfasst.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA von Sendai-Virus stammt.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Negativstrang-Einzelstrang-RNA zusätzlich ein exogenes Gen codiert.
  26. Zelle, in welche der Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder der Komplex nach einem der Ansprüche 16 bis 19 eingeführt wurde, wobei der Vektor oder der Komplex in der Zelle nicht in der Lage ist, infektiöse virale Partikel freizusetzen und sich in benachbarten Zellen zu verbreiten.
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