DE60033043T2

DE60033043T2 - Modifizierte pflanzenviren und deren verwendungsmethoden

Info

Publication number: DE60033043T2
Application number: DE60033043T
Authority: DE
Inventors: Frank Reading BRENNAN
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: EP1223977B1; MXPA02003788A; US20080124358A1; US7666624B2; AU8022100A; AR026059A1; DE60033043D1; WO2001026682A3; WO2001026682A2; CA2387629A1; AU784425B2; IL149078A0; CZ20021304A3; GB9924351D0; HRP20000701A2; ZA200202816B; EP1223977A2; JP2003514775A; US7267963B1; CO5270015A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Modulieren der Art und/oder des Ausmaßes einer Immunantwort auf ein Molekül. Insbesondere betrifft die Erfindung das Bewirken einer Erhöhung der TH1-Immunantwort auf Moleküle wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Antigene oder Immunogene. Die Erfindung betrifft ferner die Verringerung einer TH2-Immunantwort auf Moleküle. Insbesondere betrifft die Erfindung die Veränderung der Mengen an TH1- und TH2-assoziierten Immunglobulinen, des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-assoziierten Cytokinen, sowie des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aktivierung der TH1-Subpopulation von CD4+ T-Zellen ist, eher als jene der TH2-Subpopulation von CD4+ T-Zellen, im Rahmen der Konzipierung von Vakzinen von primärer Bedeutung. Dies liegt darin begründet, dass TH1-Zellen IL-2-, IFN-γ- und TNF-β-Cytokine produzieren, welche die Aktivierung von Makrophagen und cytotoxischen T-Zellen (CTL) vermitteln und die eigentlichen Effektoren einer zellvermittelten Immunität gegen intrazelluläre Mikroben und Spättyp-Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH-Reaktionen) darstellen. IFN-γ induziert ferner, einen Klassenwechsel (Class-switching) vom B-Zellen-Isotyp zum eigentlichen Effektorisotyp von Maus-IgG. IgG_2a, und in geringerem Ausmaß IgG_2b, steigert die Antikörper-abhängige zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC) und bindet fest an C1q des klassischen Komplementweges, welcher Zellen oder Antikörpercluster der Phagozytose zuführt. Als Ergebnis dieser Effektorfunktionen in Mäusen wurde beispielsweise festgestellt, dass IgG_2a Mäusen einen besseren Schutz gegenüber Virusinfektionen [Ishizaka et al. (1995) J. Infect. Dis. 172: 1108], murinen Tumoren [Kaminski et al. (1986) J. Immunol. 136: 1123] sowie Parasiten [Wechsler et al. (1986) J. Immunol. 137: 2968] bietet, und eine Erhöhung der bakteriellen Clearance bewirkt [Zigterman et al. (1989) Infect. Immun. 57: 2712].
Im Gegensatz hierzu produzieren TH2-Zellen IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13, welche den unerwünschten Effekt einer Unterdrückung der zellvermittelten Immunität besitzen [Mossman et al. (1986) J. Immunol. 136: 2248]. Darüber hinaus induziert IL-4 in B-Zellen die Produktion sowohl einer IgG-Subklasse, welche eine schwache Komplementfixierung und keine Vermittlung von ADCC bewirkt, als auch von IgE, welches an Mastzellen und Basophile bindet.
Im Stand der Technik wurde aufgrund der Feststellung, dass die Aktivierung von TH-Zell-Subpopulationen durch den Stamm des verwendeten Tieres [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 2439], die Identität des Antigens, die Applikationsart des Antigens [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 809] sowie das Immunisierungsschema [Brett et al. (1993) Immunology 80: 306] beeinflusst wird, der Versuch unternommen, die Konzipierung von Vakzinen durch Steuern der Entwicklung von TH1-Zellen zu verbessern.
Ein im Stand der Technik verfolgter Ansatz zur Erzeugung Antigen-spezifischer TH1-Antworten war die Verwendung der oxidativen/reduktiven Konjugation von Mannan an Antigen [Apostopoulos et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10128–10132] oder die Konjugation von Proteinen an bakterielle Proteine [Jahn-Schmid et al. (1997) Intl. Immunol. 9: 1867]. Das Koppeln an herkömmlich verwendete Träger wie beispielsweise KLH und Tetanustoxoid ist im Rahmen der Erhöhung des IgG_2a:IgG₁-Verhältnisses jedoch häufig nicht erfolgreich.
Andere Verfahren zur Induzierung von TH1-Antworten umfassen die Verwendung immunmodulatorischer Mittel, wie beispielsweise fremder Hilfsmittel (zum Beispiel: ISCOMS, QS21, Quil A, etc.). Alaun stellt jedoch das einzige Hilfsmittel dar, welches derzeit für eine Anwendung beim Menschen zugelassen ist, und von welchem bekannt ist, dass es eher unerwünschte TH2-artige Antworten begünstig als die in stärkerem Maße wünschenswerten TH1-artigen Antworten.
Andere immunmodulatorische Mittel, welche im Stand der Technik verwendet wurden, umfassen CpG-Oligodesoxyribonukleotide [Chu et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1623] oder Cytokine wie beispielsweise Interleukin-12 [IL-12, Scott et al. (1997) Seminl. Immunol. 9: 285], welche immunogenen Zusammensetzungen hinzugefügt werden können und zur Produktion hoher Mengen an IgG_2a führen, das gegen lösliche Proteinantigene gerichtet ist. Die kurze Halbwertszeit sowie die beträchtlichen Kosten von Cytokinen machen deren Verwendung im Rahmen einer in großem Maßstab angelegten Vakzination allerdings sowohl technisch als auch kommerziell unattraktiv.
Noch einen weiteren Ansatz stellte die Verwendung von Vakzinen auf Basis lebender Tierviren dar, um in Mäusen überwiegend virusspezifisches IgG_2a zu erzeugen [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 809; Coutelier et al. (1987) J. Exp. Med. 165: 64; Nguyen et al. (1994) J. Immunol. 152: 478; Brubaker et al. (1996) J. Immunol. 157: 1598]. Dieser Ansatz weist mehrere Nachteile auf. Erstens führen Vakzine auf Basis lebender Viren nicht einheitlich zu einer TH1-artigen Immunantwort, da einige lebende Viren die Produktion anderer Immunglobulin-Isotypen begünstigen, welche für alternierende T-Helferzell-Signalwege charakteristisch sind [Coutelier et al. (1987) J. Exp. Med. 165: 64, Perez-Filgueira et al. (1995) Vaccine 13: 953]. Zusätzlich werden derartige Vakzine auf Basis von Tierviren aus Viren hergestellt, welche in Zellkultursystemen gezüchtet werden, deren Konzipierung und Betrieb kostspielig ist. Darüber hinaus stellt der als Vektor verwendete Tiervirus häufig ein Virus dar, welchem das Tier möglicherweise bereits ausgesetzt war und möglicherweise bereits Antikörper gegen den Vektor produziert. Der Vektor kann aus diesem Grund durch das Immunsystem zerstört werden, bevor die eingebaute antigene Stelle des zweiten Virus eine Immunantwort induziert. Zusätzlich umfasst der Ansatz unter Verwendung eines zusammengesetzten Tiervirus die genetische Veränderung lebender, das Tier infizierender Viren, wobei das Risiko besteht, dass Mutationen zu neuen Formen des Virus mit veränderter Infektiosität, Antigenität und/oder Pathogenität führen. Tatsächlich bestehen Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Verwendung von Vakzinen auf Basis lebender Tierviren [Weltgesundheitsorganisation, 1989]. Darüber hinaus werden die Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Verwendung von Vakzinen auf Basis lebender Tierviren auch nicht durch die Verwendung inaktiver Tierviren überwunden, da inaktive Tierviren im Allgemeinen die Produktion von IgG_2a nicht begünstigen. Tatsächlich wird angenommen, dass der von lebenden Viren repräsentierte Infektionsprozess per se IFN-γ erzeugt, was zu einer Dominanz von Immunglobulinen führt, welche eine TH1-Antwort erzeugen [Nguyen et al. (1994) J. Immunol. 152: 478].
Obwohl ein anderer Ansatz die Verwendung lebender bakterieller Vektoren und DNA-Immunisierung, welche die Erzeugung von TH-Antworten auf exprimierte Peptide begünstigen, umfasste, weist dieser Ansatz jedoch häufig eine Abhängigkeit von und eine Empfindlichkeit gegenüber entweder der Applikationsart oder aber dem verwendeten Hilfsmittel auf. Darüber hinaus schränken Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Verwendung lebender bakterieller Vakzine und von DNA-Vakzinen deren klinische Anwendung weiter ein [Weltgesundheitsorganisation, 1989].
Somit besteht ein Bedarf in Bezug auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Erzeugung TH1-artiger Antworten. Bevorzugt wird die Erzeugung TH1-artiger Antworten durch diese Zusammensetzungen und Verfahren durch den genetischen Hintergrund des Wirtstieres, die Identität des Antigens, die Applikationsart des Antigens, sowie das Immunisierungsschema nicht beeinflusst.
Etliche Peptide sind immunogen, wenn sie auf CPMV exprimiert werden [McLain et al. (1995) AIDS Res. Hum. Retro. 11: 327; Dalsgaard et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 248; Brennan et al. (1999) Microbiol. 145: 211; Brennan et al. (1999) J. Virol. 73: 930]. Es wurde gezeigt, dass Peptide, welche aus dem Fibronektin-bindenden Protein (FnBP) von Staphylococcus aureus stammen und auf der Oberfläche von Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) oder stäbchenförmigem Kartoffelvirus X (PVX) exprimiert werden, in Mäusen überwiegend FnBP-spezifische Antikörper des IgG_2a- und/oder IgG_2b-Isotyps hervorrufen [Brennan et al. (1999) Microbiol. 145: 211; Brennan et al. (1999) Vaccine 17 (15–16): 1846], was auf eine TH1-Dominanz der Antworten auf die untersuchten, in einem chimären Viruspartikel (CVP) exprimierten Peptide schließen lässt. Gleichermaßen wurde festgestellt, dass mit einem chimären CPMV, welcher ein aus dem gp41-Transmembranprotein von HIV1 IIIB stammendes Peptid exprimierte, immunisierte Mäuse HIV1-spezifische Serumantikörper, und überwiegend IgG_2a-Serumantikörper, produzierten [Durrani et al. (1998) J. Immunol.
Methods 220 (1–2): 93], was wiederum auf eine TH1-dominierte Antwort schließen lässt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, welche eine Wirksamkeit in Bezug auf die Modulierung der Art und/oder des Ausmaßes einer Immunantwort auf ein Molekül besitzen. Insbesondere stellt die Erfindung Mittel bereit, welche eine TH1-Dominanz der Immunantwort auf Moleküle wie beispielsweise Antigene oder Immunogene bewirken und/oder eine TH2-Dominanz der Immunantwort auf derartige Moleküle verringern. In noch stärkerem Maße stellt die Erfindung Mittel zur Erhöhung einer TH1-Immunantwort bereit, welche gegen Moleküle gerichtet ist, die ansonsten allgemein eine TH2-artige Antwort stimulieren. Die Erfindung stellt ferner Zusammensetzungen zur Verringerung einer TH2-Immunantwort auf Moleküle bereit. Zusätzlich werden hierin Zusammensetzungen zur Veränderung (das heißt Erhöhung oder Erniedrigung) der Menge an TH1- und TH2-assoziierten Immunglobulinen, des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-assoziierten Cytokinen, sowie des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-Zellen bereitgestellt.
Insbesondere stellt die Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein Konjugat aus einem immunogenen Molekül von Interesse und einem chimären Pflanzenvirus bereit, welcher ein heterologes Peptid exprimiert, das mit dem Molekül von Interesse in Konjugation treten kann, wobei das heterologe Peptid innerhalb eines Strukturgens des Virus kodiert ist und das Molekül von Interesse mit dem Virus über das heterologe Peptid in Konjugation tritt.
Das Molekül von Interesse kann ein Peptid, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure oder ein Lipid umfassen.
Das Molekül kann aus einer Quelle stammen, welche aus einem Tierpathogen, einem Allergen und einer Krebszelle ausgewählt ist.
Der Pflanzenvirus kann ein ikosaedrischer Pflanzenvirus sein, welcher aus Comoviren, Tombusviren, Sobemoviren und Nepoviren ausgewählt ist. Der Pflanzenvirus ist bevorzugt ein Comovirus, und stärker bevorzugt ein Kuherbsen-Mosaikvirus.
Das heterologe Peptid wird bevorzugt in einem exponierten Teil des Hüllproteins des Pflanzenvirus exprimiert.
Das heterologe Peptid kann eine oder mehrere geladene Aminosäuren umfassen, welche aus negativ geladenen Aminosäuren und positiv geladenen Aminosäuren ausgewählt werden, wobei die negative Ladung der negativ geladenen Aminosäuren durch die positive Ladung der positiv geladenen Aminosäuren ausgeglichen wird. Bevorzugt werden die negativ geladenen Aminosäuren aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und Cystein ausgewählt, und werden die positiv geladenen Aminosäuren aus Lysin, Arginin und Histidin ausgewählt.
Das heterologe Peptid kann eine Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren umfassen, welche aus einer ersten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, und einer zweiten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren, ausgewählt wird. Bevorzugt tritt die Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren in dem heterologen Peptid als eine sich wiederholende Sequenz auf. Bevorzugt umfasst die heterologe Sequenz die erste und zweite Sequenz, wobei die erste Sequenz und die zweite Sequenz aufeinanderfolgen. Bevorzugt treten die aufeinanderfolgenden ersten und zweiten Sequenzen in dem heterologen Peptid als eine sich wiederholende Sequenz auf.
Das heterologe Peptid kann nicht-aufeinanderfolgende negativ geladene Aminosäuren und nicht-aufeinanderfolgende positiv geladene Aminosäuren umfassen, wobei das heterologe Peptid ferner eine Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren umfasst, welche aus einer ersten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, und einer zweiten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren, ausgewählt wird. Bevorzugt umfasst das heterologe Peptid eine als SEQ ID Nr. 16 aufgelistete Sequenz der allgemeinen Formel Asp-Glu_n-Gly-Lys_2n-Asp-Glu_n, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist.
Das Konjugat kann in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden. Bevorzugt ist das Konjugat für eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse vorgesehen. Das erhöhte Ausmaß an TH1-artiger Immunantwort kann aus (a) einer erhöhten Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin in dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf die Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin in einem Kontrolltier, (b) einem erhöhten Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen aus dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf das Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen aus einem Kontrolltier, und (c) einer erhöhten Menge an TH1-assoziiertem Cytokin in dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf die Menge an TH1-assoziiertem Cytokin in einem Kontrolltier ausgewählt werden. Das TH1-assoziierte Cytokin kann aus IL-2, TNF-β und IFN-γ ausgewählt werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Konjugat des ersten Aspekts, bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung für eine Verabreichung mittels mindestens einer von intranasaler, oraler, parenteraler, subkutaner, intrathekaler, intravenöser, intraperitonealer und intramuskulärer Verabreichung geeignet ist. Die Zusammensetzung kann zusätzlich mindestens eines von einem Immunhilfsmittel, einem Cytokin und einem pharmazeutischen Arzneimittelträger umfassen.
Gemäß einem dritten Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung eines Konjugats gemäß dem ersten Aspekt zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse in einem menschlichen oder tierischen Körper vor. Das Medikament kann zur Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse in einem Säuger, insbesondere in einer Maus oder in einem Menschen, vorgesehen sein. Das Medikament kann zur Verringerung der Symptome, welche mit einer Exposition des menschlichen oder tierischen Körpers gegenüber dem Molekül von Interesse verbunden sind, vorgesehen sein.
DEFINITIONEN
Um die Erfindung leichter zu verstehen, werden eine Reihe von Begriffen nachstehend definiert.
Die Begriffe „Antigen" und „antigen" bezeichnen eine beliebige Substanz, welche von einem Antikörper oder einem T-Zell-Rezeptor spezifisch erkannt wird. Antigene enthalten ein oder mehrere Epitope (auch als „antigene Determinanten" bezeichnet). Ein „Epitop" stellt eine Struktur auf einem Antigen dar, welche mit der Bindungsstelle eines Antikörpers oder eines T-Zell-Rezeptors infolge einer molekularen Komplementarität wechselwirkt. Ein Epitop kann mit dem intakten Antigen, aus welchem es stammt, hinsichtlich der Bindung an einen Antikörper konkurrieren. Im Allgemeinen sind sekretierte Antikörper und deren korrespondierende membrangebundene Formen in der Lage, eine breite Vielzahl von Substanzen wie beispielsweise Antigene zu erkennen, während T-Zell-Rezeptoren lediglich Fragmente von Proteinen, welche mit MHC-Molekülen auf Zelloberflächen komplexiert sind, erkennen können. Antigene, welche von Immunglobulin-Rezeptoren auf B-Zellen erkannt werden, werden in drei Kategorien unterteilt: T-Zell-abhängige Antigene, T-Zell-unabhängige Antigene vom Typ 1, und T-Zell-unabhängige Antigene vom Typ 2. Ein Antigen kann eines oder mehrere der nachfolgenden Moleküle enthalten: ein Peptid, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäuresequenz, und ein Lipid.
Die Begriffe „Immunogen", „immunogen" und „immunologisch aktiv" bezeichnen eine beliebige Substanz, welche in der Lage ist, eine spezifische humorale oder zellvermittelte Immunantwort zu induzieren. Definitionsgemäß muss ein Immunogen mindestens ein Epitop enthalten, und enthält im Allgemeinen mehrere Epitope. Beispiele für Immunogene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Moleküle, welche ein Peptid, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäuresequenz und/oder ein Lipid enthalten. Komplexe von Peptiden mit Lipiden, Polysacchariden oder mit Nukleinsäuresequenzen sind ebenfalls vorgesehen, umfassend (ohne Einschränkung) Glykopeptide, Lipopeptide, Glykolipide, etc. Diese Komplexe stellen besonders nützliche Immunogene dar, wenn kleinere Moleküle mit wenigen Epitopen nicht von sich aus eine zufrieden stellende Immunantwort stimulieren.
Der Begriff „Allergen" bezeichnet ein Antigen oder ein Immunogen, welches eine oder mehrere Überempfindlichkeitsreaktionen (allergische Reaktionen) induziert, welche beispielsweise die Produktion von IgE-Antikörpern umfassen, jedoch nicht hierauf beschränkt sind. Allergene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Pollen von Ambrosien, Gräsern oder Bäumen, oder jene von Pilzen, Tierschuppen, Hausstaub oder Lebensmitteln. Individuen, welche einem Allergen ausgesetzt sind, entwickeln im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, Nesselsucht oder Manifestationen von Heufieber oder Asthma.
Der Begriff „Hilfsmittel", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine beliebige Verbindung, welche, wenn sie zusammen mit einem Antigen injiziert wird, unspezifisch die Immunantwort auf jenes Antigen erhöht.
Der Begriff „Arzneimittelträger" bezeichnet hierin eine beliebige inerte Substanz (zum Beispiel Gummi arabicum, Sirup, Lanolin, Stärke, etc.), welche ein Vehikel für die Zuführung eines Antigens bildet. Der Begriff Arzneimittelträger umfasst Substanzen, welche einer Zusammensetzung in Gegenwart ausreichender Mengen an Flüssigkeit die Hafteigenschaften verleihen, die zur Herstellung von Pillen oder Tabletten benötigt werden.
Die Begriffe „Antikörper" und „Immunglobulin" werden synonym zur Bezeichnung eines Glykoproteins verwendet, welches in einem Tier von einem Immunogen hervorgerufen wird. Ein Antikörper zeigt Spezifität gegenüber dem Immunogen, oder insbesondere gegenüber einem oder mehreren in dem Immunogen enthaltenen Epitopen. Native Antikörper umfassen mindestens zwei leichte Polypeptidketten und mindestens zwei schwere Polypeptidketten. Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Der Begriff „polyklonaler Antikörper" bezeichnet ein Immunglobulin, welches aus mehr als einem einzigen Klon von Plasmazellen erzeugt wird; im Gegensatz hierzu bezeichnet „monoklonaler Antikörper" ein Immunglobulin, welches aus einem einzigen Klon von Plasmazellen erzeugt wird.
Der Begriff „Isotyp" oder „Klasse" bezeichnet, wenn er in Bezug auf einen Antikörper verwendet wird, eine Antikörperklasse, welche durch einen bestimmten Typ des für den konstanten Bereich der schweren Ketten stehenden Gens kodiert wird. Folglich unterscheiden sich unterschiedliche Antikörper-Isotypen in der Aminosäuresequenz der konstanten Region der schweren Ketten (C_H-Region). Es sind verschiedene Antikörper-Isotypen bekannt, umfassend IgA, IgD, IgG, IgE und IgM. Folglich weist IgG eine konstante Domäne mit schwerer γ-Kette auf (Cγ); weist IgM eine konstante Domäne mit schwerer μ-Kette auf (Cμ); weist IgA eine konstante Domäne mit schwerer α-Kette auf (Cα); weist IgD eine konstante Domäne mit schwerer δ-Kette auf (Cδ); und weist IgE eine konstante Domäne mit schwerer ε-Kette auf (Cε). Unterschiedliche Antikörperklassen besitzen unterschiedliche Effektorfunktionen und zeigen eine unterschiedliche Gewebelokalisierung. Jede Antikörperklasse kann als Membranform (m) oder als sekretierte Form (s) exprimiert werden, welche sich in der Sequenz am Carboxylende der schweren Kette unterscheiden. Die meisten Antigene rufen unverzüglich eine Expression von IgM im Serum hervor, welcher zu einem späteren Zeitpunkt eine sekundäre Antwort in Form eines Isotypenwechsels folgt, bei der Produkte stromabwärts liegender Gene der schweren Ketten, wie beispielsweise Cγ1 und Cγ2a, überwiegen. Der vorherrschende Antikörper-Isotyp ist im Allgemeinen von der Art des Antigens (zum Beispiel Polypeptid, Polysaccharid, etc.) abhängig, welches zum Hervorrufen der Produktion des Antikörpers verwendet wird.
Die Begriffe „Subtyp" und „Subklasse" bezeichnen, wenn sie in Bezug auf einen Antikörper-Isotyp verwendet werden, synonym Antikörper innerhalb eines Isotyps, welche eine Variation in der Struktur der schweren Ketten enthalten. Beispielsweise enthält der humane IgG-Isotyp die vier Subtypen IgG₁, IgG₂, IgG₃ und IgG₄, während der Maus-IgG-Isotyp die vier Subtypen IgG₁, IgG_2a, IgG_2b und IgG₃ enthält. Der humane IgA-Isotyp enthält IgA₁- und IgA₂-Subtypen. Die für die konstanten schweren Ketten kodierenden Gene der Maus wurden kartiert und sind auf Chromosom 12 in der Reihenfolge (vom 5'-Ende aus betrachtet) Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα, entsprechend den Isotypen IgM, IgD, IgG₃, IgG₁, IgG_2b, IgG_2a, IgE und IgA, lokalisiert.
Der Begriff „Isotypenwechsel" bezeichnet das Phänomen, mittels welchem sich ein Antikörper-Isotyp (zum Beispiel IgM) in einen anderen Antikörper-Isotyp (zum Beispiel IgG) umwandelt. Gleichermaßen bezeichnet der Begriff „Subtypenwechsel" das Phänomen, mittels welchem sich ein Antikörper-Subtyp (zum Beispiel IgG₁) in einen anderen Subtyp (zum Beispiel IgG_2a) des gleichen Antikörper-Isotyps umwandelt.
Der Begriff „Effektorfunktionen", wie er hierin in Bezug auf einen Antikörper verwendet wird, bezeichnet nicht-antigenbindende Aktivitäten, welche durch die Antikörpermoleküle vermittelt werden und durch den konstanten Bereich der schweren Ketten des Moleküls vollzogen werden. Beispiele für Effektorfunktionen sind eine Rezeptorbindung an Immunzellen, eine Komplementfixierung, etc. Effektorfunktionen erleichtern die Entfernung von Antigen aus dem Körper durch Komplement-vermittelte Lyse oder Phagozytose.
Die Begriffe „spezifische Bindung" oder „spezifisch bindend" bedeuten, wenn sie in Bezug auf die Wechselwirkung eines Antikörpers und eines Antigens verwendet werden, dass die Wechselwirkung bevorzugt eine Präferenz für die Gegenwart einer bestimmten Struktur, und stärker bevorzugt eine Abhängigkeit von der Gegenwart einer bestimmten Struktur (das heißt der antigenen Determinante oder des Epitops) auf dem Antigen zeigt; in anderen Worten erkennt und bindet der Antikörper eher an eine spezifische Antigenstruktur (umfassend hiermit in Beziehung stehende Strukturen) als an Antigene allgemein. Ist ein Antikörper beispielsweise für Epitop „A" spezifisch, so verringert die Gegenwart eines das Epitop A enthaltenden Antigens (oder freies, unmarkiertes A) in einer Reaktion, welche markiertes „A" und den Antikörper enthält, die Menge an markiertem A, das an den Antikörper gebunden ist.
Der Begriff „immunogen wirksame Menge", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jene Menge an Immunogen, welche erforderlich ist, um die Produktion von Antikörpern in einem Wirt im Rahmen einer Vakzination zu induzieren. Es ist bevorzugt, jedoch nicht erforderlich, dass die immunologisch wirksame Menge eine „protektive" Menge ist. Die Begriffe „protektive" und „therapeutische" Menge eines Immunogens bezeichnen jene Menge des Immunogens, welche ein oder mehrere unerwünschte Symptome, die mit einer Exposition des Wirtstieres gegenüber dem Immunogen assoziiert sind, abschwächt. Die Begriffe „Abschwächen" und „Verringern" von Symptomen, wie sie hierin in Bezug auf die Wirkung einer bestimmten Zusammensetzung oder eines bestimmten Verfahrens verwendet werden, bedeuten eine Verringerung, Verzögerung oder Beseitigung eines oder mehrerer Symptome verglichen mit den Symptomen, welche in Abwesenheit einer Behandlung mit der bestimmten Zusammensetzung oder dem bestimmten Verfahren beobachtet werden. Der Begriff „Verringerung" von Symptomen, wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Verringerung des Ausmaßes eines oder mehrerer Symptome. Der Begriff „Verzögerung" von Symptomen bezeichnet eine Erhöhung der Zeitspanne zwischen Exposition gegenüber dem Immunogen und dem Auftreten eines oder mehrerer Symptome. Der Begriff „Beseitigung" von Symptomen bezeichnet eine vollständige „Verringerung" und/oder vollständige „Verzögerung" eines oder mehrerer Symptome.
Der Begriff „Tier" bezeichnet ein beliebiges Tier, dessen Antikörper oder T-Zell-Rezeptoren in der Lage sind, ein Antigen spezifisch zu erkennen. Alternativ umfasst der Begriff „Tier" ein beliebiges Tier, welches in der Lage ist, eine spezifische humorale oder zellvermittelte Immunantwort auf ein Immunogen zu induzieren. Bevorzugte Tiere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Säuger wie beispielsweise Nager, Menschen, Primaten, Schafe, Rinder, Wiederkäuer, Hasenartige, Schweineartige, Ziegenartige, Pferdeartige, Hundeartige, Vögel, etc. Bevorzugte Tiere werden aus der „Ordnung Rodentia" ausgewählt, welche Nager, das heißt planzentale Säuger (Klasse Euthria), bezeichnet, die die Familie Muridae (zum Beispiel Ratten und Mäuse), am stärksten bevorzugt Mäuse, umfasst. Die Begriffe „Nukleinsäuresequenz" und „Nukleotidsequenz", wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen ein Oligonukleotid oder Polynukleotid und Fragmente oder Teile hiervon, sowie DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, welche einzel- oder doppelsträngig sein kann und den Sense- oder Antisense-Strang darstellt.
Die Begriffe „Aminosäuresequenz", „Peptid", „Peptidsequenz", „Polypeptid" und „Polypeptidsequenz" werden hierin synonym verwendet, und bezeichnen eine Sequenz von Aminosäuren.
Die Begriffe „Peptid von Interesse", „Nukleotidsequenz von Interesse" und „Molekül von Interesse" bezeichnen eine beliebige Peptidsequenz, eine beliebige Nukleotidsequenz bzw. ein beliebiges Molekül, deren/dessen Veränderung von einem Fachmann aus einem beliebigen Grund als erwünscht angesehen werden kann. Beispielhafte Moleküle von Interesse umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Peptid, ein Glykopeptid, ein Polysaccharid, ein Lipopeptid, ein Glykolipid, ein Lipid, ein Steroid, eine Nukleinsäure, etc.
Der Begriff „stammt" soll, wenn er in Bezug auf ein aus einer Krebszelle stammendes Peptid verwendet wird, ein Peptid bezeichnen, welches aus einer Krebszelle erhalten (zum Beispiel isoliert, gereinigt, etc.) wurde.
Der Begriff „biologisch aktiv" bezeichnet, wenn er auf ein beliebiges Molekül (zum Beispiel ein Polypeptid, eine Nukleotidsequenz, etc.) angewendet wird, ein Molekül mit strukturellen, regulatorischen und/oder biochemischen Funktionen des natürlich vorkommenden Moleküls.
Eine Peptidsequenz und Nukleotidsequenz kann „endogen" oder „heterolog" (das heißt „fremd") sein. Der Begriff „endogen" bezeichnet eine Sequenz, welche in der Zelle oder dem Virus, in welche(n) sie eingebracht wird, natürlicherweise vorkommt, solange sie keine Veränderungen in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz enthält. Der Begriff „heterolog" bezeichnet eine Sequenz, welche in Bezug auf die Zelle oder den Virus, in welche(n) sie eingebracht wird, nicht endogen ist. So umfasst beispielsweise heterologe DNA eine Nukleotidsequenz, welche an eine Nukleotidsequenz, an die sie natürlicherweise nicht ligiert ist oder an die sie natürlicherweise an einer anderen Stelle ligiert ist, ligiert ist oder zum Zwecke einer Ligation verändert ist. Heterologe DNA umfasst ferner eine Nukleotidsequenz, welche in der Zelle oder dem Virus, in welche(n) sie eingebracht wird, natürlicherweise vorkommt und einige Modifikationen in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz enthält. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, kodiert heterologe DNA für heterologe RNA und heterologe Proteine, welche von der Zelle oder dem Virus, in welche(n) sie eingebracht werden, normalerweise nicht produziert werden. Beispiele für heterologe DNA umfassen Reportergene, transkriptionelle und translationelle regulatorische Sequenzen, DNA-Sequenzen, welche für selektierbare Markerproteine (zum Beispiel Proteine, welche eine Arzneimittelresistenz verleihen) kodieren, etc.
Der Begriff „Wildtyp" bezeichnet, wenn er in Bezug auf eine Peptidsequenz und eine Nukleotidsequenz verwendet wird, eine Peptidsequenz bzw. eine Nukleotidsequenz, welche die Eigenschaften jener Peptidsequenz und Nukleotidsequenz besitzt, wenn diese aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert wird. Eine Wildtyp-Peptidsequenz und -Nukleotidsequenz ist jene Sequenz, welche in einer Population am häufigsten beobachtet und somit willkürlich als „normale" Form oder „Wildtyp"-Form der Peptidsequenz bzw. Nukleotidsequenz festgelegt wird. Im Gegensatz hierzu bezeichnet der Begriff „modifiziert" oder „mutiert" eine Peptidsequenz und Nukleotidsequenz, welche im Vergleich zur Wildtyp-Peptidsequenz bzw. -Nukleotidsequenz Modifikationen in Bezug auf die Sequenz und/oder funktionelle Eigenschaften (das heißt veränderte Eigenschaften) zeigt. Es wird angemerkt, dass natürlich vorkommende Mutanten isoliert werden können; diese werden dadurch identifiziert, dass sie im Vergleich zur Wildtyp-Peptidsequenz und -Nukleotidsequenz veränderte Eigenschaften aufweisen.
Der Begriff „isoliert" bezeichnet, wenn er in Bezug auf ein Molekül (zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz, Aminosäuresequenz, etc.) verwendet wird, ein Molekül, welches identifiziert und von mindestens einem verunreinigenden Molekül, mit dem es assoziiert ist, abgetrennt wird.
Der Begriff „gereinigt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Molekül (zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz, Aminosäuresequenzen, etc.), welches aus seiner natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder abgetrennt wird. Ein „isoliertes" Molekül stellt daher ein gereinigtes Molekül dar. „Im Wesentlichen gereinigte" Moleküle sind zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 75%, und stärker bevorzugt zu mindestens 90% frei von anderen Komponenten, mit welchen sie assoziiert sind.
Die Begriffe „Pathogen" und „Tierpathogen" bezeichnen einen beliebigen Organismus, welcher in einem Tier eine Erkrankung hervorruft. Pathogene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Viren, Bakterien, Protozoen, Nematoden, Pilze, etc.
Der Begriff „Krebszelle" bezeichnet eine Zelle, welche Frühstadien, Zwischenstadien oder fortgeschrittene Stadien einer über mehrere Schritte verlaufenden neoplastischen Progression durchläuft. Die Merkmale von Frühstadien, Zwischenstadien und fortgeschrittenen Stadien einer neoplastischen Progression wurden unter Verwendung der Mikroskopie beschrieben. Krebszellen weisen in jeder der drei Stadien einer neoplastischen Progression im Allgemeinen abnormale Karyotypen auf, umfassend Translokationen, Inversion, Deletionen, Isochromosomen, Monosomien, sowie Extrachromosomen. Krebszellen umfassen „hyperplastische Zellen", das heißt Zellen in den Frühstadien einer malignen Progression, „dysplastische Zellen", das heißt Zellen in den Zwischenstadien einer neoplastischen Progression, sowie „neoplastische Zellen", das heißt Zellen in den fortgeschrittenen Stadien einer neoplastischen Progression.
Der Begriff „modifizierter Pflanzenvirus" bezeichnet einen Pflanzenvirus, von dem ein beliebiger Teil mittels chemischer, biochemischer und/oder molekularbiologischer Techniken modifiziert wurde. Ein „chimärer Pflanzenvirus" ist ein Pflanzenvirus, welcher mittels molekularbiologischer Techniken modifiziert wurde.
Die Begriffe „TH1-artige Antwort" und „TH1-Antwort" bezeichnen, wenn sie in Bezug auf eine Antwort in einem Tier verwendet werden, eine beliebige zelluläre und/oder humorale Antwort, welche bei Stimulierung durch ein Antigen von TH1-Lymphozyten erzeugt wird, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen in Bezug auf die Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin, das Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen, und/oder die Menge an TH1-assoziiertem Cytokin. Im Gegensatz hierzu bezeichnen „TH2-artige Antwort" und „TH2-Antwort", wenn sie in Bezug auf eine Antwort in einem Tier verwendet werden, eine beliebige zelluläre und/oder humorale Antwort, welche bei Stimulierung durch ein Antigen von TH2-Lymphozyten erzeugt wird, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen in Bezug auf die Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin, das Ausmaß der Proliferation von TH2-Zellen, und/oder die Menge an TH2-assoziiertem Cytokin.
Die Begriffe „TH1-assoziiertes Immunglobulin" und „aus TH1-Zellen stammendes Immunglobulin" bezeichnen ein oder mehrere Immunglobuline (zum Beispiel IgG), welche von TH1-Zellen erzeugt werden. Im Gegensatz hierzu bezeichnen die Begriffe „TH2-assoziiertes Immunglobulin" und „aus TH2-Zellen stammendes Immunglobulin" ein oder mehrere der Immunglobuline (zum Beispiel IgG), welche von TH2-Zellen erzeugt werden. Die Subtypen von TH1-assoziierten Immunglobulinen und von TH2-assoziierten Immunglobulinen sind insofern speziesspezifisch, als sie von Spezies zu Spezies variieren. So stellen beispielsweise IgG₁ und IgG₃ im Menschen die die TH1-Funktionen ausübenden TH1-assoziierten Immunglobuline dar, während in Mäusen IgG₂ (und insbesondere IgG_2a und IgG_2b) das eigentliche TH1-assoziierte Immunglobulin darstellt. Im Hinblick auf TH2-assoziierte Immunglobuline umfassen diese Maus-IgG₁ und -IgG₃ sowie humanes IgG₂. Verfahren zur Bestimmung von Immunglobulin-Subtypen sind im Fachbereich bekannt und werden auch hierin beschrieben, wobei beispielsweise Techniken enzymgekoppelter Immunadsorptionstests (ELISA) verwendet werden, welche zur Detektion eine Beschichtung der Probenvertiefungen mit kommerziell erhältlichen, mit alkalischer Phosphatase (AP)-markierten anti-IgG-Konjugaten (zum Beispiel alkalischer Phosphatase (AP)-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG₁, -IgG_2a, -IgG_2b oder -IgG₃ [Southern Biotechnologies Inc., USA]) unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP, [Sigma]) als Substrat einsetzen.
Die Begriffe „TH1-assoziiertes Cytokin" und „aus TH1-Zellen stammendes Cytokin" bezeichnen ein oder mehrere der von TH1-artigen Zellen produzierten Cytokine, umfassend, ohne Einschränkung, Interleukin-2 (IL-2), Tumornekrosefaktor-β (TNF-β) sowie Interferon-γ (IFN-γ). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das TH1-assoziierte Cytokin IFN-γ. Im Gegensatz hierzu bezeichnen die Begriffe „TH2-assoziiertes Cytokin" und „aus TH2-Zellen stammendes Cytokin" ein oder mehrere der von TH2-artigen Zellen produzierten Cytokine, umfassend, ohne Einschränkung, Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-9 (IL-9), Interleukin-10 (IL-10) und Interleukin-13 (IL-13). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das TH2-assoziierte Cytokin IL-4.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, welche eine Wirksamkeit in Bezug auf die Modulierung der Art und/oder des Ausmaßes einer Immunantwort auf ein Molekül besitzen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Konjugat aus einem immunogenen Molekül von Interesse und einem chimären Pflanzenvirus (CPV) bereit, welcher ein heterologes Peptid exprimiert, das mit dem Molekül von Interesse in Konjugation treten kann, wobei das heterologe Peptid innerhalb eines Strukturgens des Virus kodiert ist und das Molekül von Interesse mit dem Virus über das heterologe Peptid in Konjugation tritt.
Im Gegensatz zu den vorstehend erläuterten CPV-Konstrukten aus dem Stand der Technik [Brennan et al. (1999) Microbiol.; Brennan et al. (1999) Vaccine; Durrani et al. (1998) J. Immunol. Methods], welche zur Expression eines heterologen Peptids, das ein immunogenes Molekül von Interesse darstellt, konstruiert sind, exprimieren die CPVs der vorliegenden Erfindung ein heterologes Peptid, welches mit einem immunogenen Molekül konjugiert werden kann, und an welches das immunogene Molekül von Interesse anschließend konjugiert wird.
Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass eine Immunisierung mit modifizierten Pflanzenviren als Plattform für eine Präsentation von Molekülen überraschenderweise zu Pflanzenvirus-spezifischen und molekülspezifischen TH1-Zellen führt. Es wird hierin eine umfassende Dominanz in Richtung einer TH1-artigen Immunantwort dargelegt, wobei der beispielhaft genannte Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) zur Präsentation von Peptiden verwendet wird, welche aus einem weiten Bereich von Quellen, umfassend Bakterien, Viren, Immunglobulin, Hormon, und Krebs-assoziiertes Zelloberflächenprotein, stammen. Es wird hierin dargelegt, dass die Dominanz zugunsten einer TH1-artigen Immunantwort von der Quelle des Moleküls, der Dosierung des Moleküls, der Gegenwart oder Abwesenheit von Hilfsmittel, der Art der immunmodulierenden Aktivität des Hilfsmittels, sofern dieses vorhanden ist, der Applikationsart, sowie der genetischen Konstitution (Genotyp) des immunisierten Tieres unabhängig ist. Dieses Ergebnis ist angesichts von Berichten im Stand der Technik, wonach die Aktivierung von TH-Zell-Subpopulationen vom Stamm des verwendeten Tieres, der Identität des Antigens, der Applikationsart des Antigens, sowie dem Immunisierungsschema beeinflusst wird, überraschend. Dieses Ergebnis ist auch angesichts der nicht-replizierenden Natur der erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren und angesichts von Berichten im Stand der Technik, wonach lebende Viren für eine überwiegende TH1-Antwort erforderlich sind [Nguyen et al. (1994), vorstehend], überraschend.
Insbesondere offenbart die Erfindung, dass Peptide, welche aus einem weiten Bereich von Quellen, umfassend Bakterien, Viren, Immunglobulin, Hormon und Krebs-assoziiertes Zelloberflächenprotein, stammen, überraschenderweise dazu tendieren, sehr viel höhere Mengen an peptidspezifischem IgG_2a im Vergleich zu den Mengen an peptidspezifischem IgG₁ zu erzeugen, wenn sie auf dem beispielhaft genannten Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) präsentiert werden. Dieser Pflanzenvirus repliziert sich in humanen Zellen nicht und verhält sich in einem Säugersystem somit wie ein vollständig inaktiver Virus. Von den hierin untersuchten unterschiedlichen CVPs erzeugten 6 eine Dominanz von peptidspezifischem IgG_2a-Antikörper gegenüber IgG₂ _b-Antikörper, während lediglich CPMV-MAST1 unter bestimmten Bedingungen die Produktion von IgG_2b gegenüber jener von IgG_2a zu begünstigen schien. Die CPMV-spezifischen Antikörperantworten zeigten ferner die gleiche Dominanz von IgG_2a gegenüber IgG₁. Auf zellulärer Ebene wurden, verglichen mit IgG₁-produzierenden SFCs in der Milz von CVP-immunisierten Mäusen, eine sehr viel höhere Anzahl sowohl an peptidspezifischen als auch an CPMV-spezifischen IgG_2a-produzierenden punktbildenden Zellen (SFCs) [B-Zellen] produziert.
Obwohl ein Verständnis betreffend den Mechanismus nicht erforderlich ist und keinerlei Einschränkung der Erfindung auf einen bestimmten Mechanismus beabsichtigt ist, scheint die starke Polarisierung der Isotypenantwort auf sowohl das Peptid als auch den Virus zugunsten einer TH1-artigen Antwort mit der Fähigkeit des Virus in Beziehung zu stehen, virusspezifisches CD4+ TH1 zu aktivieren, wodurch der Klassenwechsel von peptidspezifischen (und virusspezifischen) naiven B-Zellen zu TH1-assoziierten, Immunglobulin-produzierenden Plasmazellen erleichtert wird.
Die Dominanz von peptidspezifischem IgG_2a gegenüber IgG₁ wird hierin in 5 unterschiedlichen Mausinzuchtstämmen dargelegt, welche N-2^b (C57BL/6), H-2^d (BALB/c), H-2^q (NIH), H-2^dql (Biozzi AB/H) und H-2^s (DBA/I) umfassen. Selbst in den TH2-dominierten BALB/c- und Biozzi AB/H-Mäusen [Natsuume-Sakai et al. (1977) Immunology 32: 861; Sant'Anna et al. (1985) Immunogenetics 22: 131] trat überraschenderweise eine Dominanz von IgG_2a gegenüber IgG₁ auf. Die hierin zusammen mit den CVPs untersuchten Hilfsmittel umfassten jene, welche TH1-Antworten begünstigen, wie beispielsweise das vollständige Freund'sche Adjuvans (Freund's Complete Adjuvant), sowie jene, welche TH2-Antworten begünstigen [Alaun: Cooper (1994) „The selective induction of different immune responses by vaccine adjuvants. In: Vaccine Design (G.I. Ada., Hrsg.), R.G. Landes Company, S. 125]. Wiederum waren die unter Verwendung dieser Hilfsmittel oder in Abwesenheit von Hilfsmittel erzeugten Mengen an IgG_2a überraschenderweise viel höher als die Mengen an IgG₁, was hervorhebt, dass tatsächlich eher der als Träger fungierende Pflanzenvirus als das Hilfsmittel die TH1-Antworten steuert. Entscheidenderweise wurde beobachtet, dass, im Gegensatz zu den vorstehend beschriebenen Tierviren, die Dominanz von IgG_2a gegenüber IgG₁ vom Mausstamm oder dem für die Immunisierung verwendeten Hilfsmittel unabhängig ist.
Die Erfindung offenbart ferner, dass eine Immunisierung mit sowohl hohen als auch niedrigen Dosen (im Bereich von 2–300 μg) an CVPs zur Erzeugung TH1-artiger Antworten führte. Somit schien die über drei Größenordnungen reichende Dosis an verabreichtem Antigen, für welche bereits gezeigt wurde, dass sie die Erzeugung von Maus-IgG-Isotypen beeinflusst [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 2439; Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 809], die TH1-Dominanz in den Isotypen von peptidspezifischem IgG überraschenderweise nicht zu beeinflussen.
Die mit den hierin beschriebenen, beispielhaft genannten ikosaedrischen Pflanzenviren erhaltenen Ergebnisse waren überraschend, da andere, aus Tierviren wie beispielsweise Norwalk-Virus [Ball et al. (1998) J. Virol. 72: 1345] und Rotavirus [O'Neal et al. (1997) J. Virol. 71: 8707] stammende ikosaedrische virusähnliche Partikel (VLPs) teilweise keine derartig starke Dominanz von IgG_2a gegenüber IgG₁ wie jene, über welche hierin berichtet wird, hervorrufen. Es wird an anderer Stelle berichtet, dass das zielgerichtete Dirigieren partikulärer Antigene auf Makrophagen von sich aus nicht ausreichend ist, um eine polarisierte TH1-Antwort zu stimulieren [Sedlik et al. (1997) Intl. Immunol. 9: 91], da eine Co-Immunisierung mit Immunmodulatoren wie beispielsweise IL-12 und Poly(I):(C) erforderlich ist.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren sind zur Erzeugung von Antikörpern gegen ein Molekül, zur Induzierung einer erwünschten TH1-artigen Antwort und/oder zur Verringerung einer unerwünschten TH2-artigen Antwort auf ein Molekül zum Zwecke beispielsweise einer Detektion, Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen von Nutzen. Insbesondere finden die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren speziell (jedoch nicht ausschließlich) Verwendung in klinischen Anwendungen, da ihre immunmodulatorische Wirkung in Abwesenheit fremder immunmodulatorischer Mittel (wie beispielsweise Cytokine und Hilfsmittel) erzielt werden kann, wodurch Kosten und ungünstige Nebenwirkungen, welche mit einer Verabreichung dieser Mittel assoziiert sind, vermieden werden. Darüber hinaus stellen sie aufgrund der Tatsache, dass sich die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren in humanen Zellen nicht replizieren, einen Vorteil gegenüber existierenden Vakzinträgern dar, da Sicherheitsbedenken, welche existierende Trägersysteme für lebende Tierviren/-bakterien und DNA mit sich bringen, vermieden werden.
Die Erfindung wird weiterhin unter (A) Entwicklung von TH1/TH2-Zellen, (B) TH1-artige und TH2-artige Antworten und Pathologie, (C) Pflanzenviren, (D) Moleküle von Interesse, (E) Expression von Polypeptiden durch Pflanzenviren, (F) Konjugieren von Molekülen an Pflanzenviren, (G) Verabreichen von Zusammensetzungen an Tiere, (H) Erhöhen einer TH1-artigen Antwort, und (I) Verringern einer TH2-artigen Antwort beschrieben.
A. Entwicklung von TH1/TH2-Zellen
In Mäusen werden naive CD4+ T-Zellen in zwei Gruppen, TH1 und TH2, unterteilt, welche durch unterschiedliche Cytokin-Sekretionsprofile und damit unterschiedliche Effektorfunktionen gekennzeichnet sind [für einen Überblick siehe Mosmann et al. (1986) J. Immunol. 136: 2248–2357]. Obwohl ein Verständnis des Mechanismus zur Ausführung der Erfindung nicht erforderlich ist, und ohne die Erfindung auf einen bestimmten Mechanismus einzuschränken, können T-Zell-Klone, welche die archetypischen TH1- oder TH2-Eigenschaften zeigen, Extreme eines Kontinuums von differenzierten CD4+-Zellen darstellen, wobei das in einer „typischen" TH1- oder TH2-Antwort produzierte in vivo-Cytokinprofil von einer Reihe von Zelltypen produziert wird.
Der Einfachheit halber ist es jedoch leichter, die beiden Zelltypen so zu bezeichnen, als wären sie getrennte Einheiten. Folglich bezeichnet der Begriff „TH1-Zelle", wie er hierin verwendet wird, eine T-Helferzelle, welche ein oder mehrere TH1-assoziierte Immunglobuline (zum Beispiel Maus-IgG_2a, Maus-IgG_2b, humanes IgG₁ und humanes IgG₃) und/oder ein oder mehrere TH1-assoziierte Cytokine (zum Beispiel IL-2, TNF-β und IFN-γ) produziert. Im Gegensatz hierzu bezeichnet eine „TH2-Zelle", wie sie hierin verwendet wird, eine T-Helferzelle, welche ein oder mehrere TH2-assoziierte Immunglobuline (zum Beispiel Maus-IgG₁, Maus-IgG₃ und humanes IgG₂) und/oder ein oder mehrere TH2-assoziierte Cytokine (zum Beispiel IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13) produziert.
TH1- und TH2-Zellen entwickeln sich aus einem gemeinsamen Pool an naiven CD4+-Zellen. Verschiedene Faktoren können die TH-Zell-Differenzierung in Richtung des polarisierten TH1- oder TH2-Signalweges beeinflussen. Das von unterschiedlichen Mitteln hervorgerufene Cytokinprofil einer „natürlichen Immunität", die Art des Peptidliganden, die Identität und Menge an in der Mikroumgebung sekretierten Hormonen, die Mengen an Antigen, sowie die Gegenwart costimulierender Signalrezeptoren und des MHC-Genotyps auf den T-Zellen kann die Entwicklung der Subpopulationen bestimmen, wobei TH2-Zellen in stärkerem Maße von hohen Mengen an Antigen und der Gegenwart co-stimulierender Moleküle abhängig sind. So wurde beispielsweise im Stand der Technik beobachtet, dass in Maus-Vakzinationsmodellen verschiedene Faktoren einen Einfluss darauf haben, welche TH-Zell-Subpopulationen aktiviert werden, und die Erzeugung spezifischer Maus-IgG-Isotypen beeinflussen. Derartige Faktoren umfassen den genetischen Hintergrund des verwendeten Mausstammes, die Applikationsart des Antigens und das Immunisierungsschema (umfassend die Quantität und Halbwertszeit des Antigens), sowie die Art des Antigens. TH2-artige Cytokinprofile treten in vivo häufig später als TH1-Antworten auf.
Es wird angenommen, dass das Schlüsselcytokin der TH1-Erzeugung IL-12 ist, welches von aktivierten Makrophagen und den dendritischen Zellen produziert wird. Es wird angenommen, dass das Schlüsselcytokin der TH2-Erzeugung IL-4 ist. IL-4 wird in kleinen Mengen während der anfänglichen T-Zell-Aktivierung produziert (eine bestimmte Subpopulation von CD4-Zellen, genannt NK1.1-Zelle, wurde als ursprüngliche Quelle der IL-4-Produktion vorgeschlagen). Es wird angenommen, dass die Entwicklung einer TH2-Antwort von der Entwicklung lokaler Konzentrationen an IL-4 vorangetrieben wird, was möglicherweise ein Ergebnis persistenter T-Zell-Stimulation ist.
Was die Funktion von TH1-Zellen anbetrifft, so produzieren diese Zellen Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), welche eine Aktivierung von Makrophagen und cytotoxischen T-Zellen (CTL) vermitteln und die eigentlichen Effektoren einer zellvermittelten Immunität gegenüber intrazellulären Mikroben und von DTH (Spättyp-Überempfindlichkeitsreaktion) darstellen [Mosmann et al. (1986), vorstehend]. Es wird zunehmend erkannt, dass CTL-Reaktionen bedeutende therapeutische Faktoren im Rahmen der Behandlung von oder in Reaktion auf solide Tumore darstellen. IFN-γ, welches von TH1-Lymphozyten produziert wird, induziert ferner einen Klassenwechsel vom B-Zell-Isotyp zur IgG_2a-Subklasse, welche den eigentlichen Effektorisotyp von Maus-IgG darstellt. IgG_2a (und in geringerem Ausmaß IgG_2b) bewirkt eine Erhöhung der Antikörperabhängigen zellvermittelten Cytotoxizität (ADCC, Huesser et al. (1977) J. Exp. Med. 146: 1316) und bindet fest an C1q des klassischen Komplementweges, mittels welchem Zellen oder Antikörpercluster der Phagozytose zugeführt werden [Klaus et al. (1979) Immunology 38: 687]. Im Menschen vermitteln IgG₁ und IgG₃ diese Funktionen. Als Ergebnis dieser Effektorfunktionen bietet IgG_2a Mäusen einen besseren Schutz gegenüber Virusinfektionen, Tumoren [Kaminski et al. (1986) J. Immunol. 136: 1123] und Parasiten [Wechsler et al. (1986) J. Immunol. 137: 2968], und bewirkt eine Erhöhung der bakteriellen Clearance [Zigterman et al. (1989) Infect. Immun. 57: 2712].
Im Gegensatz zu TH1-Zellen produzieren TH2-Zellen Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-10 (IL-10) und Interleukin-13 (IL-13), welche die zellvermittelte Immunität unterdrücken [Mosmann et al. (1986), vorstehend]. IL-4 induziert B-Zellen zur Produktion von IgG₁, welches in Mäusen eine schlechte Komplementfixierung bewirkt und keine ADCC vermittelt [Klaus et al. (1979) Immunology 38: 687]. Es induziert ferner die Produktion von Immunglobulin E (IgE), welches an Mastzellen und Basophile bindet. Folglich sind TH2-Zellen für eine von Phygozyten unabhängige Wirtsabwehr gegen beispielsweise helminthische Parasiten [Sher et al. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 385] sowie für die Entwicklung allergischer Reaktionen [Erb et al. (1996) Immunol. Cell Biol. 74: 206] hauptverantwortlich.
B. TH1-artige und TH2-artige Antworten und Pathologie
Im Stand der Technik wird berichtet, dass eine Reihe von Faktoren (zum Beispiel die Art des Antigens, der genetische Hintergrund des Wirtstieres, die Applikationsart, die Wahl des Hilfsmittels) die Art und das Ausmaß einer durch Exposition eines Moleküls gegenüber dem Immunsystem eines Tieres ausgelösten Immunantwort bestimmt. So sind beispielsweise murine Antikörperantworten auf lösliche Proteine und Kohlenhydrate im Allgemeinen auf die Subklassen IgG₁ bzw. IgG₃ beschränkt. Dies lässt darauf schließen, dass IgG-Isotypen nicht nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden. Tatsächlich induzieren lebende Viren (umfassend eine Reihe von RNA- und DNA-Viren) bevorzugt die Produktion spezifischer IgG_2a Antikörper [Coutelier et al. (1987) J. Exp. Med. 165: 64]. Es wird behauptet, dass der durch lebende Viren hervorgerufene Infektionsprozess möglicherweise für die Produktion von IFN-γ von entscheidender Bedeutung ist, welches bevorzugt virusspezifische TH1-Antworten und eine Dominanz von virusspezifischem IgG_2a hervorruft [Nguyen et al. (1994) J. Immunol. 152: 478]. Dies könnte ferner erklären, warum sich replizierende (lebende) bakterielle Vakzine und DNA-Vakzine TH1-dominierte Antworten erzeugen [Londono et al. (1996) Vaccine 14: 545; Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70: 6119]. Allerdings ist bekannt, dass einige lebende Viren, wie beispielsweise Influenzavirus [Balkovic et al. (1987) Antiviral Res. 8: 151], Herpes-simplex-Virus vom Typ I [HSV-1; McKendall et al. (1988) J. Gen. Virol. 69: 847], Theiler's murines Enzephalomyelitis-Virus [Peterson et al. (1992) Immunology 75: 652] sowie Maul- und Klauenseuche-Virus [Perez-Filgueira et al. (1995) Vaccine 13: 953] überwiegend andere Isotypen als IgG_2a hervorrufen. Neben der Art des Antigens beeinflusst der genetische Hintergrund des Wirtstieres die Art und das Ausmaß einer Immunantwort. So produzieren im Falle von Influenzavirus BALB/c-Mäuse überwiegend IgG_2a, C57Bal/6 jedoch überwiegend IgG₁ [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70: 2439]. Somit weist die Immunreaktion gegen diese lebenden Viren eine Empfindlichkeit in Bezug auf ein genetisches Element auf (immungenomischer Faktor).
Die Art des Hilfsmittels spielt im Rahmen der Bestimmung der Art der Immunantwort ebenfalls eine Rolle. Beim Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV) stellt IgG_2b den vorherrschenden Isotyp dar, welcher in Reaktion sowohl auf lebenden als auch vollständig inaktiven Virus produziert wird, außer wenn ein Wasser-in-Öl-Hilfsmittel zusammen mit dem inaktiven Virus verwendet wird. Mit letzterer Hilfsmittelkombination ergibt sich eine Dominanz von IgG_2a (Perez-Filgueira et al. (1995) Vaccine 13: 953). Folglich kann die Wahl des Hilfsmittels eindeutig den Zweig der T-Helferzell-Antworten beeinflussen.
Darüber hinaus können einige inaktivierte Viren überwiegend IgG_2a-Antikörper hervorrufen. Alles in allem zeigt somit eine Vielzahl von Studien, dass die Fähigkeit, virusspezifisches IgG_2a hervorzurufen, möglicherweise nicht nur eine Folge des Infektionsprozesses ist, sondern auch von der Art des Virus selbst, dem H-2-Haplotyp der Maus, der Immunisierungsart, sowie auch der Wahl des Hilfsmittels abhängig sein kann.
Die von den TH1- und TH2-artigen T-Zellen erzeugten Cytokinprofile führen zu unterschiedlichen physiologischen Antworten auf Pathogene, mittels welchen versucht wird, die durch das Pathogen hervorgerufenen Belastungen zu verringern, zu verbessern oder zu beseitigen. Es kann allerdings aufgrund einer persistenten Reaktion oder einer Überreaktion auf das Pathogen auch ein Gewebeschaden auftreten.
Insbesondere kann die Rekrutierung und Aktivierung von Makrophagen im Falle von TH1 zu unerwünschten granulomatösen Entzündungen führen, wobei das hierfür überragende Beispiel die tuberkuloide Form von Lepra ist. Ist der infizierende Mikroorganismus ein intrazellulärer Organismus, wie beispielsweise jene, welche Tuberkulose, Brucellose hervorrufen, oder die Organismen Pneumocystis carinii (Protozoon), ein Pilz wie Candida albicans oder Leishmania major (ein intrazellulärer Parasit – Protozoon), so führt die TH1-Antwort zu einer Spättyp-Überempfindlichkeitsantwort (DTH-Antwort), welche zur Eliminierung der diese Organismen enthaltenden Zellen führt. Die Freisetzung von IFN-γ in der Nähe der Infektion aktiviert Makrophagen. Die lokalisierte Freisetzung lysosomaler Enzyme aus dem Makrophagen tötet infizierte Zellen und gesunde Bystanderzellen, was zur Zerstörung des eindringenden Mikroorganismus führt. Zusätzlich erfolgt eine Freisetzung eines MIF (Makrophagen inhibierender Faktor) genannten Proteins durch die TH1-Zelle. Dieses Protein stellt einen anti-chemotaktischen Faktor dar, welcher zu einer Immobilisierung jeglicher Makrophagen in der Nähe der TH1-Zelle führt. Somit verharren Makrophagen am Infektionsort. Der aufgrund von Tuberkulose und möglicherweise von Pneumocystis carinii beobachtete Lungenschaden stellt das Ergebnis eines durch Freisetzung von aktiven Makrophagen und lysosomalem Enzym in das Gewebe hervorgerufenen wahllosen Zellschadens dar. TH1-dominierte Antworten können auch bei der Pathogenesse organspezifischer Autoimmunerkrankungen, akuter Abstoßung allogener Transplantate, ungeklärter wiederkehrender Fehlgeburten, Kontaktdermatitis, sowie einiger chronischer entzündlicher Erkrankungen unbekannter Ätiologie beteiligt sein [zusammengefasst von Romagnani (1996) Clin. Immunol. Immunopathol. 80: 225].
Unangemessene TH2-Antworten können ferner zu unerwünschten Ergebnissen, umfassend die Rekrutierung von Basophilen und Eosinophilen, führen, was nachteilige Auswirkungen auf die Entwicklung von Allergien und Asthma haben kann. Die Antwort auf eine Frühform des RSM (respiratorisches Synzytialvirus)-Vakzins (welches ein mit Alaun konjugiertes abgetötetes Virusvakzin enthält) stellt ein Beispiel für eine unangemessene TH2-Antwort dar, welche zu Fällen von Eosinophilie und Bronchospasmus führte. Ähnliche Reaktionen können zu asthmatischen Symptomen führen. TH2-artige Antworten sind auch für das Omenn-Syndrom, einen verringerten Schutz gegenüber einigen intrazellulären Pathogenen, Transplantationstoleranz, chronische GVHD (Spender-gegen-Wirt-Erkrankung; Graftversus-Host-Disease), atopische Störungen, sowie einige systemische Autoimmunerkrankungen verantwortlich.
Es wurde beobachtet, dass eine Veränderung der Sequenz (und somit Affinität) von Peptiden innerhalb des MHC Klasse II-Komplexes die Art der CD4+ T-Zell-Antwort beeinflussen kann [Murray (1998) Immunol. Today 19: 157]. Somit können Peptidepitope, welche aus Proteinen von infektiösen Mitteln stammen, durch Evolution eine Modifizierung erfahren, was eine Neuausrichtung der Wirtsantwort auf das Pathogen, zum Beispiel zwischen TH1- und TH2-Antworten, hervorruft. Eine Parallelevolution von Wirt und Pathogen kann zur Entwicklung von T-Epitopen auf Pathogenen führen, welche mit bestimmten Affinitäten an MHC-Subpopulationen binden. Die Wirtsantwort muss ausgewogen sein, um den Erfordernissen betreffend eine Detektion mehrerer Pathogene und Formen von Pathogenen gerecht zu werden. Aus diesem Grund ist zu erwarten, dass in immunogenen Determinanten eines Pathogens zu einem gewissen Grad Sequenzvariationen auftreten. In gewissem Ausmaß stellt dies ein Mittel dar, mittels welchem die Immunmodulation einer Reaktion auf ein bestimmtes Immunogen vorgesehen sein kann, das heißt die Mutation von Aminosäuren innerhalb eines Peptids, um eine gegenüber dem Wildtyp-Peptid unterschiedliche Art von Immunreaktion zu erzielen.
C. Planzenviren
Die Erfindung stellt nicht-replizierende modifizierte Pflanzenviruspartikel bereit, welche in der Lage sind, Zellen des Immunsystems Moleküle zu präsentieren, die entweder als Immunogene oder als Antigene eine Wirksamkeit in Bezug auf die Erzeugung von Antikörpern und/oder Cytokinen, die Stimulierung einer TH1-artigen Antwort, bevorzugt überwiegend einer TH1-artigen Antwort, die Verringerung einer unerwünschten Dominanz in Richtung einer bestehenden oder erwarteten TH2-artigen Antwort, welche in bestimmten Molekülen inhärent ist, besitzen.
Die Erfindung sieht die Verwendung eines beliebigen Virus vor, in welchem die für das Kapsid kodierende Nukleinsäure eine von jener Einheit, welche für andere funktionelle Moleküle kodiert, getrennte Einheit ist, und dessen Hüllproteine eine β-Fass-Struktur (β-Barrel-Struktur) aufweisen. Ein Vorteil der Verwendung von Viren, welche diese Struktur aufweisen, ist, dass die Loops zwischen den einzelnen Strängen der β-Faltblätter geeignete Stellen für die Insertion fremder Peptide darstellen. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung stellt die Modifizierung eines oder mehrerer Loops eine bevorzugte Strategie zur Expression fremder Peptide dar. In einer Ausführungsform sieht die Erfindung die Verwendung von Comoviren [wie beispielsweise Kuherbsen-Mosaikvirus und Bean Pod Mottle-Virus], Nepoviren [wie beispielsweise Tomatenringfleckenvirus und latentes Erdbeerringfleckenvirus], Tombusviren [wie beispielsweise Tomatenzwergbusch-Virus (TBSV)], und Sobemoviren [wie beispielsweise Southern Bean-Mosaikvirus (SBMV)] vor. Insbesondere weisen die Tombusviren und Sobemoviren ähnliche 3-dimensionale Strukturen wie Comoviren und Nepoviren auf, besitzen jedoch lediglich eine einzige Art von β-Fässern.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Virus um ein Comovirus. Ein Vorteil der Comoviren ist, dass ihr Kapsid jeweils 60 Kopien dreier unterschiedlicher β-Fässer enthält, welche unabhängig voneinander manipuliert werden können, was die Expression von 60–180 Kopien eines Peptids mittels eines einzigen Viruspartikels gestattet.
Comoviren stellen eine Gruppe von mindestens vierzehn Pflanzenviren dar, welche überwiegend Hülsenfrüchte infizieren. Ihre Genome bestehen aus zwei Molekülen einzelsträngiger Plusstrang-RNA unterschiedlicher Größe, welche getrennt voneinander in isometrischen Partikeln mit einem Durchmesser von etwa 28 nm eingeschlossen sind. Die zwei Arten von Nukleoproteinpartikeln werden aufgrund ihres Verhaltens in Cäsiumchlorid-Dichtegradienten als mittlere (M) und untere (B) Komponente bezeichnet, wobei die RNAs innerhalb der Partikel als M- bzw. B-RNA bekannt sind. Beide Partikelarten weisen eine identische Proteinzusammensetzung auf, welche jeweils aus 60 Kopien eines großen (VP37) und eines kleinen (VP23) Hüllproteins bestehen. Neben den Nukleoproteinpartikeln enthalten Zubereitungen von Comoviren unterschiedliche Mengen an leeren (ausschließlich Protein) Kapsiden, welche als obere (T) Komponente bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Comovirus um Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV).
Im Falle des beispielhaft genannten Vertreters der Comovirusgruppe, Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV), ist bekannt, dass sowohl M- als auch B-RNA polyadenyliert und an ihren 5'-Enden kovalent an ein kleines Protein (VPg) gebunden sind. In stärkerem Maße auf andere Comoviren beschränkte Studien deuten darauf hin, dass diese Merkmale von den RNAs aller Vertreter der Gruppe geteilt werden. Beide RNAs aus CPMV wurden sequenziert, wobei gezeigt wurde, dass sie ohne die Poly (A)-Schwänze aus 3481 (M) und 5889 (B) Nukleotiden bestehen. Beide RNAs enthalten einen einzelnen langen offenen Leserahmen, wobei die Expression der viralen Genprodukte durch Synthese und anschließende Spaltung großer Vorläufer-Polypeptide erfolgt. Obwohl beide RNAs für eine Infektion ganzer Pflanzen erforderlich sind, ist die größere B-RNA in der Lage, sich in Protoplasten unabhängig zu replizieren, obwohl in diesem Fall keine Viruspartikel produziert werden. Diese Beobachtung, verbunden mit früheren genetischen Studien, begründete, dass die Hüllproteine durch M-RNA kodiert werden.
Eine 3.5 A-Elektronendichtekarte von CPMV zeigt, dass eine eindeutige Beziehung zwischen CPMV und den T-3-Pflanzenviren, wie beispielsweise den Tombusviren, insbesondere dem Tomatenzwergbusch-Virus (TBSV), und den Sobemoviren, insbesondere dem Southern Bean-Mosaikvirus (SBMV), besteht. Die Kapside dieser letzteren Viren sind aus 180 identischen Hüllprotein-Untereinheiten zusammengesetzt, welche jeweils aus einer einzelnen β-Fass-Domäne bestehen. Diese können drei unterschiedliche Positionen, A, B und C, innerhalb der Virione besetzen. Es wurde gezeigt, dass die zwei Hüllproteine von CPMV aus drei unterschiedlichen β-Fass-Domänen bestehen, wobei zwei aus VP37 stammen und eine aus VP23 stammt. Somit besteht jeder CPMV-Partikel, was sie mit den T-3-Viren gemein haben, aus 180 β-Fass-Strukturen. Die einzelne Domäne aus VP23 besetzt eine Position analog jener der A-Typ-Untereinheiten von TBSV und SBMV, während die N- und C-terminalen Domänen von VP37 die Positionen der C- bzw. B-Typ-Untereinheiten besetzen (U.S. Patent Nr. 5,874,087).
Eine Röntgenbeugungsanalyse von Kristallen von CPMV und einem anderen Vertreter der Gruppe, dem Bean Pod Mottle-Virus (BPMV), zeigt, dass die 3-D-Strukturen von BPMV und CPMV eine große Ähnlichkeit aufweisen und allgemein für die Comovirusgruppe typisch sind.
In den Strukturen von CPMV und BPMV besteht jedes β-Fass hauptsächlich aus 8 Strängen antiparalleler β-Faltblätter, welche durch Loops unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft sind. Die flachen β-Faltblätter werden als B-, C-, D-, E-, F-, G-, H- und I-Faltblätter bezeichnet, und die Verbindungsloops werden als βB-βC-, βD-βE-, βF-βG- und βH-βI-Loops bezeichnet.
Die Comoviren stehen auch mit den tierischen Picornaviren strukturell in Beziehung. Die Kapside von Picornaviren bestehen aus jeweils aus 60 Kopien dreier unterschiedlicher Hüllproteine VP1, VP2 und VP3, welche jeweils aus einer einzelnen β-Fass-Domäne bestehen. Wie im Falle von Comoviren werden diese Hüllproteine durch Spaltung eines Vorläufer-Polyproteins freigesetzt und in der Reihenfolge VP2-VP3-VP1 synthetisiert. Ein Vergleich der 3-dimensionalen Struktur von CPMV mit jener der Picornaviren zeigte, dass die N- und C-terminalen Domänen von VP37 VP2 bzw. VP3 äquivalent sind, und dass VP23 VP1 äquivalent ist. Die Äquivalenz zwischen struktureller Position und Genabfolge lässt darauf schließen, dass VP37 einer ungespaltenen Form der beiden Kapsidproteine VP2 und VP3 des Picornavirus entspricht.
Einer der wesentlichen Unterschiede zwischen Comoviren und Picornaviren ist, dass den Proteinuntereinheiten von Comoviren die in Picornaviren gefundenen großen Insertionen zwischen den Strängen der β-Fässer fehlen, obwohl die grundlegende Architektur der Partikel sehr ähnlich ist. Die vier Loops (βB-βC, βD-βE, βF-βG und βH) zwischen den β-Faltblättern sind hinsichtlich der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Virione nicht von entscheidender Bedeutung, werden erfindungsgemäß allerdings als Stellen für die Expression heterologer Peptidsequenzen verwendet, wie etwa beispielsweise antigene Stellen, welche aus einer breiten Auswahl an Quellen, umfassend ein Bakterium, ein Virus, ein Immunglobulin, ein Hormon sowie ein Krebs-assoziiertes Zelloberflächenprotein, stammen.
D. Moleküle von Interesse
Die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviruspartikel sind in der Lage, Zellen des Immunsystems ein beliebiges Molekül zum Zwecke beispielsweise einer Erzeugung von Antikörpern und/oder Cytokinen, Erhöhung einer TH1-artigen Antwort und/oder Verringerung einer TH2-artigen Antwort auf das Molekül zu präsentieren. Die Antikörper, welche in Reaktion auf die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviruspartikel erzeugt werden, können zur Isolierung und Reinigung des Moleküls verwendet werden. Alternativ können diese Antikörper zur Prävention, Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, welche mit der Exposition eines Tieres gegenüber dem Molekül assoziiert sind.
Moleküle, welche für eine Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen ein beliebiges Molekül, welches in einem exponierten Teil des Hüllproteins der erfindungsgemäßen Viren präsentiert werden kann.
Beispielhafte Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, welche eine Peptidsequenz, eine Nukleinsäuresequenz, ein Polysaccharid und/oder ein Lipid enthalten, wie beispielsweise Glykopeptid, Lipopeptid, Glykolipid, etc.
Moleküle, welche vorteilhafterweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen jene, welche gereinigt sind, deren Struktur jedoch unbekannt ist, sowie gereinigte Moleküle mit bekannter Struktur (zum Beispiel Peptide mit bekannter Aminosäuresequenz, Nukleinsäuresequenzen mit bekannten Nukleinsäuresequenzen, Polysaccharide mit bekannter Zusammensetzung und Struktur, etc.). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Moleküle gereinigt und weisen eine bekannte Struktur auf.
Die Erfindung sieht Polypeptidmoleküle vor, welche aus einer beliebigen Quelle stammen. Ohne dass eine Einschränkung des Schutzumfangs hiervon beabsichtigt ist, sieht die Erfindung Polypeptide vor, welche aus Krebszellen und pathogenen Parasiten (zum Beispiel Bakterien, Viren, Protozoen, Nematoden, Pilzen, etc.) stammen, und insbesondere antigene und immunogene Peptide, welche aus diesen pathogenen Parasiten stammen. Ebenfalls vom Schutzumfang der Erfindung umfasst sind Polypeptide, welche mit der Entwicklung von Erkrankungen assoziiert sind, Polypeptide, welche für Cytokine kodieren, Polypeptidallergene, Hormone, Enzyme, Wachstumsfaktoren, anti-idiotypische Antikörper, Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, sowie Teile eines beliebigen der vorstehenden Peptide oder Vorläufer hiervon.
Beispiele für Polypeptide, welche aus Krebszellen stammen, die innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen sollen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf; das Ösophaguskarzinom-assoziierte Antigen (U.S. Patent Nr. 6,069,233), das mit Brustkrebs assoziierte mammaspezifische Protein (Mammaglobin) (U.S. Patent Nr. 5,922,836), das mit Prostataadenokarzinomen assoziierte Prostata-Mucin-Antigen (U.S. Patent Nr. 5,314,996), humanes prostataspezifisches Antigen (PSA) (U.S. Patente Nr. 6,100,444; 5,902,725), das SF25-Antigen von Kolonadenokarzinom (U.S. Patent Nr. 5,212,085), mit Harntumor assoziierte Antigene (U.S. Patent Nr. 5,993,828), melanogenes Antigen (U.S. Patent Nr. 6,087,110), das MART-1 Melanom-Antigen (U.S. Patent Nr. 5,994,523), humanes tumorassoziiertes Antigen (PRAT) (U.S. Patent Nr. 6,020,478), TRP2-Protein Tumorantigen (U.S. Patent Nr. 6,083,703), das humane tumorassoziierte Antigen (TUAN) (U.S. Patent Nr. 5,922,566), sowie das mit viral induzierten Tumoren assoziierte tumorspezifische T-Antigen (U.S. Patent Nr. 6,007,8067).
Beispiele für Polypeptide, welche aus pathogenen Bakterien stammen, umfassen Antigene aus Bordetella pertussis (U.S. Patente Nr. 4,029,766; 5,897,867; 5,895,655), Antigene aus Mycobacterium tuberculosis (U.S. Patent Nr. 6,110,469), Porin-Antigene aus Bacterioides, welches mit ulzerativer Kolitis und entzündlicher Darmerkrankung assoziiert ist (U.S. Patent Nr. 6,033,864), Antigene aus Helicobacter pylori (U.S. Patent Nr. 6,025,164), mit dentaler Karies assoziierte Antigene aus Streptococcus (U.S. Patent Nr. 6,024,958), aus Campylobacter jejuni stammende Antigene, welches mit Diarrhöerkrankungen assoziiert ist (U.S. Patent Nr. 5,874,300), das mit Multidrug-Resistenz in Säugerspezies korrelierende P-Glykoprotein-Zelloberfächenantigen (U.S. Patent Nr. 4,837,306), ein in adhäsionsbildenden Bakterien vorliegendes Pilusantigen (U.S. Patent Nr. 4,795,803), und mit pulmonalen Erkrankungen assoziierte äußere Membranvesikel-Antigene aus Moraxella catarrhalis (U.S. Patent Nr. 5,993,826).
Polypeptide, welche aus pathogenen Viren stammen, umfassen beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polypeptide, welche aus Viren isoliert und gereinigt wurden, die beispielhaft durch das Rotavirus-Antigen (U.S. Patent Nr. 6,110,724), humanes Immunschwächevirus Typ II (HIV II)-Antigene und simiane Immunschwächevirus (SIV)-Antigene (U.S. Patent Nr. 5,268,265), nicht-A-, nicht-B-Hepatitisvirus-Antigen (U.S. Patente Nr. 4,702,909; 6,103,485), das Deltaantigen von Hepatitis D-Virus (U.S. Patent Nr. 4,619,896), Influenzavirus-Antigene (U.S. Patent Nr. 6,048,537) vertreten sind. Ebenfalls umfasst sind virale Polypeptide, deren Sequenzen bekannt sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, jene, welche aus Picornaviren stammen, wie beispielsweise Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV), Poliovirus, humanes Rhinovirus (HRV) und humanes Papillomvirus (HPV) (U.S. Patent Nr. 5,874,087), Hepatitis C-Virus (HCV)-Antigen (U.S. Patent Nr. 5,712,087), Hepatitis B-Kern-Antigen (U.S. Patent Nr. 4,839,277), mit Epstein-Barr-Virus in Beziehung stehende Antigene (U.S. Patent Nr. 5,679,774), Hepatitis V-Virus C33-Antigen (U.S. Patent Nr. 5,985,541), Cytomegalovirus (CMV)-Antigene (U.S. Patent Nr. 6,074,817), humanes Immunschwächevirus Typ 2-Antigen (HIV-2) (U.S. Patent Nr. 6,037,165), Herpes-simplex-Virus-Antigene (U.S. Patent Nr. 6,013,433), sowie HTLV I- und HTLV II-Antigene (U.S. Patent Nr. 5,928,861).
Polypeptide, welche innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen und aus pathogenen Protozoen und Nematoden stammen, umfassen beispielsweise die Peptidantigene, welche aus Malaria hervorrufendem Plasmodium vivax stammen (U.S. Patent Nr. 5,874,527), Antigene aus Leishmania, welche mit Leishmaniose assoziiert sind (U.S. Patent Nr. 5,834,592), die Antigene des Nematodenparasiten Dirofilaria immitis (U.S. Patent Nr. 4,839,275), sowie Antigene aus Anaplasma marginale, welche Rinderanaplasmose hervorrufen (U.S. Patent Nr. 4,956,278).
Andere Polypeptide, welche mit der Entwicklung von Erkrankungen assoziiert sind, liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, den mit der Entstehung von Krebs assoziierten, beispielhaft genannten Vorläufer des GAGE-Tumorabstoßungsantigens (U.S. Patent Nr. 6,013,481), die aus malpighischem Epithel (zum Beispiel Ösophagus und Epidermis) von Säugern extrahierten und mit rheumatoider Arthritis assoziierten Antigene (U.S. Patent Nr. 5,888,833), die Rh-Blutgruppen-Antigene (U.S. Patent Nr. 5,840,585), Antigene, welche auf die Anwesenheit und Progression von atherosklerotischer Plaque hindeuten (U.S. Patent Nr. 6,025,477), das mit Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise ulzerativer Kolitis, Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus assoziierte IgG-Fc-bindende Proteinantigen (U.S. Patent Nr. 6,004,760), das mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) assoziierte Sm-D-Antigen (U.S. Patent Nr. 5,945,105), monozytäre Antigene (U.S. Patent Nr. 6,124,436), das mit der das Innenohr betreffenden Autoimmunerkrankung Morbus Menière assoziierte Antigen (U.S. Patent Nr. 5,885,783), das mit der Differenzierung von Mesothelin assoziierte Antigen, welches bei Mesotheliomen und Eierstockkarzinomen auftritt (U.S. Patent Nr. 6,083,502), das mit Knochenerkrankungen assoziierte osteogene und fibroblastische Antigen (OFA) (U.S. Patent Nr. 6,074,833), sowie das mit entzündlichen und allergischen Reaktionen assoziierte Mastzellfunktion-assoziierte Antigen (MAFA) (U.S. Patent Nr. 6,034,227).
Ebenfalls vom Schutzbereich der Erfindung umfasst sind Polypeptide, welche für Cytokine, wie beispielsweise Interleukin-1α, Interleukin-1β (U.S. Patente Nr. 5,965,379; 5,955,476; 5,096,906), Interleukin-2, Interferon-α, Interferon-γ und Tumornekrosefaktor (U.S. Patent Nr. 5,965,379), Interleukin-6 (U.S. Patente Nr. 5,965,379; 5,955,476; 5,942,220; 5,460,810), die TGF-β-Superfamilie, welche die TGF-β-Familie [das heißt umfassend TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβ4, TGFβ5 und TGFβ1.2], die Inhibin-Familie [das heißt umfassend Aktivine und Inhibine], die DPP/VG1-Familie [das heißt umfassend morphogene Knochenmarkproteine (BMPs), DPP und Vg1] und die Mullerian-Inhibiting-Substance-Familie [das heißt umfassend die Mullerian-Inhibiting-Substance (MIS)] umfasst (U.S. Patent Nr. 5,830,671), Interleukin-11, Leukämie inhibierender Faktor, Oncostatin M und ciliärer neurotropher Faktor (U.S. Patent Nr. 5,460,810), sowie Interleukin-12 (U.S. Patent Nr. 5,955,476) kodieren.
Die Erfindung sieht ferner Polypeptidallergene wie beispielsweise, jedoch ohne Einschränkung auf, das Wespenantigen 5, welches für die Behandlung von Patienten mit Wespengiftallergie verwendet wird (U.S. Patent Nr. 6,106,844), die CRX JII-Pollenhauptallergene aus Cryptomeria japonica (U.S. Patent Nr. 6,090,386), die Weidelgras-Pollenallergene Lol p Ib.1 und Lol p Ib.2 (U.S. Patent Nr. 5,965,455), Allergene von Erlenpollen, Haselnusspollen und Birkenpollen (U.S. Patent Nr. 5,693,495), die Allergene Derf I und Derf II der Hausstaubmilbe Dermatophagoides farinae und die Allergene Der p I und Der p VII von D. pteronssinus (U.S. Patente Nr. 5,9958,415; 6,086,897; 6,077,518; 6,077,517), Katzenallergen (Fel d I) (U.S. Patent Nr. 5,547,669), Kakerlaken (CR)-Allergene (U.S. Patent Nr. 5,869,288), sowie Erdnussallergen (Ara h II) (U.S. Patent Nr. 5,973,121) vor.
Ebenfalls vom Schutzumfang der Erfindung umfasst sind Polypeptidhormone, welche beispielsweise Parathyroidhormon (PTH), mit Parathyroidhormon in Beziehung stehendes Peptid (PTHrp) und deren synthetische Analoga (U.S. Patente Nr. 5,693,616; 6,110,892), natürlich vorkommendes humanes Wachstumshormon und dessen Varianten (U.S. Patente Nr. 5,424,199; 5,962,411), avianes Wachstumshormon (U.S. Patent Nr. 5,151,511), luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH) und dessen Analoga (U.S. Patent Nr. 5,897,863), nukleäres Hormon-Rezeptorprotein (U.S. Patent Nr. 5,866,686), Häutung auslösendes Hormon (U.S. Patent Nr. 5,763,400), Gonadotropin freisetzendes Hormon (U.S. Patent Nr. 5,688,506), sowie Melanin-konzentrierende Hormone (MCH) (U.S. Patent Nr. 5,049,655) umfassen.
Nukleinsäuremoleküle, welche innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen, umfassen jene, welche für jedes der vorstehend beschriebenen Polypeptidmoleküle kodieren.
Moleküle, welche ein Polysaccharid enthalten und innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen, umfassen beispielsweise Polysaccharid- und Glykoprotein-Antigene, die aus pathogenen Parasiten (insbesondere aus Bakterien) stammen, sowie Glykoproteinhormone, wie beispielsweise Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH) und Thyroid-stimulierendes Hormon (U.S. Patente Nr. 6,103,501; 5,856,137; 5,767,067; 5,639,640; 5,444,167).
Lipide enthaltende Moleküle, welche im Rahmen dieser Erfindung Anwendung finden, umfassen, ohne Einschränkung, jene, welche aus pathogenen Parasiten stammen (zum Beispiel Lipoproteine, Lipopolysaccharide, etc.).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Molekül um ein Peptid. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform stammt das Peptid aus einem Bakterium (zum Beispiel das OM-Protein F aus Pseudomonas aeruginosa und das Fibronektin-bindende Protein (FnBP) aus Staphylococcus aureus), einem Virus (zum Beispiel caninem Parvovirus), einem Immunglobulin (zum Beispiel humanem mlgE), einem Hormon (zum Beispiel humanem Choriongonadotropin), sowie einem Krebs-assoziierten Zelloberflächenprotein (zum Beispiel epithelialem Wachstumsfaktor-Rezeptor).
E. Expression von Polypeptiden durch Pflanzenviren (Vergleich)
Pflanzenviren, welche nicht erfindungsgemäß sind, können in Übereinstimmung mit den U.S. Patenten Nr. 5,874,087; 5,958,422 konstruiert werden, um Peptide von Interesse zu exprimieren, welche, wie vorstehend beschrieben, aus einer beliebigen Quelle stammen. So sind beispielsweise Comoviren (zum Beispiel CPMV) in der Lage, aus einem einzelnen Virus 60 bis 180 Kopien eines Peptids extern zu exprimieren [eine Kopie des Peptids in jeder der 60 Kopien des kleinen (S) Hüllproteins und in jeder der 60 Kopien des großen (L) Hüllproteins].
Die Peptide, welche in die modifizierten Pflanzenviren eingebaut werden können, enthalten bevorzugt mindestens vier (4) Aminosäuren und unterliegen lediglich der Einschränkung, dass die Art und Größe des Peptids sowie die Stelle, an welcher es in oder auf dem Viruspartikel platziert wird, die Assemblierungsfähigkeit des modifizierten Virus nicht beeinträchtigt, wenn dieser in vitro oder in vivo kultiviert wird. In einer Ausführungsform ist das Peptid ein Peptid, dessen Funktion eine bestimmte Konformation für dessen Aktivität erfordert. Die biologische Aktivität des Peptids kann durch Assoziierung des Peptids mit einem größeren Molekül aufrechterhalten werden (zum Beispiel zur Erhöhung seiner Stabilität oder Präsentationsart in einem bestimmten biologischen System), wie bereits beschrieben (U.S. Patent Nr. 5,958,422).
Die virale Pflanzennukleinsäure wird durch Einbringen einer für das Peptid von Interesse kodierenden Nukleotidsequenz entweder zusätzlich zum existierenden viralen Genom (das heißt Insertion in das existierende virale Genom) oder als Ersatz für einen Teil des viralen Genoms modifiziert. Die Wahl des Einbringungsverfahrens wird zu einem großen Teil durch die Struktur des Kapsidproteins und die Leichtigkeit bestimmt, mit welcher Additionen oder ein Austausch durchgeführt werden können, ohne die Assemblierungsfähigkeit des modifizierten Virus in Pflanzen zu beeinträchtigen.
In einer Ausführungsform wird die für das Peptid von Interesse kodierende Nukleotidsequenz in das virale Genom insertiert. In einer ersten Ausführungsform wird die Insertions- oder Substitutionsstelle der für das Peptid von Interesse kodierenden Nukleotidsequenz so ausgewählt, dass direkte Sequenzwiederholungen, welche die Stelle flankieren, nicht vorhanden sind. Der Begriff „direkte Sequenzwiederholung" bedeutet, wenn er in Bezug auf ein Konstrukt, welches eine Nukleotidsequenz von Interesse enthält, verwendet wird, dass eine identische Oligonukleotidsequenz auf beiden Seiten der Nukleotidsequenz von Interesse vorhanden ist. Konstrukte, welche direkte Sequenzwiederholungen enthalten, die eine Nukleotidsequenz von Interesse flankieren, sind unerwünscht, da sie als Ergebnis einer Rekombination zwischen den flankierenden Sequenzwiederholungen genetisch instabil sind, was zu einem Verlust der flankierten Nukleotidsequenz und einer Rückkehr zur Wildtyp-Sequenz führt.
In einer alternativen Ausführungsform, in welcher die fremde Oligonukleotidsequenz als Ersatz für einen Teil der existierenden Sequenz in das Genom des Pflanzenvirus eingebracht wird, ist es bevorzugt, dass die substituierte Virusgenomsequenz nicht für eine Aminosäuresequenz im viralen Hüllprotein kodiert, was für die Replikation, Enkapsidation und/oder Fortpflanzung des Virus in einer Wirtspflanze von Bedeutung ist. Dieser Defekt kann unter Verwendung einer Kombination von im Fachbereich bekannten Verfahren und den hierin bereitgestellten Lehren auf einfache Weise bestimmt und vermieden werden.
Die für das Peptid von Interesse kodierende Nukleotidsequenz kann durch Identifizieren jenes Teils des Virusgenoms, welches für einen exponierten Teil eines Hüllproteins kodiert, in den Pflanzenvirus eingebracht werden. Der Begriff „exponierter Teil eines Hüllproteins", wie er hierin in Bezug auf einen Virus verwendet wird, ist jener Teil des viralen Hüllproteins, welcher auf der äußeren Oberfläche des Hüllproteins angeordnet ist. Der Ort von Teilen des Hüllproteins, welche exponiert sind und daher potenziell optimale Stellen für die Einbringung des Polypeptids von Interesse darstellen, kann durch Untersuchung der dreidimensionalen Struktur des Pflanzenvirus auf einfache Weise identifiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz der exponierten Teile eines Hüllproteins in Bezug auf Aminosäuren untersucht, welche α-helikale Strukturen aufbrechen, da diese potenziell optimale Stellen für eine Insertion darstellen. Beispiele geeigneter Aminosäuren sind Prolin und Hydroxyprolin, welche beide, wann auch immer sie in einer Polypeptidkette auftreten, eine Unterbrechung der α-Helix bewirken und einen starren Knick oder eine Krümmung in der Struktur erzeugen.
Sobald in Übereinstimmung mit den vorstehenden Lehren und jenen der U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087 eine geeignete Stelle im viralen Hüllprotein ausgewählt ist, kann die für das Peptid von Interesse kodierende Nukleotidsequenz an einer Stelle, welche für die gewünschte Stelle kodiert, in das virale Genom eingebracht werden. Eine derartige Einbringung kann entweder durch Insertion in eine virale Sequenz oder durch Substitution einer viralen Sequenz erzielt werden.
Ist eine Insertion erwünscht, so kann dies durch Auswählen zweier unterschiedlicher Restriktionsenzym-Schnittstellen und Spalten der Nukleinsäure unter Verwendung der ausgewählten Restriktionsenzyme erzielt werden. Eine für das Peptid von Interesse kodierende doppelsträngige Nukleotidsequenz wird unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren (zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion, PCR) synthetisiert, so dass Oligonukleotide Enden aufweisen, welche mit den ausgewählten Restriktionsenzym-Schnittstellen kompatibel sind, was eine Insertion in die gespaltene virale Nukleinsäure gestattet. Dieses Verfahren führt zur Einbringung einer für das Peptid von Interesse kodierenden Nukleotidsequenz, während die Anwesenheit direkter Sequenzwiederholungen, welche das Insert flankieren, vermieden wird. Bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise, werden komplementäre Oligonukleotide synthetisiert, in welchen die für das Peptid von Interesse kodierende Sequenz von Pflanzenvirussequenzen flankiert ist, so dass die Nukleotidsequenz von Interesse zusätzlich zur existierenden Nukleinsäure eingebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Pflanzenvirus um CPMV, und das Peptid von Interesse wird in den βB-βC-Loop des kleinen Hüllproteins (VP23) insertiert. Dieser Loop ist eindeutig auf der Oberfläche des viralen Partikels exponiert, wobei ein Computermodell zeigte, dass selbst große, an dieser Stelle insertierte Loops die Wechselwirkung zwischen benachbarten Untereinheiten, welche für die Struktur und Stabilität des Kapsids verantwortlich sind, wahrscheinlich nicht beeinträchtigen. Dieser Loop weist eine einzigartige Nhel-Stelle an Position 2708 der M-RNA-spezifischen Sequenz auf, an welcher fremde Sequenzen insertiert werden können.
Alternativ wird, wenn die Substitution einer viralen Genomsequenz erwünscht ist, die für die Substitution ausgewählte virale Sequenz unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme gespalten (zum Beispiel die Sequenz zwischen den Nhel- und Aatll-Restriktionsschnittstellen des beispielhaft genannten CPMV), und eine für das Peptid von Interesse kodierende Nukleotidsequenz wird, wie vorstehend beschrieben, hierfür substituiert (U.S. Patent Nr. 5,958,422).
Mit Bestimmung der Stelle und Art der Einbringung des Peptids von Interesse in den Pflanzenvirus kann die Veränderung des Pflanzenvirus unter Verwendung bereits beschriebener Verfahren fortgesetzt werden (U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087). So ist es beispielsweise erforderlich, wenn das Pflanzenvirus ein RNA-Virus (zum Beispiel CPMV) ist, das Peptid von Interesse unter Verwendung von cDNA-Klonen der RNA zu exprimieren. Es wurden cDNA-Klone der RNAs M und B von CPMV konstruiert, in welchen der cDNA-Klon der M-RNA eine für ein heterologes Peptid kodierende insertierte Oligonukleotidsequenz enthält, und welche sich der Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S-Promotorsequenz bedienen, die an den 5'-Enden der viralen cDNAs zur Erzeugung infektiöser Transkripte in der Pflanze gebunden ist. Diese Technik überwindet einige der Probleme, welchen man im Rahmen der Verwendung von in vitro erzeugten Transkripten begegnet, wobei sie auf alle Pflanzen-RNA-Viren anwendbar ist.
Insbesondere ist, eine Veränderung des Genoms des beispielhaft genannten CPMV betreffend, ein Volllängen-cDNA-Klon von CPMV-M-RNA im Transkriptionsvektor pPM1 verfügbar (pPMM2902), wobei dies auch für einen Volllängen-cDNA-Klon von CPMV-B-RNA (pBT7-123) zutrifft. Ein Gemisch von Transkripten aus pPMM2902 und pBT7-123 hat eine vollständige Virusinfektion zur Folge, wenn es in Kuherbsen-Protoplasten elektroporiert wird.
Um die Erzeugung einer direkten Wiederholungssequenz, welche das Insert flankiert, zu vermeiden, kann eine zweite Restriktionsenzym-Schnittstelle in der Nukleotidsequenz des für VP23 kodierenden Bereichs des CPMV-Genoms erzeugt werden. So erzeugt beispielsweise ein einzelner stiller Basenaustausch (U gegen C) an Position 2740 der M-RNA eine einzigartige Aatll-Schnittstelle an Aminosäure Valin 27 (Position 2735 der Nukleotidsequenz). Dies kann durch ortsgerichtete Mutagenese von M13-JR-1 unter Verwendung von in U.S. Patent Nr. 5,874,087 beschriebenen Verfahren erreicht werden. Die Erzeugung der Aatll-Schnittstelle ermöglicht es der für die sechs Aminosäuren des nativen βB-βC-Loops in CPMV kodierenden Nukleotidsequenz, durch Verdau mit Nhel und Aatll entfernt zu werden.
Die Sequenz kann anschließend durch eine beliebige Sequenz mit Nhel- und Aatll-kompatiblen Enden ersetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Pflanzenvirus um Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV), und das Peptid von Interesse wird zwischen den Alanin 22 (Ala²²)- und Prolin 23 (Pro²³)-Resten des βB-βC-Loops des kleinen Kapsidproteins (VP23), wie bereits beschrieben, insertiert (U.S. Patent Nr. 5,958,422).
F. Konjugieren von Molekülen an Pflanzenviren
Die erfindungsgemäßen Pflanzenviren können modifiziert werden, um den humoralen und/oder zellulären Komponenten des Immunsystems ein beliebiges Molekül von Interesse zu präsentieren, indem das Molekül von Interesse, wie nachstehend beschrieben, chemisch an den Pflanzenvirus konjugiert wird.
Der Begriff „konjugieren" bedeutet, wenn er hierin in Bezug auf ein Molekül von Interesse und einen Virus verwendet wird, das kovalente Verknüpfen des Moleküls von Interesse mit dem Virussubjekt mit der einzigen Einschränkung, dass die Art und Größe des Moleküls von Interesse und die Stelle, an welcher es kovalent an den Viruspartikel gebunden ist, die Assemblierungsfähigkeit des modifizierten Virus nicht beeinträchtigt, wenn dieser in vitro oder in vivo kultiviert wird.
1. Reaktives Peptid
In einer Ausführungsform sieht die Erfindung das Konjugieren von Molekülen von Interesse an den Virus in einem exponierten Teil des Hüllproteins des Virus vor. Dies wird durch Konjugieren des Moleküls von Interesse an ein heterologes reaktives Peptid erzielt, welches auf der Oberfläche des Hüllproteins des Virus exprimiert wird.
Der Begriff „reaktives Peptid" bezeichnet ein Peptid, welches in der Lage ist, kovalent an das Molekül von Interesse zu binden. Der Begriff „in der Lage, kovalent zu binden" bedeutet, wenn er in Bezug auf die Wechselwirkung zwischen einem Peptid und einem Molekül von Interesse verwendet wird, dass das Peptid in Gegenwart geeigneter Bedingungen, wie beispielsweise geeigneter Salzkonzentration, chemischer Reagenzien, Temperatur, pH, etc. kovalent an das Molekül bindet.
Reaktive Peptide von Interesse können in Bezug auf ihre Größe im Bereich von 1 bis 100, stärker bevorzugt von 1 bis 50, noch stärker bevorzugt von 1 bis 20 Aminosäuren liegen. In besonderem Maße wurde festgestellt, dass mindestens 38 Aminosäurereste an der Oberfläche des beispielhaft genannten CPMV dargestellt werden können (U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087).
Obwohl keinerlei Einschränkung der Aminosäuren in dem reaktiven Peptid auf eine bestimmte Art von Aminosäurerest beabsichtigt ist, enthält das reaktive Peptid in einer bevorzugten Ausführungsform eine oder mehrere „reaktive Aminosäuren", das heißt Aminosäuren, welche in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit einem Molekül von Interesse entweder direkt oder indirekt, zum Beispiel über ein bifunktionelles Molekül, das zur Ausbildung einer kovalenten Bindung sowohl mit der reaktiven Aminosäure als auch dem Molekül von Interesse befähigt ist, auszubilden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der reaktiven Aminosäure um eine geladene Aminosäure. Eine „geladene Aminosäure" ist eine Aminosäure, welche eine positive Nettoladung oder eine negative Nettoladung enthält. „Positiv geladene Aminosäuren", welche auch als „basische Aminosäuren" bezeichnet werden, umfassen Lysin, Arginin und Histidin. „Negativ geladene Aminosäuren", welche auch als „saure Aminosäuren" bezeichnet werden, umfassen Asparaginsäure, Glutaminsäure und Cystein. Angesichts der Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Pflanzenviren in Bezug auf die Anwesenheit destabilisierender geladener Reste an der Kapsidoberfläche ist es bevorzugt, jedoch nicht erforderlich, dass die Ladungsmenge auf dem reaktiven Peptid minimiert wird. Dies kann durch Einbringen sowohl negativ geladener als auch positiv geladener Aminosäuren in das reaktive Peptid erreicht werden, so dass die negative Ladung der negativ geladenen Aminosäuren mindestens teilweise von der positiven Ladung der positiv geladenen Aminosäuren ausgeglichen (das heißt neutralisiert) wird, so dass das reaktive Peptid eine positive oder negative Nettoladung aufweist. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die negative Ladung der negativ geladenen Aminosäuren vollständig von der positiven Ladung der positiv geladenen Aminosäuren ausgeglichen, so dass das reaktive Polypeptid eine Nettoladung von null aufweist.
Die geladenen Aminosäuren des reaktiven Peptids können aufeinanderfolgen (das heißt zwei oder mehrere geladene Aminosäuren in einer Anordnung ohne dazwischen liegende ungeladene Aminosäurereste oder ungeladene Aminosäureanaloga) oder nicht aufeinanderfolgen (das heißt zwei oder mehrere geladene Aminosäuren in einer Anordnung mit mindestens einem dazwischen liegenden ungeladenen Aminosäurerest oder Aminosäureanalogon). Aufeinanderfolgende geladene Aminosäuren können aus einem [zum Beispiel Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1); Arg-Arg-Arg; Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2); oder His-His] oder mehreren (zum Beispiel Asp-Glu; Asp-Arg-Glu-Lys; Cys-His-Lys; Lys-Arg-Arg oder Lys-Arg-His oder Lys-His-His) Aminosäureresten bestehen.
Folgen die geladenen Aminosäuren aufeinander, so können sie in einer Anordnung vorliegen, in welcher die negativ geladenen Aminosäuren untereinander aufeinanderfolgen und die positiv geladenen Aminosäuren untereinander aufeinanderfolgen. Beispiele für eine derartige Sequenz umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die positiv geladenen Sequenzen Lys-Lys-Arg-His-Lys (SEQ ID NO: 3) und Arg-Arg-His-Lys (SEQ ID NO: 4), und die negativ geladenen Sequenzen Asp-Cys-Glu-Asp (SEQ ID NO: 5) und Asp-Asp-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 6). Alternativ können sie, wenn die geladenen Aminosäuren aufeinanderfolgen, in einer Anordnung vorliegen, in welcher die negativ geladenen Aminosäuren untereinander nicht aufeinanderfolgen und/oder die positiv geladenen Aminosäuren untereinander nicht aufeinanderfolgen.
Eine Sequenz von aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren kann, wie durch die Formel XnYn beschrieben wird, auf eine Sequenz von aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren folgen, wobei X eine Sequenz von aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren, Y eine Sequenz von aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, und n eine ganze Zahl von 1 bis 50, stärker bevorzugt von 1 bis 25, noch stärker bevorzugt von 1 bis 10 Aminosäuren ist. Beispiele hierfür sind die Sequenzen Asp-Lys, Glu-Arg, Glu-Cys-Lys-Arg (SEQ ID NO: 7) und Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 8).
Weiterhin kann die Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren in dem reaktiven Peptid als eine sich wiederholende Sequenz auftreten. Der Begriff „sich wiederholende Sequenz" bedeutet, wenn er in Bezug auf eine in einer Peptidsequenz enthaltene Aminosäuresequenz verwendet wird, dass sich die Aminosäuresequenz 1- bis 2-mal, stärker bevorzugt 1- bis 10-mal, und am stärksten bevorzugt 1- bis 100-mal in der Peptidsequenz wiederholt. Die Wiederholungen der Peptidsequenz können nicht aufeinanderfolgen oder aufeinanderfolgen. Der Begriff „nicht aufeinanderfolgende Wiederholung" bedeutet, wenn er in Bezug auf eine sich wiederholende Peptidsequenz verwendet wird, dass mindestens eine Aminosäure (oder ein Aminosäureanalogon) zwischen die sich wiederholenden Sequenzen platziert wird. Der Begriff „aufeinanderfolgende Wiederholung" bedeutet, wenn er in Bezug auf eine sich wiederholende Peptidsequenz verwendet wird, dass keine dazwischen liegenden Aminosäuren (oder Aminosäureanaloga) zwischen den sich wiederholenden Sequenzen vorhanden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das reaktive Peptid eine sich wiederholende Sequenz von aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren sowie eine sich wiederholende Sequenz von aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, wobei die Gesamtzahl an positiv geladenen Aminosäureresten in der Sequenz von aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren die gleiche ist wie die Gesamtzahl an negativ geladenen Aminosäureresten in der Sequenz von aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform folgt die Sequenz von aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren auf die Sequenz von aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren. Beispiele hierfür sind die Sequenzen Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 9), Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys-Arg (SEQ ID NO: 10), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 11), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 12), Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 13), Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg (SEQ ID NO: 14), Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His (SEQ ID NO: 15).
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das reaktive Peptid nicht aufeinanderfolgende negativ geladene Aminosäuren und nicht aufeinanderfolgende positiv geladene Aminosäuren enthält. In anderen Worten können zwischen den geladenen Aminosäuren (ob negativ oder positiv geladen) Aminosäuren (oder Aminosäureanaloga) angeordnet sein, welche entweder ungeladen (zum Beispiel Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Methionin, Prolin, Asparagin und Glutamin) sind, oder welche eine unterschiedliche Ladung aufweisen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform enthält das reaktive Peptid ferner eine Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren, wobei die Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren entweder aus aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren oder aus aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren besteht. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz beispielsweise eine Sequenz der allgemeinen Formel Asp-Glu_n-Gly-Lys_n-Asp-Glu_n (SEQ ID NO: 16), Asp-Glu_n-Gly-Lys_2n-Asp-Glu_n (SEQ ID NO: 17), Lys-Arg_n-Ser-Gly-Asp-Glu-Asp (SEQ ID NO: 18), Lys-Arg_n-His-Pro-Met-Asp_n-Glu (SEQ ID NO: 19), wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz Asp-Glu-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Asp-Glu (SEQ ID NO: 20).
In Übereinstimmung mit den vorstehenden Lehren und jenen der U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087 kann ein beliebiges reaktives heterologes Peptid gentechnisch in einen Pflanzenviruspartikel eingebaut werden. Insbesondere kann das heterologe reaktive Peptid in einem exponierten Teil des Hüllproteins des Pflanzenvirus exprimiert werden. Es ist bevorzugt, dass das reaktive Peptid in den Pflanzenviruspartikel insertiert wird, so dass die reaktiven Aminosäuren auf dem Hüllprotein des Pflanzenvirus, stärker bevorzugt von der Struktur des Kapsids aus nach außen ragend, dargestellt werden, wodurch sich der Zugang chemischer Liganden und Reagenzien zu den reaktiven Aminosäuren des reaktiven Peptids erleichtert. In einer Ausführungsform wird das reaktive Peptid zwischen Alanin 22 und Prolin 23 des kleinen Hüllproteins (VP-S) des Kuherbsen-Mosaikvirus insertiert.
2. Konjugieren eines Moleküls von Interesse an ein reaktives Peptid
Ein beliebiges Molekül von Interesse kann an ein reaktives Peptid (ob Wildtyp oder heterolog), welches mittels der erfindungsgemäßen Pflanzenviren unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren präsentiert wird, konjugiert werden. Verfahren zum Konjugieren von Polysacchariden an Peptide umfassen beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Kupplung über Alpha- oder Epsilon-Aminogruppen an NaIO₄-aktiviertes Oligosaccharid [Bocher et al. (1997) J. Immunol. Methods 27: 191–202], die Verwendung von Quadratsäurediester (1,2-Diethoxycyclobuten-3,4-dion) als Kupplungsreagenz [Tietze et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2: 148–153], die Kupplung über einen Peptidlinker, wobei das Polysaccharid ein reduzierendes Ende aufweist und frei von Carboxylgruppen ist (U.S. Patent Nr. 5,342,770), die Kupplung mit einem aus humanem Hitzeschockprotein hsp65 stammenden synthetischen Peptidträger (U.S. Patent Nr. 5,736,146), und die Verwendung der Verfahren des U.S. Patents Nr. 4,639,512. Diese Verfahren können auf Polysaccharid-Antigene, umfassend beispielsweise das Oberflächenantigen von Staphylococcus epidermidis (U.S. Patent Nr. 5,961,975), angewendet werden.
Verfahren zum Konjugieren von Glykoproteinen an Peptide über die Kohlenhydrat-Einheiten des Glykoproteins wurden beschrieben, wobei diese beispielsweise die Erzeugung reaktiver Aldehyde in den Kohlenhydrat-Einheiten durch milde Oxidation mit Natriumperiodat und anschließende Umsetzung mit Peroxidasehydrazid [D'Alessandro et al. (1998) Clin. Chim. Acta 22: 189–197], die Verwendung des heterobifunktionellen Vernetzungsreagenz 4-(4-N-Maleinimidophenyl)-buttersäurehydrazid (MPBH), welches eine Kupplung von aus Kohlenhydraten stammenden Aldehyden an freie Thiole gestattet [Chamow et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15916–15922], das organische cyanylierende Reagenz 1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) zur Aktivierung von Polysacchariden vor Kupplung an Peptide unter milden alkalischen Bedingungen (pH 7–9) (Lees et al. (1996) Vaccine 14: 190–198], eine Carboxylaktivierung oder Hydroxylaktivierung des Polysaccharids [Devi et al. (1995) Infect. Immun. 63: 2906–2911], eine Alkalibehandlung des Polysaccharids vor Kupplung an das Peptid [Kabir (1987) J. Med. Microbiol. 23: 9–18], und die Verfahren des U.S. Patents Nr. 4,639,512 verwenden. Diese Verfahren können beispielsweise zum Konjugieren von Glykoprotein-Antigenen [beispielhaft durch das humane Immunschwächevirus Typ 2 (HIV-2)-Antigen (U.S. Patent Nr. 6,037,165) und das P-Glykoprotein- Zelloberflächenantigen (U.S. Patent Nr. 4,837,306) vertreten] an den Pflanzenvirus verwendet werden.
Ferner kann entweder die Protein- oder Polysaccharid-Einheit eines Glykoproteins dazu verwendet werden, das Glykoprotein unter Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik, welche zum Konjugieren von Glykoproteinen an Glykoproteine verwendet wurden, kovalent mit reaktiven Peptiden auf dem Virus zu verknüpfen, wie beispielsweise durch Fotoaktivierung an ein Azidobenzoyl-Derivat eines der Glykoproteine [Rathnam et al. (1980) Biochim. Biophys. Acta 624: 436–442].
Verfahren zum Konjugieren von Proteinen an Proteine sind hierin beschrieben (das heißt Konjugieren eines reaktiven heterologen Peptids, welches einen Cysteinrest enthält, an ein Protein von Interesse, das mit n-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) aktiviert wurde; Beispiel 11). Es sind ferner verschiedene zusätzliche Verfahren bekannt, umfassend das Verfahren des Konjugierens von SL-Protein an Proteinallergene [Jahn-Schmid et al. (1996) Immunotechnology 2: 103], die Kupplung mit einem aus humanem Hitzeschockprotein hsp65 stammenden synthetischen Peptidträger (U.S. Patent Nr. 5,736,146), die zum Konjugieren von Peptiden an Antikörper verwendeten Verfahren (U.S. Patente Nr. 5,194,254; 4,950,480), die zum Konjugieren von Peptiden an Insulinfragmente verwendeten Verfahren (U.S. Patent Nr. 5,442,043), die Verfahren des U.S. Patents Nr. 4,639,512, sowie das Verfahren des Konjugierens des zyklischen Dekapeptid-Antibiotikums Polymyxin B an einen IgG-Träger unter Verwendung einer EDAC [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid]-vermittelten Amidbildung [Drabick et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 583–588].
Ansätze zum Konjugieren von Nukleinsäuren an Proteine sind im Fachbereich ebenfalls bekannt, wie beispielsweise jene, welche in den U.S. Patenten Nr. 5,574,142; 6,117,631; 6,110,687 beschrieben sind.
Verfahren zum Konjugieren von Lipiden an Peptide wurden im Fachbereich beschrieben und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung von reduktiver Aminierung und einer Etherverknüpfung, welche ein sekundäres oder tertiäres Amin enthält (U.S. Patent Nr. 6,071,532), die Verfahren des U.S. Patents Nr. 4,639,512, die zur kovalenten Kupplung von Peptiden an unilamellare Liposomen verwendeten Verfahren [Friede et al. (1994) Vaccine 12: 791–797], die Kupplung von humanem Serumalbumin an Liposomen unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagenzes N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) [Kamps et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1278: 183–190], die Kupplung von Fab'-Antikörperfragmenten an Liposomen unter Verwendung eines Phospholipid-Poly(ethylenglykol)-Maleinimid-Ankers [Shahinian et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239: 157–167], und die Kupplung des CTL-Epitops von Plasmodium an Palmitinsäure über Cystein-Serin-Aminosäurespacer [Verheul et al. (1995) J. Immunol. Methods 182: 219–226].
G. Verabreichen von Zusammensetzungen an Tiere
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen modifizierten Viren zur Präsentation antigener Moleküle als immunogene Komponente von Vakzinen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren stellen im Rahmen der Konzipierung von Vakzinen ein besonders attraktives Präsentationssystem für Epitope bereit, da sie das antigene Molekül auf dem Pflanzenviruspartikel derart präsentieren, dass es vom Immunsystem leicht erkannt wird, beispielsweise durch Lokalisierung in einem exponierten Teil des Hüllproteins des Virus. Die erfindungsgemäßen modifizierten Viren können einem Empfängertier auf einem beliebigen gewünschten Weg verabreicht werden (zum Beispiel intranasal, oral, parenteral, subkutan, intravenös, subkutan, intrathekal, intraperitoneal, intramuskulär, etc.).
Obwohl die hierin präsentierten Daten belegen, dass die erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren ihre Wirkung auf die zellulären und/oder humoralen Komponenten des Immunsystems ohne Rücksicht auf die Abwesenheit oder Gegenwart fremder immunmodulatorischer Mittel (zum Beispiel Hilfsmittel, Cytokine, etc.) ausüben, ist die Erfindung ausdrücklich nicht auf eine Anwendung der Erfindung in Abwesenheit dieser Mittel beschränkt. Da beispielsweise Hilfsmittel eine Erhöhung der Art einer Immunantwort sowie des jeweiligen Signalweges der resultierenden Immunreaktion bewirken, kann von einem Fachmann die Einbeziehung von Hilfsmitteln in Kombination mit den erfindungsgemäßen modifizierten Viren unabhängig vom Einfluss, welchen das Hilfsmittel auf den ausgelösten T-Helferzell-Signalweg ausübt, als wünschenswert erachtet werden.
Obwohl die Erfindung unter Verwendung der beispielhaft genannten Hilfsmittel Alaun, FCA/FICA und QS-21 veranschaulicht wurde, ist es ausdrücklich vorgesehen, dass die Erfindung nicht auf diese Hilfsmittel beschränkt ist. Vielmehr kann ein beliebiges Hilfsmittel von Interesse umfasst sein, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, jene, welche ein Emulsionssystem und ein synthetisches Harzmaterial, welches zur Komplexbildung mit Antigenen, Hormonen, Arzneimitteln und Serum befähigt ist, enthalten (U.S. Patent Nr. 3,919,411), Copolymere von Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymeren (U.S. Patent Nr. 6,086,899), 1H-Imidazo[4,5-C-chinolin]-4-amin und dessen Derivate (U.S. Patent Nr. 6,083,505), das mutierte hitzelabile Enterotoxin Holotoxin aus Escherichia coli (U.S. Patent Nr. 6,033,673), Formyl-Methionyl-Peptid (fMLP) (U.S. Patent Nr. 6,017,537), ADP-ribosylierendes Exotoxin, welches insbesondere für ein transkutane Verabreichung geeignet ist (U.S. Patent Nr. 5,980,898), Interleukin-12 (U.S. Patent Nr. 5,976,539), Polydimethylsiloxan und ein Komplexemulgator (U.S. Patent Nr. 5,904,925), Hemozoin oder β-Hematin (U.S. Patent Nr. 5,849,307), Glucan aus Saccharomyces cervisiae (U.S. Patent Nr. 5,804,199), Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel, Lecithin und Polyalphaolefin (U.S. Patent Nr. 5,232,690), Polyoxyethylen-Sorbitanmonoester (PS), welche für eine topische Verabreichung von Antigenen über Schleimhäute von Nutzen sind (U.S. Patent Nr. 5,942,237), sowie transdermale Liposomen (U.S. Patent Nr. 5,910,306). Darüber hinaus sind ferner Verfahren im Fachbereich bekannt, welche die kristallinen Oberflächenschichten (SL) von Bakterien als Hilfsmittel verwenden, indem Antigene an SL konjugiert werden [Jahn-Schmid et al. (1997) International Immunology 9: 1867–1874].
Ferner können die erfindungsgemäßen modifizierten Viren, obwohl sie für ihre Wirksamkeit keiner Cytokine oder Arzneimittelträger bedürfen, gemeinsam mit Cytokinen oder Arzneimittelträgern von Interesse verabreicht werden. Beispiele für Cytokine umfassen, ohne Einschränkung, Interleukin-1α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-11, Interferon-γ, Interferon-γ, Tumornekrosefaktor, die TGF-β-Familie, die Inhibin-Familie, die DPP/VG1-Familie, die Mullerian Inhibiting Substance-Familie, Leukämie inhibierender Faktor, Oncostatin M und ciliärer neurotropher Faktor.
Pharmazeutische Arzneimittelträger, welche in Kombination mit den erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren Anwendung finden können, umfassen illustrativ den auf mikrokristalliner Cellulose basierenden Arzneimittelträger, welcher eine verbesserte Kompressibilität aufweist (U.S. Patent Nr. 6,103,219), Galactomannan-Hydrokolloid, welches zur Erhöhung des Härtegrades einer Guargummi enthaltenden pharmazeutischen Tablette geeignet ist (U.S. Patent Nr. 6,063,402), vernetzte Amylose, welche als Arzneimittelträger für eine langsame Freisetzung von Wirkstoffen aus Tabletten oder Pellets von Nutzen ist (U.S. Patent Nr. 5,807,575), enzymatisch entzweigte Stärken, welche zu einer Tablette verpressbar sind (U.S. Patent Nr. 5,468,286), sowie Lipidvesikel-Arzneimittelträger, welche für eine nicht-irritierende Abgabe an die Nasenschleimhaut in sprühbarer oder tropfbarer Form hergestellt werden können (U.S. Patent Nr. 5,200,393).
H. Erhöhung einer TH1-artigen Antwort
Die erfindungsgemäßen modifizierten Viren finden insbesondere zur Erhöhung einer TH1-Antwort auf ein Molekül von Interesse Anwendung, was die erfindungsgemäßen modifizierten Viren insbesondere als Träger für Moleküle attraktiv macht, welche beispielsweise infektiöse Erkrankungen, Krebs und Allergien als Angriffsziel haben.
Der Begriff „Erhöhen des Ausmaßes einer TH1-Antwort" und „erhöhtes Ausmaß einer TH1-Antwort" bedeutet, wenn er in Bezug auf die Reaktion eines Tieres auf einen ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus verwendet wird, dass das Ausmaß einer beliebigen zellulären und/oder humoralen Antwort oder mehrerer zellulärer und/oder humoraler Antworten, welche bei Stimulierung durch das Molekül oder den Virus von TH1-Lymphozyten erzeugt wird/werden, verglichen mit der entsprechenden Antwort in einem Kontrolltier durch eine beliebige statistisch signifikante Menge erhöht wird. Insbesondere bezeichnet ein erhöhtes Ausmaß einer TH1-Antwort in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, (a) eine erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin, (b) eine erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Cytokin und/oder (c) ein erhöhtes Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen.
Der Begriff „erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bezeichnet eine Erhöhung, bevorzugt eine Erhöhung von mindestens 0.1 %, stärker bevorzugt von 0.1 % bis 50 %, noch stärker bevorzugt von 0.1 % bis 20 %, und am stärksten bevorzugt von 0.1 % bis 10% der Menge einer oder mehrerer TH1-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG_2a, Maus-IgG_2b, humanes IgG₁, humanes IgG₃, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH1-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse. So wird beispielsweise eine 5%-ige Erhöhung der Menge an molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2a, bezogen auf die Gesamtmenge an Maus-IgG_2a in der gleichen Maus, als eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-Antwort in der Maus angesehen. Gleichermaßen wird eine 1 %-ige Erhöhung der Menge an molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2b, bezogen auf die Gesamtmenge an Maus-IgG_2b in der gleichen Maus, als eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-Antwort in der Maus angesehen (siehe beispielsweise Tabelle 4).
Alternativ bezeichnet der Begriff „erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, eine Erhöhung, bevorzugt eine mindestens 2-fache, stärker bevorzugt 2- bis 100000-fache, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fache, und am stärksten bevorzugt 2- bis 2000-fache Erhöhung des Mengenverhältnisses einer oder mehrerer TH1-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG_2a, Maus-IgG_2b, humanes IgG₁, humanes IgG₃, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH1-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse einerseits, verglichen mit dem Verhältnis einer oder mehrerer TH2-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG₁, Maus-IgG₃, humanes IgG₂, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder (bzw.) für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH2-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse andererseits. So wird beispielsweise eine 1000-fache Erhöhung des Verhältnisses von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2a:Gesamt-IgG_2a, bezogen auf das Verhältnis von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₁:Gesamt-IgG₁ in der gleichen Maus, als eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-Antwort in der Maus angesehen. Gleichermaßen wird eine 2000-fache Erhöhung des Verhältnisses von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2b:Gesamt-IgG_2b, bezogen auf das Verhältnis von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₃:Gesamt-IgG₃ in der gleichen Maus, als eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-Antwort in der Maus angesehen (siehe beispielsweise Tabelle 4).
In noch einer anderen Alternative bezeichnet der Begriff „erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, eine Erhöhung, bevorzugt eine mindestens 2-fache, stärker bevorzugt eine 2- bis 10000-fache, noch stärker bevorzugt eine 2- bis 1000-fache, noch stärker bevorzugt eine 2- bis 100-fache, und am stärksten bevorzugt eine 2- bis 50-fache Erhöhung des geometrisch mittleren Endpunkttiters von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) TH1-assoziierten Immunglobulinen verglichen mit dem geometrisch mittleren Endpunkttiter der molekülspezifischen (und/oder virusspezifischen) TH1-assoziierten Immunglobuline in einem Kontrolltier. Der Begriff „Endpunkttiter" ist jene Verdünnung eines Antikörpers, welche für ein vorgegebenes Molekül spezifisch ist und welche die höchste Verdünnung des Antikörpers darstellt, die eine detektierbare Reaktion (zum Beispiel mittels ELISA) hervorruft, wenn dieser mit dem Molekül kombiniert wird. So wird beispielsweise eine 20-fache Erhöhung des geometrisch mittleren Endpunkttiters von molekülspezifischem Maus-IgG_2a in einer behandelten Maus, verglichen mit dem geometrisch mittleren Endpunkttiter von molekülspezifischem Maus-IgG_2a in einer Kontrollmaus, als eine erhöhte Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin angesehen (siehe beispielsweise Tabellen 2 und 3).
Verfahren zur Quantifizierung der von einzelnen B-Zellen (sowie von mit B-Zellen fusionierten Zellen, wie beispielsweise Hybridomen) produzierten Mengen an Immunglobulin werden auf einfache Weise unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien und einer Vielzahl von Tests, umfassend die hierin beschriebenen wie beispielsweise ELISA und ELISPOT, in vitro verwirklicht. Siehe Segwick et al. (1983) J. Immunol. Methods 57: 301–309. Siehe ferner Mazer et al. (1991) J. Allergy Clin. Immunol. 88: 235–243.
In noch einer weiteren Alternative bezeichnet ein „erhöhtes Ausmaß einer TH1-Antwort" eine Erhöhung der Menge an TH1-assoziiertem Cytokin. Der Begriff „Erhöhung der Menge an TH1-assoziiertem Cytokin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bedeutet, dass die Menge eines von den TH1-Zellen des Tieres produzierten TH1-assoziierten Cytokins in einem behandelten Tier, bezogen auf die Menge eines von den T-Zellen eines Kontrolltieres produzierten TH1-assoziierten Cytokins, bevorzugt mindestens 2-fach, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fach, noch stärker bevorzugt 2- bis 1000-fach, und am stärksten bevorzugt 1- bis 100-fach erhöht ist. Die Menge an Cytokinen kann beispielsweise unter Verwendung von ELISA bestimmt werden, wie hierin unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien beschrieben ist (zum Beispiel Tabelle 6).
In einer weiteren Alternative bezeichnet ein „erhöhtes Ausmaß einer TH1-Antwort" ein erhöhtes Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen. Der Begriff „erhöhtes Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bedeutet, dass die Anzahl der von dem Tier produzierten proliferierenden TH1-Zellen, bezogen auf die Anzahl der von einem Kontrolltier produzierten proliferierenden TH1-Zellen, bevorzugt mindestens 2-fach, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fach, stärker bevorzugt 2- bis 1000-fach, und am stärksten bevorzugt 1- bis 100-fach erhöht ist. Die Anzahl an proliferierenden TH1-Zellen kann unter Verwendung von Verfahren wie jenen, welche hierin beschrieben sind, bestimmt werden, wobei deren TH1-Typ durch Untersuchung von Überständen dieser Zellen auf die Anwesenheit von TH1-assoziierten Cytokinen bestimmt werden kann (zum Beispiel Tabelle 6).
In einer Ausführungsform ist es vorgesehen, dass eine therapeutische Menge der erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren an ein Subjekt verabreicht wird.
Die hierin präsentierten Daten belegen, dass eine Immunisierung von Mäusen mit den beispielhaft genannten chimären Viruspartikeln (CVPs) von CPMV in erster Linie CPMV- und peptidspezifische IgG_2a und IgG_2b-Antikörper in Seren erzeugt, wie mittels ELISA bestimmt. Eine Enzym-verknüpfte Immunspot (ELISPOT)-Analyse bestätigte die Dominanz der Antikörperantworten in Richtung des TH1-Typs, was belegt, dass die CVPs überwiegend CPMV- und peptidspezifische IgG_2a- und IgG_2b-produzierende B-Zellen in der Milz aktivieren können. Im Gegensatz hierzu wurden lediglich geringe Mengen an CPMV- und peptidspezifischen IgG₁- und IgG₃-Antikörper produzierenden B-Zellen (Produkte des TH2-Immunsignalweges), sofern überhaupt, detektiert.
Darüber hinaus offenbart die Erfindung, dass Milzzellen (T-Zellen) aus CVP-immunisierten Mäusen in vitro zu CPMV proliferierten, wobei hohe Mengen an IFN-γ (ein TH1-assoziiertes Cytokin), jedoch keine detektierbaren Mengen an IL-4 (ein TH2-assoziiertes Cytokin) produziert wurden. Dies lässt darauf schließen, dass die CVPs in dem viralen Träger eine TH1-artige Antwort hervorrufen, wobei der virale Träger seinerseits den Isotyp der peptidspezifischen B-Zell-Antworten steuert. Die Dominanz der Antwort in Richtung des TH1-Typs wurde durch die Art des Antigens, den genetischen Hintergrund des geimpften Individuums, die Wahl des Hilfsmittels, oder die Dosis oder das Behandlungsschema der verabreichten Dosen an CVPs nicht beeinflusst.
Obwohl die hierin präsentierten Daten belegen, dass sich die Menge an TH1-assoziiertem Cytokin (zum Beispiel IFN-γ) in einer bevorzugten Ausführungsform in Reaktion auf eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen modifizierten Viren ohne Veränderung der Menge an TH2-assoziiertem Cytokin (zum Beispiel IL-4) erhöhte, ist es ausdrücklich vorgesehen, dass die Erfindung nicht auf eine Erhöhung von TH1-assoziiertem Cytokin bei vollständiger Abwesenheit detektierbarer Mengen an TH2-assoziiertem Cytokin beschränkt ist. Vielmehr umfasst die Erfindung im Rahmen ihres Schutzumfangs ausdrücklich eine Erhöhung der Menge an TH1-assoziiertem Cytokin ungeachtet der Veränderung (sofern vorhanden) der Menge an TH2-assoziiertem Cytokin.
Die vorstehenden Daten belegen die Fähigkeit der erfindungsgemäßen modifizierten Viren, welche Säugerzellen nicht infizieren oder sich in diesen replizieren, die Immunantwort auf exprimierte Peptide in Richtung des TH1-Effektortyps zu lenken, ohne dabei fremder immunmodulatorischer Mittel, wie beispielsweise Hilfsmittel oder Cytokinen, zu bedürfen, was einen Vorteil der erfindungsgemäßen Pflanzenviren als Vakzinträgersystem darstellt.
Anders ausgedrückt verhalten sich die hierin bereitgestellten modifizierten Viren im Rahmen einer Impfung von Säugern wie inaktive Viren. Obwohl im Stand der Technik prognostiziert wurde, dass inaktive Viren eine TH2-Antwort auslösen, rufen die hierin bereitgestellten Viren überraschenderweise eine TH1-artige Antwort hervor.
I. Verringern einer TH2-artigen Antwort
Die erfindungsgemäßen modifizierten Viren sind in Anwendungen von Nutzen, in welchen es erwünscht ist, eine TH2-Antwort auf ein Molekül von Interesse zu verringern. So kann beispielsweise, wenn die Verabreichung eines Moleküls (zum Beispiel eines bakteriellen Antigens) an ein Tier bekanntermaßen eine TH2-Antwort (sei es partiell, überwiegend oder ausschließlich) erzeugt, die TH2-Antwort in einem anderen Tier verringert werden, indem das Molekül dem anderen Tier im Rahmen eines hierin beschriebenen modifizierten Pflanzenvirus präsentiert wird.
Die Begriffe „partielle TH1-Antwort" und „partielle TH2-Antwort" bedeuten, dass das Tier (a) TH1- und TH2-assoziiertes Immunglobulin, (b) TH1- und TH2-assoziiertes Cytokin und/oder (c) eine Proliferation von TH1- und TH2-Zellen aufweist.
Eine „überwiegende TH2-Antwort" stellt eine partielle TH2-Antwort dar, in welcher die Menge/das Ausmaß von einem oder mehreren von TH2-assoziiertem Immunglobulin, TH2-assoziiertem Cytokin und Proliferation von TH2-Zellen statistisch höher ist als die Menge/das Ausmaß von TH1-assoziiertem Immunglobulin, TH1-assoziiertem Cytokin bzw. der Proliferation von TH1-Zellen. Im Gegensatz hierzu stellt eine „überwiegende TH1-Antwort" eine partielle TH1-Antwort dar, in welcher die Menge/das Ausmaß von einem oder mehreren von TH1-assoziiertem Immunglobulin, TH1-assoziiertem Cytokin und Proliferation von TH1-Zellen statistisch höher ist als die Menge/das Ausmaß von TH2-assoziiertem Immunglobulin, TH2-assoziiertem Cytokin bzw. der Proliferation von TH2-Zellen.
Eine „ausschließliche TH2-Antwort" stellt eine überwiegende TH2-Antwort dar, in welcher das Tier bei vollständiger Abwesenheit von TH1-assoziiertem Immunglobulin, TH1-assoziiertem Cytokin und einer Proliferation von TH1-Zellen TH2-assoziiertes Immunglobulin, TH2-assoziiertes Cytokin und eine Proliferation von TH2-Zellen aufweist. Umgekehrt stellt eine „ausschließliche TH1-Antwort" eine überwiegende TH1-Antwort dar, in welcher das Tier bei vollständiger Abwesenheit von TH2-assoziiertem Immunglobulin, TH2-assoziiertem Cytokin und einer Proliferation von TH2-Zellen TH1-assoziiertes Immunglobulin, TH1-assoziiertes Cytokin und eine Proliferation von TH1-Zellen aufweist.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen modifizierten Viren auch dort von Nutzen, wo es erwünscht ist, bestehendes TH2 in einem Tier zu verringern. Dies ist insbesondere in Anwendungen von Nutzen, in welchen Booster-Vakzinationen einer Primärvakzination folgen, in der ein Hilfsmittel verwendet wurde, welches eine unerwünschte partielle, überwiegende oder ausschließliche TH2-Antwort hervorruft. Im Stand der Technik wurde bemerkt, dass eine bereits existierende TH2-Antwort nicht durch eine Boosterapplikation von Hilfsmittel überwunden werden kann, welches ansonsten, wenn es im Rahmen der Primärvakzination verabreicht wird, zu einer TH1-Antwort führen würde. Obwohl die Verwendung von Quil-A als Hilfsmittel zur Induktion von TH1-Antworten in Mäusen führte, wenn diese mit HPV 16 E7-Protein immunisiert worden waren, wurde dieser Effekt insbesondere nicht beobachtet, wenn eine bereits existierende TH2-Antwort auf E7 vorhanden war (induziert durch Verwendung von Algammulin als Hilfsmittel) [Fernando et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47: 459]. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass in den Fällen, in welchen die Primärvakzination von Menschen mit Alaun durchgeführt wurde (welches das einzige für eine Anwendung beim Menschen zugelassene Hilfsmittel darstellt und TH2-Antworten induziert), die resultierende unerwünschte TH2-Antwort, welche unerwünschte allergische Reaktionen vermittelt, vordem möglicherweise nicht reversibel ist. Obwohl aktivierte TH2-Zellen, im Gegensatz zu TH1-Zellen, stabil sind und nicht in Richtung des TH1-Phänotyps gelenkt werden können [Perez et al. (1995) Intl. Immunol. 7: 869], wurde gezeigt, dass die Verwendung des an ein bakterielles Protein konjugierten spezifischen Allergens in humanen T-Zelllinien und in Konen, welche aus Allergiepatienten erzeugt worden waren, zur Expansion allergenspezifischer TH1/THO-Zellen führt, während das nichtkonjugierte Allergen eine Expansion von TH2-Zellen bewirkte [Jahn-Schmid et al. (1997) Intl. Immunol. 9: 1867]. Somit kann die immunmodulatorische Dominanz der CPMV-Präsentation von Immunogenen (umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Allergene) ausgedehnt werden, um die Verschiebung einer etablierten Immunantwort von einem schädlichen TH2-Signalweg zu einem in stärkerem Maße vorteilhaften TH1-Signalweg zu bewirken. Somit stellt der dominante immunmodulatorische Effekt der erfindungsgemäßen modifizierten Pflanzenviren, wenn er als Präsentationsplattform für ein Antigen verwendet wird, ein Mittel bereit, um die bestehende TH2-Antwort auf jenes Antigen, welche durch Gegenwart eines bestimmten Hilfsmittels initiiert wird, zu überwinden.
Der Begriff „Verringern des Ausmaßes einer TH2-Antwort" und „verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort" bedeutet, wenn er in Bezug auf die Reaktion eines Tieres auf einen ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus verwendet wird, dass eine beliebige zelluläre und/oder humorale Antwort oder mehrere zelluläre und/oder humorale Antworten, welche bei Stimulierung durch das Molekül oder den Virus von TH2-Lymphozyten erzeugt wird/werden, verglichen mit der entsprechenden Antwort in einem Kontrolltier durch eine beliebige statistisch signifikante Menge verringert wird. Insbesondere bezeichnet ein verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, (a) eine verringerte Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin, (b) eine verringerte Menge an TH2-assoziiertem Cytokin und/oder (c) ein verringertes Ausmaß der Proliferation von TH2-Zellen.
Der Begriff „verringerte Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bezeichnet eine Verringerung von bevorzugt 0.1 % bis 100%, stärker bevorzugt von 0.1 % bis 80%, noch stärker bevorzugt von 0.1 % bis 60 % der Menge einer oder mehrerer TH2-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG₁, Maus-IgG₃, humanes IgG₂, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH2-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse. So wird beispielsweise eine 10%-ige Verringerung der Menge an molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₁, bezogen auf die Gesamtmenge an Maus-IgG₁ in der gleichen Maus, als verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort in der Maus angesehen. Gleichermaßen wird eine 0.1 %-ige Verringerung der Menge an molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₃, bezogen auf die Gesamtmenge an Maus-IgG₃ in der gleichen Maus, als verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort in der Maus angesehen.
Alternativ bezeichnet der Begriff „verringerte Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, eine bevorzugt mindestens 2-fache, stärker bevorzugt 2- bis 100000-fache, noch stärker bevorzugt 2- bis 10000-fache, und am stärksten bevorzugt 2- bis 2000-fache Verringerung des Verhältnisses einer oder mehrerer TH2-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG₁, Maus-IgG₃, humanes IgG₂, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH2-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse einerseits, verglichen mit dem Mengenverhältnis einer oder mehrerer TH1-assoziierter Immunglobulin-Subklassen (zum Beispiel Maus-IgG_2a, Maus-IgG_2b, humanes IgG₁, humanes IgG₃, etc.), welche entweder für das Molekül von Interesse oder (bzw.) für den Virus spezifisch ist, bezogen auf die Gesamtmenge an TH2-assoziiertem Immunglobulin der gleichen Subklasse andererseits. So wird beispielsweise eine 1000-fache Verringerung des Verhältnisses von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₁:Gesamt-IgG₁, bezogen auf das Verhältnis von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2a:Gesamt-IgG_2a in der gleichen Maus, als verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort in der Maus angesehen. Gleichermaßen wird eine 2000-fache Verringerung des Verhältnisses von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG₃:Gesamt-IgG₃, bezogen auf das Verhältnis von molekülspezifischem (und/oder virusspezifischem) Maus-IgG_2a:Gesamt-IgG_2a in der Maus, als verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort in der Maus angesehen.
In einer weiteren Alternative bezeichnet der Begriff „verringerte Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, eine bevorzugt mindestens 2-fache, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fache, noch stärker bevorzugt 2- bis 1000-fache, und noch stärker bevorzugt 2- bis 100-fache Verringerung des geometrisch mittleren Endpunkttiters von molekülspezifischen (und/oder virusspezifischen) TH2-assoziierten Immunglobulinen verglichen mit dem geometrisch mittleren Endpunkttiter der molekülspezifischen (und/oder virusspezifischen) TH2-assoziierten Immunglobuline in einem Kontrolltier. So wird beispielsweise eine 2-fache Verringerung des geometrisch mittleren Endpunkttiters von molekülspezifischem Maus-IgG₁ in einer behandelten Maus, verglichen mit dem geometrisch mittleren Endpunkttiter von molekülspezifischem Maus-IgG₁ in einer Kontrollmaus, als verringerte Menge an TH2-assoziiertem Immunglobulin angesehen.
In noch einer anderen Alternative bezeichnet ein „verringertes Ausamß einer TH2-Antwort" eine verringerte Menge an TH2-assoziiertem Cytokin. Der Begriff „verringerte Menge an TH2-assoziiertem Cytokin" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bedeutet, dass die Menge eines von den TH2-Zellen des Tieres produzierten TH2-assoziierten Cytokins in einem behandelten Tier, bezogen auf die Menge eines von den T-Zellen eines Kontrolltieres produzierten TH2-assoziierten Cytokins, bevorzugt mindestens 2-fach, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fach, noch stärker bevorzugt 2- bis 1000-fach, und am stärksten bevorzugt 1- bis 100-fach verringert ist.
In einer weiteren Alternative bezeichnet ein „verringertes Ausmaß einer TH2-Antwort" ein verringertes Ausmaß der Proliferation von TH2-Zellen. Der Begriff „verringertes Ausmaß der Proliferation von TH2-Zellen" in einem Tier, welches einem ein Molekül von Interesse enthaltenden modifizierten Virus ausgesetzt ist, bedeutet, dass die Anzahl der von dem Tier produzierten proliferierenden TH2-Zellen in dem behandelten Tier, bezogen auf die Anzahl der von einem Kontrolltier produzierten proliferierenden T-Zellen, bevorzugt mindestens 2-fach, stärker bevorzugt 2- bis 10000-fach, stärker bevorzugt 2- bis 1000-fach, und am stärksten bevorzugt 1- bis 100-fach verringert ist. Die Anzahl an proliferierenden T-Zellen kann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise jenen, welche hierin beschrieben sind, bestimmt werden, wobei deren TH2-Typ durch Untersuchung von Überständen dieser Zellen auf die Anwesenheit von TH2-assoziierten Cytokinen bestimmt werden kann.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Einschränkung des Schutzumfangs hiervon auszulegen.
Sofern nicht anderweitig angegeben, stimmen die experimentellen Verfahren und Materialien in jedem der nachfolgenden Beispiele mit den nachstehend aufgelisteten allgemeinen Beschreibungen überein.
Versuchstiere
Weibliche C57BL/6 (H-2^b)-, BALB/c (H-2^d)-, NIH (H-2^q)-, DBA/1 (H-2^s)- und Biozzi AB/H (H-2^dql)-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden im Department für Pathologie, Universität Cambridge, Vereinigtes Königreich, untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der United Kingdom Home Office für Tiere in der medizinischen Forschung durchgeführt.
Konstruktion, Fortpflanzung und Reinigung von CVPs
Die zur Expression fremder Peptide sowohl auf der S- als auch der L-Untereinheit von CPMV verwendeten Verfahren waren jene, welche in Porta et al. (1994) Virology 202: 949 beschrieben sind. Die verschiedenen spezifischen CVPs, welche im Rahmen dieser Untersuchung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1: zur Immunisierung verwendete CVPs
ELISA zur Bestimmung der peptidspezifischen Konzentration sowie der Gesamtkonzentration an Isotyp
In einigen Fällen wurden die in den nachfolgenden Beispielen angegebenen OD₄₀₅-Werte in Mikrogramm an Antikörper umgerechnet. Wo dies der Fall war, wurde das nachfolgende Verfahren als Grundlage für die Berechnung verwendet: Vertiefungen wurden entweder mit Ziege-anti-Maus-IgG (Southern Biotechnologies Inc., USA) oder mit Peptid beschichtet. Verdünnungsreihen mit bekannter Konzentration eines IgG_2a-kappa-mAb (Sigma, UK) wurden den mit anti-Maus-IgG beschichteten Vertiefungen hinzugefügt, und es wurden den entweder mit anti-Maus-IgG oder mit Peptid beschichteten Vertiefungen verdünnte Lösungen von CVP-immunisierten Seren hinzugefügt. Der ELISA wurde wie an anderer Stelle in der Beschreibung dargelegt durchgeführt, wobei ein mit alkalischer Phosphatase (AP)-markiertes anti-Maus-IgG_2a Konjugat zur Detektion verwendet wurde. Durch graphisches Auftragen des aus der Wechselwirkung zwischen dem Ziege-anti-Maus-IgG und monoklonalem IgG_2a erhaltenen OD gegen die bekannten Konzentrationen an IgG_2a wurden die OD-Einheiten an anti-Peptid-IgG_2a im Testserum in Mikrogramm an peptidspezifischem IgG_2a umgerechnet. Ein OD wurde an einem geeigneten Punkt der IgG_2a-Standardkurve abgelesen. Unter Verwendung der gleichen Standardkurve können die aus Seren, welche in mit anti-IgG beschichteten Vertiefungen inkubiert wurden, erhaltenen OD-Einheiten in Mikrogramm an in der Serumprobe vorhandenem Gesamt-IgG_2a umgerechnet werden. Der prozentuale Anteil an peptidspezifischem IgG_2a wurde für jede Serumprobe berechnet. Das gleiche Verfahren wurde zur Messung der Gesamtmenge und der peptidspezifischen Menge an IgG₁, IgG_2b und IgG₃ verwendet.
Statistik
Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des Students-T-Tests ausgewertet, wobei P < 0.05 als statistisch signifikant angesehen wurde.
BEISPIEL 1 (VERGLEICH)
DT- und KLH-konjugierte Peptide rufen keine dominanten TH1-artigen Serumantikörperantworten hervor
Jegliche Dominanz, welche im T-Helferzell-Signalweg einer durch ein Antigen erzeugten Immunantwort beobachtet wird, kann durch die intrinsischen immunologischen Eigenschaften des betroffenen Peptids gesteuert werden. Um dies zu untersuchen, wurden C57BL/6-Mäuse mit dem aus humanem Choriongonadotropin stammenden CTP37-Peptid, welches an Diphtherietoxin konjugiert war (DT; Prof. V. Stevens, Ohio State Universität), oder mit einem aus einem äußeren Membranprotein (Omp F-Protein) von Pseudomonas aeruginosa stammenden Peptid (Peptid 10), welches an KLH konjugiert war (Prof. H.E. Gilleland, Louisiana State Universität), immunisiert. Beide Konjugate wurden in Gegenwart des Hilfsmittels QS-21 verimpft. Es wurden entweder 2 Immunisierungen (an den Tagen 0 und 21) oder 3 Immunisierungen (an den Tagen 0, 14 und 28) subkutan verabreicht. Blut wurde an Tag 42 durch Entnahme von Blut aus dem Schwanz (Tail-bleeding) oder nach Verbluten gesammelt, wobei die Seren gesammelt und für spätere Bestimmungen mittels ELISA bei –20°C gelagert wurden. Für die Detektion von Antikörpern gegen das OM-Protein F aus P. aeruginosa und βhCG-CTP37 (Peptide wurden von Genosys Inc., Cambridge, UK, synthetisiert und gereinigt) wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten für 3 h bei 37°C mit 0.5 μg/Vertiefung der entsprechenden Peptide beschichtet (siehe Tabelle 1, vorstehend). Eine Serie von Doppelverdünnungen der Seren wurde auf den mit Antigen beschichteten Platten für 1 h bei 37°C inkubiert. Gebundener Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG₁, -IgG_2a, -IgG_2b oder -IgG₃ (Southern Biotechnologies Inc., USA) unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP, [Sigma]) als Substrat detektiert. Diese anti-Maus-Isotyp-Reagenzien wurden zunächst gegen Standard-Mausmyelomproteine titriert, welche die vier IgG-Subklassen repräsentierten, wobei eine Verdünnung von 1:2000 eines jeden Konjugats eine weniger als 10%ige Schwankung hinsichtlich der Myelombindung ergibt. Dies war die in allen nachfolgenden Assays verwendete Verdünnung. Die Endpunkttiter wurden wie bereits beschrieben berechnet (Brennan et al. (1999) Microbiol. 145: 211; Brennan et al. (1999) J. Virol. 73: 930). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: DT- und KLH-konjugierte Peptide rufen keine dominanten TH1-artigen Serumantikörperantworten hervor

^a Immunisierung von C57/BL6-Mäusen verwendete 6 Tiere/Gruppe.
* Seren wurden an Tag 29 gesammelt und mittels ELISA in Bezug auf βhCG-CTP37- und OM-Protein F-spezifisches IgG₁, IgG_2a, IgG_2b oder IgG₃ untersucht.

Wie in Tabelle 2 dargestellt ist, riefen sowohl DT-βhCG-CTP37 als auch KLH-OM-Protein F signifikant höhere Mengen an peptidspezifischem IgG₁ verglichen mit IgG_2a hervor (P < 0.05 und P < 0.01 für DT-βhCG-CTP37 bzw. KLH-OM-Protein), was belegt, dass die Präsentation dieser Peptide in sich nicht replizierenden Vakzinträgersystemen keine Dominanz in Richtung einer TH1-artigen Antwort erzeugt.
BEISPIEL 2 (VERGLEICH)
Die Expression von Peptiden auf CPMV überwindet eine TH2-Dominanz der von den Peptiden bei anderen makromolekularen Trägersystemen stimulierten Immunantwort, was zu einer TH1-artigen Antwort führt
Im Gegensatz zum vorhergehenden Beispiel wurden vier Peptide, umfassend die zwei (DT-βhCG-CTP37 bzw. KLH-OM-Protein F) aus Beispiel 1, auf CPMV exprimiert. Vier Gruppen von acht Balb/c-Mäusen wurden in Gegenwart von FCA/FICA mit einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Dosis subkutan immunisiert. Es wurden drei Immunisierungen (an den Tagen 0 und 21 oder an den Tagen 0,14 und 28) durchgeführt, wobei jeweils 100 μg, 25 μg und weitere 25 μg an CVPs injiziert wurden. Blut wurde an Tag 42 durch Entnahme von Blut aus dem Schwanz (Tailbleeding) oder durch Verbluten gesammelt; die Seren wurden gesammelt und bei –20°C gelagert.
Für die Detektion von anti-CPMV-Antikörper wurden die Vertiefungen für 3 h bei 37°C mit 0.1 μg/Vertiefung an CPMV beschichtet. Eine Serie von Doppelverdünnungen der Seren wurde auf den mit Antigen verbundenen Platten für 1 h bei 37°C inkubiert. Gebundener Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG₁, -IgG_2a, -IgG_2b oder -IgG₃ (Southern Biotechnologies Inc., USA) unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP) (Sigma) als Substrat detektiert. Wie zuvor wurden diese anti-Maus-Isotyp-Reagenzien zunächst gegen Standard-Mausmyelomproteine titriert, welche die vier IgG-Subklassen repräsentierten. Eine Verdünnung von 1:2000 eines jeden Konjugats ergab eine weniger als 10%ige Schwankung hinsichtlich der Myelombindung, weshalb diese Verdünnung in allen nachfolgenden Assays verwendet wurde. Die Endpunkttiter wurden wie bereits beschrieben berechnet. Für CPMV-spezifische Titer wurden die Ergebnisse als Endpunkttiter angegeben, berechnet als Kehrwert jener Verdünnung, bei welcher sich ein mittlerer OD₄₀₅ ergibt, der höher ist als der bei einer 1:50-Verdünnung von zusammengefassten Seren aus nicht-immunisierten Mäusen erhaltene ODa₄₀₅.
Für peptidspezifische Titer waren die Endpunkttiter der Kehrwert jener Verdünnung, bei welcher sich eine mittlerer OD₄₀₅ ergibt, der höher ist als der bei einer 1:50-Verdünnung von zusammengefassten Seren aus CPMV-immunisierten Wildtyp-Mäusen erhaltene OD₄₀₅ Die Ergebnisse sind in Tabelle 3, Zeilen 5 und 7 dargestellt.
Tabelle 3: Isotyp von peptidspezifischem Serum-IgG, welcher von CVPs hervorgerufen wird, die eine Vielzahl unterschiedlicher Peptide exprimieren

Mausstämme^b unterschiedlicher H2-Haplotypen wurden subkutan oder *intranasal mit einer Reihe von CVPs^a in entweder FCA/FICA-, QS-21- oder Alaun-Hilfsmittel oder ohne Hilfsmittel^d immunisiert^c (5–9/Gruppe). Die Seren wurden an Tag 42 (+Tag 83) gesammelt und mittels ELISA in Bezug auf mlgE-(AGY2)-, EGFRvIII-(EGFR1)-, VP2-(PARVO9)-, βhCG-CTP37-(HCG1)-, OM-Protein F-(PAE5)- und FnBP-(MAST1)-spezifisches IgG₁, IgG_2a, IgG_2b oder IgG₃ untersucht. Die Titer sind als geometrisch mittlere Endpunkttiter ± SD angegeben.

Der Begriff „Endpunkttiter" ist jene Verdünnung eines Antikörpers, welche für ein vorgegebenes Antigen spezifisch ist und die höchste Verdünnung des Antikörpers darstellt, die bei Kombination mit dem Antigen eine detektierbare Reaktion erzeugt.
Wie in Tabelle 3 dargelegt ist, riefen diese Epitope im Falle einer Präsentation der Epitope auf CPMV sehr viel niedrigere Mengen an IgG₁ als an IgG_2a hervor, was eine Dominanz in Richtung einer TH1-artigen Immunantwort belegt. Tatsächlich rief die Präsentation der gleichen Epitope auf CPMV, im Gegensatz zu den beiden Epitopen (das heißt DT-βhCG-CTP37 und KLH-OM-Protein F), welche in Abwesenheit der Präsentation von CPMV präsentiert wurden (Beispiel 1), sehr viel niedrigere Mengen an IgG₁ als an IgG_2a hervor.
BEISPIEL 3 (VERGLEICH)
Die Präsentation von Peptiden auf CPMV ruft in Gegenwart fremder immunmodulatorischer Mittel, wie beispielsweise spezifischer Hilfsmittel, welche bekanntermaßen TH2-artige Immunantworten begünstigen, eine TH1-artige Antwort hervor
Das Hilfsmittel Alaun begünstigt im Allgemeinen die Induktion einer TH2-artigen Immunantwort. Um zu bestimmen, ob die von den Hilfsmitteln begünstigte TH2-artige Immunantwort von dem erfindungsgemäßen CPMV-Präsentationssystem umgangen werden kann, wurden drei Gruppen von C57BU6-Mäusen an der Tagen 0 und 21 entweder ausschließlich oder in Kombination mit Alaun oder QS21 jeweils mit 5 μg an CPMV-MAST1 (welches ein Peptid exprimiert, das aus dem Fibronektinbindenden Protein von Staphylococcus aureus stammt) subkutan immunisiert. Die Seren wurden an Tag 42 gesammelt und mittels ELISA in Bezug auf MAST1-peptidspezifische Immunglobuline der Klassen IgG₁, IgG_2a, IgG_2b oder IgG₃, im Wesentlichen wie vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, untersucht. Die Titer deuteten in allen drei Gruppen von Mäusen, umfassend die Kontrollgruppe, in welcher kein Hilfsmittel hinzugefügt wurde, auf eine starke Dominanz in Richtung einer TH1-Antwort hin (Tabelle 3, vorstehend, Zeilen 8, 9 und 10). Somit wurde der immunmodulatorische Effekt von Hilfsmitteln, welche bekanntermaßen TH2-Antworten begünstigen, durch Präsentation von Peptiden auf chimären CPMVs vollständig umgangen. Ferner dient die Abwesenheit eines fremden Hilfsmittels in einem Teil dieser Untersuchung dazu, den der CPMV-Plattform eigenen intrinsischen TH1-dominierenden Effekt zu betonen (Tabelle 3, vorstehend, Zeile 8).
BEISPIEL 4 (VERGLEICH)
Peptide, welche aus einer Vielzahl von Proteinen stammen, rufen in Seren unabhängig vom genetischen Hintergrund des immunisierten Individuums überwiegend peptidspezifische TH1-artige Antikörper hervor, wenn sie auf CPMV exprimiert werden
Um die universelle Nutzbarkeit von CPMV als Träger, welcher zur Erzeugung einer TH1-artigen Antwort befähigt ist, zu überprüfen, und um zu belegen, dass der immunologische Effekt von der genetischen Konstitution eines immunisierten Individuums unabhängig war, wurden Mäuse unterschiedlicher MHC-Klasse 11-Haplotypen mit CVPs beimpft, welche aus einer Reihe von unterschiedlichen Quellen stammende Peptide exprimieren. CPMV-AGY2 (Tabelle 3, Zeile 1) exprimiert ein aus der schweren Kette von humanem membrangebundenem Immunglobulin E (IgE) stammendes Peptid; CPMV-EGFR1 (Tabelle 3, Zeile 2) exprimiert ein aus dem Protein epithelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor stammendes Peptid, welches auf humanen Krebszellen vorhanden ist; CPMV-HCG3 (Tabelle 3, Zeile 6) exprimiert aus dem humanem Hormon Choriongonadotropin (hCGβ) stammende Peptide; CMPV-PARVO9 (Tabelle 3, Zeilen 3 und 4) exprimiert ein Peptid aus caninem Parvovirus, und CMPV-MAST1 (Tabelle 3, Zeilen 8–12) und CPMV-PAE5 (Tabelle 3, Zeile 7) exprimieren aus bakteriellen Membranproteinen (von S. aureus bzw. P. aeruginosa) stammende Peptide. Es wurden vier Mausstämme verwendet, welche für die verschiedenen Haplotypen (Genotypen) repräsentativ sind: DBA/1, NIH, C57BL/6 und Biozzi/ABH. Die Mäuse wurden mit den verschiedenen CVPs in Gegenwart von QS-21 (10 μg/Dosis; Aquila Biopharmaceutical Inc., Worcester, MA) mit einem Gesamtvolumen von 100 μl/Dosis subkutan immunisiert. Es wurden entweder 2 Immunisierungen an den Tagen 0 und 21 oder 3 Immunisierungen an den Tagen 0, 14 und 28 verabreicht (siehe Tabelle 3, vorstehend). Blut wurde, wie vorstehend beschrieben, an Tag 42 durch Entnahme von Blut aus dem Schwanz (Tail-bleeding) oder durch Verbluten gesammelt; die Seren wurden gesammelt und bei –20°C gelagert. Für die Detektion von anti-CPMV-Antikörper wurden die Vertiefungen für 3 h bei 37°C mit 0.1 μg/Vertiefung an CPMV beschichtet. Eine Serie von Doppelverdünnungen der Seren wurde auf den mit Antigen beschichteten Platten für 1 h bei 37°C inkubiert. Gebundener Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG₁, -IgG_2a, -IgG_2b oder -IgG₃ (Southern Biotechnologies Inc., USA) unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP) (Sigma) als Substrat detektiert.
Diese anti-Maus-Isotyp-Reagenzien wurden zunächst gegen Standard-Mausmyelomproteine titriert, welche die vier IgG-Subklassen repräsentierten. Eine Verdünnung von 1:2000 eines jeden Konjugats ergibt eine weniger als 10%ige Schwankung hinsichtlich der Myelombindung. Diese Verdünnung wurde in allen nachfolgenden Assays verwendet. Die Endpunkttiter wurden wie vorstehend beschrieben berechnet. Für CPMV-spezifische Titer wurden die Ergebnisse als Endpunkttiter angegeben, berechnet als Kehrwert jener Verdünnung, bei welcher sich ein mittlerer OD₄₀₅ ergibt, der höher ist als der bei einer 1:50-Verdünnung von zusammengefassten Seren aus nicht-immunisierten Mäusen erhaltene OD₄₀₅ Für peptidspezifische Titer waren die Endpunkttiter der Kehrwert jener Verdünnung, bei welcher sich eine mittlerer OD₄₀₅ ergibt, der höher ist als der bei einer 1:50-Verdünnung von zusammengefassten Seren aus CPMV-immunisierten Wildtyp-Mäusen erhaltene OD₄₀₅.
Es zeigte sich, dass alle 4 Konstrukte trotz Gegenwart eines bekannten TH2-immunmodulatorischen Hilfsmittels (das heißt QS21 oder Alaun) hohe Mengen an peptidspezifischem IgG_2a, bezogen auf die Mengen an IgG₁ oder IgG₃, hervorrufen (in allen Fällen P < 0.01). Die Mengen an peptidspezifischem IgG₁ und IgG₃ waren dementsprechend in allen Immunisierungsgruppen sehr viel niedriger (Tabelle 3, vorstehend). Einige der CVPs produzierten darüber hinaus signifikante Mengen an peptidspezifischem IgG_2b. Wo dies der Fall war, waren die Mengen mit Ausnahme von CPMV-MAST1, welches in einigen Fällen Mengen an IgG_2b hervorrief, die höher waren als die Mengen an IgG_2a, niedriger als die Mengen an IgG_2a (Tabelle 3, vorstehend). Somit riefen die CVPs überwiegend peptidspezifische TH1-artige Antworten hervor, welche scheinbar weder durch die Quelle noch durch die Sequenz des exprimierten Peptids noch durch die Gegenwart eines Hilfsmittels mit TH2-immunmodulatorischem Potenzial beeinflusst werden.
Entscheidend ist jedoch, dass die CVPs in diesem Experiment in Mäusen mit 4 unterschiedlichen H2-Haplotypen TH1-artige Antworten hervorriefen. Dies deutete darauf hin, dass der Effekt nicht durch Immunantwortgene (Ir-Gene) bestimmt oder gesteuert wurde. In anderen Worten stellte die genetische Veranlagung eines Individuums keinen hemmenden Faktor hinsichtlich der Fähigkeit von CPMV, eine TH1-Dominanz der durch ein bestimmtes Peptid ausgelösten Immunantwort hervorzurufen, dar. Es war insbesondere signifikant, dass der Effekt einer TH1-Dominanz einer Immunantwort in Biozzi/ABH-Mäusen, welche mit CPMV-MAST1 beimpft worden waren, beobachtet wurde. Biozzi/ABH-Mäuse besitzen eine genetische Prädisposition für die Begünstigung einer TH2-dominierten Antwort, selbst bevor die potenziell dominierenden Effekte fremder Hilfsmittel oder der Peptide selbst berücksichtigt wurden.
Folglich war die CPMV-assoziierte TH1-Antwort in der Lage, starke intrinsisch genetische Faktoren, von welchen im Allgemeinen angenommen wird, dass sie die Immunantwort eines Individuums in signifikantem Ausmaß steuern, außer Kraft zu setzen. Dies wurde ferner durch eine Analyse der Spezifität von Immunglobulinen der TH1- und TH2-Signalweg-Subtypen unterstrichen. Weniger als 1% an produziertem IgG₁ war peptidspezifisch, verglichen mit 25–100% an Gesamt-IgG_2a in allen Mäusen der Testgruppe. Zusammenfassend kann die Verwendung von CPMV als Träger und Präsentationssystem für Peptide Grenzen auf genetischer Ebene eines Individuums überwinden, wodurch ein Mittel zur Vermeidung Vakzingenomischer Überlegungen im Rahmen der Konzipierung prophylaktischer und therapeutischer Mittel bereitgestellt wird.
BEISPIEL 5 (VERGLEICH)
Die Präsentation von Peptiden auf CPMV-Partikeln induziert TH1-dominierte Immunantworten über einen weiten Bereich von Dosierungsschemata
Aus einer Betrachtung der IgG-Titrationsdaten in vorstehender Tabelle 3 war ersichtlich, dass, ungeachtet dessen, ob hohe oder niedrige Dosen (im Bereich von 300 μg an CVPs bis hinab zu 2 μg) im Rahmen des Immunisierungsprotokolls verwendet wurden, höhere Mengen an peptidspezifischem IgG_2a (weist auf eine TH1-artige Antwort hin) als an peptidspezifischem IgG₁ (weist auf eine TH2-artige Antwort hin) in Reaktion auf mehrere unterschiedliche Antigene erzeugt wurden. Somit bestand ein weiterer Vorteil der immunmodulatorischen Eigenschaften von CPMV als Trägersystem in der geringeren Menge an Material, welche erforderlich ist, um eine gewünschte Art von Antwort hervorzurufen.
BEISPIEL 6 (VERGLEICH)
CVPs rufen, ob parenteral oder mukosal präsentiert, eine TH1-artige Antwort hervor, was darauf hindeutet, dass das Partikelverabreichungsverfahren die Art der stimulierten Immunantwort nicht beeinflusst
NIH-Mäuse wurden intranasal mit CPMV-PARVO9, einem ein Peptid, welches aus dem VP2-Protein von caninem Parvovirus stammt, präsentierenden CVP, immunisiert. Für diese Impfung direkt auf eine mukosale Oberfläche wurde kein Hilfsmittel verwendet (siehe Tabelle 3, Zeile 3). Zwei Dosen, welche jeweils 100 μg an CVPs enthielten, wurden an Tag 0 und Tag 14 verabreicht. An Tag 42 wurde, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, Blut gesammelt und auf die Anwesenheit von Immunglobulin-Subklassen, welche für das PARVO9-Peptid spezifisch sind, untersucht (Tabelle 3; vorstehend, Gruppe 4). Die Konzentration an peptidspezifischem (VP2-spezifischem) Antikörper wurde für jeden der vier Isotypen als prozentualer Anteil an Gesamtantikörper in einzelnen Mäusen angegeben, wie in Tabelle 4 dargestellt ist. Ferner sind die mittleren prozentualen Werte für jeden der 4 Isotypen in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: Relative Konzentration an Gesamt-IgG-Isotypen und peptidspezifischen IgG-Isotypen in CVP-immunisierten Mäusen
Obwohl hohe Mengen an Gesamt-Ig₁ und -IgG₃ (welche nahezu ausschließlich CPMV-spezifisch waren) detektiert wurden, waren auch die Gesamtkonzentrationen an IgG_2a und IgG_2b hoch. Darüber hinaus waren signifikante Anteile peptidspezifisch (Tabelle 4, vorstehend), was erneut die Dominanz der Antworten in Richtung des TH1-Typs und die Tatsache, dass eine derartige Antwort ungeachtet der Applikationsart des auf CPMV präsentierten Antigens hervorgerufen werden kann, hervorhebt.
BEISPIEL 7 (VERGLEICH)
Verwendung eines einen chimären Viruspartikel enthaltenden immunogenen Komplexes zur Veränderung der Art einer bestehenden Immunantwort
Es gibt Situationen, in welchen bestimmte Antigene in Gegenwart von Hilfsmitteln, welche überwiegend eine TH2-artige Antwort hervorrufen, als Vakzine präsentiert werden. Tatsächlich deutet die bis zum heutigen Tage ausschließliche Zulassung von Alaun (welches überwiegend eine TH2-artige Immunantwort hervorruft) als Hilfsmittel, welches für Anwendungen im Rahmen von Humanvakzinen als sicher erachtet wird, darauf hin, dass viele zukünftig erhältliche Vakzine a priori einen Faktor enthalten, welcher eine TH2-artige Immunantwort mit ungünstigen Nebenwirkungen hervorruft. Dies unterstreicht das Bedürfnis in Bezug auf die Immunmodulierung einer Antwort in Richtung des TH1-Signalweges und fort vom TH2-Signalweg, welcher unter derartigen Umständen induziert wird. Da viele Vakzine mehrere Impfungen erfordern, um wirksam zu sein, ist es möglich, sich des Problems der Veränderung einer TH2-Antwort (welche mit einem vorgegebenen Peptid in einer Untereinheit des Vakzins assoziiert ist) zugunsten einer TH1-artigen Antwort anzunehmen, indem die ursprüngliche Antwort mittels einer Formulierung verstärkt wird, welche ein CPMV-präsentiertes Peptid enthält. Die Stärke der immunmodulatorischen Dominanz der CPMV-Plattform umgeht das Potenzial des Hilfsmittels betreffend eine Auslösung des TH2-Signalweges, während nach wie vor die erforderliche Verstärkung der Immunantwort auf das fragliche Peptid erreicht wird.
Um dies zu belegen, wurden Mäuse in Gegenwart von Alaun und/oder QS21 als Hilfsmittel zur Induzierung einer TH2-Antwort mit MAST1-Protein (Tabelle 1) immunisiert, wie anhand proteinspezifischer Mengen an IgG bestimmt. Die Testmäuse wurden anschließend mit CPMV-MAST1 immunisiert, wobei die Kontrollmäuse keine nachfolgende Immunisierung erhielten. Die Mengen an IgG in den Test- und Kontrollmäusen wurden wie vorstehend beschrieben bestimmt. Eine Erhöhung des Verhältnisses von peptidspezifischem IgG₁:IgG_2a, IgG₃:IgG_2a, IgG₁:IgG_2b und/oder IgG₃:IgG_2b in den Testtieren, bezogen auf die Kontrolltiere, belegt, dass die erfindungsgemäßen chimären Viren die TH2-Antwort überwinden, welche vom Hilfsmittel im Rahmen der Primärimmunisierung induziert wird.
BEISPIEL 8
Verwendung von CPMV-Viruspartikeln, welche zur Expression und chemischen Präsentation reaktiver Peptide konstruiert sind, zum Konjugieren von immunogenen proteinösen und nicht-proteinösen Einheiten, insbesondere Kohlenhydrat-Einheiten
Desoxyribonukleotide, welche für die Aminosäuresequenz mit der Formel DEGKGKGKGKDE (SEQ ID NO: 29) kodieren, werden in den Vektor pCP2 kloniert, welcher einer cDNA-Kopie des RNA2-Moleküls von Kuherbsen-Mosaikvirus entspricht. Die Insertion erfolgt derart, dass das reaktive Peptid zwischen Alanin 22 und Prolin 23 in den βB-βC-Loop von VP-S (dem kleineren der zwei Hüllproteine des CPMV-Virus) insertiert wird, wie bereits beschrieben (U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087). Gereinigte Kohlenhydrate werden chemisch an reaktive Lysinreste des Peptids konjugiert, und die resultierenden Kohlenhydrat-konjugierten CVPs werden mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines beispielsweise Kohlenhydrat-spezifischen Antikörpers oder mittels DEAE-Cellulosechromatographie gereinigt. Kohlenhydrat-konjugierte CVPs werden im Wesentlichen gemäß dem gleichen Immunisierungsschema, wie es vorstehend in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist, an Mäuse verimpft. An Tag 42 wurde Blut aus dem Schwanz entnommen, und die Seren wurden in Bezug auf IgG-Subklassen untersucht, welche für das Kohlenhydrat spezifisch sind. Eine Dominanz der eine TH1-Antwort hervorrufenden IgG-Subklassen steht mit der immunmodulatorischen Dominanz von CPMV im Einklang.
BEISPIEL 9 (VERGLEICH)
CVPs aktivieren überwiegend CPMV- und peptidspezifisches IgG_2a- und IgG_2b-produzierende B-Zellen in der Milz, wie mittels ELISPOT bestimmt
Milzzellen aus CPMV-MAST1 (Tabelle 3, Zeile 10) in mit QS-21 immunisierten Mäusen wurden zusammengefasst, und die roten Blutzellen durch eine in der Kälte durchgeführte Lyse in 0.8%-igem NH₄Cl entfernt. Die Zellen wurden zweimal mit RPMI 1640 gewaschen, ausgezählt und in Konzentrationen von entweder 5 × 10⁶, 5 × 10⁵ oder 5 × 10⁴ lebensfähigen Zellen/ml resuspendiert. Jede Zellsuspension (100 μl/Vertiefung) wurde den Vertiefungen von Multiscreen Immobilon IP-Platten mit 96 Vertiefungen (Millipore, Ontario, Kanada) hinzugefügt, welche über Nacht bei 4°C entweder mit CPMV oder mit FnBP-Peptid in sterilem Carbonatpuffer pH 9.6 vorbeschichtet und für 1 h bei 37°C mit RPMI 1640, welches 10% FCS enthielt, blockiert wurden. Vertiefungen für Negativkontrollen wurden ausschließlich mit Puffer oder mit einem irrelevanten Kontrollpeptid beschichtet. Die Zellen wurden auf den Platten für 20 h bei 37°C inkubiert und anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Gebundener Antikörper wurde unter Verwendung des geeigneten alkalische Phosphatase (AP)-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG₁, -IgG_2a, -IgG_2b oder -IgG₃ (Southern Biotechnologies, Inc.) detektiert. Nach 2 h bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen, und es wurde für 30 min bei 37°C Streptavidin-Peroxidase (100 μl/Vertiefung) hinzugefügt. Nach Waschen mit PBST wurde Sigma FAST^TM DAB (3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid)-Substrat hinzugefügt (100 μl/Vertiefung), bis sich eine maximale Farbintensität entwickelte. Die Platten wurden vorsichtig mit Leitungswasser gewaschen, für 30 min bei 37°C getrocknet, und die Spots unter Verwendung eines Dissektionsmikroskops (Nikon SMZ-1) ausgezählt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert an punktbildenden Zellen (SFC) pro 10⁶ Milzzellen (SFC/10⁶ Milzzellen) ± SD sowohl für CPMV als auch das Peptid angegeben, wie in Tabelle 5 dargestellt ist.
Tabelle 5: CVPs aktivieren in der Milz überwiegend CPMV- und peptidspezifisches IgG_2a- und IgG_2b-produzierende B-Zellen

^a C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit CPMV-MAST1 in QS-21 immunisiert (Tabelle 3, Zeile 10). Die Seren wurden an Tag 42 gesammelt und mittels ELISA in Bezug auf CPMV- und FnBP-spezifisches IgG₁, IgG_2a, IgG_2b oder IgG₃ untersucht. Die Titer sind als geometrisch mittlere Endpunkttiter ± SD angegeben.
^b Die Milzzellen wurden zusammengefasst und mittels ELISPOT auf die Anwesenheit von CPMV- und FnBP-spezifisches IgG₁-, IgG_2a-, IgG_2b- oder IgG₃-produzierende SFC untersucht. Die Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel von SFC/10⁶ Milzzellen ± SD angegeben.

Eine ELISPOT-Analyse der von CPMV-MAST1 in QS21 hervorgerufenen Immunglobuline zeigte eine ähnlich hohe Anzahl an IgG_2a- und IgG_2b-punktbildenden Zellen in der Milz der immunisierten Mäuse, im Gegensatz zu der sehr viel geringeren Anzahl an IgG₁- und IgG₃-SFCs (Tabelle 5). Es waren etwa 4-mal höhere Titer an CPMV-spezifischem IgG_2a- und IgG_2b-Antikörper und SFCs verglichen mit peptidspezifischem (FnBP-spezifischem) Antikörper und SFCs in diesen Mäusen vorhanden. Interessanterweise wurde, obwohl die Mengen an FnBP-spezifischem IgG_2a und IgG_2b in den Seren sehr ähnlich waren, eine sehr viel höhere Anzahl an IgG_2a-produzierenden SFCs als an IgG_2b-produzierenden SFCs mittels ELISPOT in der Milz detektiert (Tabelle 5), was darauf schließen lässt, dass CPMV-MAST1 eine größere Anzahl an FnBP-spezifisches IgG_2a-produzierenden B-Zellen aktiviert. Somit riefen C57BL/6-Mäuse, welche mit CPMV-MAST1 immunisiert worden waren, sehr hohe Konzentrationen an überwiegend CPMV-spezifischem IgG_2a und IgG_2b im Serum hervor, wobei niedrigere, jedoch signifikante Mengen an CPMV-spezifischem IgG₁ und IgG₃ vorhanden waren (Tabelle 5).
BEISPIEL 10 (VERGLEICH)
CPMV-spezifische T-Zellen, welche in der Milz von CVPs aktiviert werden, proliferieren unter Produktion von IFN-γ (ein TH1-assoziiertes Cytokin) und nicht von IL-4 (ein TH2-assoziiertes Cytokin)
Die Milz von Mäusen, welche mit CVPs immunisier worden waren, wurde 42 Tage nach der Primärimmunisierung entfernt, und es wurden einzelne Zellsuspensionen hergestellt. Nach Waschen und Lyse der roten Blutzellen mit eisgekühltem 0.85%-igem NH₄Cl wurden die Splenozyten von 5 Mäusen zusammengefasst und mittels RPMI 1040-Medium (Gibco, Paisley, UK), welches 1 mM L-Glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin und 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, in Platten mit 96 Vertiefungen, welche runde Böden aufwiesen, verteilt (2 × 10⁵/100 μl; Nunclon Delta Surface, Nunc, Dänemark). Die Zellen wurden mit 2.5 μg/ml Concanavalin A (ConA, Sigma) oder mit Wildtyp-CPMV (50 oder 5 μg/ml) für 5 Tage bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. In den letzten 12 h der Kultivierung wurden 0.5 μCi/Vertiefung an (Methyl-3H)-thymidin (Amersham Life Science) hinzugefügt. Die Zellen wurden auf Filtermatten (Wallac Oy, Turku, Finnland) geerntet, und der Einbau der Markierung unter Verwendung eines 1450 Microbeta Trilux Flüssigszintillations- und Lumineszenzzählers (Wallac) gemessen. Die Daten wurden als Stimulationsindizes angegeben, wobei die Counts pro Minute in Gegenwart von Hilfsmittel durch die Counts, welche in Abwesenheit von Antigen (ausschließlich Medium) gemessen wurden, geteilt wurden. Ein Wert von 3 oder mehr wurde als signifikant angesehen. Die Milzzellen aus Mäusen, welche mit CPMV-MAST1 immunisiert worden waren, proliferierten in vitro selbst bei Stimulation mit niedrigen Konzentrationen (5 μg/ml) an CPMV sehr stark, was auf eine hochspezifische T-Zell-Induktion hindeutet, welche durch den Peptidträger vermittelt wird.
Die zusammengefassten Milzzellen wurden anschließend alleine oder mit entweder ConA (2.5 μg/ml) oder Wildtyp-CPMV (50 oder 5 μg/ml) in Platten mit 24 Vertiefungen (5 × 10⁶/Vertiefung in 2 ml Volumen) kultiviert. Nach 48 h wurden 0.5 ml des Zellkulturüberstandes in Eppendorf-Röhrchen aufgenommen und bei –80°C gelagert. Die Überstände wurden, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, mittels ELISA auf die Anwesenheit von sowohl IFN-γ als auch IL-4 untersucht. Kurz gesagt wurden ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Immulon-4) über Nacht mit 2 μg/Vertiefung an entweder Ratten mAb-anti-Maus-IFN-γ oder Ratten mAb-anti-Maus-IL-4 (beide von Pharmingen, San Diego, CA) bei 4°C beschichtet. Nach Blockieren der Platten mit PBS, welches 0.05% Tween und 5% BSA enthielt, wurden den Vertiefungen Verdünnungsreihen der Kulturüberstände der Mausmilzzellen hinzugefügt. Als Kontrollen wurden verdünnte Lösungen von rekombinantem Maus-IFN-γ und -IL-4 (Pharmingen) hinzugefügt, wobei mit 4 ng/ml und 15 ng/ml für IL-4 bzw. IFN-γ begonnen wurde. Nach 1 h bei 37°C wurde gebundenes Cytokin unter Verwendung von biotinyliertem Ratte-anti-Maus-IFN-γ oder anti-IL-4-mAbs (beide von Pharmingen) für 1 h bei 37°C detektiert. Diese mAbs erkennen andere Epitope auf IFN-γ und IL-4 als die im Rahmen des Abfangschrittes an einem früheren Punkt des Verfahrens verwendeten mAbs. Streptavidin-Peroxidase (Sigma; 2 μg/ml) wurde für 30 Minuten bei 37°C hinzugefügt, gefolgt von O-Phenylendiamin (OPD)-Substrat (1 mg/ml). Nach 30 Minuten bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung an 2.5 M H₂SO₄ beendet, und die Extinktion bei 492 nm unter Verwendung einer automatisierten Anthos HAT II ELISA-Plattenauslesevorrichtung abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. (A) Tabelle 6: CPMV stimuliert die Proliferation und Cytokinproduktion von Milzzellen des TH1-Phänotyps
(B)

^a, ^b C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit CPMV-MAST1 in QS-21 immunisiert (Tabelle 3, Zeile 10). Die Milzzellen aus diesen Mäusen (A) und aus nicht-immunisierten Mäusen (B) wurden zusammengefasst und für 5 Tage entweder alleine oder mit 2.5 μg/ml an ConA oder 50 μg/ml an CPMV kultiviert. Die Proliferation von T-Zellen ist sowohl als Mittelwert von CPM ± SD^a als auch als SI^b angegeben.
^{c, d} Die Überstände dieser Kulturen wurden mittels ELISA auch auf die Anwesenheit von IFN-γ^c- und IL-4^d-Protein untersucht. Die Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel in ng/ml ± SD angegeben. (NT = nicht untersucht).

Es wurde gezeigt, dass die Überstände dieser proliferierenden Zellen hohe Mengen an IFN-γ und niedrige oder nicht-detektierbare Mengen an IL-4 enthalten (Tabelle 6A). Gemäß Vergleich enthalten nicht-immunisierte Mäuse keine CPMV-spezifischen Antikörper oder SFC (nicht dargestellt) und proliferieren nicht, und produzieren auch in Reaktion auf eine CPMV-Stimulation kein IFN-γ oder IL-4 (Tabelle 6B).
BEISPIEL 11
Konjugation von Peptiden
In diesem Beispiel wird in Übereinstimmung mit der Erfindung ein chimärer Pflanzenvirus zur Expression eines reaktiven Peptids konstruiert, welches einen Cysteinrest enthält und in der Lage ist, mit einem beliebigen Peptid in Konjugation zu treten, das unter Verwendung von n-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester („MBS", erhältlich von Pierce) aktiviert wurde.
Desoxyribonukleotide, welche für die Aminosäuresequenz mit der Formel Arg-Glu-Arg-Glu-His-Cys (SEQ ID NO: 30) kodieren, werden in den Vektor pCP2 kloniert, welcher einer cDNA-Kopie des RNA2-Moleküls von Kuherbsen-Mosaikvirus entspricht. Die Insertion erfolgt derart, dass das reaktive Peptid zwischen Alanin 22 und Prolin 23 in den βB-βC-Loop von VP-S (dem kleineren der zwei Hüllproteine des CPMV-Virus) insertiert wird, wie bereits beschrieben (U.S. Patente Nr. 5,958,422 und 5,874,087, auf welche jeweils in ihrer Gesamtheit Bezug genommen wird).
Das Proteinmolekül von Interesse, welches an den erfindungsgemäßen Pflanzenvirus konjugiert werden soll, wird wie folgt unter Verwendung von MBS aktiviert. Das Protein wird in Puffer (beispielsweise 0.01 M NaPO₄, pH 7.0) in einer Endkonzentration von etwa 20 mg/ml gelöst. Gleichzeitig wird MBS in N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst. Die MBS-Lösung von 0.51 ml wird zu 3.25 ml der Proteinlösung hinzugefügt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 5 Minuten gerührt wird. Das resultierende MBS-aktivierte Protein wird anschließend durch Chromatographie an einer Bio-Gel P-10-Säule (Bio-Rad; 40 ml Bettvolumen), welche mit 50 mM NaPO₄, pH 7.0 Puffer äquilibriert ist, gereinigt. Die Peakfraktionen werden zusammengefasst (6.0 ml).
Der Arg-Glu-Arg-Glu-His-Cys (20 mg) exprimierende chimäre Pflanzenvirus wird der Lösung von MBS-aktiviertem Protein hinzugefügt, bis zum Lösen des Peptids gerührt, und für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Innerhalb von 20 Minuten erfolgt eine Trübung des Reaktionsgemisches, wobei sich Präzipitate bilden. Nach 3 Stunden wird das Reaktionsgemisch bei 10000 × g für 10 min zentrifugiert, und der Überstand in Bezug auf den Proteingehalt analysiert. Das konjugierte Präzipitat wird dreimal mit PBS gewaschen und bei 4°C gelagert. Die resultierenden gereinigten proteinkonjugierten CVPs werden im Wesentlichen gemäß dem gleichen Immunisierungsschema, wie es vorstehend in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist, an Mäuse verimpft. An Tag 42 wurde Blut aus dem Schwanz entnommen, und die Seren wurden in Bezug auf IgG-Subklassen untersucht, welche für das Kohlenhydrat spezifisch sind. Eine Dominanz der eine TH1-Antwort hervorrufenden IgG-Subklassen steht mit der immunmodulatorischen Dominanz von CPMV im Einklang.
Aus vorstehenden Ausführungen wird deutlich, dass die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen bereitstellt, welche eine Wirksamkeit in Bezug auf die Modulierung der Art und/oder des Ausmaßes einer Immunantwort auf ein beliebiges Molekül von Interesse besitzen, welches beispielsweise ein Antigen oder Immunogen umfasst, jedoch nicht hierauf beschränkt ist. Insbesondere belegen die hierin präsentierten Daten, dass die Erfindung Verfahren und Mittel bereitstellt, eine TH1-Dominanz der Immunantwort auf Moleküle wie beispielsweise Antigene oder Immunogene zu bewirken und/oder eine TH2-Dominanz der Immunantwort auf derartige Moleküle zu verringern. In noch stärkerem Maße zeigen die vorstehenden Ausführungen, dass die Erfindung Verfahren und Mittel zur Erhöhung einer TH1- Immunantwort bereitstellt, welche gegen Moleküle gerichtet ist, die ansonsten allgemein eine TH2-artige Antwort stimulieren. Aus vorstehenden Ausführungen wird ferner deutlich, dass die Erfindung weiterhin Zusammensetzungen und Verfahren zur Verringerung einer TH2-Immunantwort auf Moleküle bereitstellt. Die vorstehenden Ausführungen zeigen zusätzlich, dass die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Veränderung (das heißt Erhöhung oder Erniedrigung) der Menge an TH1- und TH2-assoziierten Immunglobulinen, des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-assoziierten Cytokinen, sowie des Ausmaßes der Proliferation von TH1- und TH2-Zellen bereitstellt.
Die nachfolgenden nützlichen viralen Pflanzenvektoren sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und der darunter fallenden Ausführungsordnung hinterlegt: pTB2 (ATCC Nr. 75280) und pTBU5 (ATCC Nr. 75281). Einzelheiten betreffend die Konstruktion dieser Plasmide sind in U.S. Patent Nr. 5,589,367 dargelegt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konjugat aus einem immunogenen Molekül von Interesse und einem chimären Pflanzenvirus, welcher ein heterologes Peptid exprimiert, das mit dem Molekül von Interesse in Konjugation treten kann, wobei das heterologe Peptid innerhalb eines Strukturgens des Virus kodiert ist und das Molekül von Interesse mit dem Virus über das heterologe Peptid in Konjugation tritt.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Molekül von Interesse ein Peptid, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure oder ein Lipid umfasst.
Konjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Molekül von Interesse aus einer Quelle stammt, welche aus einem Tierpathogen, einem Allergen und einer Krebszelle ausgewählt wird.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Pflanzenvirus ein ikosaedrischer Pflanzenvirus ist, welcher aus Comoviren, Tombusviren, Sobemoviren und Nepoviren ausgewählt wird.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Pflanzenvirus ein Comovirus ist.
Konjugat nach Anspruch 5, wobei der Comovirus ein Kuherbsen-Mosaikvirus ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das heterologe Peptid in einem exponierten Teil des Hüllproteins des Pflanzenvirus exprimiert wird.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das heterologe Peptid eine oder mehrere geladene Aminosäuren umfasst, welche aus negativ geladenen Aminosäuren und positiv geladenen Aminosäuren ausgewählt werden, wobei die negative Ladung der negativ geladenen Aminosäuren durch die positive Ladung der positiv geladenen Aminosäuren ausgeglichen wird.
Konjugat nach Anspruch 8, wobei die negativ geladenen Aminosäuren aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und Cystein ausgewählt werden, und die positiv geladenen Aminosäuren aus Lysin, Arginin und Histidin ausgewählt werden.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das heterologe Peptid eine Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren umfasst, welche aus einer ersten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, und einer zweiten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren, ausgewählt wird.
Konjugat nach Anspruch 10, wobei die Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren in dem heterologen Peptid als eine sich wiederholende Sequenz auftritt.
Konjugat nach Anspruch 10 oder 11, wobei die heterologe Sequenz die erste und zweite Sequenz umfasst, und wobei die erste Sequenz und die zweite Sequenz aufeinanderfolgen.
Konjugat nach Anspruch 12, wobei die aufeinanderfolgenden ersten und zweiten Sequenzen in dem heterologen Peptid als eine sich wiederholende Sequenz auftreten.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das heterologe Peptid nichtaufeinanderfolgende negativ geladene Aminosäuren und nichtaufeinanderfolgende positiv geladene Aminosäuren umfasst, und wobei das heterologe Peptid ferner eine Sequenz von aufeinanderfolgenden geladenen Aminosäuren umfasst, welche aus einer ersten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden negativ geladenen Aminosäuren, und einer zweiten Sequenz, bestehend aus aufeinanderfolgenden positiv geladenen Aminosäuren, ausgewählt wird.
Konjugat nach Anspruch 14, wobei das heterologe Peptid eine als SEQ ID Nr. 16 aufgelistete Sequenz der allgemeinen Formel Asp-Glu_n-Gly-Lys_2n-Asp-Glu_n umfasst, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Konjugat nach Anspruch 16 zur Verwendung für eine Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse.
Konjugat nach Anspruch 17, wobei das erhöhte Ausmaß an TH1-artiger Immunantwort ausgewählt wird aus (a) einer erhöhten Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin in dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf die Menge an TH1-assoziiertem Immunglobulin in einem Kontrolltier, (b) einem erhöhten Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen aus dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf das Ausmaß der Proliferation von TH1-Zellen aus einem Kontrolltier, und (c) einer erhöhten Menge an TH1-assoziiertem Cytokin in dem menschlichen oder tierischen Körper bezogen auf die Menge an TH1-assoziiertem Cytokin in einem Kontrolltier.
Konjugat nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei das TH1-assoziierte Cytokin aus IL-2, TNF-β und IFN-γ ausgewählt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Zusammensetzung für eine Verabreichung mittels mindestens einer von intranasaler, oraler, parenteraler, subkutaner, intrathekaler, intravenöser, intraperitonealer und intramuskulärer Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die Zusammensetzung zusätzlich mindestens eines von einem Immunhilfsmittel, einem Cytokin und einem pharmazeutischen Arzneimittelträger umfasst.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse in einem menschlichen oder tierischen Körper.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Medikament zur Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse in einem Säuger vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Medikament zur Erhöhung des Ausmaßes einer TH1-artigen Immunantwort auf das Molekül von Interesse in einer Maus oder in einem Menschen vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei das Medikament zur Verringerung der Symptome, welche mit einer Exposition des menschlichen oder tierischen Körpers gegenüber dem Molekül von Interesse verbunden sind, vorgesehen ist.