DE60032119T2

DE60032119T2 - Bakterienwandfraktionen mit adjuvansaktivität

Info

Publication number: DE60032119T2
Application number: DE60032119T
Authority: DE
Inventors: Christine Libon; Nathalie Corvaia; Ngoc Thien N'guyen; Alain Beck; Jean-Yves Bonnefoy
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: ES2276673T3; EP1158993A1; WO2000054789A1; BR0009051A; ATE346602T1; AU3298000A; JP2002539169A; ZA200107628B; CN1151799C; AU778957B2; FR2790959A1; EP1158993B1; DE60032119D1; CN1343124A; FR2790959B1; CA2367917A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Membranfraktion von gramnegativen Bakterien, Klebsiella pneumoniae, welche mit einem Antigen oder Hapten assoziiert ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche dazu bestimmt ist, die Immunantwort in Richtung einer Antwort vom Th1-Typ und/oder vom gemischten Th1/Th2-Typ, welche gegen das Antigen oder Hapten gerichtet ist, zu dirigieren. Die Erfindung umfasst außerdem die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese enthalten, und deren Verwendungen bei der Verhütung und bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere den Infektionen durch Paramyxoviren, wie RSV, und von Krebserkrankungen, insbesondere jenen, bei denen die Tumore mit Tumorantigenen assoziiert sind.
Die Impfung ist ein wirksames Mittel, um insbesondere Infektionen zu verhüten oder zu verringern. Der Erfolg von Impfkampagnen auf diesem Gebiet hat erlaubt, das Konzept der Impfstoffe auf die Gebiete der Autoimmunerkrankungen, von Krebs und der Fertilität auszudehnen. Im Gegenzug sind die Impfantigene nicht immer in der Lage, allein eine schnelle und anhaltende Antikörperantwort zu induzieren, was das Vorhandensein von Adjuvantien, d.h. von Verbindungen, die diesen dabei helfen (aus dem Lateinischen: adjuvare: helfen, unterstützen), solche Antworten zu induzieren, erforderlich macht.
Die Adjuvantien bilden eine Gruppe von unterschiedlichen Verbindungen, was ihre Struktur und ihre Herkunft angeht. So findet man unter anderem in dieser Kategorie ebenso Wasser-in-Öl-Emulsionen (unvollständiges Freund'-Adjuvans) oder Öl-in-Wasser-Emulsionen, Verbindungen bakterieller Herkunft, wie Derivate des Lipopolysaccharids der gramnegativen Bakterien, wie auch Aluminiumsalze. Gegenwärtig werden nur die Aluminiumsalze beim Menschen als Adjuvans von Impfpräparaten eingesetzt.
Das Bereitstellen einer Antikörperantwort, die gegen ein Antigen gerichtet ist, erfordert eine Reihe von komplexen Ereignissen. Sie setzt Antigen-präsentierende Zellen, regulatorische T-Lymphozyten (Th für T-„Helper") und Antikörper produzierende B-Lymphozyten ein. Entsprechend dem Profil von produzierten Zytokinen können zwei Arten von Th-Lymphozyten unterschieden werden: Th-Lymphozyten vom Typ 1, die IFN-γ und IL-2 produzieren und die Bildung von IgG2a bei der Maus begünstigen, und Th-Lymphozyten vom Typ 2, die IL-4, IL-5 und IL-10 produzieren mit der Bildung von IgG1 bei der Maus (Mosmann, T.R., und Sad, S., Immunol. Today 1996, 17:138). Außerdem ist gezeigt worden, dass für ein gegebenes Antigen es das Adjuvans ist, das die Orientierung in Richtung des hauptsächlichen Isotyps während der Antikörperantwort bewirkt (Toellner, K.-M., et al. J. Exp. Med. 1998, 187:1193). So ist bekannt, dass die Aluminiumsalze, wie Alhydrogel, bei der Maus eine Antwort im Wesentlichen vom Th2-Typ induzieren und die Bildung von IgG1, ja sogar IgE begünstigen (Allison, A.C., in: Vaccine design – The role of cytokine networks, Band 293, 1–9, Plenum Press, 1997), was bei Individuen Prob leme auf dem Allergie-Gebiet aufwerfen kann. Außerdem kann abhängig von dem ins Auge gefassten therapeutischen Ziel eine Antwort vom Th1- oder gemischten (Th1/Th2) Typ angestrebt werden.
So existiert heute ein Bedarf, über neue Adjuvantien zu verfügen, die in der Lage sind, eine Immunantwort vom Th1-Typ oder gemischten (Th1/Th2) Typ, vorzugsweise eine gemischte Th1/Th2-Antwort, bei welcher die Th1-Antwort nahe bei der Th2-Antwort liegt oder höher als diese ist, zu induzieren.
Überraschenderweise haben die Autoren der Erfindung besondere Eigenschaften der Membranfraktion eines gramnegativen Bakteriums, Klebsiella pneumoniae, (bezeichnet als FMKp), insbesondere von Membranfraktionen, die durch die Verfahren, wie sie nachfolgend in den Beispielen beschrieben werden, erhalten werden, nachgewiesen. Die Autoren haben tatsächlich entdeckt, dass die mit einem Antigen assoziierte FMKp-Membranfraktion nicht nur die Fähigkeit hatte, die gegen das Antigen gerichtete Antikörperantwort zu erhöhen, sondern gleichfalls, die Zytokin-Antwort in Richtung eines Th1/Th2-Profils umzuorientieren, was so der besonderen angestrebten Adjuvans-Aktivität entspricht, und dies unabhängig von der Verabreichungsweise der Membranfraktionen.
So hat die Erfindung die Verwendung einer Membranfraktion von Klebsiella pneumoniae, welche mit einem Antigen oder Hapten assoziiert ist, um die Immunantwort in Richtung einer Antwort vom Th1-Typ und/oder vom gemischten Th1/Th2-Typ, welche gegen das Antigen oder Hapten gerichtet ist, zu dirigieren, oder für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche dazu bestimmt ist, die Immunantwort in Richtung einer Antwort vom Th1-Typ und/oder vom gemischten Th1/Th2-Typ, welche gegen das Antigen oder Hapten gerichtet ist, zu dirigieren, zum Gegenstand, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Membranfraktion durch eines der beiden Verfahren, wie sie nachfolgend beschrieben werden, hergestellt wird.
In Verbindung mit der Orientierung oder dem Dirigieren der Immunantwort in Richtung einer Th1-Antwort und/oder einer Antwort vom gemischten Th1/Th2-Typ bevorzugt man insbesondere eine Orientierung der Immunantwort, die die Induktion einer Th1-Antwort bezogen auf die Th1/Th2-Antwort, die mit dem Adjuvans Alumen (Alum) erhalten wird, begünstigt.
In Verbindung mit der Orientierung der Immunantwort in Richtung einer Th1-Antwort und/oder einer Antwort vom gemischten Th1/Th2-Typ bevorzugt man ganz besonders eine Orientierung der Immunantwort, die den Titer von IgG2a-Antikörpern, die gegen das assoziierte Antigen gerichtet sind, um einen Faktor von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 25, 50 und 100 bezogen auf den Titer von IgG2a, der mit dem Adjuvans Alumen (Alum) erhalten wird, erhöht.
Ganz besonders bevorzugt ist die Immunantwort in Richtung einer Th1-Antwort und/oder einer gemischten Antwort vom Th1/Th2-Typ, bei welcher die Th1-Antwort nahe bei der Th2- Antwort liegt oder höher als diese ist, orientiert. Mit „nahe bei" soll eine Antwort bezeichnet werden, die, ausgedrückt als Titer von IgG2a-Antikörpern, die gegen das assoziierte Antigen gerichtet sind, wenigstens gleich dem 0,5-fachen, vorzugsweise wenigstens gleich dem 0,75-fachen des Titers von IgG1-Antikörpern, die gegen das Antigen gerichtet sind, ist mit einem Titer von IgG-Antikörpern, die gegen das assoziierte Antigen gerichtet sind, der nahe bei dem oder höher als der Titer von IgG-Antikörpern, die gegen das assoziierte Antigen gerichtet sind, der mit dem Alumen- oder Freund'-Adjuvans erhalten wird, ist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die erfindungsgemäße Verwendung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Membranfraktion zumindest Membranfraktionen von zwei unterschiedlichen Bakterienstämmen umfasst.
Die Erfindung bezieht sich folglich auf eine erfindungsgemäße Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Membranfraktion hergestellt wird durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gefolgt von einer Zentrifugation der Kultur;
b) gegebenenfalls Inaktivierung der lytischen Enzyme des Bodensatzes von Bakterien, der in Schritt a) erhalten wird, dann Zentrifugation der erhaltenen Suspension;
c) Extraktion und Entfernung der Nicht-Membranproteine und der Nukleinsäuren aus dem in Schritt a) oder b) erhaltenen Bodensatz durch wenigstens einen Waschzyklus des Bodensatzes in einer Extraktionslösung;
d) Verdau des Bodensatzes von Membranen, der in Schritt c) erhalten wird, in Gegenwart von proteolytischen Enzymen, gefolgt von einer Zentrifugation;
e) wenigstens einen Waschzyklus des in Schritt d) erhaltenen Bodensatzes in einer physiologischen Lösung und/oder in destilliertem Wasser; und
f) Ultraschallbehandlung des in Schritt e) erhaltenen Bodensatzes.

Der Schritt b) der Inaktivierung der lytischen Enzyme des Bodensatzes von Bakterien, der in Schritt a) erhalten wird, kann durch alle Methoden, die für die Inaktivierung von Enzymen bekannt sind, ausgeführt werden, wie insbesondere durch Erwärmen des resuspendierten bakteriellen Bodensatzes bei einer Temperatur vorzugsweise nahe 100°C oder durch Zugabe eines Inhibitors der Aktivität dieser Enzyme.
Der Schritt c) der Extraktion und Entfernung der Nicht-Membranproteine und der Nukleinsäuren aus dem in Schritt a) oder b) erhaltenen Bodensatz kann beispielsweise ausgeführt werden durch wenigstens einen Waschzyklus des Bodensatzes in einer Extraktionslösung, welcher der Zugabe einer hypertonischen Lösung (Extraktionslösung), vorzugsweise einer Kochsalzlösung mit einer Molarität nahe 1 M, gefolgt nach einer für die gewünschte Wirkung ausreichenden Kontaktzeit von einer Zentrifugation der erhaltenen Suspension und der Entfernung des nach der Zentrifugation erhaltenen Überstands, entspricht, wobei dieser Waschzyklus mehrere Male wiederholt werden kann.
Der Schritt d) eines Verdaus des Bodensatzes von Membranen, der in Schritt c) erhalten wird, kann in Gegenwart einer Lösung von proteolytischen Enzymen, wie beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin oder eines jeglichen Enzyms mit bekannter proteolytischer Aktivität, ausgeführt werden, wobei die Reaktionsbedingungen, pH der Lösung, Temperatur und Dauer der Reaktion, vorzugsweise auf die optimalen Bedingungen für die Aktivität des oder der gewählten Enzyme eingestellt werden, gefolgt von einer Zentrifugation, wobei dieser Verdau-Zyklus mehrere Male mit dem gleichen Enzym, der gleichen Kombination von Enzymen oder mit einem für jeden ausgeführten Verdau-Zyklus unterschiedlichen Enzym wiederholt werden kann.
Der Schritt e) eines Waschens des Bodensatzes, der in Schritt d) erhalten wird, erfolgt durch Wiederaufnehmen des Bodensatzes in einer physiologischen Lösung oder in destilliertem Wasser, nach einer ausreichenden Kontaktzeit gefolgt von einer Zentrifugation, wobei dieser Waschzyklus mehrere Male wiederholt werden kann.
Schließlich hat der Schritt f) einer Ultraschallbehandlung des Bodensatzes insbesondere zum Ziel, die am Ende von Schritt e) erhaltene Membranfraktion zu zerkleinern und zu homogenisieren. Die Bedingungen der Ultraschallbehandlung (Dauer und Leistung) werden von dem Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von beispielsweise der zu behandelnden Menge an Membranfraktion festgelegt werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine erfindungsgemäße Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Membranfraktion hergestellt wird durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gegebenenfalls gefolgt von einer Zentrifugation;
b) das Einfrieren des Kulturmediums oder des Bodensatzes, welches bzw. welcher in Schritt a) erhalten wird, gefolgt von einem Auftauen und der Trocknung der Zellen;
c) Entfernung der Nukleinsäuren der in Schritt b) erhaltenen trockenen Zellen, die resuspendiert worden sind, mittels einer DNase;
d) Aufbrechen der in Schritt c) erhaltenen Zellen und Klärung der erhaltenen Suspension; e) Ausfällung der in Schritt d) erhaltenen Suspension in saurem Milieu und Entfernung des Bodensatzes;
f) Neutralisation des in Schritt e) erhaltenen Überstands, welcher die Membransuspension enthält, gefolgt von einer Dialyse und einer Aufkonzentrierung der Membransuspension; und
g) Sterilisation der in Schritt f) erhaltenen aufkonzentrierten Membransuspension.

Die Bedingungen des Auftauens in Schritt b) des obigen Verfahrens werden selbstverständlich von dem Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von der zu behandelnden anfängli chen Menge an Bodensatz bestimmt, wobei dieses vorzugsweise bei 4°C während wenigstens 48 h für das Äquivalent von 1 kg trockener Zellen ausgeführt wird.
In Schritt c) wird die Entfernung der Nukleinsäuren beispielsweise durch Zugabe einer DNase in einer Endkonzentration von 5 mg/ml einer Suspension von Zellen mit einer zu 5% trockenen Zellen äquivalenten Konzentration ausgeführt.
Das Aufbrechen der in Schritt c) erhaltenen Zellen kann mittels eines jeglichen Systems oder einer jeglichen Apparatur, die dem Fachmann auf diesem Gebiet für das Aufbrechen von Zellen bekannt sind, ausgeführt werden, wie beispielsweise mittels Pressen oder vorzugsweise wie das Aufbrechen in einer Manton-Gaulinet-Schleife (Manton-Gaulin-Homogenisator) während 30 min.
Die Klärung der nach dem Aufbrechen erhaltenen Suspension kann mittels eines jeglichen Systems oder einer jeglichen Apparatur, die dem Fachmann auf diesem Gebiet für die Klärung von Bakterienzellaufschlüssen bekannt sind, wie des Sharpless-Systems, ausgeführt werden.
Der Schritt e) einer Ausfällung der in Schritt d) erhaltenen Suspension in saurem Milieu kann beispielsweise mit Essigsäure ausgeführt werden. Der Ausfällung folgt die Entfernung des Bodensatzes mittels eines Systems vom Typ Sharpless oder durch Gewinnung des Überstands. Der Schritt f) besteht in einem Schritt, in welchem der Überstand, der nach Ausfällung in saurem Milieu erhalten wird, neutralisiert, verdünnt, dialysiert, dann aufkonzentriert wird.
Schließlich besteht der letzte Schritt in einem Sterilisationsschritt des Konzentrats der Membranfraktion, das in dem vorangegangenen Schritt erhalten wird, wie beispielsweise durch Erwärmen bei 121 °C während ungefähr 35 min.
Die Erfindung betrifft insbesondere die erfindungsgemäße Verwendung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass das Antigen oder Hapten unter den Antigenen oder Haptenen, die für ein infektiöses Agens, wie ein Virus, ein Bakterium, einen Pilz oder einen Parasiten, spezifisch sind, oder unter den mit Tumorzellen assoziierten Antigenen ausgewählt wird.
Gemäß der Erfindung werden die Antigene oder Haptene vorzugsweise unter den Peptiden, den Lipopeptiden, den Polysacchariden, den Oligosacchariden, den Nukleinsäuren oder den Lipiden ausgewählt.
Selbstverständlich kann das Antigen oder Hapten, wenn es von peptidischer Natur ist, durch chemische Synthese oder durch Rekombinationstechniken erhalten werden.
Die Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Peptiden sind heutzutage dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden in der vorliegenden Beschreibung nicht erläutert werden. Unter den Zellen, die für die Produktion dieser rekombinanten Peptide einsetzbar sind, muss man selbstverständlich die Bakterienzellen (Olins, P.O., und Lee, S.C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E. coli, Curr. Op. Biotechnology, 4:520– 525), aber gleichfalls die Hefezellen (Buckholz, R.G.., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products, Curr. Op. Biotechnology, 4:538–542) ebenso wie die tierischen Zellen, insbesondere die Kulturen von Säugetierzellen (Edwards, C.P., und Aruffo, A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems, Curr. Op. Biotechnology, 4, 558–563), aber gleichfalls die Insektenzellen, in welchen man Verfahren einsetzen kann, die beispielsweise Baculoviren einsetzen (Luckow, V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products, Curr. Op. Biotechnology 4, 564–572), aufführen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst die Erfindung die erfindungsgemäße Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Antigen oder Hapten kovalent an ein Trägerpeptid gebunden ist, um einen Komplex zu bilden, welcher in der Lage ist, sich spezifisch an Säugetier-Serumalbumin zu binden, wobei das Trägerpeptid vorzugsweise ein Peptidfragment, welches von dem Protein G von Streptokokken stammt, und insbesondere das C-terminale Fragment, welches als BB bezeichnet wird, ist.
Selbstverständlich kann der Komplex durch genetische Rekombination hergestellt werden.
Es wird hier beschrieben, dass der chimäre oder hybride Komplex durch Techniken der in vitro-DNA-Rekombination hergestellt werden kann durch Insertion oder Hinzufügen einer Sequenz, die das Antigen oder Hapten von Protein-Natur kodiert, in oder an eine DNA-Sequenz, die das Peptidfragment des Proteins G von Streptokokken kodiert.
Die Verfahren zur Synthese von hybriden Molekülen umfassen die Verfahren, die im Bereich der Gentechnologie eingesetzt werden, um hybride Polynukleotide, die die gesuchten Polypeptidsequenzen kodieren, zu konstruieren. Man kann beispielsweise in vorteilhafter Weise auf die Technik zur Gewinnung von Genen, die Fusionsproteine kodieren, verweisen, die von D.V. Goeddel beschrieben worden ist (Gene expression technology, Methods in Enzymology, Band 185, 3–187, 1990).
Die Erfindung hat gleichfalls die erfindungsgemäße Verwendung zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein Mittel umfasst, welches erlaubt, die mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierte Membranfraktion in einer Form mitzuführen, welche erlaubt, deren Stabilität und/oder deren Immunogenität zu verbessern, wie in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Typ oder in Form eines Teilchens vom Typ Liposom, Mikrosphäre, Nanosphäre oder einer jeglichen Art von Struktur, welche die Verkapselung und die Präsentation der mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierten Membranfraktion in partikulärer Form erlaubt.
Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäße Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Mittel unter den Aluminiumsalzen, den Calciumsalzen, den Verbindungen pflanzlicher Herkunft, wie Quil A oder Saponin, oder den Verbindungen bakterieller Herkunft, wie den Derivaten von Cholera-Anatoxin, Pertussis-Anatoxin, Tetanustoxoid oder dem thermolabilen Toxin von E. coli, ausgewählt wird.
Von der Erfindung umfasst wird gleichfalls die erfindungsgemäße Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein Mittel umfasst, welches erlaubt, die durch die mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierte Membranfraktion induzierte Immunantwort zu regulieren.
Unter den Regulationsmitteln werden insbesondere die Zytokine, die Wachstumsfaktoren, die Hormone oder Zellbestandteile, wie Nukleinsäuren, ein Protein aus der Familie der Hitzeschockproteine oder Ribosome bevorzugt.
Die Erfindung hat gleichfalls die erfindungsgemäße Verwendung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Verhütung oder Behandlung von Infektionskrankheiten viralen, bakteriellen, pilzlichen oder parasitären Ursprungs bestimmt ist, zum Gegenstand.
Unter den Infektionskrankheiten viralen Ursprungs werden insbesondere die Infektionskrankheiten, die durch Paramyxoviren, insbesondere durch das Parainfluenzavirus und noch mehr bevorzugt durch das Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) hervorgerufen werden, bevorzugt.
Bei einer besonderen Ausführungsweise ist die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Membranfraktion assoziierte Antigen das Peptid G2Na, ein Fragment des Proteins G des Virus mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4, ein zu G2Na homologes Peptid, dessen Sequenz ein Identitätsausmaß von wenigstens 80%, vorzugsweise 90%, 95% und 99% nach Alignment (auf Homologie basierender gegenseitiger Ausrichtung der Aminosäuresequenzen) mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist, oder das Peptid G2Na oder eines von dessen Homologen, das durch kovalente Bindung mit einem C-terminalen Fragment (BB) des Proteins G von Streptokokken verknüpft ist, um einen Komplex zu bilden, der in der Lage ist, sich an Säugetier-Serumalbumin zu binden, umfasst, wobei das Peptid BB in den Dokumenten Power et al., 1997 (Virology, 230, 155–166) und WO 96/14416 beschrieben worden ist.
Mit „Prozentsatz, Ausmaß oder Grad von Identität" zwischen zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen soll im Sinne der Erfindung ein Prozentsatz von zwischen den beiden zu vergleichenden Sequenzen identischen Nukleotiden oder Aminosäureresten, erhalten nach dem besten Alignment, bezeichnet werden, wobei dieser Prozentsatz rein statistisch ist und die Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen zufällig und über deren gesamte Länge verteilt sind. Die Sequenzvergleiche zwischen zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen werden traditionell ausgeführt, indem diese Sequenzen verglichen werden, nachdem man sie auf optimale Weise basierend auf Homologie gegeneinander ausgerichtet hat („Alignment"), wobei der Vergleich pro Segment oder pro „Vergleichsfenster" ausgeführt wird, um die lokalen Regionen mit Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Das optimale Alignment der Se quenzen für den Vergleich kann außer manuell mittels des lokale Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], mittels des lokale Homologie-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], mittels der Ähnlichkeitsrecherchenmethode von Pearson und Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], mittels Software-Programmen, die diese Algorithmen einsetzen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, oder ferner durch die Vergleichs-Software BLAST N oder BLAST P) ausgeführt werden.
Der Identitätsprozentsatz zwischen zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen wird bestimmt, indem diese beiden, pro Vergleichsfenster auf optimale Weise basierend auf Homologie gegeneinander ausgerichteten („Alignment") Sequenzen verglichen werden, wobei die zu vergleichende Region der Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen bezogen auf die Referenzsequenz für ein optimales Alignment zwischen diesen beiden Sequenzen umfassen kann. Der Identitätsprozentsatz wird berechnet, indem die Anzahl von identischen Positionen, bei welchen das Nukleotid oder der Aminosäurerest zwischen den beiden Sequenzen identisch ist, bestimmt wird, indem diese Anzahl von identischen Positionen durch die gesamte Anzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster dividiert wird und indem das erhaltene Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Identitätsprozentsatz zwischen diesen beiden Sequenzen zu erhalten.
Man kann beispielsweise das Programm BLAST, „BLAST 2 sequences", das auf der Seite httg://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html verfügbar ist, einsetzen, wobei die verwendeten Parameter jene sind, die als Vorgabe angegeben werden (insbesondere für die Parameter „open gap penalty": 5, und „extension gap penalty": 2, wobei die gewählte Matrix beispielsweise die Matrix „BLOSUM 62" ist, die von dem Programm vorgeschlagen wird), wobei der Identitätsprozentsatz zwischen den beiden zu vergleichenden Sequenzen direkt durch das Programm berechnet wird.
Die Erfindung beschreibt so ein Verfahren zur Herstellung einer Membranfraktion von gramnegativen Bakterien, insbesondere Klebsiella pneumoniae, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gefolgt von einer Zentrifugation der Kultur;
b) gegebenenfalls Inaktivierung der lytischen Enzyme des Bodensatzes von Bakterien, der in Schritt a) erhalten wird, dann Zentrifugation der erhaltenen Suspension;
c) Extraktion und Entfernung der Nicht-Membranproteine und der Nukleinsäuren aus dem in Schritt a) oder b) erhaltenen Bodensatz durch wenigstens einen Waschzyklus des Bodensatzes in einer Extraktionslösung;
d) Verdau des Bodensatzes von Membranen, der in Schritt c) erhalten wird, in Gegenwart von Protease-Enzymen, gefolgt von einer Zentrifugation;
e) wenigstens einen Waschzyklus des in Schritt d) erhaltenen Bodensatzes in einer physiologischen Lösung und/oder in destilliertem Wasser; und
f) Ultraschallbehandlung des in Schritt e) erhaltenen Bodensatzes.

Die Erfindung beschreibt auch das Verfahren zur Herstellung einer Membranfraktion von gramnegativen Bakterien, insbesondere Klebsiella pneumoniae, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

Der Proteoglycan-Titer der Membranfraktionen, die durch die Verfahren erhalten werden können, des Wirkstoffs der FMKp, repräsentiert durch die Summe der Gehalte an Galactose und an Protein, liegt vorzugsweise zwischen:

– für Galactose: zwischen 1,2 g/l und 3,4 g/l;
– für die Proteine: zwischen 7,5 g/l und 14,9 g/l.

Mehr bevorzugt liegt dieser Titer zwischen:

– für Galactose: zwischen 1,6 g/l und 2,6 g/l;
– für die Proteine: zwischen 9,3 g/l und 11,7 g/l.

Die Erfindung betrifft außerdem die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche eine Membranfraktion, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gemäß der Verwendung der Erfindung erhalten wird, und ein Antigen, Hapten oder einen Komplex, wie zuvor definiert, gemischt mit der Membranfraktion umfassen, wobei das Antigen ausgewählt wird unter den peptidischen Fragmenten von Paramyxovirus.
Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen außerdem Mittel, wie Träger, Regulationsmittel, die zuvor definiert wurden, umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsweise ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass das Paramyxovirus ein Respiratory- Syncytial-Virus oder ein Parainfluenzavirus ist, vorzugsweise dass das mit der Membranfraktion assoziierte Antigen das Peptid G2Na mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4 des Respiratory-Syncytial-Virus, eines von dessen Homologen, welche wenigstens 80% Identität aufweisen, wie zuvor definiert, oder das Peptid G2Na oder eines von dessen Homologen, welche wenigstens 80% Identität aufweisen, welches durch kovalente Bindung mit einem C-terminalen Fragment (BB) des Proteins G von Streptokokken verknüpft ist, um einen Komplex zu bilden, der in der Lage ist, sich an Säugetier-Serumalbumin zu binden, umfasst.
Die Legenden der Figuren und Beispiele, die folgen, sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne deren Umfang in irgendeiner Weise zu beschränken.
Legenden der Figuren:
1: BBG2Na, versetzt mit dem Adjuvans FMKp – Dosis-Wirkungs-Untersuchung (anti-G2Na-IgG-Serumtiter). * p < 0,05 (bezogen auf die PBS-Gruppe).
2: BBG2Na, versetzt mit dem Adjuvans FMPk – anti-G2Na-IgG1- und -IgG2a-Titer.
3: BBG2Na, versetzt mit dem Adjuvans FMPk – Untersuchung des Schutzes.
4: Adjuvans-Wirkung der FMKp gegenüber Immugrip (Grippeimpfstoff). * p < 0,05 verglichen mit der nicht mit Adjuvans versetzten Gruppe („0") am gleichen Tag der Probennahme.
Beispiel 1: Gewinnung der Membranfraktion von K. pneumoniae (FMKp)
Verfahren Nr. 1
Der Extraktion der Membranen von K. pneumoniae I145 ausgehend von dem Zentrifugationsbodensatz des Schritts geht vorzugsweise ein Schritt einer Zerstörung der lytischen Enzyme der in dem Bodensatz enthaltenen Zellbestandteile, beispielsweise durch Erwärmen von jenem bei 100°C, gegebenenfalls nach Resuspendierung, voraus.
Die Extraktion der Membranen im eigentlichen Sinne ausgehend von dem Zentrifugationsbodensatz erfolgt vorzugsweise durch Behandlung der Zellbestandteile des Bodensatzes, nach einer etwaigen Zerstörung der lytischen Enzyme, mit Hilfe einer Kochsalzlösung, beispielsweise 1 M Natriumchlorid, ein- oder mehrmals, dann Zentrifugation, vorzugsweise bei 20000 g, der erhaltenen Suspension, wobei der Überstand aus dieser Zentrifugation, der beseitigt wird, die nicht-membranartigen Verunreinigungen, wie Proteine und Nukleinsäuren, enthält, wohingegen der Bodensatz die Membranen enthält.
Nach Abtrennung der Kochsalzlösung, welche die Verunreinigungen enthält, werden die Membranen in Gegenwart von proteolytischen Enzymen, vorzugsweise Trypsin und Chymotrypsin, in einer Lösung mit pH 8 bei 37°C 4 h verdaut.
Nach dem Verdau wird die Lösung durch Ultraschallbehandlung homogenisiert. Das so erhaltene Produkt bildet die als FMKp bezeichnete Membranfraktion.
Der erhaltene Überstand wird unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugiert, vorzugsweise bei 140000 g.
Herstellung der Membran-Glycopeptide
Diese Fraktion wird ausgehend von dem durch Zentrifugation bei 40000 g während 20 min erhaltenen Bodensatz hergestellt. Dieser Bodensatz wird in physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert, dann wird diese Suspension in einem Wasserbad mit kochendem Wasser 10 min auf 100°C erwärmt, um die lytischen Enzyme zu inaktivieren. Nach dem Abkühlen zentrifugiert man 30 min bei 20000 g. Der erhaltene Bodensatz wird zweimal mit 1 M NaCl extrahiert, um die Proteine und die Nukleinsäuren zu entfernen. Die Membranen werden durch 30-minütige Zentrifugation bei 20000 g gesammelt.
Sie werden dann einem Verdau durch Trypsin bei pH 8 und bei 37°C während 4 h, dann durch Chymotrypsin unter den gleichen Bedingungen unterworfen.
Die Membranen werden dann durch Zentrifugation bei 2000 g während 30 min gesammelt, mit physiologischer Kochsalzlösung, dann destilliertem Wasser gewaschen und werden einer 15-minütigen Zerkleinerung durch Ultraschall unterworfen.
Verfahren Nr. 2
Nach Auftauen bei +4°C während mindestens 48 h werden 1 kg trockene Zellen von K. pneumoniae zu einer Konzentration von 5% trockene Zellen resuspendiert. Die DNase wird in einer Konzentration von 5 mg/l zugesetzt. Man nimmt dann das Aufbrechen in einer Manton-Gaulin-Schleife (Manton-Gaulin-Homogenisator) während 30 min, dann eine Klärung mittels eines SHARPLES-Systems bei 50 l/h vor, gefolgt von einer Ausfällung mit Essigsäure bei pH = 4,2 + 0,1 während 30 min. Der Bodensatz wird entfernt (SHARPLES, mit 25 l/h) und der Überstand wird neutralisiert, auf das Doppelte des Anfangsvolumens mit durch Osmose gereinigtem Wasser verdünnt. Eine Dialyse bei konstantem Volumen wird dann mittels PUF 100 bis zu 800 Ωcm ausgeführt, gefolgt von einer Aufkonzentrierung der so erhaltenen Membransuspension (MS) bis auf 11 l/kg trockene Zellen. Man nimmt dann die Autoklavierung der MS bei +121 °C während 35 min vor, die man bei +4°C 6 Wochen aufbewahren kann.
Charakteristiken der FMKp
Per definitionem ist der Titer an Proteoglycan, des Wirkstoffs der FMPk, gleich der Summe der Gehalte an Galactose und an Proteinen.

- Galactose: im Mittel 2,2 g/l.
– Proteine: im Mittel 10,5 g/l.

Beispiel 2: Adjuvans-Wirkung der FMKp auf ein rekombinantes Protein, BBG2Na.
BBG2Na ist ein in E. coli produziertes rekombinantes Protein. Es wird aus dem Peptid G2Na mit der Sequenz SEQ ID NO: 4, dem Fragment des Proteins G des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) vom Typ A, welches von Rest 130 bis Rest 230 geht, fusioniert mit BB, einem Fragment des Proteins G der Streptokokken, welches die Fähigkeit hat, sich an Serumalbumin zu binden, gebildet. BBG2Na ist ein anti-RSV-Impfstoff (Power, U., Virology 1997, 230:155–166).
BALB/c-Mäuse erhalten subkutan 2 Injektionen von 20 μg BBG2Na und unterschiedlichen Mengen FMKp. Blutentnahmen werden am Tag 28 ausgeführt und die Serumantikörper-Titer werden durch ELISA mit G2Na in fester Phase bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden durch die 1 veranschaulicht. Überraschenderweise zeigen sie, dass die FMKp die anti-G2Na-IgG-Antwort signifikant erhöht; der erzielte anti-G2Na-IgG-Titer ist ähnlich zu jenen, die durch Alumen oder durch Freund'-Adjuvans induziert werden. Die Wirkung ist dosisabhängig: sie wird ab 5 μg FMKp beobachtet, ist maximal ab 50 μg FMKp und bleibt stabil mit 100 μg FMKp. Die FMKp ist folglich ein potentielles Adjuvans für BBG2Na.
Um die Wirkung der FMKp auf die Orientierung der Immunantwort in Bezug auf die Th1/Th2-Antwort kennenzulernen, wurden die anti-G2Na-IgG1- und -IgG2a-Titer an Seren, die, wie zuvor genau ausgeführt, erhalten worden waren, bestimmt. Die Ergebnisse (2) zeigen, dass die FMKp überraschenderweise in der Lage ist, das anti-G2Na-IgG1/IgG2a-Verhältnis zu modifizieren zu dem Gegenteil dessen, das mit Alumen beobachtet wird, für welches der hauptsächliche Isotyp IgG1 ist. Das Profil liegt nahe bei jenem, das durch das Freund'-Adjuvans induziert wird. Dies zeigt an, dass die FMKp als Adjuvans der Immunität eingesetzt werden kann, um eine Antwort vom gemischten Typ (Th1/Th2) zu induzieren.
Die wie oben beschrieben immunisierten Tiere haben eine Virusprüfung (Virus-Provokation; Virus-Challenge) auf nasalem Wege mit 10⁵ TCID₅₀ RSV-A erhalten. Jene erfolgte 3 Wochen nach der letzten Immunisierung. Fünf Tage nach der Virusprüfung wurden die Tiere getötet und die Lungen entnommen, um die RSV-A-Titer zu bestimmen. Die Ergebnisse (3) zeigen, dass die Tiere, die BBG2Na, versetzt mit dem FMKp-Adjuvans, erhalten hatten, gegen eine Provokation (Challenge) mit RSV-A geschützt sind.
Als Schlussfolgerung erlaubt die FMKp, die Antikörper-Antwort umzuorientieren, ohne das Schutzvermögen der Mäuse gegen eine Provokation mit RSV-A zu beeinflussen.
Beispiel 3: Adjuvans-Wirkung der FMKp auf ein inaktiviertes Virus (Grippeimpfstoff)
BALB/c-Mäuse erhielten eine einzige Injektion von 0,01 μg Immugrip^TM (Grippeimpfstoff, der von den Laboratoires INAVA vertrieben wird) und von unterschiedlichen Mengen von FMKp. Die Produkte werden gemeinsam verabreicht. Die Injektion erfolgt auf subkutanem Wege am Tag 0. Blutabnahmen erfolgen am Tag 7, Tag 14 und Tag 21. Der anti-Immugrip-IgG-Serumantikörpertiter wird ermittelt durch ELISA mit 2 μg/ml Immugrip in fester Phase. Die aufgeführten Ergebnisse (4) zeigen, dass die FMKp den anti-Immugrip-Antikörpertiter signifikant erhöht und dies ab der niedrigsten FMKp-Dosis, nämlich 0,1 μg. Die Adjuvans-Wirkung ist dosisabhängig. Man stellt interessanterweise fest, dass das Vorhandensein der FMKp die Erzeugung einer früheren Antikörperantwort induziert, welche ab Tag 7 beobachtet wird, vergli chen mit der nicht mit Adjuvans verabreichten Immugrip-Kontrolle. Diese Wirkung wurde mit dem Referenz-Adjuvans, dem kompletten Freund'-Adjuvans (CFA), nicht erhalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Membranfraktion von Klebsiella pneumoniae, welche mit einem Antigen oder Hapten gemischt ist, wobei das Antigen oder Hapten unter den für ein infektiöses Agens spezifischen Antigenen oder Haptenen oder unter den mit Tumorzellen assoziierten Antigenen ausgewählt wird und wobei die Mischung in der Lage ist, die Immunantwort in Richtung einer Antwort vom Th1-Typ und/oder vom gemischten Th1/Th2-Typ, welche gegen das Antigen oder Hapten gerichtet ist, zu dirigieren, bei welcher Antwort die Th1-Antwort der Antwort vom Th2-Typ nahe kommt oder stärker als jene ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche für die Verhütung oder die Behandlung von Infektionskrankheiten oder Krebserkrankungen bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranfraktion hergestellt wird durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gefolgt von einer Zentrifugation der Kultur; b) gegebenenfalls Inaktivierung der lytischen Enzyme des Bodensatzes von Bakterien, der in Schritt a) erhalten wird, dann Zentrifugation der erhaltenen Suspension; c) Extraktion und Entfernung der Nicht-Membranproteine und der Nukleinsäuren aus dem in Schritt a) oder b) erhaltenen Bodensatz durch wenigstens einen Waschzyklus des Bodensatzes in einer Extraktionslösung; d) Verdau des Bodensatzes von Membranen, der in Schritt c) erhalten wird, in Gegenwart von Protease-Enzymen, gefolgt von einer Zentrifugation; e) wenigstens einen Waschzyklus des in Schritt d) erhaltenen Bodensatzes in einer physiologischen Lösung und/oder in destilliertem Wasser; und f) Ultraschallbehandlung des in Schritt e) erhaltenen Bodensatzes; oder durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gegebenenfalls gefolgt von einer Zentrifugation; b) das Einfrieren des Kulturmediums oder des Bodensatzes, welches bzw. welcher in Schritt a) erhalten wird, gefolgt von einem Auftauen und der Trocknung der Zellen; c) Entfernung der Nukleinsäuren der in Schritt b) erhaltenen trockenen Zellen, die resuspendiert worden sind, mittels einer DNase; d) Aufbrechen der in Schritt c) erhaltenen Zellen und Klärung der erhaltenen Suspension; e) Ausfällung der in Schritt d) erhaltenen Suspension in saurem Milieu und Entfernung des Bodensatzes; f) Neutralisation des in Schritt e) erhaltenen Überstands, welcher die Membransuspension enthält, gefolgt von einer Dialyse und einer Aufkonzentrierung der Membransuspension; und g) Sterilisation der in Schritt f) erhaltenen aufkonzentrierten Membransuspension.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranfraktion wenigstens Membranfraktionen von zwei unterschiedlichen Bakterienstämmen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen oder Hapten unter den Peptiden, den Lipopeptiden, den Polysacchariden, den Oligosacchariden, den Nukleinsäuren oder den Lipiden ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen oder Hapten kovalent an ein Trägerpeptid gebunden ist, um einen Komplex zu bilden, welcher in der Lage ist, sich spezifisch an Säugetier-Serumalbumin zu binden.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpeptid ein Peptidfragment ist, welches von dem Protein G von Streptokokken stammt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex durch genetische Rekombination hergestellt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein Mittel umfasst, welches erlaubt, die mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierte Membranfraktion in einer Form mitzuführen, welche erlaubt, deren Stabilität und/oder deren Immunogenität zu verbessern.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel eine Emulsion vom Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Typ ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein Teilchen vom Typ Liposom, Mikrosphäre, Nanosphäre oder eine jegliche Art von Struktur, welche die Verkapselung und die Präsentation der mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierten Membranfraktion in partikulärer Form erlaubt, ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel unter den Aluminiumsalzen, den Calciumsalzen, den Verbindungen pflanzlicher Herkunft, wie Quil A oder Saponin, oder den Verbindungen bakterieller Herkunft, wie den Derivaten von Cholera- Anatoxin, Pertussis-Anatoxin, Tetanustoxoid oder dem thermolabilen Toxin von E. coli, ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein Mittel umfasst, welches erlaubt, die durch die mit dem Antigen, Hapten oder Komplex assoziierte Membranfraktion induzierte Immunantwort zu regulieren.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Regulationsmittel unter den Zytokinen, den Wachstumsfaktoren, den Hormonen oder Zellbestandteilen, wie Nukleinsäuren, einem Protein aus der Familie der Hitzeschockproteine oder Ribosomen, ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Verhütung oder Behandlung von Infektionskrankheiten bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Infektionskrankheit viralen, bakteriellen, pilzlichen oder parasitären Ursprungs ist.
Verwendung nach Anspruch 13 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Verhütung oder Behandlung von Infektionen durch Paramyxoviren bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Paramyxovirus ein Respiratory-Syncytial-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Membranfraktion assoziierte Antigen das Peptid G2Na mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4 oder eines von dessen Homologen, dessen Sequenz ein Identitätsausmaß von wenigstens 80% zu der Sequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid G2Na oder das eine von dessen Homologen durch kovalente Bindung mit einem C-terminalen Fragment (BB) des Proteins G von Streptokokken verknüpft ist, um einen Komplex zu bilden, der in der Lage ist, sich an Säugetier-Serumalbumin zu binden.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Paramyxovirus ein Parainfluenzavirus ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Membranfraktion und ein Antigen oder Hapten, das mit der Membranfraktion gemischt ist, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen unter Peptidfragmenten von Paramyxoviren ausgewählt wird, und dadurch gekennzeichnet, dass die Membranfraktion hergestellt wird durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gefolgt von einer Zentrifugation der Kultur; b) gegebenenfalls Inaktivierung der lytischen Enzyme des Bodensatzes von Bakterien, der in Schritt a) erhalten wird, dann Zentrifugation der erhaltenen Suspension; c) Extraktion und Entfernung der Nicht-Membranproteine und der Nukleinsäuren aus dem in Schritt a) oder b) erhaltenen Bodensatz durch wenigstens einen Waschzyklus des Bodensatzes in einer Extraktionslösung; d) Verdau des Bodensatzes von Membranen, der in Schritt c) erhalten wird, in Gegenwart von Protease-Enzymen, gefolgt von einer Zentrifugation; e) wenigstens einen Waschzyklus des in Schritt d) erhaltenen Bodensatzes in einer physiologischen Lösung und/oder in destilliertem Wasser; und f) Ultraschallbehandlung des in Schritt e) erhaltenen Bodensatzes; oder durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: a) die Kultivierung der Bakterien in einem Kulturmedium, welches deren Vermehrung erlaubt, gegebenenfalls gefolgt von einer Zentrifugation; b) das Einfrieren des Kulturmediums oder des Bodensatzes, welches bzw. welcher in Schritt a) erhalten wird, gefolgt von einem Auftauen und der Trocknung der Zellen; c) Entfernung der Nukleinsäuren der in Schritt b) erhaltenen trockenen Zellen, die resuspendiert worden sind, mittels einer DNase; d) Aufbrechen der in Schritt c) erhaltenen Zellen und Klärung der erhaltenen Suspension; e) Ausfällung der in Schritt d) erhaltenen Suspension in saurem Milieu und Entfernung des Bodensatzes; f) Neutralisation des in Schritt e) erhaltenen Überstands, welcher die Membransuspension enthält, gefolgt von einer Dialyse und einer Aufkonzentrierung der Membransuspension; und g) Sterilisation der in Schritt f) erhaltenen aufkonzentrierten Membransuspension.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Paramyxovirus ein Respiratory-Syncytial-Virus oder ein Parainfluenzavirus ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Membranfraktion assoziierte Antigen das Peptid G2Na mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4 des Respiratory-Syncytial-Virus oder ein Peptid, dessen Sequenz ein Identitätsausmaß von wenigstens 80% zu der Sequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid G2Na oder das eine von dessen Homologen durch kovalente Bindung mit einem C-terminalen Fragment (BB) des Proteins G von Streptokokken verknüpft ist, um einen Komplex zu bilden, der in der Lage ist, sich an Säugetier-Serumalbumin zu binden.