DE60030567T2

DE60030567T2 - Aus muskeln abstammenden wirkstoffe enthaltende zusammensetzung

Info

Publication number: DE60030567T2
Application number: DE60030567T
Authority: DE
Inventors: Pnina Fishman
Original assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Current assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: US6537587B1; CA2378726A1; JP2003505425A; WO2001007060A1; AU5841800A; DE60030567D1; AU758856B2; MXPA02000915A; EP1204418A1; IL131096A0; CN1195529C; EP1204418B1; AU758856C; ATE338559T1; IL131096A; CN1399553A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein neues Verfahren für die Produktion einer Zusammensetzung, welche das Wachstum von Tumorzellen inhibiert und die Fortpflanzung normaler Zellen stimuliert. Die Erfindung betrifft desweiteren die Verwendung einer solchen Zusammensetzung in der Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener bösartiger Zustände und Erkrankungen, wie auch in Kombination mit chemotherapeutischen Behandlungen.
GLOSSAR
Im folgenden werden Begrifflichkeiten dargelegt, welche über die Beschreibung hinweg und die Ansprüche verwendet werden und welche in Übereinstimmung mit der Erfindung so verstanden werden sollen, dass sie folgendes bedeuten:
Biologisch aktiv – Aufweisend die folgenden biologischen Aktivitäten: Inhibierung der Fortpflanzung von Tumorzellen, Stimulation der Fortpflanzung von Leukozyten, hauptsächlich von Neutrophilen, antimetastatische Effekte in vivo und Reduktion der cytotoxischen Nebenwirkungen der chemotherapeutischen Behandlungen.
Zusammensetzung aus Materie – eine Zusammensetzung umfassend eine oder mehrere Substanzen, welche jeweils eine oder mehrere biologische Aktivitäten aufweisen.
Muskelgewebe – Muskelgewebe oder Zellen, direkt erhalten von einem Tier. Zur Herstellung der biologisch aktiven Zusammensetzung von dem Muskelgewebe oder der Zelle kann das Muskelgewebe oder die Zelle unmittelbar verwendet werden, nachdem sie von dem Tier erhalten werden oder sie können für variable Zeiträume beibehalten werden unter Bedingungen, welche eventuell ermöglichen, die Zusammensetzung der Erfindung daraus herzustellen.
Target-Zellen – Die Zellen betroffen durch die Zusammensetzung.
Anti-metastatischer Effekt – Effekt des Vorbeugens oder Reduzierens des metastatischen Prozesses in einem Subjekt. Der Effekt kann manifestiert werden beim Vorbeugen der Erscheinung des metastatischen Focus, in einer Verminderung der Rate des Auftretens der metastatischen Tumore oder einer Verminderung in der Anzahl der metastatischen Tumore, welche in einem Individuum erscheinen, oder in der Verminderung in der Rate von Krebs-verwandter Mortalität.
Chemoschützende Wirkung – Verminderung der cytotoxischen Nebenwirkung der Chemotherapie und insbesondere der Verminderung der Anzahl der weißen Blutzellen und Neutrophile in einem Individuum, behandelt mit einer chemotherapeutischen Behandlung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 3 kD, welche desweiteren die Fortpflanzung verschiedener Tumorzellen inhibieren, wurden zuvor bereits beschrieben in der internationalen Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 96/09060. Diese Moleküle wurden als "Muskelfaktor" (MF) bezeichnet und für sie wurde auf der einen Seite gezeigt, dass sie eine inhibitorische Aktivität auf Tumorzellen ausüben und auf der anderen Seite, dass sie die Fortpflanzung auf Nicht-Tumorzellen vorantreiben, normalen Zellen, wie z. B. Fibroblasten und Knochenmarkszellen in vitro. Darüber hinaus wurde für die MFs gezeigt, dass sie eine chemoschützende Wirkung in vivo verleihen dahingehend, dass sie die Reduktion in der Anzahl an Leukozyten sowie dem Prozentsatz an Neutrophilen in einem Individuum, welcher eine Chemotherapie empfängt, vermindern oder vorbeugen. Die MFs, wie oben beschrieben, wurden erzeugt aus einem kultivierten Medium an Muskelzellen oder Leukozyten, gezüchtet in Kultur.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass eine sehr potente biologisch aktive Zusammensetzung an Materie relativ leicht hergestellt werden kann in großen Mengen aus Muskelgewebe, erhalten von verschiedenen tierischen Quellen.
Die vorliegende Erfindung stellt zu diesem Zweck ein Verfahren zur Verfügung zum Herstellen einer biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie, welches folgendes umfasst:

(i) Behandeln des Muskelgewebes, erhalten von verschiedenen tierischen Quellen in einem flüssigen Medium unter Bedingungen, in welchem besagte Zusammensetzung an Materie, enthaltend innerhalb des Gewebes, in das Medium als ein Überstand freigesetzt wird;
(ii) Abtrennen des Überstandes von der Zellmaterie; und
(iii) Abtrennen von dem Überstand einer Fraktion, welches Substanzen umfasst, welche ein Molekulargewicht von unter ungefähr 10.000 Dalton haben, vorzugsweise unter ungefähr 3.000 Dalton, wobei

Das Muskelgewebe, von welchem die biologisch aktive Zusammensetzung an Materie der Erfindung hergestellt wird, kann beispielsweise Hühnerfleisch sein, Truthahnfleisch, Rindfleisch, Schweinefleisch etc. Die biologisch aktive Zusammensetzung an Materie der Erfindung zeigt seine Wirkung über Spezies hinweg. Folglich wird besagte Zusammensetzung an Materie, welche aus Hühnermuskeln hergestellt wird, Targetzellen von Säugetieren, einschließlich Menschen, beeinflussen.
Die Zusammensetzung der Materie der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden aus dem Muskelgewebe, unmittelbar folgend auf die Extraktion an Muskelgewebe von dem Tier. Alternativ kann das extrahierte Muskelgewebe beibehalten werden für verschiedene Zeiträume, welche auf die Extraktion an Muskelgewebe aus dem Tier folgen, und zwar unter solchen Bedingungen, welche nicht die eventuelle Herstellung der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie daraus ausschließen. Solche Bedingungen können beispielsweise Speichern in der Kälte, ggf. mit einem Konservierungsmittel darstellen. Desweiteren kann das Fleisch zusätzlich gekocht werden, typischerweise mild, um zu einem Zeitraum in der Brühe, in welcher es gekocht worden ist, gelagert werden. Solches Kochen setzt selbst die Zusammensetzung an Materie in das umgebende Medium frei und folglich kann die Brühe zu Zeiten für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an Materie eingesetzt werden.
Die biologisch aktive Zusammensetzung an Materie, erhalten aus Muskelgewebe, kann in der Form von einem natürlichen Rohextrakt vorliegen. Der natürliche Rohextrakt kann beibehalten werden in seiner ursprünglichen flüssigen Form oder kann getrocknet werden, beispielsweise durch Lyophilisierung. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung an Materie der Erfindung auch in einer Form eines aufgereinigten Extraktes vorliegen. Um eine besser aufgereinigte Zusammensetzung zu erhalten, kann die Fraktion, abgetrennt von dem Überstand, wie oben beschrieben, weiteren Aufreinigungsschritten unterzogen werden, wie z.B. Fraktionierung durch Chromatographie, typischerweise Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC, high pressure liquid chromatography), beispielsweise reverse phase HPLC. Darüber hinaus kann die ursprüngliche Präparation weiteren Filtrationsstadien unterzogen werden, desweiteren durch Dialyse aufgereinigt werden.
Die biologisch aktive Zusammensetzung an Materie der Erfindung, erhalten durch das obige Verfahren, hat sich als aufweisend mehrere biologische Aktivitäten herausgestellt. Zuerst inhibiert die Zusammensetzung die Fortpflanzung von bösartigen Zellen. Demgegenüber inhibiert die Zusammensetzung an Materie der Erfindung nicht die Proliferation von nicht bösartigen Zellen und darüber hinaus stimuliert sie die Fortpflanzung von weißen Blutzellen, speziell Neutrophilen.
Eine zusätzliche biologische Aktivität der Zusammensetzung an Materie der Erfindung ist ihr anti-metastatischer Effekt in vivo. Die Verabreichung der Zusammensetzung an Materie in einer Vielzahl von tierischen Modellen zeigte, dass sie die Anzahl an metastatischen Foki in den getesteten Tieren reduzierte im Vergleich zu Tumor-tragenden Tieren, welche nicht mit der Zusammensetzung an Materie der vorliegenden Erfindung behandelt wurden.
Zusätzlich zu den oben genannten Aktivitäten weist die Zusammensetzung an Materie der Erfindung auch einen chemoschützenden Effekt in einem Individuum auf, welches chemotherapeutische Behandlung empfängt. Solche therapeutischen Behandlungen haben ernste zytotoxische Nebenwirkungen auf eine Vielzahl von Zellen, einschließend hematopoietische Zellen, wie z.B. Knochenmarkszellen, Leukozyten, insbesondere Neutrophile und andere. Die Zusammensetzung an Materie der Erfindung vermindert oder inhibiert einige der toxischen Effekte solcher therapeutischen Behandlung, was in einer stärker eingeschränkten Reduktion der Anzahl von nicht bösartigen Leukozyten resultiert und ggf. sogar in einer Zunahme in der Anzahl von weißen Blutzellen, hauptsächlichen Neutrophilen, in Individuen, welche die Zusammensetzung der Erfindung in Kombination mit der therapeutischen Behandlung empfangen.
Die Zusammensetzung an Materie der Erfindung verleiht ihre biologische Aktivität sowohl, wenn sie parenteral verabreicht wird, als auch wenn sie oral verabreicht wird. Die orale Verabreichung der Zusammensetzung an Materie der Erfindung ist ein bevorzugter Modus der verabreichenden Übereinstimmung mit der Erfindung, wie auch unten erläutert wird.
Die vorliegenden Erfindung stellt auch die Verwendung einer biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie mit den folgenden Eigenschaften zur Verfügung:

(i) sie ist abgeleitet von Muskelgewebe;
(ii) sie filtriert sich durch einen Filter mit einem maximalen Molekulargewicht-Cut-off von ungefähr 10.000 Dalton, vorzugsweise als 3.000 Dalton;
(iii) sie weist eine biologische Wirkung auf des Inhibierens der Proliferation von Tumorzellen sowie der Stimulation der Proliferation von Leukozyten und Neutrophilen; diese Substanz ist zum Herstellen eines Medikaments zum Inhibieren von toxischen Effekten von Individuen, welche eine chemotherapeutische Behandlung empfangen.

Der Begriff "effektive Menge", wie hier verwendet, sollte sich verstehen als eine Menge der Zusammensetzung an Materie der Erfindung, welche hinreichend ist, einen gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen.
Die biologisch aktive Zusammensetzung der Erfindung weist ein geringes Molekulargewicht auf und ist löslich in Wasser. Der Begriff "geringes Molekulargewicht" sollte sich verstehen als ein Molekulargewicht einer Substanz, welche durch einen Filter filtriert mit einem maximalen Molekulargewiczhts-Cut-off von ungefähr 10.000 Dalton. Vorzugsweise weist die Zusammensetzung ein maximales Molekulargewicht von 5.000 Dalton auf und am meisten bevorzugt weist sie ein molekulares Gewicht von ungefähr 3.000 Dalton auf.
Zum Verhindern von Krebs kann die Zusammensetzung verabreicht werden an Individuen, welche keinen Krebs aufweisen und speziell an Individuen, welche ein hohes Risiko tragen, Krebs zu entwickeln. In diesem Fall wird die Zusammensetzung an Materie typischerweise über einen verlängerten Zeitraum in einer einzelnen täglichen Dosis verabreicht, in mehreren Dosen pro Tag, als eine Einzeldosis und in mehreren Tagen etc. Zur Behandlung von Krebs kann die Zusammensetzung an Materie der Erfindung an Individuen zu verschiedenen Stadien des Krebs verabreicht werden. Typischerweise wird die Zusammensetzung an Materie als eine Nachfolgebehandlung einer ursprünglichen Behandlung des primären Krebses, beispielsweise einer Chemotherapie oder Strahlentherapie oder einem chirurgischen Eingriff zum Verhindern des Entwickelns der Tumormetastasen, verabreicht werden. Jedoch kann die Zusammensetzung an Materie der Erfindung auch verabreicht werden an Individuen, welche Krebs im Frühstadium aufweisen, um das Tumorwachstum zu vermindern oder zu verhindern.
Der Begriff "effektive Menge" wird eine Menge sein einer biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie in einem gegebenen therapeutischen Verabreichungsplan, welcher hinreichend ist, dass Wachstum und die Fortpflanzung von Tumorzellen zu inhibieren oder zu reduzieren. Wo die Zusammensetzung an Materie zur Behandlung von Krebs verabreicht wird, ist die effektive Menge eine Menge von besagter Zusammensetzung, welche beispielsweise im Eindämmen des Wachstums der Primärtumors resultieren wird, in einer Abnahme in der Rate des Auftretens von metastatischen Tumoren oder einer Abnahme in der Anzahl an metastatischen Tumoren, welche in einem Individuum erscheinen oder in einer Abnahme in der Rate an krebsverwandter Mortalität. Wenn eine Zusammensetzung zur Krebs-Prävention verabreicht wird, wird eine effektive Menge von besagter Zusammensetzung sein, welche hinreichend ist, das Auftreten von primären Tumoren in dem behandelten Individuum zu inhibieren oder zu vermindern.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung an Materie verwendet zur Herstellung eines Medikaments, um einige der zytotoxischen Nebenwirkungen der chemotherapeutischen Wirkstoffe zu inhibieren (d.h. zu verhindern oder zu reduzieren). Wie oben erwähnt, besteht der hauptsächliche zytotoxische Effekt solcher Wirksubstanzen in der Reduktion der Leukozytenzahlen, insbesondere der neutrophilen Zahl in Individuen, welche solch eine Behandlung empfangen. Das Ergebnis der Verabreichung der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie der Erfindung in Kombination mit solchen chemotherapeutischen Wirksubstanzen ist eine stärker eingeschränkte Reduktion in der Anzahl an Neutrophilen in dem behandelten Individuum im Vergleich zu der Anzahl von solchen Zellen in einem krebsfreien Individuum und ggf., sogar eine Zunahme in der Anzahl dieser Zellen über normale Niveaus.
In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform sollte der Begriff "effektive Menge" sich so verstehen, dass er die Menge der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie bedeutet, welche ein Individuum schützt, welche chemotherapeutische Behandlungen gegen die Wirksubstanz-induzierte Reduktion in der Anzahl von Leukozyten, insbesondere Neutrophilen schützt. Solch eine Menge an Zusammensetzung an Materie kann entweder die geringe Anzahl solcher Zellen in einem behandelten Individuum vergrößern, um sie auf die Anzahl an Zellen in einem krebsfreien Individuum zu regenerieren, oder ggf. das Niveau solcher Zellen sogar über die Anzahl von Zellen in einem krebsfreien Individuum zu steigern.
Die Zusammensetzung an Materie der Erfindung zeigt zur gegebenen Zeit auch eine spezifische potenzierende Wirkung für die chemotherapeutische Wirksubstanz auf die Krebszellen. Diese Zunahme an Effizienz kann in einer deutlich hervortretenden Zerstörung von Tumorzellen bei einer gegebenen Dosis der Wirksubstanz, verabreicht in Kombination mit der Zusammensetzung an Materie der Erfindung resultieren oder in einer Reduktion der benötigten Dosis der Wirksubstanz, welche benötigt wird, um einen bestimmten therapeutischen Effekt zu erzielen, wenn sie in Kombination mit der Zusammensetzung der Erfindung verabreicht wird. Die Zusammensetzung an Materie der Erfindung kann verwendet werden, um den therapeutischen Index einer chemotherapeutischen Wirksubstanz zu verbessern. Für den Zweck des Verbesserns eines therapeutischen Index eines chemotherapeutischen Wirkstoffes wird die effektive Menge der biologisch aktiven Zusammensetzung der Erfindung eine Menge der Zusammensetzung sein, welche entweder die krebsspezifische Toxizität der chemotherapeutischen Behandlung steigert, oder eine Menge der Zusammensetzung, welche effektiv ist in der Verminderung der Menge der chemotherapeutischen Wirksubstanz oder die Wirksubstanz-Kombination, benötigt, um eine gewünschte Wirkung der chemotherapeutischen Wirksubstanz oder Wirksubstanz-Kombination zu erzielen, d.h. die Reduktion der Tumorlast.
Die Zusammensetzung an Materie der Erfindung kann verabreicht werden an ein Individuum durch irgendeines der Verabreichungsmittel, die im Stand der Technik bekannt sind. Durch eine Ausführungsform – in Übereinstimmung mit dieser wird eine Zusam mensetzung zur parenteralen Verabreichung formuliert (bzw. zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen oder intraperitonealen Verabreichung) – wird die Zusammensetzung typischerweise zur Verfügung gestellt als flüssige Mischung, welche fertig ist zur Verwendung oder alternativ als ein Pulver oder Lyophilisat zum Vermischen mit einer physiologischen Flüssigkeit (beispielsweise Salzlösung) vor der Verwendung.
In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung oder die Herstellung, welche die biologisch aktive Zusammensetzung der Erfindung umfasst, zur Verfügung gestellt als eine inhalierbare Zusammensetzung in der Form eines Sprays oder Aerosols. Die Zusammensetzung kann auch zur Verfügung gestellt werden in der Form eines Patches für die transdermale Verabreichung.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde festgestellt, dass die biologische Aktivität der Zusammensetzung an Materie selbst dann ausgeübt wird, wenn die Zusammensetzung oral dem behandelten Individuum verabreicht wird. Folglich wird im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Zusammensetzung an Materie zur oralen Verabreichung formuliert. Solche Formulierungen können als Flüssigkeiten, als Pulver oder Lyophilisat zum Mischen mit der genießbaren Flüssigkeit vor der Verabreichung zur Verfügung gestellt werden, oder können zur Verfügung gestellt werden in einer Dosierform, beispielsweise in der Form einer Kapsel oder einer Pille.
Die zeitliche Abstimmung der Verabreichung der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie der Erfindung an ein Individuum wird von verschiedenen Faktoren abhängen und hauptsächlich von dem speziell gewünschten Effekt in dem behandelten Individuum. Folglich wird beispielsweise, wo die Zusammensetzung zur Vorbeugung von Krebs in einem Individuum verabreicht wird, welches ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Krebs aufweist, eine Langzeitbehandlung wünschenswert sein. Die Zusammensetzung kann dann verabreicht werden von der Zeit, zu welcher das Individuum als eines definiert ist, welches zu einer Hochrisikogruppe zählt, und über einen verlängerten Zeitraum, welcher sich über die gesamte Lebenszeit des Individuums erstrecken kann. Wo die Zusammensetzung der Erfindung an ein Individuum verabreicht wird, mit einem primären Krebs wird typischerweise die Behandlung folgend auf die Behandlung des primären Krebses durch ein verträgliches Mittel beginnen, wie z.B. Chirurgie, Chemotherapie oder Radiotherapie. Zur gegebenen Zeit kann die Verabreichung der Zusammensetzung an Materie der Erfindung wünschenswert werden vor dem Beginn solcher Behandlungen oder in Kombination mit diesen. In dem Fall, in welchem die Zusammensetzung an Materie der Erfindung verabreicht wird, um den therapeutischen Index einer chemotherapeutischen Wirksubstanz zu vergrößern, kann die Verabreichung der Zusammensetzung an Materie der Erfindung typischerweise zu einem Zeitraum beginnen, der beispielsweise mehrere Tage vor der Behandlung mit der chemotherapeutischen Wirksubstanz liegt, und kann dann sich über den Zeitraum der Verabreichung der Wirksubstanz erstrecken. Zur gegebenen Zeit kann die Verabreichung besagter Zusammensetzung an Materie sogar nach Beendigung der Behandlung mit der zytotoxischen Wirksubstanz fortgeführt werden. Darüber hinaus kann zur gegebenen Zeit der Beginn der Verabreichung der Zusammensetzung an Materie nach dem Beginn der Behandlung mit der chemotherapeutischen Wirksubstanz liegen. Während dem Zeitraum der kombinierten Verabreichung der Zusammensetzung an Materie der Erfindung mit der chemotherapeutischen Wirksubstanz können verschiedene Behandlungspläne ausgewählt werden. Beispielsweise kann die therapeutische Wirksubstanz und die Zusammensetzung an Materie der Erfindung gleichzeitig verabreicht werden zu den gleichen Stunden des Tages, sie können zu unterschiedlichen Zeiten des Tages verabreicht werden, sie können an verschiedenen Tagen verabreicht werden, etc.
Wo die Zusammensetzung an Materie der Erfindung dazu gedacht ist, an ein Individuum in Kombination mit einer chemotherapeutischen Wirksubstanz verabreicht zu werden, kann die Zusammensetzung an Materie in eine einzelne pharmazeutische Formulierung mit der chemotherapeutischen Wirksubstanz kombiniert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine schematische Darstellung, welche das Einbringen von [H³]-Thymidin in Tumorzellen und Knochenmarkszellen zeigt, welche in Kultur in der Gegenwart der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie, erhalten aus Hühnermuskel durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigt. Dementsprechend wird der Prozentsatz der Kontrolle an [H³]-Thymidin-Incorporation als Thum. Incorp., bezeichnet, die Kontrolle wird als Cont. und Knochenmark wird wirder als BM bezeichnet.
2A-2B sind schematische Darstellungen, welche den Effekt auf die Fortpflanzung von Nb2-11C Lymphomazellen durch Fraktionen der biologischen aktiven Zusammensetzung an Materie, erhalten aus Muskelgewebe nach C-18 Reverse Phase HPLC (2A) oder nach Polyhydroxyethyl A HPLC (2B)-Säulen zeigen. [H³]-Thymidin-Incorporations-Assay wurde verwendet, um die Inhibierung der Fortpflanzung zu bestimmen. Dementsprechend wird der Prozentsatz der Kontrolle an Zell-Proliferation als Cell Prol. bezeichnet und die Fraktionsnummer wird als F.No.
3 ist eine schematische Darstellung, welche die Anzahl der Lungenmetastasen (No. Foci) in Mäusen zeigt, welche mit B16-F10 Melanom-Zellen verimpft wurden und entweder mit Wasser (Kontrolle, bezeichnet durch Cont.) oder der biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie, erhalten aus Hühnerbrustmuskel, behandelt wurden.
4 ist eine schematische Darstellung, welche das Niveau der weißen Blutzellen (WBC) und Neutrophilen (Neut.) in Mäusen zeigt, welche mit Chemotherapie allein behandelt wurden (Chemo, schwarze Balken) bzw. mit der biologisch aktiven Zusammensetzung der Materie folgend auf die chemotherapeutische Behandlung (CMF, graue Balken).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
BEISPIELE
Materialien und Methoden
1. Herstellung der biologisch aktiven Zusammensetzung aus Hühnermuskel
Hühnerbrustmuskel (50g) wurde in 150 ml Wasser aufgelöst und wurde für 5 Minuten in einem Mixer homogenisiert. Das gesamte Homogenat wurde dann in 400 ml Test-Tuben überführt und wurde in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge bei 13.000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch 0,22 μm-Filter filtriert und einer Ultrafiltration durch eine Amicon-Membran mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 3000 Dalton unterzogen. Dieses ultrafiltrierte Hühner-Homogenat wird hier im folgenden als "biologisch aktive Zusammensetzung" bezeichnet werden.
2. Tumor- und normale Zellen
Die Ratten-Lymphoma Nb2-11C Wachstumshormon-abhängige Zelllinie (Pines, M., Ashkenazi, A., Cohen-Chapnik, L., Binder, L., Gertler, J. Cellulor Biochem., 37:119-129, 1988) und die B-16-F10 murine Melanom-Zelllinien wurden eingesetzt. Die Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert und enthaltend 10% FBS. Die Zellen wurden in frisch präpariertes Medium zweimal wöchentlich überführt.
Normale Knochenmarkszellen wurden erhalten aus dem C57BL/6J Maus-Femur. Die Zellen wurden disaggregiert dadurch, dass sie durch eine 25G-Nadel passiert wurden.
3. Zellproliferations-Assays
[H³]-Thymidin-Incorporations-Assay wurde verwendet um das Zellwachstum zu bewerten. Tumor (3 × 10³/Well) oder Knochenmarkszellen (3 × 10⁵/Well) wurden mit 15% bzw. 7,5% biologisch aktiver Zusammensetzung inkubiert und zwar in 96-Well-Mikrotiter-Platten für 48 Stunden. RPMI Medium und Wasser in der gleichen Konzentration, wie sie zur biologisch aktiven Zusammensetzung hinzugefügt wurden, dienen als Kontrollen.
Eine Probe der biologisch aktiven Zusammensetzung wurde für eine Stunde gekocht und ihr Effekt auf die Proliferation von Nb2-11C-Lymphoma- oder murinen Knochenmarks-Zellen wurde untersucht.
Während der letzten 18h auf der Inkubation wurde jedes Well mit 1 μCi [H³]-Thymidin pulsiert. Zellen wurden geerntet und die [H³]-Thymidin-Aufnahme wurde bestimmt in einem LKB-Flüssigkeits-Scintillationszähler (LKB, Piscataway, NJ, USA).
Eine aktive Einheit (AU) wurde als die Menge der biologisch aktiven Zusammensetzung definiert, welche 50% Proliferationsinhibition der Nb2-11C-Lymphomazellen in vitro bewerkstelligte.
4. Fraktionierung und partielle Aufreinigung der inhibitorischen Aktivität, welche sich in der biologisch aktiven Zusammensetzung findet
HPLC-Abtrennungen: Die biologisch aktive Zusammensetzung wurde einer Fraktionierung durch zwei Typen an HPLC-Säulen unterzogen. Während einem jeden Aufreinigungsschritt wurden die Fraktionen gesammelt und auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Zellproliferation von Nb2-11C-Lymphom-Zellen zu inhibieren. Jede Fraktion wurde vor dem Test lyophilisiert, in RMPI-Medium suspendiert und durch eine 0,22 μm sterilen Filter filtriert.
Die erste Säule war eine präparative Reverse Phase (RP) HPLC mit einem Durchmesser von 2'' und einer Länge von 20 mm. Die Säule wurde mit Merck Lichrosphere-C18-Partikeln beladen mit einem Durchmesser von 12 μm und einer Porosität von 60A. Während eines jeden Durchlaufs wurden 800 ml des oben genannten Filtrates auf die Säule beladen und die Säule wurde eluiert mit einem Gradienten von Acetonitril bei einer Rate von 2%/Minuten, bis ein Niveau von 60% an Acetonitril erreicht wurde. Die Rate der Eluation war 100 ml/min und 200 ml Fraktionen wurden gesammelt. Ein kleiner Teil (5 ml) einer jeden Fraktion wurde getrocknet und verwendet, um die biologische Aktivität zu untersuchen.
Aktive Fraktionen wurden getrocknet mit einem Rotationsverdampfer, aufgelöst in 50 mM Ameisensäure für den nächsten chromatografischen Schritt auf einer Polyhydroxyethyl-A-Säule (9,4 × 200mm), 5μ (Poly LC, Columbia, Maryland), mit einem Eluenten, der 50 mM Ameisensäure-Lösung darstellte. 200 μl Proben wurden injiziert in die Poly-LC-Säule und einer Chromatographie unterzogen bei einer Flussrate von 0,5 ml/min und 0,5 ml Fraktion wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden in einer konzentrierenden Zentrifuge getrocknet und auf ihre biologische Aktivität hin getestet.
ERGEBNISSE
Beispiel 1: In vitro-Effekt der biologisch aktiven Zusammensetzung
Die Wirkung des biologisch aktiven Ingredienzes auf die Proliferation von Ratten-Lymphom Nb2-11C- und B-16-F10-murinen Melanomzellen, kultiviert in vitro, wurde untersucht durch Hinzugeben der biologisch aktiven Zusammensetzung zu Zellkulturen der oben genannten zwei Zellen und Vergleich der Proliferation der Zellen (angezeigt durch [H³]-Thymidin-Incorporation) im Vergleich zur Proliferation der gleichen Zellen, welche nur in Wachstumsmedium allein kultiviert wurden. Wie in 1 zu sehen ist, resultierte die Zugabe der biologisch aktiven Zusammensetzung zu Zellkulturen von Nb2-11C und B16-F10 in einer verminderten Proliferation dieser Tumorzellen.
Der Effekt der biologisch aktiven Zusammensetzung auf Knochenmarkzellen, erhalten aus C57BL/6J Maus-Femurs (wie oben beschrieben) wurde auch untersucht und zwar durch Zugabe der biologisch aktiven Zusammensetzung zu den Knochenmarkzellen und Vergleich der Proliferation dieser Zellen mit der Proliferation der gleichen Knochenmarkzellen, kultiviert in Zellkulturmedium allein. Wie auch aus 1 zu sehen ist, induziert die biologisch aktive Zusammensetzung einen substantiven Proliferationseffekt auf die Knochenmarkzellen.
Beispiel 2: Fraktionierung und Aufreinigung der aktiven Komponente in der biologisch aktiven Zusammensetzung
Die biologisch aktive Verbindung wurde einer Ultrafiltration durch 3 kD Amicon-Membran unterzogen und wurde dann durch eine RP-HPLC-Säule fraktioniert und sowie eine Polyhydroxyethyl A-Säule, wie oben beschrieben. Die Fähigkeit verschiedener Fraktionen, eluiert aus den HPLC-Säulen, Proliferation von Nb2-11C-Lymphomzellen zu inhibieren, wurde untersucht. Wie in 2A zu sehen ist, war die inhibitorische Aktivität der biologisch aktiven Zusammensetzung, eluiert auf der RP-HPLC-Säule als ein einzelner Peak der Aktivität zu finden bei einer Acetronitril-Konzentration von 16% bis 20%. Wie in 2B zu erkennen ist, wurde die inhibitorische Aktivität der biologisch aktiven Zusammensetzung, euliert auf der Polyhydroxyethyl-Säule in zwei Peaks nachgewiesen, einem scharten Peak bei 18-20 Minuten und dem zweiten Peak, welcher klar und breit bei 28-33 Minuten eluierte.
Beispiel 3: In vivo-Inhibition von Lungen-Metastasen in Mäusen durch die biologisch aktive Zusammensetzung
Mäuse, verimpft intravenös (i.v.) mit 2,5 × 10⁵ B16-F10 Melanom-Zellen, wurden in die folgenden beiden Gruppen unterteilt:

1. Mäuse, welche oral zweimal täglich mit 4AU der biologisch aktiven Zusammensetzung behandelt wurden;
2. Mäuse, welche oral zweimal täglich mit Wasser behandelt wurden (Kontrollvehikel).

Die Mäuse wurden fünfzehn Tage nach dem Beginn der Behandlung geopfert, ihre Lungen wurden entfernt und die schwarzen metastatischen Foci in entfernten Lungen wurden unter Verwendung eines sezierenden Mikroskopes gezählt.
Wie in 3 zu sehen ist, war die Anzahl der metastatischen Melanom-Foci in Lungen der Mäuse, behandelt mit der biologisch aktiven Zusammensetzung statistisch signifikant geringer als die Anzahl der metastatischen Melanom-Lungen-Foci, welche sich in Mäusen fanden, welche allein in Wasser behandelt wurden.
Beispiel 4: Myeloschützende Wirkung der biologisch aktiven Zusammensetzung auf Mäuse, welche chemotherapeutische Behandlung empfingen
Mäuse, wurden intraperitoneal (i.p.) mit 50 mg/kg Körpergewicht an Cyclophosphamid injiziert. Die Mäuse wurden dann in die folgenden drei Gruppen unterteilt:

1. Mäuse, welche orale Verabreichung von 4 AU der biologisch aktiven Zusammensetzung 48 Stunden bzw. 72 Stunden nach Behandlung mit Cyclophosphamid empfingen;
2. Mäuse, welche Cyclophosphamid alleine (Kontrolle 1) empfingen; und
3. eine weitere Gruppe von Mäusen, welche die orale Verabreichung von Wasser allein empfingen (Kontrolle 2).

96 Stunden nach Beginn des Empfangs der oben genannten Behandlungen wurden Blutproben von einer jeden der behandelten Mäuse entnommen. Die Blutzellenzahlen wurden in einem Coulter-Zähler durchgeführt, und differentielle Zellzahlen wurden auf Abstrich-Proben, angefärbt mit May-Grunvald-Giemsa-Lösung durchgeführt.
Wie in 4 zu sehen ist, war die Anzahl der peripheralen Blut-Leukozyten und Neutrophile in Mäusen, welche Cyclophosphamid allein empfingen (Kontrolle 1) verändert im Vergleich zur Anzahl dieser Zellen in Mäusen, in welche keine chemotherapeutischen Behandlung empfingen (Kontrolle 2). In Mäusen, welche die biologisch aktive Zusammensetzung empfingen, folgend auf die Cyclophosphamid-Behandlung war die Anzahl der weißen Blutzellen wieder hergestellt im Vergleich zu den Mäusen, welche Cyclophosphamid allein empfingen (Kontrolle 1), wobei die Anzahl der weißen Blutzellen und Neutrophilen sogar höher war als die Anzahl der gleichen Zellen in Mäusen, welche überhaupt kein Cyclophosphamid empfingen (Kontrolle 2).

Claims

Ein Verfahren zum Herstellen einer biologisch aktiven Zusammensetzung an Materie umfassend: (i) Behandeln von Muskelgewebe, erhalten aus verschiedenen tierischen Quellen, in einem flüssigen Medium; unter Bedingungen, unter welchen besagte Materie, enthalten innerhalb des Gewebes, in das Medium als ein Überstand freigesetzt wird; (ii) Abtrennen des Überstandes von Zellmaterie; (iii) Abtrennen einer Fraktion vom Überstand umfassend Substanzen mit einem Molekulargewicht von unterhalb ungefähr 10.000 Dalton, vorzugsweise unterhalb ungefähr 3.000 Dalton; wobei besagte Fraktion besagte biologisch aktive Zusammensetzung ist und eine chemo-schützende Wirkung aufweist oder in der Lage ist, die Proliferation von bösartigen Zellen zu inhibieren.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei besagte Fraktion eine chemo-schützende Wirkung aufweist und in der Lage ist, die Proliferation von bösartigen Zellen zu inhibieren.
Ein Verfahren gemäß entweder Anspruch 1 oder 2, worin folgend auf Schritt (iii) besagte Fraktion des weiteren einem oder mehreren zusätzlichen Aufreinigungsschritten unterzogen wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin besagte Komposition ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 3.000 Dalton aufweist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Muskelgewebe vom Huhn erhalten wird.
Die Verwendung der biologisch aktiven Zusammensetzung mit den folgenden Eigenschaften: (i) sie wird aus Muskelgewebe erhalten; (ii) sie filtriert sich durch einen Filter mit einem maximalen Molekulargewicht-Cut-Off von ungefähr 10.000 Dalton; vorzugsweise weniger als 3.000 Dalton; (iii) sie weist eine biologische Wirkung des Inhibierens der Proliferation von Tumorzellen auf und der Stimulation der Proliferation von Leukozyten und Neutrophilen; zum Herstellen eines Medikaments zum Inhibieren von toxischen Wirkungen von Individuen, welche eine chemotherapeutische Behandlung empfangen.