DE60028059T3

DE60028059T3 - Verfahren zum nachweis antibiotische überreste

Info

Publication number: DE60028059T3
Application number: DE60028059T
Authority: DE
Inventors: Cornelis Pieter LANGEVELD; Jacobus Stark; Andreas Petrus VAN PARIDON
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-03
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2020-10-04
Also published as: EP1216307B1; WO2001025471A3; DK1216307T4; AU1384201A; ATE326546T1; US7462464B1; ES2261257T3; DE60028059T2; WO2001025471A2; AU774639B2; EP1216307A2; EP1216307B2; ES2261257T5; NZ518129A; DE60028059D1; DK1216307T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren für das schnelle Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins antibiotischer Überreste in Produkten, vorzugsweise Lebensmittelprodukten. Es ist ein aus einem Schritt bestehendes Testverfahren beschrieben, bei dem Überreste antibiotischer Verbindungen, wie beispielsweise Antibiotika, bestimmt werden, während störende Verbindungen, wie beispielsweise natürliche Pigmente (z. B. Blut) und natürlicherweise hemmende Verbindungen (z. B. Lysozym), die in den Proben vorhanden sind und den Test beeinträchtigen könnten, inaktiviert werden. Diese Verbindungen werden inaktiviert, nachdem die Probe mit dem Test kombiniert wurde.
Beschreibung des Standes der Technik
Aufgrund gesundheitsbedingter Probleme und der Zunahme medikamentenresistenter Bakterien weckt das Vorhandensein antibiotischer Überreste in Nahrungsmitteln und Getränken bei den Verbrauchern zunehmende Besorgnis. Antibiotika werden nicht nur als Medikamente verwendet, sondern häufig auch als antibiotische wachstumsfördernde Substanzen eingesetzt.
Antibiotische Überreste können beispielsweise in Körperflüssigkeiten, Organen, Fleisch und Eiern vorhanden sein, die für den Verbrauch verwendet werden. Antibiotische Überreste können auch in Lebensmittelprodukten vorhanden sein, denen die tierischen Produkte als Bestandteil zugegeben werden. Beispiele für Lebensmittelprodukte sind Milch, Fleisch von Rindern, Schweinen, Geflügel und Fisch; Meeresfrüchte wie Garnelen, Leber, verarbeitete Fleischprodukte wie Würste, Fertigmahlzeiten und Säuglingsnahrung. Antibiotische Überreste können auch in Körperflüssigkeiten oder tierischen Geweben vorkommen, die für die Untersuchung, beispielsweise von Lebensmittelaufsichtsbehörden, geeignet sind. Beispiele sind Blut, Nierengewebe oder Vorharn aus der Niere und Harn. Harn und Blut können vor dem Schlachten des Tieres untersucht werden.
Es ist gut bekannt, dass Konzentrationen antibiotischer Überreste in tierischen Körperflüssigkeiten, tierischen Geweben und Lebensmittelprodukten zu hoch sein können. In den meisten Ländern, wie beispielsweise den Ländern der Europäischen Union, Kanada und den Vereinigten Staaten, sind die maximalen Überrestmengen (Maximum Residue Level, MRL) gesetzlich geregelt.
Testverfahren zum Bestimmen antibiotischer Überreste in Milchprodukten, wie beispielsweise mikrobiotische Hemmtests (z. B. Agardiffusionstests) oder Verfahren, in denen selektive Bindungsmittel (z. B. Antikörper oder Tracer) verwendet werden, sind gut bekannt. Beispiele für mikrobiotische Testverfahren sind beschrieben in GB-A-1467439 , EP 0005891 , DE 3613794 , CA 2056581 , EP 0285792 und US 5494805 . All diese Dokumente beschreiben gebrauchsbereite Tests, die einen Testorganismus verwenden. Der Testorganismus ist meistens in einem Agarmedium eingebettet, das einen Indikator, eine Pufferlösung, Nährstoffe und Substanzen enthalten kann, um die Empfindlichkeit gegenüber bestimmten antibiotischen Verbindungen auf positive oder negative Weise zu verändern.
Beispiele geeigneter Testorganismen sind Stämme von Bacillus, Streptococcus oder E. coli. Im Allgemeinen beruhen diese Tests auf dem Prinzip, dass die Farbe eines Säure-/Base- oder Redoxindikators gleich bleibt, wenn in einer Probe antibiotische Verbindungen in einer Konzentration vorhanden sind, die ausreicht, um das Wachstum des Testorganismus zu hemmen. Wenn jedoch keine Hemmung stattfindet, ist das Wachstum des Testorganismus begleitet von der Bildung von Säure oder reduzierten Metaboliten, was zu einer Farbveränderung des Indikators führt.
Diese Testverfahren sind für die Bestimmung antibiotischer Überreste in vielen Lebensmittelprodukten geeignet. Bisher war jedoch die Bestimmung antibio tischer Überreste in Proben (z. B. manchen Arten von Milch, beispielsweise Milch einzelner Kühe, Leber, Harn, Niere, Fleischsaft, Eier), die eine hohe Konzentration natürlicher antibiotischer Substanzen (z. B. Lysozym, Laktoferrin, Laktoperoxidase) oder eine hohe Konzentration natürlicher Pigmente (z. B. Blut) enthalten, nicht einfach durchzuführen.
Die hemmenden Substanzen, auf die oben Bezug genommen wird, zeigen Hemmwirkung gegen den Testmikroorganismus, was zu falsch positiven Ergebnissen führt (Okada et al., Journal of the Japan Veterinary Medical Association 46: (2) 103–107 (1993); Schiffmann, Methodische und rechtliche Probleme beim Nachweis von Hemmstoffen in Milch, Verlag: Tierärztliche Hochschule, Hannover, Deutschland; Weisser, Tierärztliche Umschau 31: (6) 276–278 (1976); Heinert et al., Archiv für Lebensmittelhygiene 27: (2) 55–60 (1976); Carlsson et al., Milchwissenschaft 42: (5) 282–285 (1987); Carlsson et al., Journal of Dairy Science 72: (12) 3166–3175 (1989)).
In Proben vorhandene natürliche hemmende Substanzen können durch Erhitzen, z. B. bei 80°C für 10 Minuten (Vermunt et al., Netherlands Milk and Dairy Journal 47: (1) 31–40 (1993); Weisser, Tierärztliche Umschau 31: (6) 276–278 (1976)), oder durch Anwendung gut bekannter Dialyseverfahren (Takahiro, Shokuhin Eiseigaku Zasshi 24: (4) 423–428 (1983); van Wall, Archiv für Lebensmittelhygiene 29: (6) 235 (1978)) inaktiviert werden. Nach dieser Vorbehandlung kann die Probe für weitere Tests verwendet werden, indem die Verfahrensweisen des Tests befolgt werden. Im Falle eines mikrobiotischen Agardiffusionstests (z. B. wie beschrieben in EP 00005891 ) kann die flüssige Probe dem Test direkt zugegeben werden, wonach der Test inkubiert wird.
Natürliche Pigmente (z. B. Blut), die in der Probe (z. B. Fleischsaft oder Saft von Organen) enthalten sind, gehen stets Wechselwirkungen mit der Agarmatrix ein. Im Falle von Tests, die auf einer Farbänderung durch Verwendung z. B. eines Säure-/Base- oder Redoxindikators beruhen, führt das Vorhandensein solcher natürlichen Pigmente häufig zu einem unlesbaren Test. Ein Verfahren zum Vermindern der Wirkung der natürlichen Pigmente ist die Durchführung einer Vorinkubation. Im Falle eines Agardiffusionstestes in Übereinstimmung mit dem in EP 0005891 beschriebenen Verfahren wird die Probe (z. B. Fleischsaft) dem Test zugegeben, gefolgt von einer Vorinkubation von beispielsweise 10–30 Minuten bei Raumtemperatur. Diese Vorinkubation sollte ausreichend lang sein, damit die antibiotischen Überreste in die Agarmatrix diffundieren können. Nach der Vorinkubation wird die Probe entfernt, der Test mit Wasser gewaschen und nach den Anleitungen des Herstellers inkubiert. Die Verfahren erfordern jedoch zusätzliche Zeit und Handhabung und verhindern nicht die Diffusion störender Verbindungen, beispielsweise natürlicher Pigmente, in den Agar. Was noch schlimmer ist, ist, dass bei Einschluss eines Erhitzungsschrittes (Inaktivierung natürlicher Hemmstoffe) immer eine brauen Farbe erscheint, was die Testergebnisse noch unlesbarer macht. Fehler beim Ablesen der Testergebnisse können zu falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen führen.
Darüber hinaus sind die Laboratorien, die Studien in Bezug auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein antibiotischer Überreste in Lebensmitteln durchführen, von der Zeit her eingeschränkt, die zur Durchführung dieser Studien erforderlich ist. Mit den vorliegenden zeitaufwändigen Verfahren kann nur eine sehr eingeschränkte Anzahl von Proben untersucht werden. Darüber hinaus können diese Tests nur in gut ausgestatteten Laboratorien und von gut geschulten Personen durchgeführt werden, was ebenfalls ein limitierender Faktor ist.
Daraus lässt sich der Schluss ziehen, dass bisher keine geeigneten Testverfahren zum Bestimmen antibiotischer Überreste in Proben mit hohen Konzentrationen natürlicher hemmender Verbindungen und/oder natürlicher Pigmente verfügbar waren. Die vorliegenden Verfahren sind zeitaufwändig und können zu falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen führen, welche zu unannehmbaren Mengen von Antibiotika in der Nahrungsmittelkette und zu wirtschaftlichen Verlusten führt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung will nun einen zuverlässigen und einfach durchzuführenden, aus einem Schritt bestehenden Test für den Nachweis antibiotischer Überreste in flüssigen Proben bereit stellen, welche natürliche Hemmstoffe und/oder störende Verbindungen, wie beispielsweise natürliche Pigmente enthalten könnten.
Es wurde herausgefunden, dass bei Zugabe einer Probe zu einem Test, der für die Bestimmung antibiotischer Überreste geeignet ist, und anschließender Inkubation für einen ausreichenden Zeitraum bei 75°C bis 85°C für die Inaktivierung der natürlichen hemmenden Verbindungen der Probe der Test direkt nach dem Erhitzen inkubiert werden kann, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein antibiotischer Überreste zu bestimmen.
Darüber hinaus kann der flüssigen Probe ein geeignetes Verdickungsmittel zugegeben werden, und störende Verbindungen, die in der Probe vorhanden sind, können in der Matrix aufgefangen werden. Die Matrix wird vorzugsweise während des Erhitzungsschrittes gebildet.
Noch überraschender ist, dass antibiotische Überreste direkt aus der festen Matrix in das Testsystem diffundieren. Zusätzliche Extraktionsverfahren, um die antibiotischen Überreste aus der Matrix zu erhalten, sind daher nicht erforderlich.
Gemäß der Erfindung ist also ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines antibiotischen Überrests in einer Probe bereit gestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(i) In-Berührung-Bringen der Probe mit einem Test, der einen ausgewählten empfindlichen Mikroorganismus und einen Farbindikator umfasst;
(ii) Erhitzen der Probe und des Tests, die in Berührung gebracht sind, auf eine Temperatur von 75°C bis 85°C für einen ausreichenden Zeitraum, um eine natürliche störende Verbindung, die in der Probe vorhanden ist, zu inaktivieren, und sofort danach
(iii) Inkubieren der Probe und des Tests, die in Berührung gebracht sind.

Natürliche störende Verbindungen sind Verbindungen, die den Test stören können und die natürlicherweise in der Probe vorhanden sind, beispielsweise natürlicherweise hemmende Verbindungen (z. B. Lysozym) oder natürliche Pigmente (z. B. Blut). Mit störend oder hemmend ist daher das Verhalten dieser Verbindungen auf einen Teil des Tests gemeint, beispielsweise die Testmikroorganismen oder die Farbindikatoren.
In einem Verfahren der Erfindung kann jeder Test verwendet werden, der sich für das Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins antibiotischer Überreste eignet. Geeignete Tests sind solche, bei denen ausgewählte empfindliche Mikroorganismen verwendet werden, z. B. mikrobiotischer Agardiffusionstests oder Tests auf der Basis einer selektiven Bindung der zu bestimmenden Verbindung. Selektive Bindung kann anhand der gut bekannten Antikörpertechnologie oder durch Verwendung bestimmter Tracer erreicht werden. Ein Beispiel eines bestimmten Tracers ist das Penicillinbindende Protein, das beispielsweise in der Delvo-X-Press^® zum Nachweis von Betalaktamen verwendet wird.
Beispiele geeigneter mikrobiotischer Agardiffusionstests sind Tests, bei denen Arten von Bacillus, Streptococcus oder E. coli verwendet werden. Vorzugsweise werden thermophile Arten, beispielsweise Bacillus stearothermophilus und Streptococcus thermophilus verwendet. Beispiele bevorzugter Stämme sind Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 (1974 hinterlegt beim Laboratory of Microbiology der Technical University of Delft unter der Zugangsnummer LMD 74.1 und 1983 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, unter der Zugangsnummer CBS 760.83, wo der Stamm für die Öffentlichkeit verfügbar ist) und Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022, hinterlegt am 3. März 1987). Beide Stämme sind gegenüber antibiotischen Verbindungen sehr empfindlich, vor allem gegen Chemotherapeutika wie Sulfa-Verbindungen und Antibiotika wie Penicilline und Tetracycline. E.coli-Stämme und andere geeignete gramnegative Bakterien können beispielsweise für die Bestimmung von Chinolonen verwendet werden.
Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 und Streptococcus thermophilus T101 wachsen schnell und haben den Vorteil, dass sie thermophil sind. Die optimale Wachstumstemperatur des Bacillus-Stammes ist beispielsweise 50°C bis 70°C. Der Testorganismus ist daher für einen erfindungsgemäßen Test sehr geeignet, da er nicht durch Erhitzen zum Inaktivieren der möglicherweise in der Probe vorhandenen natürlichen hemmenden Verbindungen abgetötet wird.
Wenn es sich bei dem Testorganismus um einen Bacillus-Stamm handelt, ist er vorzugsweise in Form einer Sporensuspension in das Agarmedium eingebunden, welche hergestellt und vor der Verfestigung durch bekannte Verfahren (siehe beispielsweise GB-A-1467439 ) in das Agarmedium eingebunden wird. Handelt es sich bei dem Testorganismus um einen Streptococcus-Stamm, werden die Bakterien vorzugsweise in Form von Bakterienzellen in das Agarmedium eingebunden, welche nach bekannten Verfahren (siehe beispielsweise EP 0285792 ) in das Agarmedium eingebunden werden können. Die Konzentration des Testorganismus in dem Agarmedium ist vorzugsweise 10⁵ bis 10¹⁰ Kolonie bildende Einheiten je ml Agarmedium.
Geeignete Nährstoffe, um die Vervielfältigung des Testorganismus in Abwesenheit antibiotischer Überreste zu ermöglichen, sind beispielsweise assimilierbare Kohlenstoffquellen (z. B. Laktose, Glukose oder Dextrose), assimilierbare Stickstoffquellen (z. B. Pepton) und Quellen von Wachstumsfaktoren, Vitaminen und Mineralstoffen (z. B. Hefeextrakt).
Das Wachstum des Testorganismus kann anhand gut bekannter Verfahren bestimmt werden, vorzugsweise durch eine Farbveränderung des Agarmediums der Testprobe. Typischerweise wird ein Farbindikator, vorzugsweise ein Säure-/Base- oder Redoxindikator, verwendet. Beispiele geeigneter Säure-/Baseindikatoren umfassen Bromkresolblau und Phenolrot. Beispiele geeigneter Redoxindikatoren umfassen Brillant-Schwarz, Methylenblau, Toluidinblau und Nilblau. Es können auch Kombinationen von zwei oder mehr Indikatoren verwendet werden.
Typischerweise ist eine feste Matrix eine Matrix, die störende Verbindungen zurückhält, beispielsweise Pigmente, aber es auch ermöglicht, dass antibiotische Überreste in der Probe in den Test diffundieren.
Die Empfindlichkeit des Tests kann wahlweise verändert werden, indem bestimmte Substanzen zugegeben werden, indem Testbedingungen wie der pH-Wert oder die Konzentration von Puffersubstanzen oder Agar verändert werden oder indem das Verhältnis der Volumen von Agar und der Probe variiert werden. Beispiele von Substanzen, die dem Testsystem zugegeben werden können, um die Empfindlichkeit zu verändern, sind Nukleoside wie beispielsweise Adenosin oder Antifolate wie beispielsweise Trimethoprim, Ormethoprim oder Tetroxoprim, welche die Empfindlichkeit des Testorganismus gegenüber Sulfa-Verbindungen verbessern. Salze von Oxalsäure oder Fluorwasserstoffsäure können zugegeben werden, um die Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclinen zu verbessern. Cystein kann zugegeben werden, um die Empfindlichkeit gegenüber Penicillinen zu vermindern.
Proben, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen jedes Substrat, für das die Anwesenheit oder Abwesenheit antibiotischer Überreste bestimmt werden soll. Beispielsweise kann die Probe eine tierische Körperflüssigkeit, ein Tiergewebe oder ein Extrakt sein, beispielsweise ein flüssiger Extrakt davon. Darüber hinaus kann es sich bei der Probe um ein Lebensmittel handeln. Beispiele tierischer Körperflüssigkeiten umfassen Blut, Harn, Vorharn, Milch und Fleischsaft. Beispiele tierischer Gewebe umfassen Muskel, Herz, Leber und Niere. Die Probe kann ein Extrakt von einem dieser Gewebe sein.
Die Menge an flüssiger Probe, die dem Test zugegeben werden soll, richtet sich nach dem Testsystem. Für mikrobiotische Diffusionstests werden dem Test anhand gut bekannter Verfahren typischerweise 0,01 bis 1,0 ml, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 ml zugegeben.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Probe des Weiteren ein geeignetes Verdickungsmittel zugegeben werden. Beispiele geeigneter Verdickungsmittel zur Verwendung in einem Prozess oder Testkit der Erfindung sind beispielsweise Polysaccharide (z. B. Cellulose wie beispielsweise Methylcellulose, HMPC, Johannisbrotkernmehl, Stärke oder Xanthan) oder Proteine (z. B. Eialbumin, Molkeproteine oder Rinderalbumin). Vorzugsweise werden Methylcellulose und Rinderalbumin verwendet. Es können auch Kombinationen geeigneter Verdickungsmittel verwendet werden. Die Konzentration des geeigneten Verdickungsmittels sollte ausreichend sein, um eine solide Matrix zu bilden.
Erfindungsgemäß werden hemmende Verbindungen durch eine Temperaturbehandlung von 75°C bis 85°C inaktiviert. Beispielsweise wird die Probe/der Test für etwa 10 Min. bei etwa 80°C erhitzt, um die natürlichen hemmenden Verbindungen zu inaktivieren. Die Konzentration des Verdickungsmittels sollte ausreichend sein, um die feste Matrix während der Inkubation des Tests zu erhalten. Alternativ kann die feste Matrix auch (teilweise) während der Inkubation des Tests gebildet werden. Das Verdickungsmittel kann der flüssigen Probe mit einem beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zugegeben werden, z. B. als ein Pulver oder als eine Tablette. Das Verdickungsmittel kann der Probe vor Zugabe der Probe zu dem Test oder nach Zugabe der Probe zu dem Test zugegeben werden. Alternativ kann das Verdickungsmittel Teil des Tests sein, z. B. als ein Inhaltsstoff des Agar oder dem Agar zugegeben, z. B. als eine Tablette oder ein Pulver, bevor dem Test die flüssige Probe zugegeben wird. Die Erfindung umfasst auch eine Kombination aus Temperaturbehandlung und Zugabe eines Verdickungsmittels.
Typischerweise ist eine feste Matrix eine Matrix, die störende Verbindungen zurückhält, beispielsweise Pigmente, aber es auch ermöglicht, dass antibiotische Überreste in der Probe heraus diffundieren
Nach Zugabe der Probe kann der Test bei 75°C bis 85°C erhitzt werden, um die in der Probe vorhandenen natürlichen antibiotischen Verbindungen, beispielsweise Lysozym, zu inaktivieren. Der Erhitzungsschritt kann auch wahlweise die Bildung einer festen Matrix unterstützen. Vorzugsweise wird der Test 2 bis 20 Minuten lang bei 75°C bis 85°C erhitzt. Mehr bevorzugt wird der Test 10 bis 15 Minuten lang bei 75°C bis 85°C erhitzt. Es kann eine beliebige andere Zeit-/Temperaturbehandlung verwendet werden, die ausreichend ist, um die natürlichen hemmenden Verbindungen der Probe zu inaktivieren, ohne die zu bestimmenden antibiotischen Überreste zu inaktivieren.
Die genauen Zeit-/Temperaturanforderungen richten sich beispielsweise nach der Art der Probe (Milch, Fleisch- oder Organsaft, Harn, Ei, Blut, etc.), dem Zustand der Probe (z. B. der Starttemperatur, dem Probenvolumen), der Art des Tests (z. B. mikrobiotische Hemmtests oder Assays auf der Basis selektiver Bindungsmittel (z. B. Antikörper oder Tracer)) oder dem in dem Test verwendeten Mikroorganismus (z. B. thermophile oder nicht thermophile Bacillus- oder Streptomyces-Arten). Natürlich ist dafür zu sorgen, dass die Hitzebehandlung die zu bestimmenden antibiotischen Überreste nicht inaktiviert. Die Hitzebehandlung kann anhand eines beliebigen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrens ausgeführt werden, z. B. durch Verwendung eines Inkubators wie unten beschrieben oder durch Erhitzen in einem Wasserbad.
Nach der Hitzebehandlung wird der Test nach den Anleitungen des Testherstellers inkubiert. Die Inkubationszeit des Tests richtet sich nach den Umständen. Im Falle eines Agardiffusionstests, bei dem Bacillus stearothermophilus verwendet wird, wird der Test in einem Wasserbad oder Heizblock bei beispielsweise 60°C bis 70°C, vorzugsweise bei 62°C bis 65°C inkubiert. Die Ergebnisse können typischerweise nach 1,5 bis 4 Stunden, vorzugsweise nach 2,5 bis 3,5 Stunden erhalten werden. Im Fall von Tests, die selektive Bindungsmittel wie Antikörper oder Tracer verwenden, können die Ergebnisse innerhalb etwa 30 Minuten erhalten werden.
Herkömmliche mikrobiotische Hemmtests, die sich zur Anwendung in der Erfindung eignen, umfassen die kommerziellen Produkte Delvotest^®, Premi^®Test, BR-Test^® (DSM, Holland), die ADM-Copan(R)-Tests (Copan, Italien) und die CHARM(R)-AIM-Tests (Charm, USA)). Inaktivierung der in den in der flüssigen Probe vorhandenen natürlichen hemmenden Verbindungen und eine wahlweise Bildung einer Matrix durch Zugabe eines geeigneten Verdickungsmittels und Aktivierung der Sporen des Testorganismus wird vorzugsweise durch Erhitzen beispielsweise für 5 bis 15 Minuten auf beispielsweise 75°C bis 85°C erreicht. Alternativ kann jede andere Temperatur-/Zeitbehandlung verwendet werden, die ausreichend ist, um die Effekte zu erhalten.
Beispiele von Kits, die für den Prozess der Erfindung geeignet sind, sind durchsichtige Röhren, einzeln oder in einem Satz oder kombiniert als ein Block von lichtdurchlässigem Material, das mit einer Anzahl von Öffnungen darin ausgestattet ist (Inkubator). Das Testkit kann verfestigtes Agarmedium enthalten, das wahlweise gepuffert sein kann, einen Testorganismus (z. B. ein Stamm von Bacillus oder Streptococcus) mit ausreichenden Kolonie bildenden Einheiten, Nährstoffe zum Wachstum des Organismus, einen Indikator (z. B. einen Säure-/Base- oder Redoxinkubator), wahlweise Substanzen zum Verändern der Empfindlichkeit bestimmter antibiotischer Verbindungen auf positive oder negative Weise. Alle Inhaltsstoffe können dem Test wahlweise als gesonderte Quelle, beispielsweise als eine Tablette oder Papierscheibe, zugegeben werden.
Die Testkits haben vorzugsweise festgelegte Größen. Dies ist durch die Zuverlässigkeit des Tests bedingt. Im Falle eines Tests auf der Basis der Agardiffusionstechnologie werden vorzugsweise Röhren verwendet. Die Testeinheit ist vorzugsweise hoch genug, um eine Menge von Agarmedium und einer Probe entsprechend einer Höhe von 3 bis 30 mm zu enthalten, mehr bevorzugt von 5 bis 15 mm. Die Abmessung des Innenquerschnitts der Testeinheiten liegt vorzugsweise bei 1 bis 30 mm, mehr bevorzugt bei 5 bis 15 mm. Die Testeinheiten sind vorzugsweise während der Lagerung luftdicht verschlossen, wobei sie in diesem Zustand mindestens mehrere Monate lang aufbewahrt werden können. Natürlich umfasst diese Erfindung jede andere Testeinheit, die für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist.
Das Volumen des Agarmediums in der Testeinheit ist von der Höhe der Testeinheit, der Abmessung des Innenquerschnitts der Testeinheit und dem prozentualen Volumen der Testeinheit, das mit dem Agarmedium gefüllt ist, festgelegt. Das Volumen des Agarmediums liegt vorzugsweise bei 10 μl bis 5 ml, mehr bevorzugt bei 100 μl bis 1 ml.
Inkubatoren, die geeignet sind, um die Hitzebehandlungen, die in dieser Erfindung beschrieben sind, auszuführen, können derart konstruiert sein, dass nach Platzieren der Testeinheiten in dem Inkubator, die Hitze- und Inkubationsbehandlungen wie oben beschrieben durchgeführt werden können. Die erste Hitzebehandlung zur Inaktivierung der hemmenden Verbindungen und zum wahlweisen Formen einer soliden Matrix und/oder zum Aktivieren der Sporen wird bei einer höheren Temperatur durchgeführt, wobei anschließend die Inkubation des Tests bei einer niedrigeren Temperatur fortgesetzt wird. Nach Inkubation des Tests kann der Inkubator wahlweise auf eine Temperatur abkühlen, die ausreichend ist, um den Test anzuhalten.
Ein Beispiel eines solchen Inkubators ist ein Heizblock, in den Testeinheiten (z. B. Ampullen) platziert werden können. Im Falle eines konventionellen mikrobiotischen Agardiffusionstests beispielsweise, bei dem ein Stamm von Bacillus stearothermophilus verwendet wird, kann der Inkubator/Heizblock eine Anzahl von Öffnungen enthalten, die geeignet sind, um die Testampullen oder Testplatten (z. B. Delvotest^® oder Premi^®Test) darin zu platzieren. Nachdem die Ampullen oder Platten platziert sind, erhitzt der Inkubator den Test auf eine Temperatur beispielsweise von 75°C bis 85°C für beispielsweise 10 bis 20 Minuten, wonach der Inkubator zwischen 1,5 und 4 Stunden (Inkubation des Tests) zu einer niedrigeren Temperatur zwischen 62°C und 65°C wechselt. Natürlich richten sich die genauen Zeit-/Temperaturintervalle nach vielen Faktoren und sind je nach Art des Tests unterschiedlich. Diese Erfindung umfasst alle Inkubatoren, die eine Vorinkubation bei einer bestimmten Temperatur eine bestimmte Zeit lang ausführen können, direkt gefolgt von einer Inkubation bei einer niedrigeren Temperatur für einen bestimmten Zeitraum. Wahlweise kann der Inkubator nach der Inkubation des Tests auf eine Temperatur abkühlen, die ausreichend ist, um den Test anzuhalten.
Der in dieser Erfindung beschriebene Prozess ist sehr einfach durchzuführen, so dass Personen, die den Test durchführen, nicht in besonderer Weise ausgebildet oder geschult sein müssen.
Beispiel 1
Inaktivierung natürlicher hemmender Verbindungen, die in einer Vorharnprobe vorhanden sind
Aus einem Schlachthof wurden frische Nieren von 7 negativen (negativ im Sinne des Vorhandenseins von Antibiotika) Kühen erhalten. Um Proben zum Testen auf Vorhandensein oder Nichtvorhandensein antibiotischer Arzneimittelüberreste wurden die Nierenrosetten in Stücke aufgeteilt. Die Stücke wurden vorsichtig mit einer Knoblauchpresse zerdrückt, um Vorharn zu erhalten.
Die Proben wurden dann unter Verwendung von mikrobiotischen Hemmtestampullen untersucht, die nach den in EP 0005891 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wobei die Nährstoffe im Agar enthalten waren. Der Test ist auch als Premi^®Test bekannt (kommerziell erhältlich von DSM N. V. Delft, Niederlande).
Je 100 μl der 7 ausgedrückten Proben (Vorharn) wurde den Testampullen (in dreifacher Ausführung) zugegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Es ist bekannt, dass diese Vorinkubationszeit ausreichend ist, um antibiotische Überreste (falls in der Probe vorhanden) in die Agarmatrix des Tests diffundieren zu lassen. Nach dieser Vorinkubation wurde die Probe entfernt. Schließlich wurde der Test in einem Wasserband bei 64°C nach Anleitungen des Herstellers inkubiert. Nach 185-minütiger Inkubation bei 64°C waren alle 3 Proben von 4 Tieren noch immer positiv (> 50%). Nach 200 Minuten waren alle 3 Proben von 2 Tieren noch immer positiv (> 30%). Diese falsch-positiven Ergebnisse wurden von dem hemmenden Effekt natürlicher hemmender Verbindungen im Vorharn bewirkt.
Je 100 μl der 7 ausgedrückten Proben (Vorharn) wurde den Testampullen zugegeben und 10 Minuten lang bei 80°C im Wasserbad erhitzt. Die Ampullen wurden sofort in ein Wasserband bei 64°C platziert und nach den Anleitungen des Herstellers inkubiert. Nach 175-minütiger Inkubation wechselte die Farbe aller Tests von violett zu gelb, was anzeigt, dass keine antibiotischen Überreste vorhanden waren.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass natürliche hemmende Verbindungen des Vorharns den Test hemmen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Wenn der Test nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren durchgeführt wird, d. h. durch Zugabe der Probe direkt zum Test, Erhitzen des Tests wie oben beschrieben und Inkubieren des Tests nach den Anleitungen des Herstellers, wurde die Aktivität der natürlichen hemmenden Verbindungen beseitigt und keine falsch-positiven Ergebnisse wurden beobachten.
Beispiel 2
Inaktivierung natürlicher hemmender Verbindungen, die in zerriebenen Nierenproben vorhanden sind
Dieses Experiment wurde nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt, ausgenommen die Vorgehensweise zur Probennahme. In diesem Experiment wurden Proben von der Nierenrosette zerrieben. Je 100 μl der 7 zerriebenen Proben (in dreifacher Ausführung) wurden den Testampullen zugegeben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert, wobei die Proben im Anschluss daran entfernt und der Test wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert wurde. Nach 220 Minuten waren alle 21 Proben noch immer positiv. Aufgrund der Verfärbung des Tests aufgrund einer Kombination des Vorhandenseins natürlicher Pigmente (z. B. Blut) und dem Erhitzen dieser Pigmente war es nicht möglich, die Ergebnisse des Tests ordnungsgemäß abzulesen.
Das Experiment wurde wiederholt. Nun wurden die zerriebenen Proben jedoch 1:1 mit Wasser verdünnt. Nach 185 Minuten waren 3 Proben noch immer positiv.
Schließlich wurden die verdünnten Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht. Je 100 μl der 7 zerriebenen Proben wurden den Testampullen zugegeben, 10 Minuten bei 80°C erhitzt und direkt inkubiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 175 Minuten wechselte die Farbe aller Tests von violett zu gelb, was anzeigt, dass keine antibiotischen Überreste vorhanden waren.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass natürliche hemmende Verbindungen der zerriebenen Nierenproben den Test hemmen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Wenn der Test nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren durchgeführt wird, d. h. durch Zugabe der Probe direkt zum Test, Erhitzen des Tests wie oben beschrieben und Inkubieren des Tests nach den Anleitungen des Herstellers, wurde die Aktivität der natürlichen hemmenden Verbindungen beseitigt und keine falsch-positiven Ergebnisse wurden beobachten.
Beispiel 3
Inaktivierung natürlicher hemmender Verbindungen, die in einer Eierprobe vorhanden sind
Es wurden Proben von 5 Eiern (in doppelter Ausführung) ohne antibiotische Überreste zur Untersuchung auf Vorhandensein oder Nichtvorhandensein antibiotischer Überreste erhalten. In das Ei wurde eine Öffnung von etwa 1–2 cm² gemacht, das Eigelb wurde angestochen, und das Ei wurde mit der Öffnung nach unten auf eine Flasche gelegt, wodurch das Eiweiß und das Eigelb in die Flasche tropfen konnten. Nach Entleeren des Eis wurde die Flasche geschlossen und die Probe durch Schütteln homogenisiert.
Um die natürlichen hemmenden Verbindungen, die in der Eiprobe vorhanden sind, zu inaktivieren, wurden je 100 μl der 5 Proben auf Delvotest^®-Ampullen gegeben. Der Test wurde nach den in EP 0005891 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die Nährstoffe im Agar vorhanden waren. Nach Erhitzen bei 80°C für 10 Minuten in einem Wasserband wurden die Ampullen sofort in ein Wasserband bei 64°C gegeben und nach den Anleitungen des Herstellers inkubiert. Nach 140 Minuten wechselte die Farbe aller Tests von violett zu gelb, was anzeigt, dass keine antibiotischen Überreste vorhanden waren.
Kontrollproben wurden nicht 10 Minuten lang bei 80°C erhitzt, sonder direkt auf die Ampulle gegeben. Diese Tests blieben mindestens 4 Stunden lang violett.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass natürliche hemmende Verbindungen in der Eiprobe den Test hemmen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Wenn die Probe wie oben beschrieben erhitzt wurde, wurde die Aktivität der natürlichen hemmenden Verbindungen beseitigt und keine falsch-positiven Ergebnisse wurden mehr beobachten.
Beispiel 4
Bestimmung der Empfindlichkeit des Delvotests^® gemäß den in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren anhand von beimpften Proben
Es wurden Eiproben nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhalten. Die Proben wurden beimpft, indem Penicillin G (0 und 4 ppb) oder Sulfadiazin (10 und 100 ppb) zugegeben wurden. Die Eiproben wurden nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren zu Delvotest^®-Ampullen gegeben (siehe Beispiel 3); 10 Minuten lang bei 80°C erhitzt und anschließend sofort in ein Wasserband bei 64°C gegeben und nach den Anleitungen des Herstellers inkubiert. Die Ergebnisse wurden abgelesen, sobald die Farbe zu gelb wechselte (nach 140 Minuten). Die Proben ohne Penicillin G oder Sulfadiazin (0 ppb) waren negativ, während die Proben, die mit 4 ppb Penicillin G und 100 ppb Sulfadiazin versetzt waren, blieben violett (positiv).
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren geeignet ist, um antibiotische Überreste in Eiproben zu bestimmen.
Beispiel 5
Verwendung eines Verdickungsmittels in einer Nierenprobe
Es wurden nach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren zerriebene Nierenproben erhalten. In diesem Experiment wurden die Nieren jedoch zuerst eingefroren. Es ist gut bekannt, dass nach dem Einfrieren einer zerriebenen Nierenprobe viele hemmende Verbindungen freigesetzt werden, so dass bisher die Bestimmung antibiotischer Überreste anhand eines mikrobiotischen Hemmtests nicht möglich war.
Ein Teil der Probe wurde anhand der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren untersucht (fünffach). Nach 175 Minuten waren alle Proben positiv, selbst nach 190 Minuten waren 3 Proben positiv. Darüber hinaus waren die Ergebnisse aufgrund des Vorhandenseins natürlicher Pigmente (z. B. Blut) sehr schwierig abzulesen.
Ein anderer Teil der Probe wurde wie oben beschrieben untersucht. Jedoch wurde das Verdickungsmittel Rinderalbumin (Sigma) der Probe zugegeben (6% und 8%, fünffach), wonach die Probe den Tests zugegeben und 10 Minuten bei 80°C erhitzt wurde. Nach Inkubation der Tests für 175 Minuten bei 64°C waren alle 10 Tests negativ, was darauf hinweist, dass keine antibiotischen Überreste vorhanden waren. Darüber hinaus war die violette und gelbe Farbe des Tests sehr kräftig. Aufgrund des Vorhandenseins der durch die Zugabe von Rinderalbumin gebildeten Matrix wurden sowohl hemmende Verbindungen als auch natürliche Pigmente in der Matrix gefangen.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Zugabe eines Verdickungsmittels zu der zerriebenen und gefrorenen Nierenprobe es möglich macht, den Test ordnungsgemäß durchzuführen. Beide natürlichen hemmenden Verbindungen und natürliche Pigmente sind in der Matrix gefangen.
Beispiel 6
Verwendung eines Verdickungsmittels in einer Vorharnprobe
Das Experiment wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Allerdings wurde nun einem Teil der Vorharnprobe das Verdickungsmittel Methylcellulose (4000 c. p. i., Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 1,5% zugegeben. Nach 185 Minuten wechselte die Farbe der Kontrolltests, die vor der Inkubation 10 Minuten bei 80°C erhitzt wurden, um in der Probe vorhandene natürliche hemmende Verbindungen zu inaktivieren, von violett zu gelb, was darauf hinweist, dass keine antibiotischen Überreste vorhanden waren. Kontrollen, die vor der Inkubation nicht erhitzt wurden, blieben mehr als 240 Minuten lang violett (falsch-positive Ergebnisse).
Alle Tests, die mit Proben durchgeführt wurden, welche 5 und 10 ppb Amoxicillin, 75 und 100 ppm Oxytetracyclin und 75 und 100 ppm Sulfadiazin enthielten, blieben violett (positiv).
In diesem Experiment wurde auch gezeigt, dass aufgrund des Vorhandenseins der durch Zugabe von Methylcellulose gebildeten Matrix in der Vorharnprobe vorhandene natürliche Pigmente in der Matrix gefangen wurden. Deshalb zeigten diese Tests viel kräftigere Farben (gelb und violett) als Tests, die mit Proben durchgeführt wurden, welche das Verdickungsmittel nicht enthielten.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass es die Zugabe eines Verdickungsmittels zu dem Vorharn möglich macht, den Test 20 Minuten früher abzulesen (keine Vorinkubation). Außerdem ist der Test aufgrund der kräftigeren Farben leichter ablesbar.
Beispiel 7
Verwendung eines Verdickungsmittels in einer Milchprobe
Von einem Landwirt wurden Rohmilchproben negativer Kühe (negativ im Sinne des Vorhandenseins von Antibiotika) erhalten.
Beimpfte Proben wurden hergestellt, indem der Milch Penicillin G zugegeben wurde (0, 4 und 6 ppm).
Zu einem Teil der Proben wurde das Verdickungsmittel Rinderalbumin (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 6% zugegeben.
Die Proben wurden anschließend mit mikrobiotischen Hemmtestampullen untersucht, die nach dem in EP 0005891 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wobei sich die Nährstoffe im Agar befanden.
Den Testampullen wurde 100 μl Milch zugegeben. Ein Teil der Testampullen mit der Rohmilchprobe wurde 10 Minuten bei 80°C wie in Beispiel 1 beschrieben erhitzt. Alle Experimente wurden in fünffacher Ausführung durchgeführt. Die Tests wurden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren weiter inkubiert.
Nach 160 Minuten wechselte die Farbe aller Kontrolltests, die 10 Minuten bei 80°C erhitzt wurden, von gelb zu violett, was anzeigt, dass keine antibioti schen Überreste vorhanden waren. Außerdem wechselten alle Kontrolltests, denen Rinderalbumin zugegeben wurde, nach 160 Minuten von gelb zu violett. Die Kontrolltests, denen kein Rinderalbumin zugegeben wurde und die nicht 10 Minuten bei 80°C erhitzt wurden, wechselten nach 185 Minuten zu gelb.
Alle Tests mit Proben, die 4 und 6 ppm Penicillin G enthielten, blieben violett (positiv).
Aufgrund der durch Zugabe von Rinderalbumin gebildeten Matrix wurden in der Rohmilch vorhandene hemmende Verbindungen in der Matrix gefangen. Als ein Ergebnis davon war die Dauer der Inkubationszeit des Tests 25 Minuten kürzer.
Es wurde auch gezeigt, dass dieser Effekt erhalten wird, indem die Testampulle, welche die Rohmilchprobe enthält, 10 Minuten bei 80°C erhitzt wird.
Es kann daher der Schluss gezogen werden, dass in der Rohmilch vorhandene natürliche hemmende Verbindungen mit beiden in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren inaktiviert werden: Durch Inaktivierung durch einen Erhitzungsschritt oder durch Fangen dieser Verbindungen in der von einem Verdickungsmittel gebildeten Matrix in Kombination mit einer Hitzebehandlung.

Claims

Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines antibiotischen Überrests in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (i) In-Berührung-Bringen der Probe mit einem Test, der einen ausgewählten empfindlichen Mikroorganismus und einen Farbindikator umfasst; (ii) Erhitzen der Probe und des Tests, die in Berührung gebracht sind, auf eine Temperatur von 75°C bis 85°C für einen ausreichenden Zeitraum, um eine natürliche störende Verbindung, die in der Probe vorhanden ist, zu inaktivieren, und sofort danach (iii) Inkubieren der Probe und des Tests, die in Berührung gebracht sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe auch mit einem Verdickungsmittel in Berührung gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verdickungsmittel ein Polysaccharid oder ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verdickungsmittel Methylzellulose oder Rinderalbumin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe und der Test 2 bis 20 Minuten lang erhitzt werden, vorzugsweise, wobei die Probe und der Test 10 bis 15 Minuten lang erhitzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Probe um ein Nahrungsmittel, eine Körperflüssigkeit eines Tieres, ein Gewebe eines Tieres oder einen Extrakt davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Körperflüssigkeit um Blut, Harn, Vorharn, Milch oder Fleischsaft handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Gewebe eines Tieres oder einem Extrakt davon um Muskel, Herz, Leber oder Niere oder einen Extrakt davon handelt.