DE60025945T2

DE60025945T2 - Herstellung von antikörpern in mammarsekreten von zuchttieren

Info

Publication number: DE60025945T2
Application number: DE60025945T
Authority: DE
Inventors: He Sang LEE
Original assignee: MucoVax Holding BV
Current assignee: W. HEALTH L.P., NASSAU, BS
Priority date: 1999-11-01
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: JP2003513106A; CA2389582C; CA2389582A1; CY1105024T1; ES2258483T3; DK1226176T3; KR100627635B1; AU779776B2; EP1226176B1; NZ518638A; EP1226176A1; PT1226176E; AU1739001A; JP4668499B2; WO2001032713A1; ATE317400T1; DE60025945D1; HK1048323A1; HK1048323B; KR20020065497A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie. Insbesondere betrifft die Erfindung Mittel und Verfahren zur Antikörperherstellung.
Antikörper finden viele Anwendungen in Forschung und Medizin. Sie weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit auf, sehr spezifische Ziele zu binden. Außerdem ist es ganz einfach, neue Antikörper gegen ein Ziel zu generieren. Antikörper können auf eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Für die meisten Anwendungen werden Antikörper durch sogenannte Hybridoma-Zelllinien produziert, die aus der Fusion einer Antikörper-produzierenden B-Zelle mit einer immortalisierten Zelllinie herrühren. Solche Hybridoma-Zellen können leicht kultiviert werden und der Antikörper kann aus dem Kulturüberstand gewonnen werden. Ein weiteres Verfahren für die Antikörperherstellung ist die Gewinnung aus Serum von immunisierten Tieren oder die Herstellung von Antikörperfragmenten durch Bakterien. Natürlich sind viele andere Herstellungsverfahren vorhanden.
Obwohl viele unterschiedliche Verfahren zur Antikörperherstellung vorhanden sind, leiden sie alle mehr oder weniger unter dem gleichen Problem. Die Herstellungskosten sind relativ hoch. Für kultivierte Systeme auf Hybridoma-Basis müssen große Kultursysteme aufgebaut, validiert und aufrechterhalten werden. Wenn Serum die Quelle ist, muss Blut gesammelt und aufgearbeitet werden. Außerdem müssen Systeme vorhanden sein, um eine mikrobielle/virale Kontamination des Erzeugnisses zu testen. Die hohen Produktionskosten verhindern die Implementation von vielen Anwendungen, bei denen die Kosten des Antikörpers wichtig sind. Zum Beispiel sind viele diagnostische Kits für Erkrankungen nicht allgemein für Länder der dritten Welt verfügbar.
Einer der Wege, die eingeschlagen wurden, um die Herstellungskosten von Antikörpern zu vermindern, ist eine Verwendung von Nutztieren. Eine Technologie zum Züchten von Nutztieren ist weit verbreitet und ein Halten von Nutztieren ist relativ billig. Mehrere Initiativen wurden unternommen, um Antikörper in der Milch von Nutztieren herzustellen. Zum Beispiel wurde eine Immunisierung über den Lymphknoten über der Brust (supramammary lymph node) in Guidry et al., J. Dairy Sci. 77(10): 2965–2974 (1994) und in Tomita et al., J. Dairy Sci. 81(8): 2159–2164 (1998) beschrieben. Eine intranasale Immunisierung oder Immunisierung in die Brust (intramammary) wurde in Woods, J. Am. Vet. Med. Assoc. 173(5 Pt 2): 643–647 (1978) und in Bohl et al., Infect. Immun. 11(1): 23–32 (1975) beschrieben. Eine Implementierung auf kommerziellem Maßstab wurde durch Immunisierung über den Lymphknoten über der Brust, wie in Leitner et al., WO 99/33954, beschrieben, und über direkte Injektion in das Brustgewebe (mammary tissue), wie in Petersen et al., US-PS 3,376,198, und in Hasting, US-PS 5,017,372, beschrieben, versucht. Jedoch ist es bis jetzt möglich, lediglich begrenzte Mengen an Immunogen-spezifischen Antikörpern in Brustsekretionsprodukten (mammary secretion products) von Nutztieren zu erhalten. Beste Ergebnisse werden in dem Kolostrum erhalten, d.h. der ersten Milchflüssigkeit, die durch das weibliche Tier nach Geburt eines Jungtiers produziert wird. Milch, die durch das weibliche Tier nach dem Kolostrumstadium hergestellt wird, wird hierin als reife Milch bezeichnet. Kolostrum ist ein ziemlich einzigartiges Produkt, das aus einem bestimmten physiologischen und funktionellen Zustand der Brustdrüse (mammary gland) entsteht. Bei Wiederkäuern besteht der hauptsächliche Unterschied in der Zusammensetzung zwischen Kolostrum und reifer Milch in dem sehr hohen Anteil an Kolostrum-Immunglobulin, von dem die IgG-Klasse 80–90% ausmacht.

McFadden, T.B. et al. (1997) in Milk Composition, Production and Biotechnology, Welch, R.A.S., Burns, S.R., Popay, A.I. und Prosser, C.G., Hrsg., Seiten 133–152, CAB International, New York.

Obwohl die Antikörpermengen im Kolostrum höher sind als in reifer (normaler) Milch, benötigt die Gewinnung des Kolostrums ein exaktes Timing der Geburt, da das Kolostrum maximal zwei bis drei Tage nach Geburt des Jungtieres anhält. Außerdem sind, da Kolostrum lediglich für zwei oder drei Tage abgegeben wird, die absoluten Mengen an Antikörper, die pro Tier gesammelt werden können, begrenzt. Für die größere Produktion an Antikörpern im kommerziellen Maßstab muss eine große Kollektion von Nutztieren gehalten werden. Der Bedarf an einer großen Kollektion von Nutztieren erfordert auch eine große Anzahl von Immunisierungen etc., was folglich die logistischen Probleme und Produktionskosten erhöht. Außerdem ist aufgrund der Dicke/Viskosität des Kolostrums (es ist sehr reich an Fett und Protein) die weitere Aufarbeitung von Kolostrum problematisch.
Jahrzehntelang wurden verschiedene (Immunisierungs-) Versuche unternommen, um eine erhöhte Sekretion von Immunogen-spezifischen Antikörpern über die Brustdrüse von Nutztieren zu erhalten. Solche Versuche zielten teilweise auf eine Steuerung von Infektionen in der Brustdrüse, d.h. Mastitis (Guidry et al., J. Dairy Sci. 77(10): 2965–2974 (1994); Pighetti et al., J. Dairy Sci. 78(3): 528–537 (1995)), als auch auf eine Produktion großer Mengen an Immunogen-spezifischen Antikörpern über Milch ab. Die Antikörpermengen in reifer Milch verbleiben jedoch immer noch gering (etwa eine Größenordnung) im Vergleich zu denjenigen, die im Kolostrum erreicht werden können (Hodgkinson et al., WO 98/54226; Hastings, US-PS 5017372). Demzufolge sind Antigen-spezifische Antikörper, die in den meisten klinischen und vorklinischen Untersuchungen verwendet werden, von Kolostrum abgeleitet und gehören folglich hauptsächlich zu der IgG-Klasse (Tollemar et al., Bone Marrow Transpl. 23: 283–290 (1999); Bostwick et al., US-PS 5,773,000; Cordle et al., US-PS 5,260,05?).
"Saif et al. (1984, Am. J. Vet. Res. 45: 49–58) beschreiben eine Kombination von intramuskulärer und intramammärer Immunisierung von Rindern, aber beschreiben nicht eine Immunisierung über einen mukosalen Weg.
Die JP 08 092108 beschreibt, dass eine intramuskuläre Immunisierung und Immunisierung in die Brust eines Melktieres eine Milch erzeugt, die eine präventive und therapeutische Wirkung aufweist, die nahezu gleich zu der von Kolostrum ist. Die JP 08 092108 beschreibt jedoch keine Kombination einer mukosalen Immunisierung und Immunisierung in die Brust/Lymphimmunisierung über der Brust, noch beschreibt die JP 08 092108 eine reife Milch, die Antikörpertiter aufweist, die höher sind als diejenigen im Kolostrum. Die WO 98/54226 beschreibt Immunisierungspläne, die eine Milch mit IgA-Antikörpertitern erzeugen, die höher sind als die Titer in Kolostren von Kontrolltieren, die nicht immunisiert wurden. Jedoch beschreibt die WO 98/54226 keine Milch mit IgA-Antikörpertitern spezifisch für ein Antigen bei signifikant höheren Titern als der Durchschnittstiter des IgA-Antikörpers, der für das Antigen spezifisch ist, in Kolostren aus unterschiedlichen nicht ausgewählten Nutztieren, die gegen das Antigen immunisiert worden waren."
Erfindungsgemäß wird ein gewonnenes Brustsekretionsprodukt bereitgestellt, das einen für ein Antigen spezifischen Antikörper umfasst, wobei das Brustsekretionsprodukt durch ein Verfahren erhältlich ist, umfassend

– Hyperimmunisieren eines Nutztieres hinsichtlich des Antigens, wobei das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens über einen intramukosalen Weg umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Luftweg des Nutztiers, intravaginal, intrarektal und intranasal, und
– Verabreichen des Antigens an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust des Nutztieres und
– Gewinnen des Brustsekretionsprodukts von dem Nutztier. Das Brustsekretionsprodukt enthält überraschenderweise wesentlich höhere Mengen an für das Antigen spezifischem Antikörper (hierin nachstehend als Antigen-spezifischer Antikörper bezeichnet) als Sekretionsprodukte, die über herkömmliche Verfahren im Stand der Technik erhalten werden. Außerdem wurde festgestellt, dass es unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren möglich war, wesentliche Mengen an Antigenspezifischem Antikörper in der reifen Milch des laktierenden Tiers zu erhalten. Tatsächlich lagen die Mengen an solchen Antigen-spezifischen Antikörpern in dem Bereich von denjenigen, die im Kolostrum erzeugt werden können. Unter Hyperimmunisieren wird verstanden, dass das Tier eine übernormale Menge an Antigen-spezifischen Antikörpern in dem Blut oder in einer mukosalen Sekretion, nicht in einer Milchsekretion, produziert. Eine übernormale Menge bedeutet, dass die Menge an Antikörpern in dem Tierkörper höher ist, als sie ohne eine Verabreichung des Antigens oder nach einer einzigen Verabreichung des Antigens wäre. Vorzugsweise umfasst das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens an einen Luftweg des Tieres. Durch diese Luftwegverabreichung war es möglich, eine anhaltende Produktion von beträchtlichen Mengen an Antikörper in der Milch des Tieres ohne den Bedarf an zusätzlichen Boosterverabreichungen des Antigens an das Tier zu erhalten. Jedoch können Boosterverabreichungen des Antigens an das Tier in denjenigen Fällen durchgeführt werden, bei denen festgestellt wird, dass die Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper nach einer gewissen Zeit abfallen. Vorzugsweise umfasst die Luftwegverabreichung eine intranasale Verabreichung des Antigens. Eine intranasale Verabreichung ist relativ leicht durchzuführen und es wurde festgestellt, dass eine Luftwegverabreichung höhere Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper in dem Brustsekretionsprodukt und eine länger anhaltende Produktion der Antikörper in der Milch des Tiers über die Zeit induziert. Vorzugsweise ist das Brustsekretionsprodukt Milch. Milch ist leicht zu sammeln und es ist, da die Produktion an Antigen-spezifischem Antikörper in der Milch über die Zeit andauert, möglich, eine Gruppe von Tieren zu selektieren, die die besten Mengen an Antigenspezifischem Antikörper in der Milch aufweisen, wodurch die Gesamtleistung und Logistik des Verfahrens verbessert werden.

Die Erfindung zeigt folglich, dass ein Herstellen einer einzigartigen Milchflüssigkeit in einer anhaltenden Weise möglich ist. Die Eigenschaften einer solchen Flüssigkeit sind: a) die Flüssigkeit weist die Eigenschaften von Kolostrum auf, sofern Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper betroffen sind, b) die Gesamtzusammensetzungseigenschaften der Flüssigkeit sind dennoch vergleichbar mit denen von Milch. Unter den Eigenschaften von Kolostrum, sofern Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper betroffen sind, wird hierin verstanden, dass die Menge und/oder Art eines Antigen-spezifischen Antikörpers vergleichbarer zu Kolostrum als zu Milch ist. Zum Beispiel muss die Menge an Antigen-spezifischem Antikörper in der Flüssigkeit höher sein als die Menge an Antigen-spezifischem Antikörper, die normalerweise in Milch erhalten wird. In diesem Fall ist die Menge an Antigen-spezifischem Antikörper in der Flüssigkeit mindestens teilweise vergleichbar zu der Menge an Antigenspezifischem Antikörper in dem Kolostrum, da beide Mengen höher sind als die Menge an Antigen-spezifischem Antikörper, die normalerweise in Milch erhalten wird.
Es ist klar, dass ein jeglicher Immunisierungsplan, wobei das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens über einen intramuskulären Weg umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Luftweg des Nutztiers, intravaginal, intrarektal und intranasal, der zu einem Tier führt, das hinsichtlich des Antigens hyperimmunisiert ist, mit einer Verabreichung eines Antigens an eine Brustdrüse oder einen Lymphknoten über der Brust kombiniert werden kann, um das Ergebnis zu erhalten. Es besteht kein tatsächlicher Bedarf zu untersuchen, ob ein Tier hyperimmunisiert ist, bevor eine Verabreichung eines Antigens an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust durchgeführt wird. Man kann leicht die Antikörpermenge in einem Brustsekretionsprodukt des Tiers bestimmen. Eine niedrige Menge an Antikörper in dem Sekretionsprodukt zeigt an, dass das Tier nicht hyperimmunisiert war, und eine zusätzliche Verabreichung an Antigen wird benötigt, um eine Hyperimmunisierung zu erreichen.
Ein Antigen, gegen das der Antigen-spezifische Antikörper gerichtet ist, kann eine jegliche Verbindung oder Kollektion von Verbindungen sein, die zum Auslösen einer Immunantwort fähig ist. Typischerweise umfasst das Antigen ein Protein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon. Ein Antigen, das an das Tier verabreicht wird, unterscheidet sich typischerweise nicht von Verabreichung zu Verabreichung an das Tier. Jedoch muss dies nicht notwendigerweise zutreffen. Es ist möglich, unterschiedliche Manifestationen an Antigen, z.B. unterschiedliche Proteine, zu verwenden, sofern unterschiedliche Manifestationen mindestens einen Teil umfassen, der immunologisch der gleiche ist. Unter immunologisch der gleiche wird verstanden, dass ein Antikörper fähig ist, unterschiedliche Manifestationen des Antigens zu erkennen. Ein Antigen kann auch über ein Verabreichen einer Nukleinsäure, die das Antigen oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert, an das Tier verabreicht werden. Eine verabreichte Nukleinsäure kann von Zellen des Tiers, denen die Nukleinsäure zugeführt wurde, exprimiert werden. Eine Expression des Antigens oder funktionellen Äquivalents in Zellen des Tiers erzeugt eine Immunantwort. Diese Technologie wird im Stand der Technik auch als Nukleinsäure-Vakzine bezeichnet.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass eine hohe allgemeine Immunantwort benötigt wird, um einen wesentlichen Pool, eine wesentliche Zirkulation oder ein wesentliches Reservoir an Zellen bereitzustellen, die einen Antigen-spezifischen Antikörper produzieren. Eine Immunisierung einer Brustdrüse und/oder eines Lymphknotens über der Brust wird benötigt, um Zellen aus dem Pool, der Zirkulation oder dem Reservoir zu dem Brustgewebe derart anzuziehen, dass eine Sekretion des Antigen-spezifischen Antikörpers zu dem Brustsekretionsprodukt ermöglicht wird. Es ist bevorzugt, dass die Bildung des Pools, der Zirkulation oder des Reservoirs mit einem Immunisierungsplan erreicht wird, der zu einer hohen mukosalen Immunantwort führt, da auf diesem Wege mindestens ein Teil des Pools, der Zirkulation oder des Reservoirs zu der Brustdrüse gezogen wird, was folglich eine frühere und ausgeprägtere Sekretion des Antigen-spezifischen Antikörpers nach einer Immunisierung einer Brustdrüse und/oder eines Lymphknotens über der Brust vereinfacht. Vorzugsweise wird jedoch der Pool, die Zirkulation oder das Reservoir über einen Immunisierungsplan gebildet, der zu einer hohen mukosalen und/oder systemischen Immunantwort führt.
Ein Immunisierungsplan umfasst eine oder mehrere Verabreichungen eines Antigens an ein Nutztier. Ein Immunisierungsplan, der zu einer hohen mukosalen und/oder systemischen Immunantwort führt, wird vorzugsweise mindestens teilweise durch Inhalation eines Antigens durch das Tier erreicht. Die Zusammensetzung für eine Inhalation wird natürlich vorzugsweise derart verabreicht, dass ein Antigen in der Zusammensetzung über den Hauptteil des Luftweges des Tiers verteilt wird. Eine Luftwegverabreichung wird vorzugsweise in der Form von Aerosolen erreicht. Vorzugsweise erfolgt die Luftwegverabreichung durch intranasale Verabreichung. Vorzugsweise umfasst der Immunisierungsplan, der zu einer hohen mukosalen und/oder systemischen Immunantwort führt, mindestens zwei Luftwegverabreichungen einer Zusammensetzung, die das Antigen umfasst. Mehr bevorzugt umfasst er mindestens vier Luftwegverabreichungen einer Zusammensetzung, die das Antigen umfasst.
Durch erfindungsgemäße Mittel und Verfahren weisen sowohl eine Brustdrüsenimmunisierung als auch eine Verabreichung an einen Lymphknoten über der Brust einer Zusammensetzung, die das Antigen beinhaltet, die Wirkung auf, die Sekretion an großen Mengen von Antigen-spezifischem Antikörper in der Milch eines Nutztieres zu ermöglichen. Vorzugsweise wird mindestens eine Verabreichung in den Lymphknoten über die Brustdrüse durchgeführt. Vorzugsweise werden mindestens zwei Verabreichungen in den Lymphknoten über der Brust durchgeführt. Eine Verabreichung an einen Lymphknoten über der Brust führt zu einer höheren und früheren Zunahme an Antigen-spezifischen Antikörpern in der Milch.
Erfindungsgemäße Mittel und Verfahren sind geeignet, um eine hohe und anhaltende Produktion an Antigen-spezifischem Antikörper in der Milch eines jeglichen laktierenden Säugers zu erhalten. Vorzugsweise ist das Tier ein Nutztier. Nutztiere sind Tiere, die auf einer kommerziellen Basis durch Menschen verwendet werden, sei es für die Produktion von Milch, Fleisch oder sogar Antikörpern. Nutztiere, die bereits für die Produktion von Milch im kommerziellen Maßstab verwendet werden, sind erfindungsgemäß bevorzugt, da für diese Tiere spezielle Linien und/oder Züchtungen existieren, die für eine Milchproduktion optimiert sind. Vorzugsweise ist das Nutztier eine Kuh. Alternativ dazu ist das Nutztier eine Ziege.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, hohe Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper in einem jeglichen Brustsekretionsprodukt, wie z.B. dem Kolostrum oder der Milch, zu erhalten.
Antigen-spezifische Antikörper in der Milch können einer jeglichen Immunklasse angehören. Jedoch gehören vorzugsweise die Antikörper der IgG- und/oder IgA-Klasse an. Mehr bevorzugt gehören die Antikörper der IgA-Klasse an.
Milch, die Antigen-spezifische Antikörper enthält, wird vorzugsweise durch Melken des Tiers gesammelt. Milch, die so gesammelt wurde, kann entweder direkt verwendet werden oder kann z.B. zu reinen Antigen-spezifischen Antikörpern weiter aufgearbeitet werden. Verfahren für die (teilweise) Aufreinigung von (Antigen-spezifischen) Antikörpern aus Milch sind im Stand der Technik vorhanden und müssen hier nicht aufgelistet werden.
Erfindungsgemäße Antigen-spezifische Antikörper können für einen nahezu jeglichen Zweck verwendet werden. Vorzugsweise werden die Antikörper für einen Zweck verwendet, für den polyklonale Antikörper im Stand der Technik verwendet werden. Jedoch ist es unter Verwendung von Aufreinigungsverfahren im Stand der Technik auch möglich, im Wesentlichen monoklonale Antikörper zu erhalten, z.B. durch Immunisierung mit einem Antigen, das im Wesentlichen lediglich einen immunogenen Teil umfasst. Im Wesentlichen monoklonale Antikörper können auch auf anderen Wegen, z.B. durch Immunaufreinigung eines Antikörpers unter Verwendung eines Peptids, das im Wesentlichen lediglich eine Bindungsregion für einen Antikörper umfasst, produziert werden. Antigen-spezifische Antikörper (aufgereinigt aus der Milch oder nicht) werden vorzugsweise für die Herstellung eines Medikaments verwendet. Solche Antikörper können z.B. für die Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Hautwunden, z.B. mit einem Antikörper, der für ein Hautbakterium spezifisch ist, verwendet werden. Solche Antikörper sind auch besonders für die Behandlung einer Erkrankung geeignet, die durch Pathogene im Gastrointestinaltrakt verursacht wird. Im Allgemeinen können die Antigenspezifischen Antikörper aus der Milch eines Nutztiers in einem jeglichen (mindestens teilweise) immungeschützten Bereich des menschlichen Körpers verwendet werden. Solche Bereiche sind z.B. der Gastrointestinaltrakt, der Respirationstrakt, der Urogenitaltrakt, das Auge, der Mund und die Haut. Jedoch können solche Antikörper auch verwendet werden, um Antigene zu binden, die über dem Blutfluss in einem Patienten erreicht werden können, z.B. nach systemischer Verabreichung der Antikörper an das Individuum. Unter Berücksichtigung, dass das zu behandelnde Individuum gewöhnlich ein Mensch ist, und die Antikörper von einem Nutztier abgeleitet sind, wird erwartet, dass das Immunsystem des Individuums auf die verabreichten Antikörper, insbesondere, wenn sie systemisch verabreicht werden, reagie ren wird. Jedoch sind viele Anwendungen einer solchen systemischen Verabreichung von Antikörpern immer noch möglich, z.B. wenn das Individuum noch keine Immunantwort auf die Antikörper erzeugt hat (wie z.B. in dem Fall einer ersten Verwendung in dem Individuum) oder wenn die Immunantwort (über die Zeit) abgenommen hat.
Antigen-spezifische Antikörper (aufgereinigt aus der Milch oder nicht) können auch für die Herstellung z.B. eines Nahrungsmittelprodukts verwendet werden. Viele bakterielle aber auch virale Mikroben können in dem Magendarmtrakt vorhanden sein. Einige dieser Mikroben können subklinisch vorhanden sein. Mit einem erfindungsgemäßen Verfahren können Antikörper erzeugt werden, die gegenüber einer oder mehreren dieser Mikroben spezifisch sind. Solche Antikörper können verwendet werden, um ein Nahrungsmittelprodukt oder ein anderes Produkt herzustellen. Durch Essen des Produkts werden Antikörper gegen eine oder mehrere Mikroben in dem Magendarmtrakt freigesetzt, was folglich mindestens teilweise verhindert, dass sich die Mikroben vermehren.
Unter Berücksichtigung, dass die Antikörper in einem Nutztier produziert werden, werden die Antikörper typischerweise für Antigene spezifisch sein, die nicht natürlicherweise in dem Tier (nicht selbst) vorhanden sind. Folglich können im Allgemeinen Antikörper gegen ein jegliches Antigen produziert werden, das für das Tier fremd ist. Typischerweise umfassen solche Antikörper eine Spezifität gegen Bakterien, Viren und Toxine davon. Jedoch können Antikörper auch gegen Säugerantigene gerichtet werden, wenn eine ausreichende Divergenz zwischen dem verabreichten Antigen und dem Homolog des Antigens in dem Nutztier vorhanden ist. Obwohl es weniger einfach ist, ist es auch möglich, eine Antikörperantwort auf mindestens einige Selbstantigene zu erzeugen. Mehrere Verfahren zum Erreichen dieses Ergebnisses sind im Stand der Technik vorhanden.
Ein oder mehrere der Immunisierungspläne können ferner eine Verabreichung einer oder mehrerer anderer Verbindungen beinhalten, die zur Stimulation und/oder Modulation einer Immunantwort des Nutztieres fähig sind. Geeignete Adjuvanzien sind im Stand der Technik bekannt und können unter anderem Freund'sches unvollständiges Adjuvans, Aluminiumhydroxid, immunstimulierende Komplexe ISCOMS auf Saponin/Cholesterin-Basis und das auf Glycerin-Polysorbat-basierende Adjuvans "RhinoVax" (Jakobsen et al., Infect. Immun. 67:4128–4133 (1999)), beinhalten. Vorzugsweise ist das Adjuvans zur Modulation einer Immunantwort zu ei ner mukosalen Immunantwort fähig. Nicht begrenzende Beispiele solcher Verbindungen sind 1α,25(OH₂)D₃, Cholera-Holotoxin, Toxin A und Toxin B von Clostridium difficile, Cytokine wie IL-5, IL-6, IL-12 oder TGF-3, unmethylierte C_pG (bakterielle DNA)-Sequenzen mit Phosphodiesterrückgrat. Käuflich verfügbare Alternativen zu Freund'schen vollständigen Adjuvanzien beinhalten Ribi Adjuvant System (RAS), Titer Max, Syntex Adjuvant Formulation (SAF), Elvax 40W, Montanid, AdjuPrime, Gerbu Adjuvant und Super Carrier. Antigene können auch für eine langsame Freisetzung mit L-Tyrosin co-präzipitiert oder an Nitrocellulose adsorbiert sein. Natürlich können auch Kombinationen von Adjuvanzien verwendet werden.
Erfindungsgemäße Verfahren können verwendet werden, um eine Immunantwort gegen das Antigen in dem Nutztier auszulösen. Jedoch ist es natürlich auch möglich, die erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden, um eine bereits existierende Immunität gegen das Antigen in dem Nutztier zu amplifizieren.
Das Nutztier kann gegen ein Antigen immunisiert sein, jedoch unter Berücksichtigung, dass eine polyklonale Immunantwort erzeugt wird, umfassen Antigen-spezifische Antikörper in der Milch typischerweise eine Spezifität gegenüber zwei oder mehreren unterschiedlichen Teilen des Antigens. Wenn ein Antigen verwendet wird, das ein komplexes Gemisch von unterschiedlichen Verbindungen umfasst, werden viele Antikörper, die eine Spezifität für unterschiedliche Teile des Antigens umfassen, erzeugt und sind in der Milch des Tiers vorhanden. Es ist natürlich leicht, ein erfindungsgemäßes Verfahren für ein anderes Antigen einmal oder mehrere Male zu wiederholen und folglich ein Brustsekretionsprodukt zu erzeugen, das einen Satz an Antikörpern für ein oder mehrere Antigene oder mehrere vernetzte Antigene umfasst.
Eine Immunempfindlichkeit von Nutztieren bezüglich eines bestimmten Antigens kann mittels genetischer Manipulation der Tiere weiter verstärkt werden. Zum Beispiel kann ein jeglicher der zahlreichen biochemischen Schritte, die kritisch bei dem Verfahren von einer B-Zell-Aktivierung zu einer Antikörpersekretion in den mukosalen Oberflächen involviert sind, mittels genetischer Modifizierung optimiert werden. Nicht begrenzende Beispiele sind: eine erhöhte Expression von spezifischen MHC-Antigen-Molekülen für eine wirksame Antigenpräsentation, eine erhöhte Expression einer J-Kette für eine erhöhte IgA-Dimer-Bildung und/oder eine erhöhte Expression von Homing-Rezeptoren für eine erhöhte Migration aktivierter Lymphozyten zu dem Brustgewebe. Eine Expression von zahlreichen Cytokinen und Lymphokinen, die bei dem Prozess involviert sind, kann auch manipuliert werden, um Mengen für eine maximale Antikörpersekretion zu optimieren. Ferner können Tiere, von denen bewiesen ist, dass sie starke Responder auf ein bestimmtes Antigen sind, kloniert werden, so dass nach einer Immunisierung der klonierten Tiere hohe Ausbeuten an Antigen-spezifischem Antikörper gewährleistet werden.
In einer Ausführungsform umfasst das Antigen eine Kollektion von Verbindungen, die aus einer Kultur von Clostridium diffcile gewonnen werden. Diese Kollektion von Verbindungen enthält mehrere Proteine, zu denen Formaldehyd-inaktivierte C. difficile (VPI10463)-Zellen, Formaldehyd-inaktivierte Sporen des Bakteriums und Formaldehyd-inaktivierte C. diffcile-Toxoide, die Toxin A und Toxin B sind, gehören. Antikörper, die gegen diese Kollektion gerichtet sind, werden typischerweise eine Spezifität gegenüber mehr als einem Protein von C. diffcile umfassen. Vorzugsweise umfassen die Antikörper Antikörper, die für Sporen von C. diffcile spezifisch sind. Zubereitungen solcher Antikörper können für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die mit C. difficile-Infektionen assoziiert sind. Eine Verabreichung an ein Individuum erfolgt vorzugsweise derart, dass Antikörper dem Darm zugeführt werden. Mehrere Verfahren sind im Stand der Technik vorhanden, um eine solche Zufuhr zu ermöglichen, z.B. können Antikörper in Pillen enthalten sein, die ihren Inhalt an den Darm abgeben. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Antikörper eine Spezifität gegenüber Sporen von C. difficile. Solche Antikörper sind besonders dafür verwendbar, um mindestens teilweise ein Wiederauftreten einer mit C. difficile in Beziehung stehenden Erkrankung zu verhindern. Typischerweise wird eine mit C. diffcile in Beziehung stehende Erkrankung mit einer Medikation behandelt, die gegen eine Entfernung von C. difficile-Bakterien gerichtet ist. Eine solche Medikation kann z.B. aus der Verabreichung von Antibiotika und/oder Antikörpern, die gegen eine oder mehrere bakterielle Komponenten von C. difficile gerichtet sind, bestehen. Obwohl diese Behandlung gewöhnlich beim Heilen des Patienten von den Symptomen erfolgreich ist, ist sie oft (in 20% der Fälle) nicht ausreichend, um ein Wiederauftreten der Erkrankung in dem Patienten zu verhindern. Ein Wiederauftreten kann zumindest teilweise dadurch verhindert werden, dass dem Darm des Patienten Antikörper mit einer Spezifität gegenüber Sporen von C. difficile zugeführt werden. Ein Binden der Antikörper an mindestens einen Teil der C. difficile-Sporen in dem Darm vermindert mindestens teilweise die Neigung, mit der die Sporen ausreifen können. Folglich wird zumindest teilweise ein Wiederauftreten einer mit C. difficile in Beziehung stehenden Erkrankung in dem Patien ten verhindert. Folglich wird erfindungsgemäß auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Antikörper umfasst, der zum Binden an eine Spore von C. difficile fähig ist. Ferner wird die Verwendung eines Antikörpers, der für eine C. difficile-Spore spezifisch ist, für die Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Vorzugsweise wird der Antikörper für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer mit C. difficile in Beziehung stehenden Erkrankung verwendet.
Laktierende Nutztiere können an bakteriellen und/oder viralen Infektionen in der Brustdrüse leiden. Solche Infektionen können mindestens teilweise dadurch behandelt werden, dass eine Sekretion eines Antigen-spezifischen Antikörpers in das Sekretionskompartiment der Brustdrüse ermöglicht wird. Eine solcher Erkrankungen ist Mastitis. Erfindungsgemäß wird daher ferner ein Verfahren für die Behandlung einer mikrobiellen Infektion einer Brustdrüse in einem Tier bereitgestellt, das ein Verabreichen an das Tier eines Antigens derart, dass eine hohe Immunantwort erhalten wird, und ein Verabreichen des Antigens an eine Brustdrüse und/oder an einen Lymphknoten über der Brust des Tiers umfasst, wobei das Antigen mindestens einen Teil der Mikrobe oder ein funktionelles Derivat und/oder Analogon davon umfasst. Die Immunantwort kann eine systemische Immunantwort sein. Vorzugsweise ist die Immunantwort eine allgemeine (sowohl eine systemische als auch mukosale) Immunantwort. Vorzugsweise leidet das Tier an Mastitis oder es besteht ein Risiko, dass es an Mastitis leidet.
Antigene können für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion einer Brustdrüse verwendet werden, wobei das Medikament eine Zusammensetzung für eine Luftwegverabreichung des Antigens und eine Zusammensetzung für eine Verabreichung des Antigens an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust umfasst. Vorzugsweise verursacht die mikrobielle Infektion Mastitis. Das Medikament kann auch für die Behandlung eines Menschen geeignet sein.
Mastitis ist eine Erkrankung, die den transienten oder manchmal permanenten Verlust einer Milchproduktion verursacht. Ein Verlust der Milchproduktion kann durch die Erkrankung selbst oder durch die Verwendung von Antibiotika, die die Milchproduktion beeinflussen, oder durch beides induziert werden. Tiere, die an Mastitis leiden, werden sehr krank und manchmal sterben sie. Mastitis beeinflusst in beträchtlichem Maß die Menge an Arbeit und Produktionskosten für einen Landwirt.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird Milch bereitgestellt, die von einem laktierenden Nutztier erhalten wird und mindestens 15 μg/ml an Antigen-spezifischem Antikörper umfasst. Mehr bevorzugt umfasst die Milch mindestens 50 μg/ml an Antikörper, gegen den das Tier durch ein erfindungsgemäßes Verfahren immunisiert wurde.
Eine Verabreichung eines Antigens an das Tier kann durch bekannte Mittel erreicht werden. Typischerweise wird ein Antigen in einem Bereich verabreicht, der für ein Protein einer Größe von etwa 10 kDa zwischen 5 und 500 μg variiert. Ein Antigen auf der Basis von ganzen (inaktivierten) Zellen und/oder Sporen wird typischerweise derart verabreicht, dass ein Äquivalent in dem Bereich von 10⁸ bis 10¹¹ Zellen und/oder Sporen dem Tier zugeführt wird. Andere Konzentrationen und/oder Mengen können auch verwendet werden, abhängig von der Größe des Tiers, der Immunogenizität des Antigens und/oder Adjuvanzien oder anderen bekannten Variablen.
Ein starker Beweis existiert in der Literatur, dass Pathogen-spezifische Antikörper, die aus Kolostrum und Milch von Kühen erhalten werden, für eine Verhinderung und Behandlung von gastrointestinalen Infektionen, die durch verschiedene Pathogene verursacht werden, wirksam sind. Trotz vielversprechender Indikationen wurde jedoch eine Produktentwicklung hauptsächlich aufgrund einer Nichtverfügbarkeit von ausreichenden Mengen an Pathogen-spezifischen Antikörpern noch nicht weitverbreitet realisiert.
Es ist relativ leicht, hohe Mengen an Antigen-spezifischen Antikörpern aus Kolostrum von Kühen nach einer Immunisierung mittels herkömmlicher Verfahren zu erhalten. Jedoch hält eine Sekretion von Kolostrum lediglich 2 bis 3 Tage nach jeder Geburt eines Kalbes an und, sobald sie in eine Zeitspanne einer reifen Laktation eintreten, fallen Mengen eines solchen Antikörpers nahe auf Null. Erfindungsgemäß werden Immunisierungsverfahren beschrieben, die zu einer Sekretion von hohen Mengen an Antigen-spezifischen Antikörpern nicht nur im Kolostrum sondern auch in reifer Milch von laktierenden Nutztieren für eine anhaltende Zeitspanne führen. Wie wir in den Beispielen zeigen, ist es unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, reife Milch von einem Tier zu erhalten, die einen Antigen-spezifischen Antikörper in einer Menge umfasst, die mindestens halb so groß ist wie diejenige, die durchschnittlich in dem Kolostrum des Tiers unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren des Stands der Technik erhalten werden kann.
Folglich wird in einem erfindungsgemäßen Aspekt eine reife Milch bereitgestellt, die aus einem Säuger erhältlich ist und einen Antigen-spezifischen Antikörper in einer Menge von mindestens 200% der durchschnittlichen Menge des Antigen-spezifischen Antikörpers umfasst, die im Kolostrum des Säugers erhältlich ist, wobei das Kolostrum nach einer Immunisierung des Säugers gegen das Antigen erhalten wird. Vorzugsweise besteht der Antigen-spezifische Antikörper aus IgA, da IgA Dimere bildet, die sehr gut zur Bildung von Komplexen fähig sind.
Unter einer durchschnittlichen Menge des Antigen-spezifischen Antikörpers, die im Kolostrum erhältlich ist, wird hierin eine Menge verstanden, die der Durchschnitt von Ausbeuten an Antigen-spezifischem Antikörper ist, erhalten aus Kolostren von unterschiedlichen nicht selektierten Tieren, die gegen das Antigen immunisiert worden waren.
Eine Ausbeute von mindestens 200% ist eine wichtige Verbesserung, da im Stand der Technik lediglich Ausbeuten an Antigen-spezifischem Antikörper in reifer Milch von etwa einem Zehntel im Vergleich zu Ausbeuten, die aus Kolostrum erhalten werden, möglich waren. Jedoch werden, wie wir in den Beispielen zeigen, erfindungsgemäß höhere Ausbeuten an IgA in reifer Milch bereitgestellt als die Ausbeuten, die im Kolostrum unter Verwendung herkömmlicher Verfahren des Stands der Technik erhalten wurden.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND METHODEN
DUKORAL^®, ein orales Cholera-Vakzin, das für eine Verwendung in Menschen zugelassen ist, wurde von SBL Vaccin AB, Stockholm, bezogen. Jede Ampulle besteht aus Formalin-inaktivierten Vibrio cholera und Cholera-Toxin-Untereinheit-B (CTB) bei Konzentrationen von 10¹¹ Zellen bzw. 1 mg Protein in 3 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (PBS).
Ganze Zellen von Clostridium difficile. Ganze Zellen von C. difficile wurden wie vorher beschrieben hergestellt und inaktiviert. Kurz gesagt, wurde C. difficile VPI 10463 in BHI-Medium bei 37°C unter einer anaeroben Atmosphäre 36 Stunden vermehrt. Kulturen wurden zentrifugiert und Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Die sich ergebenden Pellets wurden in PBS mit 1% (vol/vol) Formaldehyd wieder suspendiert und bei 4°C bis zu einer Verwendung gehalten. Vor einer jeglichen Immunisierung wurde ein Überschuss an Formaldehyd durch zwei Waschgänge mit PBS entfernt. Eine Animpfung des Äquivalents von 109 C. difficile CFU (eine Zellsuspension mit einer optischen Dichte von 1,0 bei 550 nm bei einem Lichtweg von 1 cm) in BHI-Medium ergab kein Wachstum nach 36 Stunden bei 37°C in einer anaeroben Atmosphäre.
C. difficile-Toxoid. Ein Kulturfiltrat von C. difficile wurde wie vorher beschrieben hergestellt und inaktiviert. Kurz gesagt, wurde C. difficile VPI 10463 in Proteose-Pepton-Hefe-Extrakt-Medium 48 Stunden bei 37°C vermehrt und durch Zugabe von Formaldehyd, um eine Konzentration von 1% (vol/vol) zu ergeben und Inkubation bei 37°C für 1 Stunde inaktiviert. Der Überstand wurde sterilfiltriert, dreimal mit PBS durch Ultrafiltration (Amicon, 30 kDa) gewaschen, 10fach in einem 500-ml-Zellkonzentrator konzentriert und bei –20°C bis zu einer Verwendung gelagert.
Tiere. Tragende Holstein-Friesische und MRY-Milchkühe wurden gemäß allgemein anerkannten Milchmanagementpraktiken in den Niederlanden gehalten. In den in dieser Mitteilung beschriebenen Experimenten wurden hauptsächlich Holstein-Friesische-Kühe verwendet. Zusätzlich wurden schwangere Ziegen ausgewählt und in einer separaten Farm ebenfalls gemäß allgemein anerkannten Managementpraktiken gehalten.
Immunisierungswege und -pläne. Kühe: Für eine intramuskuläre (IM) Immunisierung, Immunisierung in das Euter (IUDR) oder Immunisierung in einen Lymphknoten über der Brust (LMF) wurde eine 2-ml-Vakzin-Zubereitung in PBS über eine direkte Injektion in die entsprechenden Gewebe verabreicht. Für eine intranasale (IN) Immunisierung wurde eine 2-ml-Vakzin-Zubereitung in eines der Nasenlöcher von Kühen über eine Düse, die an eine Spritze befestigt war, versprüht, während das Gesicht nach oben gezwungen wurde. Für Immunisierungen mit dem Cholera-Vakzin wurde DUKORAL in PBS derart verdünnt, dass jeweils 2 ml 6,5 × 10⁹ V. cholera zusammen mit 66 μg an CTB enthielten. In den Fällen des C. difficile (CD)-Vakzins wurden das Toxoid und die Ganzzellzubereitungen gemischt und in PBS verdünnt, um 5 × 10¹⁰ inaktivierte C. difficile zusammen mit 5,5 mg Protein an Kulturüberstand in 2 ml zu ergeben.
Ziegen: Vakzine, die für Rinder hergestellt wurden, wurden weiter mit einem gleichen Volumen an PBS (auf 50%) verdünnt. Für jede Immunisierung wurden 2 ml verwendet, mit der Ausnahme von LMF, bei der lediglich 1 ml verwendet wurde.
Probensammlung und Serum- und Molkenherstellung. Normalerweise wurden 5 ml Milchprobe von jedem Viertel wöchentlich gesammelt. Wenn gewünscht, wurden 5 ml Blutprobe auch aus der Schwanzvene gesammelt. Molke wurde aus Milchproben wie vorher beschrieben hergestellt. Kurz gesagt, wurde Fett mittels Zentrifugation bei 4°C für 15 Minuten bei 4300 g in einer MSE Mistralzentrifuge 6000 entfernt. Casein wurde durch Säurepräzipitation bei einem pH-Wert von 4,6 durch Zugabe von Natriumacetat und Essigsäure, gefolgt von Zentrifugation bei Raumtemperatur für 15 Minuten bei 3500 g entfernt. Blut wurde zur Gerinnung über Nacht bei 4°C stehen gelassen und das Serum wurde durch Zentrifugation erhalten.
Test. Ein indirekter ELISA wurde durchgeführt, um Mengen an Immunogen-spezifischem IgG und IgA in Molke- und Serumproben zu messen. Am Anfang (für Proben aus Kühen, die mit DUKORAL immunisiert worden waren) erfolgte ein ELISA manuell, aber später (für Proben aus Kühen, die mit dem CD-Vakzin immunisiert worden waren, und Proben von Ziegen, die mit DUKORAL und dem CD-Vakzin immunisiert worden waren) wurde der ELISA-Roboter BioTek OMNI verwendet. In beiden Fällen wurden Mikrotiterplatten (Greiner 655902, Greiner) mit entweder CTB oder inaktivierten ganzen Zellen von C. difficile bei Konzentrationen von 0,3 μg CTB bzw. 2 × 10⁷ Zellen pro Well beschichtet. Ein Beschichten wurde durch Inkubation für 2 h bei 37°C mit CTB oder für 2 h bei 70°C mit ganzen Zellen von C. difficile erreicht. Die Platten wurden nach einem jeglichen Inkubationsschritt mit PBS mit 0,05% Tween 20 gewaschen. Die Wells wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 2% Gelatine in PBS geblockt. Proben wurden in PBS in Duplikaten verdünnt und wurden 1 h bei 37°C inkubiert. Für die Messung von Antigen-spezifischen Rinder-Antikörpern in gesammelten Proben wurden Digoxigenin-markierte monoklonale Anti-Rinder-IgA- oder Anti-Rinder-IgG-Antikörper in dem Labor hergestellt und als die sekundären Antikörper verwendet. Für die Messung von Antigen-spezifischen Ziegen-Antikörpern in gesammelten Proben wurden monoklonale Anti-Ziegenantikörper anstelle von Anti-Rinderantikörpern als die sekundären Antikörper verwendet. Für einen Nachweis wurde Rettichperoxidase-markiertes Ziegen-Anti-Digoxigenin-POD-Fab-Fragment (Boehringer Mannheim) verwendet. ABTS, 2,2'-Azinodiethylbenzothiazolinsulfonsäure (Sigma) wurde als das Substrat für Rettichperoxidase ver wendet. Die optische Dichte nach einer Inkubation für 30 min bei 37°C wurde bei 415 nm mit einem Bio-Tek EL_x800-Lesegerät gemessen.
Titer. Mengen an Immunogen-spezifischem Ig in Proben wurden in Einheiten gegenüber dem Standard von 1000 Einheiten/ml ausgedrückt. Der Standard ist eine Molkezubereitung aus Kolostrum von Kühen, die entweder mit DUKORAL oder mit dem CD-Vakzin immunisiert worden waren.
Messungen von gesamtem Ig in Milch. Der Gesamtgehalt an Ig in jeder Molkeprobe, die aus immunisierter und nicht immunisierter Milch hergestellt worden war, wurde unter Verwendung von Hochdruck-Gel-Permeations-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
ERGEBNISSE. Bildung von Standards für Tests mit Antigen-spezifischem Antikörper. Kühe in ihrer späten Schwangerschaft wurden viermal mit einem dreiwöchigen Intervall zwischen den Immunisierungen vor einer Kalbung immunisiert. Für jede Immunisierung wurden Kombinationen von intranasalen (IN) und subkutanen (SC) Wegen verwendet. Das Immunogen bestand aus einer gleichen Menge an sowohl Vakzinen (DUKORAL und das CD-Vakzin) ergänzt mit Cholera-Toxin (50 μg/Kuh/Immunisierung) für den IN-Weg und Freund'schem unvollständigem Adjuvanz (gleiches Volumen des Immunogens) für den SC-Weg. Von jeder Kuh wurde Kolostrum aus dem ersten Melken gesammelt und Molke wurde hergestellt. Nach notwendigen Verdünnungen (Anti-CTB-IgA 320 x, Anti-CTB-IgG 8000 x, Anti-CD-IgA 130 x und Anti-CD-IgG 8000 x) mit PBS erfolgte ein ELISA. Die Messungen der optischen Dichte bei 415 nm sind in 1 (Anti-CTB-Antikörper) und in 2 (Anti-CD-Antikörper) gezeigt. Die Molkenzubereitungen wurden gesammelt und als Standards verwendet.
Anti-CTB-Ig-Mengen in Milch von Kühen nach einer Immunisierung mit Cholera-Vakzin, Dukoral. Mit dem Ziel einer Gewinnung von hohen Mengen an Immunogen-spezifischem Ig in der Milch von Säugern für einen anhaltenden Zeitraum wurden verschiedene Dosen von Dukoral als ein Antigen in laktierenden Kühen unter Verwendung verschiedener Immunisierungswege getestet. Zum Beispiel wurden Kombinationen von Wegen, ausgewählt aus subkutan (SC), in das Euter (IUDR), in einen Lymphknoten über der Brust (LMF), intravaginal (IVG) und intraperitoneal (IP), mit Konzentrationen an DUKORAL untersucht, die von einer 50fachen Verdünnung bis unverdünnt reichten. In den meisten Fällen waren die Anti-CTB-IgA- und -IgG-Titer in der Milch extrem niedrig (3 und 4) im Vergleich zu unserem Standard von 1000 Einheiten/ml. In wenigen Fällen, bei denen die Mengen wenige 100 Einheiten erreichten, konnten sie nicht wesentlich länger als eine Woche aufrechterhalten werden. Außerdem war der Zeitpunkt eines Auftretens solcher sporadischer Peaks hinsichtlich des Zeitpunkts einer Immunisierung nicht vorhersehbar.
Anti-CTB-Ig-Mengen in Milch und Blut von Kühen nach einer Nasalsprayimmunisierung gefolgt von einer Immunisierung in die Brust. Eine Gruppe von sechs Kühen in ihrer reifen Laktation wurden intranasal (IN) einmal wöchentlich für fünf aufeinanderfolgende Wochen mit dem Cholera-Vakzin Dukoral immunisiert. Während dieses fünfwöchigen Zeitraums wurden Mengen an CTB-spezifischem IgA und IgG in der Molke der Milch und im Blut überwacht. Die niedrigen Mengen (die von 0 bis etwa 50 reichten) in der Molke waren zu den Ergebnisse, die aus vorhergehenden Experimenten erhalten wurden, nicht signifikant verschieden (5 und 6). Anti-CTB-IgG-Mengen im Blut erhöhten sich jedoch kontinuierlich mit wiederholten IN-Behandlungen (ausgehend von etwa 10 bis etwa 1000 Einheiten am Ende der fünften Immunisierungssitzung), wohingegen CTB-spezifisches IgA im Blut unter der nachweisbaren Menge über die Zeitspanne der Experimente blieb. Eine einzige Boostbehandlung brachte jedoch interessante Veränderungen bezüglich dieser Ergebnisse in einer Reihe von Aspekten (5 und 6). Die Boostbehandlung, die 6 Wochen nach der letzten IN-Immunisierung gegeben wurde, bestand aus einer IM, einer IUDR in das hintere, rechte Viertel und einer LMF, ebenfalls in das hintere, rechte Viertel, wobei jeweils 2 ml verwendet wurden. Die Messung von Anti-CTB-IgA- und Anti-CTB-IgG-Titern über einen fünfmonatigen Zeitraum ist in 5 und 6 gezeigt. Ein paar auffällige Veränderungen, die von der Boostimmunisierung in die Brust herrührten, sind die folgenden: i) Sowohl Anti-CTB-IgA- als auch Anti-CTB-IgG-Antworten wurden in allen (6/6) Tieren beobachtet. ii) Im Vergleich zu den Titern im Standard (1000 Einheiten/ml) waren IgA-Antworten sehr stark, wobei sie etwa 300–500% der Standardmengen in einigen Kühen erreichten. IgG-Antworten waren geringer als diejenigen von IgA, aber immer noch sehr hoch (sie erreichten 30% des Standards in starken Respondern). iii) IgA-Antworten dauerten signifikant länger als diejenigen von IgG. iv) Obwohl es eine große Variation unter den Tieren hinsichtlich der Immunantworten gab, konnte das hier verwendete Immunisierungsverfahren die Antworten in eine synchrone Weise unter den Tieren bringen. v) IgA-Antworten waren mehr oder weniger auf die im munisierten Viertel begrenzt, wohingegen IgG-Antworten allgemein auf alle vier Viertel verteilt waren.
Mengen an Anti-C. difficile (ganze Zellen)-Ig in der Milch nach einer Nasalsprayimmunisierung gefolgt von einer Immunisierung in die Brust. Die interessanten Feststellungen, die in dem vorhergehenden Experiment gemacht wurden, stimulierten uns, das Experiment mit einem unterschiedlichen Immunogen auszudehnen. Folglich erfolgte ein Experiment mit dem CD-Vakzin mit wenigen Modifikationen zu dem vorstehend verwendeten Protokoll. Die Änderungen, die in dem neuen Protokoll verwendet wurden, zielten auf eine Evaluierung der Bedeutung der Anzahl von IN-Immunisierungen vor einer Injektion in die Brust als auch der Bedeutung des Intervalls zwischen IN-Immunisierungen und Immunisierungen in die Brust. Jede Kuh in einer Zehnergruppe in ihrer mittleren Laktation erhielt eine 2-ml-IN- und eine 2-ml-IM-Immunisierung. Messungen von Mengen an Anti-CD (ganze Zellen)-IgA und -IgG in Proben, die nach dem Primen aber vor dem Boost gesammelt worden waren, zeigten erwartete Ergebnisse: kaum nachweisbar ( 7). Drei Wochen nach dem Primen erhielt jede Kuh Boostbehandlungen, die aus einer 2-ml-IN, einer 2-ml-IUDR in das hintere, rechte Viertel und einer 2-ml-LMF auch in das hintere, rechte Viertel bestand. Milchproben wurden kontinuierlich wöchentlich gesammelt und Messungen für Mengen an Anti-CD (ganze Zellen) erfolgten unter Verwendung eines ELISA. Eine synchrone Zunahme an Immunogenspezifischem IgG, das von 130 bis 430 Einheiten/ml (gegenüber unserem Anti-CD-Standard von 1000 Einheiten/ml) abhängig von der Kuh reichte, wurde in der ersten Woche nach den Boostbehandlungen beobachtet (7). Wie es in dem Fall mit dem Cholera-Vakzin beobachtet wurde, war eine Anti-CD-IgG-Sekretion gleichmäßig über die vier Viertel verteilt und die Sekretion einer hohen Menge war relativ kurzlebig, wobei sie zu etwa 50%igen Mengen in einem Zeitraum von weniger als 2 Wochen abnahm. Unähnlich zu den sofortigen IgG-Antworten nach dem Boost zeigten sich Anti-CD-IgA-Antworten langsam und konnten mehr als einen Monat später nachgewiesen werden (8), wobei an diesem Zeitpunkt 7 Kühe (von 10) ausgewählt und wieder immunisiert wurden. Die erneute Immunisierung begann mit 2 IN-Immunisierungen, die eine Woche voneinander getrennt waren. Zwei Wochen danach erhielt jede Kuh Boostimmunisierungen einer IN- und zweier LMF-Immunisierungen (eine für jedes hintere Viertel). Unähnlich zu dem Fall einer IgG-Antwort und zu unserer Überraschung war eine Anti-CD-IgA-Antwort nicht unter den immunisierten Kühen synchronisiert (Synchronität einer Anti-CD-IgA-Antwort konnte später wiederhergestellt werden, wenn eine Kombination von LMF- und IMA-Wegen als ein Boost angewendet wurde) (vgl. das Experiment von 11). Ein weiteres unerwartetes Ergebnis in diesem Experiment ist, dass die starke Viertelspezifität, die in dem Fall einer Anti-CTB-IgA-Antwort festgestellt wurde, nicht länger festgestellt wurde, d.h. das immunisierte Viertel (hinten rechts) war nicht notwendigerweise dasjenige, das die größte Menge an Anti-CD-IgA sekretierte.
Relative Bedeutung von Immunisierungswegen. Um die relative Verteilung jedes Immunisierungsweges zu dem endgültigen Ergebnis einer Antikörpersekretion in Milch zu bewerten, wurden 8 Kühe mit dem CD-Vakzin immunisiert. Wie erwartet, wurden keine Anti-CD-Antikörper in der Milch nach zwei aufeinanderfolgenden Immunisierungen über den IN-Weg nachgewiesen, wobei zwei Wochen zwischen den Immunisierungen lagen (9 und 10). Eine Woche nach der zweiten IN-Immunisierung erhielten alle Kühe die dritte IN-Immunisierung zusätzlich zu einer IMA-Immunisierung lediglich in die vorderen Viertel (am 22.05.2000). Eine Woche danach (28.05.2000) waren Anti-CD-IgGs in allen vier Vierteln nachweisbar, aber sie waren äußerst niedrig (9). Anti-CD-IgA war jedoch nicht in allen vier Vierteln nachweisbar (10). Die 8 Kühe wurden sodann in zwei Gruppen aufgeteilt. Vier von diesen (Gruppe 1) erhielten das CD-Vakzin und die anderen vier (Gruppe 2) erhielten Kochsalzlösung über den LMF-Weg (am 29.05.2000). Eine Woche danach ergab sich eine bemerkenswerte Zunahme der Anti-IgG-Sekretion lediglich bei der Gruppe 1, was impliziert, dass der IMA-Weg relativ unwichtig für eine Sekretion der IgG-Klasse sein kann (9). Wie erwartet, gab es keine Viertelspezifität für die Sekretion. Wie für die IgA-Klasse wurden jedoch signifikante Mengen an Anti-CD-Antikörper-Sekretion in beiden Gruppen festgestellt, sogar in der Kochsalz-behandelten Gruppe (10), obwohl die letztere schnell über die Zeit abnahm. Die Daten implizieren, dass der LMF-Weg die Hauptrolle für eine IgA-Sekretion spielt, aber der IMA-Weg dies zu einem geringeren Maß auch tut. Es ergab sich ebenfalls (zusätzlich zu dem vorstehenden Experiment) ein scheinbares Verschwinden einer Viertelspezifität. Diese Beobachtung scheint unabhängig von den Immunisierungswegen zu sein und muss folglich das Ergebnis des verwendeten Vakzins sein, d.h. des attenuierten Toxins A von CD, des attenuierten Toxins B von CD und/oder der inaktivierten CD-Zellen. Die Feststellung ist möglicherweise wichtig, da sie uns zu einer Lösung eines unerwünschten logistischem Problems führen kann, dass Milch aus lediglich den hinteren Vierteln von Kühen gesammelt werden muss (eine Immunisierung der vorderen Viertel einer Kuh über den LMF-Weg ist ohne Chirurgie nicht möglich). Die Gesamtmengen an Anti-CD-Antikörper, sowohl IgA als auch IgG, in diesem Experiment (9 und 10) waren mindestens eine Größen- Ordnung niedriger als diejenigen, die vorher beobachtet wurden. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass es hochgradig wünschenswert ist, dass ein Boosten über den LMF-Weg mit einem anderen mukosalen Weg/anderen mukosalen Wegen wie IMA, intravaginal, intrarektal und/oder vorzugsweise intranasal einhergeht. Ein solches Beispiel, bei dem Kühe über die LMF- und IMA-Wege nach einem Primen über den IN-Weg immunisiert wurden, ist in 11 (Anti-CD-IgA) und in 12 (Anti-CD-IgG) gezeigt.
Mengen an Gesamt-Ig-Konzentration in der Milch von immunisierten Kühen. Unter Verwendung der in dieser Mitteilung beschriebenen Verfahren, konnten Mengen an Antigen-spezifischem Antikörper erreicht werden, die (nahe) an dem Bereich lagen, der normalerweise in dem Kolostrum von immunisierten Kühen gefunden wird. Da die Gesamt-Ig-Konzentration im Kolostrum einer nicht immunisierten Kuh ungefähr zwei Größenordnungen höher liegt als diejenige in reifer Milch, ist eine offensichtliche Frage, was die Gesamt-Ig-Konzentration in der Milch von immunisierten Kühen sein würde. Messungen, die unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie erfolgten, zeigten, dass Gesamt-Ig-Mengen in immunisierter Milch nicht signifikant verschieden von denjenigen in nicht immunisierter Milch waren, die im Durchschnitt 0,3 mg/ml betrugen. Die relative Menge an Gesamt-Ig in immunisierter und nicht immunisierter Milch ist in 13 gezeigt (für eine Immunempfindlichkeit jeder Kuh vergleiche 8). Der Wert der Kontrollgruppe ist derjenige einer zusammengefassten Gruppe (von 9 Proben).
Immunempfindlichkeit von von Rindern verschiedenen Säugern. Um eine Anwendbarkeit des gleichen Immunisierungsverfahrens auf andere Säuger für ähnliche Ergebnisse zu testen, wurden Ziegen ausgewählt: sie sind im Überfluss erhältlich und jede kann bis zu 2000 Liter Milch produzieren. Automatische Melksysteme sind auch erhältlich und Verfahren einer Käsebildung aus deren Milch und folglich einer Molkenbildung als auch Information über ihren Erkrankungsstatus und ihre Handhabung sind bekannt. Zehn Ziegen wurden dreimal über IN-Wege immunisiert, wobei drei Wochen zwischen den Immunisierungen lagen. Zwei Wochen nach der dritten IN-Immunisierung erhielt jede Ziege drei Immunisierungen jeweils eine über den IN-, IMA- und LMF-Weg. Messungen von Mengen an Anti-CTB-IgG, Anti-CTB-IgA, Anti-CD-IgG und Anti-CD-IgA in Molkeproben zeigten das ähnliche allgemeine Muster der Immunantwort, das in der Milch von immunisierten Kühen festgestellt wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung von relativen Mengen an Anti-CTB-IgA und -IgG in Kolostrum von immunisierten Kühen, die als der Standard verwendet wurden.
2 ist eine graphische Darstellung von relativen Mengen an Anti-CD-IgA und -IgG in Kolostrum von immunisierten Kühen, die als der Standard verwendet wurden.
3 ist eine graphische Darstellung von Anti-CTB-IgA-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung verschiedener bekannter Immunisierungsverfahren.
4 ist eine graphische Darstellung von Anti-CTB-IgG-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung verschiedener bekannter Immunisierungsverfahren.
5 ist eine graphische Darstellung von Anti-CTB-IgA-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung erfindungsgemäßer Immunisierungsverfahren.
6 ist eine graphische Darstellung von Anti-CTB-IgG-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung erfindungsgemäßer Immunisierungsverfahren.
7 ist eine graphische Darstellung von Anti-CD-IgG-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung erfindungsgemäßer Immunisierungsverfahren.
8 ist eine graphische Darstellung von Anti-CD-IgA-Antworten (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in der Milch von Kühen nach einer Anwendung erfindungsgemäßer Immunisierungsverfahren.
9 ist eine graphische Darstellung der relativen Anti-CD-IgG-Empfindlichkeit in Milch nach verschiedenen Immunisierungswegen.
10 ist eine graphische Darstellung der relativen Anti-CD-IgA-Empfindlichkeit in Milch nach verschiedenen Immunisierungswegen.
11 ist eine graphische Darstellung einer Anti-CD-IgA-Antwort (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in Milch von Kühen als das Ergebnis eines Boostens über die LMF- zusammen mit den IMA-Wegen.
12 ist eine graphische Darstellung einer Anti-CD-IgG-Antwort (gegenüber 1000 Einheiten/ml des Standards) in Milch von Kühen als das Ergebnis eines Boostens über die LMF- zusammen mit den IMA-Wegen.
13 ist eine graphische Darstellung von relativen Mengen von Gesamt-Igs in der Milch von immunisierten Kühen im Vergleich zu denjenigen von nicht immunisierten Kühen.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Brustsekretionsprodukts, das einen für ein Antigen spezifischen Antikörper umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Hyperimmunisieren eines Nutztiers hinsichtlich des Antigens, wobei das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens über einen intramukosalen Weg umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Luftweg des Nutztiers, intravaginal, intrarektal und intranasal, (b) Verabreichen des Antigens an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust des Nutztiers und (c) Gewinnen des Brustsekretionsprodukts von dem Nutztier.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Brustsekretionsprodukt Milch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ein IgA-Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das ferner ein Boosten einer Immunantwort auf das Antigen in dem Nutztier umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Boost-Schritt ein Verabreichen des Antigens an einen Luftweg, eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust des Nutztiers umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Antigen dadurch verabreicht wird, dass eine Nukleinsäure, die für das Antigen oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert, verabreicht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nutztier ein Rind oder eine Ziege ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Hyperimmunisierungsschritt ferner ein Verabreichen eines Adjuvanz an das Nutztier umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Adjuvanz Toxin B von Clostridium difficile ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein zweiter Hyperimmunisierungsschritt erfolgt, nachdem das Antigen an die Brustdrüse und/oder den Lymphknoten über der Brust des Nutztiers verabreicht wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Antigen von einer Kultur von Clostridium difficile abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Antigen eine Spore von Clostridium difficile ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Antigen Toxin A, Toxin B von Clostridium difficile oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren zum Herstellen einer Antikörper-Zusammensetzung, die einen für ein Antigen spezifischen Antikörper umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Herstellen eines Brustsekretionsprodukts, das den für ein Antigen spezifischen Antikörper umfasst, in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, und b) Ableiten der Antikörper-Zusammensetzung aus dem Brustsekretionsprodukt.
Verfahren zum Herstellen eines Antigen-spezifischen Antikörpers, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Herstellen eines Brustsekretionsprodukts, das den für ein Antigen spezifischen Antikörper umfasst, in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, und b) Aufreinigen des Antigen-spezifischen Antikörpers aus dem Brustsekretionsprodukt.
Reife Milch, die aus einem Nutztier erhältlich ist, das hinsichtlich eines Antigens hyperimmunisiert wurde, wobei das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens über einen intramukosalen Weg umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Luftweg des Nutztiers, intravaginal, intrarektal und intranasal, und wobei dem Tier das Antigen an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust des Tiers verabreicht wurde, wobei die Milch dadurch charakterisiert ist, dass sie einen für das Antigen spezifischen IgA-Antikörper in einer Menge von mindestens 200% der durchschnittlichen Menge des für das Antigen spezifischen IgA-Antikörpers umfasst, erhältlich aus Vormilch von verschiedenen nicht ausgewählten Nutztieren, die gegen das Antigen immunisiert wurden.
Reife Milch, die aus einem Nutztier erhältlich ist, das hinsichtlich eines Antigens hyperimmunisiert wurde, wobei das Hyperimmunisieren ein Verabreichen des Antigens über einen intramukosalen Weg umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Luftweg des Nutztiers, intravaginal, intrarektal und intranasal, und wobei dem Tier das Antigen an eine Brustdrüse und/oder einen Lymphknoten über der Brust des Tieres verabreicht wurde, wobei die Milch dadurch charakterisiert ist, dass sie mindestens 15 μg/ml an für das Antigen spezifischem, polyklonalem Antikörper umfasst.
Reife Milch gemäß Anspruch 17, wobei der für das Antigen spezifische Antikörper aus IgA besteht.