DE60025522T2

DE60025522T2 - Mycoplasma mycoides subsp. mycoides sc antigenisches lppq protein, seine herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60025522T2
Application number: DE60025522T
Authority: DE
Inventors: Joachim Frey; Jacques Nicolet; El-Mostafa Abdo
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2020-11-25
Also published as: DE60025522D1; EP1240328A1; AU1524001A; EP1240328B1; WO2001040471A1; ES2256062T3; ATE315649T1; AU777145B2; JP2003515340A

Description

Die vorliegende Erfindung liegt im wesentlichen auf dem Feld der Veterinärmedizin und der Viehtierzucht. Insbesondere betrifft die Erfindung das Protein LppQ von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC und DNS, die das besagte Protein kodiert. Die Erfindung betrifft die serologische Erfassung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen, den äthiologischen Agens der ansteckenden Rinderlungenseuche (CBPP für „contagious bovine pleuropneumonia") und das Design von irgendeiner Art Impfstoff, insbesondere von Markierungsimpfstoffen für die Unterscheidung von infizierten Tieren gegenüber geimpften Tieren. Das spezielle Lipoportein LppQ und ganz insbesondere sein N-terminaler antigener Teil wird als rekombinantes Peptid exprimiert, welches als spezifisches Antigen für die Sero-Detektion von CBPP eingesetzt wird.
Die ansteckende Rinderlungenseuche (CBPP), die durch Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC bewirkt wird, ist eine schwere Krankheit, die Rinder als auch Büffel befällt. CBPP führt zu grossen ökonomischen Verlusten in endemischen Regionen und wird von dem Office International des Epiozooties (OIE) als eine Krankheit der Liste "A" aufgeführt, welche die am meisten gefährlichen und ansteckenden Tierkrankheiten beinhaltet; diese Krankheiten erfordern spezielle internationale Regelungen für ihre Ausrottung.
CBPP ist auf den meisten Kontinenten während des 19. Jahrhunderts ausradiert worden, blieb aber in Afrika endemisch. Trotz strikter sanitärer Kontrollmassnahmen ist sie in Europa seit 1980 wieder auf dem Vormarsch und führt somit zu einer schweren Bedrohung für die Tiergesundheit und die Zuchtproduktion (ter Laak, 1992; Nicholas und Bashiruddin, 1995; Provost et al., 1987; Egwu et al., 1996).
Die Serodiagnose ist das wesentlichste Tool zur Kontrolle von CBPP. Einige serologische Tests sind während den letzten fünfzig Jahren beschrieben worden wie Agglutination, die Komplementfixierung (CF) (Campbell und Turner, 1953), die Agargelausfällung (Gourlay und Shifrine, 1965), der enzymverbundene Immunosorbant-Assay, die passive Haemagglutination, das Western-Blot und das Dot-Blot (Nicholas et al., 1996). Die komplementäre Fixierung (CF) ist als Test der am weitest verbreitetste und benutzte serologische Diagnosetest (Nicholas et al., 1996) und wird als spezifisch und empfindlich in der akuten Phase der Krankheit angesehen. Dennoch wird für den CF-Test angegeben, dass in nur 70% der Fälle die chronisch infizierten Tiere erfasst werden und dass er nicht fähig ist, asymptomatische Tiere in dem frühen Zustand der Krankheit festzustellen (Provost et al., 1987). Zusätzlich sind Probleme mit der Spezifizität des CF-Test festgestellt worden; eine kürzliche Analyse von Proben bei der Überwachung von Rindern in einem Bereich ohne CBPP hat eine signifikante Anzahl von falschen positiven Ergebnissen gezeigt (Stark et al., 1995b; Stark et al., 1995a). Kürzlich ist ein kompetitiver ELISA für die Serodiagnose von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen entwickelt worden, basierend auf einem monoklonalen Antikörper, welcher eine spezifische Epitope eines 80 kDa Antigens der Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC erfasst (Le und Thiaucourt, 1998). Ansonsten besteht kein spezifisches Antigen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC und kein einfacher Test, wie ein nicht kompetitiver indirekter Festphasen ELISA (Festhalten von Antikörpern) für die Sero-Detektion von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen. Für in direkte ELISAs ist die Qualität der Antigenherstellung entscheidend für die Spezifizität und die Empfindlichkeit des Tests. Gesamtzell-Antigene oder Extrakte von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC enthalten viele Antigene, die mit verwandten Mycoplasmen reagieren und nicht eingesetzt werden können. Ein Teil der vorliegenden Erfindung umfasst den Einsatz eines einzelnen spezifischen Lipoproteins von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC als Antigen für serologische Tests.
Impfstoffe sind bis heute auf attenuierten Stämmen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC basiert gewesen und sind als Lebendimpfstoffe eingesetzt worden. Diese Impfstoffe gestatten jedoch nicht die Unterscheidung von geimpften Rindern von infizierten Rindern, was ein grosses Problem in Kontroll- und Ausrottungsprogrammen ist, bei denen Impfstoffe eingesetzt werden.
Kürzlich hat Abdo et al. (1998) den Weg der Immunreaktionen von Vielfachantigenen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC bei der Bronchienspülung und im Serum von Rindern, welche für experimentelle Zwecke mit dem afrikanischen Stamm Afadé (hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP40JG.UK, Hinterlegungsnummer 99081024) und mit dem europäischen Stamm L2 infiziert worden sind, unter Einsatz von Western-Blots und Komplementfixierung (CF) analysiert. Einige gemeinsame dominante immunogene Antigene mit den Molekularmassen 110, 95, 85, 80, 72, 62, 48 und 39 kDa sind identifiziert worden. Da eine Vielzahl von Stämmen von Mycoplasmen bekannt sind, die sehr nahe mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC verwandt sind, ist es fraglich, ob jegliche der identifizierten immunogenen Antigene spezifisch für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC gewesen sind. Es ist nun in überraschender Weise gefunden worden, dass das 48 kDa Protein, welches oben angeführt worden ist, die Spezifizität für Mycoplasma mycoides subsp. my coides SC hat, was es dem Fachmann erlaubt, die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung wie unten beschrieben zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung ist die Entdeckung eines Lipoproteinantigens mit dem Namen LppQ, welches für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC spezifisch ist, und sein Einsatz oder die Verwendung eines Teils dieses Proteins, insbesondere die N-terminale Hälfte des Peptids, als ein spezifisches Antigen für die Sero-Detektion von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen durch Einsatz des Peptids beispielsweise als spezifisches Antigen in nicht kompetitiver indirekter Festphasen ELISA oder jeglichem anderen serologischen Testverfahren. Die Erfindung umfasst die Gensequenz von lppQ für die Expression von Antigenen oder für die Verwendung in der genetischen Identifikation oder Erfassung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC oder für das Design und die Herstellung von jeglicher Art von Impfstoff gegen Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC. Dies umfasst sowohl das Design von Markierungsimpfstoffen durch die Herstellung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Stämmen, denen die LppQ Biosynthese fehlt, die Formulierung von Impfstoffen, die LppQ als eine Komponente benutzen, als auch von Impfstoffverfahren, die die Gensequenz von lppQ (beispielsweise DNS-Impfstoffe) einsetzen.
Die vorliegende Erfindung liefert ein spezifisches Protein der Membran von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC und sein entsprechendes Gen und Gensequenzdaten für die spezifische Sero-Erfassung von Tieren, die mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC infiziert worden sind. Das Protein, mit dem Namen LppQ, ist ein Lipoprotein von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC. Sein entsprechendes Gen lppQ ist aus dem Stamm Afadé aus Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC geklont worden.
Die Gensequenz von lppQ und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins LppQ ist in Tabelle 5 dargestellt.
Das Gen lppQ ist in getesteter Weise sowohl im Typstamm PG1 als auch in allen europäischen und afrikanischen Feldisolierungen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, bestimmt durch PCR, vorhanden (siehe Tabelle 1).
Um lppQ in rekombinanten E.coli Stämmen und anderen Genexprimierungssystemen zu exprimieren, ist die Gensequenz mutiert worden, um UGA in UGG_trp zu wechseln. Insgesamt sind 9 UGA Kodone in UGG_trp durch Punktmutagenese gewechselt worden. Drei synthetische Gene sind hergestellt worden:

– lppQ* kodiert das gesamte lppQ Gen, aber umfasst den universalen genetischen Code, der durch E.coli und andere Hosts für die Genexprimierung gelesen werden kann (Tabelle 6). Das Plasmid, welches das lppQ* Gen enthält, ist pJFFmaLP48-MuHis1 (hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP40JG.UK, Hinterlegungsnummer: 99081025).
– lppQ*N' kodiert den N-terminalen antigene Teil von LppQ, LppQN'. Das lppQ*N' enthält den universalen genetischen Code (Tabelle 8). Das Plasmid, welches das lppQ*N' Gen enthält, ist pJFFLP48-11.
– lppQ*C' kodiert den C'-terminalen Teil von LppQ, LppQC'. Das lppQ*C' enthält den universalen genetischen Code (Tabelle 10). Das Plasmid, welches lppQ*C' enthält, ist pJFFmaLppQ-Cterm.

Die Exprimierung der drei synthetischen Gene, die auf den Plasmiden vorhanden sind, die oben beschrieben worden sind, ist durch Einsatz des Expressionsvektors pETHIS-1 erreicht worden. Die Gensequenz des Plasmids pETHIS-1 ist in der Genbank/EMBL unter der Zugangsnummer AF012911 zu finden. Das Plasmid pETHIS1 ist konstruiert worden, um die Exprimierung von Fusionsproteine mit einem N-terminalen Histidin-Hexamer und/oder einem C-terminalen Histidin-Dekamer in spezialisierten Escherichia coli-Hostzellen zu gestatten, die induzierbare T₇-RNS-Polymerase-Gene enthält, wie beispielsweise E.coli Stamm BL21 (DE3) (F-, ompT, r-(B), m-(B), lambda DE3, i21, lacI, lacUV5lacZ, T₇-RNA-pol. (lysogenic), int). Die mit Polyhistadin beendeten LppQ-His-Peptide sind durch Ni-Chelation-Chromatographie gereinigt worden.
Der N-terminale Anteil von LppQ ist der antigene Teil dieses Lipoproteins. Dies wird durch ein Immunoblot Experiment gezeigt, von dem die Ergebnisse in der Tabelle 12 dargestellt sind. Kaninchen-Antiserum, welches gegen die voll rekombinante LppQ-His gerichtet ist, erkannte sowohl das rekombinante N-terminale LppQN'-His und das rekombinante C-terminle LppQC'-His als auch das volle LppQ-His Protein (Tabelle 12, Panel 1). Serum von einer Kuh, die mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC von einem CBPP-Ausbruch in Italien im Jahre 1992 infiziert worden war, reagierte in starker weise mit dem rekombinanten N-terminalen Peptid des Proteins, LppQN'-His, und mit dem vollen LppQ-His, aber nicht mit dem C-terminalen Teil LppQC'-His (Tabelle 12, Panel 2). Dieselbe Bebachtung wurde mit Serum von einer experimentellen Infektion gemacht. Serum von der frühen Phase (Tabelle 12, Panel 4) und von der späten Phase der Infektion zeigten starke Reaktionen auf LppQN' (Tabelle 12, Panel 5). Keine Reaktion ist in dem Kontrollserum gefunden worden, das von dem Tier vor der Infektion genommen worden ist (Tabelle 12, Panel 3).
LppQ und insbesondere der N-terminale Teil des Proteins LppQN' ist ein früher und persistenter antigener Marker von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen. Dies wird gezeigt durch Immunoblot Experimente mit Seren von kontrollierten experimentellen Infektionen von Rindern mit zwei unterschiedlichen Stämmen von Mycoplasma mycoides subsp, mycoides SC, einem afrikanischen Stamm Afadé und einem europäischen Stamm L2 (Abdo et al., 1998). Die Seren von durch einen experimentellen Kontakt infizierten Tiere zeigten eine frühe, starke und persistente Antwort auf LppQN'-His (Tabelle 13). Repräsentative Seren von einer Kuh, die mit dem europäischen Stamm L2 infiziert worden war, zeigten klare Signale auf Immunoblots, die LppQN'-His enthielten, startend vom Tag 92 nach der Kontaktinfektion, gleichzeitig mit dem ersten positiven Titer auf dem Standard CF-Test und anhaltend bis Tag 224 nach der Kontaktinfektion (Tabelle 13, Teil A), wenn der Titer des Standard CF-Tests bereits für mehr als zwei Monate unterhalb des Erfassungslimits gewesen ist (Abdo et al., 1998). Repräsentative Seren von einer Kuh, die mit dem afrikanischen Stamm Afadé infiziert worden war, zeigte ein starkes Signal am Tag 28 nach der Kontaktinfektion, gleichzeitig mit dem ersten klaren positiven CF-Titer und verbleibend bis zum Tag 134 nach der Kontaktinfektion (Tabelle 13, Teil B), wenn der Titer des Standard CF-Tests für drei Wochen unterhalb des Erfassungslimits gewesen ist (Abdo et al., 1998).
Der N-terminale Teil von LppQ (LppQN') ist ein spezifisches Antigen von Mycoplasma mycoides subsp, mycoides SC. Serum von einem Kaninchen, das mit gesamten Zellen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC des Typs des Stammes PG1 immunisiert worden war, reagierte in starker Weise mit LppQN' auf Immunoblots, während Seren von Kaninchen, die mit gesamten Zellen von darauf bezogenen Mycoplasmen von Mycoplasma mycoides Clustern oder Mycoplasma putrefaciens immunisiert worden waren, keine Reaktion mit LppQN'-His unter den selben Bedingungen zeigten. Zusätzlich zeigten Seren von Schweizer Rindern, die für Mycoplasma bovis positiv gewesen sind, die aber frei von CBPP gewesen sind, keine Reaktion mit LppQN'-His (Tabelle 14).
Der N-terminale Teil von LppQ (LppQN'-His) wird in grossen Mengen Aus dem Plasmid pJFFLP48-11 erzeugt, welches in E. coli Stämmen JF1979 [BL21(DE3)(F-, ompT, r-(B), m-(B), lambda DE3, i21, lacI, lacUV5lacZ, T₇-RNS-pol. (lysogenic), int^–)/pJFFLP48-11 Ap^R] beherbergt gewesen ist. LppQN'-His wird direkt aus Guanidium-Hydrochlorid solubilisierten Zellen durch Ni-Chelat-Chromatographie gereinigt. Eine 50 ml Kultur des Stammes JF1979 ergab 2 mg an gereinigtem LppQN'-His-Protein. Andere Exprimierungssysteme können für die Herstellung von LppQN' Peptiden oder Derivaten davon eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von serologischen Test-Kits wie Immunoblots oder nicht-kompetitive indirekte Festphasen-ELISA oder jegliche andere Antikörper-Detektionsverfahren für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen, die nützlich sind beim Screenen von Tieren für CBPP und für Träger von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.
"Immunologische Erfassungssysteme" bezieht sich auf Verfahren, um Antikörper festzustellen, die gegen spezifische Komponenten von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC in Seren von Tieren gerichtet sind, wie Immunoblots (siehe Tabelle 12) und ELISA (siehe Tabelle 2). Diese Verfahren werden für die Sero-Diagnose von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen eingesetzt werden. Beispiele für einen ELISA-Test unter Einsatz von LppQN'-His-beschichteten Mikrotiter-Platten wird in Tabelle 2 gegeben. ELISA, basierend auf LppQN'-His-beschichteten Mikrotiter-Platten, war signifikant sensitiver als der CF-Test, insbesondere, wenn die Seren in der späten Phase nach der Infektion aufgenommen worden sind (siehe Ergebnisse Tabelle 2).
Das lppQ-Gen kann eingesetzt werden, um ein System für die genetische Erfassung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC herzustellen. Die Spezifizität des lppQ-Gens für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Sc wird in der Tabelle 1 angezeigt, welche zeigt, dass lppQ in allen Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC-Stämmen vorhanden war, die aus den verschiedenen Kontinenten und Ländern und zu verschiedenen Jahrzehnten isoliert worden sind. Das lppQ-Gen ist nicht in anderen Mycoplasmen gefunden worden, insbesondere nicht in phänotypisch und antigen nahe verwandten tierischen Mycoplasmen.
Um die Erfindung klarer zu erläutern, wird nun folgend eine Liste von einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung beschrieben. Die Liste beschränkt die Erfindung nicht exklusiv auf diese Ausführungsbeispiele.

A. Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Protein von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, welche die Aminosäuresequenz wie in der Tabelle 5 dargestellt zeigt (LppQ-Precursor, SEQ ID Nr. 25) oder Teile davon, wobei die Teile vorzugsweise durch die Aminosäurensequenzen charakterisiert sind, wie sie in der Tabelle 7 dargestellt sind (Reife LppQ, SEQ ID Nr. 27) oder in Tabelle 9 (LppQN', SEQ ID Nr. 29). Weiterhin sind Ausführungsbeispiele der Erfindung der LppQ-Precursor, das reife LppQ-Protein und die N-terminale Hälfte von LppQ (LppQN').
B. Ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Protein, welches unter dem obigen Buchstaben A beschrieben worden ist, wobei der Sequenz des Proteins 2 bis 12 Histidin-Residuen vorangehen oder folgen, vorzugsweise durch Vorangehen von 6 Histidin-Residuen oder durch Folgen von 10 Histidin-Residuen.
C. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Protein, wie es unter Buchstabe A beschrieben worden ist, welches ein Lipoprotein ist. Ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Protein, wie es unter Buchstabe A beschrieben worden ist, und welches ein Glycoprotein ist. Solch ein Glycoprotein kann aus einer DNS exprimiert werden, welche unter Buchstabe D in einer eukaryotischen Host-Zelle exprimiert worden ist.
D. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine DNS, die ein Protein kodiert, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, vorzugsweise durch eine DNS-Sequenz charakterisiert, wie sie in der Tabelle 5 dargestellt ist (lppQ Precursor-Gen, SEQ ID Nr. 24), Tabelle 6 (lppQ*, SEQ ID Nr. 26) oder Tabelle 8 (lppQ*N', SEQ ID Nr. 28). Die DNS kann genomische DNS, cDNS oder künstliche DNS sein.
E. Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins, wie es unter Buchstabe A, B oder C beschrieben worden ist, in einem Diagnoseverfahren für die direkte oder indirekte Erfassung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, vorzugsweise, wenn das Diagnoseverfahren ein immunologisches Verfahren ist und aus einer Gruppe umfassend Immunoblotting, serologische Tests und ELISA ausgewählt ist.
F. Ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, oder einer DNS, wie sie unter Buchstabe D beschrieben worden ist, für die Herstellung eines Impfstoffes gegen die Infektion von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC; der Impfstoff selbst; und die Verwendung einer DNS, wie sie unter Buchstabe D beschrieben worden ist, für die Herstellung von lebenden, attenuierten oder von inaktivierten Zellen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, welche als Marker- Impfstoff einzusetzen sind, wobei den besagten Zellen die Fähigkeit zur Synthetisierung des LppQ-Lipoproteins fehlt.
G. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine DNS, wie sie unter Buchstabe D beschrieben worden ist, in einem Erfassungsverfahren für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, vorzugsweise bei welchem das Erfassungsverfahren aus einer Gruppe ausgewählt ist, die PCR und Hybridisierungs-Verfahren umfasst.
H. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Verwendung einer DNS, wie sie unter Buchstabe D beschrieben worden ist, für die Exprimierung eines Proteins, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, einem Vektor, der diese DNS umfasst, und eine Host-Zelle, die den besagten Vektor oder die besagte DNS umfasst.
I. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Prozess für die Herstellung eines Proteins, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, bei welchen (a) ein Vektor, der die DNS umfasst, wie sie unter dem Buchstaben D beschrieben worden ist, in eine geeignete Host-Zelle eingeführt wird, (b) die Host-Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die die Exprimierung des besagten Proteins gestatten, und (c) das Protein des Schrittes (c) von den Host-Zellen oder dem Supernatanten isoliert werden.
J. Noch ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer DNS, die charakterisiert wird durch die DNS-Sequenz der Tabelle 5 (SEQ ID Nr. 25), wobei (a) eine DNS-Bibliothek der genomischen DNS von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC in einen geeigneten Phagen geklont wird, (b) der Phage aus Schritt (a) eingesetzt wird, um geeignete Host-Zellen zu infizieren, (c) die Host-Zellen mit Seren gescreent werden, die von einem Säugetier stammen, welches mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC infiziert worden ist, (d) positive Klone ausgewählt und gereinigt werden, und (e) die genomische DNS des Phagen aus Schritt (d) isoliert wird.
K. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer DNS, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die DNS-Sequenz der Tabelle 6 (lppQ*, SEQ ID Nr. 26) oder Tabelle 8 (lppQ*N', SEQ ID Nr. 28) vorliegt, wobei (a) eine DNS, die durch eine DNS-Seguenz nach der Tabelle 5 (SEQ ID Nr. 24) charakterisiert ist und geeignete Sätze von Primern gemäss Tabelle 3 (SEQ ID Nr. 1 bis 4 und 6 bis 21) in einer Überlappungs-Erstreckungs-PCR (OE-PCR) angewandt werden, welche in einem ersten PCR-Produkt resultieren, (b) das erste PCR-Produkt des OE-PCR des Schrittes (a) auf eine oder mehrere OE-PCRs angewandt wird, wie dies von der Anzahl der gewünschten Mutationen erforderlich ist, die in einem endgültigen PCR-Produkt vorliegen sollen, und (c) das finale PCR-Produkt isoliert wird.
L. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erfassung von Antikörpern, die auf ein Protein ausgerichtet sind, welches unter einem der Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, in einer Körperflüssigkeit von einem Tier, wobei (a) ein Protein gemäss einem der Buchstaben A, B oder C auf einer geeigneten Membrane geblottet wird, (b) die Membrane mit der besagten Körperflüssigkeit inku biert wird, (c) die Membrane mit einem markierten Konjugat inkubiert wird, und (d) eine Farbreaktion initiiert wird, um einen Komplex des Antikörpers des Konjugats und Antikörper von der Körperflüssigkeit festzustellen, die auf das Protein ausgerichtet sind, vorzugsweise, wenn die Körperflüssigkeit aus einer Gruppe ausgewählt wird, die Serum und Bronchialflüssigkeit umfasst, wobei die Membrane eine Nitro-Zellulose- oder Nylon-Membrane ist und das Konjugat mit Alkalin-Phosphatase markiert ist.
M. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erfassung von Antikörpern, die auf ein Protein ausgerichtet sind, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist, in einer Körperflüssigkeit eines Tieres, wobei (a) eine Mikrotiterplatte mit einem Protein beschichtet ist, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben ist, (b) die Mikrotiterplatte mit der besagten Körperflüssigkeit inkubiert ist, (c) die Mikrotiterplatte mit einem markierten Konjugat inkubiert ist, und (d) eine Farbreaktion initiiert wird, um einen Komplex des Antikörpers des Konjugats und Antikörper aus der Körperflüssigkeit, die auf das Protein gerichtet sind, zu erfassen, vorzugsweise, wenn die Körperflüssigkeit aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Serum und Bronchialflüssigkeit enthält, und das Konjugat mit Alkalin-Phosphatase markiert ist.
N. Weiterhin ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ein Verfahren zur Erfassung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, wobei (a) ein Paar von geeigneten PCR-Primern für die Erfassung einer DNS, wie sie in Tabelle 5 dargestellt ist (LppQ Precursor, SEQ ID Nr. 24), in einer PCR-Reaktion mit einer zu testenden Probe eingesetzt wird, und (b) nach der PCR das Vorhandensein des PCR-Produktes, welches erwartet wird, mit dem geeigneten Paar von PCR-Primern geprüft wird, wobei vorzugsweise das geeignete Paar von PCR-Primern aus einer Gruppe ausgewählt wird, die die Primer MMMSCO5-7 (SEQ ID Nr. 22) und MMMSCO5-6 (SEQ ID Nr. 23), wie in der Tabelle 3 gezeigt, umfasst.
O. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper, der für ein Protein gemäss einem der Buchstaben A, B oder C spezifisch ist.
P. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Diagnose-Kit, welches ein Protein nach einem der Buchstaben A, B oder C enthält und/oder mindestens einen Antikörper, wie er im Buchstaben O in einem geeigneten Container vorliegt.

Einige der oben beschriebenen Ausführungsbeispiele der Erfindung sind im folgenden in grösserem Detail beschrieben.
Die Erfindung umfasst auch LppQ-Fragmente und Varianten. Polypeptide, die als LppQ-Varianten qualifizieren, können gemäss der vorliegenden Erfindung durch konventionelle reverse genetische Techniken erzeugt werden, das heisst durch Bestimmen einer genetischen Sequenz basierend auf einer Aminosäuresequenz oder durch konventionelle genetische Splicing-Techniken. Beispielsweise können LppQ-Varianten durch Techniken erzeugt werden, die ortsgerichtete Mutagenese oder oligonukleotid-gerichtete Mutagenese umfassen. Siehe beispielsweise "Mutagenesis of Cloned DNA" in "Current Protocols in Molecular Biology 8.0.3 et seq. "von Ausubel et al., Herausgeber 1989 ("Ausubel").
Andere LppQ-Varianten gemäss der vorliegenden Erfindungen sind Moleküle, die einem Abschnitt von LppQ oder einem Fragment davon entsprechen, oder die ein Teil von LppQ umfassen aber nicht mit dem natürlichen Polypeptid übereinstimmen, wobei beide die immunogene Aktivität von LppQ darstellen, wenn sie alleine auftreten, oder alternativ, wenn sie mit einem Träger verbunden sind. Eine LppQ-Variante dieser Art und Weise könnte ein tatsächliches Fragment des natürlichen Moleküls darstellen oder könnte ein synthetisiertes Polypeptid de novo oder rekombinant sein.
Bei einem nochmals weiteren Ausführungsbeispiel werden Aminosäuresequenz-Varianten des Proteins hergestellt. Diese können beispielsweise kleinere Sequenzvarianten des Proteins sein, die aufgrund der natürlichen Variation der Population von Mikroorganismen auftreten, von denen das Protein identifiziert wird, oder sie können Homologe eines Proteins sein, welches in anderen Mikroorganismen gefunden wird. Sie können auch Sequenzen haben, die in dem Protein nicht natürlich auftreten, aber die in ausreichender Weise ähnlich sind, dass sie eine Immunantwort hervorrufen, wenn sie einem Host verabreicht werden. Sequenzvarianten können gemäss Standardverfahren von ortsgerichteter Mutagenese hergestellt werden.
Aminosäuresequenz-Varianten des Proteins können Varianten durch Substitution, Einfügen oder Löschung sein. Löschungsvarianten fehlen eine oder mehrere Residuen des ursprünglichen Proteins, die für die immunogene Aktivität nicht wesentlich sind. Ein anderer häufiger Typ der Löschungsvariante ist einer, bei der geheime Signalsequenzen oder Signalsequenzen, die auf ein Protein hinweisen, um an einen bestimmten Teil der Zelle anzubinden, fehlen.
Varianten durch Substitution enthalten üblicherweise den Austausch von einer Aminosäure für eine andere an einem oder mehreren Orten innerhalb des Proteins und sind so ausgeführt, um eine oder mehrere Eigenschaften des Proteins wie Stabilität gegen proteolytisches Schneiden zu modulieren. Ersetzungen sind Vorteilhafterweise konservativ, das heisst eine Aminosäure wird durch eine ähnlich geformte und Ladung aufweisende Aminosäure ersetzt. Konservative Ersetzungen sind im Stand der Technik wohl bekannt und umfassen beispielsweise den Wechsel von Alanin zu Serin; Arginin auf Lysin; Asparagin auf Glutamin oder Histidin; Aspertat auf Glutamat; Cystein zu Serin; Glutamin zu Asparigin; Glutamat zu Asparat; Glycin zu Prolin; Histidin zu Asparigin oder Glutamin; Isoleucin zu Leucin oder Valin; Leucin zu Valin oder Isoleucin; Phenylalanin zu Tyrosin, Leucin oder Methionin; Serin zu Threonin; Threonin zu Serin; Tryptophan zu Tyrosin; Tyrosin zu Tryptophan oder Phenylanalin; und Valin zu Isoleucin oder Leucin.
Die Einführungsvarianten umfassen Fusionsproteine, wie diejenigen, die eingesetzt werden, um eine schnelle Reinigung des Proteins zu gestatten. Andere Einführungsvarianten können solche umfassen, in denen zusätzliche Aminosäuren innerhalb der Kodiersequenz des Proteins eingefügt sind. Solche sind typischerweise kleinere Einfügungen als die Fusionsproteine, die oben beschrieben worden sind und eingeführt werden, beispielsweise um einen Protease-Schnittort zu aufzubrechen.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden hauptsächliche antigene Determinanten des Proteins durch einen empirischen Ansatz identifiziert, bei dem Teile des Gens, welches das Protein kodiert, in einem rekombinanten Host exprimiert werden; und die resultierenden Proteine für ihre Fähigkeit getestet werden, Host-Tiere vor einem Challenge zu schützen. Beispielsweise kann PCR eingesetzt werden, um einen Bereich an Proteinen herzustellen, welchen aufeinanderfolgend längere Fragmente des C-Endes des Proteins fehlen. Die Immunoaktivität von diesen Proteinen definiert dann die Fragmente oder Domänen des Proteins, welche für diese Aktivität wesentlich sind. Weitere Experimente, bei denen nur eine kleine Anzahl von Aminosäuren bei jeder Iteration entfernt werden, gestattet dann die Anordnung der Antigen-Determinanten des Proteins.
Ein anderes Ausführungsbeispiel der Herstellung der Proteine der Erfindung ist der Einsatz von Peptid-Mimetics. Mimetics sind Peptid enthaltende Moleküle, die wie Elemente von Sekundär-Protein-Strukturen und somit analog wirken. Siehe beispielsweise Johnson et al. (1993). Das hinter diesem Einsatz von Peptid-Mimetics stehende Prinzip ist, dass das Peptid-Rückgrat von Proteinen im Wesentlichen dazu dient, die Aminosäuren-Seitenketten in solche einer Weise auszurichten, um es für molekulare Interaktionen zu vereinfachen, wie solche von Antikörper und Antigen. Ein Peptid-mimetisches Protein der vorliegenden Erfindung würde, wenn einem Host verabreicht, eine Immunantwort hervorrufen, die zu der Erkennung des nativen Host-Zell-Proteins führen würde.
Lesezeichen bis hierher durch
Erfolgreiche Anwendungen von dem Peptid-Mimetic-Konzept sind soweit auf Mimetics von β-Runden mit Proteinen fokussiert, die als hoch antigen bekannt sind. Ähnliche β-Strukturen mit einem Protein der Erfindung können durch Computer basierte Algorhythmen wie oben beschrieben hervorgerechnet werden. Sobald die Komponenten Aminosäuren der Runde bestimmt sind, können Mimetics gebaut werden, um eine ähnliche räumliche Orientierung der wesentlichen Elemente der Aminosäure-Seitenketten zu erreichen, wie dies in Johnson et al., wie oben erwähnt schon diskutiert worden ist. Das Mimetic-Emblem kann dann zu einem Trägerprotein zum Einsatz in einem Impfstoff konjugiert werden.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird eine Computer-Sequenz-Analyse eingesetzt, um den Ort der vorhergesagten hauptsächlichen Antigenen bestimmenden Epitopen des rekombinanten Proteins zu bestimmen. Die Software die fähig ist, eine solche Analyse auszuführen ist bereits kommerziell erhältlich, bspw. von MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software benutzt üblicherweise Standard-Algorhythmen wie Kyte/Doolittle oder Hopp/Woods Verfahren zur Lokalisierung von hydrophilen Sequenzen, die charakteristischer Weise auf der Oberfläche der Proteine gefunden werden und dort daher als Antigene-Determinanten wirken. Sobald diese Analyse durchgeführt ist können die Polypeptide hergestellt werden, die mindestens die essentiellen Merkmale der Antigenen-Determinante enthalten und die in Impfstoffen eingesetzt werden können. Gene, die diese Determinanten kodieren, können konstruiert und in Eprimierungsvektoren eingefügt werden durch Standardmethoden, wie bspw. unter Einsatz der PCR-Klonierungs-Methodologie.
Als Alternative zu rekombinanten Polypeptiden, können synthetische Peptide, die zu den Antigenen-Determinanten gehören, hergestellt werden. Solche Peptide sind mindestens sechs Aminosäuren-Residuen lang und können bis zu ungefähr 35 Residuen enthalten, was das ungefähre obere Längenlimit von automatisierten Peptiden-Synthese-Maschinen ist, wie diejenigen, die von Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältlich sind. Der Einsatz von solchen kleinen Peptiden in Impfstoffen erfordert üblicherweise die Konjugation des Peptids mit einem immunogenen Trägerprotein wie dem Hepatitis B Oberflächenantigen. Verfahren zur Durchführung dieser Konjugation sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Die Erfindung betrifft auch ein Impfstoff. Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst der Impfstoff das Protein, wie es unter den Buchstaben A, B oder C beschrieben worden ist oder ein Fragment davon in Konjunktion mit einem Träger oder Hilfsmittel und wo geeignet, mit weiteren Hilfssubstanzen, zur Immunisierung von Rindern gegen Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.
Allgemeiner gesagt ist der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung für die Immunisierung eines dafür empfänglichen Säugetieres vorgesehen. Säugetiere, die für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC zusätzlich zu Rinderarten empfänglich sind, umfassen kleine und grössere Wiederkäuer.
Folgend der Reinigung bis zu einem akzeptablem Grad (was allgemein grösser als 50% des gesamten Peptids oder Proteins bedeutet) kann das Antigen dank Tieren in Gestalt eines Impfstoffes verabreicht werden. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die zu immunisierenden Tiere Rinder. Wenn geeignet können ganze Zellen in den Impfstoffen verwendet werden. Bspw. können Sf9-Zellen oder CHO-Zellen, die das rekombinante Antigen exprimieren, direkt eingesetzt werden, in lebender oder getöteter Form, um das Antigen den Host-Tieren zu verabreichen. Alternativ können Lebend-Viren, die die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die die Antigene der Erfindung kodieren, in Impfstoffen verwendet werden.
Die Impfstoffe können jegliche Anzahl von unterschiedlichen Substanzen umfassen, die als Hilfsstoffe bezeichnet werden, die dafür bekannt sind, den geeigneten Anteil des Immunsystems des geimpften Tieres zu stimulieren. Geeignete Hilfsstoffe für die Impfung von Tieren umfassen, aber sind nicht begrenzt auf Öl-Emulsionen wie der Freund'sche vollständige oder unvollständige Impfstoff (nicht geeignet für Lebendvieh), Marcol 52: Mantanide 888 (Marcol ist eine Handelsmarke von Esso, Montanide ist eine Handelsmarke von SEPPIC, Paris), SQUALAN oder SQUALEN, Adjuvant 65 (welcher Erdnussöl, MANNID-MONOOLEAT und Aluminium-Monostearat umfasst) Mineralgele wie Aluminium-Hydroxid, Aluminium-Phosphat, Calcium-Phosphat und Alum, Oberflächenbildner wie Hexadecylamin, Octadeclyamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N,N'-bis(2-Hydroxyethyl)-Propanediamin, Methoxyhexadecylglycerol und pluronische Polyole, Polyanione wie Pyran, Dextran-Sulfat, Polyacryl-Säure und Carbopol, Peptide und Aminosäuren wie Muramyl-Dipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin und Trehalose-Dimycolat.
Die Antigene, die Exprimierungs-Produkte und/oder die synthetischen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch nach Einsatz in Liposome oder anderen Mikroträger verabreicht werden, oder nach Konjugation mit Polysacchariden, Proteinen oder Polymeren oder in Kombination mit Quil-A, um "Isocoms" zu bilden (Immunostimulierende Komplexe).
Verabreichungswege, zu verabreichende Dosen und die Häufigkeit von Injektionen sind alles Faktoren, die optimiert werden können unter Einsatz der bekannten Techniken. Typischerweise folgt der ursprünglichen Impfung einige Wochen später eine oder mehrere sogenannte "Booster-Impfungen", wobei der Gesamteffekt eine vigorouse zelluläre und humorale Immunantwort ist.
Das Verfahren der Immunisierung eines Säugetieres gegen CBPP umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge des vorgenannten Immunogens. Die Verabreichung kann jegliches Verfahren einsetzen, welches beim Stand der Technik wohl bekannt ist. Jede Immunisierungsroute, die betrachtet werden kann, oder die gezeigt hat, dass sie eine geeignete Immunantwort erzeugt, kann einge setzt werden, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, obwohl die subcutane Verabreichung bevorzugt wird. Geeignete Verabreichungsformen umfassen die parenterale, die intrakutanöse oder die intramuskuläre Injektion oder Präparationen, die geeignet sind für die orale, nasale oder rektale Verabreichung.
Die hier in Rede stehende Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper und Antiseren zu natürlichem LppQ, LppQ-Fragmenten, rekombinanter LppQ oder LppQ-Varianten. Solche Antikörper und Antiseren werden gemäss üblichen Impfregime im geeigneten Hosts aufgezogen. Der Host wird mit mindestens einem Antigen oder Impfstoff der vorliegenden Erfindung geimpft, mit oder ohne Hilfsmittel, um eine Immunantwort zu erzeugen. Die Immunantwort kann überwacht werden, bspw. durch Messung der Niveaus der erzeugten Antikörper, unter Einsatz von Standard ELISA-Verfahren.
Bei einem bevorzugtem Ausführungsbeispiel wird die Herstellung von Polyklonalen-Antiseren durchgeführt unter Einsatz von Rind als Host-Tieren. Der Host wird auf einer wiederkehrenden Basis Blut abgenommen und die Antikörper-Fraktion wird aus dem Blut durch Standardverfahren, bspw. durch Protein A oder Protein G Chromatographie gereinigt. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel ist der Host eine Maus, und Monoklonale Antikörper herstellende Hybridomae werden durch Standardmittel hergestellt. Siehe hierfür "Current Protocols in Immunology", von Coligan et al., (1991), Kapitel 2.5. Monoklonale Antikörper werden dann aus dem Hybridomae-Zellen durch Standardverfahren hergestellt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Diagnose-Kit, welches das Protein gemäss den Buchstaben A, B oder C enthält und vorzugsweise mindestens einen der Antikörper, wie er oben beschrieben worden ist, in geeigneten Behältern.
Die Diagnose-Kits zur Feststellung von M. mycoides subsp. mycoides SC-Infektionen werden hergestellt durch Lieferung von mindestens einem der entsprechenden obigen Angaben hergestellten Antikörpern, zusammen mit einem positiven Kontrollstandard einer bekannten Konzentration des Antikörper der vorliegenden Erfindung. Bei einem Ausführungsbeispiel ist die Antigen-positive Kontrolle rekombinantes LppQ oder LppQN'. Das Kitformat entspricht Standard-Diagnoseformaten wie dem ELISA-Format.
Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun im grösseren Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Beispiel 1: Identifikation von LppQ
Um die humorale und bronchiale Immunantworten in Rinder zu untersuchen, die mit M. mycoides subsp. mycoides SC infiziert sind, sind aufeinander folgend gesammelte Seren und bronchiale Auswürfe von Rindern, die in experimenteller Weise mit dem afrikanischen Stamm Afadé oder dem europäischen Stamm L2 infiziert worden sind, durch Immunoblotting analysiert worden (Abdo et al., 1998). Einige gemeinsame dominante immunogene Antigene mit dem Molekularmassen 110, 95, 85, 80, 72, 62, 48 und 39 kDa sind identifiziert worden. Die Studien zeigten – unter anderen Immunreaktionen – eine frühe und weiter bestehende Immunreaktion auf ein Protein von 48 kDa in sowohl den Seren als auch den bronchialen Waschungen von Rindern, die mit entweder dem Stamm Afadé, dem Referenzstamm für den afrikanischen Klaster von M. mycoides subsp. mycoides SC (Cheng et al., 1995) oder dem Stamm L2, dem Referenzstamm für den europäischen Klaster (Cheng et al., 1995) infiziert worden sind. Jetzt ist gezeigt worden durch Immunoblot-Analyse von Antigenen von den Mycoplasmen, die genetisch und antigenetisch am meisten mit M. mycoides subsp. mycoides SC verwandt sind unter Einsatz der selben Seren, dass das 48 kDa für die Art M. mycoides subsp. mycoides SC (Tabelle 1) spezifisch war. Das 48 kDa Antigen ist daher als Kandidat für ein spezifisches, predominantes und persistentes Antigen für die vorliegende Entwicklung der Sero-Detektion von der ansteckenden Rinder-Pleuropneumonie (CBPP) und/oder für die Entwicklung von Komponenten von Impfstoffen gegen CBPP eingesetzt worden.
Beispiel 2: Identifizierung und Klonierung der lppQ-Gens
Das Gen lppQ, welches das Lipoprotein LppQ kodiert, ist durch Konstruktion einer Gen-Bibliothek geklont worden, welche mit Sau3Al aufgeschlossener genomischer DNS von M. mycoides subsp. mycoides SC gemacht worden ist, welches in einem λZAP-Express^TM-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA, USA) geklont worden ist, gefolgt durch die in vitro Verpackung und Infizierung von kompatibler E. coli-Stämme mit den rekombinanten Phagen unter Einsatz des "Gigapack gold"-Packaging-Kits (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Die Phagen-Plaques sind mit Seren von Rindern gescreend worden, die in experimenteller Weise mit M. mycoides subsp. mycoides SC des Stammes Afadé (Abdo et al., 1998) infiziert worden sind, unter Einsatz einer Standard-Prozedur für das screenen von Gen-Bibliotheken (Ausbel et al., 1990). Einige Phagen-Klone sind in Phagmid-Klone transformiert worden unter Einsatz des f1 Helper-Phages gemäss dem Protokoll des Herstellers des λZAP-Express^TM (Stratagene). Die DNS-Sequenzen von verschiedenen Klonen sind bestimmt worden unter Einsatz eines ABI-Prism model 310 genetic analyser (Applied Biosystems/Perkin-Emler Cetus, Norwalk, Connecticat, USA) und der DNS-Sequenzen assembly software Sequencher 3.0 (GeneCode, Ann Arbor, MI, USA), um die benachbarten Sequenzen zu erhalten. Ein Klon, Plasmid pJFFma5 zeigte ein ORF, welches ein charakteristisches Lipoprotein von 48 kDa kodierte, wie es durch die beschriebenen Parameter bestimmt worden ist (Hayashi, 1990). Das Gen kodierende 48 kDa Lipoprotein wurde als lppQ (Tabelle 5) bezeichnet.
Beispiel 3: Mutagenese der 9 Kodone in dem lppQ-Gen
Um Mycoplasma spezifische UGA_trp-Kodone zu den universellen UGG_trp-Kodonen auszutauschen, ist ortsdirekte Mutagenese des lppQ-Gens durch das Verfahren durchgeführt worden, welches von Urban et al. (1997) beschieben worden ist, unter Einsatz von Oligonukleotid-Primern, die in Tabelle 3 aufgeführt worden sind und die klonierten lppQ-Gene auf Plasmid pJFFma5 als ein Template. Das mutagenisierte Gen mit den UGG_trp-Kodonen wird als lppQ* bezeichnet (Tabelle 6).
Beispiel 4: Herstellung der Plasmide, die Poly-Histidin beendete LppQ-Peptide exprimieren
Das Plasmid pJFFmaLP48-MuHis1 eprimierende Poly-Histidin beendete lppQ (bezeichnet als LppQ-His) ist wie folgt hergestellt worden. Das mutagenisierte lppQ*-Gen (Tabelle 6), wie es oben beschieben worden ist, ist als ein Template für die PCR-Verstärkung unter Einsatz von Oligonukleotid-Primern P48EcoR1 und P48B7r (Tabelle 3) und Pwo-Polymerase erhalten worden. Das verstärkte Gen ist dem Restriktionsenzym-Aufschluss unter Einsatz von EcoR1 und BamH1 unterworfen worden und nachfolgend zu den entsprechenden aufgeschlossenen Klonierungs/Exprimierungs-Vektor pETHIS-1 legiert worden. Das Plasmid pJFFLP48-11 exprimierende Poly-Histidin beendete N'-Endhälfte von LppQ, mit dem Namen LppQN'-His ist wie folgt hergestellt worden Das mutagenisierte lppQ*-Gen (Tabelle 6), welches wie oben beschieben erhalten worden ist, ist als Template für die PCR-Verstärkung unter Einsatz der Oligonukleotid-Primern MMMLP481 und MMMLP484 (Tabelle 3) und Pwo-Polymerase eingesetzt worden. Das verstärkte Gen- Fragment lppQ*N' (Tabelle 8) ist mit Restriktionsenzymen Nde1 und BamH1 aufgeschlossen und nachfolgend an die entsprechenden Klonierungsorte des Exprimierungs-Vektors pETHIS-1 legiert worden.
Plasmid pJFFmaLppQ-Cterm exprimierendes Poly-Histidin beendete C-Endhälfte von LppQ, mit dem Namen LppQC'-His, ist wie folgt hergestellt worden: Das mutagenisierte lppQ*-Gen (Tabelle 6); welches wie oben beschrieben erhalten worden ist, ist als Template für die PCR-Verstärkung unter Einsatz der Oligonukleotid-Primern P48B1f und P48B7r (Tabelle 3) und Pwo-Polymerase eingesetzt worden. Das verstärkte Gen, welches mit lppQ*C' (Tabelle 10) benannt worden ist, ist dem Restriktionsenzym-Aufschluss unter Einsatz von EcoR1 und BamH1 unterworfen worden und nachfolgend an den entsprechenden Klonierungsorten von EcoR1 und BamH1 aufgeschlossenem Exprimierungs-Vektor pETHIS-1 legiert worden.
Beispiel 5: Exprimierung der Poly-Histidin markierten Proteine in spezialisierten E. coli
Für die Exprimierung der drei Poly-Histidin beendeten LppQ-Peptide ist der E. coli-Stamm BL21 (DE3) (Stratagene) mit Plasmiden pJFFmaLP48-MuHis1, pJFFLP48-11 oder pJFFmaLppQ-Cterm (Tabelle 4) transformiert worden. Die Exprimierung und die nachfolgende Reinigung der Poly-Histidin beendeten Peptide ist nach Induktion von Zellkulturen bei mittel exponentieller Wachstumsphase mit IPTG und Reinigung unter Einsatz von Ni²⁺-Chelationschromatographie erhalten worden, wie dies im Detail durch Braun et al. (1999) beschrieben worden ist.
Beispiel 6: Protokolle der Immunoblots
Immunoblots sind wie beschrieben von Ausubel et al. (1990) durchgeführt worden. Serum oder bronchiale Waschungsflüssigkeit sind aus der experimentellen Infizierung wie oben beschrieben (Abdo et al., 1998) eingesetzt worden. Gereinigte rekombinante Proteine (200 μg/ml) sind mit einem gleichen Volumen von SDS Sample-Buffer (0.06 M Tris HCl pH-Wert 6,8, 2% SDS, 10% Glycerol, 2% p-Mercaptoethanol, 0,025% Bromphenol blau) gemischt und für 5 Minuten gekocht worden. Die Antigene sind durch SDS-PAGE-Polyacrylamid-Gele getrennt worden unter Einsatz von 5–15% Gradienten Polyacrylamid-Gelen, und dann auf eine Nitro-Zellulose Membrane mit Porengrösse von 0,2 μm (Bio-Rad) geblottet worden. Die Membrane ist dann mit Milch-Buffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, getrocknet und Streifen geschnitten worden. Die Streifen sind mit Serenproben für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert worden und 3 mal mit TBS (100 mM Tris HCl pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl) für 5 Minuten gewaschen worden. Die Streifen sind dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalin-Phosphatase markierten Konjugaten inkubiert worden, die in Milch-Buffer verdünnt worden sind. Die eingesetzten Konjugate waren a) Monoklonaler-Antikörper (Mab) anti-bovines IgG (Sigma #A7554) welches 1:5000 verdünnt worden ist, b) Polyklonale Ab Anti-Hasen oder Anti-Maus IgG (Girkegaard und Perry Gaithersberg, MD, USA) welches 1:2000 verdünnt worden ist. Alle Streifen sind 3 mal mit TBS-Buffer gewaschen worden. Die Farbreaktion ist durch 0,3 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland), 0,15 mg 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) (Boehringer Mannheim) in alkalinem Buffer injiziert und mit destilliertem Wasser gestoppt worden.
Beispiel 7: Auf dem Gen lppQ basiertes PCR-Verfahren als spezifisches System zur Feststellung von M. mycoides subsp. mycoides SC
Ein spezifisches PCR-Verfahren ist entwickelt worden, welches die Identifizierung des Organismus M. mycoides subsp. mycoides SC basierend auf dem lppQ-Gen gestattet. Die spezifischen entwickelten Primer waren MMMSCO5-7 und MMMSCO5-6 (Tabelle 3). Die spezifischen PCR-Parameter sind: Denaturierung 94°C, 30 Sekunden; Annealiren 48°C, 30 Sekunden; Elongation 72°C, 1 Minute; 35 Zyklen. Diese PCR verstärkte ein spezifisches 1304 bp-Fragment von allen Stämmen von M. mycoides subsp. mycoides SC, welche von den weltweit entferntesten Plätzen (Tabelle 1) stammt. Keine Verstärkung ist mit den anderen bezogenen Mycoplasmal-Organismen (Tabelle 1) unter den gleichen Bedingungen beobachtet worden.
Beispiel 8: Immunologische Erfassungssysteme
Gereinigtes rekombinantes LppQN'-His (N-beendetes Peptid) ist von dem Stamm JF1979 hergestellt und nachfolgend durch Ni-Chelations-Chromatographie (6) gereinigt worden. Gereinigtes LppQN'-His ist eingesetzt worden, um Mikrotiter-Platten zu beschichten. Die Beschichtung ist unter Einsatz von Standardverfahren (Nicolet und Martel, 1996) durchgeführt worden unter Einsatz von 100 μl von LppQ 10 μg/ml in Karbonat beschichteten Buffer (0,1 M Na₂CO₃/NaHCO₃ mit dem pH-Wert 9,6). Die beschichteten Mikrotiter-Platten (enthaltend 1 μg LppQN' je Probe) sind eingesetzt worden, um indirektes ELISA auf Seren durchzuführen, die von verschiedenen Rindern stammen, umfassend auch Rinder mit CBPP aus verschiedenen Ländern, Seren von gesunden Rind, Seren von experimentell infiziertem Rind und Seren von gesundem Rind, welche Seren enthalten, die falsche positive Resultate mit dem Standard CF-Test ergeben haben. Die prelimidären Daten von diesem ELISA sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten zeigen, dass ein ELISA-Test, der auf LppQN'-His basiert geeignet ist für spezifische und empfindliche Sero-Diagnose, um Tiere mit CBPP festzustellen oder Tiere, die mit M. mycoides subsp. mycoides SC infi ziert worden sind.
Literatur

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Tabelle 1. Stämme von Mycoplasmen

*AAHL, Australian Animal Health Laboratory, Geelong, Vic., Australien; BVVG, Jena, Deutschland; CIRAD, CIRAD-EMVT, Montpellier, Frankreich; FVLP, Faculdad de Veterinaria, Universidad de Las Palmas, Spanien; IVBBE, Institute for Veterinary Bacteriology, University of Berne, Schweiz; LNV, Laboratorio Nacional de Veterinaria, Lisboa, Portugal; LPB, Laboratoire de Pathologie Bovine; Lyon, Frankreich; NCTC, National Collection of Type Cultures, PHLS, London, Vereinigtes Königreich; NVI, National Veterinary Institute, Uppsala, Schweden.
lppQ ist durch PCR und/oder durch Southern Blot-Hybridisation bestimmt worden.

Tabelle 3

Kleingeschriebene Kursivbuchstaben weisen auf die Nukleotide hin, die hinzugefügt worden sind, um Restriktionsenzym-Erkennungsorte (unterstrichen) zum Klonieren zu erzeugen
A) Annealling-Temperatur für die PCR-Verstärkung
B) SDM = ortsgerichtete Mutagenese (steht für "site directed mutagenesis"), C = Klonieren, D = Erfassung
C) 1 = lppQ* wie geklont in pJFFmaLP48-MuHis1 2 = lppQ*N' wie geklont in pJFFLP48-11 3 = lppQ*C' wie geklont in pJFFma LppQ-

Tabelle 4
Tabelle 5 Nukleotidesequenz des lppQ-Gens und Aminosäuresequenz des Lipoproteins LppQ
Tabelle 6 Nukleotidsequenz des synthetischen Gens lppQ*, kodierend LppQ von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, (reifes LppQ)

Fette/kursive Buchstaben zeigen die induzierten Punktmutationen, um den universellen UGG_Trp-Kodon zu erhalten.

Tabelle 7 Aminosäuresequenz von LppQ von M. mycoides subsp. Mycoides SC, (reifes LppQ)
Tabelle 8 Nukleotidsequenz von synthetischem Gen lppQ*N' von M. mycoides subsp. Mycoides SC, (N-terminaler Teil des LppQ)

Tabelle 9 Aminosäuresequenz von LppQN' von M. mycoides subsp. Mycoides SC, (N-terminaler Teil des LppQ)
Tabelle 10 Nukleotidsequenz von synthetischem Gen lppQ*C' kodierend LppQC' von M, mycoides subsp. Mycoides SC, (C-terminaler Teil des LppQ)

Tabelle 11 Aminosäuresequenz von LppQC' von M. mycoides subsp. Mycoides SC, (C-terminaler Teil des LppQ)
Tabelle 12 Antigenizität des N'-Teils und des C'-Teils von LppQ von M. mycoides subsp. Mycoides SC
Antigene

C:

LppQC'-His 1 Mikrogramm

N:

LppQN'-His 1 Mikrogramm

F:

volles LppQ-His 0.3 Mikrogramm

*

experimentelle Infektion Abdo et al. 1998

Tabelle 13
Serologische Reaktivität von rekombinanten LppQN'-His mit sequentiell gesammelten Seren von Tieren, die mit Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides SC Stamm L2 und Afadé (CBPP) kontaktinfiziert sind.
A.) Experimentelle Infektion mit dem Europäischen Stamm L2

Bemerkung: Tier #502 war seronegativ vor Tag 92 nach der Infektion nach der Bestimmung mit dem CF-Test (Abdo Et al., 1998)

B.) Experimentelle Infektion mit dem Afrikanischen Stamm Afa

Bemerkung: Der CF-Test von Tier #511 war negativ am Tag 21 und davor und leicht positiv (1/20) auf Tag 28 (Abdo et al., 1998)
Immunoblot-Bedingungen: Antigen: 1 Mikrogramm LppQ/Immunoblot Serumverdünnung: 1:100 Verfahren; siehe Abdo et al., 1998

Tabelle 14
Serologische Spezifizität von LppQN' auf Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides SC in Abwesenheit von Kreuzreaktionen mit verwandten Tiermycoplasmen.
Immunoblots enthaltend 1 Mikrogramm LppQN'-His sind mit Kaninchen Hyperimmun-Serum oder mit Serum vom Rind reagiert worden.

1:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. mycoides subsp. mycoides SC (PG 1)
2:: Kaninchenserum (1:1000) gegen Mycoplasma sp. bovine gr. 7 (PG 50)
3:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. capricolum subsp. capricolum (Calif kid)
4:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. mycoides subsp. capri (PG 3)
5:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. capricolum subsp. capripneumoniae (F3 8)
6:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. putrifaciens
7:: Kaninchenserum (1:1000) gegen M. mycoides subsp. mycoides LC (Y-Ziege)
8:: Rinderserum (1:50) positiv für M. bovis (#68)
9:: Rinderserum (1:50) positiv für M. bovis (#4488/64)
10:: Rinderserum (1:50) positiv für M. bovis (#9/369)
11:: Rinderserum (1:50) positiv für M. bovis (#58/58)

Claims

Isoliertes Protein von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC („small colony"-Typ) mit der in der SEQ ID Nr. 25 dargestellten Aminosäuresequenz oder antigenische Teile davon.
Isoliertes LppQ Precursor Protein von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr. 25.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, bei dem die Teile durch die Aminosäuresequenz gekennzeichnet sind, wie sie in SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 29 dargestellt sind.
Isoliertes reifes LppQ Protein von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 27 dargestellt ist.
N-terminale Hälfte des reifen LppQ Proteins von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt ist.
Isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Protein ein Lipoprotein ist.
DNS kodierend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
DNS nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS Sequenz wie sie in der Sequenz ID Nr. 24, der Sequenz ID Nr. 26 oder der Sequenz ID Nr. 28 dargestellt ist.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem Diagnostizierverfahren für die direkte oder indirekte Feststellung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.
Verwendung nach Anspruch 9, bei dem das Diagnoseverfahren ein immunologisches Verfahren ist und aus einer Gruppe ausgewählt ist, welche Immuno-Blotting, serologische Tests und ELISA umfasst.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8 für die Herstellung eines Impfstoffs gegen die Infektion, die durch Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC hervorgerufen wird.
Verwendung einer DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8 für die Herstellung von lebenden attenuierten oder inaktivierten Zellen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, um als Markierungsimpfstoff verwendet zu werden, wobei den besagten Zellen die Fähigkeit zur Synthese des LppQ Proteins fehlt.
Verwendung einer DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8 in einem Feststellungsverfahren für Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.
Verwendung nach Anspruch 13, bei dem das Feststellungsverfahren ausgewählt wird aus einem Verfahren umfassend PCR und Hybridisationsverfahren.
Verwendung einer DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8 für die Exprimierung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Vektor umfassend eine DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8.
Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Vektor der Vektor pJFFmaLP48-MuHis1 ist, wie er bei der European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP40JP.UK unter der Hinterlegungsnummer 99081025 hinterlegt worden ist.
Hostzelle mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 16 oder 17 oder eine DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei (a) ein Vektor nach Anspruch 16 oder 17 in eine geeignete Hostzelle eingeführt wird, (b) die Hostzelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Exprimierung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gestatten, und (c) das Protein nach Schritt (b) aus der Hostzelle oder dem Supernatanten isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung einer DNS, gekennzeichnet durch die DNS Sequenz nach der SEQ ID Nr. 25, wobei (a) eine DNS Bibliothek von genomischer DNS von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC in einen geeigneten Phagen geklont wird, (b) der Phage aus Schritt (a) eingesetzt wird, um geeignete Hostzellen zu infizieren, (c) die Hostzellen mit Seren gescreent werden, die aus einem Säugetier stammen, welches mit Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC infiziert ist, (d) positive Klone ausgewählt und gereinigt werden, und (e) die genomische DNS des Phagen aus Schritt (d) isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung einer DNS, gekennzeichnet durch die DNS Sequenz nach SEQ ID Nr. 26 oder SEQ ID Nr. 28, wobei (a) eine DNS dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die DNS Sequenz der SEQ ID Nr. 24 enthält, und Sätze von Primern nach SEQ ID's Nr. 1 bis 4 und 6 bis 21 in einer überlappenden Erweiterung von PCR (OE-PCR) angewandt werden, was in einem ersten PCR-Produkt resultiert, (b) das PCR-Produkt nach der OE-PCR des Schrittes (a) auf eine oder mehrere OE-PCRs angewandt wird, wie es erforderlich ist aufgrund der Anzahl der gewünschten Mutationen, die in einem endgültigen PCR-Produkt resultieren, und (c) das endgültige PCR-Produkt isoliert wird.
Verfahren zur Erfassung von Antikörpern, die auf ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ausgerichtet sind, in einer Körperflüssigkeit eines Tieres, wobei (a) ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in eine geeignete Membran geblottet wird, (b) die Membran mit der besagten Körperflüssigkeit inkubiert wird, (c) die Membran mit einem markierten Konjugat inkubiert wird, und (d) eine Farbreaktion initiiert wird, um einen Komplex des Antikörpers des Konjugats und Antikörper aus der Körperflüssigkeit, die auf ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerichtet sind, festzustellen.
Verfahren zur Erfassung von Antikörpern, die auf ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerichtet sind, in einer Körperflüssigkeit aus einem Tier, wobei (a) eine Mikortiterplatte mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 beschichtet wird, (b) die Mikrotiterplatte mit der besagten Körperflüssigkeit inkubiert wird, (c) die Mikrotiterplatte mit einem markierten Konjugat inkubiert wird, und (d) eine Farbreaktion initiiert wird, um einen Komplex des Antikörpers des Konjugats und Antikörper aus der Körperflüssigkeit, die auf ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerichtet sind, festzustellen.
Verfahren zur Feststellung von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, wobei (a) ein Paar von PCR-Primern für die Feststellung einer DNS nach der Sequenz ID Nr. 24 eingesetzt wird in einer PCR-Reaktion mit einer zu testenden Probe, und (b) nach der PCR-Reaktion die Präsenz des PCR-Produkts, welches mit dem Paar von PCR-Primern erwartet wird, überprüft wird.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem das Paar von PCR-Primern ausgewählt wird aus einer Gruppe, umfassend die Primer der Sequenz ID Nr. 22 und Sequenz ID Nr. 23.
Monoklonaler Antikörper, der für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 spezifisch ist.
Diagnosekit mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder mindestens einem Antikörper nach Anspruch 26 in einem geeignetem Behälter.
Impfstoff umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eine DNS nach einem der Ansprüche 7 oder 8 gegen die Infektion von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.