DE60023800T2

DE60023800T2 - Verfahren zur produktion von koenzym q10

Info

Publication number: DE60023800T2
Application number: DE60023800T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Matsuda; Makoto Kawamukai; Yajima Kazuyoshi; Yasuhiro Ikenaka; Kenichi Nishi; Junzo Hasegawa; Satomi Takahashi
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-02-04
Also published as: AU2325200A; JP4307609B2; CA2325009A1; US6461842B1; EP1070759B1; DE60023800D1; ATE309368T1; EP1070759A4; WO2000047746A1; NO20004991D0; JP2000228987A; EP1070759A1; ES2251959T3; NO20004991L

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀, das als pharmazeutisches Mittel und dergl. verwendet werden kann. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀ durch Isolierung eines Gens, das ein Enzym kodiert, welches für das Biosynthetisieren der Coenzym Q₁₀-Seitenkette verantwortlich ist, das Schlüsselenzym in dem Coenzym Q₁₀ biosynthetischen Weg, d.h. Decaprenyldiphosphatsynthase, welches aus einem Bakterium, das zur Familie Rhizobiasceae gehört, stammt und durch Übertragung dieses Gens in einen Mikroorganismus, um Coenzym Q₁₀ herzustellen.
HINTERGRUND
Industriell ist Coenzym Q₁₀ durch Isolieren eines Coenzyms aus Pflanzen, wie Tabak, hergestellt worden, wobei die Seitenketten synthetisch geändert wurden.
Außerdem ist bekannt, dass Coenzym Q₁₀ durch eine Vielzahl von Organismen hergestellt wird, einschließlich von Mikroorganismen, wie einem Bakterium und Hefe, bis zu höheren Pflanzen und Tieren. Es wird gesagt, dass eines der effizientesten Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀ ein Verfahren ist, das das Kultivieren des Mikroorganismus und das Extrahieren der Verbindung aus der Kultur umfasst. Ein solches Verfahren ist ebenfalls zur industriellen Herstellung von Coenzym Q₁₀ verwendet worden. Jedoch liefern die obigen bekannten Verfahren aufgrund ihrer niedrigen Ausbeute oder dem komplizierten Vorgehen nicht ausreichend Produktivität.
Obgleich es einige Unterschiede zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Wegen zur Biosynthese von Coenzym Q₁₀ gibt, setzen sich beide Wege aus komplizierten mehrschrittigen Reaktionen zusammen, in die mehrere Enzyme involviert sind. Sie bestehen im wesentlichen aus den folgenden drei Schritten: Synthetisieren von Decaprenyldiphosphat, das für die Prenylseitenkette des Coenzyms Q₁₀ verwendet wird; Synthetisieren von Parahydroxylbeonzoesäure, die für den Chinonring verwendet wird; und Binden dieser beiden Komponenten und sequenzielles Umwandeln der Substituenten, um Coenzym Q₁₀ zu ergeben. Die Reaktion, die die Länge der Seitenkette bestimmt, und von der angenommen wird, dass es ein Reaktionsgeschwindigkeits-limitieren der Schritt in dem Biosyntheseweg ist, d.h., die Reaktion an der Decaprenyldiphosphatsynthase beteiligt ist, ist offensichtlich die wichtigste Reaktion. Zur effektiven Herstellung von Coenzym Q₁₀ scheint es daher eine gute Idee zu sein, dass Decaprenyldiphosphatsynthasegen zu isolieren, welches das Schlüsselenzym in dem Biosyntheseweg ist, und dieses Gen zur Verbesserung der Produktivität einzusetzen. Einer der potentiellen Kandidaten der Genquelle ist ein Bakterium, das zur Familie Rhizobiaceae gehört und das verhältnismäßig große Mengen Coenzym Q₁₀ herstellt.
Bisher wurden die Decaprenylphosphorsäuresynthasegene aus verschiedenen Mikroorganismen isoliert, einschließlich Schizosaccaromyces pombe (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. H09-173076) und Gluconobacter suboxtdans (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. H10-57072). Jedoch zeigen diese keine ausreichende Produktivität des Coenzyms Q₁₀ und im Stand der Technik ist bis jetzt keine effektive Kultur, Isolierung oder Reinigung mit diesen Mikroorganismen erreicht worden. Daher bestand das Anliegen, ein Gen dieses Enzyms aus einem Bakterium zu isolieren, das eine hohe Coenzym Q₁₀-herstellende Fähigkeit besitzt.
DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSENDE PROBLEME
Der Erfindung liegt zu Grunde, dass oben genannte Problem der geringen Produktivität zu lösen. Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das Coenzym Q₁₀ effektiv mittels eines Mikroorganismus herstellt, durch Isolierung eines Gens, das für ein Enzym kodiert, das eine Seitenkette von Coenzym Q₁₀ synthetisiert aus einem Bakterium, das zur Familie Rhizobiaceae gehört, und Verwendung des Gens.
Gemäß der Erfindung wurde das Decaprenyldiphosphatsynthasegen, das Schlüsselgen in dem biosynthetischen Weg von Coenzym Q₁₀, aus einem Bakterium isoliert, das zur Familie Rhizobiaceae gehört. Eine effiziente Coenzym Q₁₀-Herstellung wurde erreicht, durch Übertragen des Gens in einen Mikroorganismus, wie Escherichia coli und Exprimieren desselben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben versucht, dass Decaprenyldiphosphatsynthasegen aus einem Bakterium, das zur Familie Rhizobiaceae gehört, welches verhältnismäßig große Mengen an Coenzym Q₁₀ herstellt, zu isolieren und haben dieses Gen erfolgreich isoliert.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, umfassend eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder eine Sequenz mit einer Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Basen der Sequenz und die Decaprenyldiphosphatsynthase kodiert. Die Erfindung stellt außerdem ein Protein bereit mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäure sequenz mit einer Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Aminsäuren der Sequenz und die Decaprenyldiphosphatsynthaseaktivität aufweist; und eine DNA, die diese Aminsäuresequenz kodiert.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁₀ bereit, umfassend die Schritte des Übertragens der oben beschriebenen DNA-Sequenz in einen Wirt-Mikroorganismus und Kultivieren des Mikroorganismus. Der Wirt-Mikroorganismus der erfindungsgemäß vermindert wird, ist nicht eingeschränkt, ist aber bevorzugt Escherichia coli. Obgleich normales Escherichia coli Coenzym Q₈ herstellt, kann erfindungsgemäß Escherichia coli modifiziert werden, um Coenzym Q₁₀ herzustellen.
Außerdem stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, umfassend die oben beschriebene DNA-Sequenz. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann hergestellt werden durch Verwenden einer der bekannten Vektorsysteme. Z.B. wird pQAD-1 bereitgestellt, der durch Übertragen des Gens der SEQ ID NO: 1 in das bekannte Expressionsvektorsystem pUCNT hergestellt wird.
Erfindungsgemäß wird außerdem ein Wirt-Mikroorganismus, der mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz transformiert wird, bereitgestellt. Als Wirt-Mikroorganismus, der erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist Escherichia coli bevorzugt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pQAD1, das das Decaprenyldiphosphatsynthasegen enthält.
2 zeigt ein Diagramm der Hochflüssigkeitschromatographie durch das Coenzym Q₁₀, hergestellt durch rekombinantes E. coli, umfassend das Decaprenyldiphosphatsynthasegen, nachgewiesen wird.
BESTE ERFINDUNGSGEMÄSSE AUSFÜHRUNGSFORM
Die Erfinder haben intensiv versucht das gewünschte Gen aus dem Bakterium, das zur Familie Rhizobiaceae gehört, und das verhältnismäßig hohe Coenzym Q₁₀-Mengen herstellt, zu isolieren und waren erfolgreich ein Fragment aus diesem Gen durch PCR-Technik zu erhalten.
Die Erfinder verglichen die bekannten Decaprenyldiphosphatsynthasegene und Polyprenyldiphosphatsynthasegene, die analoge Enzyme des erstgenannten sind und an der Biosynthese längerer Prenylketten beteiligt sind, um Coenzyme Q mit unterschiedlichen Seitenkettenlängen bereitzustellen; und auf Basis der homologen Bereiche zwischen diesen Sequenzen wurden verschiedene PCR-Primer entworfen. Unterschiedliche Kombinationen aus den erhaltenen Primern wurden untersucht, um PCR-Bedingungen zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass ein 400 Bp-Genfragment des gewünschten Enzyms von dem chromosomalen Gen von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) unter Verwendung von DPS-1 (5'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-3') und DPS-2 (5'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3') (wobei R A oder G darstellt, Y C oder T darstellt und N G, A, T oder C darstellt) als PCR-Primer amplifiziert wurde, wobei das PCR-Verfahren bei 94°C 1 Minute durchgeführt wurde und anschließend über 25 Wärmezyklen bei 94°C 1 Minute → 50°C 1 Minute → 75°C 1 Minute. Das erhaltene Gen wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Um die gesamte Länge des Enzyms zu bestimmen wurde als nächster Schritt Agrobacterium sp. KNK 712 (FERM BP-1900) chromosomales Gen mit dem EcoRI-Restriktionsenzym verdaut und die erhaltenen Fragmente wurden in einen λ-Phagenvektor übertragen, um eine rekombinante Phagenbibliothek bereitzustellen. Die Plaques wurden auf einen Nylonfilter geblottet und der Filter wurde mit dem markierten PCR-Fragment Plaquehybridisierung ausgesetzt und anschließend konnte ein Klon erhalten werden, der die gesamte Länge des Decaprenyldiphosphatsynthasegens umfasst.
Die Basensequenz des Decaprenyldiphosphatsynthasegens, das in dem erhaltenen Klon enthalten ist, wurde unter Erhalt der Sequenz der SEQ ID NO: 1 bestimmt. Die aus der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz enthielt Bereiche, die Sequenzen aufweisen, die charakteristisch für Decaprenyldiphosphatsynthase sind.
Zum Exprimieren des Decaprenyldiphosphatsynthasegens ist es erforderlich, das Gen in einen Vektor zu ligieren, der in einem Bereich stromabwärts eines geeigneten Promotors liegt. Z.B. kann ein Expressionsvektor durch Ausschneiden eines DNA-Fragmentes, das das gewünschte Gen enthält, mittels eines Restriktionsenzyms oder durch Amplifizieren des Fragments, dass das Enzym kodiert, mittels PCR hergestellt werden, wobei das Fragment anschließend in einen Vektor mit einem Promotor übertragen wird. Z.B. kann das Expressionsvektorsystem pUCNT (das in WO 94/03613 beschrieben ist) mit diesem Gen transfiziert werden, um einen Expressionsvektor pQAD1 für das Decaprenyldiphosphatsynthasegen bereitzustellen.
Anschließend kann ein geeigneter Mikroorganismus verwendet werden, um Coenzym Q₁₀ herzustellen, wobei derselbe mit dem Expressionsvektor für das Enzym transformiert wird. Z.B. kann Escherichia coli, das ursprünglich das Coenzym Q₈ herstellt, mit pQAD1, dem Expressionsvektor für das Decaprenyldiphosphatsynthasegen, transformiert werden, um eine signifikant höhere Coenyzm-Q₁₀-Menge, die ursprünglich nicht hergestellt wird, als die Coenzym-Q₈-Menge herzustellen.
Transformiertes Escherichia coli, Escherichia coli HB101 pQAD1 wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6538 hinterlegt.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte Gen kann allein oder auch mit einem anderen biosynthetischen Gen in einen Mikroorganismus transferiert und darin exprimiert werden, um eine bessere Wirkung zu erreichen.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung zur Herstellung von Coenzym Q₁₀ kann der Wirt-Mikroorganismus, der mit dem Gen transformiert ist, kultiviert werden, um Coenzym Q₁₀ herzustellen. Die Kulturbedingung ist nicht eingeschränkt und kann in Abhängigkeit des ausgewählten Wirt-Mikroorganismus bestimmt werden. Bedingungen zur Kultivierung verschiedener Wirt-Mikroorganismen sind im Stand der Technik bekannt. Nachdem das Kultivieren beendet ist, kann der Wirt-Mikroorganismus geerntet werden und Coenzym Q₁₀ kann isoliert und mittels einem geeigneten Verfahren gereinigt werden. Das Verfahren zum Isolieren von Coenzymen Q aus einem Wirt-Mikroorganismus ist im Stand der Technik gut bekannt.
BEISPIEL
Die vorliegende Erfindung wird im Detail mittels der folgenden Beispiele beschrieben. Die Beispiele dienen lediglich zu Erklärungszwecken und schränken den Erfindungsumfang in keiner Weise ein.
(BEISPIEL 1)
Eine chromosomale DNA aus Agrobacterium sp. KNK712 wurde durch das Verfahren von Marmur, J. Mol. Biol., Band 3, S. 208–218 (1961) hergestellt. PCR-Primer wurden auf Basis der Basensequenzhomologie zwischen der DNA und dem bekannten langkettigen Prenylphosphorsäuresynthasegen entworfen, unter Erhalt von zwei Primern DPS-1 (5'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-3') und DPS-2 (5'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3'), wobei R A oder G darstellt, Y C oder T darstellt und N G, A, T oder C darstellt. Sie wurden dem PCR-Wärmezyklus unterworfen (94°C 1 Minute → (25 Zyklen bei 94°C 1 Minute → 50°C 1 Minute → 70°C 1 Minute) → 4°C 1 Minute. Die amplifizierte Mischung wurde durch 0,8%ige Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein 400 Bp-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit einem DNA-Extraktionskit (Takara Co.) gereinigt und anschließend wurde die DNA-Basensequenz des Fragments mittels dem DNA-Sequenzierer (373 A-Typ, Aplliedbiosystems Co.) und dem DNA-Sequenzkit (ABI PRIMTM Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit mit Amplitaq^R DNA-Polymerase, FS) gemäß der Anweisungen des Herstellers bestimmt. Als Folge wurde eine Basensequenz erhalten, die den Nukleotiden 514 bis 906 der SEQ ID NO: 1 entspricht. Die von der Basensequenz translatierte Aminosäuresequenz hatte die Bereiche "VGDFLLG" und "EGEVLQL", die für das synthetische Enzym von Prenyldiphosphat mit einer langen Prenylkette charakteris tisch sind. Folglich wurde bestätigt, dass das erhaltene Gen ein Teil des Decaprenyldiphosphatsynthasegens ist.
(BEISPIEL 2)
Agrobacterium sp. KNK712 chromosomale DNA (0,25 μg) wurde der PCR-Amplifizierung mit den Primern NQE-11 (mit der Sequenz 5'-AAGTCCACCGCCCGCACGATCT-3') und NQE-12 (mit der Sequenz 5'-CCGAGGTTCATGCCGTAGGATTTT) unterworfen. PCR wurde bei 94°C 1 Minute → (25 Zyklen bei 94°C 1 Minute → 50°C 1 Minute → 70°C 1 Minute) → 4°C 1 Minute durchgeführt. Die amplifizierte Mischung wurde durch 0,8%ige Agarosegelelektrophorese getrennt, ein ungefähr 320 Bp-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend wurde das Fragment mittels eines DNA-Extraktionskits (Takara Co.) gereinigt. 25 ng des erhaltenen DNA-Fragments wurden mit [α-32P]dCTP mittels des Megaprime^TM-DNA-Markierungssystems (Amersham Co.) markiert.
(BEISPIEL 3)
Agrobacterium sp. KNK712 chromosomale DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SacI, NotI und XhoI verdaut und anschließend durch 0,8%ige Agarosegelelektrophorese getrennt. Dann wurde das Gel mittels alkalischer Lösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) denaturiert und neutralisiert (0,5 M Tris·HCl (pH 7,5)). Ein Highbond N+ Filter (Amersham Co.) wurde auf das Gel gelegt und die DNA-Banden auf dem Gel wurden Southern auf den Filter mit 10 × SSC transferiert. Der erhaltene Filter wurde getrocknet und bei 80°C 2 Stunden fixiert und anschließend wurde der Filter hybridisiert bei 60°C 4 Stunden in der Hybridisierungslösung (15 ml 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitratdehydrat, pH 7,0), 5 ml 10% SDS (Natriumdodecylsulfat), 5 ml 50 × Denhardt's-Lösung (10 g/l FicolR-Typ 400 (Pharmacia), 10 g/l Polyvinylpyrrolidon und 10 g/l Rinderserumalbumin (Fraction V, Sigma), 0,5 ml einer 10 mg/ml Lachssperma-DNA (durch 5-minütiges Erwärmen bei 95°C denaturiert und auf Eis gequenscht) und 24,5 ml Wasser).
Die markierten Sonden wurden bei 95°C 5 Minuten erwärmt und auf Eis gequenscht und zu der Hybridisierungslösung, enthaltend den prehybridisierten Filter, gegeben. Die Hybridisierung wurde bei 60°C 22 Stunden durchgeführt. Der Hybridisierungsfilter wurde zweimal bei Raumtemperatur mit 5 × SSC, ergänzt mit 0,5% SDS und anschließend mit 1 × SSC, ergänzt mit 0,1% SDS, während die Temperatur allmählich von 60°C auf 75°C anstieg, gewaschen. Der Filter wurde getrocknet und einem Röntgenfilm durch Anhaften ausgesetzt, anschließend wurden die schwarzen Banden entwickelt. Es ergab sich, dass die Sonden stark mit dem EcoRI-Fragment von ungefähr 2,7 kB, dem SacI-Fragment von ungefähr 4,7 kB, dem NotI-Fragment 8,3 kB und dem XhoI-Fragment von ungefähr 4,7 kB hybridisierten.
(BEISPIEL 4)
Eine chromosomale DNA aus Agrobacterium sp. KNK712 wurde mit dem EcoI-Restriktionsenzym geschnitten, durch 0,8% Agarosegelelektrophorese getrennt, woraufhin ein DNA-Fragment von ungefähr 7 kB ausgeschnitten und unter Erhalt des DNA-Fragmentes zur Klonierung gereinigt wurde. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den λ-ZAPII unter Verwendung des Phagenkits (Stratagene Co.) an der EcoRI-Stelle eingefügt und unter Verwendung eines in vitro-Verpackungskits (Amersham Co.) verpackt. Anschließend wurde E-coli XL 1-Blue MRF' mit dem Phagen infiziert. Die infizierten Zellen wurden auf ein NZY-Plattenkulturmedium (5 g/l NaCl, 2 g/l MgSO₄/7H₂O, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NZ-Amin, 18 g/l Agar (pH 7,5)) zusammen mit dem NZY weichen Agarmedium (das gleiche wie das NZY-Plattenkulturmedium, außer dass die Agarmenge 8 g/l ist) unter Entwicklung von Plaques kultiviert. Die Plaques wurden auf den Highbond N+ Filter (Amersham Co.) übertragen. Der Filter wurde mit einer alkalischen Lösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) denaturiert, neutralisiert (0,5 M Tris·HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl), getrocknet und bei 80°C 2 Stunden fixiert.
24 Filter, die wie oben erhalten wurden, wurden hybridisiert und anschließend mit markierten Sonden gemäß einem ähnlichen Verfahren zum Beispiel 3 markiert, und die erhaltenen Filter wurden gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Filter Röntgenstrahlen ausgesetzt, indem sie an Röntgenfilme angeheftet wurden. Die Plaques der Phagen, die den sich entwickelten schwarzen Flecken entsprechen, wurden isoliert. Die isolierten Phagen wurden in E. coli gemäß dem oben beschriebenen Verfahren infiziert. Die erhaltenen Plaques wurden auf den Filter geblottet und anschließend zur Bestätigung hybridisiert. 12 Stämme der Phagen wurden ausgewählt.
PCR wurde unter Verwendung einer Suspension der jeweiligen Phagen und der zuvor genannten NQE-11 und NQE-12 durchgeführt. 320 Bp DNA-Fragmente wurden in 8 Stämmen festgestellt. Phagemiden wurden aus zwei Stämmen der 8 unter Verwendung des λ-ZAPII-Phagenkits gemäß der Anweisungen des Herstellers hergestellt.
(BEISPIEL 5)
Unter Verwendung der oben erhaltenen zwei Phagemiden wurden die DNA, DNA-Basensequenz des Decaprenyldiphosphatsynthasegens, gemäß dem Verfahren bestimmt, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 ist. Unter den eingeführten DNAs wurde ein DNA-Basensequenzfragment von ungefähr 1,6 kb bestimmt. Die erhal tene Sequenz ist in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 1 gezeigt. Eine aus der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO: 2 gezeigt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit denen der Decaprenyldiphosphatsynthase, die aus Gluconobacter suboxydans (japanische offengelegte Patentanmeldung H10-57072) verglichen und festgestellt, dass sie ungefähr 47% Aminosäurensequenzhomologis und ungefähr 60% DNA-Sequenzhomologie aufweisen. Die Ergebnisse sind in den 3, 4 und 5 gezeigt. Die Sequenzen wurden auch mit der Decaprenyldiphosphatsynthase, die von Schizosaccaromyces pombe abstammt, verglichen und festgestellt, dass sie ungefähr 30% Aminosäure und 46% DNA-Homologien aufweisen.
(BEISPIEL 6)
Zum Ausschneiden des kodierenden Bereichs der Decaprenyldiphosphatsynthase aus dem oben hergestellten Phagemid, wurde PCR unter Verwendung der synthetischen DNA-Primer NQE-22 (mit der Sequenz 5'-AGTCAAGCTTCAGCTCACCCGGTCGATC-3') und NQE-23 (mit der Sequenz 5'-AGCTCATATGATACCGCTGGAAGACAGC-3') gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt. Das erhaltene Fragment wurde mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsenzymen geschnitten und das erhaltene Fragment wurde in den Expressionsvektor pUCNT (WO 94/03613) übertragen, um den Expressionsvektor pQAD1 für Decaprenyldiphosphat zu erhalten. Die pQAD1-Restriktionskarte ist in 1 gezeigt. In dieser Figur stellt DPS den kodierenden Bereich der Decaprenyldiphosphatsynthase dar.
(BEISPIEL 7)
Der so erhaltene Expressionsvektor für Decaprenyldiphosphatsynthase wurde zu E. coli HB101 gegeben, die Zellen wurden über Nacht in 10 ml LB-Medium bei 37°C geschüttelt und anschließend gesammelt (2.000 Upm, 20 Minuten).
Die gesammelten Zellen wurden in 1 ml 3% wässriger Schwefelsäure suspendiert, auf 120°C 30 Minuten erwärmt, woraufhin 2 ml 14% wässriges Natriumhydrat zugegeben wurde und auf 120°C zusätzliche 15 Minuten erwärmt wurde. Anschließend wurde die behandelte Mischung durch Zugabe von 3 ml Hexan/Isopropanol (10:2) extrahiert und zentrifugiert. 1,5 ml organische Lösungsmittelphase wurden getrennt und unter reduziertem Druck bis zur Trockene verdampft. Der Rest wurde in 0,5 ml Ethanol aufgelöst und 20 μl der Lösung wurden mit einem Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografiesystem (LC-10A; Shimadz Co.) untersucht. Zum Eluieren wurde die Umkehrphasensäule (YMC-Pack ODS-A, 250 × 4,6 mm, S-5 μm, 120A) verwendet und Ethanol/Methanol (2:1) wurde als Lösungsmittel der mobilen Phase verwendet. Das hergestellte Coenzym Q₁₀ wurde durch Absorption bei einer Wellenlänge von 275 nm ver folgt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Aus 2 ist ersichtlich, dass rekombinantes Escherichia coli, das durch Einführen und Exprimieren des Decaprenyldiphosphatsynthasegens Coenzym Q₁₀, das vom Wildtyp-Stamm, nicht hergestellt wird, herstellt.
Der erhaltene rekombinante E. coli-Stamm, Escherichia coli HB101 pQAD1 wurde am 1. Oktober 1996 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt (Hinterlegungsnummer FERM BP-6538).
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Erfindungsgemäß wurde ein Gen, das Decaprenyldiphosphatsynthase, das Schlüsselenzym in dem Coenzym-Q₁₀-biosynthetischen System, kodiert aus dem Bakterium isoliert, das zur Familie Rhizobiaceae gehört und die Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Außerdem konnten die Erfinder erfolgreich das erhaltende Gen in Escherichia coli einführen und dasselbe exprimieren. Unter Verwendung des Gens und des Verfahrens der Erfindung kann Coenzym Q₁₀, das bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und dergl. verwendet werden kann, wirksam hergestellt werden.
REFERENZ DER HINTERLEGTEN MIKROORGANISMEN
Escherichia coli HB101 pQAD1 wurde am 1. Oktober 1996 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer FERM BP-6538 wurde zugeteilt.
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Polynukleotid, das ein Protein mit einer Decaprenyldiphosphatsynthaseaktivität codiert, wobei das Polynukleotid (a) die Nukleotidsequenz gemäss SEQ ID NO: 1 oder (b) eine Nukleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Nukleotidsequenz gemäss SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten Hybridisierungsbedingungen ein Hybridisieren bei 60°C und ein Waschen in 1 × SSC, supplementiert mit 0,1% SDS, umfassen, während die Temperatur von 60 auf 75°C angehoben wird.
Isoliertes Polynukleotid gemäss Anspruch 1, das eine Decaprenyldiphosphatsynthase codiert, umfassend die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2.
Verfahren zur Erzeugung von Coenzym Q₁₀, umfassend die Transformation eines Wirt-Mikroorganismus mit dem Polynukleotid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2, Kultivieren des transformierten Wirt-Mikroorganismus und Isolieren von Coenzym Q₁₀.
Verfahren gemäss Anspruch 3, wobei der Wirt-Mikroorganismus Escherichia coli ist.
Verfahren gemäss Anspruch 4, wobei der transformierte Wirt-Mikroorganismus Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538) ist.
Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2.
Expressionsvektor gemäss Anspruch 6, wobei der Expressionsvektor pQAD1 ist, wie in Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538) enthalten.
Wirt-Mikroorganismus, transformiert mit dem Polynukleotid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2.
Mikroorganismus gemäss Anspruch 8, wobei es sich um Escherichia coli handelt.
Mikroorganismus gemäss Anspruch 9, wobei der Escherichia coli-Stamm Escherichia coli HB101 pQRD1 (FERM BP-6538) ist.
Wirt-Mikroorganismus, transformiert mit dem Expressionsvektor gemäss Anspruch 6.
Mikroorganismus gemäss Anspruch 11, wobei es sich um Escherichia coli handelt.
Mikroorganismus gemäss Anspruch 12, wobei der Escherichia coli-Stamm Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538) ist.
Isoliertes Protein, das durch das Polynukleotid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2 codiert wird und eine Decaprenyldiphosphatsynthaseaktivität aufweist.
Isoliertes Protein, das die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2 umfasst und eine Decaprenyldiphosphatsynthaseaktivität aufweist.