DE60023722T2

DE60023722T2 - Oligosaccharide, die sich vom Ribose-Ribtol-Phosphat herleiten und Impfstoffe, die diese Oligosaccharide enthalten

Info

Publication number: DE60023722T2
Application number: DE60023722T
Authority: DE
Inventors: Vicente Guillermo Verez Bencomo; Rene Roy
Original assignee: University of Ottawa; Universidad de la Habana
Current assignee: University of Ottawa; Universidad de la Habana
Priority date: 1999-08-30
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-08-16
Also published as: AR025435A1; ATE308551T1; CA2382602C; KR100818163B1; EA200200314A1; BRPI0013686B8; CA2382602A1; US6765091B1; UA75579C2; CZ2002721A3; JP2003528032A; DK1212334T3; DE60023722D1; CU22904A1; HK1050693A1; BRPI0013686B1; EP1212334B1; CN1376158A; EA005381B1; MXPA02002066A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, insbesondere die chemische Synthese von Oligosaccharid-Mischungen, die sich von Ribose-Ribit-Phosphat ableiten, welche als Hauptwirkstoff in Impfstoffen zur Verhinderung von durch Haemophilus influenzae Typ b (Hib) verursachten Infektionen verwendet werden, sowie mit Impfstoffen, welche die Oligosaccharid-Mischungen enthalten.
Stand der Technik
Haemophilus influenzae Typ b ist ein ernstzunehmendes Gesundheitsproblem für den Menschen weltweit. Das Bakterium verursacht hauptsächlich bei Kindern unter einem Alter von 5 Jahren Meningitis, Pneumonia, Epiglotitis und andere Erkrankungen des Respirationstraktes. Die beobachteten Folgeerscheinungen, die von Hörproblemen bis hin zu einer drastischen mentalen Retardierung reichen, befallen in vielen Ländern mehr als 30% an Überlebenden der Krankheit. Jüngste Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation gaben an, dass mehr als 550 000 Kinder jährlich durch die durch Haemophilus influenzae Typ b verursachten Erkrankungen weltweit sterben.
Gereinigtes Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae ist in der Lage, eine schützende Immunität beim Erwachsenen zu induzieren, gleichwohl ist die Immunantwort in Kindern sehr schlecht, und bei Kleinkindern unter 2 Jahren praktisch nicht vorhanden.
Das Kapselpolysaccharid besitzt die folgende Struktur:
Es wurde gezeigt, dass das Hauptproblem seine antigene Natur selbst ist, da es nämlich ein Polysaccharid ist, ist es ein T-unabhängiges Antigen, welches nicht in der Lage ist, das immer noch unreife Immunsystem des Kleinkindes zu stimulieren. Es wurde gezeigt, dass die Lösung zu diesem Problem erreicht werden kann, indem das Polysaccharid an einem als Träger bekannten Protein kovalent gebunden wird (konjugiert wird). Das so erhaltene Produkt, welches als konjugierter Impfstoff bekannt ist, induziert Antikörper-Schutzspiegel vom 2. Lebensmonat an.
Chu et al. (Infection immunity 1983, 40, 245–256) erhielten das Konjugat aus dem nativen Kapselpolysaccharid und Tetanustoxoid nach Aktivierung mit Cyanogenbromid.
Gordon (US-Patent Nr. 4 496 538) aktivierte das natürliche Polysaccharid mit Cyanogenbromid und konjugierten es dann zum Diphtherietoxoid durch das Adipinsäuredihidrazid.
Hilman et al. (US-Patent Nr. 4 459 286) konjugierten das natürliche Polysaccharid mittels 6-Aminocaproinsäure an Meningococcen-Außenmembranprotein nach ihrer anfänglichen Aktivierung.
In allen der vorhergehenden Konjugationsverfahren findet die kovalente Verknüpfung zwischen mehreren Gruppen des Kapselpolysaccharids und des Trägerproteins statt.
Das Vermögen, eine Schutzimmunität bei Kleinkindern zu induzieren, hängt von der Struktur des Konjugats ab. Wenn die Konjugation bei dem nativen Polysaccharid durchgeführt wird, werden die Gruppen, welche bei der Verknüpfung partizipieren, statistisch entlang der Polysaccharidkette verteilt, wodurch die Charakterisierung jedes Ansatzes sehr komplex wird.
Alle diese Impfstoffe sind sehr schwierig mittels physiko-chemischen Verfahren zu analysieren; deshalb ist es die gängige Praxis, die Evaluierung jedes Ansatzes durch Untersuchungen der Immunogenität bei experimentellen Tieren vorzunehmen. Gleichwohl unterscheidet sich das Verhalten des Konjugats bei Kindern von dem in Tierexperimenten.
Gemäß den Kriterien von stabiler Qualität (M. R. Holliday, C. Jones, Biologicals, 1999, 27, 51–53) der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sollte die Kontrolle von konjugierten Impfstoffen auf physiko-chemischen Verfahren basieren, wodurch Ähnlichkeit von einem Ansatz zum anderen gezeigt werden sollte.
Um diese Aufgabe zu erleichtern, sollten konjugierte Impfstoffe auf einem molekularen Niveau immer stärker definiert werden. Eine alternative Lösung dieses Problems ist die Synthese von Kapselpolysaccharidfragmenten. Das Verfahren zur Konstruktion des Haemophilus influenzae Typ b-Antigens durch die Synthese weist zwei Hauptschritte auf, die Synthese der Disaccharid-Zwischenstufe und seine Oligomerisierung. Mehrere Herangehensweisen wurden für diese Synthese entwickelt.
Beuvery et al. (Europäische Patentanmeldung EPO 0276 516; US-Patent 5 034 519; Tetrahedron Lett. 28, 1553, 1987) und Hoogerhout et al. (J. Carbohydr. Chem, 7, 1988, 399–416) erhielten durch die Synthese ein Fragment des Kapselpolysaccharids, von dem behauptet wurde, dass es zwischen 3 bis 20 Repetiereinheiten enthielt. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die Disaccharid-Zwischenstufe 2 zuerst hergestellt, und dann wurde durch Fest-Phasen-Chemie oder Lösungssynthese ein Oligomer hergestellt, welches 6 Repetiereinheiten enthielt (Elie et al., Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 108, 1989, 219). Die Oligomere wurden an Proteine oder Peptide durch einen Spacer konjugiert. Das Konjugat Trimer war genauso immunogen in Mäusen wie der kommerziell erhältliche Impfstoff, der aus dem Kapselpolysaccharid hergestellt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform, welche den folgenden Syntheseweg veranschaulicht, wurde die nachfolgende Strategie angewandt: 1 – Synthese des Ribits, 2 – Koppeln an Ribose, 3 – selektive Einführung von Substituenten in die Riboseeinheit und 4 – Einführung der phosphor-aktivierenden Gruppe. Unter Anwendung dieses Weges wurde das Disaccharid-Schlüsselderivat 2 in nur 15 Reaktionsschritten erhalten.
Die Gesamtausbeute beträgt 7% (Hermans et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1987, 106, 498–504). Ferner besitzt dieses Verfahren zwei Hauptnachteile: Das Verfahren schließt 11 chromatographische Schritte ein, und die Schutzgruppen der Schlüssel Zwischenstufe sind für den Oligomerisierungsprozess nicht ideal.
Bei der Oligomerisierung oder dem zweiten Schritt der Synthese ist das angewandte Verfahren die Lösung Synthese durch die Aktivierung von Phosphotriester, was Ausbeuten zwischen 70–90% pro Zyklus, bezogen auf das Disaccharid, ermöglicht. Der Hauptnachteil einer solchen Prozedur ist die Unmöglichkeit Fragmente herzustellen, welche mehr als vier Repetiereinheiten enthalten, da die Ausbeuten drastisch verringert werden. Die Disaccharid-Zwischenstufe 2 besitzt drei unterschiedliche Schutzgruppen, was die Ent schützung des Endprodukts sehr schwierig macht. Deshalb ist dieses Disaccharid weniger zweckdienlich für eine Oligomerisierung mittels Fest-Phasen-Chemie. Deshalb wurde die Synthese eines Hexamers berichtet.
In immunologischen Assays (Peters CCAM, et al., Infect. Immunity 1991, 59, 3504–10) ist nur die Konjugation eines Trimers an Tetanus-Toxoid und seine Immunogenität in Mäusen und Affen beschrieben.
G. Just, J. Upeslacis (Europäische Patentanmeldung EP 0 320 942 , L. Chan; G. Just, Tetrahedron, 46, 1990, 151–162) synthetisierten ebenfalls ein Fragment des Kapselpolysaccharids durch eine Disaccharid-Zwischenstufe und die Synthese durch Lösungschemie. Mit dem Ziel der Herstellung einer optimalen Zwischenstufe für die Synthese des Antigens wurde ein unterschiedlicher Weg gewählt: 1 – Synthese von Ribit, 2 – Synthese der Riboseeinheit mit angemessenen Schutzgruppen, 3 – Koppeln von Ribose und Ribit und 4 – Einührung der phosphoraktiven Funktionalität.
Unter Anwendung dieser Methodologie ergibt sich eine Prozedur für die Zwischenstufe 3 als Phosphoramidit, die eine bessere Auswahl von Schutzgruppen für die Oligomerisierungsprozedur zeigt. Um dieses Ziel zu erreichen, war eine größere Anzahl von Schritten erforderlich. Das Schlüsselderivat wurde in 19 Schritten erhalten, und unter Verwendung von 8 Chromatographieprozessen zur Reinigung.
Das Disaccharid 3 wurde in Lösung oligomerisiert, wodurch man Fragmente des Kapselpolysaccharids, das 3 Repetiereinheiten enthielt, mit Ausbeuten zwischen 70–90% pro Zyklus, basierend auf dem Disaccharid, erhielt.
Kandil et al. (Syn. Lett., 1992, 555–7), Chon et al. (PCT-Patentanmeldung WO 93/15205 und US-Patent 5 679 352) synthetisierten ein Fragment des Kapselpolysaccharids unter Verwendung der gleichen Disaccharid-Zwischenstufe 3 und mittels Fest-Phasen-Chemie unter Verwendung von Monomethoxypolyethylenglycol als Träger, wobei Fragmente mit bis zu 6 Repetiereinheiten erhalten wurden, wobei die Ausbeute pro Zyklus 95% war.
Krivan et al. (PCT-Patentanmeldung WO 94/00149) und Nilsson, et al. (J. Carbohydr. Chem. 10, 1991, 1–22) erhielten ein Fragment mit 10 Repetiereinheiten mit einer ähnlichen Disaccharid-Zwischenstufe und der Fest-Phasen-Chemie. Dieses Fragment wurde durch einen Spacer an Hib-Adhesin konjugiert. Die Phosphonat-Zwischenstufe wurde in 21 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 5% erhalten. Mindestens 7 chromatographische Schritte waren ebenfalls erforderlich. Das Oligomerisierungsverfahren wurde unter Verwendung von H-Phosphonaten und der Fest-Phasen-Chemie unter Verwendung von aminierten Merrifield-Harzen durchgeführt. Das Antigen wurde unter Einbringung von 97–99% pro Zyklus erhalten.
Chiu Machado et al. (J. Carbohydr. Chem, 13 1994, 465–474) und das kubanische Patent 22424 berichten von einer effizienten Prozedur zur Synthese eines geeigneten geschützten Ribosederivats aus Glukose. Unter Verwendung dieses Derivats präparierten sie das Schlüsseldisaccharid in 20 Reaktionsschritten.
Einer der Aspekte, welche die Anwendung der Synthese für die Herstellung der Hib-Fragmente und ihrer Verwendung in Impfstoffen schwierig macht, ist die Synthese der Disaccharid-Zwischenstufe.
Alle oben aufgelisteten Verfahren reflektieren den Stand der Technik der modernen Kohlenhydratchemie, gleichwohl weisen sie zwei ernstzunehmende technische Hauptnachteile auf. Die Verwendung von mehreren chromato graphischen Schritten durch die Synthese, welche die Synthese in einem industriellen Maßstab unpraktisch machen und die Anzahl von synthetischen Schritten, welche für gewöhnlich sehr hoch ist. Das Hauptproblem für die Synthese des Disaccharids in weniger Reaktionsschritten ist die Einführung von Benzylgruppen in die Riboseeinheit.
Der Oligomerisierungsprozess der Disaccharid-Zwischenstufe könnte entweder in Lösung durchgeführt werden, mit der ernstzunehmenden unangenehmen Tatsache, dass die maximale Größe, welche erhalten werden könnte, auf 3–4 Repetiereinheiten beschränkt ist. Er könnte ebenfalls durch die Fest-Phasen-Chemie durchgeführt werden. Die Fest-Phasen-Chemie ermöglicht die Herstellung von Oligosacchariden im Bereich von 6 bis 10 Repetiereinheiten mit hohen Ausbeuten pro Zyklus. Gleichwohl sind die zwei ernstzunehmenden Probleme, welche für gewöhnlich vorliegen, die, dass die reale Ausbeute nur 10– 15% beträgt, da zum Erhalt einer hohen Einbringung einer Disaccharid-Zwischenstufe pro Zyklus ein hoher Überschuss an Disaccharid zwischen dem 3- bis 10-mol-fachen für gewöhnlich erforderlich ist. Der Überschuss an Disaccharid geht während des Prozesses verloren. Ein weiteres Problem ist das, dass zwei unterschiedliche Derivate für gewöhnlich erforderlich sind, eines zum Koppeln an den festen Träger, und das Zweite für die Verlängerung der Kette.
Die Synthese eines einzelnen reinen Oligosaccharidfragments, welches nicht nur keinen Unterschied bezüglich der Struktur aufweist, sondern ebenfalls keinen bezüglich der Kettenlänge, ist ein gängiger Aspekt bezüglich aller vorliegenden Berichte wie über die Synthese von Hib-Antigenen und war gleichzeitig eine ihrer Hauptziele. All dieses basierte auf der Annahme, dass das aus einem einzelnen Molekül bestehende Antigen notwendig ist, um Anti-Hib-Konjugat-Impfstoffe mit stabilerer Qualität aufgrund einer leichteren Kontrolle bzw. Regulierung zu erhalten.
Es wurden neue Verfahren zur Herstellung von Oligosaccharidfragmenten durch die Fragmentierung von natürlichen Polysacchariden und ebenfalls für die Aktivierung der Oligosaccharidmischung mittels einer ihrer endständigen Positionen entwickelt.
In den US-Patenten 4 808 700; US 4 761 283 sowie in Glycoconjugate J., 1989, 6, 489–498 (R. C. Seid, et al.) wird das natürliche Polysaccharid mit Peryodat oxidiert und die erhaltenen Fragmente gereinigt. Die Mischung aus Oligosaccharidfragmenten wird durch die zwei endständigen Positionen aktiviert, wie es in dem folgenden Schema gezeigt ist. Diese Oligosaccharide wurden durch eine reduktive Aminierungsreaktion an CRM 197 konjugiert. Wie aus dem Schema ersichtlich ist, sind beide Konjugationsstellen unterschiedlich. Sobald die Konjugation durchgeführt wurde, liegen mindestens zwei Familien an konjugierten Oligosacchariden mit unterschiedlichen Strukturen vor. Auf der anderen Seite bestimmt der Prozentwert des Oligosaccharids nicht sehr gut die Ergebnisse der Verknüpfung des gleichen Oligosaccharids an zwei unterschiedlichen Stellen des gleichen Proteins oder zu zwei unterschiedlichen Proteinmolekülen. Alle diese Phänomene erzeugen Heterogenität und machen die Kontrolle schwierig.
Auf der anderen Seite wird in dem US-Patent 5 153 312 sowie in Vaccine 1999, 17, 1251–63 (P. Constantino et al.) von der Hydrolyse des natürlichen Polysaccharids mit Essigsäure und von der Reinigung der resultierenden Mischung von Oligosaccharidfragmenten berichtet. Das Produkt wird durch eine Reihe von Reaktionen aktiviert, wobei der Spacer durch eine reduktive Aminierung mit Ethylendiamin bei einem hohen pH-Wert und hoher Temperatur eingeführt wird, welche die Integrität der Oligosaccharidmischung beeinflussen können. Auf der anderen Seite wird ein Teil des Antigens wahrscheinlich nach seiner Reduktion seines Carbonylhemiacetals inaktiviert, wie in dem folgenden Schema gezeigt. Ferner wurde das Oligosaccharidaminderivat selektiv mit dem aktiven Ester von Adipinsäure durch eine ihrer endständigen Esterfunktionen substituiert. Die andere Esterfunktion verbleibt für das Koppeln eines Proteins aktiv.
Die zwei Impfstoffe, welche aus Produkten der Fragmentierung des natürlichen Polysaccharids hergestellt worden waren, sind in der Immunisierungspraxis von großen Massen an Kindern verwendet worden. Dies hat gezeigt, dass es möglich ist, Oligosaccharid ohne eine einzelne Größe, sondern vielmehr in einem Größenbereich, bei der Herstellung von Konjugatimpfstoff gegen Hib zu verwenden, und gleichzeitig in angemessener Weise die Reproduzierbarkeit und die Qualität des Produkts zu regulieren. Selbst wenn das auf diese Weise erhaltene Konjugat definierter ist als jene, welche durch die direkte Aktivierung des Polysaccharids erhalten werden, ist es praktisch unmöglich, eine Fragmentierung des natürlichen Polysaccharids, gefolgt von der Einführung einer funktionellen aktiven Gruppe, durchzuführen und das gleiche Ausmaß von molekularer Bestimmtheit und Reinheit in dem Antigen zu erreichen, welche durch die chemische Synthese erhalten werden kann.
Es gibt keine offensichtlichen Vorteile bei der Kontrolle von Konjugatimpfstoffen mit der Verwendung entweder eines Oligosaccharids mit einer definierten Größe oder einer Mischung von Oligosacchariden in Bezug auf die Größe, jedoch homogen bezüglich des Restes ihrer Struktur. Dies wurde mit dem Fortschritt bezüglich analytischer Verfahren des Stands der Technik gezeigt, durch welche es sehr leicht ist, die Zusammensetzung einer Hib-Oligosaccharidmischung zu bestimmen (P. Constantino, et al., Vaccine 1999, 17, 1251–1263 und D. Prioeti, et al., European Carbohydrate Symposium, Galway, Juli 1999, PB014).
Auf der anderen Seite gibt es keine Unterschiede in dem immunologischen Verhalten zwischen einem Impfstoff, der aus einer Mischung von Größen von Hib-Oligosacchariden oder aus einer einzelnen Größe von Oligosaccharid besteht, wenn das Fragment größer als 3 Repetiereinheiten ist (S. Pillai, et al., Infection and Immunity, 1991, 59, 4371–6; A. A. Kandil, et al., Glycoconjugate J., 1997, 14, 13–7 und Peters CCAM, et al., Infect. Immunity 1991, 59, 3504–10).
Zusätzliche Umstände erschweren die Auswahl einer optimalen einzelnen Größe von allen Blickwinkeln aus. Die Oligosaccharide mit 4–6 Repetiereinheiten werden leichter synthetisiert, und ihre Größe ist für gewöhnlich ausreichend, um eine angemessene Immunantwort zu induzieren. Gleichwohl ist die Menge an Trägerprotein, die für diesen Impfstoff notwendig ist, sehr hoch, und die Stabilität des Oligosaccharids in dem Impfstoff ist schlechter, und zwar aufgrund des Abbauprozesses durch die Hydrolyse des Phosphodiesters, welcher sehr schnell ein sehr kurzes, an ein Protein gekoppeltes Fragment mit weniger als vier Repetiereinheiten hervorbringt und deswegen inaktiv ist. Die Fragmente mit einer Größe zwischen 8–20 Repetiereinheiten sind im Prinzip stabiler, da nach dem Abbau auf die Hälfte ihrer Größe das verbleibende Fragment, welches an dem Trägerprotein gebunden ist, größer als vier Repetiereinheiten sein wird. Die Menge an Trägerprotein, die für Impfstoffdosen notwendig ist, ist ebenfalls geringer.
Gleichwohl ist gemäß dem Stand der Technik für Oligosaccharide von Hib die Synthese von Fragmenten mit einer Größe zwischen 10–20 unmöglich mittels Lösungsverfahren und ist immer noch eine Herausforderung mittels Fest-Phasen-Verfahren. In der Tat sind bei früher berichteten Beispielen die Oligosaccharide dieser Größe vollständig abwesend. Ein weiterer Nachteil ist die T-Abhängigkeit der Immunantwort, ein sehr wichtiger Aspekt zum Erreichen einer guten Immunantwort in Kindern. Die T-Abhängigkeit eines Polysaccharids nimmt mit der Zunahme in der Größe ab (C. Fernández, E. Sverremark, Cell Immunol 1994, 153, 67–78).
Daraus folgt, dass jeder Weg der Synthese von Hib-Antigenen, der wettbewerbsfähig sein soll, die Anzahl von Schritten zu dem Schlüssel Disaccharid reduzieren muss, um die Anzahl an Chromatographieschritten zu verringern und speziell signifikant die Ausbeuten in dem Oligomerisierungsverfahren zu erhöhen.
Die Mischungen von Oligosacchariden, die durch die Hydrolyse der natürlichen Polysaccharide erhalten werden, enthalten Fraktionen von beiden Größenintervallen, wodurch der Vorteil von jedem genutzt wird und die Nachteile verringert werden. Wenn ähnliche Mischungen durch die Synthese erhalten werden könnten, führt dies zum Vorteil, dass beide Größenintervalle enthalten sind. Da diese Mischung durch Synthese entsteht, wird sie definierter und reiner sein, und wird den Spacer in einem präzisen Anteil und präziser Position enthalten.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die chemische Synthese von Oligosaccharidmischungen, die sich von Ribose-Ribit-Phosphat ableiten, welche als Hauptwirkstoff in Impfstoffen für die Prävention von durch Haemophilus influenzae Typ b (Hib) verursachten Infektionen verwendet werden, sowie die Impfstoffe, welche die Oligosaccharidmischungen enthalten.
Die Oligosaccharidmischungen, welche durch die chemische Synthese der vorliegenden Erfindung erhalten werden, umfassen Repetiereinheiten der Formeln (Phosphat-Ribose-Ribit)n oder (Ribose-Ribit-Phosphat)n aus mindestens 5 Verbindungen der Struktur A oder B, welche die Repetiereinheit des Kapselpolysaccharids von Haemophilus influenzae Typ b repräsentieren und sich nur durch n unterscheiden, wobei n ein Wert ist, welcher sich auf zwischen 4 bis 25 beläuft (n ≥ 4 und ≤ 25), und worin R₁ oder R₂ ein Spacer zur Konjugation an einen Träger ist, mit der Bedingung, dass R₁ = Spacer ist, wenn R₂ = H ist, oder R₂ = Spacer ist, wenn R₁ = H ist.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es möglich, durch chemische Synthese eine reguläre Mischung von Oligosacchariden einer gut definierten Größe und auf eine effizientere Weise zu erhalten. Diese Mischung besitzt eine höhere Reinheit, und sie wird unter Verwendung eines einfacheren technischen Verfahrens erhalten. Ebenfalls wurde herausgefunden, dass die konjugierten Impfstoffe, die aus der Mischung der Erfindung hergestellt werden, aufgrund ihrer Herstellung überlegener sind und einfacher zu regulieren sind.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das synthetische Verfahren, um die oben erwähnte Oligosaccharidmischung zu erhalten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Ein-Schritt-Verfahren ist, das in einer regulierten Polykondensationsreaktion zwischen einer Disaccharid-Schlüsselzwischenstufe, einem Spacer und einem Promoter besteht und ebenfalls durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass die Durchschnittsgröße des Antigens durch den Anteil jedes Teilnehmers, der Reihenfolge ihrer Zugabe und der Reaktionszeit reguliert werden kann.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Optimierung des synthetischen Verfahrens zu dem Schlüssel Disaccharid, welches für die Synthese von Hib-Oligosacchariden erforderlich ist. Die Optimierung besteht im Auffinden einer neuen selektiven Benzylierungsreaktion, welche, wenn sie auf das Disaccharid 4 angewendet wird, seine Transformation zum Disaccharid 5 ermöglicht, mit der Einführung von Benzylschutzgruppen in die Riboseeinheit in einem einzelnen Schritt, wodurch das gesamte Verfahren signifikant kürzer und einfacher wird.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die optimale Prozedur zur Synthese der Zwischenstufe 4, welche ihre Herstellung mit hoher Reinheit in nur 11 Reaktionsschritten und ohne die Anwendung von chromatographischen Verfahren ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der vorausgehend beschriebenen Oligosaccharide beim Nachweis und bei der Quantifizierung von Anti-Hib-Antikörpern durch ihre Konjugate mit immunologisch inerten Substanzen als Polyacrylamid, Polystyrol, Latex.
Die Neuheit der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung der erhaltenen Oligosaccharidmischung, welche sich auf die Repetiereinheit des Kapselpolysaccharids vom Haemophilus influenzae Typ b mit einem Spacer für die Konjugation in nur einer der endständigen Positionen, in einer in der Synthese vorentworfenen Position, bezieht. Es richtet sich auf die gleiche reguläre und homogene Struktur. Die Oligosaccharidmischung enthält Fragmente aus zwei unterschiedlichen Größenintervallen, hauptsächlich zwischen 4–8 und 8–20, wodurch die Vorteile von jedem Intervall genutzt werden und die Nachteile, welche jede Gruppe separat haben könnten, reduziert werden.
Ferner liegt die Neuheit der vorliegenden Erfindung in dem Verfahren selbst zur Herstellung von einer solchen Mischung durch chemische Synthese, wodurch die Herstellung des Produktes mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz ermöglicht wird. Auf die gleiche Weise wird durch die vorliegende Erfindung ebenfalls gezeigt, dass nur eine Reaktion zur Einführung von Benzylschutzgruppen in die Riboseeinheit in einem einzelnen Schritt führt, wodurch die Effizienz einer Herstellung eines Disaccharid-Schlüsselderivats für die Synthese von solchen Oligosacchariden erhöht wird.
Die Synthese einer Disaccharid-Zwischenstufe beginnt mit der Herstellung eines Derivats 5-O-allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribit 14 durch 9 chemische Reaktionen, die in dem folgenden Schema repräsentiert werden. D-Ribose-Wachs wurde zu dem Isopropyliden-Derivat 6 transformiert, gefolgt von der Prozedur, die bereits früher im Fachbereich beschrieben wurde (Leonart et al., J. Het. Chem., 1966, 3, 485). Die Position 5 wurde mit Allylbromid unter Phasentransferbedingungen allyliert, gefolgt von der Hydrolyse der Isopropylidengruppe mit Schwefelsäure in Methanol, um das Derivat 8 zu erhalten, welches einer Benzylierung mit Benzylchlorid und Natriumhydrid in Dimethylformamid zugeführt wurde.
Die Methylgruppe wurde mit einer Mischung aus Essigsäure und Chlorwasserstoffsäure hydrolisiert, gefolgt von der Reduktion mit Natriumborhydrid. Das Derivat 5-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-D-Ribit 11 wurde auf Silicagel absorbiert und selektiv mittels eines Perkolationsverfahrens zuerst mit Cyclohexan und dann mit Chloroform extrahiert. Diese Prozedur erlaubt die Reinigung in großem Maßstab, ohne auf herkömmliche chromatographische Verfahren zurückgreifen zu müssen.
Ferner wurde das Derivat 11 in Pyridin trityliert, mit Benzylchlorid und Natriumhydrid in Dimethylformamid benzyliert und schließlich mit Essigsäure hydrolisiert, wodurch man das letztendliche Ribitderivat erhielt, welches mittels Destillation gereinigt wurde. Das Ribitderivat 14 wurde mit einem Ribofuranoseperacetat 15 ribosyliert, wie es im folgenden Schema gezeigt ist. Nach der Deacetylierung folgt eine neue Anwendung eines Absorptions-Desorptions-Verfahrens, was dazu führt, dass Triol 4 in hohem Maßstab erhalten wird, und zwar ohne irgendwelche herkömmlichen chromatographischen Schritte.
Dann wird es der Dibenzylierungsreaktion, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, zu Triol 4 zugeführt. Diese Reaktion führt dazu, dass das Derivat 5 nach einem Säulenchromatographie-Reinigungsverfahren erhalten wird. Die Allylgruppe der Zwischenstufe 5 wurde zu Propenyl isomerisiert, gefolgt von der Einführung von Phosphonat an der freien 3-Position der Riboseeinheit. Die Entfernung der Propenylgruppe ergab das Zwischenstufen-Schlüsselderivat 19. In gleicher Weise führte die Acetylierung der Hydroxyfunktion an der Position 3 in dem Derivat 17, gefolgt von der Hydrolyse von Propenyl, der Einführung des Phosphonats an der Position 5 und der Deacetylierung des Produkts, zum Schlüsseldisaccharid 23, welches Phosphonat an der Position 5 und eine freie Hydroxyfunktion an der Position 3 besitzt.
Die Struktur der gebildeten Produkte wurde in allen Fällen durch ¹H- und ¹³C-Kernmagnetresonanz und durch H-H- und H-X-Korrelationsexperimenten bestätigt. Die Reinheit wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie oder mittels HPLC geprüft.
Ausgehend von den Derivaten 18 oder 22 können die Derivate 24 und 25 erhalten werden, welche als Akzeptoren in der Polykondensationsreaktion ebenfalls verwendet werden, wie gezeigt werden wird.
Die Oligomerisierungsreaktion wurde unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht, immer auf der Basis von nur drei Komponenten, einem Schlüsseldisaccharid (19 oder seinem Analog 23), einem Promoter der Reaktion, welcher Pivaloylchlorid, Adamantan-1-carbonylchlorid oder ein anderes sterisch gehindertes Säurechlorid sein kann, und eine dritte Komponente, welche die Reaktion unterdrücken kann und gleichzeitig den Spacer einführen kann. Diese Komponente enthält die funktionelle aktive Gruppe oder ihren Vorläufer in einer endständigen Position, wie zum Beispiel 24, 25 oder 26.
Als ein Spacer, welcher im Fall von 24, 25 oder 26 5-Azido-3-oxapentanol ist, können jedwede anderen Verbindungen mit der allgemeinen Formel R₁-Y-OH verwendet werden, worin Y die Spacerkette ist, welche eine aliphatische Kette sein kann. Die aliphatische Kette kann eine aromatische Kette einschließen, welche in dieser eingefügt ist, oder eine Anzahl von Heteroatomen, die zwischen 0–5 schwanken. R₁ ist eine funktionelle Gruppe in der endständigen Position des Spacers und kann NH₂, COOR, CHO, SH oder ein beliebiger ihrer Vorläufer sein.
Die optimalen Bedingungen für das Polykondensationsverfahren wurden für mehrere Fälle entwickelt, zum Beispiel mit dem Disaccharid 19, dem Spacer 5-Azido-3-oxapentanol 26 und Pivaloylchlorid in Dichlormethan-Pyridin, was zu einem Produkt führt. Eine Oligomere 27 enthaltende Fraktion kann in einer Ausbeute von 70–85% erhalten werden, basierend auf Disaccharid, und zwar nach der Oxidation und LH-20-Gel-Chromatographie in LH-20 in Methanol.
Die Oligosaccharidmischung 27 wurde in Methanol-Ethyl-Acetat-Wasser-Essigsäure in Gegenwart von Palladium-auf-Kohlenstoff hydriert, wodurch man die Roh-Oligosaccharidmischung 28 erhielt. Wenn die Spacergruppe aktiviert werden muss, wird der Prozess besser im nächsten Schritt durchgeführt. Zum Beispiel wurde zu der Mischung von Oligomeren 28 N-Hydroxysuccinimidylester von β-Maleimidopropionsäure in Dimethylformamid gegeben. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde die resultierende Lösung mit destilliertem Wasser verdünnt und diafiltriert unter Stickstoffdruck durch eine Membran mit einem Cut-off-Wert von 1 000. Das so erhaltene Produkt 30 ist eine aktive Oligosaccharidmischung, die für den Einsatz in den Konjugationsprozess fertig ist.
Die Struktur der gebildeten Produkte wurde in allen Fällen durch ¹H- und ¹³C-Kernmagnetresonanz und mittels H-H- und H-X-Korrelationsexperimenten bestätigt.
Die Proteine wurden mit Thiopropionsäure derivatisiert und zwar durch die Einführung von als ein Bisulfid maskiertes Thiol. Für diese Derivatisierung können Reagenzien wie SPDP oder DSP verwendet werden, gefolgt von der Reaktion mit Dithiotreitol in einer Stickstoffatmosphäre. Ein Reagenzienüberschuss kann für Neisseria meningitidis OMP oder für Tetanustoxoid durch die Präzipitation mit wässrigem Ethanol (20–95%), gefolgt von einer Zentrifugation, eliminiert werden. Für Neisseria meningitidis OMP ist das Verfahren, welches ausgeführt wurde, im folgenden Schema veranschaulicht.
Das thiolierte Protein wird in einer inerten Atmosphäre mit dem aktiven Oligosaccharid gemischt, im Voraus durch 0,2-Mikrometer filtriert und lyophilisiert. Die Reaktion wurde durch Ethanolpräzipitation abgelöscht bzw. unterdrückt, gefolgt von einer Zentrifugation und Diafiltration.
Alternativ kann der Überschuss an aktivierenden Reagenzien von dem Konjugat durch Diafiltration entfernt werden. Beide Separationsprozesse eliminieren fast das ganze Nicht-Konjugat-Oligosaccharid an dem Protein, was die Qualität des Endprodukts sehr stabil macht.
Die Mischung von Oligosacchariden 30 kann an andere Träger konjugiert werden, zum Beispiel Lipide. Somit führt zum Beispiel die Reaktion mit 2,3-Dioctadecyloxipropylsuccinimidylbutandioat 33 in Gegenwart von Carbodiimid zum Erhalt des Konjugats 34.
Das Konjugat der synthetischen Oligosaccharidmischung und Proteine kann verdünnt werden oder in einem angemessenen physiologischen Puffer rekonstituiert werden und kann mit Additiven, wie Hilfsstoffen, Konservierungsmitteln und anderen gemischt werden, und zwar mit dem Ziel, die letztendliche Impfstoffformulierung zu erhalten.
In entsprechender Weise kann der Impfstoff vor oder während des Formulierungsverfahrens mit anderen Impfstoffen gemischt werden, welche von dem Typ sind, die derzeit im Immunisierungsplan für Kleinkinder unter einem Alter von einem Jahr verwendet werden. Zum Beispiel kann das Mischen mit den Außenmembranproteinen von Neisseria meningitidis Typ B (OMP), einem kombinierten Impfstoff Anti-Hib und Anti-Meningitis Typ B, durchgeführt werden. Nach dem Mischen mit DTP kann ein kombinierter tetravalenter Impfstoff erhalten werden, Anti-Hib und Anti-Diphtherie, Pertussis und Tetanus.
Die Immunogenität des Konjugatimpfstoffes zwischen Oligosacchariden 30 und meningococcalen Außenmembranproteinen wurde in mehreren Tiermodellen gezeigt. Die Anwesenheit von Antikörpern gegen das Hib-Kapselpolysaccharid, welches durch den Impfstoff induziert wurde, wurde unter Verwendung des ELISA-Verfahrens detektiert (D. C. Phipps et al., J. Immunol. Methods, 1990, 135, 121–8). Die Ergebnisse sind in der 2–5 gezeigt.
In Kaninchen induziert der ohne Aluminiumoxid formulierte Impfstoff eine höhere Antwortreaktion bei den ersten Dosen. Gleichwohl werden beide Präparationen gleich nach den zweiten Dosen. In beiden Fällen wurde ein hoher Antikörper-Titer festgestellt.
In dem Beispiel von Sprague-Dawley-Ratten zeigte der Impfstoff, der aus den zwei Konjugaten, die im Kohlenhydrat-Protein-Verhältnis differierten, ebenfalls hohe Anti-Hib-Antikörper-Titer.
In Balb-c-Mäusen induzierte der aus einem ähnlichen Konjugat erhaltene Impfstoff hohe Anti-Kapsel-Polysaccharid-Antikörper-Titer.
Die Mischung von Oligosacchariden 30 kann an Matrizen, wie zum Beispiel Polyacrylamid, gekoppelt werden. Das Produkt kann zum Nachweis von Anti-Hib-Antikörpern in immunisierten Menschen oder in Labortieren verwendet werden. Die Mischung kann ebenfalls an Latex gekoppelt werden und beim Nachweis von Antikörpern bei kranken oder geimpften Menschen verwendet werden. Das Polyacrylamid, welches gemäß N. Bovin (Glycoconjugate J., 1998, 15, 431–446) aktiviert worden war, reagierte mit einer Mischung aus Oligoacchariden 30. Die vergleichende Fähigkeit von HbO-HSA, die empfohlene Substanz für den Nachweis von Anti-Hib-Antikörpern, und das Polyacrylamid-Konjugat von 30, ist in der 6 gezeigt. Ein besseres Antwort-Rausch-Verhältnis wurde mit dem Produkt erreicht, welches die synthetischen Oligosaccharide enthielt.
ARBEITSBEISPIELE:
BEISPIEL 1: Synthese von 5-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-D-ribit 11.
Allylierung: 100 g Methyl 2,3-O-isopropyliden-D-ribofuranosid wurden in 70 mL Allylbromid gelöst und in Gegenwart von 75 mL wässrigen 50%igem Natriumhydroxid und 2,6 g Tetrabutylammoniumiodid während 12 Stunden gerührt. Danach wurde das Rühren gestoppt, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (70 mL) extrahiert, und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet und abgedampft.
Hydrolyse: Der resultierende Sirup wurde in 1,5 L Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3,6 mL wässrige Schwefelsäure (0,4 N) hinzugegeben, und die Mischung wurde 3 Stunden am Rückfluss gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert, und die resultierenden Salze wurden filtriert, und die Lösung wurde abgedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet und abgedampft. Das Produkt wurde im Vakuum mindestens 2 Stunden lang getrocknet.
Benzylierung: Das erhaltene Produkt wurde in 450 mL Dimethylformamid geöst. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und 50 g Natriumhydrid wurden langsam hinzugesetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, und dann wurde Benzylchlorid hinzugetropft (150 mL). Nach 2 Stunden Rühren wurden 20 mL Methanol der Reaktion hinzugesetzt. Die resultierende Suspension wurde im Vakuum abgedampft, erneut in Dichlormethan gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.
Hydrolyse: Der resultierende Sirup aus der vorhergehenden Reaktion wurde in 1,5 L Dioxan gelöst. HCl (2 N, 1,5 L) wurde hinzugesetzt, und das System wurde bei 75–80°C erhitzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde zweimal mit 200 mL Dichlormethan extrahiert, und die vereinigte organische Phase wurde abge dampft. Das konzentrierte Produkt wurde in Dichlormethan (1 L) gelöst und der Reihe nach mit Wasser (400 mL), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (300 mL) und Wasser (400 mL) gewaschen und schließlich mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.
Reduktion: Der resultierende Sirup wurde in Ethanol (800 mL) gelöst, und das System wurde auf 20°C gekühlt. Dann wurden 24 g NaBH₄ hinzugesetzt. Die Mischung wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und nachdem die Reaktion beendet war, wurde der Überschuss an Borhydrid mit Essigsäure zerstört, bis ein pH-Wert von 7 bis 8 erreicht war. Die Lösung wurde filtriert und abgedampft. Der Rückstand wurde in 500 mL Dichlormethan gelöst, die organische Lösung wurde mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im folgenden Beispiel verwendet.
Beispiel 2: Reinigung von 5-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-D-ribit 11.
Zu der Dichlormethanlösung von rohem 5-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-D-ribit 11 aus dem vorhergehenden Beispiel wurden 300 g Silicagel gegeben, und die Mischung wurde per Hand gerührt, bis das Produkt in der festen Phase adsorbiert war. Die Suspension wurde im Vakuum zur Entfernung von Dichlormethan abgedampft. Das Silicagel, welches das Produkt enthielt, wurde in einen Percolator gestellt. Die Verunreinigungen wurden durch Extraktion mit Cyclohexan während 48 Stunden entfernt. Das Lösungsmittel zur Extraktion wurde zu Dichlormethan zur Extraktion des Produkts ausgetauscht, wodurch ein chromatographisch reiner blassgelber Sirup erhalten wurde. Ausbeute: 75–95%. ¹³C-NMR: δ 60,7 (C-1), 70,2 (C-4), 71,0, 71,7, 72,0, 73,6 (PhCH₂C-5, OCH₂CH=), 79,2, 79,3 (C-2, 3), 117,1 (CH₂=), 127,5–128,2 (Ph), 134,3 (CH=), 138,0, 138,1 (Cipso).
BEISPIEL 3: Synthese von 5-O-allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribit 14
Trytilierung: 100 g 5-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-D-ribit 11 von dem vorhergehenden Beispiel wurden im Vakuum getrocknet und in 600 mL Pyridin gelöst. Zu dieser Lösung wurden 75 g Chlortriphenylmethan und 0,5 g Dimethylaminopyridin gegeben, und die Mischung wurde bei 50°C 6 Stunden lang gerührt. Sobald die Reaktion beendet war, wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand wurde in 500 mL Dichlormethan gelöst, die Lösung wurde mit Wasser (1 L) gewaschen, getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wurde im Vakuum 3 Stunden lang getrocknet.
Benzylierung: Der Sirup aus der vorangehenden Reaktion wurde in 300 mL Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wurde auf 5°C gekühlt. Natriumhydrid (25 g) wurde langsam hinzugesetzt, und das Rühren wurde dann 30 Minuten lang fortgesetzt. Benzylchlorid (40 mL) wurde dann langsam hinzugesetzt, und das Rühren wurde eine Stunde lang beibehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde es erneut gekühlt und 10 mL Methanol wurden langsam hinzugesetzt, um den Überschuss an Reagenzien zu zerstören. Die Lösungsmittel wurden abgedampft, und der Rückstand wurde in 500 mL Dichlormethan gelöst, mit 1 Liter Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.
Hydrolyse: Der Rückstand wurde in Essigsäure (1 L) und 110 mL Wasser gelöst, und die Reaktion wurde bei 80°C 1,5 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Abdampfung entfernt, und der Rückstand wurde in 500 mL Cyclohexan gelöst. Die organische Phase wurde auf 0–5°C 4 Stunden lang gekühlt und dann filtriert, mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft. Das Produkt wurde mittels Destillation bei 200–220°C und 0,1 mm rein erhalten. Ausbeute 80–90 g Base auf 100 g Ribose. ¹³C-NMR: δ 61,2 (C-1), 69,6, 71,8, 72,1, 72,3, 73,9 (PhCH₂C-5, OCH₂CH=), 78,0, 78,8, 78,9 (C-2, 3, 4), 116,8 (CH₂=), 127,5–128,2 (Ph), 134,7 (CH=), 138,0, 138,1, 138,2 (Cipso).
BEISPIEL 4: Synthese von 5-O-Allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-O-(β-D-ribofuranosyl)-D-ribit 4.
Glycosylierung: Das Produkt des vorausgehenden Beispiels (370 g) wurde in 2,7 L getrocknetem Dichlorethan gelöst und in einen Reaktor gegeben. Die Lösung wurde auf 0 bis 25°C gekühlt, pulverförmige Molekularsiebe 4 Å (207 g) wurden hinzugesetzt, und nach 15 Minuten wurde Bortrifluoridetherat (407 mL) langsam bei 15 mL/min. hinzugesetzt. Schließlich wurde D-Ribofuranoseperacetat 15 (370 g), gelöst in getrocknetem Dichlorethan (1 L), langsam während 20 Minuten hinzugesetzt. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang gerührt und mittels TLC mit Hexanen/Ethylacetat (2/1) überwacht. Die Platten wurden entwickelt durch Verkohlung mit 5%iger H₂SO_4(c) in Ethanol. Sobald die Reaktion beendet war, wurde mit Triethylamin (222 mL) auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert, und dann wurde eine gesättigte Lösung von Natriumbicarbonat (800 mL) hinzugesetzt, und das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. Der pH-Wert der Reaktion muss auf Neutralität gehalten werden. Der Inhalt des Reaktors wurde im Vakuum filtriert. Der Feststoff wurde zweimal mit Dichlorethan (200 mL) gewaschen, um jedwedes restliche Produkt in dem Feststoff zu extrahieren. Die feste Phase wurde verworfen, und die organische Phase wurde zweimal mit Wasser 600 mL extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum abgedampft.
Deacetylierung: Zu dem resultierenden Sirup aus der vorhergehenden Reaktion, gelöst in Methanol (2 L), wurde eine Lösung von Natriummethoxid (1%) in Methanol hinzugegeben, bis der pH-Wert 9 erreichte. Die Reaktion wurde fast 2 Stunden lang fortgesetzt. Sobald beendet, wurde die Reaktion mit Säureharz neutralisiert, bis ein pH-Wert von 6–7 erreicht wurde. Das Harz wurde mittels Filtration im Vakuum eliminiert. Der Sirup (427 g) enthielt das gewünschte Produkt zusammen mit 5-O-Allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribit, D-Ribose und anderen nicht bestimmten Verunreinigungen.
BEISPIEL 5: Reinigung von 5-O-Allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-O-(β-D-ribofuranosyl)-D-ribit 4.
Der Sirup des vorangehenden Beispiels wurde in Dichlormethan (1 L) gelöst. Zu der Lösung wurde Silicagel (1 kg) gegeben, und die Mischung wurde per Hand so lange gerührt, bis das Produkt in der festen Phase adsorbiert war. Die Suspension wurde im Vakuum zur Eliminierung von Dichlormethan abgedampft. Der resultierende Feststoff wurde im Vakuum 2 Stunden lang zur Entfernung von jedweden Spuren an Dichlormethan getrocknet.
Das Silicagel, welches das Produkt enthielt, wurde in einen Percolator gestellt. Die Verunreinigungen wurden mittels Extraktion mit Cyclohexan 48 Stunden lang entfernt. Das Lösungsmittel zur Extraktion wurde zu Chloroform zur Extraktion des Produkts ausgetauscht, wodurch man einen blassgelben Sirup erhielt. Ausbeute 238 g. ¹H-NMR: δ 5,85 (m, 1H, CH=), 5,20 (m, 2H, CH₂=), 4,85 (s, 1H, H-1'), ¹³C δ 62,8 (C-5'), 77,7, 77,9, 78,2 (C-2, 3, 4), 84,0 (C-4'), 107,2 (C-1').
BEISPIEL 6: Synthese von 5-O-allyl-2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(β-D-2',5'-di-O-benzyl-ribofuranosyl)-D-ribit 5.
Benzylierung: Die Verbindungen (200 g), welche aus dem vorangehenden Beispiel resultierten, wurden in Toluol (2 L) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Bu₂SnO (80 g) gegeben, und die Mischung wurde 4 Stunden lang am Rückfluss gehalten. NaH 50% (56 g) wurde in kleinen Portionen bei Raumtemperatur hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei 80°C 30 Minuten lang gerührt. Tetrabutylammoniumjodid (62 g) wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde erneut 1 Stunde lang gerührt. Benzylchlorid wurde dann hinzugegeben (148 mL), und die Reaktion wurde unter Rühren bei 80°C mehrere Stunden lang fortgesetzt. Ähnliche Zugaben an Benzylchlorid wurden in einem Intervall von 30 Minuten so lange wiederholt, bis die TLC (Hexane/Ethylacetat – 2/1) ein Hauptprodukt anzeigte, das aus einem dibenzylierten Disaccharid bestand. Die Reaktion wurde gekühlt und mit einer methanolischen Lösung von 1% HCl neutralisiert. Dann wurde die Reaktion durch Celite filtriert und unter reduziertem Druck abgedampft. Das resultierende Produkt, welches einige Salze enthielt, wurde in Ethylacetat gelöst, bei reduziertem Druck filtriert und konzentriert. Der rohe Sirup wurde mittels Säulenchromatographie in einem Lösungsmittelsystem aus Toluol-Aceton 60/1 gereinigt. Reines 5 wurde als ein Sirup erhalten (100 g). ¹H-NMR: δ 5,96 (m, 1H, -CH=), 5,18 (m, 2H, CH₂=), 5,02 (s, 1H, H-1).
BEISPIEL 7: Synthese von 2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(β-D-2',5'-di-O-benzyl-3'-O-triethylammoniumphosphonat-ribofuranosyl)-D-ribit (19).
Isomerisierung der Allylgruppe: 20 g des resultierenden Sirups aus dem vorhergehenden Beispiel wurden in hohem Vakuum 2 Stunden lang getrocknet. Der Sirup wurde in getrocknetem Dimethylsulfoxid (100 mL) gelöst und Kalium-t-Butoxid (6,4 g) wurde hinzugesetzt. Die Reaktion wurde bei 100°C eine Stunde lang gerührt, und dann wurden 250 mL Eis-Wasser hinzugesetzt. Konzentrierte Chlorwasserstoffsäure wurde Tropfen für Tropfen hinzugegeben, bis ein pH-Wert von 7 erreicht war. Die Mischung wurde dreimal mit 80 mL Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.
Phosphonylierung: Eine Lösung von Imidazol (1,5 g) in getrocknetem Acetonitril (34 mL) wurde auf 0°C gekühlt. Phosphortrichlorid (0,56 mL) und Triethylamin (3,1 mL) wurden hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde 15 Minuten lang gerührt. Das Disaccharid aus der vorhergehenden Reaktion wurde dieser Mischung, gelöst in getrocknetem Acetonitril (3 mL), hinzugegeben. Die resultierende Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, und sie wurde durch Zugabe einer 1 M-Lösung an Triethylammoniumbromid gestoppt. Das Rühren wurde 10 Minuten lang fortgesetzt, das Dichlormethan wurde hinzugegeben und die Phasen wurden abgetrennt. Die organische Phase wurde mit kalter Lösung an Triethylammoniumbicarbonat gewaschen, getrocknet und abgedampft.
Hydrolyse der Propenylgruppe: Das Produkt wurde in 60%iger Essigsäure gelöst und bei 70°C 30 Minuten lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Abdampfung entfernt, und das Produkt wurde in Dichlormethan gelöst, mit Triethylammoniumbicarbonat gewaschen, getrocknet und abgedampft. Die Säulenchromatographie des resultierenden Produkts ergab die reine Verbindung mit einer Ausbeute zwischen 70–85%. ¹H-NMR: δ 6,85 (d, H-P), 4,95 (s, H-1), 4,60 (m, H-3), 2,93 (q, NCH₂CH₃) 1,20 (t, NCH₂CH₃). ¹³C δ 105,9 (C-1).
BEISPIEL 8: Polykondensationsreaktion zwischen 19 und 26 (Verhältnis 10–1).
Zu einer Lösung der Verbindung 19 (1 g) in Pyridin-Triethylamin (10–1, 1 mL) wurde Trimethylacetylchlorid (0,14 mL) gegeben, und die Reaktion wurde 20 Minuten lang gerührt. Der Spacer 26 (29,2 mg) wurde hinzugegeben, und eine neue Menge an Trimethylacetylchlorid (0,9 mL) wurde hinzugesetzt, und die Reaktion wurde eine Stunde lang gerührt. Eine Lösung von I₂ (1,1 g) in Pyridin-Wasser wurde hinzugegeben (7,3 mL; 20–1), und die Reaktion wurde 30 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde mit Dichlormethan verdünnt, mit Lösungen an Natriumthiosulfat (1 M) und mit einer kalten Lösung von Triethylammoniumbromid (0,5 M) gewaschen, dann mit Natriumsulfat getrocknet und abgedampft. Das resultierende Produkt wurde in Methanol gelöst und auf einer Sephadex LN-20-Säule im gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Die Fraktionen, welche die Oligomeren enthielten, wurden vereinigt und abgedampft. Ausbeute 80%.
BEISPIEL 9: Polykondensationsreaktion zwischen 19 und 26 (Verhältnis 10–1).
Zu einer Lösung der Verbindung 19 (1 g) und des Spacers 26 (14,6 mg) in Pyridin-Triethylamin (10–1, 1 mL) wurde Trimethylacetylchlorid (0,23 mL) gegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt. Eine Lösung von I₂ (1,1 g) in Pyridin-Wasser wurde hinzugesetzt (7,3 mL; 20–1) und das Produkt wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 8 behandelt.
BEISPIEL 10: Polykondensationsreaktion zwischen 19 und 26 (Verhältnis 5–1).
Zu einer Lösung der Verbindung 19 (1 g) und des Spacers 24 (29,2 mg) in Pyridin-Triethylamin (10–1, 1 mL) wurde Trimethylacetylchlorid (0,23 mL) gegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt. Eine Lösung von I₂ (1,1 g) in Pyridin-Wasser wurde hinzugesetzt (7,3 mL; 20–1) und das Produkt wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 8 gewaschen.
BEISPIEL 11: Polykondensationsreaktion zwischen 23 und 26 (Verhältnis 5–1, Lösungsmittel Pyridin).
Zu einer Lösung von Verbindung 23 (1 g) und dem Spacer 26 (29,2 mg) in Pyridin (1 mL) wurde Trimethylacetylchlorid (0,23 mL) gegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt. Eine Lösung von I₂ (1,1 g) in Pyridin-Wasser wurde hinzugesetzt (7,3 mL; 20–1), und das Produkt wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten.
BEISPIEL 12: Polykondensationsreaktion zwischen 19 und 24 (Verhältnis 5–1, Lösungsmittel Pyridin).
Zu einer Lösung von Verbindung 19 (1 g) und dem Spacer 24 (29,2 mg) in Pyridin (1 mL) wurde Trimethylacetylchlorid (0,23 mL) gegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt. Eine Lösung von I₂ (1,1 g) in Pyridin-Wasser wurde hinzugesetzt (7,3 mL; 20–1), und das Produkt wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten.
BEISPIEL 13: Hydrierungsreaktion der Produkte von den Beispielen 8 bis 12.
Das rohe Produkt der vorausgehenden Beispiele 8–12 wurde in einer Mischung aus Ethylacetat-Ethanol-Wasser-Essigsäure (1–2–2–0,1) mit 10% Palladium-auf-Kohlenstoff hydriert. Schließlich wurde das Produkt mittels Ionenaustauschchromatographie auf Sephadex C-25 Na gereinigt. Das lyophilisierte Produkt wurde mittels NMR charakterisiert, und es zeigte die grundlegende (Basic) Repetiereinheit Rib-Rib-Phosphat und den Spacer. Aktive Fraktionen wurden nach einer Diafiltration und einem Ultrafiltrationsprozess, zuerst durch eine Membran mit einem Cut-off-Wert von 1 000 und durch eine Membran mit einem Cut-off-Wert von 10 000 bezüglich des Retentats erhalten. Die Lösung, welche durch die 10 000-Membran ging, wurde vereinigt und lyophilisiert, wodurch das letztendliche 28 mit einer Gesamtausbeute, die von den Reaktionsbedingungen abhängig war, zwischen 20–80%, basierend auf dem abgetrennten Disaccharid, erhalten wurde. ¹H-NMR δ 5,12 (H-1), 4,60 (H-3), 3,29 (CH₂NH₂). ³¹P δ 2,14 (spac-P-Rib) 0,74 (Ribit-P-Rib).
BEISPIEL 14: Synthese eines Derivats von 5-(3-Maleimidopropionamido)-3-oxapentyl-oligo-ribosil-ribit-phosphat 30
Zu einer Lösung des vorangehenden Beispiels (3,34 mg, 1,73 μmol) in bidestilliertem Wasser (0,1 mL) wurden 0,7 mg (2,62 μmol) N-hydroxysuccinimidyl-β-maleimidopropionat 27, gelöst in N,N-Dimethylformamid (0,4 mL), gegeben. Nach 4 Stunden der Reaktion wurde die Lösung im Vakuum abgedampft, erneut in destilliertem Wasser suspendiert (0,5 mL) und zentrifugiert (10 Minuten, 3 500 Umdrehungen pro Minute). Der Überstand wurde mit Wasser verdünnt und in eine Amicon-Gerätschaft mit einer Cut-off-Membran von 1 000 ultrafiltriert. Das Retentat wurde lyophilisiert. Die Ausbeuten lagen zwischen 85 und 95%. ¹H-NMR: δ 6,95 (s, 2H, CH=CH), 5,01 (s, H-1) 3,41 (t, 2H, CH₂NH), 2,56 (t, 2H, CH₂a).
BEISPIEL 15: Analyse der aus dem Beispiel 13 mittels Ionenaustauschchromatographie erhaltenen Produkte
Die Produkte von Beispiel 8–12 hydriert und als ein Natriumsalz, wurden mittels Ionenaustauschchromatographie in einer HR5/5 Mono Q-Säule mit einem linearen Gradienten von Natriumchlorid analysiert (P. Constantino, y col., Vaccine 1999, 17, 1251–1263). Das chromatographische Elutionsprofil von Beispiel 8 wird in der 1B repräsentiert und zeigt Fragmente in verschiedenen Größen. Wenn sie mit den Ergebnissen verglichen werden, die in der Literatur und in der 1A, welche ein Chromatogramm eines Pentameren zeigt, angegeben sind, kann daraus geschlossen werden, dass in der Mischung Fragmente mit 4–5 Repetiereinheiten bis mehr als 20 vorliegen.
BEISPIEL 16: Konjugation an Neisseria meningitidis-Außenmembranprotein.
Neisseria meningitidis Außenmembranprotein-Komplex (OMPC) 400 mg wurde in 80 mL PBS-Puffer, pH 8, der vorher mit N₂ (g) gespült worden war, gelöst. Die Lösung wurde mit N₂ (g) 5 Minuten lang unter Rühren in einem Eis-Wasser-Bad gespült. 1,6 mL einer Lösung von DSP in Dimethylformamid wurde hinzugesetzt und die Mischung wurde langsam bei 4°C 2 Stunden lang gerührt. 1,6 mL Lösung von DTT in PBS wurde hinzugesetzt, und das Rühren wurde bei 4°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Die resultierende Suspension wurde in einen Zentrifugenkolben, der 20–400 mL kaltes Ethanol enthielt, überführt. Der Kolben wurde bei 1 800 Umdrehungen pro Minute und bei 4°C 30 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Eine neue Portion an Ethanol wurde dem Feststoff hinzugesetzt, und der Zentrifugationsprozess wurde erneut wiederholt nach Zugabe von 200–400 mL Ethanol. Das Präzipitat wurde erneut in 80 mL PBS-Puffer, pH = 7–9 suspendiert. Zu der resultierenden Lösung wurde das synthetische Oligosaccharid 30 hinzugesetzt, und das Rühren wurde 1–48 Stunden lang fortgesetzt. Sobald der Prozess abgeschlossen war, wurden die ethanolischen Präzipitations-Zentrifugations- Vorgänge wiederholt, gefolgt von einer Diafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Cut-off-Wert von 30 000. Das Retentat wurde in einem PBS-Puffer zu einer Konzentration von Hib von 40–80 μg pro mL aufgenommen.
BEISPIEL 17: Konjugation an Tetanustoxoid.
Eine Lösung von Tetanustoxoid bei einer Konzentration von 5 mg/mL in PBS, pH 8, wurde mit N_2(g) 5 Minuten lang gespült. Unter Aufrechterhalten des Rührens in einem Eis-Wasser-Bad wurden 1,6 mL einer Lösung von DSP in Dimethylformamid hinzugesetzt, und die Mischung wurde sanft bei 4°C 2 Stunden lang gerührt. 1,6 mL Lösung von DTT in PBS wurde hinzugesetzt und das Rühren wurde bei 4°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Die resultierende Lösung wurde in eine Ultrafiltrationsgerätschaft mit einer Cut-off-Membran von 10 000 überführt. Die Lösung wurde mehrere Male diafiltriert mittels Hinzugabe von frischem Puffer, welcher vorher mit N_2(g) gespült worden war, bis die Lösung, welche durch die Membran ging, gegenüber einem Elman-Test negativ war. Zu der resultierenden Lösung wurde das synthetische Oligosaccharid 30 gegeben und das Rühren wurde 1–48 Stunden lang fortgesetzt. Sobald das Verfahren abgeschlossen war, wurde die Lösung erneut solange diafiltriert, bis die Lösung, welche durch die Membran ging, gegenüber einem Phenol-Schwefelsäure-Test für Zucker negativ war. Schließlich wurde die Lösung in PBS-Puffer auf eine Konzentration von Hib 40–80 μg pro mL aufgenommen.
BEISPIEL 18: Konjugation an Dioctadecilglycerolhemisuccinat.
Das Produkt von Beispiel 8 (10 mg) wurde in 1 mL Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von Dioctadecilglycerolhemisuccinat als N-Hydroxysuccinamidester 31 gegeben. Zu der Lösung wurde Ethyldiaminopropylcarbodiimid (5 mg) gegeben, und die Reaktion wurde 6 Stunden lang gerührt. Eine neue Portion an Carbodiimid wurde hinzugesetzt und das Rühren wurde 6 Stunden lang fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und die Mischung wurde auf eine C18-Silicagel-Säule (1 g) gegeben. Die Elution mit Wasser entfernte das Oligosaccharid. Das Produkt wurde mit einem Konzentrationsgradienten von Methanol-Wasser eluiert. Ausbeute: 85%. ¹H-NMR: δ 5,12 (H-1), 4,60 (H-3), 3,40 (CH₂NH), 1,30 (CH₂), 0,90 (CH₃).
BEISPIEL 19: Herstellung eines Impfstoffes ohne Hilfsstoff.
Das Immunogen des Beispiels 16, gelöst in einem Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 40 μg pro mL, wurde unter aseptischen Bedingungen bei 4–8°C mit einer Lösung aus bidestilliertem Wasser verdünnt. Die Suspension wurde 10 Minuten lang gerührt. Die Endkonzentration an Hib-Antigen wurde durch Abschätzung der Ribose und der Gesamtproteine bestimmt und konnte erneut eingestellt werden, indem mehr Pufferlösung hinzugesetzt wurde, bis eine Hib-Antigen-Endkonzentration von 20 mg pro mL erhalten wurde. Tiomersal wurde auf eine Endkonzentration von 0,1–0,001% hinzugesetzt. Die resultierende Suspension ist die Endmasse eines Anti-Hib-Konjugat-Impfstoffes ohne Hilfsstoff.
BEISPIEL 20: Herstellung von Anti-Hib-Impfstoff in Aluminiumoxid als Hilfsstoff.
Das Immunogen des Beispiels 16, gelöst in einem Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 40 μg pro mL, wurde unter aseptischen Bedingungen bei 4–6°C mit einem gleichen Volumen an Aluminiumoxid 1–0,01 mg pro mL in destilliertem Wasser gemischt. Das Rühren wurde 20 Minuten bei 4–8°C aufrechterhalten. Die Endkonzentration an Hib wurde bestimmt, indem Ribose und Gesamtproteine abgeschätzt wurden, und sie konnte erneut eingestellt werden, indem mehr Pufferlösung hinzugesetzt wurde, bis eine Antigen-Hib-Endkonzentration von 20 mg pro mL erhalten wurde. Tiomersal wurde auf eine Endkonzentration von 0,1 bis 0,001% hinzugesetzt. Die resultierende Suspension ist die Endmasse eines Anti-Hib-Konjugat-Impfstoffes in Aluminiumoxid.
BEISPIEL 21: Herstellung eines kombinierten Anti-Hib- und Anti-Meningococcus-B-Impfstoffes
Das Immunogen des Beispiels 16, gelöst in einem Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 80 μg pro mL, wurde unter aseptischen Bedingungen bei 4–6°C mit einer Massenlösung vom Außenmembranprotein-Komplex (OMPC) von Neisseria meningitidis Typ B, die derzeit in VAMEMGOC BC bei einer Konzentration in PBS von 100–200 mg pro mL eingesetzt wird, gemischt. Nach 20 Minuten der Homogenisierung durch leichtes magnetisches Rühren wurde der Inhalt der Reaktion mit gleichem Volumen an Aluminiumoxid von 1–0,01 mg pro mL in destilliertem Wasser gemischt. Das Rühren wurde 20 Minuten bei 4–6°C fortgesetzt. Die Endkonzentration des Hib-Antigens wurde bestimmt, indem eine Abschätzung der Ribose und der Gesamtproteine gemäß Lowry vorgenommen wurde und sie konnte erneut eingestellt werden, indem mehr Pufferlösung hinzugesetzt wurde, bis eine Hib-Antigen-Endkonzentration von 20 mg pro mL erreicht worden war. Tiomersal wurde auf eine Endkonzentration von 0,1–0,001% hinzugesetzt. Die resultierende Suspension ist die Endmasse kombiniertem Anti-Hib- und Anti-Meningococcus B in Aluminiumoxid.
BEISPIEL 22: Herstellung eines kombinierten Anti-Hib- und Anti-DTP-Impfstoffes
Das Immunogen des Beispiels 16, gelöst in einem Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 80 μg pro mL, wurde unter aseptischen Bedingungen bei 4–6°C mit einer Massenlösung von DTP bei einer vierfachen Konzentration gemischt. Nach 20 Minuten der Homogenisierung durch weiches magnetisches Rühren wurde der Inhalt mit gleichem Volumen an Aluminiumoxid 1–0,01 mg pro mL in bidestilliertem Wasser gemischt. Das Rühren wurde 20 Minuten lang bei 4–6°C beibehalten. Die Endkonzentration an Hib wurde bestimmt, indem Ribose und Gesamtproteine gemäß Lowry abgeschätzt wurden, und sie konnte erneut eingestellt werden, indem mehr Pufferlösung so lange hinzugesetzt wurde, bis eine Hib-Antigen-Endkonzentration von 20 mg pro mL erreicht worden war. Tiomersal wurde auf eine Endkonzentration von 0,1–0,001 hinzugesetzt. Die resultierende Suspension ist die Endmasse von kombiniertem Anti-Hib- und Anti-DTP in Aluminiumoxid.
BEISPIEL 23: Immunologische Assays von Impfstoffen, die aus einer synthetischen Oligosaccharidmischung und OMP hergestellt wurden
Der Impfstoff der Beispiele 19 und 20 wurde bei einer Dosis von 1 μg oder 2 μg an Antigenen immunisiert. Die in diesen Experimenten verwendeten Tiere waren Kaninchen, Ratten und Mäuse. 2 Immunisierungen wurden in Intervallen von 4 Wochen durch Ausbluten am 0., 28. und 42. Tag durchgeführt. Das Blut wurde gesammelt und bei 3 500 Umdrehungen pro Minute während 20 Minuten zentrifugiert. Die Seren wurden 10-fach verdünnt und bei –40°C gelagert.
Das Antikörper-Ansprechverhalten wurde durch indirektes ELISA unter Verwendung von Hib-HSA als Beschichtungs-Antigen gemessen. Die Ergebnisse sind in den 2–5 gezeigt.
BEISPIEL 24: Konjugat zwischen der Mischung aus synthetischen Oligosacchariden und p-Nitrophenylacrylat
Die Mischung von Oligosacchariden aus dem Beispiel 13 (10 mg) wurde in Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von Nitrophenylacrylat (10–30 mg) in Dimethylformamid (1 mL) gegeben. 0,1–0,5 mL Triethylamin wurden hinzugesetzt und die Reaktion wurde unter Rühren 16 Stunden lang gehalten. 0,1–0,5 mL Ammoniak wurden hinzugesetzt, und das Rühren wurde 24 Stunden lang fortgesetzt. Die Lösung wurde auf eine sephadex LH-20-Säule in Acetonitril aufgetragen. Die Elution wurde mit Acetonitril-Wasser durchgeführt. Fraktionen, die in dem Orcinol-Assay für Ribose positiv waren, wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute liegt für gewöhnlich höher als 80%.
BEISPIEL 25: Vermögen des synthetischen Oligosaccharid-Konjugats, Anti-Hib-Antikörper nachzuweisen.
Eine Lösung des Produkts von dem vorausgehenden Beispiel in einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer wurde in einer Konzentration von 1–100 μg pro mL auf die Hälfte einer Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Auf die andere Hälfte der Platte wurde das HbO-HSA-Antigen in empfohlenen Konzentrationen aufgetragen. Ein ELISA-Assay wurde unter Verwendung der Seren von Mäusen, die mit einem Impfstoff immunisiert worden waren, der das an Tetanustoxoid gekoppelte natürliche Kapselpolysaccharid enthielt, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 6 gezeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1: Typisches Chromatogramm der in Beispiel 15 durch Ionenaustauschchromatographie auf Mono Q HR 5/5 mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0–500 mM erhaltenen oligomeren Fraktionen, wobei A – Pentamer; B – Oligomer von Beispiel 10.
2: Antikörper-Antwort in Kaninchen, die mit dem Impfstoff des Beispiels 16 immunisiert worden waren.
3: Antikörper-Antwort in Kaninchen, die mit dem Impfstoff von Beispiel 15 immunisiert worden waren.
4: Antikörper-Antwort in Ratten, die mit dem Impfstoff von Beispiel 15 immunisiert worden waren.
5: Antikörper-Antwort in Balb-C-Mäusen, die mit dem Impfstoff von Beispiel 15 immunisiert worden waren.
6: Das Vermögen des Konjugats 26-PAA zum Nachweis von Anti-Hib-Antikörpern.

Claims

Verfahren zur Synthetisierung einer Mischung von Oligosacchariden, die Repetiereinheiten der Formel (Phosphat-Ribose-Ribit)_n oder der Formel (Ribose-Ribit-Phosphat)_n umfassen, wobei eine in einem Schritt erfolgende Polykondensationsreaktion am Disaccharid-Derivat 19 oder 23
in Gegenwart eines Promotors in einem basischen Lösungsmittel und mit einem Spacer, der als ein das Wachstum der oligomeren Kette unterdrückender Akzeptor an der Reaktion teilnimmt, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Disaccharid-Zwischenstufe 19 oder 23 und der Promotor in einem Stoffmengenverhältnis von 1/1–3 verwendet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei der Promotor ein aktiviertes Derivat einer sterisch gehinderten Säure ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der Promotor Pivaloylchlorid, Adamantoylchlorid oder ein aktiviertes Derivat einer Phosphorsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Disaccharid-Zwischenstufe 19 oder 23 und der Spacer in einem Stoffmengenverhältnis von 5–10/1 verwendet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Disaccharid 19 ist, der Spacer 24 ist, der Promotor Pivaloylchlorid ist und das Lösungsmittel Pyridin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin umfassend eine Oxidation von Phosphonat zu Phosphat, gefolgt von einer Hydrierung zur Entfernung der Benzyl-Schutzgruppen, einer Entschützung oder Aktivierung des Spacers und einer Eliminierung von Fraktionen mit weniger als 4 oder mehr als 25 Repetiereinheiten durch ein oder mehrere Molekularsiebungsprozeduren, wodurch eine Mischung von Oligosacchariden erhalten wird, die wenigstens 5 Verbindungen der Struktur A oder B
umfasst, wobei n einen Wert von 4 bis 25 hat, R₁ oder R₂ ein Spacer zur Konjugation mit einem Träger ist, R₁ ein Spacer ist, wenn R₂ = H, und R₂ ein Spacer ist, wenn R₁ = H.
Verfahren zur Synthetisierung der Disaccharid-Zwischenstufe 2,3,4-Tri-O-benzyl-5-O-allyl(β-D-ribofuranosyl)-D-ribit 4
in reiner Form durch die Ribosylierung von 2,3,4-Tri-O-benzyl-5-O-allyl-D-ribit mit Ribofuranoseperacetat, gefolgt von einer Deacetylierung, wodurch die Verbindung 4 erhalten wird, die zur Reinigung einer Absorption-Desorption in Kieselgel unterzogen werden kann.
Verfahren zur Synthetisierung der Disaccharid-Zwischenstufe 17
umfassend die Dibenzylierung des Disaccharids 4 mit Dibutylzinnoxid, Tetrabutylammoniumiodid, Natriumhydrid und Benzylchlorid in einem Verhältnis von 1:0,5–2:0,001–1, 0,5–10:1–5 in einem Lösungsmittel wie Toluol, Benzol, Tetrahydrofuran oder Xylol, wodurch Verbindungen mit der Formel 5
erhalten werden, gefolgt von einer Isomerisierung von Allyl zu Propenyl.
Disaccharid 5-O-Propenyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-O-(2',5'-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-D-ribit 17
Disaccharidderivate 2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(2',5'-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-D-ribit-5-O-triethylammoniumphosphonat 23 und 2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(2',5'-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-D-ribit-3'-O-triethylammoniumphosphonat 19
Verfahren zur Herstellung der Disaccharide 19 oder 23 ausgehend vom Disaccharid 17, umfassend eine Phosphonylierung mit Phosphortrichloridimidazol, gefolgt von einer Hydrolyse der Propenylgruppe oder. einer Acetylierung, einer Hydrolyse der Propenylgruppe und einer Phosphonylierung mit Phosphortrichloridimidazol, gefolgt von einer Deacetylierung.
Verwendung der Disaccharide 19 oder 23 zur Synthese von Oligosaccharid-Mischungen, die wenigstens 5 Verbindungen der Struktur A oder B
umfassen, wobei n einen Wert von 4 bis 25 hat, R₁ oder R₂ ein Spacer zur Konjugation mit einem Träger ist, R₁ ein Spacer ist, wenn R₂ = H, und R₂ ein Spacer ist, wenn R₁ = H.