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Diese
Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Zufuhr von
Nukleinsäuren
in Zellen in vitro, ex vivo oder in vivo. Noch bevorzugter betrifft
die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren für die Zufuhr von Nukleinsäuren in
Zellen unter Verwendung replizierender viraler Konstrukte, insbesondere
replizierender retroviraler Konstrukte. Die Erfindung betrifft auch
die Zubereitung der Konstrukte, genetisch modifizierter Zellen,
die die Konstrukte beinhalten, beispielsweise Verpackungszellen,
als auch die Verwendung dieser Zusammensetzungen und Verfahren für die Zufuhr
eines jeden ausgewählten
Polynukleotids in eine Zelle für
experimentelle, prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Anwendungen.
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Die
Zufuhr von Nukleinsäuren
in Zellen findet Anwendung in zahlreichen biotechnologischen und pharmakologischen
Gebieten, beispielsweise in der Experimentalforschung, in der klinischen
Forschung, in der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung
als auch in der Diagnostik. Die Genzufuhr in vitro kann verwendet
werden, um beispielsweise rekombinante Proteine oder Viren herzustellen
als auch um stabile rekombinante Zellen zu Durchmusterungszwecken
herzustellen. In vivo oder ex vivo ermöglicht die Genzufuhr die Herstellung
von transgenen Tieren, die Untersuchung der Genregulation sowie
therapeutische und/oder prophylaktische Behandlungen von Säugetieren
einschließlich
des Menschen. Diesbezüglich
wurde in der Literatur in zunehmendem Ausmaße von Tier- und klinischen
Studien berichtet, die die Zufuhr von Nukleinsäuren, die therapeutische oder
antigene Polypeptide kodieren, in Patienten betreffen. Diese Herangehensweisen
verwenden verschiedene Gentransferstrategien, die beispielsweise
die Verwendung von (i) viralen Vektoren (oder Zellen, die virale
Vektoren herstellen), (ii) nicht-virale Vektoren (beispielsweise
Plasmide in Kombination mit chemischen Wirkstoffen oder physikalischen
Behandlungen), (iii) nackte DNA oder (iv) genetisch modifizierte
Zellen, die dem Patienten, gegebenenfalls nach Einkapselung zur
Einschränkung der
Immunreaktion, eingepflanzt werden, umfassen.
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Die
Verwendung von rekombinanten Retroviren ist eines der erfolgreichsten
Verfahren um Nukleinsäuren
in sich teilende Zellen in vitro, in vivo oder ex vivo einzuführen. Diese
Gentransferstrategie erwies sich sowohl für die Grundlagenforschung als auch
für klinische
Anwendungen als nützlich.
Diesbezüglich
wurden in Menschen große
Fortschritte bei der Transduktion von hämatopoetischen Vorläufern (Nolta
et al., Exp. Hematol. 20 (1992) 1065–1071), reifen Lymphozyten
(Bunnell et al., Proc. Natl. Sci. USA 92 (1995) 7739–7743), Tumorzellen
(Klatzmann et al. Hum. Gen. Ther. 9 (1998) 2595–2604; Caruso et al.; PNAS
90 (1993) 7024–7028),
etc gemacht. Retroviren haben sich daher als Genzufuhrvehikel in vivo
in Menschen für
klinische Anwendungen (Behandlung von Krebsarten, genetischen Erkrankungen
(z. B. ADA-Defizienz, SCID), viralen Infektionen (z. B. HN-Behandlung),
Immunerkrankungen (z. B. Transplantat gegen Empfängererkrankung; Graft-Versus-Host-Disease;
Autoimmunerkrankungen, etc.), etc., bestätigt. Insbesondere Hughes et
al. (Journal of Virology, 61, 3004–3012, 1987) offenbaren ein
rekombinantes replizierendes retrovirales Genom, das ein CAT-Polynukleotid
umfasst, das unterhalb des env-Gens eingesetzt ist und in das eine
Splice-Akzeptorstelle
zwischen dem env-Gen und dem CAT-Polynukleotid eingesetzt ist. Das
betrifft „Untergruppe
D-Vektoren", die
einen Tropismus für
Säugerzellen
haben.
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Rekombinante
Retroviren die im Stand der Technik für Genzufuhranwendungen verwendet
werden, wurden genetisch modifiziert um sie zu inaktivieren, d.
h. eine Replikation ihres Genoms und/oder ihre Ausbreitung nach
Infektion von kompetenten Zellen in Abwesenheit von trans-komplementierenden
Funktionen zu vermeiden. Insofern werden die meisten rekombinanten
Retroviren durch Austausch der viralen Gene gag, pol und env im
rekombinanten Genom durch eine Nukleinsäure von Interesse geschaffen.
Die rekombinanten, inaktivierten Retroviren werden in einer so genannte
Verpackungszelle zubereitet, die die komplementierenden Funktionen,
die durch gag, pol und env kodiert werden, herstellt. Beispiele
solcher Verpackungszelllinien sind beispielsweise PA 317 (Miller
et Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2895), PsiCRIP (Danos et
Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460), oder GP+EnvAm12 (Markowitz et al. Virology
167 (1988) S. 400). Andere Beispiele für retrovirusverpackende Zellen
sind beispielsweise in
EP 243
204 , WO89/07150, WO90/02806,
US5,766,945 ,
EP 476 953 , WO93/04167 und
WO93/10218 beschrieben. Die in den Zellen hergestellten rekombinanten
Retroviren sind infektiös,
können
sich selbst aber nach der Infektion nicht replizieren. Diesbezüglich werden
sie als replikations-inaktiviert betrachtet. Solche replikationsinaktivierten
rekombinanten Retroviren wurden mittels verschiedener Typen von
Retroviren herstellt, einschließlich
beispielsweise MoMLV (Moloney Leukämievirus der Maus), ALV, BLV, MMTV
oder RSV, oder mittels Lentiviren wie beispielsweise HIV, SIV oder
CAEV.
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Es
ist allgemein anerkannt, dass die Genzufuhrvektoren so inaktiviert
wie möglich
sein sollten, um nachteilige Wirkungen nach der Verabreichung in vivo
zu vermeiden. Deshalb fehlen den bislang verwendeten retroviralen
Vektoren im Wesentlichen alle der viralen gag, pol und env Proteine.
Dieselben Bedenken bestehen auch bei allen anderen Typen von momentan verwendeten
viralen Vektoren wie adenovirale Vektoren, AAV, Herpesvirenvektoren
und dergleichen. Beispielsweise umfassen Adenoviren im Allgemeinen
wenigstens eine Deletion des E1-Bereichs und momentan werden Anstrengungen
unternommen, um „Gutless"-Adenovektoren herzustellen, d.
h. adenovirale Vektoren ohne jegliche virale kodierende Sequenzen.
In ähnlicher
Weise fehlen den meisten rekombinanten AAV-Vektoren die kodierenden
Bereiche für
rep und cap.
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Während große Fortschritte
bei den Genzufuhrvektoren gemacht wurden, besteht jedoch immer noch
ein Bedarf an alternativen Strategien, die die Gentransfereffizienz
erhöhen,
die Genexpressionsstabilität
erhöhen
und/oder die Genvektorherstellung erleichtern, ganz besonders für industrielle
Verwendungen.
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In
der Patentanmeldung Nr. PCT/FR 95/00208 haben die Anmelder ein neuartiges
Genzufuhrkonzept offenbart. Dieses Konzept umfasst die Zufuhr eines
(von) Nukleinsäurekonstrukts
(-en) in eine Zelle in vitro, ex vivo oder in vivo, wobei das (die) Konstrukte)
alle genetischen Elemente umfasst (umfassen), die es der Zelle erlauben
ein rekombinantes Virus herzustellen. Dieses Verfahren verwendet
deshalb Nukleinsäuren,
die in situ rekombinante virusherstellende Zellen generieren. Dieses
Verfahren ist beispielsweise für
die Zufuhr therapeutischer oder toxischer Gene in vivo oder für die Zubereitung
von Vaccinzusammensetzungen verwendet worden (siehe PCT/FR 97/00619
Noguiez-Hellin et al., PNAS 93 (1996) 4175–4180). Das Verfahren bietet
mehre Vorteile gegenüber
früheren
Genzufuhrvektoren und es vermeidet insbesondere die Notwendigkeit
von Verpackungszellen, erlaubt die Verwendung von rekombinanten
Plasmiden, um die viralen Gene in vivo zuzuführen, stellt einen effizienten
Gentransfer in vivo zur Verfügung,
etc.
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Die
vorliegende Erfindung stellt jetzt eine neuartige Herangehensweise
für die
Genzufuhr in Zellen zur Verfügung.
Diese Herangehensweise basiert auf der Verwendung von replizierenden
retroviralen Konstrukten, um Gene in vitro, ex vivo oder in vivo
zuzuführen.
Im Gegensatz zu allen zuvor existierenden Verfahren, die auf der
Verwendung von replikations-inaktivierten viralen Konstrukten basieren, stammt
die vorliegende Erfindung jetzt von einem neuen und originären Konzept
der Verwendung replizierender viraler Konstrukte, insbesondere replizierender
retroviraler Konstrukte, für
die Zufuhr von Polynukleotiden in vivo, ex vivo oder in vitro ab.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass solche Konstrukte in hoher
Quantität
und Qualität
gemacht werden können
und jedes Gen oder jede Nukleinsäure
von Interesse effizient in Zellen in vitro, ex vivo oder in vivo zuführen und
exprimieren können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher Verfahren und Zusammensetzungen
zur in vitro-, ex vivo- oder in vivo-Zufuhr von Polynukleotiden
in Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen,
die replizierende virale Konstrukte umfassen und deren Verwendung
bei der Zufuhr von Polynukleotiden in Zellen. In anderen Aspekten
liegt die Erfindung auch in Verwendungen von Verpackungszellen, die
replizierende rekombinante Viren herstellen.
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Die Verwendung replizierender
viraler Konstrukte
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Wie
oben angeführt.
liegt die Erfindung in einer Ausführungsform in replizierenden
viralen Konstrukten und deren Verwendungen, insbesondere in replizierenden
retroviralen Konstrukten und deren Verwendungen.
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Zahlreiche
retrovirale Vektorsysteme sind für die
Genzufuhr und die Gentherapie im vergangenen Jahrzehnt entwickelt
worden. Den Hauptvorteil dieser Systeme sieht man in der Fähigkeit
dieser Vektoren stabil in das Wirtsgenom zu integrieren. Diesbezüglich infizieren
Retroviren wie das MoMLV selektiv sich teilende Zellen und werden
daher als vielversprechende Vektoren für die Transduktion von proliferierenden
Zellen (d. h. Tumorzellen, proliferierende Lymphozyten, etc.) betrachtet.
Alternativ können
Retroviren wie Lentiviren auch sich nicht-teilende Zellen infizieren
und können
daher als Vektoren verwendet werden, um Gene in ruhende Zellen zuzuführen. Beispielsweise
können
MoMLV-abgeleitete retrovirale Vektoren verwendet werden, um Gene
in proliferierende Zellen wie Tumorzellen oder hämatopoetische Zellen (insbesondere
aktivierte T-Lymphozyten) zuzuführen,
mit dem Ziel, die Zellen zu zerstören oder zu modifizieren. Lentivirus-abgeleitete
Vektoren können
verwendet werden, um Polynukleotide an ruhende Zellen wie Fibroblasten
oder Muskelzellen (insbesondere glatter oder Skelettmuskel) zuzuführen, vornehmlich
mit dem Ziel eine Immunantwort gegenüber spezifischen Antigenen
oder einer Gruppe von Antigenen hervorzurufen. Abhängig von
den Zielzellen oder den Behandlungsbedingungen stellen diese Vektoren
jedoch nicht immer ausreichende Transduktionseffizienz zur Verfügung, und
mehrere Herangehensweisen wurden entwickelt, um diesen Aspekt anzugehen
(starke Promotoren, gezielte Vektoren, ex vivo Gentransfer, etc).
Die vorliegende Erfindung stellt nun eine neuartige Herangehensweise
zur Verfügung,
um die Transduktionseffizienz von retroviralen Vektoren zu verbessern.
Diese Herangehensweise basiert auf der Verwendung replizierender
Viren, die die Fähigkeit,
sich in der Zielzellpopulation, im Gewebe oder Organ zu verbreiten,
beibehalten.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „replizierend", dass das (die) Konstrukt(e),
das (die) verwendet wird (werden), ein genetisches Element enthält (enthalten),
das für
die Herstellung von replizierenden rekombinanten Viren notwendig
ist, d. h. rekombinante Viren, die in der Lage sind, in Abwesenheit
jeglicher trans-komplementierender Funktion zu replizieren und daher
in der Lage sind, sich in der Zielzellpopulation, dem Gewebe oder
dem Organ auszubreiten. Diese rekombinanten Viren werden auch als
replikationskompetent bezeichnet.
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Es
ist bekannt, dass die genomische Organisation von Retroviren im
Wesentlichen die folgenden Elemente umfasst:
- – einen
LTR („Long
Terminal Repeat")-Bereich, der
sich an jedem Ende des Genoms befindet und der als Ursprung der
Replikation und als transkriptioneller Promoterbereich wirkt. Jeder
LTR-Bereich setzt sich im Wesentlich aus 3 funktionalen Bereichen,
die als U3, R und US bezeichnet werden, zusammen, wobei US und U3
an der Provirusintegration beteiligt sind,
- – eine
Verpackungssequenz („Psi"), die an der Verpackung
des proviralen Genoms in das virale Partikel beteiligt ist,
- – 3
kodierende Bereiche, bezeichnet als gag, pol und env, die für die Kernproteine
(gag), die Enzyme (Reverse Transkriptase, Protease, Integrase) und
das Hüll-Glykoprotein
(env) kodieren.
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Im
Allgemeinen ist daher ein erfindungsgemäßes replizierendes retrovirales
Konstrukt jedes Konstrukt (d. h. eine Nukleinsäure, ein Plasmid, ein Virus),
das wenigstens funktionsfähige
gag, pol und env-Gene sowie ein Polynukleotid, das den Zellen zugeführt werden
soll, umfasst. Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße replizierende
retrovirale Konstrukt (i) funktionale gag-, pol- und env-Gene, (ii) ein
Polynukleotid, das den Zellen zugeführt werden soll, (iii) eine
retrovirale Verpackungssequenz und (iv) mindestens eine retrovirale
LTR-Sequenz. Diese Elemente werden in dieser Anmeldung auch als
das rekombinante, replikations-kompetente retrovirale Genom bezeichnet.
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Bezüglich der
Lentiviren: ihr Genom umfasst ferner zusätzliche kodierende oder regulatorische Sequenzen
wie vif, vpr, vpu, vpx, rev, tat, und nef. Ein erfindungsgemäßes retrovirales
Konstrukt vom Lentivirustyp würde
daher vorzugsweise die oben aufgelisteten Elemente (i)–(iv) sowie
(v) funktionale vif, vpr, vpu, vpx, rev, tat und nef Sequenzen,
oder nur einen für
die Replikation des viralen Genoms notwendigen Teil davon, umfassen.
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Ein
erfindungsgemäßes replizierendes
retrovirales Konstrukt ist daher jedes Konstrukt (z. B. eine Nukleinsäure, ein
Plasmid, ein Virus), das mindestens ein replikations-kompetentes
retrovirales Genom, wie es oben definiert ist, umfasst.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Polynukleotid" jedes Nukleinsäuremolekül, dessen
Zufuhr in eine Zelle, Kultur, Gewebe, Organ oder Organismus gewünscht ist,
wie es unten diskutiert werden wird. Dieser Ausdruck kann auch retrovirale
Gene umfassen, wie retrovirale Hüllgene
mit beispielsweise fusogener Aktivität. In dieser Ausführungsform
würde das
Polynukleotid das env-Gen darstellen.
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Noch
bevorzugter ist das replikations-kompetente retrovirale Genom ein
DNA- oder RNA-Molekül, das in
5' -> 3' Richtung folgendes umfasst:
- (i) einen retroviralen 5' LTR-Bereich,
- (ii) eine retrovirale Verpackungssequenz,
- (iii) funktionale gag-, pol- und env-Gene, und
- (iv) einen retroviralen 3' LTR-Bereich,
wobei
das Genom ferner ein ausgewähltes
Polynukleotid umfasst, das in einen Bereich des Genoms eingesetzt
ist, der nicht die Replikationskapazität des Genoms einschränkt.
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Die
Elemente (i) bis (iv) können
durch bekannte Techniken zubereitet werden, ausgehend von verschiedenen
Materialien und unterschiedlichen Retrovirustypen.
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Insbesondere
können
sich die funktionalen gag- und pol-Gene, die LTR-Sequenz und der
Verpackungsbereich ableiten von (erhalten werden vom Genom von)
Retroviren wie beispielsweise MoMLV (Moloney Leukämievirus
der Maus), ALV, BLV, MMTV oder RSV, oder von Lentiviren wie beispielsweise
HIV, SIV oder CAEV. Diese Elemente können isoliert und manipuliert
werden, wenn man den dem Fachmann bekannten Techniken folgt oder
von Plasmiden, die im Stand der Technik erhältlich sind, isoliert werden.
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Das
funktionale env-Gen kann eine ekotrope (infektiös in Zellen derselben Spezies)
oder eine amphotrope (infektiös
in verschiedenen Spezies) Hülle kodieren.
Besondere Hüllen,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
beispielsweise die Hüllen
der folgenden Viren: 4070A (Ott et al., J. Virol. Vol. 64 (1990)
S 757–766),
RD114, 10A1, VSV, VIH, Tollwutvirus oder GALV (Delassus S. et al., Virology
173 (1989) 205–213,
das fusogen ist, oder Derivate oder andere Typen, die in
EP 99400964.5 offenbart
sind, die fusogen oder nicht-fusogen
sind). Die Hülle
kann auch zellulären
Ursprungs sein, beispielsweise ein Membranprotein, das das Zielen
des Retrovirus auf einen ausgewählten
Liganden, wie beispielsweise einen CD4-Rezeptor, erlaubt. Vorzugsweise
ist die Hülle
eine retrovirale Hülle
mit einem Tropismus für
Säugerzellen,
bevorzugter für menschliche
Zellen, insbesondere eine amphotrope oder eine Hülle mit neuer Spezifität. GALV,
4070A oder 10A1 stellen bevorzugte Ausführungsformen für die Herstellung
von replizierenden Viren der vorliegenden Erfindung dar. Diesbezüglich können wie
unten diskutiert werden wird, das Hüll-Gen oder jede Variante davon
auch das Polynukleotid der Vektorkonstrukte darstellen.
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Zusätzlich können die
Elemente (i) und (iv) weiter modifiziert werden, um eine verbesserte Transduktionseffizienz,
Expressionsstabilität,
oder Kontrolle über
jegliche Verbreitung des Retrovirus in vitro, ex vivo oder in vivo
zür Verfügung zu
stellen. Insbesondere werden in bevorzugten Ausführungsformen modifizierte Hüllproteine,
die beispielsweise einen Zielbestanteil (einen Ligand, Rezeptor,
etc.) und/oder ein ausgewähltes
Epitop umfassen, verwendet. Diese Modifikationen oder Varianten
werden weiter unten detaillierter offenbart.
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In
einer ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Polynukleotid 3' des Hüll-Gens eingesetzt,
vorzugsweise in der selben transkriptionellen Orientierung wie das
env-Gen. Insofern offenbart die Erfindung jetzt einen bevorzugten
und effizienten Weg, um ein funktionales rekombinantes replikations-kompetentes
Genom wie oben beschrieben herzustellen, das die Schaffung einer zweiten
Splice-Akzeptorstelle innerhalb des viralen Genoms umfasst, die
die Translation des Polynukleotids von dem im LTR-Bereich enthaltenen
transkriptionalen Promoter aus erlaubt. Ein Beispiel eines solchen
Konstrukts ist dargestellt in 3. In einer
bevorzugten Ausführungsform
liegt die Erfindung daher in einem retroviralen Konstrukt, das ein replikations-kompetentes
retrovirales Genom umfasst, das wiederum die folgenden Elemente
in 5' -> 3' Richtung umfasst:
- (i)
einen retroviralen 5' LTR-Bereich,
- (ii) eine retrovirale Verpackungssequenz,
- (iii) funktionale gag-, pol- und env-Gene,
- (iv) ein Polynukleotid, und
- (v) einen retroviralen 3'LTR-Bereich,
wobei
das retrovirale Genom ferner eine Splice-Akzeptorstelle zwischen
dem env-Gen und den Polynukleotid umfasst.
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Wo
die retroviralen Konstrukte vom Lentivirus-Typ verwendet werden,
umfassen die Elemente oben unter (iii) ferner funktionale kodierende
oder regulatorische Sequenzen ausgewählt aus vif, vpr, vpu, vpx,
ref und tat, die notwendig sind für die Replikation solcher Viren.
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Dieser
Typ von Konstrukt hat sich als vorteilhaft erwiesen, da er eine
effiziente Expression des Polynukleotids ohne Bedarf für einen
zusätzlichen (internen)
Promoterbereich erlaubt. Außerdem
imitiert solch ein artifizielles Konstrukt, das die Expression des
Polynukleotids mittels alternativen Splicens zur Verfügung stellt,
die natürliche
Expressionsart in komplexen Retroviren. Die eingesetzte zweite Splice-Akzeptorstelle
kann die im retroviralen Konstrukt stromaufwärts des env-Gens bereits anwesende Splice-Akzeptorstelle
duplizieren. Diese besondere Ausführungsform ist in den Beispielen
dargestellt, wobei die geschaffene Splice-Akzeptorstelle ein Fragment einer retroviralen
DNA von weniger als 1 kb umfasst, das die MoMLV Splice-Akzeptorstelle umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform
umfasst die geschaffene Splice-Akzeptorstelle ein Fragment von weniger
als 1 kb, vorzugsweise von weniger als 0,6 kb einer Sequenz, die
einer Sequenz einer retroviralen Splice-Akzeptorstelle oder einer
Variante davon entspricht, die die Aktivität einer Splice-Akzeptorstelle
beibehält.
Varianten können
auf ihre Aktivität in
einem retroviralen Konstrukt der vorliegenden Erfindung durch Überprüfen der
Expression des Polynukleotids getestet werden. Diesbezüglich sind
die Struktur und allgemeinen Eigenschaften der Splice-Akzeptorstellen,
insbesondere der retroviralen Splice-Akzeptorstellen, dem Fachmann
bekannt. Splice-Akzeptorstellen finden sich im Genom aller Retroviren
zwischen den pol- und env-Genen. Diese Splice-Akzeptorstellen regulieren
die Transkription des env-Gens vom 5'-LTR. Jede Splice-Akzeptorstelle kann
daher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beispielsweise
ein DNA-Fragment einer unterschiedlichen Größe, das den Splice-Akzeptor, eine
synthetische Sequenz, oder ein entsprechender Bereich von einem
anderen Retrovirus enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Splice-Akzeptorstelle die gesamte oder einen Teil von SEQ
ID-Nr. 6, oder einen
Variante davon. Noch bevorzugter ist die Splice-Akzeptorstelle ein
Nukleinsäurefragment,
das die Sequenz von Position 437 bis Position 802 von SEQ ID-Nr.
6 oder eine Variante davon umfasst. Sogar noch bevorzugter umfasst
die eingesetzte Nukleinsäure
die Sequenz von Position 532 bis Position 540 von SEQ ID-Nr. 6 oder
eine Variante davon. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die eingesetzte
Nukleinsäure,
die die Splice-Akzeptorstelle
umfasst, weniger als ungefähr
1,5 kb, sogar noch bevorzugter etwa 1 kb oder weniger.
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Außerdem führt in einem
anderen Aspekt dieser Erfindung die Duplikation eines retroviralen
(z. B. des MoMLV) Splice-Akzeptorbereichs zu einer Tandemwiederholung,
die das env-Gen flankiert (3). Die
Deletion genomischer Sequenzen aufgrund von wiederholten Sequenzen
im retroviralen Genom ist zuvor beschrieben worden. Die Veränderung
der Größe der wiederholten
Bereiche innerhalb solch eines replizierten Vektors wurde vorgeschlagen als
Mittel zur Kontrolle seiner Virulenz durch gezielte Destabilisierung
des viralen env-Gens ohne die Expression des Gens von Interesse
zu beeinflussen. Diesbezüglich
schafft diese Ausführungsform
daher ein abgeschwächtes
replikations-kompetentes Retrovirus (Sorge et al., J. Mol. Appl.
Genet. 1 (1982) 547; Hugues et al., Virology 136 (1984) 89).
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Weil
auch eine Deletion des Polynukleotids aus dem replizierenden Genom
beobachtet werden kann, legt die Erfindung alternativ auch nahe,
jedes derartige Deletionsereignis als weiteres Mittel zur Kontrolle
der viralen Ausbreitung zu verwenden. Dadurch, das man die virale
Replikation abhängig macht
von der Anwesenheit des Polynukleotids, ist es insbesondere möglich, aus
jedem möglich
Deletionsereignis, das das Polynukleotid beeinflusst, Vorteil zu
ziehen. In einer besonderen Ausführungsform umfasst
das replizierende virale Konstrukt einen modifizierten LTR-Bereich,
der in Anwesenheit eines Polypeptids, das durch (i) das virale Konstrukt
selbst oder (ii) ein andere virales Konstrukt kodiert wird, aktiv
ist.
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Insbesondere
liegt ein spezifisches Ziel dieser Erfindung in einem replizierenden
viralen Konstrukt, wobei das virale Konstrukt einen modifizierten LTR-Bereich
umfasst, der aktiv in der Anwesenheit eines aktivierenden Polypeptids
ist, und wobei das virale Konstrukt ein Polynukleotid umfasst, das
für das aktivierende
Polypeptid kodiert. Sogar noch bevorzugter wird das aktivierende
Polypeptid kodiert durch das gleiche Polynukleotid, das das Produkt
kodiert, dessen Zufuhr begehrt wird. Die zwei Polypeptide können als
ein einzelnes Fusionsmolekül
hergestellt werden, das nach der Expression innerhalb der Zellen
gespalten werden kann, beispielsweise durch Verdau einer Spaltstelle,
die zwischen den zwei Polypeptiden eingeführt wurde. Alternativ können die zwei
Polypeptide als zwei separate Moleküle hergestellt werden, wobei
die beiden entsprechenden kodierenden Nukleinsäuren beispielsweise mittels
einer IRES fusioniert sind. In diesen Ausführungsformen schafft jedes
Deletionsereignis des Polynukleotids ein replikations-inaktiviertes
virales Konstrukt und vermeidet daher dessen Verbreitung. In einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das aktivierende Polypeptid vom viralen Konstrukt unter der Kontrolle
eines regulierten oder (gewebs-oder zell-)spezifischen Promoters
exprimiert, um die virale Replikation weiter zu kontrollieren.
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Beispiele
solcher Promotoren sind später
in dieser Anmeldung beschrieben.
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Das
aktivierende Polypeptid kann jedes Transaktivatormolekül sein,
beispielsweise ein auf Tetracyclin reagierender Transaktivator oder
das HIV Tat/tar-System, oder jedes andere transkriptionsaktivierende
Molekül,
vorzugsweise nicht-humanen Ursprungs, um eine höhere Selektivität des Systems
zu sichern. Die modifizierte LTR kann Operatorsequenzen umfassen,
an die der Transaktivator bindet, wodurch die Expression von der
LTR aus aktiviert wird. Die Operatorsequenz kann beispielsweise
im Austausch des gesamten oder eines Teils des U3-Bereichs der LTR
eingesetzt werden. Die Operatorsequenzen können in einer oder mehreren
Tandemkopien beispielsweise zwischen 1–8 Kopien, noch bevorzugter
zwischen 1 und 5, eingesetzt werden. Die Tetrazyclinoperatorsequenzen
(TetOp) können
vom Fachmann mittels konventioneller Techniken zubereitet werden.
Diesbezüglich
liegt ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung in einer modifizierten
retroviralen LTR, wobei die LTR eine Transkriptionsaktivatoroperatorsequenz
im Austausch gegen den gesamten oder einen Teil des U3-Bereichs
umfasst.
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Wie
weiter unten ferner beschrieben werden wird, kann das aktivierende
Polypeptid auch von einem separaten viralen Konstrukt exprimiert
werden. In dieser Situation sind nicht nur die viralen Konstrukte
abhängig
voneinander in Bezug auf die Natur der Proteine die produziert werden,
sondern sind auch abhängig
von der Aktivierung der Expression davon.
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Während die
Insertion des Polynukleotids 3' des
für die
env-Nukleinsäure
kodierenden Bereichs wie oben beschrieben eine bevorzugte Ausführungsform
dieser Erfindung darstellt, sollte man verstehen, dass andere Insertionsstellen
oder -strategien verwendet werden können. Insbesondere kann das
Polynukleotid innerhalb des replizierenden viralen Konstrukts der
vorliegenden Erfindung auch eingesetzt werden:
- – 5' des env-Gens, der
zweiten, für
die Regulation der Expression des env-Proteins verwendeten Spliceakzeptorstelle,
oder
- – 3' des Hüll-Gens
als eine bicistronische Einheit damit. Insbesondere kann eine IRES-Sequenz (interne
Ribosomeneintrittsstelle; Internal Ribosome Entry Site) zwischen
dem env-Gen und dem Polynukleotid eingesetzt werden, um eine Co-Expression
des Bereichs der 5'-LTR
sicherzustellen,
- – 3' des Hüll-Gens,
aber in entgegengesetzter transkriptioneller Orientierung. In dieser
Ausführungsform
wird die Transkription des Polynukleotids von einem internen Promoterbereich,
der im Polynukleotid enthalten ist, kontrolliert, der, wie später beschrieben
wird, ein regulierter und/oder ein zell- oder gewebespezifischer
Promoter sein kann.
- – Obwohl
weniger bevorzugt, kann das Polynukleotid auch an anderen Stellen
des viralen Genoms, beispielsweise im U3-Bereich der LTR-Sequenz, vorliegen.
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Bevorzugte
replizierende virale Konstrukte oder Genome dieser Erfindung und
insbesondere bevorzugte retrovirale Konstrukte oder Genome dieser Erfindung
umfassend: (i) funktionale gag-, pol- und env-Gene, (ii) ein Polynukleotid,
das in die Zellen zugeführt
werden soll, (iii) eine retrovirale Verpackungssequenz und (iv)
wenigstens eine retrovirale LTR-Sequenz, sind weiter dadurch charakterisiert,
dass:
- – sie
für ein
modifiziertes Hüllprotein
mit einem modifizierten Wirtsspektrum (d. h. Hülle mit neuer Spezifität) kodieren,
und/oder
- – sie
für ein
modifiziertes Hüllprotein
kodieren, das ein ausgewähltes
Epitop umfasst, und/oder
- – sie
eine modifizierte LTR-Sequenz umfassen, die in Anwesenheit eines
aktivierenden Polypeptids aktiv ist, und/oder
- – das
Polynukleotid αGal4
kodiert, und/oder
- – das
Polynukleotid für
ein immunogenes Polypeptid oder ein Zytokin kodiert und/oder
- – das
Polynukleotid für
ein (konditionales) toxisches Molekül kodiert, und/oder
- – das
Polynukleotid einen regulierten oder spezifischen Promoter umfasst.
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Diese
Charakteristika können
innerhalb der viralen Konstrukte dieser Erfindung als jegliche Kombination
davon vorliegen. Vorzugsweise liegen wenigstens ein oder zwei der
Merkmale innerhalb der Konstrukte vor.
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Wie
oben angedeutet können
die replizierenden (retro-) viralen Konstrukte der vorliegenden
Erfindung beispielsweise eine Nukleinsäure, ein Plasmid, ein Vektor
oder ein Virus sein, die das oben offenbarte Genom umfassen.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das retrovirale Konstrukt ein retroviraler Vektor
oder Plasmid, d. h. eine lineare oder zirkuläre Nukleinsäure (RNA oder DNA), die ein
rekombinantes replikations-kompetentes (retro-) virales Genom wie
oben definiert umfasst.
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Dementsprechend
liegt die Erfindung in einem Aspekt in einem Plasmid, das ein rekombinantes
replikations-kompetentes retrovirales Genom wie oben definiert umfasst,
sowie in jeder Zusammensetzung, die solch ein Plasmid umfasst. Die
Erfindung liegt auch in einem Verfahren zur Zufuhr eines Polynukleotids
in Zellen umfassend das in Kontaktbringen der Zellen (Kultur, Gewebe,
Organ, etc.) in vitro, ex vivo oder in vivo mit dem Plasmid oder
der Zusammensetzung.
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Diese
Ausführungsform
ist vorteilhaft, weil die Plasmid- oder Vektorkonstruktionen, die
Manipulationen und die Herstellung in jeder geeigneten Wirtszelle
gemäß konventioneller
rekombinanter DNA-Techniken durchgeführt werden können. Beispielsweise
ist in einer besonderen Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung das retrovirale Konstrukt ein Plasmid, das
ein rekombinantes, replikations-kompetentes retrovirales Genom wie
oben definiert und einen Replikationsursprung umfasst, der in einer
Wirtszelle, beispielsweise einer prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszelle, funktional ist. Das Plasmid kann daher in jeder passenden
Wirtszelle wie Bakterien (z. B. E. coli) oder Hefezellen (z. B.
Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.) zubereitet werden, und es besteht
kein Bedarf an einer stabilen Verpackungszelllinie, einer begrenzten
Umwelt, komplexer Aufreinigungsverfahren, etc. In einem besonderen
Aspekt dieser Erfindung kann das Plasmid ferner ein Markergen umfassen,
das die Konstruktion, Manipulation und Produktion davon in vitro
weiter erleichtert.
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Ein
anderer Vorteil dieser Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung ist, das hohe Grade an Plasmidtransduktion
nicht notwendig sind, um eine effiziente Genzuführ zu erhalten. Tatsächlich dringt das
Plasmid oder der Vektor nach Berührung
mit der Zelle, der Kultur, dem Gewebe, dem Organ, oder dergleichen
in die Zellen ein und erlaubt es dem rekombinanten retroviralen
Genom zu replizieren (normalerweise nach dessen Integration in das
Wirtsgenom). Das replizierte rekombinante retrovirale Genom wird
dann in retrovirale Partikel verpackt, die durch Assemblierung der
Kern- und Hüllproteine,
die von den funktionalen gag und env-Genen exprimiert werden, gebildet
werden, und anschließend
außerhalb
der transduzierten Zellen freigesetzt wird. In Anbetracht der Replikations-
und Verpackungseffizienz von Retroviren erlaubt dieses Verfahren
die Herstellung großer
Mengen an rekombinanten replikationskompetenten retroviralen Partikeln
von einem Plasmid oder Vektor aus, das/der in einer Zelle eingebaut ist.
Diesbezüglich
zeigen die Beispiele, die noch folgen werden, klar die effiziente
Ausbreitung des rekombinanten Retrovirus. Dementsprechend erlaubt dieses
Verfahren sogar dort, wo der anfängliche
Kontaktschritt nicht verbessert oder optimiert ist, die Produktion
großer
Mengen infektiöser,
rekombinanter, replikations-kompetenter retroviraler Partikel, die sich
ausbreiten können
und umgebende Zellen infizieren können, und eine hohe Polynukleotidtransfereffizienz
in vitro, ex vivo oder in vivo erlauben.
-
Die
Erfindung liegt daher auch in Verfahren der Zufuhr eines Polynukleotids
an eine Zelle in virtro, ex vivo oder in vivo, die das Kontaktieren
der Zelle mit einem Plasmid oder einer Zusammensetzung wie oben
beschrieben umfassen. Die Erfindung liegt auch in der Verwendung
eines Plasmids oder einer Zusammensetzung wie oben beschrieben für die Zubereitung
einer Zusammensetzung für
die Zufuhr eines Polynukleotids in eine Zelle in vitro, ex vivo
oder in vivo.
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In
einer besonderen Ausführungsform
kann der Kontaktierungsschritt in Anwesenheit jedes Agens oder jeder
Behandlung durchgeführt
werden, von dem/der bekannt ist, dass es/sie die Zelltransduktion
erleichtert. Diesbezüglich
ist von verschiedenen Transfektionsagenzien in der Literatur berichtet worden
wie Liposomen, kationische Lipide, Peptide, Polymere, etc., sowie
physikalische Behandlungen wie elektrisches Feld, Genkanone, ballistische
Verfahren und dergleichen. Jede solche Behandlung und/oder jedes
solche Verfahren kann auf den anfänglichen Kontaktierungsschritt
angewendet werden, um die Transduktion des Plasmids, falls notwendig
weiter zu steigern. Alternativ kann der Kontaktierungsschritt mit
nackten DNA- Plasmidzusammensetzungen
durchgeführt
werden, speziell für
die intramuskuläre
Genzufuhr. Natürlich
kann jedes andere Verfahren, Agens, Behandlung oder Bedingung, von der
bekannt ist, dass sie den Kontaktierungsschritt verbessert, bei
der Durchführung
des vorliegenden Verfahrens verwendet werden.
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In
besonderen Ausführungsformen
kann der Kontraktierungsschritt mittels liposomen-, kationischem
lipid-, polymer- oder peptid-vermittelter Transfektion durchgeführt werden.
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In
einer weiteren besonderen Variante der Erfindung wird ein replikations-inaktiviertes
Virus verwendet, um den obigen Vektor/das Plasmid oder, allgemeiner
gesagt, das replizierende virale Genom den Zellen zuzuführen. Diesbezüglich kann
das retrovirale Genom (oder Vektor/Plasmid) in einen inaktivierten
adenoviralen oder AAV-Vektor, ein Herpesamplikon, einen Vacciniavirusvektor?
oder dergleichen eingesetzt werden. Der anfängliche Kontaktierungsschritt
bezieht daher beispielsweise die Infektion der Zelle, der Kultur,
des Gewebes oder des Organs mit dem entsprechenden Virus (z. B.
Adenoviren, AAVs, HSV, Vaccinia) mit ein.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das replizierende retrovirale Konstrukt
ein rekombinantes Retrovirus, das das rekombinante, replikationskompetente
retrovirale Genom, wie es oben definiert ist, umfasst.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt daher in einem replizierenden
Retrovirus, das ein rekombinantes, replikations-kompetentes retrovirales
Genom wie oben definiert umfasst, sowie jede Zusammensetzung, die
solch ein Retrovirus umfasst, und deren Verwendungen. Noch bevorzugter
wird das Polynukleotid im replizierenden Genom außerhalb
der LTR-Sequenzen eingesetzt, vorzugsweise 3' des env-kodierenden Bereichs, sogar
noch bevorzugter stromabwärts
einer Splice-Akzeptorstelle.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kodiert das replizierende retrovirale Gen für ein modifiziertes env-Glykoprotein,
d. h. ein env-Protein mit neuer Spezifität mit modifizierten Tropismus,
was insbesondere die bevorzugte Infektion (einer) ausgewählten Zellpopulation(en),
Gewebe(n) oder Organen) erlaubt, und/oder ein immunogenes env-Protein (das
ein ausgewähltes
Epitop enthält),
wie weiter unter noch detaillierter diskutiert werden wird.
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Natürlich kann
in einer besonderen Ausführungsform
das replizierende retrovirale Genom die zwei obigen Merkmale sowie
andere, die später
in dieser Anmeldung beschrieben werden, kombinieren.
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Falls
gewünscht
kann das rekombinante Retrovirus, das das rekombinante, replikationskompetente
retrovirale Genom umfasst, in vitro hergestellt werden, entweder
mittels transienter Transfektion einer kompetenten Zelle mit dem
retroviralen Konstrukt, oder von einer korrespondierenden stabilen Verpackungszelllinie,
d. h. einer Population von Zellen, die das replikations-kompetente
retrovirale Genom wie oben definiert in ihrem Genom integriert umfassen.
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Die
in vitro Herstellung mittels transienter Transfektion kann wie oben
beschrieben erreicht werden mittels Kontaktierung einer kompetenten Zellpopulation
mit einem retroviralen Vektor oder Plasmid, der ein replikations-kompetentes
retrovirales Genom umfasst, gefolgt von der Wiedergewinnung der
hergestellten rekombinanten Retroviren. Kompetente Zellen können beispielsweise
jegliche Säugetier-
oder Insektenzellen sein, die in Kultur gezüchtet werden können, die
keine wesentliche pathogene Aktivität ausüben, und die ein retrovirales
Genom replizieren können.
Die Zelle kann als immortalisierte Zelllinie, oder als eine Kultur
von primären Zellen
etabliert werden. Noch bevorzugter ist die kompetente Zelle einer
Säugetierzelle
wie eine Nagerzelle, eine Primatenzelle oder einer humane Zelle.
Spezifische Beispiele schließen
Fibroblasten (beispielsweise NIH 3T3), Retinoblasten, Nierenzellen
(z. B. 293 Zellen) und dergleichen mit ein. Andere Beispiele für kompetente
Zellen oder Zelllinien sind beispielsweise in
EP 243 204 , WO 89/07150, WO 90/02806
oder WO 93/10218 beschrieben worden.
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Alternativ
kann wie oben erwähnt
eine Verpackungszelle zubereitet werden, die ein rekombinantes replikations-kompetentes
Retrovirus der vorliegenden Erfindung herstellt. Für diesen
Zweck wird eine Population kompetenter Zellen, die als Zelllinie etabliert
sind, mit einem retroviralen Vektor oder Plasmid, der/das ein replikations-kompetentes
retrovirales Genom und gegebenenfalls ein Markergen umfasst, kontaktiert.
Klone kompetenter Zellen mit stabil integriertem retroviralen Genom
können
selektioniert und subkultiviert werden. Danach können Zellbanken, einschließlich Masterzellbanken,
die mittels verschiedener Techniken wie beispielsweise PCR auf stabile
Integration des rekombinanten retroviralen Genoms überprüft werden,
zubereitet werden und unter geeigneten Bedingungen gelagert werden. Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet stabile Integration des
Genoms, dass das rekombinante retrovirale Genom innerhalb des Genoms
der Wirtszelle über
einen Zeitraum von mindestens 20 Generationen (d. h. über 20 Zellteilungen)
integriert bleibt. Die Herstellung ausgehend von solchen Verpackungszelllinien
umfasst (i) das Kultivieren der Zellen in geeignetem Medium und
unter geeigneten Bedingungen, um die Replikation des Genoms, die
Expression der Kern- und Hüllproteine,
die Verpackung und Freisetzung des Retrovirus zu erlauben, (ii)
gefolgt von der Wiedergewinnung der hergestellten Viren.
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Diesbezüglich liegt
ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung in einer retroviralen
Verpackungszelle, wobei die Verpackungszelle in ihrem Genom integriert
ein rekombinantes replikations-kompetentes retrovirales Genom wie
es oben beschrieben ist, umfasst. Wie zuvor diskutiert stellen die
zuvor beschriebenen retroviralen Verpackungszellen replikationsinaktivierte
Retroviren her. Im Gegensatz dazu erlauben die Verpackungszellen,
wie sie hier beansprucht werden, die Herstellung replizierender
Retroviren.
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Wo
rekombinante Viren verwendet werden kann, die Kontaktierung zwischen
der Zellpopulation und dem rekombinanten Retrovirus in vitro, ex
vivo oder in vivo mittels Inkubation der Zellen in Anwesenheit einer
Suspension von Retroviren erfolgen. Die Suspension kann ein Überstand
einer Verpackungszelllinienkultur, die das Virus herstellt, oder
eine Verdünnung
oder ein Konzentrat davon sein. Die Suspension kann auch teilweise
aufgereinigter Überstand
sein, in dem die Viren angereichert wurden, und gemäß bekannter
Verfahren (d. h. Grandientenzentrifugation, Chromatographie oder
dergleichen) erhalten wird. Die Inkubation wird allgemein mit einer Retrovirensuspension
durchgeführt,
die zwischen ungefähr
104 und 107, noch
bevorzugter zwischen ungefähr
104 und 106 virale
Partikel umfasst. Man sollte verstehen, dass die genaue Virusmenge
pro in diesem Verfahren verwendeter Zelle vom Fachmann ohne übermäßiges experimentieren
angepasst werden kann. Das Kontaktieren kann auch mittels Cokultivieren
der Zielzellen, des Gewebe, der Organe, etc. mit Verpackungszellen
wie sie oben beschrieben sind (für
in vitro- oder ex vivo-Verwendungen) oder mittels in vivo-Transplantation
der Verpackungszellen wie oben beschrieben erhalten werden.
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Wie
in den Beispielen illustriert stellt die Verwendung eines (abgesicherten)
replizierenden viralen Konstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung eine
sehr effiziente Weise der Zufuhr von Nukleinsäuren in Zellen in vitro, ex
vivo oder in vivo dar, insbesondere an proliferierende Zellen, noch
bevorzugter an Tumorzellen.
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Das Polynukleotid
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Die
vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um im Wesentlichen
jedes Polynukleotid einer Zelle, Kultur, Gewebe, Organ oder Organismus zuzuführen. Noch
bevorzugter kann das Polynukleotid jede DNA, cDNA, synthetische
oder semi-synthetische DNA, RNA, mRNA, etc. sein. Das Polynukleotid
umfasst vorzugsweise weniger als 10 kb, noch bevorzugter weniger
als 5 kb. Bevorzugte Polynukleotide, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden sollen, umfassen zwischen 200 und 4000 bp. Die Polynukleotide
können
zusätzlich
einen Promoterbereich oder andere Expressionssignale umfassen, obwohl,
wie oben erklärt
wurde, die Anwesenheit solcher Elemente nicht notwendig sein mag,
um eine einwandfreie Expression sicherzustellen.
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Vorzugsweise
ist das Polynukleotid heterolog bezüglich des retroviralen Konstrukts,
d. h. es stammt nicht vom für
die Herstellung der Konstrukte verwendeten Retrovirus ab. Das Polynukleotid
kann jedoch, wie zuvor angedeutet, auch virale oder retrovirale
Proteine kodieren, wie beispielsweise fusogene retrovirale Hüllproteine
(VSV-G, GALV, etc.) oder immunogene Hüllproteine wie die HIV-Hülle, Poliohülle, oder
modifizierte Hüll-Proteine,
die ein antigenes Peptid in ihrer Sequenz umfassen. In solchen Ausführungsformen
würde das
Polynukleotid durch das env oder ein entsprechendes retrovirales
Gen ersetzt. Besondere Beispiele schließen MoMLV retrovirale Konstrukte
mit ein, die mit einer Nukleinsäure pseudotypisiert
wurden, die für
ein heterologes Hüllprotein,
z. B. eine HIV-Hülle,
kodiert. In solch einer Ausführungsform
ist das Polynukleotid das env-Gen.
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Alternativ
kann das env-Gen modifiziert werden, so dass es eine Sequenz enthält, die
für ein
antigenes Peptid kodiert. In dieser Ausführungsform ist das Polynukleotid
daher eine Nukleinsäure,
die für ein
retrovirales, modifiziertes Hüll-Protein
kodiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist das retrovirale Konstrukt vom MoMLV-Typ, die Hülle von
einem anderen Typ (z. B. HIV), und das Polynukleotid kodiert ein
immuno-stimulatorisches Polypeptid wie ein Zytokin (z. B. IL-2).
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Das
Polynukleotid kann für
jedes Produkt von Interesse kodieren, einschließlich einer oder mehrerer RNAs,
eines oder mehrerer Peptide, eines oder mehrerer Polypeptide und/oder
eines oder mehrerer Proteine. Das kodierte Produkt kann eine biologische
Aktivität
ausüben, beispielsweise
therapeutische oder immunogene Aktivitäten. Es kann auch eine toxische
Aktivität,
eine Markereigenschaft, eine Antisense-Aktivität, etc., ausüben. Man
glaubt, dass die vorliegende Erfindung vom Fachmann mit im Prinzip
jeder Art von Polynukleotid verwendet werden kann.
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Das
Polynukleotid kodiert vorzugsweise ein Produkt, das in Säugetierzellen,
wie humanen Zellen, biologisch aktiv ist.
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Beispiele
für Polynukleotide
schließen
jedes Suizid- oder toxische Gen mit ein, insbesondere konditional
toxische Gene wie Thymidinkinase, Cytosindeaminase, oder dergleichen,
oder andere bakterielle Toxine oder fusogene retrovirale Hüllen. Das
Polynukleotid kann auch Tumorsupressorproteine kodieren wie p53,
Rb, E1, BRCA1, etc., Zytokine (z. B. IL-2, oder jedes andere Lymphokin
we TNF, IFN, etc.), antiangiogene Faktoren, antigene Peptide, Wachstumsfaktoren
(G-CSF, GM-CSF, BDNF, CNTF, etc.) und dergleichen. Das Polynukleotid
kann auch Einzelkettenantikörper,
Antisens RNAs, Ribozym und dergleichen kodieren.
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Kontrolle der Virusausbreitung
-
Wie
zuvor erwähnt,
stammt die Erfindung von einem neuen Konzept der Verwendung replikations-kompetenter
viraler Konstrukte zur Zufuhr von Genen in Zellen in vitro oder
in vivo ab. Im Stand der Technik sind immer Anstrengungen unternommen worden,
um die Replikation von rekombinanten Viren zu vermeiden (komplexe
Verpackungzellen), hochgradig deletierte virale Konstrukte, etc.).
Die Erfindung nimmt jetzt in Anspruch, dass die Replikation von
viralen Konstrukten toleriert werden kann, und zieht Vorteil aus
der Replikation, um die Zufuhr des Polynukleotids und dessen Expression
zu steigern. Es wird in der Tat vorgeschlagen, dass die Replikation
einiger Retroviren (beispielsweise MoMLV Retroviren) keinen wesentlichen
pathologischen Krankheitszustand in Patienten induzieren würde. Insbesondere
wird vorgeschlagen, dass solch potenziell ungünstigen Effekte (i) stark ausgeglichen
werden durch die biologischen Vorteile, die von diesem Zufuhrsystem
erhalten werden, und (ii) mittels verschiedener Verfahren und Konstrukte
kontrolliert werden können
(beispielsweise wo andere Retroviren verwendet werden). Für diesen
Zweck sind mehrere Strategien möglich,
die bevorzugte spezifische Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung darstellen. Diese Strategien können alleine
oder in Kombinationen verwendet werden.
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Als
vorläufige
Bemerkung sollte zur Kenntnis genommen werden, dass bestimmte Retroviren,
beispielsweise MoMLV, im Wesentlichen sich teilende Zellen infizieren,
sodass die Ausbreitung der retroviralen Genome, die mittels MoMLV-Sequenzen
konstruiert wurden, beschränkt
ist auf solche sich teilende Zellen und sich normalerweise nicht
auf ruhende Zellen erstrecken würde.
Die Virusausbreitung kann jedoch auch dort, wo andere Retroviren
wie Lentiviren, die auch ruhende Zellen infizieren, verwendet werden,
mittels jedes einzelnen der folgenden Verfahren oder Konstrukte,
entweder allein oder in Kombination(en), kontrolliert oder eingeschränkt.
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In
einer besonderen Ausführungsform
wird die Virusausbreitung mittels Viren mit neuer Spezifität weiter
kontrolliert. In der Tat wird der Tropismus eines Retrovirus im
Wesentlichen durch das Hüll-Glykoprotein
bestimmt. Das retrovirale Oberflächenprotein
SU der Hülle
ist hauptsächlich
verantwortlich für die
Bindung des Virus an einen spezifischen Zellobenflächenrezeptor,
und die TM-Untereinheit löst
Ereignisse nach dem Binden aus, was zur Membranfusion und zum viralen
Eintritt führt
(Ragheb et al., J. Virol. 68 (1994) 3207). Es ist offenbart worden,
dass das Hüll-Glykoprotein
beispielsweise modifiziert werden kann, um einen spezifischen Rezeptorliganden oder
ein Rezeptorfragment einzubauen, und dass die resultierenden Hüll-Proteine
eine gezielte Infektion von Zellen, die den Rezeptor oder den Liganden
exprimieren, zur Verfügung
stellt. Dementsprechend hat das Hüll-Protein, das durch die replizierenden oder
semi-replizierenden viralen Genome kodiert wird, zur Kontrolle der
Ausbreitung der Viren in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung einen modifizierten
Tropismus, der die Spezifität
der retroviralen Anlagerung neu ausrichtet. Beispiele für solche
Hüll-Proteine
mit modifiziertem Tropismus schließen Membranproteine mit Affinität für CD4, retrovirale
Hüll-Proteine,
die eine TM-Untereinheit fusioniert an ein Peptid umfassen, beispielsweise
ein Hepatozytenwachstumsfaktorfragment (Nguyen et al., Hum. Gene
Ther. 9 (1998) 2469), sowie amphotrope Hüll-Proteine fusioniert an ihrem
N-terminalen Ende an Liganden wie beispielsweise Einzelkettenantikörper, mit
ein.
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Die
Virusausbreitung kann auch durch die Verwendung von gewebespezifischen
und/oder regulierten (z. B. induzierbaren) Promotoren kontrolliert werden,
d. h. Promoterbereiche, die besonders in bevorzugten Zellen, Geweben
oder Organen, und/oder bestimmten Bedingungen aktiv sind. Diesbezüglich kann
eine gezielte Expressionskontrolle auf verschiedenen Stufen eingeführt werden,
abhängig
von der Struktur der verwendeten viralen Konstrukte. Beispielsweise
kann da wo das Polynukleotid seinen eigenen Promoterbereich umfasst,
eine gezielte Expression des Polynukleotids mittels Einführen eines selektiven
und/oder regulierten Promoters in das Polynukleotid erreicht werden.
Alternativ ist es dort, wo die Expression des Polynukleotids mittels
des Promoterbereichs der LTR kontrolliert wird, möglich, den LTR-Bereich so zu mofifizieren,
dass eine selektive und/oder regulierte Expression darauf übertragen wird.
Insofern kann der 3' U3-Bereich
der LTR mit jeder gewebespezifischen/regulierten regulatorischen Sequenz
konstruiert werden, sodass nach reverser Transkription die 5' LTR die Expression
der viralen Gene und Polynukleotide mit den regulatorischen Sequenzen
kontrolliert.
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Mehrere
Kandidaten für
einen selektiven und/oder regulierten Promoter oder regulatorische Bereiche
können
verwendet werden, beispielsweise ein Promoter (oder Fragmente davon),
der die präferentielle
und/oder regulierte Expression in bestimmten Tumorzellen (z. B.
Hepatokarzinom, Colonkarzinom, Glioblastom) oder in anderen anormal-proliferierenden
Zellen, einschließlich
beispielsweise Zellen des hämatopoetischen
oder Nervensystems, gestattet. Besondere Beispiele selektiver und/oder
regulierter Promoteren schließen
beispielsweise ein:
- – den Alpha-Fetoprotein(AFP)-Promoter,
der in ungefähr
40 % der primären
Lebertumore exprimiert wird (Mawatari et al., Cancer Gene Ther.
5 (1998) 301). Frühere
Studien haben gezeigt, dass der humane AFP-Promoter eine präferentielle
Expression eines Reportergens in Häpatokarzinomzellen gestattet.
Darüber
hinaus ist selektive Häpatokarzinomexpression
mit dem AFP-Promotor im Kontext retroviraler Vektoren beobachtet
worden.
- – der
AldolaseA-Promotor, der in Lebertumoren exprimiert wird, insbesondere
in Patienten mit HCC (Moch et al., Transgenic Research 7 (1998) 113;
Guillouzo et al., J. Cell Sci. 49 (1981) 249).
- – der
Promotor des Pankreas-assoziierten Proteins (PAP/HIP), der in bis
zu 70 % der Häpatokarzinome überexprimiert
wird (Christa et al., J. Hepatol. 30 (1999) 105). Der PAP/HIP-Promotor scheint
in HCC-Zellen streng reguliert zu sein, und ein 1,3 kb-Fragment davon regelt
eine hochpräferentielle
Expression in HCC-Zellen.
- – der
Promotor des karzinoembryonalen Antigens (CEA), der insbesondere
im Colonkarzinom (CC) aktiv ist. Von diesem Promotor wurde schon
gezeigt, dass er im viralen Kontext selektiv bleibt (Richards et
al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 881).
- – der
Promotor des glialen fibrinären
sauren Proteins (GFAP;) und der Promoter des basischen Myelinproteins
(MBP), von denen gezeigt wurde, dass sie präferentiell die Transkription
in Glioblastomzellen initiieren (McKie et al., Gene Ther. 5 (1998)
440; Morelli et al., J. Gen Virol. 80 (1999) 571).
- – Interleukinpromotoren,
die verwendet werden können,
um präferentielle
Expressionen in bestimmten hämtopoetischen
Zellen zur Verfügung zu
stellen,
- – jeder
Promoter, einschließlich
gewebe-selektiver Promotoren (beispielsweise neuronale und endokrine
Promotoren mit beispielsweise neuronaler, glialer und hypophyser?
spezifischer Aktivität)
kombiniert mit regulatorischen Sequenzen wie den tetrazyklinregulierbaren
Expressionssequenzen (Smith-Arica et al., Cold Spring Harbor, Spring
Meeting, 1999) oder jedem anderem modifizierten transkriptionalen
Aktivator.
-
Man
sollte verstehen, dass jeder andere Promoter oder regulatorische
Sequenz, der/die eine selektive und/oder regulierte Expression vermitteln, vom
Fachmann verwendet werden kann.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform
kann die Virusausbreitung mittels des Produkts, das vom Polynukleotid
selbst kodiert wird, kontrolliert werden. Beispielsweise kann das
Polynukleotid eine Sequenz umfassen, die ein (konditional) toxisches Molekül kodiert,
das verwendet werden kann, um infizierte Zellen zu zerstören. Solch
ein konditional toxisches Molekül
kann beispielsweise eine Thymidinkinase, eine Cytosindeaminase,
Derivate davon und dergleichen sein, die in der Lage sind, einen
Metaboliten (z. B. ein Nukleosidanalogon bzw. 5-FU) in ein Produkt umzuwandeln, das
die infizierten Zellen zerstört.
Die Sequenz, die ein (konditional) toxisches Molekül kodiert
kann dem Polynukleotid in Kombination mit einer weiteren kodierenden
Sequenz, die ein biologisches Produkt herstellt, zugefügt werden.
Es kann natürlich
auch als ein biologisch-aktives Gen/Produkt verwendet werden, beispielsweise
zur Krebsbehandlung. Das Polynukleotid kann auch für andere
toxische Moleküle
wie fusogene Hüll-Proteine,
die zum Tod der infizierten Zelle führen, kodieren.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform
kodiert das replizierende virale Konstrukt für ein Polypeptid, das die infizierten
Zellen sensitiv gegenüber
Zellen des Immunsystems macht und daher deren Eleminierung durch
den Wirtsorganismus verursacht oder stimuliert. Ein besonderes Beispiel
eines solchen Polypeptids ist die α-Galaktosyltransferase (αGAL4), wie
in Gollogly et al. (Neoplasma 43 (1996) 285) beschrieben. αGAL4 ist
ein bakterielles Enzym das nicht in humanen Zellen exprimiert wird
und das besondere Glykosylierungsmotive schafft. Insbesondere führt αGAL4 alpha-(1
bis 3)-Galaktosylmotive auf Glykolipiden ein, ein Motiv, das in
humanen Zellen nicht anwesend ist. Dieses Motiv wird jedoch von vielen
Bakterien exprimiert, und Menschen haben hohe Konzentrationen an
natürlichen
Antikörpern, die
dagegen gerichtet sind. Durch Einführung einer Nukleinsäure, die
für solch
ein Polypeptid kodiert, in replizierende Viren der vorliegenden
Erfindung, können
virale Partikel und infizierte Zellen durch das Immunsystem des
Wirts neutralisiert und zerstört
werden, wodurch die virale Ausbreitung kontrolliert wird. Außerdem kann
das αGAL4
auch als therapeutisches Gen oder Produkt fungieren, wo die Zerstörung de:
erkrankten Zellen (beispielsweise Tumorzellen) beabsichtigt wird.
Diesbezüglich
beschreibt in einer besonderen Ausführungsform die vorliegende
Erfindung ein replizierendes virales Konstrukt, das eine Nukleinsäure umfasst,
die für
ein αGAL4-Polypeptid kodiert.
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Andere
Beispiele für
solche Polypeptide schließen
antigene Peptide, noch bevorzugter von Mikroorganismen, gegen die
die Menschen vacciniert sind oder vacciniert werden können (beispielsweise
antigene Peptide vom Tetanustoxoid oder von Hepatitis) und/oder
immunostimulatorische Moleküle (wie
beispielsweise Interleukin-2 oder andere Zytokine) mit ein. Die
Expression eines solchen Polynukleotids bewirkt eine Immunantwort
des Wirts gegen die Peptide, Proteine und/oder Moleküle, was
zu einer Immunantwort gegen die mit den retroviralen Konstrukten
transfizierten Zellen führt.
Diese Immunantwort produziert daher (i) den erwarteten biologischen Effekt
der Polynukleotidzufuhr und -expression und führt (ii) zur Eliminierung der
infizierten Zellen im Organismus. Dementsprechend ist die Verwendung
der vorliegenden Erfindung zur Bewirkung einer Immunantwort (d.h.
zellulär
oder Antikörper)
vorteilhaft, weil sie den Effekt hat, die Virusausbreitung zu kontrollieren,
wenn der gewünschte
Immuneffekt erhalten wird.
-
Diesbezüglich liegt
eine besondere Ausführungsform
dieser Erfindung in einer Zusammensetzung replizierender viraler
Konstrukte, wie sie oben definiert sind, wobei die viralen Konstrukte
ein Polynukleotid, das für αGAL4 oder
ein antigenes Peptid kodiert, umfassen und, in Kombination oder
separat, ein Polynukleotid umfassen, das für ein Zytokin, noch bevorzugter
für IL-2,
kodiert. Noch bevorzugter umfasst die Zusammensetzung wenigstens
ein erstes replizierendes virales Konstrukt umfassend ein Polynukleotid,
das für αGAL4 oder
ein antigenes Peptid kodiert, und wenigstens ein zweites replizierendes
virales Konstrukt umfassend ein Polynukleotid, das für ein Zytokin,
noch bevorzugter für
IL-2, kodiert, für
die simultane, separate oder sequenzielle Verwendung.
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Noch
eine weitere Herangehensweise, um die Virusausbreitung in vivo zu
kontrollieren, umfasst die Verabreichung neutralisierender Verbindungen, beispielsweise
neutralisiernde Antikörper
oder antivirale Verbindungen, die die Retroviren inaktivieren können. Diesbezüglich sind
mehrere retrovirus-neutralisierende monoklonale Antikörper im
Stand der Technik offenbart. Wenn der Vektor ein antigenes Peptid
von einem Mikroorganismus umfasst, beispielsweise das Tetanustoxoid,
können
Immunseren, die gegen diesen Mikroorganismus erzeugt wurden und
die allgemein klinisch verwendet werden, vorteilhaft in dieser Anordnung
verwendet werden. Geeignete antivirale Verbindungen schließen auch
beispielsweise AZT (Zidovudin) oder andere Didesoxynukleotidanaloga
wie DDC (Didesoxycytosin) und DDI (Didesoxyinosin), Antiproteasen
wie Protease p12- und Protease p15-Inhibitoren, Kombinationen davon,
Vakzine und dergleichen mit ein. In einer besonderen Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
der Zufuhr von Polynukleotiden in vivo daher die Co-Verabreichung
von (i) replizierenden retroviralen Konstrukten, wie sie oben offenbart sind
und (ii) eine neutralisierende Verbindung, beispielsweise ein neutralisierender
monoklonaler Antikörper
(oder Derivate davon) wie die Fab-Fragmente, Einzelkettenantikörper, etc.)
oder eine antivirale Verbindung oder Behandlung. In einer besonderen
Ausführungsform
werden die replizierenden retroviralen Konstrukte an ein Gewebe
oder Organ verabreicht und die neutralisierende Verbindung wird
beispielsweise mittels intravenöser
Injektion verabreicht. Die Co-Verabreichung impliziert nicht die
simultane Verabreichung, deutet aber an, dass, um die Kontrolle über die
Virusausbreitung zur Verfügung
zu stellen, die neutralisierenden Moleküle verabreicht werden sollten
(d. h. entweder vor den retroviralen Konstrukten oder ungefähr zur gleichen
Zeit, oder sogar anschließend).
-
Darüber hinaus
kann die Kontrolle über
die Virusausbreitung auch vorteilhaft erreicht werden unter Verwendung
retroviraler Konstrukte mit (modifizierten) Hüll-Proteinen, gegen die der
Wirtsorganismus bereits immunisiert wurde, oder leicht immunisiert
werden kann. Diesbezüglich
wird die virale Ausbreitung eingeschränkt sein, wo der Wirt schon
anti-env-Antikörper aufweist.
Alternativ kann der Wirt, um die Virusausbreitung zu kontrollieren,
vor oder ungefähr
zur gleichen Zeit, oder nach der Verabreichung der retroviralen
Konstrukte immunisiert werden (z. B. mittels eines Poliovakzins,
wenn das retrovirale Konstrukt mit der Poliohülle ist pseudotypisiert (sie
exprimiert), optional in Kombination mit anderen retroviralen Hüllen, beispielsweise
MoMLV- oder HIV-Hüllen).
Alternativ kann das Hüll-Protein
wie oben beschrieben modifiziert werden, sodass es ein Epitop enthält, das
von Antikörpern
oder Immunzellen des Wirtsorganismus erkannt wird. Diesbezüglich können in
das Hüll-Protein
Epitope ohne wesentliche Veränderung
der Aktivität
der Hülle
eingeführt
werden, wobei die Epitope an der Oberfläche des viralen Partikels oder
an der Oberfläche
der damit infizierten Zellen exponiert werden. Die Epitope können ausgewählt werden
aus Epitopen, gegen die Menschen immun sind oder leicht immunisiert
werden können. Solche
Epitope schließen
beispielsweise jedes immunogene Peptid ein, das abgeleitet wurde
von Tetanustoxin, Grippevirus, Poliovirus, Masernvirus, Hepatitisviren...
Das Epitop oder das Peptid sollte von ausreichender Größe sein,
um eine ordnungsgemäße Konformation
sicherzustellen, die die Erkennung durch Antikörper erlaubt, oder könnten kurze
Sequenzen im Allgemeinen unter 20 Aminosäuren, noch bevorzugter unter
15 Aminosäuren
sein, wenn die Erkennung durch CTLs beabsichtigt wird. Das antigene
Peptid wird vorzugsweise am C-terminalen Ende der Hülle eingeführt, um
dessen Exposition sicherzustellen. Nach Verabreichung (oder in vivo-Produktion)
solcher Viren können
die Partikel, die sich ausbreiten, mittels Antikörpern des Wirts neutralisiert und
eliminiert werden und die infizierten Zellen mittels Antikörpern oder
Zellen des Immunsystems zerstört
werden. Insofern umfasst in einer besonderen Ausführungsform
das Epitop (die Epitope) wenigstens 1 Klasse I MHC-Epitop, das durch
CTL-Lymphozyten erkannt wird, was zur Eliminierung der infizierten
Zellen führt.
Diese stellen besondere Ausführungsformen
und Verfahren dar/oder kontrollieren die virale Ausbreitung.
-
Modifikation
der Hülle,
um die Verpackungseffizienz zu erhöhen
-
Wie
oben erwähnt
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschenderweise gezeigt,
das das env-Gen einen negativen Effekt auf die Verpackung des retroviralen
Genoms in ein retrovirales Partikel ausübt. Diese unerwartete Entdeckung eröffnet neue
Strategien, um die Verpackungseffizienz für retrovirale Vektoren durch
Modifikation des env-Gens zu erhöhen.
Diesbezüglich
beschreibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz
eines retroviralen Vektors, wobei das Verfahren die Modifikation
des env-Gens im
retroviralen Vektor umfasst, um ein nicht-funktionelles env-Gen
zu schaffen. Die Modifikation umfasst noch bevorzugter die Deletion
des gesamten oder eines Teils des env-Gens, noch bevorzugter die Deletion
aller env-kodierenden Sequenzen. Dieses Verfahren kann auf alle
Typen von retroviralen Vektoren, wie sie oben erwähnt wurden,
angewendet werden und ist insbesondere geeignet für die Herstellung
von einander abhängiger
retroviraler Vektorsysteme, in denen wenigstens zwei retrovirale
Konstrukte verwendet werden (entweder simultan oder sequenziell),
und von denen eines inaktiviertes env aufweist.
-
Wie
in den folgenden Beispielen offenbart werden wird, stellt die vorliegende
Erfindung nun sehr effiziente Zusammensetzungen und Verfahren für die Zufuhr
von Polynukleotiden in Zellen in vitro, in vivo oder ex vivo zur
Verfügung.
Die Verwendung kann für
die experimentelle Forschung, klinische Forschung, im Menschen und/oder
im Tier, sowie für
therapeutische, diagnostische oder prophylaktische Behandlungen
verwendet werden.
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LEGENDE ZU
DEN FIGUREN
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1:
Konstruktion des pGH45-Plasmids
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2:
Herstellung des pGH2-Plasmids
-
3:
Molekulares Design des replikations-kompetenten MoMLV-Vektors. Im
MoMLV werden die offenen Leseraster von gag-pol und env von einem
gemeinsamen Promoter in der 5' LTR
(Pfeil) mit Hilfe alternativen Splicens exprimiert. Um den replikations-kompetenten
Vektor GH20 herzustellen, wurde eine zusätzliche Splice-Akzeptorstelle
stromabwärts
des env-Gens von MoMLV durch Duplikation von 0,4 kb der pol-Sequenz,
die den natürlichen
Akzeptorbereich (SA) enthält,
eingeführt.
Das Reportergen EGFP wurde stromabwärts des zweiten SA platziert.
Der Abstand zwischen der SA-Stelle und dem Startkodon des Transgens
ist ähnlich
zu dem der env-Transkriptionseinheit.
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4:
Vermehrung des Vektors. Subkonfluente Mono-Layers von NIH 3T3-Zellen
wurden mit dem replikativen Konstrukt GH20 (A) oder mit einem nicht-replizierenden
EGFP-exprimierenden
Vektor (B) bei einer niedrigen m.o.i. infiziert. Fluoreszierende
Fozi wurden 3 Tage nach der Infektion fotographiert.
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5:
Serielle Infektionen. NIH 3T3-Zellen wurden mit dem Vektor GH20
bei max. 103 focusbildenden Einheiten pro
Loch infiziert. Nach 3 Tagen wurden die Überstände geerntet und für die nächste Infektionsrunde
verdünnt.
Die Überstände wurden auf
ihren Titer mit NIH 3T3-Zellen
mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft.
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6:
Titration des Vektors. 500 μl
des Überstands
eines GH20 „Producerzellpools" wurden verwendet
um 105 NIH 3T3-Zellen zu infizieren. 3 Tage
nach der Infektion wurde der Titer mittels Fluoreszenzmikroskopie
bestimmt. Der Titer wurde mit dem Prozentsatz an EGFP-exprimierenden Zellen, wie
mittels FACS bestimmt wurde (A), verglichen. Um die Einstellungen
für die
FACS-Analyse zu offenbaren, wird die Infektion mit unverdünntem Überstand (B)
und uninfizierten NIH 3T3-Zellen (C) gezeigt.
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7:
PCR-Abschätzung
der wt-Rearrangements.
-
- A) ein vektor-spezifisches PCR-Produkt wurde amplifiziert,
das sich vom MoMLV-env bis zum 5'-Terminus
des EGFP Reportergens erstreckt.
- B) ein Primerpaar, das an das env-Gen bzw. an den U3-Bereich
der LTR bindet, ergibt mit MoMLV wt DNA als Matrize ein 1 kb-Fragment.
Ein vektor-spezifisches Fragment mit der theoretischen Größe von 2
kb wird bei den gewählten
Parametern nicht amplifiziert. Es wurden Lysate von 5 × 104 Zellen pro Reaktion analysiert, und Kontrollreaktionen
(Spuren 1–3)
wurden in einem äquivalenten
Hintergrund von NIH 3T3-genomischer DNA durchgeführt.
-
8:
Sequenz SEQ ID Nr. 6. Die Nukleotidposition 1 entspricht Nukleotid
7801 in pGH45. Das Element (I) an nt 427 ist das Stopkodon des env.
Das Element (II) an nt 437 stellt den Beginn des wiederholten pol-Bereichs
dar, der die SA-Stelle enthält,
der am Element (IV) an nt 802 endet. Dieser Bereich 437–802 ist
ein besonderes Fragment, das eine Splice-Akzeptorstelle umfasst.
Das Element (III) von nt 532 – nt
540 stellt die Splice-Akzeptorstelle dar. Das Element (V) an nt
840 (ATG) ist das Startkodon des EGFP-Gens.
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9:
Vergleich der Transgenexpression und der Wirksamkeit des therapeutischen
Gentransfers mittels replikativer oder inaktivierter retroviraler Vektoren,
die ein TK/GFP-Fusionsprotein
transduzieren. Die Balken stellen das mittlere Tumorgewicht für Tumore
dar, die mit einem replikativen oder inaktivierten Vektor transduziert
wurden, und/oder nicht mit Gancyclovir behandelt wurden. Für jede Gruppe ist
der Anteil an GFP-exprimierenden Zellen mittels der gestrichelten
Fläche
des Balkens dargestellt.
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10:
Behandlung etablierter Tumore mittels replikativer oder inaktivierter
Vektoren, die ein TK/GFP-Fusionsgen transduzieren.
-
BEISPIELE
A – Zubereitung
und Verwendung replizierender viraler Konstrukte
-
Um
den replizierenden MoMLV Vektor pGH45 herzustellen, wurde das Reportergen
stromabwärts
des env-Gens hinter einer Kopie des viralen Splice-Akzeptorbereichs
platziert. Die beschriebenen Konstrukte sind in der Genomischen
Struktur LTR-gagpol-env-EGFP-LTR. Zwischen dem env-Gen und dem EGFP
Reportergens wurde ein 0,4 kb Fragment des MoMLV pol-Gens, das die
bekannten kritischen Bereiche des Splice-Akzeptors enthält, eingesetzt.
Die Mechanismen der Splicekontrolle in MoMLV sind bislang nicht
gut verstanden. Während
die Expressionsniveaus des Transgens von der Akzeptanz der zusätzlichen
Splice-Akzeptorstelle abhängen,
wird von einem Übersplicen
an dieser Stelle erwartet, dass das Viruswachstum durch die Reduktion der
Menge an genomischer RNA voller Länge oder durch Interferenz
mit dem Prozessieren der enc-Boten-RNA ausgesetzt wird. Überraschenderweise
erlaubt die gewählte
Konfiguration sowohl eine effiziente Expression des Reportergens
als auch eine Replikation des viralen Vektors.
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Darüber hinaus
wurde die beabsichtigte Abschwächung
des Vektors mittels gezielter Deletion des env-Gens in GH45 mit
hoher Frequenz beobachtet. Klone infizierter Zellen wurden auf die
erwartete Deletion mittels PCR getestet (Daten nicht gezeigt). Ungefähr 30 %
(8 von 28) der EGFP-exprimierenden Klone, die nach 3 Infektionsrunden
isoliert wurden, zeigten im PCR-Test die env deletierte Form.
-
A.1. Herstellung des replizierenden
Vektors pGH45 (1–3)
-
Die
Plasmide pMLM38 und pET47 wurden als Quelle für die Sequenzen um die Splice-Akzeptorstelle, die
in den Vektor eingeführt
werden sollten, verwendet. Die transkriptionelle Startstelle des Transgens
an der beabsichtigten Splice-Akzeptorstelle enthielt ein zusätzliches
aberrantes ATG-Signal und wurde wie folgt korrigiert:
pGH1
Das
Plasmid pMLM38 wurde mit NotI und AvaI geschnitten und ein synthetischer
Linker bestehend aus den Oligonukleotiden GH51 (5'-GGCCGCTA TTTAAATGGC
CGGCCTTAAT TAAAGTCTAG AGGATGGTCC ACCC; SEQ ID Nr. 2) und GH52 (5'-CCGGGGGTG GACCATCCTC
TAGACTTTAA TTAAGGCCGG CCATTTAAAT AGC; SEQ ID Nr. 3) wurde eingesetzt.
Das resultierende Plasmid wurde pGH1 genannt.
pGH2 (2)
Ein
0,4 kb Fragment, das den korrigierten Bereich enthält, wurde
aus pGH1 mittels SfiI- und FseI-Verdau isoliert und in den mit SfiI/FseI
geschnittenen pET47 kloniert. Das resultierende Plasmid pGH2 ist identisch
zu pET47 mit Ausnahme des verbesserten transkriptionellen Startbereichs
des Transgens.
-
Die
Assemblierung des replizierenden Vektors pGH2, der das gesamte MoMLV
provirale Genom enthält,
einschließlich
der offenen Leseraster von gap-pol und env und des EGFP Reportergens, wurde
wie folgt gemacht:
pGH10
Der 3' gelegene Teil des MoMLV env-Gens wurde
als ein 0,75 kb PCR-Fragment mit den Primern GH10 vorwärts (AGTACCGGGA
TTAATCCATG CATCTCCACC ACCATACTG; SEQ ID Nr. 4) und GH10 rückwärts (TATGGTCTCT
AGACATATGC TAT GGCTCGT ACTCTATAGG CTTCAGC; SEQ ID Nr. 5) und des
Plasmids pNca als Matrize amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit
den Enzymen AseI und XbaI geschnitten und in den mit NdeI/XbaI geschnittenen pUC
18 ligiert, um pGH10 zu ergeben.
pGH11
Das Plasmid pGH2
wurde mit NdeI und SacI verdaut um ein 1,6 kb Fragment zu isolieren,
das 400 bp des 3' terminalen
Teils des MoMLV pol-Gens, den gesamten Leserahmen von EGFP und die
3'-LTR-Sequenzen
enthält.
Die Ligation dieses Fragments in den NdeI/SacI geschnittenen pGH10
führte
zum Plasmid pGH11.
pGH12
pGH11 wurde mit NheI und AflIII
gespalten, um ein 0,75 kb Fragment von pNca (Colicelli J., J. Mol.
Biol. 199 (1988) 47–59)
einzusetzen, wodurch die 3'-LTR vervollständigt wurde.
Das resultierende Plasmid wurde pGH12 genannt.
pGH20
Ein
bp-Fragment wurde mittels Verdau von pGH12 mit den Enzymen NsiI
und AflIII erhalten. Dieses Fragment wurde in den NsiI/AflIII geschnittenen pNca
ligiert, um pGH20 zu ergeben. Das Plasmid pGH20 enthält ein funktional
replizierendes EGFP-exprimierendes retrovirales Genom.
-
Die
Elemente des Vektors pGH20 sind wie folgt kartiert (siehe 1 und 3):
1–593 5'-LTR
1070–2684 gag,
komplette kodierende Sequenz
1070–6284 gag-pol, komplette kodierende
Sequenz
5942–5951
Splice-Akzeptorstelle
6226–8223
env ekotrop, komplette kodierende Sequenz
8231–8596 pol-Sequenzen,
teilweise (NdeI-XbaI)
8316–8325
Splice-Akzeptorstelle (SEQ ID Nr. 6)
8634–9353 EGFP-Gen, komplette kodierende
Sequenz
9416–10008
3'-LTR
-
Der
Vektor pGH20 wurde durch Deletion der Plasmidsequenzen, die zur
homologen Rekombination und daher zur gelegentlichen wt-Bildung
während der
Replikation führen,
verbessert. Das verbesserte Konstrukt, als pGH45 bezeichnet, wurde
wie folgt hergestellt (siehe 1):
pGH43
Um
den Bereich stromäufwärts der
5'-LTR zu manipulieren,
wurde die 3'-Hälfte der
retroviralen Sequenzen aus dem Plasmid pNca mittels Verdau mit den Enzymen
NcoI und AflIII und Religation deletiert. Das resultierende Plasmid
wurde pGH43 genannt.
pGH44
pGH43 wurde mit EcoRI und NheI
gespalten und ein synthetischer Linker bestehend aus den angelagerten
Oligonukleotiden GH43/1 (AATTCAATGA AAGACCCCAC CTGTAGGTTT GGCAAC;
SEQ ID Nr. 7) und GH43/2 (CTAGGTTGCC AAACCTACAG GTGGGGTCTT TCATTG;
SEQ ID Nr. 8) wurde eingesetzt. Dadurch wurden im resultierenden
Plasmid pGH44 160 bp der Plasmidsequenz stromaufwärts des
proviralen Genoms entfernt.
pGH45
Ein 4,2 kb Fragment,
das die korrigierte Sequenz enthält,
wurde aus pGH44 mittels EcoRI/ SalI-Verdau isoliert und in den mit EcoRI/SalI
geschnittenen Vektor pGH20 ligiert. Das resultierende korrigierte
Plasmid wird als pGH45 bezeichnet und hat dieselbe provirale Sequenz
wie pGH20.
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Strukturkarte
von pGH45
7–599
5'-LTR
1076–2692 gag
1076–6292 gag-pol
5948–5957 Splice-Akzeptorstelle
6232–8229 env
ekotrop
8237–8600
pol-Sequenzen (NdeI/XbaI)
8322–8331 Splice-Akzeptorstelle
8640–9359 EGFP-Gen
9422–10014 3'-LTR
-
Das
Herstellungsschema für
und die Struktur von pGH45 ist in den 1–3 abgebildet.
-
Die
virale Provirus-Sequenz, beginnend an der 5'-LTR bis zum 3'-Ende des env im Plasmid pGH45 entspricht
der wt-Sequenz, wie sie in pNca vorliegt. Stromabwärts des
env-Gens enthält
die Sequenz den 3'-terminalen
Teil des pol-Gens, das EGFP-Gen und die 3'-LTR, wie sie in Plasmid pMLM38 vorliegen.
Die wiederholte pol-Sequenz, die die Splice-Akzeptorstelle enthält, besteht
aus einem 0,4 kb Fragment, das sich von der NdeI-Schnittstelle bis
zur XbaI-Schnittstelle,
die im MoMLV pol-Gen vorliegt, erstreckt, umfasst SEQ ID Nr. 6 oder
eine Variante davon.
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A2. Vermehrung und Transgenexpression
-
Provirale
DNA wurde in NIH 3T3-Zellen mittels Kalziumphosphatpräzipitation
transfiziert, und die Überstände wurden
3 Tage nach der Transfektion abgenommen. Infiziert NIH-3T3-Zellen
wurden für die
Etablierung von Producerpools und für wiederholte Infektionsexperimente
verwendet. Der Vektor zeigte substantielle EGFP-Expression und Replikation, wie
mittels fluoreszierender Focusbildung gefolgt von Infektion in vitro
(4) und mittels Induktion von Syncytien auf RatXC-Zellen
gezeigt wurde. Die Wachstumseigenschaften wurden in 5 wiederholten Infektionen
von NIH 3T3-Zellen abgeschätzt. Über diesen
15 Tage langen Zeitraum blieb die Propagation relativ stabil auf
einem Niveau von 1–2
Logs an FFU (Fluoreszierende focusbildende Einheiten) pro 3-Tage-Infektion
(5). Die Funktionalität des Konstrukts ist ein Anzeichen
für ausgeglichene
Expression des Reporters und der viralen Proteine. Der Titer der „Producerpools" liegt, wie mittels
Fluoreszenzmikroskopie und mittels FACS-Analyse (6)
bestimmt wurde, bei ungefähr
106 FFU pro ml. Bei Infektionen mit niedriger
m.o.i. korrespondiert eine FFU mit 102 EGFP
exprimierenden Zellen, was die Vermehrung des Vektors wiedergibt.
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A3. Genetische Stabilität
-
Genomische
Rearrangements, die zur Wildtyp(wt)-Bildung führen, sind ein altbekanntes
Problem mit retroviralen Vektoren im Allgemeinen. Insbesondere mit
replikations-kompetenten Konstrukten wurde ein Verlust der Transgenexpression
aufgrund von Deletionen häufig
beobachtet. Die genetische Integrität des Vektors wurde daher mittels
PCR verfolgt. Lysate infizierter Zellen wurden PCR-Reaktionen, die
spezifisch für
wt-Arrangements bzw. für
die Originalvektorform waren, unterworfen. Die Nachweisgrenze der
Assays war unterhalb von 5 × 103 Kopien pro Reaktion. Der Aufbau der PCR
ist in 7 abgebildet. Ein erstes Konstrukt, bezeichnet
als GH20, zeigte wt-Reversion, die schon nach 3 Passagen nachweisbar
war. Mit einer verbesserten Version des Vektors (GH45) war nach
6 Passagen (d21) keine wt-spezifische Bande im PCR-Assay nachweisbar,
was eine niedrigere Reversionsrate andeutet. Interessanterweise
ist die genomische Sequenz des anfänglichen Konstrukts GH20 identisch
zu der von GH45, aber 150 bp retrovirale Sequenzen liegen außerhalb
der genomischen Transkriptionseinheit in der GH20 Plasmid DNA vor,
direkt stromaufwärts
der 5'-LTR. Da diese
Sequenz von der viralen Replikation ausgeschlossen wird, ist eine
homologe DNA- Rekombination
während
der Transfektion am wahrscheinlichsten für die beobachteten Rearrangements verantwortlich.
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A4. Ruhigstellung des
Vektors mittels gezielter Deletion
-
Die
Duplikation des SA-Bereichs des Vektors führte zu einer 0,4 kb Tandemwiederholung,
die das env-Gen flankiert (3). Die
Deletion genomischer Sequenzen im retroviralen Genom aufgrund wiederholter
Sequenzen und deren Anwendung auf gezielte Rearrangements ist bereits
früher
beschrieben worden. Tatsächlich
wurde in GH20 der Verlust des env-Gens durch Rekombination zwischen
den Wiederholungen mit hoher Frequenz beobachtet. Klone infizierter
Zellen wurden auf die erwartete Deletion mittels PCR überprüft (Daten
nicht gezeigt). Ungefähr
30 % (8 von 28) der EGFP exprimierenden Klone, die nach 3 Infektionsrunden
isoliert wurden, wiesen die env-deletierte Struktur in der PCR-Überprüfung auf.
Die Veränderung
der Größe der wiederholten
Bereiche im Genom sollte ein Mittel zur Verfügung stellen, um die Virulenz
des Vektors mittels gezielter Destabilisierung des viralen env-Gens
zu kontrollieren, ohne dabei negativ die Expression des Gens von
Interesse zu beeinflussen.
-
DISKUSSION
-
Retrovirale
Vektoren, die stabil ein Transgen exprimieren und die replikationskomptent
in Säugetieren
sind, stellen – aufgrund
einer beträchtlich
verstärkten
Transduktionseffizienz – ein
nützliches Werkzeug
zur Zufuhr von Polynukleotiden in Zellen dar, insbesondere bei der
Gentherapie mit Suizidgenen. Wir versuchten eine Herangehensweise
mit multiplem alternativem Splicen zur Expression eines Reportergens
in MoMLV. Die effiziente Translation des Transgens und die Vermerhung
des Vektors deuten stark eine ausgeglichene Verteilung der Splice-Produkte
an. Natürlich
können
Varianten des vorliegenden Vektors mit Abänderungen in dem zweiten Splice-Akzeptorbereich
konstruiert werden, um die Auswirkungen auf das Splicen und die
Rate der Ruhigstellung mittels env-Deletion zu verbessern. Die Überwachung
der genomischen Stabilität
des Konstrukts mittels PCR ergab in einem Zeitraum von 21 Tagen
keine sich bildenden revertanten Strukturen.
-
B. Rückgang des Tumors in vivo unter
Verwendung von replizierenden oder semi-replizierenden viralen Konstrukten
-
Dieses
Beispiel bestätigt
die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung durch Illustration des
Rückgangs
des Tumors in vivo unter Verwendung von replizierenden viralen Konstrukten,
die ein Thymidinkinase-Polypeptid exprimieren. Insbesondere wurden Verpackungszellen,
die ein replizierendes retrovirales Konstrukt herstellen, in Mäuse injiziert,
entweder in Kombination mit Tumorzellen oder direkt in etablierte
Tumoren. Der Gentransfer als auch der Rückgang des Tumors (oder der
Größe) nach
Verabreichung eines Nukleosidanalogons (z. B. Gancyclovir) wurde
abgeschätzt.
-
Zwei
Verpackungszelllinien wurden in diesen Experimenten verwendet:
- – klassische
Verpackungszellen (Kontrolle), die nicht-verpackbare gag/pol- und
env-Gene zusammen
mit einem verpackbaren inaktivierten retroviralen Vektor exprimieren,
wodurch die Verpackungszellen infektiöse aber inaktivierte retrovirale
Partikel herstellen,
- – Zellen,
die sowohl ein verpackbares replizierendes Wildtypretrovirus als
auch einen verpackbaren inaktivierten retroviralen Vektor (d. h.
2 transkomplementierende retrovirale Konstrukte) exprimieren, und
dadurch infektiöse
und replizierende Partikel herstellen.
-
B1. Co-Injektion von Tumorzellen
und Verpackungszellen
-
Um
die Eigenschaften replizierender und inaktivierter retroviraler
Vektoren auf quantitative Art und Weise zu vergleichen, wurde ein
Gemisch von DHDK12-Tumorzellen (98 %) und Verpackungszelllinien
(2%), die entweder replizierende oder inaktivierte retrovirale Vektoren,
die TK/GFP transduzieren, herstellen, zubereitet. Zehn Millionen
Zellen wurden subkutan in Nacktmäuse
(Tag 0) injiziert. Am 7. Tag wurden die Tiere in zwei Gruppen aufgeteilt,
von denen eine Gancyclovir (150mg/kg/Tag) 7 Tage lang erhielt. Die
Mäuse wurden
dann getötet
(Tag 14). Die Tumore wurden seziert, gewogen, und der Prozentsatz
GFP-exprimierender Zellen nach Dilazeration wurde mittels Durchflusszytometrteanalyse
gemessen.
-
Die
Ergebnisse dieses Expertiments sind in 9 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass (i) der Gentransfer sehr viel effizienter
mit einem replizierenden als einen inaktivierenten Vektor ist, wie
anhand des Anteils an GFP-exprimierenden Zellen in den Gruppen,
die kein Gancyclovir erhielten, abgeschätzt werden kann; (ii) GCV-Behandlung
reduziert dramatisch die Anzahl an GFP-exprimierenden Zellen in
beiden Gruppen; (iii) ein signifikanter Rückgang des Tumorvolumens wird
nur in der Gruppe beobachtet, die den replizierenden Vektor erhielt
und mit Gancyclovir behandelt wurde, in Übereinstimmung mit der Effizienz
der Transgentransduktion. Es sollte bemerkt werden, dass dieses
Experiment in Nacktmäusen
durchgeführt
wurde und dass es daher nicht zu einer völligen Ausmerzung des Tumors
kommt, die eines kompetenten Immunsystems bedarf.
-
B2. Injektion von Verpackungszellen
in etablierte Tumore
-
Zuerst
wurden subkutane Tumore in Nacktmäusen durch Injektion von DHDK12-Zellen
erzeugt. Nach 7 Tagen, wenn die Tumore ertastbar sind, wurden ihnen
ungefähr
3 × 106 Verpackungszellen injiziert, die entweder
einen replizierenden oder ein inaktivierten retroviralen Vektor
freisetzen, der TK/GFP transduziert. 7 Tage später wurden ein Teil der Tiere mit
Gancyclovir 7 Tage lang behandelt, der andere Teil wurde nicht behandelt.
Die Tumore wurden wie für 9 analysiert.
-
Die
dargestellten Ergebnisse in 10 zeigen,
dass nur replizierende Vektoren zu einer signifikanten Transduktion
der Tumorzellen und zu einem therapeutischen Effekt führen.