DE60022762T2

DE60022762T2 - Polymerisierbare biotinderivate, bioptinpolymer und polymer, das auf stimulierung durch avidin reagiert

Info

Publication number: DE60022762T2
Application number: DE60022762T
Authority: DE
Inventors: Noriyuki Ohnishi; Mikiko Yoshida; Kazunori Bunkyo-ku KATAOKA; Katsuhiko Ueno
Original assignee: Japan Chemical Innovation Institute; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: JNC Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-07-29
Also published as: WO2001009141A1; EP1201667A4; DE60022762D1; EP1201667B1; EP1201667A1; US7052917B1

Description

Technisches Gebiet
Durch die vorliegende Erfindung wird eine ausgezeichnete Verfahrenstechnik als Immobilisierungsverfahren von (Imino)biotinderivaten angegeben und zur Verfügung gestellt, wobei sich die entsprechenden Verfahren seit kurzem einer weit verbreiteten Anwendung erfreuen. Die Erfindung betrifft ferner die Bereitstellung eines funktionellen Polymers, das eine (Imino)biotin-Stelle aufweist, die mittels der Derivate immobilisiert ist.
Stand der Technik
Eine Verfahrenstechnik unter Anwendung einer hohen Biotin-Avidin-Affinität (z.B. "Methods Enzymol, 184, 5–13, und 184, 14–35) ist für Immunoassayverfahren (z.B. JP Hei 4-363 659 und Hei 6-160 387), für Biosensoren (z.B. JP Hei 10-282 040, Hei 9-292 397 und Hei 8-94 510), für DNA-Operationen (z.B. JP Hei-4-267 896), für Trennmaterialien (z.B. JP Hei 5-340 945 und Hei 4-311 397) sowie für klinische Therapien (z.B. J. Nucl. Med. Commun. 12, 211–234 (1991) und Int. J. cancer 45, 1184–1189 (1990)) angewandt worden.
Die oben beschriebenen verschiedenen Verfahren benötigen die Immobilisierung von Biotin an ein Protein (Glycoprotein), an Antikörper, Enzyme, Chromophore, Dextran oder dgl., und für diesen Zweck sind verschiedene Biotin-Immobilisierungsreagenzien auf den Markt gebracht worden (Methods Enzymol. 184, 123–138). Diese Reagenzien dienen dazu, Biotin an einem biologischen Material durch Reaktion seiner reaktiven funktionellen Gruppe wie einer Aminogruppe, einer Schwefelgruppe, einer Carbonsäure oder eines Alkohols zu immobilisieren (siehe z.B. "Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Kapitel 4"). Biotinderivate werden für solch eine Immobilisierungsreaktion angewandt (siehe z.B. Molecular Probes Handbook of Flurescent Probes and Research Chemicals, Kapitel 4, S. 87). Über die Immobilisierung von Biotin an das Ende von Polyethylenglykol mittels dieser Reagenzien ist ebenfalls berichtet worden (Bioconjugate Chem. 8, 545–551 (1997)).
Die oben beschriebene Immobilisierung von Biotin wird auf der Grundlage des Konzepts durchgeführt, dass Biotin durch Durchführung von 1 Reaktion mit 1 funktioneller Gruppe einer ursprünglich vorliegenden Substanz wie eines Proteins immobilisiert wird (siehe z.B. JP Hei 6-148 190).
Die Eignung von Biotin ist somit auf verschiedenen Gebieten verifiziert worden, und es besteht die Möglichkeit seiner industriellen Anwendung, die zur Entwicklung von Produkten führt, die eine Funktion zeigen und ergeben. Die oben beschriebenen Biotin-Immobilisierungsreagenzien sind allerdings teuer, was deren industrielle Anwendung zur Immobilisierung von Biotin verhindert. Außerdem besteht eine starke Nachfrage nach einem wärmeempfindlichen Polymer, das in wässriger Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung durch einen Kühlvorgang aggregiert wird und eine obere kritische Lösungstemperatur (upper critical solution temperature = UCST) zeigt und ergibt, wobei dessen Anwendbarkeit für ein Trennmittel oder für DDS zu erwarten ist (Macromol. Chem , Rapid Commun. 13, 577–581 (1992)).
Die Biotin-Immobilisierungsreagenzien immobilisieren Biotin an eine reaktive funktionelle Gruppe, wie oben beschrieben, und der Schutz der funktionellen Gruppe ist manchmal notwendig. Die Biotin-Immobilisierungsreaktion selbst ist schwierig im Fall einer Immobilisierung an eine funktionelle Gruppe mit großer sterischer Hinderung oder einer Immobilisierung eines Biotingerüsts an eine Polymerkette. Wird Biotin beispielsweise an einem Protein immobilisiert, das gewöhnlich ein Makromolekül ist, wird durch den Mangel an dessen funktionellen Gruppen die Immobilisierung einer hinreichenden Menge von Biotin verhindert, und außerdem wird Biotin nur an den funktionellen Gruppen immobilisiert, die auf der Oberfläche des Proteins vorliegen. Je höher der Polymerisationsgrad eines Polymers ist, um so schwieriger wird es, Biotin in gewünschter Weise mit den herkömmlichen Immobilisierungsverfahren zu immobilisieren.
WO 86/01 899 offenbart ein Verfahren zur Durchführung eines Marker-verbundenen spezifischen Bindungsassay, z.B. ein Immunoassayverfahren. Beispiel 1 dieses Dokuments betrifft die Herstellung von 2-Hydroxyethylmethylacrylester (HEMA) von Biotin und die Verwendung dieses Biotin-HEMA-Monomers zur Herstellung von Copolymeren mit Acrylamid und Methylenbisacrylamid.
EP 0 226 470 A2 betrifft Materialien und Verfahren für mikrochemische Testverfahren. Beispiel 2 dieses Dokuments beschreibt ein Gel-bindendes Material, das Biotinyl-HEMA-Co-Monomer und Glucose-Oxidase einschließt.
EP 0 914 835 A2 betrifft biokompatible Polymerüberzüge. Gemäß Beispiel 5 wird ein hydrophobes Acrylatpolymer für einen Stent-Überzug durch Copolymerisieren von Biotinmethacrylat mit N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat und Laurylmethacrylat hergestellt. Das sich ergebende Polymer eignet sich zum Überziehen von Metall-Stents und -Oberflächen, die eine spezifische Affinität zu Liganden aufweisen, die an die Oberfläche unter Verwendung gewünschter Avidin-Ligand-Komponenten gebunden werden, die ihrerseits wiederum über den Biotin-Avidin-Komplex gebunden werden.
WO 95/31 730 offenbart ein Verfahren zum raschen Analyt-Nachweis mittels eines nachweisbaren synthetischen Polymers. In Beispiel 6 dieses Dokuments wird ein wasserlösliches Copolymer von Biotin und PMB aus Biotin und N-Aminopropylmethacrylamid hergestellt.
EP 0 922 715 A2 offenbart ein Reiz-reaktives Polymer, wobei eine Keto-Enol-Tautomerisierung genutzt wird. Gemäß einem der Beispiele (4 bis 7) wird ein Copolymer aus N-Acetylmethacrylamid und Methacrylamid mit darin fixiertem Biotin aus einem Biotin-stämmigen Acrylsäureester hergestellt.
Data base biosis no. PREV 1993 95116256 und die zugrunde liegende Veröffentlichung (J.E. Morris et al., Biotechnology and Bioengineering, Bd. 41, Seiten 991–997 (1993)) betreffen eine Biotin-aufweisende Polymerverbindung, die zuerst durch Polymerisieren von Acrylamid und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid erhalten wird, bevor in einer zweiten Stufe Biotin an das sich ergebende Polymer gebunden wird.
WO 99/64 378 betrifft eine gesteuerte kombinatorische Verbindungsbibliothek und einen hohen Durchsatzassay zum Aussieben derselben. Im Zusammenhang mit Glycopolymeren für Festphasen-Glycosyl-Transferase-Assayverfahren (Seiten 24 und 25) werden wasserlösliche Glycopolymer-Akzeptoren im Festphasen-Glycosyl-Transferase-Assay verwendet. Diese stellen mehrwertige Substrate dar, die aus N-substituiertem Polyacrylamid-Rückgrat zusammengesetzt sind, das auch Biotin enthalten kann.
Demnach ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein eine Biotin-Komponente enthaltendes poly- oder multifunktionales Polymer zu synthetisieren oder zu entwerfen, das auf verschiedenen Gebieten anwendbar ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, das die Biotin-Komponente enthaltende Polymer in industriellem Maßstab zu produzieren und es mit ausgezeichneten Wirtschaftlichkeits- und Leistungsdaten zu synthetisieren oder zu entwerfen.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wärmeempfindliches Polymer bereitzustellen, das sich in einer wässrigen Lösung durch einen Kühlvorgang zusammenlagert und eine obere kritische Lösungstemperatur (upper critical solution temperature = UCST) sogar in physiologischer Kochsalzlösung zeigt und ergibt und sich auch in einer wässrigen Lösung durch einen Erwärmungsvorgang zusammenlagert und eine untere kritische Lösungstemperatur (lower critical solution temperature = LCST) in einer wässrigen Lösung aufweist.
Offenbarung der Erfindung
Es wurde herausgefunden, dass die oben beschriebenen Aufgaben gelöst werden, und zwar mit einer
Polymerverbindung, die eine UCST (upper critical solution temperature) in einer wässrigen Lösung zeigt und ergibt, wobei die Polymerverbindung ein polymerisierbares Biotinderivat der folgenden Formel (Ib) und Acrylamid oder Methacrylamid als Copolymer-Komponente umfasst:
wobei in der Formel (Ib) R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe, R³ und R⁴, jeweils unabhängig, ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Arylgruppe, T ein Sauerstoffatom oder -NH,
R¹ eine Einfachbindung oder eine C_1-5-Alkylengruppe und X⁴ -NH- darstellen.
Durch die Erfindung wird es durch die Polymerisation des polymerisierbaren Biotinderivats (das nachfolgend ganz einfach als "Biotinmonomer" bezeichnet wird), welches eine Biofunktion aufweist, ermöglicht, dass das entsprechende Polymer mit dem daran immobilisierten (Imino)biotin (der hier verwendete Begriff "Biotin" umfasst die Bedeutung von Iminobiotin, wenn nicht Anderes ganz spezifisch durch den Namen einer Verbindung ausgesagt wird) in industriellem Maßstab und wirtschaftlich synthetisiert wird.
Das Biotinmonomer mit dem daran immobilisierten Biotin weist als Ausgangsmaterial Wirtschaftlichkeit und Leistungsvermögen auf, wodurch die industrielle Produktion ermöglicht wird.
Das Erfindungsverfahren unterscheidet sich von der bekannten Biotinimmobilisiertechnik wie der Immobilisierung von Biotin an ein Polymer durch Reaktion seiner funktionellen Gruppe dadurch, dass sogar durch die Copolymerisation mit einem Monomer, das eine funktionelle Gruppe aufweist, die mit einem Biotin-Immobilisierungsreagens reaktiv ist, die Synthese des entsprechenden Copolymers ermöglicht, wird, das Biotin immobilisiert an das Copolymer aufweist, aber die unreagiert zurückgebliebene funktionelle Gruppe noch enthält.
Sogar im Fall, dass die herkömmliche Biotinimmobilisierungstechnik nicht angewandt werden kann, weil die funktionelle Gruppe in eine hochmolekulare Kette eingeschlossen ist, wird es durch den entsprechenden Entwurf eines Polymers ermöglicht, darin ein Biotingerüst als lange Polymerkette in jedem Verhältnis zu integrieren und aufzunehmen.
Beispielsweise wurde ein thermo-reaktives Polymer aufgefunden, das eine Biotin- oder Iminobiotin-Stelle aufweist und eine untere kritische Lösungstemperatur (lower critical solution temperature = LCST) oder eine obere kritische Lösungstemperatur (upper critical solution temperature = UCST) in wässriger Lösung zeigt und ergibt.
Dabei wurde herausgefunden, dass ein Polymer, das durch Copolymerisieren des polymerisierbaren Biotinderivats der Erfindung mit mindestens einer Monomerkomponente, ausgewählt aus Acrylamid und Methacrylamid, eine wärmeempfindliche Polymerverbindung ist, die eine obere kritische Lösungstemperatur (UCST) in einer wässrigen Lösung oder einer physiologischen Kochsalzlösung aufweist.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass durch Immobilisieren von Biotin an ein thermo-reaktives Polymer, das eine LCST aufweist, dieses thermo-reaktive Polymer dann eine ausgeprägt hohe Anlagerungskraft bei der LCST oder darüber erwirbt.
Da diese Polymeren daran immobilisiertes Biotin aufweisen, können verschiedene mit Avidin immobilisierte Liganden und, durch die vier Bindungsstellen des Avidins, verschiedene biotinylierte Liganden an jenen Polymeren unmittelbar immobilisiert werden. Der hier verwendete Begriff "Avidin" umfasst die Bedeutung von Streptavidin.
Die thermo-reaktiven Polymerderivate der Erfindung sind thermo-reaktiv bezüglich einer großen Aggregationskraft bei der LCST oder darüber oder bei der UCST oder darunter in einer wässrigen Lösung, einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einer Pufferlösung, so dass sie in ganz wirkungsvoller Weise zur Abtrennung, enzymatischen Immobilisierung, Gewichtung oder zum Vergleich verschiedener Substanzen angewandt werden können.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben.
Beim polymerisierbaren Biotinderivat der Formel (Ib) ist es bevorzugt, dass R² Wasserstoff oder eine C_1-3-Alkylgruppe und R³ und R⁴ jeweils ein Wasserstoffatom, eine C_1-3-Alkyl- oder eine Phenylgruppe darstellen. Es ist besonders bevorzugt, dass R² ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R³ und R⁴ jeweils ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder eine Phenylgruppe darstellen. Die Alkyl- oder Arylgruppen können nötigenfalls einen Substituenten aufweisen.
In der Formel (Ib) stellt R¹ eine Einfachbindung oder eine C_1-5-Alkylengruppe dar.
In der Formel (Ib) ist es bevorzugt, dass R¹ eine C_1-5-Alkylengruppe, bevorzugter eine C_2-4-Alkylengruppe, R² vorzugsweise ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R³ und R⁴, jeweils unabhängig von einander, ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Arylgruppe und bevorzugter ein Wasserstoffatom darstellen. X⁴ stellt vorzugsweise -NH- dar. T stellt ein Sauerstoffatom oder =NH dar.
Das polymerisierbare Biotinderivat der Formel (Ib) ist gewöhnlich durch Reaktion des unten angegebenen Biotinderivats der Formel (b1) mit einem geeigneten Acrylierungsagens (b2) (einschließlich eines Methacrylierungsagens, wobei entsprechende Beispiele Acrylierungsmittel wie Acrylsäure, Acrylsäurechlorid, Acrylsäureanhydrid und Acryloxysuccinimid und Methacrylierungsmittel wie Methacrylsäure, Methacrylsäurechlorid, Methacrylsäureanhydrid und Methacryloxysuccinimid einschließen) erhältlich:
In der obigen Gleichung ist das Biotinderivat der Formel (b1) durch Reduktion des Biotins bzw. Biotinderivats der Formel (a1) mit einem geeigneten Reduziermittel zum entsprechenden Alkoholderivat (worin X⁴ = ein Sauerstoffatom) erhältlich, wobei die Hydroxylgruppe des Alkoholderivats in eine funktionelle Gruppe mit der Funktion einer Abgangsgruppe überführt und dann die entstandene Verbindung einer Substitutionsreaktion mit einem Aminderivat unterzogen werden (wobei in der Formel (b1) X⁴ = -NH-).
Dieses Verfahren wird nun spezifischer beschrieben.
Beispielsweise wird, wie unten dargestellt, im Handel verfügbares Biotin (Produkt von Merck & Co., Inc.) zu Biotinol (iv) mit einem reduzierenden Mittel wie mit Natriumborhydrid, Diisobutylaluminiumhydrid, THF-Boran oder mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert (Flaster und Kohn, J. Heterocycl. Chem. 18(7), 1425–36 (1981)). Das entstandene Biotinol (iv) wird mit einem Acrylierungsagens zur Reaktion gebracht, worauf umkristallisiert wird, wodurch das Biotinolacrylat (D) erhältlich ist:
Das Biotinolmethacrylat (E) ist durch Reaktion des Biotinols (iv) mit einem Methacrylierungsagens erhältlich:

* = Bezugsbeispiele

Wie unten dargestellt, wird nach Überführung der Hydroxylgruppe des Biotinols (iv) in eine funktionelle Gruppe mit Abgangsfunktion eine Substitutionsreaktion mit einem Aminderivat durchgeführt, um das Biotinamin (V) zu erhalten. Das Biotinamin oder ein Salz davon werden dann mit einem Acrylierungsagens in der Gegenwart eines Kondensiermittels (wie von Diethylphosphorsäurecyanid oder von Diphenylphosphorsäureazid) zur Reaktion gebracht, wodurch das Biotinaminacrylamid (F) erhältlich ist:
In gleicher Weise werden das Biotinamin (v) oder ein Salz davon mit einem Methacrylierungsagens in der Gegenwart eines Kondensiermittels (wie von Diethylphosphorsäurecyanid oder von Diphenylphosphorsäureazid) zur Reaktion gebracht, wodurch das Biotinaminmethacrylamid (G) erhältlich ist:
Wie unten dargestellt, werden das Norbiotinamin (vi) oder ein Salz davon mit einem Acrylierungsagens in der Gegenwart eines Kondensiermittels (wie von Diethylphosphorsäurecyanid oder Diphenylphosphorsäureazid) zur Reaktion gebracht, wodurch das Norbiotinaminacrylamid (H) erhältlich ist:
In gleicher Weise wie oben, werden das Norbiotinamid (vi) oder ein Salz davon mit einem Methacrylierungsagens in der Gegenwart eines Kondensiermittels (wie von Diethylphosphorsäurecyanid oder von Diphenylphosphorsäureazid) zur Reaktion gebracht, wodurch das Norbiotinaminmethacrylamid (J) erhältlich ist:
Wie spezifischer dargestellt, ist beispielsweise das Biotinolmethacryloylcarbamat (K) durch Reaktion des Biotinols (iv) mit dem Methacroylisocyanat (vii) in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid erhältlich:
Durch Polymerisieren der so erhaltenen neuen polymerisierbaren Biotinderivate (der Biotinmonomeren) der Erfindung allein oder zusammen mit einem damit copolymerisierbaren Monomer in herkömmlicher Weise in der Gegenwart eines geeigneten Radikal-Polymerisationsinitiators, beispielsweise in einem Lösungsmittel, worin diese löslich sind, sind die eine Biotin-Komponente enthaltenden Polymerderivate (die nachfolgend ganz einfach als "Biotinpolymere" bezeichnet werden können) erhältlich. Dadurch wird es ermöglicht, äußerst nützliche Polymerverbindungen, die daran immobilisiertes Biotin aufweisen, in industriellem Maßstab unmittelbar zu erzeugen und zu produzieren. Der hierin verwendete Begriff "Biotin-Komponente" bedeutet ein Teilstück, das eine hohe Affinität mit Avidin (einschließlich Streptavidin) aufweist, und er bedeutet noch spezifischer eine Komponente (eine Biotin- oder Iminobiotin-Komponente) der dargestellten Formel (II):
In der Erfindung wird durch Copolymerisation mit einer weiteren Monomer-Komponente die Befähigung zur Synthese oder zum Entwurf eines Biotinpolymers geschaffen, das mit einer Funktion dieser Monomerkomponente ausgerüstet ist. Dies führt zur Synthese eines poly- oder multifunktionalen Polymers. Somit wird es durch die Polymerisation mit diesem Biotinmonomer ermöglicht, ein Biotinpolymer zu erzeugen, das von der Nützlichkeit eines Biotinmonomers Gebrauch zu machen vermag, wobei gleichzeitig die Eigenschaften des Polymers selbst genutzt werden können, und es ergeben sich somit synergistische Effekte.
Es bestehen keine besonderen Einschränkungen bezüglich der mit den polymerisierbaren Biotinderivaten copolymerisierbaren Komponente, solange diese polymerisierbar ist. Als einschlägige Komponenten sind Vinyl-, Vinyliden-, Butadien- und ähnliche polymerisierbare Monomere einsetzbar. Spezifische Beispiele schließen Acrylamid, Methacrylamid, Styrol, N-Alkylacrylamid, Methylacrylat, Vinylacetat, Methacrylnitril, Methylmethacrylat und Isopren ein. Es besteht keine besondere Einschränkung beim Copolymerisationsverhältnis, und die Monomeren können in jedem Verhältnis gemäß Bedarf copolymerisiert werden.
Nach der Reaktion werden die Polymerderivate vorzugsweise in üblicher Weise gereinigt. Die Reinigung kann z.B. durch Gießen in ein Alkohol-Lösungsmittel zur Ausfällung durchgeführt werden.
Spezifische Entwurfs-, Ausführungs- und Anwendungsbeispiele des Biotinpolymers der vorliegenden Erfindung werden nun beschrieben.
Beispielsweise werden durch Gelierung des Polymers der Erfindung durch die Verwendung eines Vernetzungsmaterials der Entwurf oder die Synthese eines Gels erleichtert, das Biotin sogar im Inneren des Gels immobilisiert aufweist. Dadurch werden auch die Aufbringung auf ein magnetisches Material oder die Anwendung als Trennmaterial erleichtert.
Der molekulare Entwurf eines Polymers, das neue Besonderheiten aufweist, ist durch Copolymerisieren des Biotinmonomers mit einem weiteren Monomer erzielbar, wobei die Besonderheit des Biotinmonomers in Betracht gezogen wird.
Beispielsweise ist PNIPAM (Poly-N-alkylacrylamid) ein bekanntes Polymer (J. Macromol. Sci. Chem., A₂, 1441 (1968)), das eine LCST (eine untere kritische Lösungstemperatur) zeigt und ergibt. Das Copolymer, das aus N-Isopropylacrylamid und dem Biotinmonomer erhalten wird, vermag ein Molekül-Erkennungsvermögen zu erwerben, ohne die LCST-Charakteristika zu verlieren.
Polymere mit einer LCST (lower critical solution temperature) aggregieren auf der höheren Temperaturseite als der Phasenübergangstemperatur und werden auf der niedrigeren Temperaturseite gelöst. Sie haben daher eine weit verbreitete Anwendung in verschiedenen Trennmitteln, Steuerungsmitteln zur Freisetzung von Medikamenten, künstlichen Muskeln, Sensoren, Aktuatoren, Trägermitteln zur Zellzüchtung und dgl. gefunden.
Es besteht keine besondere Einschränkung bei der Monomerkomponente, die in der Erfindung für ein Polymer verwendet wird, das eine LCST in wässriger Lösung zeigt und ergibt. Spezifische Beispiele schließen Poly(meth)acrylamidderivate wie Poly(N-methyl(meth)acrylamid), Poly(N-ethyl(meth)acrylamid, Poly(N-propyl(meth)acrylamid), Poly(N-isopropyl-(meth)acrylamid), Poly(N-butyl(meth)acrylamid), Poly(N-acryloylpyrrolidon), Poly(N-acryloylmorpholin), Poly(N,N-dimethyl(meth)acrylamid) und Poly(N,N-diethyl(meth)acrylamid), Poly-N-vinylamidderivate wie N-Vinylacetamid, N-Vinylbutylamid und N-Vinylisobutylamid, Polyvinylacetat-Partialhydrolysatderivate, Methylcellulosederivate und Alkylvinyletherderivate wie Poly(methylvinylether) und Poly(ethylvinylether) ein.
Es wurde herausgefunden, dass Polymere, die durch Copolymerisation von Acrylamid oder Methacrylamid mit dem Biotinmonomer der Erfindung erhalten werden, UCST (upper critical solution temperature)-Charakteristika in den jeweiligen wässrigen Lösungen und physiologischen Kochsalzlösungen zeigen und ergeben.
Die Polymerderivate mit UCST (von denen ein jedes nachfolgend ganz einfach als "UCST-Polymer" bezeichnet werden kann) sind vorzugsweise diejenigen, die erhalten werden, indem man das Acrylamid oder Methacrylamid und das Biotinmonomer der Erfindung bei einem Verhältnis (Molverhältnis) im Bereich von 3 bis 30 beaufschlagt. Die UCST kann durch Auflösen des sich ergebenden Polymers in Wasser oder Kochsalzlösung, Gießen der Lösung in eine Quarz-Zelle, Belichten seines Lichtkanals mit einem Licht aus einer Lichtquelle von 500 nm und durch Untersuchung und Auswertung der Beziehung zwischen der Durchlässigkeit und der Temperatur gemessen werden.
Gebiete, auf denen diese UCST-Polymeren zur Anwendung als Temperaturreiz-empfindliches Polymer gelangen können, sollten den oben beschriebenen Anwendungsgebieten ähneln. Im Unterschied zu den LCST-Polymeren lösen sich jene allerdings auf der hohen Temperaturseite und aggregieren auf der niedrigen Temperaturseite. Es besteht demzufolge die Möglichkeit zur Entwicklung von Materialien, die auf Gebieten zur Anwendung gelangen können, die sich von den oben beschriebenen der LCST-Polymeren unterscheiden, und es wird daher von diesen Materialien erwartet, dass sie Produkte darstellen, die als Reiz-empfindliches Material interessant sind.
Insbesondere können in einem Trägermaterial für Zellkulturen auf einem Film, der ein UCST-Polymer enthält, das auf der niedrigen Temperaturseite aggregiert, die gezüchteten Zellen auf dem mit dem UCST-Polymer bedeckten Trägermaterial vom Träger bei niedriger Temperatur abgetrennt werden (Tissue Culture, 17(9), 349–353 (1990)). Das an ein Medikament gebundene Polymer, welche beide in Lösung auf der hohen Temperaturseite vorliegen, bildet ein aggregiertes Polymer unter niedrigen Temperaturbedingungen, wobei das Medikament im Inneren des Polymers eingeschlossen wird. Kurz gesagt, lässt sich eine Medikament-Freisetzsteuerung durchführen ("Macromolecules, 27, 947–952 (1994)").
In der Erfindung können ein hydrophiles oder hydrophobes Monomer in die Polymerverbindung als Copolymerkomponente einverleibt werden. Dadurch wird es ermöglicht, die LCST oder die UCST in wässriger Lösung zu verändern. Die hier verwendeten Begriffe "hydrophil" oder "hydrophob" bedeuten hydrophil oder hydrophob für das Monomer, das als Hauptkomponente in das Polymer eingebaut wird.
Obwohl die Art der hydrophilen oder hydrophoben Monomeren in Beziehung zum Monomer steht, das als oben beschriebene Hauptkomponente eingebaut wird, und Beispiele davon Alles in Allem nicht angegeben werden können, schließen spezifische Beispiele der hydrophilen Monomeren Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid ein, wogegen diejenigen der hydrophoben Monomeren Acrylate, Methacrylate, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid und Styrol einschließen.
Es besteht keine besondere Einschränkung beim Molekulargewicht der Polymerverbindung der Erfindung. Die Eigenschaften wie die UCST oder LCST der Polymerverbindung hängen nicht allzu sehr vom Molekulargewicht ab. In der Praxis beträgt das gewichtsdurchschnittliche Molekulargewicht ca. 500 bis 1.000.000 und bevorzugter ca. 1.000 bis 100.000.
Bei Verwendung als Trennmittel weist die Polymerverbindung vorzugsweise eine UCST oder LCST von 0 bis 50°C und insbesondere von 0 bis 40°C auf.
In der Erfindung gilt, dass es um so besser ist, je enger der Bereich der LCST oder UCST (der Umschaltbereich) ist. Gemäß der Erfindung sind thermo-reaktive Polymere mit einer LCST oder UCST innerhalb eines für die Praxis geeigneten Umschaltbereichs von 5°C oder weniger erhältlich. Das Biotinmonomer der Erfindung eignet sich als ein Polymermaterial mit Biofunktion und ist im breiten Umfang anwendbar (siehe z.B. "Chemical Sensors, 12(1), 8–11 (1996)"). Dies deshalb, weil Biotin selbst ein biofunktionales Material mit der Befähigung zum Erkennen einer Vielfalt von Substanzen und noch spezifischer mit der Befähigung darstellt, nicht nur das Molekül von Avidin zu erkennen, sondern auch an ein Protein wie Kollagen gebunden zu werden. Außerdem kann es auf breiten Gebieten wie der Affinitätschromatografie unter Anwendung einer Sandwich-Struktur mit darin eingelagertem Avidin und der Immunochemie unter Nutzung des Vermögens zum Erkennen vieler Antikörper zur Anwendung gelangen.
Da das thermo-reaktive Polymer der Erfindung (Imino)biotin immobilisiert daran aufweist, kann ein Ligand durch eine Avidin-Biotin-Affinität ohne Bildung einer kovalenten Bindung immobilisiert werden.
Alternativ dazu, wird, da Avidin 4 Stellen aufweist, die Biotin erkennen, eine der Bindungsstellen von Avidin für das Biotin-immobilisierte thermo-reaktive Polymer genutzt, während die verbliebenen 3 Biotin-Bindungsstellen zur Immobilisierung biotinylierter Antikörper, biotinylierter Enzyme, biotinylierter Wärmeschock-Proteine und dgl. nutzbar sind.
Durch Anpassung eines Avidin-immobilisierten Ligands im Voraus kann dieser direkt am Biotin-immobilisierten thermoreaktiven Polymer immobilisiert werden.
Durch die Verwendung mono- oder polyclonaler Antikörper für den immobilisierten Ligand werden die Abtrennung oder Aufkonzentrierung von Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung erleichtert. In ganz spezifischer Weise wird, nach der Bindung eines avidinierten oder biotinylierten mono- oder polyclonalen Antikörpers für einen spezifischen Mikroorganismus an das wärmeempfindliche Polymer der Erfindung, das entstandene Polymer in hinreichend guten Kontakt mit dem in Lösung vorliegenden Mikroorganismus gebracht. Die Lösung wird erwärmt, um eine Aggregation von sowohl dem Mikroorganismus als auch dem thermo-reaktiven Polymer zu verursachen, und es kann dadurch der Mikroorganismus leicht durch Abgießen gesammelt werden. Beispielsweise können, durch Bindung biotinylierter Salmonella-Bakterien an das thermo-reaktive Polymer, nur die Salmonella-Bakterien in einer Nahrungsmittelsuspension aufkonzentriert und leichter abgetrennt werden. Somit lässt sich die Kombination des Polymers mit einem sauber geeigneten Antikörper und einem entsprechenden Nachweisreagens als Nachweis-Kit oder Diagnose-Erzeugnis für Mikroorganismen anwenden, und das so erhaltene Kit oder das Erzeugnis weisen eine stark verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich mit den herkömmlichen Produkten auf.
Ein thermo-reaktives Polymer der Erfindung, das an ein biotinyliertes Basenpaar einer Nucleinsäure gebunden wird, ist zur Reinigung, Aufkonzentrierung oder zum Nachweis eines spezifischen Gens verwendbar.
Eine Zielsubstanz, die an ein Reiz-empfindliches Material der Erfindung gebunden oder daran adsorbiert wird, lässt sich leicht durch (1) Steigerung der Konzentration eines Salzes, (2) pH-Änderung (ins Saure oder Alkalische), (3) Zugabe eines Inhibitors, Substrats oder dgl., (4) Zugabe eines Modifiziermittels wie Harnstoff oder SDS, (5) Zugabe eines organischen Lösungsmittels, eines Metallions oder dgl. oder durch (6) Temperaturänderung eluieren.
Insbesondere kann das Trennmaterial der Erfindung vom thermoreaktiven Typ in wirkungsvoller Weise für Testmittel von Bakterien oder rückständigen Pestiziden, für Diagnose- Erzeugnisse, zur Abtrennung von Bioprodukten wie von Mikroorganismen oder gezüchteten Zellen, zur Aktivierung und Beibehaltung einer bio-reaktiven Funktion durch Immobilisierung von Enzymen oder molekularen Chaperoninen verwendet werden.
Das Biotinmonomer der Erfindung mit daran immobilisiertem Biotin ist hinreichend wirtschaftlich und wirkungsvoll, so dass Anwendungen im industriellen Maßstab geschaffen werden.
Beispiele und Bezugsbeispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun noch detaillierter beschrieben. Die Erfindung sollte aber nicht darauf eingeschränkt sein. Alle Bezugsverbindungen und die entsprechenden Beispiele sind mit "*" markiert.
Beispiel 1*
Synthese von 2-Biotinylethylacrylat (Verbindung A)*
Bei Raumtemperatur wurden 500 mg Biotin (Verbindung i, Produkt von Merck & Co., Inc.), 200 mg 2-Hydroxyethylacrylat, 20 mL Thionylchlorid und 20 mL Toluol vermischt. Die entstandene Mischung wurde 2 h lang am Rückfluss gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatografie mit einer Chloroform-Methanol-Lösungsmittelmischung unterzogen. Durch Entfernen des Lösungsmittels wurden 100 mg 2-Biotinylethylacrylat (Verbindung A) als pulvrige Substanz erhalten (Ausbeute: 14 %).
Die NMR-Analyse zeigte ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung A (in DMSO).
NH- und Acrylgruppe-Bindung H:5H, δ 5,8-6, 6a, 3a, OCH₂:6H, multi, δ 4,1-4,3, 6α:1H, multi, δ 3,1, 6β:1H, d, δ 2,8, CH₂8H, δ 1-1,6
Beispiel 2*
Synthese von N-Biotinyl-N'-methacroyltrimethylenamid (Verbindung B)*
In 300 mL N,N-Diemthylformamid (DMF) wurden 18 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid, 24 g Biotin und 30 g Triethylamin gelöst und dann auf 0°C abgekühlt. Zur Reaktionsmischung wurde eine Lösung, erhalten durch Auflösen von 28 g Diphenylphosphorylazid in 50 mL DMF, 1 h lang getropft. Nach Beendigung des Zutropfens wurde bei 0°C 3 h lang und dann bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurden das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand einer Säulenchromatografie mit einer Chloroform-Methanol-Mischung als Entwicklungslösungsmittel unterzogen. Als Ergebnis wurden 22 g N-Biotinyl-N'-methacroyltrimethylenamid (Verbindung B) als Zielverbindung in der Form eines weißen Pulvers erhalten (Ausbeute: 59 %).
Die NMR-Analyse zeigte ganz klar, das Vorliegen der Zielverbindung B (in DMSO).
CONH:2H, br.s, δ 7,9, NH, NH:2H, d, δ 6,4, H2, H3:2H, s, δ 5,6, δ 5,3, 3a, 6a:2H, br. d, δ 4,2, CH₂:4H, s, δ 3,0, 6α, 6β: 2H, multi, δ 2,8, 4H:1H, multi, δ 2,6, COCH₂:2H, br.s, δ 2,1, CH₂:3H, δ 1,8, CH₂:8H, δ 1,2-1,5
Beispiel 3*
Synthese von N-Iminobiotinyl-N'-methacroyltrimethylenamid (Verbindung C)*
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 2, mit der Ausnahme, dass 18 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrobromid anstatt der 18 g des in Beispiel 2 enthaltenen N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorids und 24 g Iminobiotin anstatt der 24 g Biotin verwendet wurden, wurden 15 g Hydrobromid des N-Iminobiotinyl-N'-methacroyltrimethylenamids (der Verbindung C) erhalten (Ausbeute: 42 %).
Die NMR-Analyse zeigte ganz klar das Vorliegen des Hydrobroms der Zielverbindung C (in DMSO).
NH, NH:2H, d, δ 8,0-8,2, CONH:2H, br.s, δ 7,9, =NHxHBr:2H, s, δ 7,5, H2, H3:2H, s, δ 5,6, δ 5,3, 3a, 6a:2H, br.d, δ 4,2, CH₂:4H, s, δ 3,0, 6α, 6β:2H, multi, δ 2,8, 4H:1H, multi, δ 2,6, COCH₂:2H, br.s, δ 2,1, CH₃:3H, δ 1,8, CH₂:8H, δ 1,2-1,5
Beispiel 4*
Synthese von Biotinolacrylat (Verbindung D)*
4-1) Synthese von Biotinol (Verbindung iv) aus Biotin:
Lithiumaluminiumhydrid (1,96 g, 51,64 mmol) wurde zu 250 mL entwässertem Ether in Anteilen gegeben, worauf das Ganze verrührt wurde. Eine heiße Lösung, erhalten durch Auflösen von 1,96 g (8,02 mmol) Biotin in 50 mL Pyridin, wurde in die Reaktionsmischung getropft, und das Ganze wurde bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Nach Erwärmen am Rückfluss über 30 min wurde die Reaktion beendet. Überschüssiges Lithiumaluminiumhydrid wurde durch Wasser oder dgl. zersetzt. Das Pyridin wurde unter verringertem Druck entfernt. Zum Rückstand wurde 6 N Salzsäure gegeben, um den pH-Wert auf ca. 2 einzustellen. Die Mischung wurde mit Chloroform extrahiert. Abdestillieren des Lösungsmittels ergab ein weißes Pulver. Das weiße Pulver wurde aus Ethanol umkristallisiert, wobei 1,6 mg Biotinol (Verbindung iv) erhalten wurden (Ausbeute: 85 %).
4-2) Synthese von Biotinolacrylat (Verbindung D) durch die Reaktion von Biotinol (der Verbindung iv) mit einem Acrylierungsagens:
Reaktionsschema 1:
Nach Vermischen von 230 mg (1 mmol) Biotinol (Verbindung iv), 2,73 mg (3 mmol)Triethylamin, 252 mg (2 mmol) Acrylsäureanhydrid, 12,9 mg (0,1 mmol) Dimethylaminopyridin und von 5 mL Dichlormethan bei Raumtemperatur wurde die Mischung am Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO₃, mit gesättigter Kochsalzlösung und mit Wasser gewaschen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einem Lösungsmittel extrahiert und dann einer Säulenchromatografie mit einer Chloroform-Methanol-Mischung als Entwicklungslösungsmittel unterzogen, wobei 170 mg Biotinolacrylat (Verbindung D) als weißes Pulver erhalten wurden (Ausbeute: 59 %, die Ausbeute von Biotinolacrylat aus Biotinmethylester betrug ca. 50 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse und Massenspektrometrie (MS) zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung D.
NMR (in CDCl₃) H1, H2, H3: δ 6,4-6,1, H3:1H, d, δ 5,9, NH:1H, s, δ 5,6, δ 5,1, 6α:1H, multi, δ 4,5, 3a:1H, tri, δ 4,3, OCH₂:2H, tri, δ 4,1, H4:1H, multi, δ 3,1, 6α:1H, quart, δ 2,9, 6β:1H, d, δ 2,6, CH₂:8H, δ 1-1,6
MS-Masse = 285
Beispiel 5*
Synthese von Biotinolmethacrylat (Verbindung E)*
Nach Vermischen von 550 mg (2,3 mmol) Biotinol (Verbindung iv), erhalten in Beispiel 4, von 1,4 g (7 mmol) Triethylamin (Et₃N), 1,6 g (4,6 mmol) Methacrylsäureanhydrid, 60 mg Dimethylaminopyridin und von 4 mL Dichlormethan (Lösungsmittel) wurde die Mischung am Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO₃ gewaschen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Chloroform extrahiert und dann einer Säulenchromatografie mit einem Chloroform-Methanol-Lösungsmittelgemisch unterzogen, wobei 630 mg Biotinolmethacrylat (Verbindung E) als weißes Pulver erhalten wurden (Ausbeute: 40 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse und der Massenspektrometrie (MS) zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung E.
NMR (in DMSO) NH:1H, s, δ 6,4, NH:1H, s, δ 6,3, H2, H3:1H, s, δ 6,0-5,6, 6a:1H, multi, δ 4,3, 3a, OCH₂:3H, multi, δ 4,1, 6α:1H, quart, δ 3,1, 6β:1H, d, δ 2,8, CH₃:3H, s, δ 1,9, CH₂:8H, δ 1-1,6
MS-Masse = 300
Beispiel 6
Synthese von Biotinaminacrylamid (Verbindung F)
Reaktionsschema 2:
6-1) Synthese von Biotinoltosylat (Verbindung viii):
Bei 0°C wurde 1 g (4,3 mmol) Biotinol (Verbindung iv), erhalten in Beispiel 4, zu 25 mL trockener Pyridin-Lösung gegeben, worin 2400 mg (12,6 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid vermischt waren. Die entstandene Mischung wurde dann bei 0°C 15 h lang stehen gelassen. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in Wasser gegossen und dann mit Dichlormethan extrahiert. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und es wurden 900 mg Biotinoltosylat (Verbindung viii) erhalten (Ausbeute: 54 %).
6-2) Synthese eines Biotinphthalimidderivats (der Verbindung ix):
In 14 mL entwässertem Dimethylformamid (DMF) wurden 900 mg (2,3 mmol) oben erhaltenes Biotinoltosylat (Verbindung viii) gelöst. Zur entstandenen Lösung wurden 481 mg (2,6 mmol) Phthalimid-Kaliumsalz gegeben, und die Mischung wurde bei 60°C 20 h lang erwärmt. Nach Beendigung der Reaktion wurde Wasser zugegossen, um das Phthalimidderivat auszufällen. Das Derivat wurde durch Filtrat gesammelt und getrocknet, wobei 570 mg Biotinphthalimidderivat (Verbindung ix) erhalten wurden (Ausbeute: 68 %).
6-3) Synthese von Biotinamin (der Verbindung x):
Hydrazin-Monohydrat (626 mg) wurde zu Methanol in Anteilen gegeben (um eine 0,5 M MeOH-Lösung zu ergeben), und es wurden dann des Weiteren 570 mg oben erhaltenes Biotinphthalimidderivat (Verbindung ix) zugegeben. In einer Stickstoff-Atmosphäre wurde die Mischung bei 40°C 20 h lang zur Reaktion gebracht, wobei 411 mg ungereinigtes Biotinamin (BiNH₂) (Verbindung x) erhalten wurden (Ausbeute: ca. 100 %).
6-4) Synthese von Biotinaminacrylamid (Verbindung F):
In 4 mL Dimethylformamid (DMF, Lösungsmittel) wurden 133 mg, (0,5 mmol) Biotinamin-Hydrochlorid, erhalten durch die Reaktion des oben beschriebenen Biotinamins (der Verbindung x) mit Salzsäure, und 36 μL (0,5 mmol) Acrylsäure gelöst. Die entstandene Lösung wurde bei 0°C gehalten und dann gerührt. In die Reaktionsmischung wurden 165 μL (0,6 mmol) Diphenylphosphorylazid (DPPA) getropft, und die Mischung wurde bei 0°C gehalten. Eine Lösung, erhalten durch Auflösen von 208 μL (1,5 mmol) Triethylamin in 1 mL DMF, wurde zugetropft, und die Mischung wurde bei 0°C 2 bis 4 h lang gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, und die Reaktion wurde über Nacht fortgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden das DMF abdestilliert und der Rückstand mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Schicht wurde dann mit 1 N Salzsäure, NaHCO₃ und mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde dann beseitigt. Der Rückstand wurde in einer DMF-n-Hexan-Lösungsmittelmischung gelöst, wobei 40 mg Biotinaminacrylamid (Verbindung F) (Ausbeute: 25 %) als Niederschlag erhalten wurden.
Die Ergebnisse der NMR-Analyse und der Massenspektrometrie (MS) zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung F.
NMR (in DMSO) CONH:1H, s, δ 7,9, H1, H2, H3:3H, multi, δ 7,5-6,9, NH, NH:1H, s, δ 6,4, δ 6,3, 6a:1H, multi, δ 4,3, 3a:1H, multi, δ 4,1, CONHCH₂, H4:H3, multi, δ 3,5-3,0, 6α:1H, quart, δ 2,8, 6β:1H, d, δ 2,5, CH₂:8H, δ 1-1,6
MS-Masse = 284
Beispiel 7
Synthese von Biotinaminmethacrylamid (Verbindung G)
In 5 mL DMF (Lösungsmittel) wurden 100 mg (0,38 mmol) Biotinamin-Hydrochlorid und 38 μL (0,43 nmol) Methacrylsäure gelöst. Die entstandene Lösung wurde bei 0°C gehalten und dann gerührt. In die Reaktionsmischung wurden 130 μL (0,5 mmol) DPPA getropft, und die Mischung wurde bei 0°C gehalten. Eine Lösung, erhalten durch Auflösen von 156 μL (1,1 mmol) Triethylamin in 1 mL DMF, wurde zugetropft, und die Mischung wurde 2 bis 4 h lang bei 0°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, und die Reaktion wurde danach fortgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das DMF unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst. Die Chloroform-Schicht wurde mit 1 N Salzsäure, NaHCO₃ und mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde dann entfernt. Der Rückstand wurde in einem THF-n-Hexan-Lösungsmittelgemisch behandelt, wobei 40 mg Biotinaminmethacrylamid (Verbindung G) als Niederschlag erhalten wurden (Ausbeute: 35 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse und der Massenspektrometrie (MS) zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung G.
CONH:1H, s, δ 7,9, H1, H2, H3:3H, multi, δ 7,5-6,9, NH, NH:1H, s, δ 6,4, δ 6,3, 5a:1H, multi, δ 4,3, 3a:1H, multi, δ 4,1, CONHCH₂, H4:3H, multi, δ 3,5-3,0, 6α:1H, quart, δ 2,8, 6β:1H, D, δ 2,5, CH₂:6H, δ 1-1,6
MS-Masse = 299
Beispiel 8
Synthese von Norbiotinaminacrylamid (Verbindung H)
In 3 mL Dimethylformamid (DMF, Lösungsmittel) wurden 125 mg (0,5 mmol) Norbiotinamin-Hydrochlorid (Produkt von Merck & Co., Inc.) und 36 μL Acrylsäure gelöst. Die entstandene Lösung wurde bei 0°C gehalten und gerührt. In die Reaktionsmischung wurden 165 μL (0,06 mmol) Diphenylphosphorylazid (DPPA) getropft, und die Mischung wurde bei 0°C gehalten. Eine Lösung, erhalten durch Auflösen von 208 μL (1,5 mmol) Triethylamin in 1 mL DMF, wurde zugetropft, und die Mischung wurde bei 0°C 2 bis 4 h lang gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gehalten und über Nacht zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurde das DMF abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Schicht wurde dann mit 1 N Salzsäure, NaHCO₃ und mit Wasser gewaschen, worauf das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rückstand wurde in einem THF-n-Hexan-Lösungsmittelgemisch behandelt, wobei 30 mg Norbiotinaminacrylamid (Verbindung H) als Niederschlag erhalten wurden (Ausbeute: 20 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung H (in DMSO).
NMR (in DMSO) CONH:1H, s, δ 7,8, NH, NH:1H, s, δ 6,4, δ 6,3, H1, H2:1H, s, δ 5,6, δ 5,3, 6a:1H, multi, δ 4,3, 3a:1H, multi, δ 4,1, CONHCH₂, H4:3H, multi, δ 3,5-3,0, 6α:1H, quart, δ 2,8, 6β:1H, d, δ 2,5, CH₃:3H, δ 1,8, CH₂:8H, δ 1-1,6
Beispiel 9
Synthese von Norbiotinaminmethacrylamid (Verbindung J)
In 3 mL DMF (Lösungsmittel) wurden 94 mg (0,38 mmol) Norbiotinamin-Hydrochlorid und 38 μL (0,43 mmol) Methacrylsäure gelöst. Die entstandene Lösung wurde bei 0°C gehalten und gerührt. DPPA (130 μL, 0,5 mmol) wurden dann in die Reaktionsmischung getropft, und die Temperatur wurde bei 0°C gehalten. Eine Lösung, erhalten durch Auflösen von 156 μL (1,1 mmol) Triethylamin in 1 mL DMF, wurde des Weiteren zugetropft, und die Mischung wurde 2 bis 4 h lang bei 0°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gehalten und über Nacht zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurde das DMF entfernt. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Schicht wurde mit 1 N Salzsäure, NaHCO₃ und mit Wasser gewaschen, worauf das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rückstand wurde in einem THF-n-Hexan-Lösungsmittelgemisch behandelt, wobei 30 mg Norbiotinaminmethacrylamid (Verbindung J) als Niederschlag erhalten wurden (Ausbeute: 30 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung J (in DMSO).
CONH:1H, s, δ 7,8, NH, NH:2H, d, δ 6,4, H1, H2:1H, s, δ 5,6, δ 5,3, 6a:1H, multi, δ 4,3, 3a:1H, multi, δ 4,1, CONHCH₂, H4:3H, multi, δ 3,5-3,0, 6α:1H, quart, δ 2,8, 6β:1H, d, δ 2,5, CH₃:3H, δ 1,8, CH₂:6H, δ 1-1,6
Beispiel 10
Synthese von Biotinolmethacroylcarbamat (Verbindung K)*
In 20 mL Methylenchlorid wurden 266 mg Methacroylisocyanat (Verbindung vii) gelöst. Die Lösung wurde bei 0°C gehalten. Eine Methylenchlorid-Lösung, enthaltend 500 mg Biotinol, wurde dann in Anteilen zugetropft. Die Mischung wurde 1 h lang und dann bei Raumtemperatur 10 h lang gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurden 30 mL gesättigte wässrige Natriumbicarbonat-Lösung zugegeben, worauf mit Chloroform extrahiert wurde. Aus der Chloroform-Schicht wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde an einer Kieselgel-Säule chromatografiert. Die so erhaltene rohe Zielverbindung wurde aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 120 mg Biotinolmethacroylcarbamat (Verbindung K) erhalten wurden (Ausbeute: 16 %).
Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigten ganz klar das Vorliegen der Zielverbindung K.
CONHCO:1H, s, δ 8,4-8,5, NH:1H, s, δ 6,2, H2, H3:1H, s, δ 5,8, δ 5,6, NH:1H, s, δ 5,5, 6a:1H, multi, δ 4,5, 3a:1H, multi, δ 4,3, OCH₂:2H, tri, δ 4,2 4H:1H, multi, δ 3,2, 6α:1H, quart, δ 2,9, 6β:1H, d, δ 2,7, CH₃:3H, s, δ 1,9, CH₂:8H, δ 1,2-1,7
Die Protonen der oben beschriebenen NMR-Daten sind wie folgt angegeben:

(Im Fall des Amids ist das Sauerstoffatom durch NH ersetzt)

Beispiele 11 bis 15*
Synthese von Acrylamid/Biotinolacrylat-Copolymeren
Acrylamid (710 mg), 142 mg Biotinolacrylat (Verbindung B)*, 10 mL Dimethylsulfoxid und 8,5 mg 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) wurden vermischt und dann in einer Stickstoffgas-Atmosphäre entlüftet. Die Temperatur wurde stufenweise angehoben, und bei 45°C wurde die Reaktion 2 bis 3 h lang unter Rühren durchgeführt. Schließlich wurde die Temperatur auf ca. 65°C angehoben, und es wurde die Reaktion beendet. Einige mL Lösungsmittel (Dimethylsulfoxid) wurden zum Reaktionssystem gegeben. Die Zugabe der entstandenen Mischung zu Ethanol verursachte eine Ausfällung (Ausbeute: mindestens 95 %). Nach Trocknen des Niederschlags wurde dieser in Wasser gelöst und dann dialysiert. Durch Entfernen des Wassers wurde die Reinigung des Polymers beendet.
Die Ergebnisse von Polymeren, enthalten durch Polymerisation von Acrylamid und Biotinolacrylat, beaufschlagt mit variierten Verhältnissen (Molverhältnissen) in der Gegenwart von entweder 1 oder 2 Initiatoren) (Verwendung von Azobisisobutyronitril anstatt des oben beschriebenen Initiators 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril); die Unterschiede bestehen bei der Reaktionstemperatur und beim Molekulargewicht), sind in Tabelle-2 angegeben:
Das Molekulargewicht wurden mit "G4000PW" von TOSO gemessen.
Physiologische Kochsalzlösung: Die Durchlässigkeit wurde in physiologischer Kochsalzlösung gemessen.
Wasser: Die Durchlässigkeit wurde in destilliertem Wasser gemessen.
Beaufschlagungsverhältnis: Molverhältnis
Die Polymerisationstemperatur betrug 45 bis 65°C in der Gegenwart von 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril).
Die Polymerisationstemperatur betrug 80°C in der Gegenwart von Azobisisobutyronitril.
Konzentration der Lösung, verwendet zur Durchlässigkeitsmessung in Beispiel 11 oder 12: 6 mg/mL
Konzentration der Lösung, verwendet zur Durchlässigkeitsmessung in Wasser in Beispiel 13: 10 mg/mL
Konzentration der Lösung, verwendet zur Durchlässigkeitsmessung in physiologischer Kochsalzlösung in Beispiel 13: 6 mg/mL
Konzentration der Lösung, verwendet zur Durchlässigkeitsmessung in Beispiel 14: 22,4 mg/mL
Konzentration der Lösung, verwendet zur Durchlässigkeitsmessung in Beispiel 15: 6 mg/mL

AAm: Acrylamid BA: Biotinolacrylat
Die NMR-Daten (in DMSO) des Acrylamid/Biotinolacrylat-Copolymers (Beaufschlagungsmolverhältnis: 20:1) werden wie folgt angegeben:
4 Peaks: δ 7,5-6,5, s: δ 6,4, s: δ 4,3, s: δ 4,1, s: δ 3,1, breit: δ 2,8, breit: δ 2,1, breit: δ 1,5-1,3
Die Peaks der obigen Copolymeren waren trotz der veränderten Beaufschlagungsverhältnisse (Molverhältnisse) ähnlich. Das Homopolymer von Biotinolacrylat zeigte Peaks an ähnlichen Stellen wie das Copolymer mit der Ausnahme von ca. 1 Peak bei δ 7,5 bis 6,5.
Die Beziehung zwischen der Temperatur und der Durchlässigkeit bei Erwärmen und Abkühlen mittels UCST (Copolymer-Konzentration: 10 mg/mL) des Acrylamid/Biotinolacrylat-Copolymers (Beaufschlagungsmolverhältnis = 20:1) in Wasser und die Abweichungen der Durchlässigkeit (bei Abkühlung) eines Copolymers, das Avidin in physiologischer Kochsalzlösung erkannt hat, bezogen auf die Abweichungen beim Avidin-Erkennungsvermögen des Acrylamid/Biotinolacrylat-Copolymers (Beaufschlagungsverhältnis: 20) in physiologischer Kochsalzlösung (Copolymer-Konzentration: 6 mg/mL), und die UCST (lediglich die Durchlässigkeit bei Abkühlung) wurden gemessen.
Die Abweichungen der LCST (bei Abkühlung) eines N-Isopropylacrylamid/Biotinol-Acrylat-Copolymers durch die Zugabe von Avidin legen es nahe, dass die Zugabe von Avidin zu einer wässrigen Lösung, die das Copolymer enthält, die Änderung seiner Durchlässigkeit absenkt und die Löslichkeit des Polymers erhöht.
Es ist somit herausgefunden worden, dass ein Copolymer, das das Biotinmonomer der Erfindung als Copolymerkomponente enthält, charakteristische Eigenschaften als Temperaturreizempfindliches Material aufweist.
Beispiel 16*
Synthese von Biotin-immobilisiertem Poly(N-isopropylacrylamid)
In einen 300 mL Kolben wurden 0,488 g N-Isopropylacrylamid, 0,159 g N-Methacroyl-N'-biotinylpropylendiamin und 94 mL destilliertes Wasser gegeben. Die entstandene Mischung wurde gründlich bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden 0,1 g Kaliumpersulfat gegeben, und es wurde das Ganze bei Raumtemperatur 6 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde 24 h lang dialysiert, wobei eine biotinylierte Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung mit LCST erhalten wurde. Als Messergebnis wies die entstandene Lösung eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) von 31°C auf. Diese LCST verändert sich sogar in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem 100 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) nur kaum. Das auf die LCST oder darüber erwärmte Polymer zeigte ein deutlich hohes Aggregationsvermögen und fiel am Boden aus. Das Polymer wurde durch Abgießen gesammelt.
Die LCST wurde aus der Durchlässigkeit von sichtbarem Licht bestimmt.
Beispiel 17*
Abtrennung von Avidin aus wässriger Lösung
Nach 50 μL der wässrigen Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung, erhalten in Beispiel 16, wurden 50 μL 1,0 %ige Avidin-Lösung, 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) und 800 μL destilliertes Wasser gründlich in einem Testrohr vermischt, und das Testrohr wurde in Eiswasser gegeben, um die Temperatur der Lösung auf die LCST oder darunter einzustellen. Das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt. Nach Modifikation von 100 μL Überstand mit SDS wurde das Verschwinden der Avidin entsprechenden Bande aus dem Überstand durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestätigt.
Beispiel 18*
Spezifische Abtrennung von Avidin aus Eiweiß
Nach 50 μL in Beispiel 16 erhaltener Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung mit LCST wurden 50 μL 1,0 %ige Avidin-Lösung, 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0), 450 μL destilliertes Wasser und 400 μL 2,5 %ige Eiweiß-Lösung gründlich in einem Testrohr vermischt, und das Testrohr wurde in Eiswasser gegeben, um die Temperatur der Lösung auf die LCST oder darüber einzustellen. Das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt. Nach Modifikation von 100 μL Überstand mit SDS wurde das Verschwinden der Avidin entsprechenden Bande aus dem Überstand durch SDS-PAGE bestätigt.
Beispiel 19*
Immobilisierung von avidiniertem Enzym an Biotinimmobilisiertem Poly(N-isopropylacrylamid)
Die in Beispiel 16 erhaltene wässrige Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung (100 μL), 1000 μL im Handel erhältliche avidinierte Peroxidase-Lösung (1 mg/mL), 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) und 700 μL destilliertes Wasser wurden gründlich vermischt. Die entstandene Lösung wurde abgekühlt, und das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt. Nach Entfernen von 1900 μL Überstand wurden 1900 μL 0,1 M Phosphat-Puffer (pH = 7,0) zugegeben, wodurch eine wässrige Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung mit daran immobilisierter avidinierter Peroxidase mit LCST zubereitet wurde. Diese Lösung zeigte Löslichkeit bei Temperaturen, die nicht über der LCST lagen, und Aggregation bei LCST oder darüber. Die Temperatur der Lösung wurde in einem Thermostat abgeändert, und es wurden Vorgänge wie Auflösen, Aggregation und Abgießungsgewinnung durchgeführt. Die Peroxidase-Aktivität jedes Überstands wurde mit dem unten beschriebenen Peroxidase-Aktivitätsmessverfahren gemessen. Jedes Mal nach dem Sammeln durch Abgießen wurden 1900 μL Überstand entfernt und 1900 μL 0,1 M Phosphat-Puffer (pH = 7,0) statt dessen zugegeben.
(Peroxidase-Aktivitätsmessverfahren)
In der Zelle eines Absorptiometers wurden 100 μL 100 mM Wasserstoffperoxid, 50 mM Phenol, 100 μL 50 mM 4-Aminoantipyrin, 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) und 580 μL destilliertes Wasser vorab vermischt. Zur entstandenen Mischung wurden 20 μL Probe gegeben. Nach erneuter gründlicher Vermischung wurde das entstandene Produkt durch den Anstieg der Absorption bei 500 nm gemessen. Die oben beschriebene Reaktion wurde bei 30°C durchgeführt.
Die Messergebnisse der enzymatischen Aktivität der Überstände sind nach Wiederholung der Aggregations- und Auflösungsvorgänge mit dem oben beschriebenen Verfahren unten in Tabelle-3 angegeben. Die enzymatische Aktivität wurde durch eine spezifische Aktivität ausgedrückt, bezogen auf die Aktivität bei der ersten Auflösung, die auf 100 festgelegt wurde.
Tabelle-3
Diese Ergebnisse legen es nahe, dass die an Poly(N-isopropylacrylamid) immobilisierte avidinierte Peroxidase bei wiederholter Auflösung und Aggregation zusammen mit Poly(N-isopropylacrylamid) und sogar bei dieser Wiederholung ihre Aktivität nicht einbüßte.
Beispiel 20*
Immobilisierung eines biotinylierten Enzyms an avidiniertem Poly(N-isopropylacrylamid)
Ein avidiniertes Poly(N-isopropylacrylamid), dessen Avidin 3 freie Biotin-Bindungsstellen aufwies, wurde wie folgt erhalten. Nach Zugabe von 500 μL 1,0 %iger Avidin-Lösung, 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) und von 350 μL destilliertem Wasser zu 50 μL in Beispiel 1 erhaltener wässriger Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung und gründlicher Vermischung in einem Testrohr wurde das Testrohr in einen Thermostat von 40°C gegeben, um die Temperatur der Lösung auf die LCST oder darüber einzustellen. Das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt, wobei ein avidiniertes Poly(N-isopropylacrylamid) erhalten wurde, dessen Biotin-Bindungsstellen im Unterschied zu den an das Polymer gebundenen frei waren. Die entstandene wässrige Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung (100 μL), 1000 μL im Handel erhältliche biotinylierte Peroxidase-Lösung (1 mg/mL), 100 μL 1,0 M Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) und 700 μL destilliertes Wasser wurden gründlich vermischt. Die entstandene Lösung wurde abgekühlt, und daraus wurde das Aggregat durch Abgießen gesammelt. Nach Entfernen von 1900 μL Überstand wurden 1900 μM 0,1 M Phosphat-Puffer (pH = 7,0) statt dessen zugegeben, wodurch avidiniertes Poly(N-isopropylacrylamid) mit daran immobilisierter biotinylierter Peroxidase zubereitet wurde. Wie in Beispiel 19 wurden Auflösung, Aggregation und Sammeln mit diesem Poly(N-isopropylacrylamid) wiederholt. Die Messergebnisse der enzymatischen Aktivität jedes Überstands sind unten in Tabelle-4 angegeben. Die enzymatische Aktivität wurde durch die spezifische Aktivität ausgedrückt, bezogen auf die Aktivität bei der ersten Auflösung, die auf 100 festgelegt wurde.
Tabelle-4
Diese Ergebnisse legen es nahe, dass die am Poly(N-isopropylacrylamid) gebundene biotinylierte Peroxidase mit daran immobilisiertem Avidin bei wiederholter Auflösung und Aggregation zusammen mit Poly(N-isopropylacrylamid) und sogar durch diese Wiederholung ihre Aktivität nicht einbüßte.
Beispiel 21*
Immobilisierung von molekularem Chaperon an Poly(N-isopropylacrylamid)
Das im Handel erhältliche biotinylierte Wärmeschock-Protein "HSP70" wurde gründlich mit einem 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,0) vermischt. Nach Modifikation eines 5 μL Anteils der entstandenen Mischung wurde die Bande des HSP70 durch SDS-PAGE bestätigt. Zur Mischung wurden 50 μL in Beispiel 20 erhaltene wässrige Lösung des avidinierten Poly(N-isopropylacrylamids) gegeben, dessen Biotin-Bindungsstellen im Unterschied zu den am Polymer gebundenen noch frei geblieben waren. Nach gründlicher Vermischung wurde die Lösung wie in Beispiel 17 erwärmt, um die vorliegende Verbindung zu aggregieren. Die Verbindung wurde durch Abgießen gesammelt, und das HSP70 des Überstands wurde mit SDS-PAGE bestätigt. Als Ergebnis wurde kein HSP70 aus dem Überstand beobachtet, was dessen Bindung an das Avidin nahelegt, das am Poly(N-isopropylacrylamid) immobilisiert wurde.
Beispiel 22*
Abtrennungs- und Aufkonzentrierungsverfahren von Mikroorganismen
Ein im Handel erhältlicher biotinylierter Salmonella-Antikörper wurde an Poly(N-isopropylacrylamid) wie in Beispiel 19 immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch SDS-PAGE bestätigt. Zu 20 mL einer bakteriellen Suspension, die auf 1 Zelle/mL Salmonella-Bakterien eingestellt war, wurde 1 mL der entstandenen wässrigen Poly(N-isopropylacrylamid)-Lösung gegeben. Nach gründlichem Rühren wurde die Lösung wie in Beispiel 16 erwärmt, um Poly(N-isopropylacrylamid) zu aggregieren. Das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt, und der Überstand wurde entnommen, und es wurde 1 mL Lösung erhalten. Die entstandene Lösung, die vorab sterilisiert wurde, wurde zu 20 mL Hirn-Herz-Infusionsagarmedium gegeben, das vorab bei 50°C inkubiert worden war. Nach sofortiger Vermischung wurde die Mischung auf einer Petri-Schale ausgebreitet und abgekühlt, bis sich das Agarmedium verfestigte. Bei 37°C wurde 48 h lang inkubiert. Die Ergebnisse der Kolonie-Zahl nach 48 h sind unten in Tabelle-5 angegeben. Die oben beschriebenen Vorgänge und Abläufe wurden alle auf einer reinen Bank durchgeführt. Zum Vergleich wurde die Schale-Zahl in 1 mL der bakteriellen Suspension, die vorher zuerst eingestellt worden war, in gleicher Weise ohne die Zugabe von Poly(N-isopropylacrylamid) gemessen.
Tabelle-5
Aus diesen Ergebnissen war ersichtlich, dass die Salmonella-Bakterien durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Poly(N-isopropylacrylamids) auf konzentriert und angereichert wurden.
Beispiel 23*
Immobilisierung von Nucleinsäure an Poly(N-isopropylacrylamid)
Zu 500 μL (50 bis 1000 bp) im Handel erhältlichen Biotinmarkierten DNA-Fragmenten wurden 450 μL destilliertes Wasser und 50 μL der in Beispiel 20 hergestellten wässrigen Lösung des avidinierten Poly(N-isopropylacrylamids) gegeben, dessen Biotin-Bindungsstellen anders als die mit dem Polymer gebundenen noch frei geblieben waren. Nach gründlicher Vermischung wurde die Lösung wie in Beispiel 17 erwärmt, um Poly(N-isopropylacrylamid) zu aggregieren. Das Aggregat wurde durch Abgießen gesammelt. Eine Agarosegel-Elektrophorese der DNA-Fragmente im Überstand legte es nahe, dass jedes der DNA-Fragmente an Poly(N-isopropylacrylamid) gebunden wurde. Ein ähnlicher Test wurde für RNA durchgeführt, und es wurde die Bindung an Poly(N-isopropylacrylamid) bestätigt.
Industrielle Anwendbarkeit
Die in der Erfindung verwendeten polymerisierbaren Biotinderivate (Biotinmonomere) weisen eine gute und hohe Polymerisierbarkeit auf, so dass die Verwendung dieser Monomeren die Herstellung von eine Biotin-Komponente enthaltenden Polymerderivaten erleichtert, die auf vielen Gebieten verwendbar sind. Insbesondere ermöglicht die Copolymerisation des Biotinmonomers mit einem weiteren Monomer die Synthese oder den Entwurf eines Polymers, das dann mit den Funktionen beider Monomere ausgerüstet wird. Durch die Auswahl entsprechend geeigneter Copolymerkomponenten oder Additive unter Nutzung des Wirkvermögens der Biotinkomponente, die sich aus einer Biotin-Avidin-Affinität ergibt, werden die Synthese oder der Entwurf verschiedener poly- oder multifunktionaler Polymerer ermöglicht, die eine breite Nutzungs- und Anwendungsvielfalt aufweisen.
Beispielsweise weist ein Copolymer aus dem Biotinmonomer und aus Acrylamid- oder Methacrylamid eine UCST sowohl jeweils in einer wässrigen Lösung als auch in einer physiologischen Kochsalzlösung auf, so dass das Copolymer als interessantes Reiz-empfindliches Material zu dienen vermag. Ein Copolymer aus dem Biotinmonomer und einem hochmolekularen Monomer, welches eine LCST zeigt und ergibt, weist eine deutlich hohe Aggregationskraft bei der LCST oder darüber auf, so dass Reaktionen in einem einheitlichen System in wässriger Lösung durchgeführt werden und nach Beendigung der Reaktionen ein Ligand-immobilisiertes Polymer, das durch Erwärmen aggregiert wurde, sofort und unmittelbar durch Filtration gesammelt werden kann.
Durch Verwendung der thermo-reaktiven Polymeren der Erfindung wird es ermöglicht, ausgezeichnete Trennmittel, Testmittel, immobilisierte Enzyme und Denaturierungsmittel für denaturierte Proteine zu erhalten.
Die polymerisierbaren Biotinderivate der Erfindung sind Monomere zur Verwendung als hochmolekulares Material, das eine Biofunktion aufweist, und sie können in breitem Umfang für Immunoassayverfahren, Biosensoren, DNA-Verfahrensabläufe, Trennmaterialien und für klinische Therapieverfahren eingesetzt und angewandt werden. Dies ist der Tatsache zuzuschreiben, dass Biotin selbst ein biofunktionales Material mit der Befähigung zum Erkennen von nicht nur dem Avidin-Molekül, sondern auch vieler Antikörper und von Kollagen ist. Beispielsweise kann eine Sandwich-Struktur, die darin eingebrachtes Avidin aufweist, auf den verschiedensten Gebieten zur Anwendung gelangen.
Die Polymerverbindung, die mit dem polymerisierbaren Biotin der Erfindung erhalten wird, kann industriell produziert werden, und deren Wirtschaftlichkeit und Leistungsvermögen sind ausgezeichnet.

Claims

Polymerverbindung, die in einer wäßrigen Lösung eine obere kritische Lösungstemperatur (UCST) aufweist, wobei die Polymerverbindung ein polymerisierbares Biotinderivat der folgenden Formel (Ib) und Acrylamid oder Methacrylamid als Copolymerkomponente umfaßt:
In der Formel (Ib) bedeutet R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe; R³ und R⁴ bedeuten unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe; T bedeutet ein Sauerstoffatom oder =NH; R¹ bedeutet eine Einfachbindung oder eine C_1-5-Alkylengruppe und X⁴ bedeutet -NH-.
Polymerverbindung gemäß Anspruch 1, die ferner eine hydrophiles oder hydrophobes Monomer als weitere Copolymerkomponente umfaßt.
Polymerverbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin ein biotinierter Antikörper durch einen Avidinimmobilisierten Antikörper oder eine Bindungsstelle des Avidins immobilisiert wird.
Trennmittel, welches die Polymerverbindung des Anspruchs 3 umfaßt.
Ein Mittel zum Testen von Mikroorganismen über die Trennung oder Konzentration des Mikroorganismus unter Verwendung einer Polymerverbindung des Anspruchs 3.
Ein immobilisiertes Enzym, welches eine Polymerverbindung des Anspruchs 3 umfaßt.
Polymerderivat des Anspruchs 1, worin ein Avidinimmobilisiertes Wärmeschockprotein oder ein biotiniertes Wärmeschockprotein über die Bindungsstelle des Avidins immobilisiert wird.