DE60020213T2

DE60020213T2 - Zusammensetzungen sowie verfahren zur diagnose und behandlung von tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE60020213T2
Application number: DE60020213T
Authority: DE
Inventors: David Botstein; Audrey Goddard; A. David LAWRENCE; Diane Pennica; Ann Margaret ROY; I. William WOOD
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-01-21
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-01-20
Also published as: ES2242597T3; IL143055A; JP2002534987A; DE60020213D1; EP1145011B1; EP1145011A3; CA2354375A1; AU2512400A; WO2000043790A9; EP1145011A2; IL143055A0; WO2000043790A3; AU776063B2; WO2000043790A2; ATE295963T1; AU776063C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren für die Tumordiagnose und Tumorbehandlung.
Hintergrund der Erfindung
Bösartige Tumoren (Krebsformen) sind nach Herzerkrankungen die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43, 7 (1993)).
Krebs ist gekennzeichnet durch die Zunahme der Anzahl abnormaler oder neoplastischer, von einem normalen Gewebe stammender Zellen, die sich vermehren, um eine Tumormasse zu bilden, die Invasion benachbarter Gewebe durch diese neoplastischen Tumorzellen und die Erzeugung bösartiger Zellen, die sich letztlich über das Blut oder das lymphatische System auf lokale Lymphknoten und entferntere Stellen (Metastasen) verbreiten. In einem krebsartigen Zustand vermehrt sich eine Zelle unter Bedingungen, unter denen normale Zellen nicht wachsen würden. Krebs manifestiert sich in einer großen Vielfalt an Formen, die durch verschiedene Ausmaße an Invasivität und Aggressivität gekennzeichnet sind.
Die Veränderung der Genexpression steht in enger Beziehung mit dem/der unkontrollierten Wachstum und Entdifferenzierung, die eine verbreitete Eigenschaft aller Krebsformen sind. Es hat sich gezeigt, dass die Genome bestimmter gut untersuchter Tumoren eine verminderte Expression rezessiver Gene aufweisen, die üblicherweise als Tumorsuppressorgene bezeichnet werden, die normalerweise in ihrer Funktion das bösartige Zellwachstum und/oder die Überexpression von bestimmten dominanten Genen, wie z.B. Oncogenen, deren Wirkung bösartiges Wachstum fördert, verhindern. Jede dieser genetischen Veränderungen scheint für die Einbringung mancher Merkmale verantwortlich zu sein, die insgesamt den vollständigen neoplastischen Phänotyp darstellen (Hunter, Cell 64, 1129 (1991); Bishop, Cell 64, 235–248 (1991)).
Ein wohlbekannter Mechanismus der Gen-(z.B. Oncogen-)Expression in Krebszellen ist die Genamplifikation. Dies ist ein Prozess, bei dem im Chromosom der Stammzelle Vielfachkopien eines bestimmten Gens produziert werden. Der Prozess umfasst die nicht programmgemäße Replikation der das Gen umfassenden Chromosomenregion, gefolgt von der Rekombination der replizierten Segmente zurück in das Chromosom (Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 47, 235–281 (1986)). Es wird angenommen, dass die Überexpression des Gens mit der Genamplifikation einhergeht, d.h., proportional zur Anzahl der hergestellten Kopien ist.
Es ist festgestellt worden, dass Proto-Oncogene, die für Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren kodieren, wichtige Rollen bei der Pathogenese verschiedener menschlicher Malignitäten, einschließlich Brustkarzinom spielen. Beispielsweise ist gefunden worden, dass das menschliche ErbB2-Gen (erbB2, auch als her2 oder c-erbB-2 bekannt), das für einen 185-kd-Transmembranglykoproteinrezeptor (p185^HER2; HER2) kodiert, das mit dem Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) verwandt ist, bei ungefähr 25% bis 30% der menschlichen Brustkarzinome überexprimiert wird (Slamon et al., Science 235, 177–182 (1987); Slamon et al., Science 244, 707–712 (1989)).
Es ist berichtet worden, dass die Genamplifikation eines Proto-Oncogens ein Ereignis ist, das typischerweise an bösartigeren Krebsformen beteiligt ist und als Vorhersagemittel eines klinischen Ergebnisses dienen könnte (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer 1, 181–193 (1990); Alitalo et al., s.o.) Folglich wird die erbB2-Überexpression üblicherweise als Vorhersagemittel einer schlechten Prognose angesehen, insbesondere bei Patienten mit einer Primärerkrankung, die Achsellymphknoten umfasst (Slamon et al. (1987) und (1989), s.o.; Ravdin und Chamness, Gene 159, 19–27 (1995); und Hynes und Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198, 165–184 (1994)), und ist mit Empfindlichkeit und/oder Resistenz gegen Hormontherapie und chemotherapeutische Regime, einschließlich CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat und Fluoruracil) und Anthrazyklinen in Verbindung gebracht worden (Baselga et al., Oncology 11 (3 Suppl. 1), 43–48 (1997)). Jedoch waren trotz der Verbindung von erbB2-Überexpression mit schlechter Prognose die Unterschiede HER2-positiver Patienten, die auf Behandlung mit Taxanen klinisch reagierten, dreimal höher als jene HER2-negativer Patienten (ebenda). Ein rekombinanter humanisierter monoklonaler Anti-ErbB2-(Anti-HER2-)Antikörper (eine humanisierte Version des Maus-Anti-ErbBG2-Antikörpers 4D5, der als rhuMab HER2 oder Herceptin^® bezeichnet wird) war klinisch aktiv in Patienten mit ErbB2-überexprimierenden metastatischen Brustkarzinomen, die eine umfassende vorhergehende Antikrebstherapie erhalten haben (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14, 737–744 (1996)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von neoplastischem/r Zellwachstum und Vermehrung in Säugetieren, einschließlich Menschen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung eines Gens, das im Genom von Tumorzellen amplifiziert wird. Von einer derartigen Genamplifikation wird erwartet, dass sie mit der Überexpression des Genprodukts in Verbindung steht und zur Tumorgenese beiträgt. Demgemäß wird vom Protein, das vom amplifizierten Gen kodiert wird, angenommen, dass es ein zweckdienliches Ziel zur Diagnose und/oder Behandlung (einschließlich Prävention) bestimmter Krebsformen ist und als Vorhersagemittel der Prognose der Tumorbehandlung dienen könnte.
Ein Genprodukt, CT-1, das zur Behandlung von Herzversagen und/oder neurologischen Störungen, wie z.B. peripherer Neuropathie zweckdienlich ist, wurde im US-Patent Nr. 5.571.675 und ferner in WO 97/30146; US 5.627.073 ; US 5.679.545 ; US 5.571.893 ; und Pennica et al., Cytokine 8(3), 183–189 (1996) offenbart. Hierin wird die überraschende Entdeckung offenbart, dass CT-1 in Tumorzellen, wie z.B. Lungen- und Dickdarmtumorzellen amplifiziert wird. Die Entdeckung des Anmelders, dass CT-1 in Tumorzellen amplifiziert wird, führte zu den zusätzlichen Entdeckungen von Zusammensetzungen zur Behandlung von Tumorzellen und Verfahren zur Durchführung einer derartigen Behandlung.
In einer ihrer Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Tumordiagnose in einem Säugetier, umfassend das Detektieren des Amplifikations- und/oder Expressionsausmaßes eines für ein CT-1-Polypeptid kodierenden Gens (a) in einer Testprobe von vom Säugetier erhaltenen Gewebezellen und (b) in einer Kontrollprobe bekannter normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin die Genamplifikation und/oder ein höheres Expressionsausmaß in der Testprobe die Gegenwart eines Tumors im Säugetier anzeigt, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines Tumors in einem Säugetier, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-CT-1-Antikörpers mit einer Testprobe der vom Säugetier erhaltenen Gewebezellen und (b) die Detektion der Bildung eines Komplexes zwischen dem Anti-CT-1-Antikörper und dem CT-1-Polypeptid in der Testprobe. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ sein und kann im Vergleich mit der Beobachtung der Komplexbildung in einer Kontrollprobe bekannter normaler Gewebezellen desselben Zelltyps durchgeführt werden. Eine größere Menge von in der Testprobe gebildeten Komplexen zeigt die Gegenwart eines Tumors im Säugetier an, aus dem die Testgewebezellen erhalten wurden. Der Antikörper trägt vorzugsweise einen nachweisbaren Marker. Die Komplexbildung kann beispielsweise mittels Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder durch andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Techniken beobachtet werden.
Die Testprobe wird üblicherweise von einem Individuum erhalten, von dem angenommen wird, dass es neoplastische(s) Zellwachstum oder Vermehrung (z.B. Krebszellen) aufweist.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines die Expression und/oder Aktivität des CT-1-Polypeptids hemmenden Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Tumorbehandlung. Das Mittel ist vorzugsweise ein Anti-CT-1-Antikörper, ein kleines organisches und anorganisches Molekül, Peptid, Phosphopeptid, Antisense- oder Ribozym-Molekül oder ein Tripelhelixmolekül. In einem speziellen Aspekt induziert das Mittel, z.B. der Anti-CT-1-Antikörper den Zelltod. In einem weiteren Aspekt werden die Tumorzellen einer Strahlenbehandlung und/oder einem zytotoxischen oder chemotherapeutischen Mittel weiter exponiert.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 (Seq.-ID Nr. 1 und 2) zeigt die Nucleotidsequenz der DNA58125, die eine für ein Nativsequenz-Cardiotrophin-1 (CT-1) kodierende cDNA ist. Seq.-ID Nr. 1 ist der kodierende Strang der DNA58125 und Seq.-ID Nr. 2 ist der komplementäre Strang der DNA58125. Seq.-ID Nr. 3 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des Nativsequenz-Cardiotrophin-1 (CT-1).
2 ist eine graphische Darstellung des menschlichen Chromosoms 16 und kennzeichnet jene Regionen des Chromosoms, an denen DNA58125 und verschiedene Markersonden hybridisieren. Die Markersonden (P7, P55, P99, P154 und P208) befinden sich ungefähr alle 20 Megabasen entlang des Chromosoms 16 und werden als Kontrollen zur Messung der genetischen Amplifikation verwendet. DNA58125 hybridisiert an eine Region am langen Arm zwischen dem Centromer und der Markersonde P99.
3 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Gerüstanalyse der DNA58125 (Cardiotrophin-1) am Lungentumor-Panel 1. Die getesteten Primärlungentumoren sind entlang der x-Achse dargestellt; die Markersonden und DNA58125 sind entlang der z-Achse dargestellt; und die relative genetische Amplifikation im Bereich jeder dieser Markersonden ist als Balken an der y-Achse dargestellt. Die Balken ragen für relativ zur DNA58125 im gesunden Gewebe amplifizierte genetische Regionen über die Nullpunktsebene hinaus oder ragen unter die Nullpunktsebene hinaus, was auf eine verminderte genetische Quantifizierung in dieser Region hinweist.
4 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Gerüstanalyse von DNA58125 (Cardiotrophin-1) am Lungentumor-Panel 2. Das Balkendiagramm ist wie in 3 allgemein beschrieben angeordnet.
5 ist eine zweidimensionale Balkendiagramm-Zusammenfassung der Ergebnisse für DNA58125 aus 3 und 4. Es sind die für jede der getesteten Lungentumorlinien bestimmten mittleren ΔCt-Werte dargestellt.
6 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Gerüstanalyse der DNA58125 (Cardiotrophin-1) am Dickdarmtumor-Panel 1. Die getesteten Dickdarm-Primärtumoren sind entlang der x-Achse dargestellt; die Markersonden und DNA58125 sind entlang der z-Achse dargestellt; und die relative genetische Amplifikation im Bereich jeder dieser Markersonden ist als Balken an der y-Achse dargestellt. Die Balken ragen für relativ zur DNA58125 im gesunden Gewebe amplifizierte genetische Regionen über die Nullpunktsebene hinaus oder ragen unter die Nullpunktsebene hinaus, was auf eine verminderte genetische Quantifizierung in dieser Region hinweist.
7 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Gerüstanalyse der DNA58125 (Cardiotrophin-1) am Dickdarmtumor-Panel 2. Das Balkendiagramm ist wie in 6 allgemein beschrieben angeordnet.
8 ist eine zweidimensionale Balkendiagramm-Zusammenfassung der Ergebnisse für DNA58125 aus 6 und 7. Es sind die für jeden der getesteten Dickdarmtumoren bestimmten mittleren ΔCt-Werte dargestellt.
9 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Epizentrum-Analyse der DNA58125 (Cardiotrophin-1) am Lungentumor-Panel 1. Das Balkendiagramm ist wie in 3 allgemein beschrieben angeordnet.
10 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Epizentrum-Analyse der DNA58125 (CT-1) am Lungentumor-Panel 2. Das Balkendiagramm ist wie in 3 allgemein beschrieben angeordnet.
11 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Epizentrum-Analyse der DNA58125 (CT-1) am Dickdarmtumor-Panel 1. Das Balkendiagramm ist wie in 6 allgemein beschrieben angeordnet.
12 ist eine dreidimensionale Darstellung der Ergebnisse einer Epizentrum-Analyse der DNA58125 (CT-1) am Lungentumor-Panel 2. Das Balkendiagramm ist wie in 6 allgemein beschrieben angeordnet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die Ausdrücke „Genamplifikation" und „Genduplikation" werden wechselseitig verwendet und beziehen sich auf einen Prozess, durch den Vielfachkopien eines Gens oder Genfragments in einer bestimmten Zelle oder Zelllinie gebildet werden. Die duplizierte Region (ein Abschnitt amplifizierter DNA) wird häufig als „Amplicon" bezeichnet. Üblicherweise erhöht die Menge an produzierter Messenger-RNA (mRNA), d.h. das Ausmaß der Genexpression ebenfalls im Verhältnis zur Anzahl der hergestellten Kopien des speziellen exprimierten Gens.
„Tumor" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jegliche(s) neoplastische Zellwachstum und Vermehrung, ob sie bös- oder gutartig ist, und auf alle präkanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe.
Die Begriffe „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unkontrolliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Dickdarmkarzinom, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Magen-Darm-Karzinom, Pankreaskarzinom, Glioblastom, Zervixkarzinom, Einerstockkarzinom, Leberkarzinom, Blasenkarzinom, Hepatom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkarzinom, Leberkarzinom, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkarzinom und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
„Behandlung" ist ein Eingriff, der mit der Absicht durchgeführt wird, die Entwicklung der Pathologie einer Störung zu verhindern oder diese zu verändern. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" sowohl auf therapeutische Behandlung, als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, welche die Störung bereits aufweisen sowie jene, bei denen die Störung zu verhindern ist. Bei der Tumor-(z.B. Krebs-)Behandlung kann ein therapeutisches Mittel die Pathologie von Tumorzellen direkt vermindern oder kann die Tumorzellen empfänglicher für eine Behandlung mit anderen therapeutischen Mitteln, z.B. Bestrahlung und/oder Chemotherapie machen.
Die „Pathologie" von Krebs umfasst alle Phänomene, welche die Gesundheit des Patienten beeinträchtigen. Dies umfasst ohne Einschränkung abnormales oder unkontrollierbares Wachstum, Metastase, Störung der normalen Funktion von Nachbarzellen, Freisetzung von Cytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in abnormalen Ausmaßen, Unterdrückung oder Verschlimmerung entzündlicher oder immunologischer Reaktionen usw.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere, und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
Hierin verwendete „Träger" umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die/das damit exponierte Zelle oder Säugetier bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Verabreichung „in Kombination mit" bezieht sich wie hierin verwendet auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck beabsichtigt die Umfassung von radioaktiven Iso topen (z.B. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutischen Mitteln und Toxinen, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine, die aus Bakterien, Pilzen oder Tieren stammen, oder Fragmente davon.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine bei der Behandlung von Krebs zweckdienliche Verbindung. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thioetepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosamid, Mitotoxin C, Mitoxantron, Vincistrin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Loste. Ebenfalls in dieser Definition umfasst sind hormonale Mittel, deren Wirkung die Hormonwirkung auf Tumoren reguliert oder hemmt, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere einer Krebszelle hemmt, die ein beliebiges der hierin identifizierten Gene entweder in vitro oder in vivo überexprimiert. Folglich ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil an Zellen, die derartige Gene in der S-Phase des Zellzyklus überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen Mittel, die das Fortschreiten des Zellzyklus (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist) blockiert, wie z.B. Mittel, die G1-Arretierung und M-Phasen-Arretierung auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen Vincas (Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Hemmstoffe, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, welche die G1 arretieren, quellen auch in die S-Phasen-Arretierung über, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und ara-C. Weitere Angaben finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasmic drugs" von Murakami et al., WB Saunders, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum. Der vollständige chemische Name von Doxorubicin lautet (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxy-α-L-lyxohexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacendion.
Der Ausdruck „Cytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Mediatoren wirken. Beispiele derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Unter den Cytokinen mit umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathyroidhormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH); thyreotropes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH); Leberwachs tumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müller-verhindernde Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenwachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; insulinartiger Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); knochenbildende Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulocyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-1α; IL-2; IL-3; IL-4; IL-4; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-11; IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie z.B. TNF-α oder TNF-β; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Entsprechungen der Nativsequenz-Cytokine.
Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck „CT-1"-Polypeptid verwendet, um sich auf ein Polypeptid zu beziehen, das ein Nativsequenz-Polypeptid mit derselben Sequenz wie ein entsprechendes, aus der Natur stammendes CT-1-Polypeptid umfasst, oder Fragmente derartiger Nativsequenz-Polypeptide. Derartige Nativsequenz-CT-1-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können zusammen mit den jeweiligen Fragmenten durch rekombinante und/oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck umfasst ausdrücklich natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich auftretende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des CT-1-Polypeptids. In einer der Ausführungsformen der Erfindung ist das Nativsequenz-CT-1 eine native Präsequenz voller Länge oder eine reife Form eines CT-1-Polypeptids, wie sie in 1 (Seq.-ID Nr. 3) dargestellt ist. Fragmente der jeweiligen nativen Polypeptide hierein umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Polypeptidvarianten, aus denen die native N-terminale Signalsequenz vollständig oder teilweise entfernt oder durch eine andere Sequenz ersetzt worden ist, und extrazelluläre Domänen der jeweiligen nativen Sequenzen un abhängig davon, ob derartige trunkierte (sekretierte) Formen in der Natur vorkommen oder nicht.
Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül, das für ein CT-1-Polypeptid kodiert, ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der für CT-1 kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes, für CT-1 kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt nicht in der Form oder in dem Milieu vor, in der/dem es sich in der Natur findet. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher von dem für CT-1 kodierenden Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes, für ein CT-1-Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül Moleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich CT-1 exprimieren, wo sich das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einem anderen chromosomalen Ort als dem natürlicher Zellen befindet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kotrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Polypeptids beteiligt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, das die Translation erleichtert wird. Die Bindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht vorkom men, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist von einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung leicht bestimmbar und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für die korrekte Ausrichtung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Renaturierungsfähigkeit denaturierter DNA ab, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorliegen. Je höher der Grad an gewünschter Homologie zwischen Sonde und hybridisierbarer Sequenz, desto höher die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Daraus folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und zur Erläuterung von Stringenz und Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
Hierin definierte „stringente Bedingungen" oder „hochstringente Bedingungen" können durch jene gekennzeichnet sein, die: (1) eine niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen einsetzen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel einsetzen, wie z.B. Formamid, beispielsweise 50 (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42° mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SCC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C einsetzen, gefolgt von einem hochstringenten Waschvorgang, bestehend aus EDTA enthaltendem 0,1 × SCC bei 55°C.
„Mäßig stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989) festgelegt werden und umfassen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein Beispiel mäßig stringenter Bedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung bestehend aus: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Der geübte Fachmann wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. einzustellen sind, wie sie notwendig sind, um mit Einflussfaktoren, wie z.B. Sondenlänge und dergleichen im Einklang zu stehen.
Der Ausdruck „Epitop-markiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das ein an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes CT-1-Polypeptid umfasst. Das Marker-Polypeptid hat genügend Reste um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, jedoch kurz genug ist, so das es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Marker-Polypeptid ist außerdem vorzugsweise ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste auf (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
„Aktiv" oder „Aktivität" im Zusammenhang mit Molekülen, die auf Basis der CT-1-Polypeptide (oder ihrer kodierenden Sequenzen) identifiziert wurden, bezieht sich auf Polypeptide (z.B. Antikörper) oder organische oder anorganische kleine Moleküle, Peptide usw., welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten/Eigenschaften eines nativen oder natürlich auftretenden CT-1 beibehalten.
„Biologische Aktivität" im Zusammenhang mit einem Antikörper oder anderen Molekül, das mittels hierin offenbarten Screening-Tests identifiziert werden kann (z.B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid usw.), wird verwendet, um sich auf die Fähigkeit derartiger Moleküle zu beziehen, an die von den hierin identifizierten amplifizierten Genen kodierten Polypeptide zu binden oder zu komplexieren, oder anderweitig die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen Zellproteinen zu stören. Eine bevorzugte biologische Aktivität ist die Wachstumshemmung einer Ziel-Tumorzelle. Eine weitere bevorzugte biologische Aktivität ist zytotoxische Aktivität, die den Tod der Ziel-Tumorzelle bewirkt.
Unter dem Ausdruck „immunologische Eigenschaft" wird die immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop eines CT-1-Polypeptids verstanden.
„Immunologische Kreuzreaktivität" bedeutet bei Verwendung hierin, dass das Kandidat-Polypeptid fähig ist, die qualitative biologische Aktivität eines CT-1-Polypeptids, das diese Aktivität aufweist, mit polyklonalen, gegen das bekannte aktive CT-1-Polypeptid hergestellten Antiseren kompetitiv zu hemmen. Derartige Antiseren werden auf herkömmliche Weise durch subkutane Injektion von beispielsweise Ziegen oder Kaninchen mit dem bekannten Analogon in komplettem Freund'schem Adjuvans, gefolgt von intraperitonealer oder subkutaner Injektion in inkomplettem Freund'schem Adjuvans hergestellt. Die immunologische Kreuzreaktivität ist vorzugsweise „spezifisch", was bedeutet, dass die Bindungsaffinität des identifizierten, immunologisch kreuzreaktiven Moleküls (z.B. Antikörpers) zum entsprechenden CT-1-Polypeptid signifikant höher (vorzugsweise zumindest ungefähr 2-mal, bevorzugter zumindest ungefähr 4-mal, noch bevorzugter zumindest ungefähr 8-mal, insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 8-mal höher) ist als die Bindungsaffinität dieses Moleküls zu einem beliebigen anderen bekannten nativen Polypeptid.
Der Ausdruck „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst jegliches Molekül, das teilweise oder vollständig eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten nativen CT-1-Polypeptids blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird der Ausdruck „Agonist" im weitesten Sinne verwendet und umfasst jegli ches Molekül, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten CT-1-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonist- und Antagonist-Moleküle umfassen speziell Agonist- oder Antagonist-Antikörper oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten nativer Polypeptide, Peptide, kleine organische Moleküle usw.
Ein „kleines Molekül" ist hierin mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton definiert.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, welche dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Während Antikörper eine Bindungsspezifität an ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper, als auch antikörperartige Moleküle, denen die Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in niedrigen Ausmaßen vom Lymphsystem produziert und in erhöhten Ausmaßen von Myelomen. Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst ohne Einschränkung intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl an Disulfidbindungen unter den Schwerketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen Zwischenketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H), gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen auf. Jede Leichtkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist an der ersten konstanten Domäne der Schwerkette ausgerichtet und die variable Domäne der Leichtkette ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet.
Von bestimmten Aminosäureresten wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der Leicht- und Schwerkette bilden.
Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte Abschnitte der variablen Domäne sich unter Antikörpern stark unterscheiden und bei der Bindung und für die Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein jeweiliges Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten verdichtet, die Complementary-determining-regions (CDRs) oder hypervariable Regionen genannt werden, und zwar in den variablen Domänen sowohl der Leichtkette, als auch der Schwerkette. Die stärker konservierten Abschnitte variabler Domänen werden Gerüst (FR) genannt. Die variablen Domänen nativer Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattkonfiguration einnehmen, die durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen nahe beieinander gehalten und tragen mit den CDRs der anderen Kette zur Ausbildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., NIH-Veröffentlichung Nr. 91-3242, Bd. 1, Seiten 647–669 (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. Beteiligung des Antikörpers an antikörperabhängiger Zelltoxizität.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die antigenbindende oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiel von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Dibodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
Der Papain-Verdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, wobei beide eine einzelne Anti genbindungsstelle aufweisen, und ein verbleibendes „Fc"-Fragment, dessen Name seien Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Die Pepsin-Behandlung liefert ein F(ab')₂-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor zur Vernetzung von Antigen fähig ist.
„Fv" ist das Minimal-Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Antigenbindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne Wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für ein Antigen spezifische CDRs umfasst) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste an den Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich zweier Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cystein-Rest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobuline) aus jeglicher Wirbeltierspezies können einer von zwei klar unterscheidbaren Typen zugeordnet werden, die auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen Kappa (κ) und Lambda (λ) genannt werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Domänen der Schwerketten, die den verschiedenen Immunglobulinklassen entsprechen, werden α, δ, ε, γ bzw. μ genannt. Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Immunglobulinklassen sind wohlbekannt.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt wird, d.h., die einzelnen Antikörper, welche die Population umfassten, sind identisch mit Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Außerdem richtet sich jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen unterschiedliche Antigene (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante am Antigen. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft, da sie nicht durch andere Immunglobuline verunreinigt von der Hybridomkultur synthetisiert werden. Der Modifikator „monoklonal" kennzeichnet den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wird, und ist nicht dahingehend auszulegen, dass die Herstellung des Antikörpers irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahren hergestellt werden oder können mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567). Die „monoklonalen Antikörper" können beispielsweise auch aus Phagen-Antikörper-Bibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer bestimmten Spezies herleiten oder einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer anderen Spezies herleiten oder einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, sowie Fragmente derartiger Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z.B. Maus) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen Immunglobulin hergeleitete Minimalsequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste aus einer CDR des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-FR-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird gegebenenfalls auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen PRIMATIZED^TM-Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers aus einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makak-Affen mit dem Antigen von Interesse hergestellt wurde.
„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Antikörperdomänen, worin diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H. und V_L-Domänen, was es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenberg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) umfassen, die mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) verbunden ist. Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Ketten zu erlauben, sind die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161; und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993) beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer der identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht-proteinische Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) zu mehr als 95 Gewichtsprozent Antikörper, wie ermittelt mittels Lowry-Verfahren, und insbesondere bevorzugt zu mehr als 99 Gewichtsprozent, (2) in einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zu erlangen oder (3) zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörper nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isolierter Antikörper durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Marker" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen „markierten" Antikörper zu erzeugen. Der Marker kann selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder kann im Falle eines enzymatischen Markers eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren, die nachweisbar ist.
Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierin vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus Glas (z.B. Controlled-poreglass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet werden. In manchen Ausführungsformen kann die Festphase in Abhängigkeit vom Zusammenhang den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst außerdem eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z.B. jene im US-Patent Nr. 4.275.149 beschriebenen.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das aus verschiedenen Lipidtypen, Phospholipiden und/oder Tensiden zusammengesetzt ist, das zur Abgabe eines Medikaments (wie z.B. eines CT-1-Polypeptids oder eines Antikörpers dagegen und, gegebenenfalls, eines therapeutischen Mittels) an ein Säugetier zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen in einer Doppelschicht angeordnet.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (ein „Adhäsin") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombiniert. Strukturell umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die nicht jene der Antigenerkennungs- und Bindungsstelle eines Antikörpers ist (d.h., „heterolog" ist), mit der Sequenz einer konstanten Immunglobulindomäne. Der Adhäsin-Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder Liganden umfasst. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne im Immunoadhäsin kann aus jedem Immunglobulin, wie z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3, oder IgG-4-Subtypen, IgG (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erlangt werden.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
1. Herstellung der CT-1-Polypeptide
Es werden Verfahren zur Verwendung der für CT-1 kodierenden DNA58125 zur Herstellung von Verbindungen offenbart, die neoplastisches Wachstum hemmen, sowie zur Herstellung von Screening-Verfahren zur Identifizierung wachstumshemmender Verbindungen (z.B. Tumorverbindungen). Insbesondere cDNAs, die für bestimmte CT-1-Polypeptide kodieren. Der Einfachheit halber werden in der vorliegenden Patentbeschreibung die von der als „DNA58125" bezeichneten Nucleinsäure kodierten Proteine sowie alle weiteren nativen Homologe und Varianten, die in der vorangegangenen Definition des CT-1-Polypeptids umfasst sind, unabhängig von ihrem Ursprung oder ihrer Expressionsweise als „CT-1"-Polypeptid bezeichnet.
Die untenstehende Beschreibung bezieht sich in erster Linie of die Produktion von CT-1 Polypeptiden durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor, der die für CT-1 kodierende Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert sind. Es ist selbstverständlich vorgesehen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, zur Herstellung von CT-1-Polypeptiden eingesetzt werden können. Beispielsweise können die CT-1-Polypeptidsequenz oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)). Die In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Techniken oder mittels Automation durchgeführt werden. Die automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosynthesis Peptid Synthesizer (Foster City, CA) unter Verwendung der Herstelleranleitungen erzielt werden. Verschiedene Abschnitte des CT-1-Polypeptids können unter Anwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren getrennt oder kombiniert chemisch synthetisiert werden, um das CT-1 voller Länge herzustellen.
i. Synthese oder Isolierung von DNA, die für CT-1-Polypeptid kodiert
Für CT-1, Homologe, Varianten oder Abschnitte davon kodierende DNA kann mittels direkter DNA-Synthese unter Verwendung standardmäßiger Nucleinsäure-Synthesetechniken hergestellt werden (Siehe z.B. M. J. Gait, Oligonucleotid Synthesis, IRL Press, Oxford (1984)). Die In-vitro-DNA-Synthese kann unter Verwendung manueller Techniken oder durch Automation durchgeführt werden. Die automatisierte Oligonucleotidsynthese kann beispielsweise unter Verwendung von Standardtechniken erzielt werden. Verschiedene Abschnitte der für CT-1 kodierenden Nucleinsäuresequenz können unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren getrennt oder kombiniert chemisch synthetisiert werden, um die für CT-1 kodierende Sequenz voller Länge herzustellen.
Alternativ dazu kann für CT-1 kodierende DNA aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es die CT-1-mRNA aufweist und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Demgemäß kann menschliche CT-1-DNA in geeigneter Weise aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wurde, wie es z.B. in den Beispielen beschrieben ist. Das für CT-1 kodierende Gen kann auch aus einer Genombibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese erlangt werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie z.B. Antikörpern gegen das CT-1-Polypeptid oder Oligonucleotide von zumindest ungefähr 20–80 Basen) gescreent werden, die konstruiert wurden, um das Gen von Interesse oder das von ihm kodierte Protein zu identifizieren. Das Screenen der cDNA- oder Genombibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben werden. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für CT-1 kodierenden Gens ist die Verwendung von PCR-Verfahren (Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Die untenstehenden Beispiele beschreiben Techniken für das Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern, wie z.B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz, werden von Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
Bei derartigen Screeningverfahren von Bibliotheken identifizierte Sequenzen können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. Gen-Bank oder privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und verfügbar sind, verglichen und daran angeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder auf Nucleinsäureebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die volle Länge der Sequenz kann durch Sequenzangleichung unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen, wie z.B. ALIGN, DNAstar und INHERIT ermittelt werden, die verschiedene Algorithmen verwenden, um die Homologie zu messen.
Nucleinsäure, die eine kodierende Sequenz aufweist, kann durch Screening gewählter cDNA- oder Genombibliotheken unter Verwendung der abgeleiteten Aminosäure sequenz erhalten werden, die hierin erstmals offenbart ist und, falls notwendig, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind.
ii. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit hierin für die CT-1-Produktion beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert worden sind. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen können vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991) und Sambrook et al., s.o.
Verfahren der Transfizierung sind dem gewöhnlichen Fachmann bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. In Abhängigkeit vom verwendeten Wirt wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung setzt wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben Calciumchlorid ein oder die Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al. Gene 23, 315 (1983) und in WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphatverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978) eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetier-Wirtszell-System-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Ver fahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977) und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979) durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. mittels Kerninjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyorthinin ebenfalls verwendet werden. Für verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990) und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der DNA in die Vektoren hierin umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E. coli K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1767 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für CT-1-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem CT-1 stammen von mehrzelligen Organismen. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamstereierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Speziellere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (293 oder für Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamstereierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungezellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Wahl der geeigneten Wirtszelle vom Fachmann durchführbar ist.
iii. Wahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die für CT-1 kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) kann zur Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Vielzahl an Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf eine oder mehrere der folgenden Komponenten: eine Signalsequenz, ein Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, ein Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein, die dem geübten Fachmann bekannt sind.
Das CT-1-Polypeptid kann rekombinant nicht nur direkt produziert werden, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid sein kann, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der für CT-1 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die aus der aus Alkalische Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabiles Enterotoxin II-Leader bestehenden Gruppe gewählt sein kann. Für die Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist) oder Saure Phosphatase-Leader, der C. albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der am 15. November 1990 veröffentlichten WO 90/13646 beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie z.B. Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmid-Replikationsstartpunkt ist für Hefe geeignet und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zur Klonierung in Säugetierzellen zweckdienlich.
Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) wichtige Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen ist jenes, das die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die zur Aufnahme der für CT-1 kodierenden Nucleinsäure kompetent sind, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defiziente CHO-Linie, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980) beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorliegende trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für CT-1 kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acid Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden auch eine operabel an die für CT-1 kodierende DNA gebundene Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz enthalten.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Systeme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte abbauende Enzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind in EP 73.657 weitergehend beschrieben.
Die CT-1-Transkription aus Vektoren in Säugetierzellen wird beispielsweise von Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren, wie Polyomavirus, Geflügelpockevirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus, ein Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor und aus Hitzeschockpromotoren unter der Voraussetzung erlangt werden, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer für ein CT-1-Polypeptid kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, die üblicherweise 10 bis 300 bp aufweisen, die an einem Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Es sind zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus eukaryotischer Zellen verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Stelle des Replikationsstartpunkts) bp 100–270), den frühen Cytomegalovirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der für CT-1 kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Derartige Sequenzen sind allgemein vom 5'-Ende und gelegentlich vom 3'-Ende untranslatierter Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für CT-1 kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung der Synthese von CT-1 in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
iv: Detektieren der Genamplifikation/Genexpression
Die Genamplifikation und/oder Genexpression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe erkennen können. Die Antikörper können ihrerseits markiert sein und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Duplex-Bildung an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenen Antikörper detektiert werden kann.
Eine Genexpression kann alternativ dazu mittels immunologischer Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunohistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für immunohistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein natives CT-1-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine an CT-1-DNA fusionierte exogene Sequenz hergestellt werden, die für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert.
v. Polypeptid-Reinigung
Formen von CT-1-Polypeptiden können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Falls es membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Bei der Expression von CT-1 eingesetzte Zellen können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z.B. Einfrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanisches Aufbrechen oder Zelllyse-Mittel aufgebrochen werden.
Es kann erwünscht sein, CT-1 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren: mittels Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silikagel oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie z.B. IgG; und metallchelatierende Säulen, um epitopmarkierte Formen der CT-1-Polypeptide zu binden. Es können verschiedene Proteinreinigungsverfahren eingesetzt werden und derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice; Springer-Verlag, New York (1982) beschrieben. Der/die gewählte(n) Reinigungsschritt(e) wird/werden beispielsweise vom Charakter des verwendeten Produktionsverfahrens und dem jeweiligen hergestellten CT-1-Polypeptid abhängen.
2. Amplifikation von Genen, die für die CT-1-Polypeptide in Tumorgewebe und Zelllinien kodieren
Die vorliegenden Erfindung basiert auf der Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in bestimmten Krebszellen amplifiziert werden.
Das Genom prokaryotischer und eukaryotischer Organismen ist zwei anscheinend widersprechenden Erfordernissen unterworfen. Eine davon ist die Erhaltung und Vermehrung von DNA als genetische Information in seiner ursprünglichen Form, um eine stabile Vererbung über mehrere Generationen zu gewährleisten. Andererseits müssen Zellen und Organismen in der Lage sein, sich nachhaltigen Umweltveränderungen anzupassen. Die Adaptierungsmechanismen können qualitative oder quantitative Modifizierungen des genetischen Materials umfassen. Qualitative Modifizierungen umfassen DNA-Mutationen, bei denen kodierende Sequenzen verändert werden, was in einem strukturell und/oder funktionell andersartigen Protein resultiert. Genamplifikation ist eine quantitative Veränderung, wodurch sich die tatsächliche Anzahl einer vollständigen kodierenden Sequenz, d.h., ein Gen, erhöht, was zu einer erhöhten Anzahl verfügbarer Template für die Transkription, einer erhöhten Anzahl translatierbarer Transkripte und letztlich zu einer erhöhten Menge des vom amplifizierten Gen kodierten Proteins führt.
Das Phänomen der Genamplifikation und dessen zugrunde liegenden Mechanismen sind in vitro in mehreren prokaryotischen und eukaryotischen Kultursystemen untersucht worden. Das am besten charakterisierte Beispiel der Genamplifikation umfasst die Kultur eukaryotischer Zellen in Medium, das variable Konzentrationen des zytotoxischen Medikaments Methotrexat (MTX) enthält. MTX ist ein Folsäure-Analogon und stört die DNA-Synthese durch Blockieren des Enzyms Dihydrofolatreduktase (DHFL). Während der anfänglichen Exposition mit niedrigen Konzentrationen von MTX sterben die meisten Zellen (> 99,9%). Eine kleine Anzahl von Zellen überlebt und ist fähig, in ansteigenden MTX-Konzentrationen zu wachsen, indem sie große Mengen an DHFR-RNA und Protein produziert. Die Basis dieser Überproduktion ist die Amplifikation des einzelnen DHFR-Gens. Die zusätzlichen Kopien des Gens finden sich als extrachromosomale Kopien in Form kleiner, überzähliger Chromosomen (Minimalchromosomen) oder als integrierte chromosomale Kopien.
Die Genamplifikation wird am häufigsten bei der Entwicklung von Resistenz gegen zytotoxische Medikamente (Antibiotika für Bakterien und chemotherapeutische Mittel für eukaryotische Zellen) und neoplastischer Transformation angetroffen. Die Trans formation einer eukaryotischen Zelle als spontanes Ereignis oder aufgrund viralen oder chemischen/umweltbedingten Insults ist typischerweise mit Veränderungen des genetischen Materials dieser Zelle verbunden. Eine der häufigsten genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Malignitäten beobachtet wird, sind Mutationen des p53-Proteins. p53 kontrolliert den Übergang von Zellen von der stationären (G1-) in die replikative (S-) Phase des Zellzyklus und verhindert diesen Übergang in Gegenwart einer DNA-Schädigung. In anderen Worten ist eine der Hauptkonsequenzen deaktivierender p53-Mutationen die Anhäufung und Vermehrung der DNA-Schädigung, d.h., genetische Veränderungen. Übliche Typen genetischer Veränderungen in neoplastischen Zellen sind, zusätzlich zu Punktmutationen, Amplifikationen und starke strukturelle Veränderungen, wie z.B. Translokationen.
Die Amplifikation von DNA-Sequenzen kann eine spezifische funktionelle Voraussetzung anzeigen, wie sie am experimentellen DHFR-System illustriert wird. Daher weist die Amplifikation gewisser Onkogene bei Malignitäten auf eine ursächliche Rolle dieser Gene beim Vorgang der malignen Transformation und Erhaltung des transformierten Phänotyps hin. Diese Hypothese ist in neulichen Studien bestätigt worden. Beispielsweise hat sich erwiesen, dass das bcl-2-Protein in gewissen Typen des Non-Hodgkin-Lymphoms amplifiziert wird. Dieses Protein hemmt die Apoptose und führt zur fortschreitenden Anhäufung neoplastischer Zellen. Es hat sich gezeigt, dass Elemente der Genfamilie von Wachstumsfaktorrezeptoren in verschiedenen Krebstypen amplifiziert werden, was darauf hinweist, dass die Überexpression dieser Rezeptoren neoplastische Zellen weniger anfällig für limitierende Mengen an verfügbarem Wachstumsfaktor machen könnten. Beispiele umfassen die Amplifikation des Androgen-Rezeptors bei wiederkehrendem Prostatakarzinom während der Androgenmangeltherapie und die Amplifikation des Wachstumsfaktorrezeptorhomologs ERB2 bei Brustkarzinom. Schließlich können Gene, die an der intrazellulären Signalisierung und Kontrolle der Zellzyklusabfolge beteiligt sind, während der malignen Transformation eine Amplifikation erfahren. Dies wird durch die Amplifikation der bcl-I- und ras-Gene in verschiedenen Epithel- und Lymphoid-Neoplasmen illustriert.
Diese früheren Studien illustrieren die Durchführbarkeit der Identifizierung amplifizierter DNA-Sequenzen bei Neoplasmen, da dieser Ansatz Gene identifizieren kann, die für die maligne Transformation wichtig sind. Der Fall von ERB2 demonstriert außerdem die Durchführbarkeit vom therapeutischen Standpunkt, da transformierende Proteine neue und spezifische Ziele für die Tumortherapie darstellen könnten.
Es können mehrere verschiedene Techniken verwendet werden, um amplifizierte genomische Sequenzen nachzuweisen. Die klassische zytogenetische Analyse von Chromosomenbereichen, die aus Krebszellen hergestellt wurden, ist zur Identifizierung starker struktureller Veränderungen, wie z.B. Translokationen, Deletionen und Inversionen angemessen. Amplifizierte Genomregionen können nur dann sichtbar gemacht werden, wenn sie große Regionen mit hoher Kopieanzahl umfassen oder als extrachromosomales Material vorliegen. Obwohl die Zytogenetik die erste Technik war, um die folgerichtige Verbindung spezifischer chromosomaler Veränderungen mit bestimmten Neoplasmen nachzuweisen, ist sie für die Identifizierung und Isolierung handhabbarer DNA-Sequenzen ungeeignet. Die vor kurzem entwickelte Technik der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) hat das verbreitete Phänomen der genomischen Amplifikation in Neoplasmen illustriert. Tumor- und normale DNA werden gleichzeitig auf Metaphasen normaler Zellen hybridisiert und das gesamte Genom kann mittels Bildanalyse auf DNA-Sequenzen gescreent werden, die im Tumor mit erhöhter Häufigkeit vorliegen. (WO 93/18.186; Gray et al., Radiation Res. 137, 275–289 (1994)). Als Screeningverfahren hat diese Analysenart eine große Anzahl an wiederkehrenden Amplicons (ein Abschnitt amplifizierter DNA) in einer Vielzahl von menschlichen Neoplasmen offenbart. Obgleich CGH bei der Identifizierung amplifizierter DNA-Abschnitte empfindlicher ist als die klassische zytogenetische Analyse, erlaubt sie keine schnelle Identifizierung und Isolierung kodierender Sequenzen innerhalb des Amplicons durch standardmäßige molekulare genetische Techniken.
Die empfindlichsten Verfahren zur Detektion einer Genamplifikation sind Tests auf Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese Tests setzen sehr beringe Mengen an Tumor-DNA als Ausgangsmaterial ein, sind ausgesprochen empfindlich, stel len DNA bereit, die für eine weitere Analyse, wie z.B. Sequenzierung zugänglich ist und sind für die High-throughput-Analyse geeignet.
Die oben erwähnten Tests schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern werden häufig in Kombination verwendet, um Amplifikationen in Neoplasmen zu identifizieren. Während zytogenetische Analyse und CGH Screeningverfahren darstellen, um das gesamte Genom auf amplifizierte Regionen zu untersuchen, sind auf PCR basierende Tests für die endgültige Identifizierung kodierenden Sequenzen, d.h., Genen in amplifizierten Regionen höchst geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind derartige Gene mittels quantitativer PCR (S. Gelmini et al., Clin. Chem. 43, 752 (1997)), durch Vergleich von DNA aus einer Vielzahl von Primärtumoren, einschließlich Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Prostata-, Hirn-, Nieren-, Pankreas-, Milz-, Thymus-, Hoden-, Eierstock-, Uterus- usw. Tumoren. oder Tumorzelllinien, mit gepoolter DNA aus gesunden Spendern identifiziert worden.
Menschliche Lungenkarzinom-Zelllinien umfassen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774) und SW900 (SRCC775), die alle von ATCC erhältlich sind. Menschliche Primärlungentumorzellen stammen üblicherweise aus Adenokarzinomen, Plattenepithelkarzinomen, großzelligen Karzinomen, nicht kleinzelligen Karzinomen, kleinzelligen Karzinomen und bronchoalveolaren Karzinomen und umfassen beispielsweise SRCC724 (Plattenepithelkarzinom, abgekürzt als „SqCCa"), SRCC725 (nicht kleinzelliges Karzinom, abgekürzt als „NSCCa"), SRCC726 (Adenokarzinom, abgekürzt als „AdenoCa"), SRCC727 (Adenokarzinom), SRCC728 (Plattenepithelkarzinom), SRCC729 (Adenokarzinom), SRCC730 (Adeno/Plattenepithelkarzinom), SRCC731 (Adenokarzinom), SRCC732 (Plattenepithelkarzinom), SRCC733 (adenokarzinom), SRCC734 (Adenokarzinom), SRCC735 (bronchoalveolares Karzinom, abgekürzt als „BAC"), SRCC736 (Plattenepithelkarzinom), SRCC738 (Plattenepithelkarzinom), SRCC739 (Plattenepithelkarzinom). SRCC740 (Plattenepithelkarzinom), SRCC740 (Lungenzellenkarzinom, abgekürzt als „LCCa").
Dickdarmkrebszelllinien umfassen beispielsweise die ATCC-Zelllinien SW480 (Adenokarzinom, SRCC776), SW620 (Lymphknotenmetastase des Dickdarm-Adenokarzinoms, SRCC777), COLO320 (Adenokarzinom, SRCC778), HT29 (Adenokarzinom, SRCC779), HM7 (Karzinom, SRCC780), CaWiDr (Adenokarzinom, srcc781), HCT116 (Karzinom, SRCC782), SKCO1 (Adenokarzinom, SRCC783), SW403 (Adenokarzinom, SRCC784), LS174T (Karzinom, SRCC785) und HM7 (eine Variante der ATCC-Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinie LS174T, die hohe Mengen Mucin produziert, erhalten von Dr. Robert Warren, UCSF). Dickdarm-Primärtumoren umfassen Dickdarm-Adenokarzinome, die mit ColT2 (SRCC742), ColT3 (SRCC743), ColT8 (SRCC744), ColT10 (SRCC745), ColT12 (SRCC746), ColT14 (SRCC747), ColT15 (SRCC748), ColT17 (SRCC750), ColT1 (SRCC751), ColT4 (SRCC752), ColT5 (SRCC753), ColT6 (SRCC754), ColT7 (SRCC755), ColT9 (SRCC756), ColT11 (SRCC757), ColT18 (SRCC758) und DcR3, BACrev, BACfwd, T160 und T159 bezeichnet werden.
Menschliche Brustkarzinom-Zelllinien umfassen beispielsweise HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766), SKBR3 (SRCC767).
3. Gewebeverteilung
Die Ergebnisse der Genamplifikationsstests hierin können durch weitere Untersuchungen, wie z.B. durch Ermittlung der mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Geweben verifiziert werden.
Wie vorhin angemerkt, kann die Genamplifikation und/oder Genexpression in verschiedenen Geweben durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen gemessen werden. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt wer den, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe erkennen können.
Die Genexpression in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu mittels immunologischer Verfahren, wie z.B. immunohistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für immunohistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienlichen Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-CT-1-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz, die an CT-1-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert, hergestellt werden. Allgemeine Techniken zur Erzeugung von Antikörpern und spezielle Protokolle für Northern-Blotting und In-situ-Hybridisierung werden hierin unten bereitgestellt.
4. Chromosomkartierung
Wenn die Amplifikation eines gegebenen Gens funktionell relevant ist, dann sollte dieses Gen stärker amplifiziert werden als benachbarte genomische Regionen, die für das Überleben des Tumors nicht wichtig sind. Um dies zu testen, kann das Gen gegen ein bestimmtes Chromosom, z.B. durch Bestrahlungs-Hybrid-Analyse kartiert werden. Das Amplifikationsausmaß wird dann an der identifizierten Stelle ermittelt, sowie an benachbarten genomischen Regionen. Die selektive oder bevorzugte Amplifikation an der genomischen Region, an die das Gen kartiert worden ist, steht im Einklang mit der Möglichkeit, dass die beobachtete Genamplifikation das Wachstum oder Überleben des Tumors fördert. Die Chromosomkartierung umfasst Gerüst- sowie Epizentrum-Kartierung. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. Stewart et al., Genome Research 7, 422–433 (1997).
5. Antikörperbindungsuntersuchungen
Die Ergebnisse der Genamplifikationsuntersuchung können mittels Antikörperbindungsuntersuchungen weiter verifiziert werden, wobei die Fähigkeit von Anti-CT-1-Antikörpern getestet wird, die Wirkung der CT-1-Polypeptide an Tumor-(Krebs-)Zellen zu hemmen. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper, deren Herstellung hierin unten beschrieben wird.
Antikörperbindungsuntersuchungen können in einem beliebigen bekannten Testverfahren durchgeführt werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte und indirekte Sandwich-Tests und Immunopräzipitationstests. Zola, monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an Zielprotein (kodiert von einem in einer Tumorzelle amplifizierten Gen) in der Testprobe ist umgekehrt proportional der Menge an Standard, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge an gebundenem Standard zu erleichtern, werden die Antikörper vor oder nach der Konkurrenzreaktion vorzugsweise insolubilisiert, so dass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht vom ungebunden verbliebenen Standard und Analyten getrennt werden können.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei beide fähig sind, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder an ein anderes immunogenes Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwich-Test wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwich-Tests) oder kann unter Verwendung eines Anti- Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Beispielsweise ist einer der Sandwich-Testtypen ein ELISA-Test, wobei in diesem Fall die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
Für die Immunohistochemie kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein oder kann beispielsweise in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel, wie z.B. Formalin fixiert sein.
6. Auf Zellen basierende Tumortests
Auf Zellen basierende Tests und Tiermodelle für Tumoren (z.B. Karzinome) können verwendet werden, um die Befunde des Genamplifikationstests zu verifizieren und die Beziehung zwischen den hierin identifizierten Genen und der Entwicklung und Pathogenese des neoplastischen Zellwachstums besser zu verstehen. Die Rolle von hierin identifizierten Genprodukten bei der Entwicklung und Pathologie von Tumoren oder Karzinomen kann getestet werden, indem Primärtumorzellen oder Zelllinien verwendet werden, von denen erkannt worden ist, dass sie die Gene amplifizieren. Derartige Zellen umfassen beispielsweise Brust-, Dickdarm- und Lungenkarzinomzellen und Zelllinien, die oben aufgezählt sind.
In einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, der bekanntermaßen an einem bestimmten Tumor beteiligt ist, mit den cDNAs hierin transfiziert und es wird die Fähigkeit dieser cDNAs analysiert, übermäßiges Wachstum auszulösen, wird analysiert. Geeignete Zellen umfassen beispielsweise stabile Tumorzelllinien, wie z.B. die B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinien, transfiziert mit dem neu-Protooncogen) und ras-transfizierte NIH-3T3-Zellen, die mit dem gewünschten Gen transfiziert und auf tumorartiges Wachstums beobachtet werden können. Derartige transfizierte Zelllinien können dann verwendet werden, um die Fähigkeit von poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörperzusammensetzungen zu testen, das tumorartige Zellwachstum durch Ausüben zytostatischer oder zytotoxischer Aktivität auf das Wachstum transformierter Zellen oder durch Vermitteln von Antikörper-abhängiger Zelltoxizität (ADCC) zu hemmen. Mit den kodierenden Sequenzen der hierin identifizierten Gene transfizierte Zellen können weiter verwendet werden, um Medikament-Kandidaten für die Krebsbehandlung zu identifizieren.
Außerdem können Primärkulturen, die aus Tumoren in transgenen Tieren stammen (wie unten beschrieben), in den auf Zellen basierenden Tests hierin verwendet werden, obgleich stabile Zelllinien bevorzugt sind. Techniken zur Herleitung kontinuierlicher Zelllinien aus transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt (siehe z.B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985)).
7. Tiermodelle
Es kann eine Vielzahl wohlbekannter Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene bei der Entwicklung und Pathogenese von Tumoren besser zu verstehen und die Wirksamkeit von therapeutischen Kandidat-Mitteln, einschließlich Antikörpern und anderen Antagonisten der nativen Polypeptide, einschließlich kleiner Antagonisten-Moleküle zu testen. Der In-vivo-Charakter derartiger Modelle macht diese besonders prognostisch für Reaktionen in menschlichen Patienten. Tiermodelle von Tumoren und Karzinomen (z.B. Brustkarzinom, Dickdarmkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkarzinom) umfassen nicht-rekombinante sowie rekombinante (transgene) Tiere. Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nager-, z.B. Mausmodelle. Derartige Modelle können durch Einführen von Tumorzellen in syngenetische Mäuse unter Verwendung von Standardtechniken, z.B. subkutane Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter die Nierenkapsel oder Orthopin-Implantation erzeugt werden, z.B. in Dickdarmgewebe implantierte Dickdarmkarzinomzellen. (Siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, veröffentlicht am 18. September 1997).
Die wahrscheinlich am häufigsten bei onkologischen Studien verwendete Tierspezies sind immunodefiziente Mäuse und insbesondere Nacktmäuse. Die Beobachtung, dass Nacktmäuse mit Hypo/Aplasie erfolgreich als Wirte für menschliche Tumor-Xenotransplantate agieren können, hat zu ihrer weiten Verbreitung zu diesem Zweck geführt. Das autosomal rezessive nu-Gen ist in eine sehr große Zahl von unterschiedlichen kongenen Stämmen von Nacktmäusen eingeführt worden, beispielsweise in ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII und SJL. Außerdem ist eine breite Vielfalt anderer Tiere, die nicht Nacktmäuse sind, mit vererbten immunologischen Defekten gezüchtet und als Empfänger von Tumor-Xenoimplantaten verwendet worden. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven und B. Winograd (Hrsg.), CRC Press Inc. (1991).
Die in solche Tiere eingeführten Zellen können von bekannten Tumor/Karzinom-Zelllinien stammen, wie z.B. von jeglichen der oben aufgezählten Tumorzelllinien und beispielsweise von der B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinien, transfiziert mit dem neu-Protoonkogen); ras-transfizierten NIH-3T3-Zellen; Caco-2 (ATCC HTB-37); einer mäßig gut differenzierten menschlichen Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinien des Grades II, HAT-29 (ATCC HTB-38); oder von Tumoren und Karzinomen. Proben von Tumor- oder Krebszellen können aus Patienten erhalten werden, die operiert werden, und zwar unter Anwendung von Standardbedingungen, die Einfrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff umfassen (Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689–696 (1983)).
Tumorzellen können mittels einer Vielzahl von Verfahren in Tiere, wie z.B. Nacktmäuse eingeführt werden. Der subkutane (s.c.) Raum eignet sich besonders für die Tumorimplantation. Tumoren können s.c. als massive Blöcke, als Nadelbiopsien durch Verwendung einer Hohlnadel oder als Zellsuspensionen transplantiert werden. Für die Massivblock- oder Hohlnadelimplantation werden Tumorgewebefragmente geeigneter Größe in den subkutanen Raum eingeführt. Zellsuspensionen werden aus Primärtumoren oder stabilen Tumorzelllinien frisch hergestellt und subkutan injiziert. Tumorzelllinien können auch als subdermale Implantate injiziert werden. An dieser Stelle wird das Inokulum zwischen dem unteren Teil des Hautbindegewebes und dem subkutanen Gewebe eingelagert. Boven und Winograd (1991), s.o.
Tiermodelle des Brustkarzinoms können beispielsweise durch Implantieren von Ratten-Neuroblastomzellen (aus denen das neu-Onkogen ursprünglich isoliert wurde) oder neu-transformierten NIH-3T3-Zellen in Nacktmäuse, im Wesentlichen wie von Drebin et al., PNAS USA 83, 9129–9133 (1986) beschrieben erzeugt werden.
Gleichermaßen können Tiermodelle des Dickdarbkarzinoms erzeugt werden, indem eine Passage von Dickdarmkarzinomzellen in Tieren, z.B. Nacktmäusen durchgeführt wird, was zum Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt. Ein orthotopisches Transplantatmodell von menschlichem Dickdarmkarzinom in Nacktmäusen ist beispielsweise von Wang et al., Cancer Research 54, 4726–4728 (1994) und Too et al., Cancer Research 55, 681–684 (1995) beschrieben worden. Dieses Modell basiert auf der so genannten „METAMOUSE^TM", die von Anticancer Inc. (San Diego, Kalifornien) verkauft wird.
Tumoren, die in Tieren entstehen, können entfernt und in vitro kultiviert werden. Zellen aus den In-vitro-Kulturen können dann an Tiere passagiert werden. Derartige Tumoren können als Ziele für weiteres Testen oder Arzneimittel-Screening dienen. Alternativ dazu können die aus der Passage resultierenden Tumoren isoliert und RNA aus Vor-Passage-Zellen und Zellen, die nach einem oder mehreren Passage-Umläufen isoliert wurden, auf differenzielle Expression von Genen von Interesse analysiert werden. Derartige Passage-Techniken können mit beliebigen bekannten Tumor- oder Krebszelllinien durchgeführt werden.
Beispielsweise sind Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 und WEHI-164 chemisch induzierte Fibrosarkome weiblicher BALB/c-Mäuse (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), die ein sehr gut steuerbares Modellsystem zur Untersuchung der Antitumoraktivitäten verschiedener Mittel bereitstellen (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023–4032 (1987)). Zusammenfassend werden Tumorzellen in vitro in Zellkultur vermehrt. Vor der Injektion in die Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in einer Zelldichte von etwa 10 × 10⁶ bis 10 × 10⁷ Zelle/ml in Puffer suspendiert. Die Tiere werden dann subkutan mit 10 bis 100 μl der Zellsuspension infiziert und das Auftreten eines Tumors für ein bis drei Wochen abgewartet.
Außerdem kann das Lewis-Lungen-(3LL-)Karzinom der Mäuse, das einer der am gründlichsten untersuchten experimentellen Tumoren ist, als Forschungs-Tumormodell verwendet werden. Die Wirksamkeit dieses Tumormodells ist mit vorteilhaften Wirkungen bei der Behandlung von menschlichen Patienten korreliert worden, die mit kleinzelligem Lungenkarzinom (SCCL) diagnostiziert worden sind. Dieser Tumor kann durch Injektion von Tumorfragmenten einer befallenen Maus oder von in Kultur gehaltenen Zellen in normale Mäuse eingeführt werden (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, Nachtrag 4, 309 (1980)). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Tumoren sogar aus der Injektion einer einzigen Zelle ausgelöst werden können und dass ein sehr hoher Anteil infizierter Tumorzellen überlebt. Für weitere Informationen über diesen Tumor siehe Zacharski, Haemostasis 16, 300–320 (1986)).
Eine Art und Weise der Beurteilung der Wirksamkeit einer Testverbindung in einem Tiermodell auf einen implantierten Tumor ist die Messung der Größer des Tumors vor und nach der Behandlung. Herkömmlicherweise ist die Größe implantierter Tumoren mit einer Schublehre in zwei oder drei Dimensionen gemessen worden. Die auf zwei Dimensionen begrenzte Messung kann die Größe des Tumors nicht genau wiedergeben und daher wird sie üblicherweise durch Verwendung einer mathematischen Formel in das entsprechende Volumen umgewandelt. Jedoch ist die Messung der Tumorgröße sehr ungenau. Die therapeutischen Wirkungen eines Medikament-Kandidaten kann als eine durch die Behandlung ausgelöste Wachstumsverzögerung und spezifische Wachstumsverzögerung besser beschrieben werden. Eine weitere wichtige Variable bei der Beschreibung von Tumorwachstum ist die Tumorvolumen-Verdoppelungszeit. Computerprogramme zur Berechnung und Beschreibung von Tumorwachstum sind ebenfalls verfügbar, wie z.B. jenes, das von Rygaard und Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu und Sheng (Hrsg.), Basel, 301 (1989) beschrieben wird. Es wird jedoch angemerkt, dass Nekrose und entzündliche Reaktionen nach der Behandlung zumindest anfänglich auch in einer Erhöhung der Tumorgröße resultieren können. Daher müssen diese Veränderungen sorgfältig beobachtet werden, und zwar durch eine Kombination eines morphometrischen Verfahrens und einer durchflusszytometrischen Analyse.
Rekombinante (transgene) Tiermodelle können unter Verwendung von Standardtechniken zur Herstellung transgener Tiere durch Einführen des kodierenden Abschnitts der hierin identifizierten Gene in das Genom der Tiere von Interesse konstruiert werden. Tiere, die als Ziel zur transgenen Manipulation dienen können, umfassen ohne Einschränkung Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche Primaten, z.B. Paviane, Schimpansen und Affen. Techniken zur Einführung eines Transgen in solche Tiere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassen Pronukleus-Mikroinjektion (Hoppe und Wanger, US-Patent Nr. 4.873.191); Retrovirus-vermittelter Gentransfer in Keimbahnen (z.B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)); Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)); Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803–1814 (1983)); Spermien-vermittelter Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989)). Für einen Überblick siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.736.866.
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene, die das Transgen in nur einem Teil ihrer Zellen beherbergen („Mosaik-Tier"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder als Koncatemere, z.B. als Kopf-Kopf- oder Kopf-Schwanz-Tandems integriert sein. Die selektive Einführung eines Transgens in einen bestimmten Zelltyp ist außerdem möglich, indem beispielsweise die Technik von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232–636 (1992) befolgt wird.
Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann mittels Standardtechniken beobachtet werden. Beispielsweise kann Southern-Blotting-Analyse oder PCR-Amplifikation verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren. Das Ausmaß der mRNA-Expression kann dann unter Verwendung von Techniken, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunozytochemie analysiert werden. Die Tiere werden auf Anzeichen von Tumor- oder Karzinomentwicklung weiter untersucht.
Alternativ dazu können „Knockout"-Tiere konstruiert werden, die ein defektes oder verändertes, für ein hierin identifiziertes CT-1-Polypeptid kodierendes Gen aufweisen, und zwar als Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem endogenen, für das Polypeptid kodierenden Gen und veränderter, für dasselbe Polypeptid kodierender genomischer DNA, die in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführt wurde. Beispielsweise kann für ein bestimmtes CT-1-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um nach etablierten Techniken für dieses Polypeptid kodierende genomische DNA zu klonieren. Ein Abschnitt der für ein bestimmtes CT-1-Polypeptid kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen, wie z.B. durch ein für einen selektierbaren Marker kodierendes Gen ersetzt werden, das zur Feststellung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise umfasst der Vektor mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (an den 5'- sowie 3'-Enden) (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt und es werden jene Zellen selektiert, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregations-Chimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertsen (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein „Knockout"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise durch ihre Fähigkeit charakterisiert werden, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zu wehren und durch ihre Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund der Abwesenheit des CT-1-Polypeptids.
Die Wirksamkeit von Antikörpern, die spezifisch an die hierin identifizierten Polypeptide und andere Medikament-Kandidaten binden, können auch bei der Behandlung spontaner Tier-Tumoren getestet werden. Ein geeignetes Ziel für derartige Untersu chungen ist das orale Katzen-Plattenepithelkarzinom (SCC). Orale Katzen-SCC ist ein höchst invasiver, maligner Tumor, der die häufigste orale Malignität von Katzen und für über 60% der berichteten oralen Tumoren dieser Spezies verantwortlich ist. Er metastasiert selten zu entfernten Stellen, obgleich die niedrige Metastasehäufigkeit lediglich die kurzen Überlabenszeiten für Katzen mit diesem Tumor widerspiegeln könnte. Diese Tumoren sind üblicherweise einer Operation nicht zugänglich, und zwar in erster Linie aufgrund der Anatomie der Katzen-Mundhöhle. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung für diesen Tumor. Vor dem Eintritt in die Studie wird jede Katze einer vollständigen klinischen Untersuchung und Biopsie unterzogen und wird mittels Computertomografie gescannt. Mit sublingualen oralen Plattenepithel-Tumoren diagnostizierte Katzen werden von der Studie ausgeschlossen. Die Zunge kann als Resultat eines derartigen Tumors paralysiert werden und sogar wenn die Behandlung den Tumor abtötet, wären die Tiere möglicherweise nicht in der Lage, sich selbst zu ernähren. Jede Katze wird wiederholt über einen längeren Zeitraum behandelt. Es werden Fotografien des Tumors täglich während dem Behandlungszeitraum und bei jeder nachfolgenden Kontrolluntersuchung angefertigt. Nach der Behandlung wird jede Katze einem weiteren Computertomografie-Scan unterzogen. Computertomografie-Scans und Thorax-Radiografien werden alle 8 Wochen danach beurteilt. Die Daten werden auf Unterschiede hinsichtlich Überleben, Reaktion und Toxizität im Vergleich zu Kontrollgruppen beurteilt. Eine positive Reaktion kann den Nachweis der Tumorregression, vorzugsweise mit Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhter Lebenszeit erfordern.
Zusätzlich können andere spontane Tier-Tumoren, wie z.B. Fibrosarkom, Adenokarzinom, Lymphom, Chondrom, Leiomyosarkom von Hunden, Katzen und Pavianen ebenfalls getestet werden. Von diesen ist das Mamma-Adenokarzinom bei Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da ihr Aussehen und Verhalten jenem beim Menschen sehr ähnlich ist. Jedoch ist die Brauchbarkeit dieses Modells aufgrund des seltenen Auftretens dieses Tumortyps bei Tieren beschränkt.
8. Screeningtests für Medikament-Kandidaten
Screeningtests für Medikament-Kandidaten sind konstruiert, um Verbindungen zu identifizieren, die an die von den hierin identifizierten Genen kodierten Polypeptide binden oder komplexieren oder die Wechselwirkung der kodierten Proteine mit anderen Zellproteinen anderweitig stören. Derartige Screeningtests umfassen Tests, die einem High-throughput-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie insbesondere zur Identifizierung von Medikament-Kandidaten kleiner Molekülgröße geeignet sind. Vorgesehene kleine Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen, einschließlich Peptide, vorzugsweise lösliche Peptide, (Poly)peptid-Immunglobulin-Fusionen und insbesondere Antikörper, einschließlich und ohne Einschränkung poly- und monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente, Einzelketten-Antikörper, antiidiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Versionen derartiger Antikörper und Fragmente, sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente. Die Tests können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich als Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut charakterisiert sind.
Alle Tests haben gemeinsam, dass sie das Kontaktieren des Medikament-Kandidaten mit einem von der hierin identifizierten Nucleinsäure kodierten Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeit erfordern, die ausreicht, um die Wechselwirkung dieser beiden Komponenten zu ermöglichen.
Bei Bindungstests ist die Wechselwirkung die Bindung und der gebildete Komplex kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert und nachgewiesen werden. In einer speziellen Ausführungsform wird das vom hierin identifizierten Gen kodierte Polypeptid oder der Medikament-Kandidat an eine Festphase, z.B. an einer Mikrotiterplatte durch kovalente oder nicht-kovalente Anlagerungen immobilisiert. Die nicht-kovalente Anlagerung wird im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Polypeptids und Trocknen erzielt. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein für das zu immobilisierende Polypeptid spezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, um das Polypeptid an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durchgeführt, indem die nicht immobilisierte Komponente, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der die verankerte Komponente enthaltenden, beschichteten Oberfläche zugegeben wird. Wenn die Reaktion beendet ist, werden die nicht reagierten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe nachgewiesen. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente einen nachweisbaren Marker trägt, zeigt der Nachweis von an der Oberfläche immobilisiertem Marker an, dass eine Komplexierung aufgetreten ist. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente keinen Marker trägt, kann eine Komplexierung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der spezifisch an den immobilisierten Komplex bindet.
Wenn die Kandidat-Verbindung mit dem speziellen, von einer hierin beschriebenen Nucleinsäuresequenz kodierten CT-1-Polypeptid wechselwirkt, jedoch nicht daran bindet, kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels Verfahren getestet werden, die für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen wohlbekannt sind. Derartige Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunopräzipitation und Co-Reinigung über Gradienten oder chromatographische Säulen. Außerdem können Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Verwendung eines genetischen Systems auf Basis von Hefe wie von Fields und Mitarbeitern beschrieben beobachtet werden (Fields und Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991), wie offenbart von Chevray und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991)). Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe-GAL4, bestehen aus zwei physikalisch unterschiedlichen modularen Domänen, wovon eine als DNA-Bindungsdomäne agiert, während die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne agiert. Das in den vorangegangenen Veröffentlichungen beschriebene Hefe-Expressionssystem (allgemein als „Zwei-Hybrid-System" bezeichnet) nützt den Vorteil dieser Eigenschaft aus und setzt zwei Hybridproteine ein, und zwar eines, bei dem das Zielprotein an die DNA-bindende Domäne von GAL4 fusioniert ist, und ein weiteres, bei dem aktivierende Kandidat-Proteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression eines GAL1-lacZ-Reportergens unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung der GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Proteine enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung der Zwei-Hybrid-Technik ist im Handel von Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um Proteindomänen zu kartieren, die an spezifischen Proteinwechselwirkungen beteiligt sind, sowie um Aminosäurereste genau festzustellen, die für diese Wechselwirkung entscheidend sind.
Verbindungen, welche die Wechselwirkung eines für CT-1 kodierenden, hierin identifizierten Gens mit anderen intra- oder extrazellulären Komponenten stört, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch, welches das Produkt des amplifizierten Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente enthält, unter Bedingungen und für eine Zeit hergestellt, welche die Wechselwirkung und Bindung der beiden Produkte ermöglicht. Um die Fähigkeit einer Testverbindung zu testen, die Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und Anwesenheit der Testverbindung durchgeführt. Außerdem kann ein Placebo einem dritten Reaktionsgemisch zugegeben werden, um als Kontrolle zu dienen. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Verbindung, die in Gemisch vorhanden sind, wird wie hierin oben beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), nicht jedoch im die Testverbindung enthaltendem Reaktionsgemisch zeigt an, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihrem Reaktionspartner stört.
9. Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Tumoren
Die Zusammensetzungen, die zur Behandlung von mit der Amplifikation der hierin identifizierten Gene im Zusammenhang stehenden Tumoren zweckdienlich sind, umfassen ohne Einschränkung Antikörper, kleine organische und anorganische Molekü le, Peptide, Phosphopeptide, Antisense- und Ribozym-Moleküle, Tripelhelix-Moleküle usw., welche die Expression und/oder Aktivität des Ziel-Genprodukts hemmen.
Beispielsweise wirken Antisense-RNA und RNA-Molekül, um die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Verhinderung der Proteintranslation direkt zu blockieren. Wenn Antisense-DNA verwendet wird, sind Oligodesoxyribonucleotide bevorzugt, die von der Translationsinitiationsstelle stammen, z.B. von einer Position zwischen ungefähr –10 und +10 der Ziel-Gen-Nucleotidsequenz.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme agieren durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels können mit Hilfe bekannter Techniken identifiziert werden. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. Rossi, Current Biology 4, 469–471 (1994) und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die zur Hemmung der Transkription verwendet werden, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so konstruiert, dass sie die Tripelhelix-Bildung über Hoogsteen-Basenpaarungsgesetz fördert, was im Allgemeinen beträchtliche Abschnitte von Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordert. Für weitere Einzelheiten siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, s.o.
Diese Moleküle können durch ein beliebiges oder durch jegliche Kombination der hierin oben erörterten Screeningtests und/oder durch jegliche andere Screeningtests identifiziert werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
9.1 Antikörper
Einige der aussichtsreichsten Medikament-Kandidaten gemäß der vorliegenden Erfindung sind Antikörper und Antikörperfragmente, welche die Produktion des Genprodukts der hierin identifizierten amplifizierten Gene und/oder die Aktivität der Genprodukte hemmen könnten.
i. Polyklonale Antikörper
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier hergestellt werden, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das CT-1-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das im zu immunisierenden Säugetier bekanntermaßen immunogen ist. Beispiele derartiger immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Keyhole-limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiele von Adjuvantien, die eingesetzt werden können, umfassen Freund'sches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden.
ii. Monoklonale Antikörper
Die Anti-CT-1-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie z.B. jenen von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschriebenen hergestellt werden. Bei einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunogenen Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder dazu fähig sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das CT-1-Polypeptid, einschließlich Fragmente oder ein Fusionsprotein einer derartigen Proteins oder ein Fragment davon umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblut-Lymphozyten (PBLs'') verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, falls nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht sind.
Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagern, Rindern oder menschlichen Ursprungs. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben nicht fusionierter, immortalisierter Zellen hemmt. Wenn beispielsweise den elterlichen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Medium typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindert.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Expression des Antikörpers durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen im hohen Ausmaß aufrecht erhalten und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien und der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von Antikörpern getestet werden, die gegen CT-1 gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbent-assay (ELISA) ermittelt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse 33, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc.,), Manassas, Viproduzierten pr von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980) ermittelt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie aus dem Kulturmedium oder Aszites isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können außerdem durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtkletten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamstereierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenz für konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.) oder durch kovalentes Verbinden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid mit der für Immunglobulin kodierenden Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können monovalente Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und der modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einer beliebigen Stelle in der Fc-Region trunkiert, um die Schwerkettenvernetzung zu verhindern. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste mit einem anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um eine Vernetzung zu verhindern.
In-vitro-Verfahren sind zur Herstellung monovalenter Antikörper ebenfalls geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente herzustellen, kann unter Verwendung von Routinetechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erzielt werden.
iii. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-CT-1-Antikörper können außerdem humanisierte oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nicht-menschlicher (z.B. Maus) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregionen des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können außerdem Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen des nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall außerdem zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nicht-menschlichen Quelle in diesen eingeführt sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durchgeführt werden, indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen substituiert werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne mit der entsprechenden Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschlichen Antikörper, bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können ebenfalls hergestellt werden, und zwar unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Techniken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)). Gleichermaßen können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulin-Loci in transgene Tiere hergestellt werden, z.B. in Mäuse, bei denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig inaktiviert worden sind. Bei Exposition wird eine Produktion menschlicher Antikörper beobachtet, die der im Menschen beobachteten in allen Aspekten, einschließlich Gen-Umordnung, Assemblierung und Antikörper-Repertoire sehr nahe kommt. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.852; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
iv. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist einer der Bindungsspezifitäten für ein CT-1-Polypeptid und die andere für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptor-Untereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der Zufallsanordnung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eine die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte erzielt. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3659 (1991) offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinierungsstellen) können an Immunglobulinsequenzen konstanter Domänen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die für die Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. Für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls erwünscht, die Immunglobulin-Leichtkette kodierenden DNAs werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
v. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-Patent Nr. 4.676.980), sowie zur Behandlung der HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ). Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Ausbildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
vi. Effektorfunktion-Konstruktion
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung bezüglich der Effektorfunktion zu modifizieren, um beispielsweise die Wirksamkeit des Antikörpers zur Krebsbehandlung zu erhöhen. Beispielsweise kann/können (ein) Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Ausbildung einer Zwischenketten-Disulfidbindung in dieser Region ermöglicht wird. Der so erzeugte heterodimere Antikörper kann eine verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder erhöhte Komplement-vermittelte Zellabtötung und Antikörper-abhängige Zelltoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992) und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit verstärkter Antitumoraktivität können unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993) beschrieben ebenfalls hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper konstruiert werden, der duale Fc-Regionen aufweist und daher verstärkte Komplement-Lyse- und ADCC-Fähigkeiten aufweisen könnte. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
vii. Immunokonjugate
Die Erfindung betrifft außerdem Immunokonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel, wie z.B. an ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h., Radiokonjugat) konjugiert ist.
Bei der Erzeugung derartiger Immunokonjugate zweckdienliche chemotherapeutische Mittel sind oben beschrieben worden. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie A-Kette, nicht bindende Fragmente von Diphtherie-Toxin, Exotoxin A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin A-Kette, Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, Alpha-Sarcin, Aleurites fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca americana-Proteine (PAPI; PAPII und PAPS), Momordica-Charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Eine Vielzahl von Radionukliden ist zur Produktion radiokonjugierter Antikörper verfügbar. Beispiele umfassen ²¹²BI,¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung einer Vielzahl bifunktioneller Proteinkopplungsmittel hergestellt, wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat HCl), aktive Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie z.B. Glutaraldehyd), Bis-azido-Verbindungen (wie z.B. Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-diazonium-Derivate (wie z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin), Diisocyanate (wie z.B. Toylen-2,6-diisocyanat) und bis-aktive Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). Beispielsweise kann ein Ricin-Immunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987) beschrieben hergestellt werden. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylen-triaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhaftes Chelatierungsmittel für die Konjugation eines Radionuklids an einen Antikörper. Siehe WO 94/11026.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie z.B. Streptavidin) zur Verwertung beim Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat an den Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung des ungebundenen Konjugats aus dem Kreislauf unter Verwendung eines Clearing-Mittels und anschließender Verabreichung eines „Liganden" (z.B. Avidin), das an ein zytotoxisches Mittel (z.B. Radionuklid) konjugiert ist.
viii. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Den Antikörper enthaltende Liposomen werden mittels Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. jenen, die in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 368 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Insbesondere zweckdienliche Liposomen können mittels Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst. Liposomen werden durch Filter definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu liefern. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982) über eine Disulfid-Austauschreaktion an die Liposomen konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie z.B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. (19), 1484 (1989).
10. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Antikörper, die das Produkt eines hierin identifizierten amplifizierten Gens spezifisch binden, sowie andere Moleküle, die mittels der hierin vorhergehend offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von Tumoren, einschließlich Karzinomen in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen verabreicht werden.
Falls das vom amplifizierten Gen kodierte Protein intrazellulär vorliegt und vollständige Antikörper als Inhibitoren verwendet werden, sind internalisierende Antikörper bevorzugt. Jedoch können auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment an Zellen abzugeben. Wo Antikörperfragmente verwendet werden, ist das kleinste hemmende Fragment bevorzugt, das spezifisch an die Bindungsdomäne des Zielproteins bindet. Beispielsweise können auf Basis der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle konstruiert werden, welche die Fähigkeit zur Bindung der Ziel-Proteinsequenz beibehalten. Derartige Peptide können chemisch synthetisiert und/oder mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden (siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993)).
Therapeutische Formulierungen für die Lagerung des Antikörpers werden hergestellt, indem der Antikörper mit dem gewünschten Reinheitsgrad gegebenenfalls mit annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt werden (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)), und zwar in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol; Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatierungsmittel, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Sucrose, Mannitol, Trehalose oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Nicht-Antikörper-Verbindungen, die von den Screeningtests der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, können auf analoge Weise unter Verwendung von Standardtechniken formuliert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
Die Formulierung hierin kann außerdem mehr als eine aktive Verbindung enthalten, die für die jeweilige behandelte Indikation notwendig sind, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, welche sich gegenseitig nicht nachteilig beeinflussen.
Alternativ dazu oder zusätzlich kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin oder wachstumshemmendes Mittel umfassen. Derartige Moleküle sind in geeigneter Weise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
Der aktive Bestandteil kann auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Abgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Markoemulsionen hergestellt werden. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980) offenbart.
Die zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen erzielt werden.
Es können Präparate mit nachhaltiger Freisetzung hergestellt werden. Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die den Antikörper enthalten, wobei die Mat rices in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln vorliegen. Beispiele von Matrices für nachhaltige Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethl-methacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. das LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Protein über kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Antikörper für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis der Exposition mit Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Es können rationale Strategien zur Stabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als Bildung intermolekularer S-S-Bindungen über Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrolle des Feuchtegehalts, Verwendung geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
11. Behandlungsverfahren
Es ist vorgesehen, dass die Antikörper und andere Anti-Tumor-Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um verschiedene Konditionen zu behandeln, einschließlich jene, die durch Überexpression und/oder Aktivierung der hierin identifizierten, amplifizierten Gene gekennzeichnet sind. Mit derartigen Antikörpern oder anderen, kleine organische und anorganische Molekülen, Peptide, Antisense-Moleküle usw. umfassenden, jedoch nicht darauf beschränkten Verbindungen zu behandelnde beispielhafte Konditionen oder Störungen umfassen gutartige oder bösartige Tumoren (z.B. Nieren-, Leber-, Blasen-, Brust-, Magen-, Eierstock-, Dickdarm-Mastdarm-, Prostata-, Pankreas-, Ling-, Vulva-, Schilddrüsen-Karzinome; Sarkome; Glioblastome; und verschiedene Kopf- und Halstumore); Leukämien und Lymphmalignitäten; andere Störungen, wie z.B. Neuronen-, Glia-, Astrozyten-, Hypothalamus- und andere Drüsen-, Makrophagen-, Epithel-, Stroma und Blastozölen-Störungen; und entzündliche, angiogene und immunologische Störungen.
Die Anti-Tumor-Mittel der vorliegenden Erfindung, z.B. Antikörper, werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen nach bekannten Verfahren, wie z.B. intravenöser Verabreichung als Bolus- oder kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum durch intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrospinale, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale, orale, topische oder inhalative Wege verabreicht. Die intravenöse Verabreichung des Antikörpers wird bevorzugt.
Andere therapeutische Regime können mit der Verabreichung der Anti-Krebs-Mittel, z.B. Antikörper der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Beispielsweise kann der mit derartigen Anti-Krebs-Mitteln zu behandelnde Patient außerdem eine Bestrahlungstherapie erhalten. Alternativ dazu oder zusätzlich kann dem Patienten ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht werden. Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige chemotherapeutische Mittel können nach Anleitungen des Herstellers verwendet oder vom geübten Praktiker empirisch ermittelt werden. Herstellungs- und Dosierungspläne für eine derartige Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann der Verabreichung des Anti-Tumor-Mittels, z.B. Antikörpers vorangehen oder folgen, oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden. Der Antikörper kann mit einer Anti-Östrogen-Verbindung, wie z.B. Tamoxifen oder einem Anti-Progesteron, wie z.B. Onapriston (siehe EP 616812 ) in Dosierungen kombiniert werden, die für derartige Moleküle bekannt sind.
Es kann wünschenswert sein, außerdem Antikörper gegen andere Tumor-assoziierte Antigene zu verabreichen, wie z.B. Antikörper, die an den ErbB2-, EGFR-, ErbB3, ErbB4- oder Gefäßendothel-Faktor (VEGF) binden. Alternativ dazu oder zusätzlich können zwei oder mehr Antikörper dem Patienten verabreicht werden, die dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte Antigene binden. Manchmal kann es vorteilhaft sein, dem Patienten auch ein oder mehrere Cytokine zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper hierin gemeinsam mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht. Beispielsweise kann das wachstumshemmende Mittel zuerst verabreicht werden, gefolgt von einem Antikörper der vorliegenden Erfindung. Jedoch ist die gleichzeitige Verabreichung oder die Verabreichung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung als Erstes ebenfalls vorgesehen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel sind jene, die gegenwärtig verwendet werden und können aufgrund der kombinierten Wirkung (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des Antikörpers hierin erniedrigt werden.
Zur Prävention oder Behandlung einer Krankheit wird die geeignete Dosierung eines Anti-Tumor-Mittels, z.B. eines Antikörpers hierin von Folgendem abhängen: von der Art der wie oben definierten, zu behandelnden Krankheit, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob das Mittel zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von der vorhergehenden Therapie, der Krankengeschichte und Reaktion auf das Mittel und dem Ermessen des behandelnden Arztes. Das Mittel wird dem Patienten in geeigneter Weise auf einmal oder über eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
Beispielsweise sind in Abhängigkeit von der Art und Schwere der Krankheit ungefähr 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z.B. 0,1–20 mg/kg) Antikörper eine anfängliche Kandidat-Dosierung für die Verabreichung an den Patienten, sei es beispielsweise durch eine oder mehrere gesonderte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische tägliche Dosierung kann in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr reichen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung in Abhängigkeit vom Zustand aufrechterhalten, bis eine gewünschte Unterdrückung von Krankheitssymptomen auftritt. Jedoch können andere Dosierungsregime zweckdienlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann durch herkömmliche Techniken und Tests leicht überwacht werden.
12. Fertigartikel
Ein Fertigartikel, der Materialien enthält, die zur Diagnose und Behandlung der oben beschriebenen Störungen zweckdienlich sind, kann bereitgestellt werden. Der Fertigartikel umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus eine Vielzahl von Materialien, wie z.B. Glas oder Kunststoff bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung der Kondition wirksam ist und kann eine sterile Füllöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel für intravenöse Lösungen oder ein Fläschchen sein, das einen von einer subkutanen Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen aufweist). Das aktive Mittel in der Zusammensetzung ist üblicherweise ein Anti-Tumor-Mittel, das fähig ist, die Aktivität des hierin identifizierten Genprodukts zu stören, z.B. ein Antikörper. Das Etikett, das am Behälter angebracht oder diesem beigefügt ist, weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der Kondition der Wahl verwendet wird. Der Fertigartikel kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung umfasst. Er kann weiters andere Materialien umfassen, die vom kommerziellen Standpunkt oder Standpunkt des Verwenders wünschenswert sind, einschließlich andere Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Verwendungsanleitungen.
13. Diagnose und Prognose von Tumoren
Während Zelloberflächenproteine, wie z.B. in gewissen Tumoren überexprimierte Wachstumsrezeptoren hervorragende Ziele für Medikament-Kandidaten oder Tumor-(z.B. Krebs-)Behandlung sind, finden dieselben Proteine gemeinsam mit sekretierten, von den in Tumorzellen amplifizierten Genen kodierten Proteinen weitere Anwendungen bei der Diagnose und Prognose von Tumoren. Beispielsweise können Antikörper, die gegen Proteinprodukte von in Tumorzellen amplifizierten Genen gerichtet sind, als Tumor-Diagnostika oder Prognostika verwendet werden.
Beispielsweise können Antikörper, einschließlich Antikörperfragmente verwendet werden, um die Expression der von den amplifizierten Genen kodierten Proteine („Markergenprodukte") qualitativ oder quantitativ nachzuweisen. Der Antikörper ist vorzugsweise mit einem nachweisbaren, z.B. fluoreszierenden Marken ausgestattet und die Bindung kann mittels Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken beobachtet werden. Diese Techniken sind besonders geeignet wenn das amplifizierte Gen für ein Zelloberflächenprotein, z.B. einen Wachstumsfaktor kodiert. Derartige Bindungstests werden im Wesentlichen wie im obigen Abschnitt 5 beschrieben durchgeführt.
Der In-situ-Nachweis der Antikörperbindung an die Markergenprodukte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz oder Immunelektronenmikroskopie durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem Patienten entfernt und ein markierter Antikörper auf diese vorzugsweise durch Überschichten der biologischen Probe mit dem Antikörper aufgebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts im untersuchten Gewebe. Für den qualifizierten Fachmann ist offensichtlich, dass eine breite Vielfalt an histologischen Verfahren für den In-situ-Nachweis leicht verfügbar ist.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen in keiner Weise die Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, wenn nicht anders angegeben, gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Patentbeschreibung durch ATCC-Zugangsnummern gekennzeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA. Wenn nicht anders angegeben, verwendet die vorliegende Erfindung Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie, wie z.B. jene, die hierin oben und in den folgenden Lehrbüchern beschrieben sind: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., N.Y. (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); R. I. Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
Beispiel 1
Genamplifikation
Dieses Beispiel zeigt, dass das für CT-1 kodierende Gen im Genom gewisser menschlicher Lungen- und Dickdarm-Karzinom-Zelllinien amplifiziert wird. Die Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts assoziiert, was darauf hinweist, dass die CT-1-Proteine zweckdienliche Ziele für die therapeutische Intervention bei gewissen Karzinomen, wie z.B. Dickdarm-, Lungen-, Brust- oder anderen Karzinomen sind. Ein therapeutisches Mittel kann die Form von Antagonisten der für CT-1 kodierenden Genprodukte einnehmen, beispielsweise Maus-Mensch-chimäre, humanisierte oder menschliche Antikörper gegen ein CT-1-(CT-1-)Polypeptid.
Das Ausgangsmaterial für das Screening war aus einer Reihe von Karzinomen isolierte genomische DNA. Die DNA wird z.B. fluorimetrisch exakt quantifiziert. Als negative Kontrolle wurde DNA aus den Zellen von zehn normalen gesunden Individuen isoliert, die gepoolt und als Testkontrollen für die Genkopiezahl in gesunden Individuen verwendet wurden (nicht dargestellt). Der 5'-Nuclease-Test (zum Beispiel TaqMan^TM) und die quantitative Echtzeit-PCR (zum Beispiel ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^TM (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) wurden verwendet, um Gene aufzufinden, die möglicherweise bei gewissen Karzinomen amplifiziert werden. Die Ergebnisse wurden verwendet, um zu ermitteln, ob für CT-1 kodierende DNA in irgendwelchen der gescreenten primären Lungen- oder Dickdarm-Karzinome oder Karzinomzelllinien überrepräsentiert war. Die primären Lungenkarzinome wurden aus Individuen mit Tumoren des in Tabelle 1 angeführten Typs und Stadiums erhalten. Eine Erklärung der für die Bezeichnung der in Tabelle 1 aufgezählten Primärtumoren und der Primärtumoren und Zelllinien verwendeten Abkürzungen, auf die in diesem Beispiel durchwegs Bezug genommen wird, ist oben gegeben worden. Die Ergebnisse des Tagman^TM-Tests sind in Delta-(Δ-)Ct-Einheiten angegeben. Eine Einheit entspricht einem PCR-Zyklus oder ungefähr einer zweifachen Amplifikation im Vergleich zur normalen, zwei Einheiten entsprechen einer vierfachen, 3 Einheiten einer achtfachen Amplifikation und so weiter. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung von Primern und einer Tagman^TM-Fluoreszenzsonde erlangt, die vom für CT-1 kodierenden Gen hergeleitet wurde. CT-1-Regionen, die mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einzigartige Nucleinsäuresequenzen enthalten und die mit geringster Wahrscheinlichkeit herausgespleißte Introns aufweisen, sind zur Herleitung von Primer und Sonde bevorzugt, z.B. eine 3'-untranslatierte Region. Die Sequenzen für die Primer und Sonden (vorwärts, rückwärts und Sonde), die für die CT-1-Genamplifikation verwendet wurden, waren die folgenden:
Die 5'-Nucleasetestreaktion ist eine auf PCR basierende Fluoreszenztechnik, welche die 5'-Exonucleaseaktivität des Taq-DNA-Polymeraseenzyms einsetzt, um die Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Es werden zwei Oligonucleotidprimer verwendet, um ein für eine PCR-Reaktion typisches Amplicon zu erzeugen. Ein drittes Oligonucleotid oder eine Sonde wird konstruiert, um die zwischen den beiden PCR-Primern befindliche Sequenz nachzuweisen. Die Sonde ist vom Taq-DNA-Polymeraseenzym nicht verlängerbar und ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Eine laserinduzierte Emission aus dem Reporter-Farbstoff wird vom Quench-Farbstoff gequencht, wenn die beiden Farbstoffe nahe beieinander liegen, wie es an der Sonde der Fall ist.
Während der Amplifikationsreaktion spaltet das Taq-DNA-Polymeraseenzym die Sonde auf Templat-abhängige Weise. Die resultierenden Sondenfragmente dissoziieren in Lösung und das Signal aus dem freigesetzten Reporter-Farbstoff ist frei von der Quench-Wirkung des zweiten Fluorophors. Ein Molekül des Reporter-Farbstoffs wird je neu synthetisiertes Molekül freigesetzt und der Nachweis des nicht gequenchten Reporter-Farbstoffs stellt die Basis für die quantitative Interpretation der Daten bereit.
Die 5'-Nuclease-Prozedur wird an einem quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt, wie z.B. der ABI Prism 7700^TM Sequence Detection. Das System besteht aus einem Thermocycler, Laser, einer Kamera mit hochauflösendem Bildpunktfeld (CCD-Kamera) und einem Computer. Das System amplifiziert Proben im 96-Napf-Format am Thermocycler. Während der Amplifikation wird das laserinduzierte Fluoreszenzsignal in Echtzeit durch Faseroptikleitungen für alle 96 Näpfe gesammelt und an der CCD-Kamera detektiert. Das System umfasst Software zum Betrieb des Geräts und zur Datenanalyse.
5'-Nucleasetestdaten werden anfänglich als Ct oder Schwellenwert-Zyklus ausgedrückt. Dieser ist als jener Zyklus definiert, bei dem das Reporter-Signal über das Hintergrundausmaß der Fluoreszenz hinaus akkumuliert. Die ΔCt-Werte werden als quantitative Messung der relativen Anzahl an Anfangskopien einer bestimmten Zielsequenz in einer Nucleinsäure beim Vergleich von Karzinom-DNA-Ergebnissen mit DNA-Ergebnissen normaler menschlicher DNA verwendet.
Tabelle 1 beschreibt das Stadium, T-Stadium und N-Stadium verschiedener Primärtumoren, die verwendet wurden, um die CT-1-Verbindungen der Erfindung zu screenen.
Tabelle 1 Primäre Lungen- und Dickdarm-Tumorprofile
DNA-Herstellung:
DNA wurde aus kultivierten Zelllinien, Primärtumoren und normalem menschlichen Blut hergestellt. Die Isolierung wurde unter Verwendung von Reinigungsset, Pufferset und Protease (alle von Quiagen) nach den Anleitungen des Herstellers und der unten stehenden Beschreibung durchgeführt.
Zellkulturlyse:
Zellen wurden in einer Konzentration von 7,5 × 10⁸ pro Spitze gewaschen und trypsinisiert und mittels Zentrifugation bei 1.000 Upm für 5 Minuten bei 4°C pelletiert, gefolgt von nochmaligem Waschen mit ½ Volumen PBS und neuerlicher Zentrifugation. Die Pellets wurden ein drittes Mal gewaschen, die suspendierten Zellen gesammelt und 2 × mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 10 ml PBS suspendiert. Puffer C1 wurde bei 4°C äquilibriert. Quiagen-Protease Nr. 19155 wurde in 6,25 ml kaltes ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml verdünnt und bei 4°C äquilibriert. 10 ml G2-Puffer wurde durch Verdünnen von Quiagen-RNAse A-Stammlösung (100 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 200 μg/ml hergestellt.
Puffer C1 (10 ml, 4°C) und ddH₂O (40 ml, 4°C) wurden dann den 10 ml Zellsuspension zugegeben, durch Kippen vermischt und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellkerne wurden mittels Zentrifugation in einem Beckmann-Ausschwingrotor bei 2.500 Upm bei 4°C für 15 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Kerne mit einem Vortex in 2 ml Puffer C1 (bei 4°C) und 6 ml ddH₂O suspendiert, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei 2.500 Upm für 15 Minuten bei 4°C. Die Kerne wurden dann unter Verwendung von 200 μl pro Spitze in Restpuffer resuspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurde den suspendierten Kernen bei schonendem Vortexen zugegeben. Nach vollständiger Pufferzugabe wurde mittels Vortex für 30 Sekunden kräftig geschüttelt. Quiagen-Protease (200 μl, wie oben angegeben hergestellt) wurde zugegeben und bei 50°C für 60 Minuten inkubiert. Die Inkubation und Zentrifugation wurde wiederholt bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Herstellung und Lyse einer menschlichen massiven Tumorprobe:
Tumorproben wurden gewogen und in konische 50 ml-Röhrchen gegeben und auf Eis gehalten. Die Verarbeitung war auf nicht mehr als 250 mg Gewebe pro Präparation (1 Spitze/Präparation) beschränkt. Die Protease-Lösung wurde durch Verdünnen in 6,25 ml kaltem ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4°C gelagert. G2-Puffer (20 ml) wurde durch Verdünnen von DNAse A auf eine Endkonzentration von 200 mg/ml hergestellt (aus einer Stammlösung mit 100 mg/ml). Das Tumorgewebe wurde in 19 ml G2-Puffer für 60 Sekunden unter Verwendung der großen Spitze des Polytrons in einer Laminar-TC-Werkbank homogenisiert, um die Inhalation von Aerosolen zu vermeiden, und auf Raumtemperatur gehalten. Zwischen den Proben wurde das Polytron durch Zentrifugieren bei 2 × 30 Sekunden jeweils in 2 l ddH₂O, gefolgt von G2-Puffer (50 ml) gereinigt. Falls nach wie vor Gewebe an der Generator-Spitze vorhanden war, wurde der Apparat zerlegt und gereinigt.
Quiagen-Protease (wie oben angegeben hergestellt, 1,0 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Vortexen und Inkubation bei 50°C für 3 Stunden. Die Inkubation und Zentrifugation wurde wiederholt bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Herstellung und Lyse von menschlichem Blut
Blut wurde freiwilligen gesunden Spendern unter Verwendung von standardmäßigen Infektionsmittel-Protokollen abgenommen und in 10 ml Proben je Spitze titriert. Quiagen-Protease wurde durch Verdünnen in 6,25 ml kaltem ddH₂O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4°C gelagert. G2-Puffer wurde durch Verdünnen von RNAse A auf eine Endkonzentration von 200 μg/ml aus einer Stammlösung mit 100 mg/ml hergestellt. Das Blut (10 ml) wurde in ein konisches 50 ml-Röhrchen gegeben und es wurden 10 ml C1-Puffer und 30 ml ddH₂O zugegeben (beide vorher auf 4°C äquilibriert) und die Komponenten durch Kippen vermischt und für 10 Minuten auf Eis gehalten. Die Kerne wurden mit einem Beckman- Ausschwingrotor bei 2.500 Upm, 4°C für 15 Minuten pelletiert und der Überstand verworfen. Mit einem Vortex wurden die Kerne in 2 ml C1-Puffer (4°C) und 6 ml ddH₂O (4°C) suspendiert. Das Vortexen wurde wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Kerne wurden dann unter Verwendung einer 200 ml-Spitze in den Restpuffer suspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurde den suspendierten Pellets unter sanftem Vortexen zugegeben, gefolgt von kräftigem Vortexen für 30 Sekunden. Quiagen-Protease wurde zugegeben (200 μl) und bei 50°C für 60 Minuten inkubiert. Die Inkubation und Zentrifugation wurde wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für weitere 30–60 Minuten, pelletieren bei 3.000 × g für 10 Minuten, 4°C).
Reinigung der geklärten Lysate:
(1) Isolierung genomischer DNA
Genomische DNA wurde mit 10 ml QBT-Puffer äquilibriert (1 Probe je Maxi-Spitzen-Präparat). QF-Elutionspufter wurde be 50°C äquilibriert. Die Proben wurden für 30 Sekunden gevortext, anschließend auf Äquilibrierungsspitzen aufgegeben und mittels Gravitation entleert. Die Spitzen wurden mit 2 × 15 ml QC-Puffer gewaschen. Die DNA wurde in silanisierte, autoklavierte 30 ml-Cortex-Röhrchen mit 15 ml QF-Puffer (50°C) eluiert. Isopropanol (10,5 ml) wurde jeder Probe zugegeben, die Röhrchen mit Paraffin verschlossen und durch wiederholtes Kippen vermischt, bis die DNA präzipitierte. Die Proben wurden durch Zentrifugation im SS-34-Rotor bei 15.000 Upm für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Die Lage des Pellets wurde markiert, der Überstand verworfen und 10 ml 70%iges Ethanol (4°C) zugegeben. Die Proben wurden wiederum durch Zentrifugation am SS-34-Rotor bei 10.000 Upm für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Die Lage des Pellets wurde markiert und der Überstand verworfen. Die Röhrchen wurden dann in einem Trockengestell auf die Seite gelegt und 10 Minuten bei 37°C getrocknet, wobei darauf geachtet wurde, die Proben nicht zu stark zu trocknen.
Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 1,0 ml TE (pH 8,5) aufgelöst und für 1–2 Stunden bei 50°C aufbewahrt. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C gehalten, wo bei sich das Auflösen fortsetzte. Die DNA-Lösung wurde dann in 1,5 ml-Röhrchen mit einer Injektionsnadel Nr. 26 an einer Tuberkulinspritze überführt. Die Überführung wurde 5-mal wiederholt, um die DNA zu scheren. Die Proben wurden dann für 1–2 Stunden bei 50°C aufbewahrt.
Quantifizierung genomischer DNA und Herstellung für den Genamplifikationstest:
Die DNA-Mengen in jedem Röhrchen wurden mittels standardmäßiger A₂₆₀,A₂₈₀-Spektralphotometrie bei einer Verdünnung von 1:20 (5 μl DNA + 95 μl ddH₂O) unter Verwendung der 0,1 ml-Quarzküvetten im Beckman-Spektralphotometer DU640 quantifiziert. Die A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse lagen im Bereich von 1,8–1,9. Jede DNA-Probe wurde dann auf ungefähr 200 ng/ml in TE (pH 8,5) weiter verdünnt. Falls das Ausgangsmaterial hochkonzentriert war (etwa 700 ng/μl), wurde das Material bis zur Resuspension für mehrere Stunden bei 50°C aufbewahrt.
Eine fluorimetrische DNA-Quantifizierung wurde dann am verdünnten Material (20–600 ng/ml) durchgeführt, wobei die wie unten angegeben modifizierten Richtlinien des Herstellers verwendet wurden. Dies wurde erzielt, indem ein Fluorometer DyNA Quant 200 von Hoeffer für etwa 15 Minuten aufgewärmt wurde. Die Hoechst-Farbstoff-Arbeitslösung (Nr. H33258, 10 μl, hergestellt innerhalb von 12 Stunden der Verwendung) wurde in 100 ml 1 × TNE-Puffer verdünnt. Eine 2 ml-Küvette wurde mit der Fluorometer-Lösung gefüllt, in das Gerät gegeben und das Gerät auf Null abgeglichen. pGEM 3Zf(+) (2 μl, Charge Nr. 360851026) wurde zu 2 ml Fluorometer-Lösung zugegeben und auf 200 Einheiten kalibriert. Weitere 2 μl pGEM 3Zf(+)-DNA wurden dann getestet und die Messung bei 400 +/– 10 Einheiten bestätigt. Jede Probe wurde dann zumindest in dreifacher Ausführung gemessen. Wenn 3 Proben innerhalb von 10% lagen, wurde ihr Mittelwert genommen und dieser Wert als Quantifizierungswert verwendet.
Die fluorimetrisch ermittelte Konzentration wurde dann verwendet, um jede Probe auf 10 ng/μl in ddH₂O zu verdünnen. Dies wurde gleichzeitig an allen Templat-Proben für einen einzigen TaqMan^TM-Plattentest vorgenommen und mit ausreichend Material zur Durchführung von 500–1.000 Tests. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung mit Taqman^TM-Primern und B-Actin- sowie GAPDH-Sonde an einer einzigen Platte mit normaler menschlicher DNA und Kontrollen ohne Templat getestet. Die verdünnten Proben wurden unter der Voraussetzung verwendet, dass der von der Test-DNA subtrahierte Ct-Wert normaler menschlicher DNA +/– 1 Ct betrug. Die verdünnte, chargenqualifizierte genomische DNA wurde in 1 ml-Aliquoten bei –80°C gelagert. Aliquote, die anschließend im Genamplifikationstest zu verwenden waren, wurden bei 4°C gelagert. Jedes 1 ml-Aliquot reicht für 8–9 Platten oder 64 Tests aus.
Genamplifikationstest
Die CT-1-(Cardiotrophin-1-)Verbindungen der Erfindung wurden in den folgenden Primärtumoren gescreent und die resultierenden ΔCt-Werte sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 Screening von DNA58125-ΔCt-Werten in Lungen- und Dickdarm-Primärtumormodellen
CT-1:
CT-1 (Cardiotrophin-1, DNA58125) wurde mit Gerüst- sowie Epizentrum-Kartierung nachgeprüft, und zwar unter Verwendung von aus dem obigen anfänglichen Screening gewählten Tumoren. 3–8 und Tabellen 3–5 stellen die Ergebnisse der Chromosom 16-Kartierung oder Gerüst-Marker in Lungen- und Dickdarmtumoren bereit. Die Gerüst-Marker sind ungefähr alle 20 Megabasen lokalisiert und wurden als Kontrollen zur Ermittlung der Amplifikation verwendet. Tabellen 6–8 und 9–12 zeigen die Ergebnisse der Chromosom 16-Kartierung der Epizentrum-Marker nahe DNA58125.
Tabelle 3 Gerüst-Marker
Die ΔCt-Werte der oben beschriebenen Gerüst-Marker entlang Chromosom 16 im Vergleich zu CT-1 sind für ausgewählte Lungen- und Dickdarmtumoren in Tabelle 4 bzw. 5 angegeben.
Tabelle 4 Amplifikation von Gerüst-Markern im Vergleich zur DNA58125 im Lungentumor
3 und 4 stellen eine dreidimensionale grafische Darstellung der Daten in Tabelle 4, Panel 1 bzw. 2 bereit. Die Lungentumoren sind entlang der x-Achse aufgetragen, die Marker und DNA58125 sind entlang der z-Achse aufgetragen und die relative Amplifikation des Chromosoms 16 in der Region des Markers ist entlang der y-Achse durch die Höhe des Balkens angegeben. 5 ist ein zweidimensionales Balkendiagramm, das die Daten in Tabelle 4 für DNA58125 zusammenfasst und zeigt, dass die für CT-1 kodierende chromosomale DNA in einigen der Lungentumoren amplifiziert ist (mittlere ΔCt-Werte über 1,0 sind einfach unterstrichen und Werte über 2,0 sind doppelt unterstrichen).
Tabelle 5 Amplifikation von Gerüst-Markern im Vergleich zur DNA58125 in Dickdarmtumoren
6 und 7 stellen eine dreidimensionale grafische Darstellung der Daten in Tabelle 5, Panel 1 bzw. 2 bereit. Die Dickdarmtumoren sind entlang der x-Achse aufgetragen, die Marker und DNA58125 sind entlang der z-Achse aufgetragen und die relative Amplifikation des Chromosoms 16 in der Region des Markers ist entlang der y-Achse durch die Höhe des Balkens angegeben. 8 ist ein zweidimensionales Balkendiagramm, das die Daten in Tabelle 5 für DNA58125 zusammenfasst und zeigt, dass die für CT-1 kodierende chromosomale DNA in mehreren der Dickdarmtumoren amplifiziert ist (mittlere ΔCt-Werte über 1,0 sind einfach unterstrichen und Werte über 2,0 sind doppelt unterstrichen).
Tabelle 6 beschreibt die Epizentrum-Marker, die in Verbindung mit CT-1 (DNA58125) eingesetzt wurden. Diese Marker befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur DNA58125 und werden verwendet, um den Amplifikationsstatus der Region von Chromosom 16 festzustellen, in dem sich die DNA58125 befindet. Der Abstand zwischen einzelnen Markern wird in Centi-Rays gemessen, die eine Strahlungsbruchstellen-Einheit ist, die ungefähr einer Bruchwahrscheinlichkeit von 1 zwischen zwei Markern gleichkommt. Ein cR entspricht sehr grob geschätzt 20 Kilobasen. Der Marker SHGC-36123 ist der Marker, von dem gefunden wurde, dass er demjenigen Ort am Chromosom am nächsten steht, an dem DNA58125 am besten mit der Kartierung übereinstimmt. Jedoch versagten die Taqman^TM-Primer und Sonden für SHGC-2726 in unserem Test aufgrund technischer Probleme im Zusammenhang mit der PCR.
Tabelle 6 Epizentrum-Marker
Tabelle 7 gibt die ΔCt-Werte für Ergebnisse der Epizentrum-Kartierung im Vergleich zur DNA58125 in Lungentumoren an, welche die relative Amplifikation in derjenigen Region anzeigen, die sich unmittelbarer am tatsächlichen Ort der DNA58125 entlang Chromosom 16 befindet.
Tabelle 7 Amplifikation von Epizentrum-Markern im Vergleich zur DNA58125 in Lungentumoren
Tabelle 8 gibt die ΔCt-Werte für Ergebnisse der Epizentrum-Kartierung im Vergleich zur DNA58125 in Lungentumoren an, welche die relative Amplifikation in derjenigen Region anzeigen, die sich unmittelbarer am tatsächlichen Ort der DNA58125 entlang Chromosom 16 befindet.
Tabelle 8 Amplifikation von Epizentrum-Markern im Vergleich zur DNA58125 in Dickdarmtumoren
Diskussion
Die ΔCt-Werte für DNA58125 (CT-1) in einer Vielzahl von Lungen- und Dickdarmtumoren sind in den Tabellen 2 (anfängliches Screening), 4 und 5 (welche die Amplifikation mittels Gerüstanalyse im Vergleich zu Markern anderswo am Chromosom 16 zeigen), 7 und 8 (welche die Amplifikation mittels Epizentrum-Analyse im Vergleich zu Markern im chromosomalen Bereich zeigen, wo die DNA58125 lokalisiert ist) sowie in 3–12 angegeben. Ein ΔCt-Wert > 1 (Werte, die einfach unterstrichen sind) wurde typischerweise als Schwellenwert für die Bewertung der Amplifikation verwendet, da dieser Wert eine Verdoppelung der Genkopieanzahl darstellt. Tabelle 4 weist darauf hin, dass eine signifikante Amplifikation von DNA58125 in den Lungen-Primärtumoren LT3, LT12, LT13, LT15, LT17 und LT18 auftrat. Die mittleren ΔCt-Werte für die Lungentumoren waren 1,02, 1,00, 1,33, 1,83, 1,03 bzw. 1,08. Dies stellt einen Anstieg von ungefähr 2,0, 2,0, 2,5, 3,6, 2,0 bzw. 2,1 der Genkopieanzahl für die Lungentumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dar.
Tabelle 5 weist darauf hin, dass eine signifikante Amplifikation von DNA58125 in den Dickdarm-Primärtumoren CloT2, ColT3, ColT8, ColT10, ColT12, ColT14, ColT15, ColT1, ColT4, ColT5, ColT6, ColT11 und ColT18 auftrat. Die mittleren ΔCt-Werte für Dickdarmtumoren waren 2,27, 1,34, 1,23, 1,74, 1,13, 1,74, 1,30, 1,08, 1,13, 2,17, 1,41, 2,24 bzw. 1,04. Dies stellt einen ungefähr 4,8-, 2,5-, 2,3-, 3,3-, 2,2-, 3,3-, 2,5-, 2,1-, 2,2-, 4,5-, 2,6-, 4,7- bzw. 2,0fachen Anstieg der Genkopieanzahl für die Dickdarmtumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dar.
Im Gegensatz dazu werden die bekanntermaßen am nächsten liegenden Marker (Tabellen 7 und 8) nicht stärker amplifiziert als DNA58125. Die Amplifikation derjenigen Marker, die der DNA58125 am nächsten stehen, erfolgt nicht in einem stärkeren Ausmaß als jene der DNA58125. Dies ist ein deutliche Hinweis darauf, dass die DNA58125 jenes Gen ist, das die Ursache für die Amplifikation der speziellen Region am Chromosom 16 ist.
Da die Amplifikation der DNA58125 (CT-1) in verschiedenen Tumoren auftritt, spielt sie wahrscheinlich eine signifikante Rolle bei der Tumorbildung und beim Tumorwachstum. Als Ergebnis kann von Antagonisten (z.B. Antikörpern), die sich gegen das von DNA59125 kodierte Protein richten, erwartet werden, dass sie in der Krebstherapie nützlich sind.
Beispiel 2
In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zum Nachweis und zur Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder Gewebepräparaten. Sie kann beispielsweise zweckdienlich sein, um Orte der Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren, Virusinfektion zu identifizieren und zu lokalisieren, Veränderungen der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomen-Kartierung zu unterstützen.
Die Gewebeverteilung von Cardiotrophin-1 in menschlichem Gewebe wurde untersucht in der zugehörigen US-Anmeldung 08/286.304, angemeldet am 5. August 1994, nunmehr US-Patent Nr. 5.571.893, erteilt am 5. November 1996, hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen. Derartige Untersuchungen werden auch von D. Pennica et al., Cytokine 8(3), 183–9 (1996) beschrieben, die hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen ist. Poly (A)⁺RNA aus mehreren adulten menschlichen Geweben wurde unter Verwendung einer Sonde aus Maus-CT-1-cDNA-Klonen gescreent. Blot-Hybridisierung mit einer 180 bp-Maus-CT-1-Sonde (erstreckend von 19 bp 5' des initiierenden ATG zur Aminosäure 50) in 20% Formamid, 5 × SSC bei 42°C mit einem letzten Waschvorgang in 0,25 × SSC bei 52°C. Von einer 1,7 kb-CT-1-mRNA wurde gezeigt, dass sie im adulten menschlichen Herzen, Skelettmuskel, Eierstock, Dickdarm, Prostata und Hoden und in der fötalen Niere und Lunge exprimiert wird.
Die In-situ-Hybridisierung kann auch nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994) unter Verwendung von PCR-erzeugten ³³P-markierten Ribosonden durchgeführt werden. Zusammenfassend werden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebe geschnitten, vom Paraffin befreit, in Proteinase K (20 g/ml) für 15 Minuten bei 37°C deproteiniert und wie von Lu und Gillett, s.o., beschrieben für die In-situ-Hybridisierung weiterverarbeitet. Eine [³³P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde wird aus einem PCR- Produkt erzeugt und bei 55°C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger werden in Kernemulsion Kodak NTB2 getaucht und für 4 Wochen exponiert.
³³P-Ribosondensynthese
6,0 μl (125 mCi) ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2.000 Ci/mmol) wurden mittels Speed-Vac getrocknet.
Jedem Röhrchen, das getrocknetes ³³P-UTP enthielt, wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
2,0 μl 5 × Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM : 10 μl; jeweils 10 mM GTP, CTP und ATP +10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. 1,0 μl RQ1-DNase wurden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 15 Minuten. 90 μl TE (Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) wurden zugegeben und das Gemisch auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde auf eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit geladen und unter Verwendung von Programm 10 (6 Minuten) zentrifugiert. Die Filtrationseinheit wurde über ein zweites Röhrchen invertiert und unter Verwendung von Programm 2 (3 Minuten) zentrifugiert. Nach der letzten Zentrifugation zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugegeben. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde an einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde oder 5 μl RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugegeben. Nach dem Erhit zen in einem Heizblock bei 95°C für drei Minuten wurde das Gel sofort auf Eis gegeben. Die Näpfe des Gels wurden gespült, die Probe aufgegeben und bei 180–250 Volt für 45 Minuten laufen gelassen. Das Gel wurde in PVD-Folie eingewickelt und bei –70°C im Gefrierschrank für eine Stunde bis über Nacht einem XAR-Film mit einer Verstärkerfolie exponiert.
³³P-Hybridisierung
Vorbehandlung gefrorener Schnitte. Die Objektträger wurden dem Gefrierschrank entnommen, auf Aluminiumschalen gelegt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten aufgetaut. Die Schalen wurden für 5 Minuten bei 55°C in einen Inkubator gelegt, um die Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden für 10 Minuten in 4% Paraformaldehyd auf Eis in einem Abzug fixiert und in 0,5 × SSC für 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H₂O). Nach Deproteinierung in 0,5 μg/ml Proteinase K für 10 Minuten bei 37°C (12,5 μl einer Stammlösung mit 10 mg/ml in 250 ml vorgewärmtem RNase-freiem RNAse-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC für 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden für jeweils 2 Minuten in 70%, 95%, 100% Ethanol entwässert.
Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten. Die Objektträger wurden vom Paraffin befreit, in SQ-H₂O gegeben und zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten gespült. Die Schnitte wurden in 20 μg/ml Proteinase K (500 μl einer Lösung mit 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37°C, 15 Minuten) deproteiniert – menschlicher Embryo, oder 8 × Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37°C, 30 Minuten) – Formalingewebe. Anschließendes Spülen in 0,5 × SSC und Entwässerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Vorhybridisierung. Die Objektträger wurden in einer mit Box-Puffer (4 × SSC, 50% Formamid) – gesättigtes Filterpapier ausgekleideten Kunststoffbox ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H₂O) bedeckt, gevortext und in einer Mikrowelle für 2 Minuten mit gelockerten Kappen erhitzt. Nach Abkühlen auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H₂O zugegeben, das Gewebe gut gevortext und bei 42°C für 1–4 Stunden inkubiert.
Hybridisierung. 1,0 × 10⁶ cpm Sonde und 1,0 μl tRNA 850 mg/ml Stammlösung) je Objektträger wurden bei 95°C für 3 Minuten erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis gekühlt und es wurden 48 μl Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen wurden 50 μl ³³P-gemisch zu 50 μl Vorhybridisierung am Objektträger zugegeben. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55°C inkubiert.
Waschungen. Das Waschen wurde für 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur durchgeführt (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f = 4 l), gefolgt von RNase-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten (500 μl einer Lösung von 10 mg/ml in 250 ml RNase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringenz-Waschbedingungen waren die folgenden: 2 Stunden bei 55°C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f = 4 l).
Beispiel 3
Verwendung von CT-1 als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für ein CT-1-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, welche die kodierende Sequenz des CT-1 voller Länge oder reifen CT-1 umfasst (wie in 1 dargestellt, Seq.-ID Nr. 1 und 2), wird als Sonde eingesetzt, um auf homologe DNAs (wie z.B. jene, die für natürlich vorkommende Varianten von CT-1 kodieren) in menschlichen cDNA-Bibliotheken oder menschlichen genomischen Gewebe-Genom-Bibliotheken zu screenen.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die eine der beiden Bibliothek-DNAs enthalten, wird unter den folgenden Stringenzbedingungen durchgeführt. Die Hybridisierung der radioaktiv markierten, von CT-1 hergeleiteten Sonde an die Filter wird in einer Lösung von 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C für 20 Stunden durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs, welche die gewünschte Sequenzidentität mit der für das Nativsequenz-CR-1 voller Länge kodierenden DNA aufweisen, können dann unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
Beispiel 4
Expression von CT-1 in E. coli
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form von CT-1 mittels rekombinanter Expression in E. coli.
Die für CT-1 kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen aufweisen, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren eingesetzt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (aus E. coli stammend; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor wird vorzugsweise Sequenzen umfassen, die für eine Antibiotikum-Resistenzgen-, eine trp-Promotor-, eine Polyhis-Leader-(einschließlich die ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle)Sequenz, die für CT-1 kodierende Region, Lamda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen kodieren.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen und es werden dann Antibiotika-resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigmedium, wie z.B. mit Antibiotika ergänzter LB-Bouillon gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur größeren Maßstabs zu inokulieren. Die Zellen werden dann auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das mittels Zentrifugation erlangte Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden und das solubilisierte Protein kann dann unter Verwendung einer metallchelatierenden Säule unter Bedingungen gereinigt werden, welche die feste Bindung des Proteins ermöglichen.
CT-1 wird in E. coli unter Verwendung des folgenden Verfahrens in poly-His-markierter Form exprimiert. Die für CT-1 kodierende DNA wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere zweckdienliche Sequenzen, die für eine effiziente und verlässliche Translationsinitiation, schnelle Reinigung an einer metallchelatierenden Säule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der dann verwendet wird, um einen auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpTrs) clpP(lacIq)) basierenden E.-coli-Wirt zu transformieren. Transformanten werden zuerst in 50 mg/ml Carbenicillin enthaltendem LB bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O. D. 600 von 3–5 erreicht ist. Die Kulturen wurden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)SO₄, 0,71 g Natriumcitrat·2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser, sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und für ungefähr 20–30 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Es werden Proben entnommen, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren und der Hauptanteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus Fermentationen von 0,5 bis 1 l (6–10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH8, resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat werden zugegeben, bis eine Endkonzentration von 0,1 M bzw. 0,02 M erreicht ist und die Lösung über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt resultiert in einem denaturierten Protein, bei dem alle Cysteinreste durch Sulfitolierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 Upm in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3–5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und zur Klärung durch 0,22-μm-Filter filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine im Metallchelatsäulenpuffer äquilibrierte 5 ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule aufgegeben. Die Säule wird mit weiterem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität), pH 7,4 enthält. Das Protein wird mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Das gewünschte Protein enthaltende Fraktionen werden vereinigt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch Absorption bei 280 nm unter Verwendung des auf Basis seiner Aminosäuresequenz berechneten Extinktionskoeffizienten abgeschätzt.
Die Proteine werden neu gefaltet, indem die Probe langsam in frisch hergestelltem Neufaltungspuffer verdünnt wird, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht. Neufaltungs-Volumina werden so gewählt, dass die Protein-Endkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird bei 4°C für 12–16 Stunden sanft gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch Zugabe von TFA auf eine Endkon zentration von 0,4% (pH von ungefähr 3) gequencht. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und es wird Acetonitril auf eine Endkonzentration von 2–10% zugegeben. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1% TFA mit Elution mit einem Gradienten von Acetonitril von 10 bis 80% chromatographiert. Aliquote von Fraktionen mit A₂₈₀-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden vereinigt. Im Allgemeinen werden die richtig gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitril-Konzentrationen eluiert, da jene Spezies die kompaktesten sind und ihr hydrophober Innenbereich von der Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zur Auftrennung fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, welche die gewünschten gefalteten CT-1-Proteine enthalten, werden vereinigt und das Acetonitril mit einem leichten, auf die Lösung gerichteten Stickstoffstrom entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4% Mannit mittels Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von in Formulierungspuffer äquilibrierten G25 Superfine-(Pharmacia)Harzen formuliert und sterilfiltriert.
Beispiel 5
Expression von CT-1 in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form von CT-1 mittels rekombinanter Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird die CT-1-DNA in pRK5 mit gewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der CT-1-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie z.B. jenen, die in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird pRK5-CT-1 genannt.
In einer der Ausführungsformen können die gewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in Medium, wie z.B. in mit fötalem Kälberserum und, gegebenenfalls, mit Komponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM zur Konfluenz gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-CT-1-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), vermischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 M EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugegeben und die Bildung eines Präzipitats für 10 Minuten bei 25°C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und den 293-Zellen zugegeben und für etwa vier Stunden bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt und es werden 2 ml 20%iges Glycerin in PBS für 30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, es wird frisches Medium zugegeben und die Zellen für ungefähr 5 Tage inkubiert.
Ungefähr 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium ersetzt, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält.
Nach einer Inkubation für 12 Stunden wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine gewählte Zeitspanne einem Film exponiert werden, um die Gegenwart von CT-1-Protein zu offenbaren. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und das Medium in gewählten Biotests getestet werden.
In einer alternativen Technik kann CT-1-DNA unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981) beschriebenen Dextransulfat-Verfahrens vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Zentrifugenflasche auf maximale Dichte gezüchtet und es werden 700 μg pRK-CT-1-DNA zugegeben. Die Zellen werden zuerst mittels Zentrifugation aus der Zentrifugenflasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet für vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin für 90 Sekunden behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthaltende Zentrifugenflasche eingebracht. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die exprimiertes CT-1 enthaltende Probe kann dann mit jeglichem gewählten Verfahren, wie z.B. Dialyse und/der Säulechromatographie gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann CT-1 in CHO-Zellen exprimiert werden. Der pRK5-CT-1-Vektor kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium ersetzt werden, das einen radioaktiven Marker, wie z.B. ³⁵S-Methinon enthält. Nach der Ermittlung der Gegenwart des CT-1-Polypeptids kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen für etwa 6 Tage inkubiert und dann das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte CT-1 enthaltende Medium kann dann mit jeglichem gewählten Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitop-markiertes CT-12 kann ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das CT-1 kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR unterzogen werden, um In-frame mit einem gewählten Epitop-Marker, wie z.B. einem poly-His-Marker in einem Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte CT-1-Insert kann dann in einem SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-angetriebenen Vektor (wie oben beschrieben) transfiziert werden. Die Markierung kann wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das das poly-His-markierte CT-1 enthaltende Kulturmedium kann dann mit jeglichem gewählten Verfahren, wie z.B. Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie konzentriert und gereinigt werden.
CT-1 wurde sowohl durch ein vorübergehendes, als auch durch ein stabiles Expressionsverfahren exprimiert. Die stabile Expression in CHO-Zellen wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazellulären Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Sequenz der konstanten Region fusioniert waren, welche die Gelenk-, CH2- und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist.
Nach der PCR-Amplifikation wird die DNA58125 in einem CHO-Expressionsvektor subkloniert, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997) beschrieben sind. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, das sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um das zweckmäßige Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Die Vektor-Expression erfolgt wie in Lucas er al., Nucl. Acids Res. 24, 9 (1774–1779 (1996) beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression der cDNA von Interesse und Dihydrofolatreductase (DHFR) anzutreiben. Die DHFR-Expression erlaubt die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids nach der Transfektion.
Zwölf Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA wurden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Quiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Böhringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen wurden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Ungefähr 3 × 10⁷ Zellen werden für die unten beschriebene weitere Züchtung und Produktion in einer Ampulle eingefroren.
Die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen wurden aufgetaut, indem sie in ein Wasserbad gestellt und mittels Vortex gemischt wurden. Die Inhalte wurden in ein 10 ml Medium enthaltendes Zentrifugenröhrchen pipettiert und bei 1.000 Upm für 5 Minu ten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 10 ml Selektivmedium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertes fötales Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in eine 100 ml-Zentrifugenflasche aliquotiert, die 90 ml Selektivmedium enthielt. Nach 1–2 Tagen wurden die Zellen in eine mit 150 ml Selektivwachstumsmedium gefüllte 250 ml-Zentrifugenflasche überführt und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen wurde eine 250 ml-, 500 ml- und 2.000 ml-Zentrifugenflasche mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wurde mittels Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium durch frisches Medium ausgetauscht. Obgleich jegliches geeignete CHO-Medium eingesetzt werden kann, wurde tatsächlich ein im am 16. Juni 1992 erteilten US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenes Produktionsmedium verwendet. Eine 3 l-Produktionszentrifugenflasche wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. Am Tag 0 wurden Zellzahl und pH bestimmt. Am Tag 1 wurden der Zentrifugenflasche Proben entnommen und die Belüftung mit filtrierter Luft begonnen. Am Tag 2 wurden der Zentrifugenflasche Proben entnommen, die Temperatur auf 33°C umgestellt und 30 ml einer Lösung von 500 g/l Glucose und 0,6 ml 10% Antischaum (z.B. 35% Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) zugegeben. Während der gesamten Produktionszeit wurde der pH wie erforderlich eingestellt, um einen pH von etwa 7,2 aufrecht zu erhalten. Nach 10 Tagen oder wenn die Lebensfähigkeit auf unter 70% sank, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugation und Filtration durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C gelagert oder sofort zur Reinigung auf Säulen aufgegeben.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration on 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine Ni-NTA-Säule gepumpt, die mit 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem, 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das höchst gereinigte Protein wurde anschließend mit einer G25 Superfine-(Pharmacia)Säule in Lagerungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8 enthielt und bei –80°C gelagert.
CT-1 kann ebenso durch vorübergehende Expression in COS-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken produziert werden.
Beispiel 6
Expression von CT-1 in Hefe
Das folgende Beispiel beschreibt die rekombinante Expression von CT-1 in Hefe.
Zuerst werden Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von CT-1 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. Für CT-1 kodierende DNA58125 und der Pomotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen in das gewählte Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression von CT-1 zu steuern. Zur Sekretion kann für CT-1 kodierende DNA gemeinsam mit für der für ADH2/GAPDH-Promotor kodierenden DNA, einem CT-1-Signalpeptid oder einem anderen Säugetier-Signalpeptid oder beispielsweise einer Hefe-Alpha-Faktor- oder Invetase-Sekretionssignal-/Leader-Sequenz und Linkersequenzen (falls benötigt) zur Expression von CT-1 in das gewählte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in gewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die Überstände der transformierten Hefen können mittels Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von der Färbung der Gele mit Coomassieblau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes CT-1 kann anschließend durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifugation und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Verwendung gewählter Kartuschenfilter isoliert und gereinigt werden.
Das CT-1 enthaltende Konzentrat kann unter Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze weiter gereinigt werden.
Beispiel 7
Expression von CT-1 in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante CT-1-Expression in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Die für CT-1 kodierende Sequenz wird stromauf eines Epitop-Markers, der in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Derartige Epitop-Marker umfassen poly-His-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Zusammenfassend wird die für CT-1 oder den gewünschten Abschnitt der kodierenden Sequenz von CT-1 (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz oder die für das reife Protein kodierende Sequenz, falls das Protein extrazellulär ist) kodierende Sequenz mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen beinhalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Ein rekombinanter Baculovirus wird durch Co-transfizieren des obigen Plasmids und der BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel erhältlich von GIBCO-BRL) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford, Oxford University Press (1994) beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-His-markiertes CT-1 kann dann beispielsweise wie folgt mittels Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Es werden Extrakte aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993) beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal für 20 Sekunden auf Eis beschallt. Die beschallten Proben werden mittels Zentrifugation geklärt und der Überstand 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-Agarosesäule (im Handel erhältlich von Quiagen) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 20 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird bis zur Basislinien-A₂₈₀ mit Beladungspuffer gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt das Fraktionensammeln begonnen wird. Als nächstes wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, wodurch unspezifisch gebundenes Protein eluiert wird. Nach dem neuerlichen Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem 0→500 mM Imidazol-Gradienten im zweiten Waschpuffer entwickelt. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA-konjugierter Alkalischer Phosphatase (Quiagen) analysiert. Fraktionen, die eluiertes, His₁₀-markiertes CT-1 enthalten, werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert. Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) CT-1 unter Verwendung bekannter Chromatographietechniken durchgeführt werden, die beispielsweise Protein A- oder Protein G-Chromatographie umfassen.
Obwohl die CT-1-Expression in einem Maßstab von 0,5 bis 2 l durchgeführt wird, kann sie leicht in einem größeren Maßstab für größere (z.B. 8 l) Präparate durchgeführt werden. CT-1 wird außerdem als IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, bei dem die extrazelluläre Proteinregion an eine IgG1-Sequenz der konstanten Region fusioniert ist, welche die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen enthält, und/oder als poly-His-markierte Formen.
Nach der PCR-Amplifikation wird die kodierende Sequenz in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-His-markierte Proteine) subkloniert und der Vektor und BaculoGold^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) werden in 105 Spondoptera frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) co-transfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen) mit modifizierten Polylinker-Regionen, die His- oder Fc-Marker-Sequenzen umfassen. Die Zellen werden in Hink-TNM-FH-Medium gezüchtet, das mit 10% FBS (Hyclone) ergänzt ist. Die Zellen werden für 5 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und anschließend für die erste virale Amplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in mit 10% FBS ergänztem Hink-TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen werden für 3 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor ermittelt, und zwar mittels Chargen-Bindung von 1 ml Überstand an 25 ml NI-NTA-Perlen (Qiagen) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse und Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Färbung.
Der Überstand der ersten viralen Amplifikation wird verwendet, um eine Zentrifugenflaschen-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten Sf9-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen werden für 3 Tage bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und filtriert. Die Chargen-Bindungs- und SDS-PAGE-Analyse wird wie erforderlich wiederholt, bis die Expression der Zentrifugenflaschen-Kultur bestätigt ist.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,3 bis 3 l) wird zur Entfernung der Zellen mittels Zentrifugation geerntet und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte werden die Proteinkonstrukte mittels Ni-NTA-Säule (Quiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6 ml Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem, 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war. Nach der Beladung wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend mit einer G25 Superfine-(Pharmacia)Säule von 25 ml in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 8, enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin-(Fc enthaltende)Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5 ml-Protein A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wird durch Sammeln von 1 ml-Fraktionen in 275 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthaltende Röhrchen sofort neutralisiert. Das höchst gereinigte Protein wird anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität der Proteine wird mittels SDS-PAGE und N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
Beispiel 8
Herstellung von Antikörpern, die CT-1 binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch CT-1 binden können.
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes CT-1, CT-1 enthaltende Fusionsproteine und Zellen, die rekombinantes CT-1 an der Zelloberfläche exprimieren. Die Wahl des Immunogens kann vom geübten Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren erfolgen.
Mäuse, wie z.B. BAIb/c, werden mit dem in Freund'schem Adjuvans emulgierten CT-1-Immunogen immunisiert und in einer Menge von 1–100 Mikrogramm subkutan oder intraperitoneal injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Namilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem, im gewählten Adjuvans emulgierten Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse außerdem für mehrere Wochen mit weiteren Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Es können von den Mäusen mittels retroorbitaler Blutabnahme periodisch Serumproben zur Testen in ELISA-Tests erhalten werden, um Anti-CT-1-Antikörper nachzuweisen.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen worden ist, kann den auf Antikörper „positiven" Tieren eine letzte intravenöse Injektion von CT-1 injiziert werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol) mit einer gewählten Maus-Myelom-Zelllinie, wie z.B. P3X63AgU.1, erhältlich von ATCC, Nr. CRL 1597, fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden können, die HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)Medium enthalten, um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Hybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen CT-1 gescreent. Die Ermittlung „positiver" Hybridomzellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen CT-1 sekretieren, ist von Fachleuten durchführbar.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-CT-1-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie erzielt werden. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung von Antikörper an Protein A oder G eingesetzt werden.
Hinterlegung von Material
Das folgende Material, ein für CT-1 kodierendes Plasmid (offenbart in US-Patent Nr. 5.571.893, erteilt am 5. November 1996), ist bei der American Type Culture Collection, 10801 University Bvld., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapest-Übereinkommen) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATTC unter den Bedingungen des Budapest-Übereinkommens zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gehörenden Regeln des Bevollmächtigten ermächtigt ist (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638).
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benach richtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die vorangehende, niedergeschriebene Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte Konstrukt in seinen Ansprüchen nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Zugeständnis dar, dass die hierin enthaltende niedergeschriebene Beschreibung unzulänglich ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsart davon zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie darstellt. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.

Claims

Verfahren zur Diagnose von Tumoren bei Säugetieren, umfassend die Detektion der Amplifikation und/oder des Niveaus der Expression eines Gens, das für ein Cardiotrophin-1-(CT-1-)Polypeptid kodiert, (a) in einer Testprobe von vom Säugetier erhaltenen Gewebezellen und (b) in einer Vergleichsprobe bekannter, normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin Genamplifikation und/oder ein höheres Expressionsniveau in der Testprobe auf die Gegenwart eines Tumors im Säugetier, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden, hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amplifikation und/oder das Niveau der Expression unter Verwendung einer markierten Nucleinsäuresonde, basierend auf der Sequenz aus 1, nachgewiesen wird.
Verfahren zur Diagnose von Tumoren bei Säugetieren, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-CT-1-Antikörpers mit einer Testprobe der vom Säugetier erhaltenen Gewebezellen und (b) die Detektion der Bildung eines Komplexes zwischen dem Anti-CT-1-Antikörper und einem CT-1-Polypeptid in der Testprobe.
Verfahren nach Anspruch 3, das unter Vergleich mit der Beobachtung der Komplexbildung in einer Vergleichsprobe bekannter, normaler Gewebezellen desselben Zelltyps durchgeführt wird, worin eine größere Menge an in der Testprobe gebildeten Komplexen auf die Gegenwart eines Tumors im Säugetier, von dem die Testgewebezellen erhalten wurden, hinweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Testprobe von einem Individuum erhalten wird, von dem angenommen wird, dass es neoplastische(s) Zellwachstum oder -vermehrung aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Tumor ein Lungen-, Dickdarm- oder Brustkarzinom ist.
Verwendung eines Mittels, das die Expression und/oder Aktivität eines CT-1-Polypeptids hemmt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die Behandlung einem Lungen-, Dickdarm- oder Brustkarzinom gilt.
Verwendung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin das Mittel entweder (i) ein Anti-CT-1-Antikörper oder (ii) eine Nucleinsäure ist, die ein Antisense-, Ribozym- oder Tripelhelix-Molekül ist.