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DE60019948T2 - Humanin, ein Polypeptid, welches neuronales Absterben unterdrückt - Google Patents

Humanin, ein Polypeptid, welches neuronales Absterben unterdrückt Download PDF

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DE60019948T2
DE60019948T2 DE60019948T DE60019948T DE60019948T2 DE 60019948 T2 DE60019948 T2 DE 60019948T2 DE 60019948 T DE60019948 T DE 60019948T DE 60019948 T DE60019948 T DE 60019948T DE 60019948 T2 DE60019948 T2 DE 60019948T2
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polypeptide
death
cells
neuronal
cell
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Ikuo Nishimoto
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Original Assignee
Keio University
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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, welche Neuronen gegen Zelltod, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung, schützen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Alzheimer-Erkrankung (Alzheimer's Erkrankung, AD) ist die derzeit am aktivsten untersuchte neurodegenerative Erkrankung. Alzheimer wird klinisch charakterisiert durch progressive Amnesie und kognitive Schädigung sowie pathologisch charakterisiert durch einen weiten Bereich an neuronalem Verlust, intraneuronalen Tangles und extrazellulären Senilplaquen, welche einen kongophilen dichten Kern aufweisen. Effektive Behandlung für AD existiert bislang immer noch nicht. Es ist im Allgemeinen akzeptiert, dass nicht alle aber viele der klinischen Manifestationen dieser Erkrankung durch progressives neuronales Absterben erklärt werden. Die Erläuterung von pathologischen Mechanismen des Einschalten des neuronalen Absterbens in AD, um AD zu verhindern, ist essenziell für die Entwicklung neuer effektiver Behandlungen für AD.
  • Von vier verschiedenen Gruppen von mutierten Genen ist bekannt, dass sie das frühe Anschalten familiärer AD (FAD) verursachen: V642I/F/GAPP (die Zahl repräsentiert die Position in APP695, ein APP, das aus 695 Aminosäuren besteht); K595N/M596L APP (NL-APP); Präsenilin (PS)-1-Mutanten; und PS-2-Mutanten (Shastry, B. S. und Giblin, F. J. (1999) Brain Res. Bull. 48, 121–127). Yamatsuji et al. schlugen vor, dass diese FAD-Gene das Zell-Absterben von Neuronen verursachen könnten, basierend auf der Beobachtung der Nervenzell-Linie F11, in welcher drei V642-Typ cDNA Mutanten von APP vorübergehend exprimiert wurden (Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349–1352). Das Ergebnis wurde auch bestätigt durch Experimente, welche in primär kultivierte Neuronen und andere Nervenzell-Linien verwendet wurden. (Zhao, B. et al. (1997) J. Neurosci. Res. 47, 253–263; Luo, J. J. et al. (1999) J. Neurosci. Res. 55, 629–42). Des Weiteren brachten Wolozin et al. zu Tage, dass die FAD-verknüpfte Mutante N141I PS-2 signfikant die Zell-Mortalität in PC12-Zellen verstärkt und dass die FAD-verknüpfte Mutante PS-1 Apoptose in T-Lymphozyten induziert (Wolozin, B. et al. (1996) Science 274, 1710–1713; Wolozin, B. et al. (1998) Neurobiol. Aging 19, S23–27). Des Weiteren wurde mit Bezug auf PS-1 verstärkte Sensitivität gegen neuronales Absterben, induziert durch Aβ-Addition und/oder Defizienz trophischer Faktoren aufgrund der Expression der PS-1-Mutante beobachtet (Guo, Q. et al. (1996) Neuroreport 8, 379–83; Zhang, Z. et al. (1998) Nature 395, 698–702; Guo, Q. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96., 4125–30) und verstärkte Sensitivität gegen neuronales Absterben durch Defizienz trophischer Faktoren in kultivierten kortikalen Neuronen, abgeleitet von transgenen Ratten, welche Wildtyp PS-1 überexprimierten, im Vergleich mit denjenigen in nicht-transgenen Kontrollen (Czech, C. et al. (1998) Neuroscience 87, 325-36); und solche Beobachtungen wurden wiederholt getätigt. Obwohl es kontrovers ist, ob das mutierte PS-1 ein Stimulationsfaktor des neuronalen Absterbens ist oder keinen Effekt auf das neuronale Absterben aufweist (Weihl, C. C. et al. (1999) J. Neurosci. 19, 5360–9; Bursztajn, S. et al. (1998) J. Neurosci. 18, 9790–9) ist es stark möglich, dass alle vier Typen von bekannten FAD-Genen (V642-Typ Mutante APP, NL-APP, PS-1-Mutante und PS-2-Mutante) neuronales Absterben amplifizieren oder die Verletzlichkeit der Neuronen gegenüber anderen Stimuli für Zell-Absterben unter bestimmten Bedingungen verstärken. Folglich wird nahegelegt, dass das Auffinden von Molekülen, welche das AD-Gen-induzierte Zell-Absterben unterdrücken, das in Neuronen beobachtet wird, der wichtigste Schlüssel zur Entwicklung von Verfahren zur Behandlung von AD ist.
  • WO98/15179 offenbart die therapeutische Anwendung von Laminin, einem Polypeptid, welches mit β-Amyloidprotein interagiert und die Amyloid-Fibrillen-Ausbildung inhibiert.
  • WO97/27296 offenbart Nukleinsäuren und Proteine, die mit Alzheimer-Erkrankung assoziiert sind und Verfahren zum Nachweisen und zur Diagnose der gleichen Erkrankung.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Polypeptide zur Verfügung zu stellen, welche Neuronen gegenüber Zell-Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung schützen und die Verwendung dergleichen.
  • Der vorliegende Erfinder hat bereits früher eine Nerv-Zellinie (F11/EcR/V642I) etabliert, welche induktiv die familiäre Alzheimer-Erkrankungs-Typ-Mutante V642I amyloider Vorläufer-Proteine (V642I APP)(siehe internationale Veröffentlichungsnummer WO00/14204) exprimieren. Demgemäß wird das System V642I APP in F11-Neuronen als Antwort auf Ekdysonbehandlung exprimiert. Zell-Absterben trat in beinahe allen der F11/EcR/V642I-Zellen, inkubiert mit Ekdyson für 2 bis 3 Tage auf; wohingegen Zell-Absterben nur in wenigen Zellen der Kontroll-Inkubation auftrat. Der vorliegende Erfinder verwendete die F11/EcR/V642I-Zellen zur Suche nach Genen, welche als Antagonisten von V642I APP-induziertem neuronalem Absterben fungieren.
  • Genauer gesagt wurde eine cDNA-Bibliothek konstruiert aus dem Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung (AD) und wurde in die F11/EcR/V642I-Zellen, wie oben erwähnt, transfiziert. Anschließend wurde eine Absterben-Fallen-Screening-Operation wiederholt durchgeführt um Zellen auszuwählen, welche das neuronale Absterben, induziert durch V642I APP, überlebten. Als ein Ergebnis gelang es dem vorliegenden Erfinder, ein neues Gen zu identifizieren, welches Zellen gegen neuronales Absterben, induziert durch V642I APP, schützt. Es wurde zutage gefördert, dass der Klon mit dem Namen Humanin (HN) cDNA, kodierend für ein neues Polypeptid von 24 Aminosäuren, neuronales Absterben, assoziiert mit AD, unterdrückt. Das heißt, der Klon unterdrückte neuronales Absterben, induziert durch alle der bekannten Typen des frühen Anschaltens familiärer AD Gene [V642I APP, K595N/M596L APP, M146L Presenilin (PS)-1 und N141I PS-2] und durch Aβ1-43. Im Gegensatz dazu zeigte der Klon keinen Effekt auf die Neurotoxizität von Polyglutamin-Repeat Q79, assoziiert mit Huntington-Erkrankung (Huntington's desease, HD)/spinozerebellarer Ataxie (spinozerebellar Ataxia, SCA); und Mutanten von Cu/Zn-abhängiger Superoxid-Dismutase (Cu/Zn dependent superoxide dismutase, SOD1), assoziiert mit amyotropher lateraler Sklerose (ALS). HN-mRNA wurde in erster Linie in verschiedenen Organen exprimiert, welche verschieden vom Zentralen Nervensystem waren. Die Transfektion von HN-cDNA in Neuronen führte zur Transkription und Produktion der erwarteten Peptide, wobei die Peptide in das Kultivierungs-Medium sekretiert wurden bis zu einem Spiegel von ungefähr 10 μM. Der Kultivierungs-Überstand war aktiv genug, um signifikanten Schutz der Zellen gegen neuronales Absterben, induziert durch V642I APP, zu demonstrieren. Synthetisches HN-Polypeptid zeigte auch neuroschützende Wirkung mit ähnlichen Dosis-Antwort-Eigenschaften gegen die vier Typen von AD-Genen und ihre Unterdrückung war maximal bei 1 bis 10 μM. Polypeptide, exprimiert innerhalb von Neuronen mit einer cDNA, kodierend ein HN-Derivat, welches keine Sekretionsfähigkeit zeigten, konnten Neuronen gegen das Zell-Absterben nicht schützen. Jedoch zeigte das gleiche Polypeptid synthetisiert und zugegeben zum Kultivierungs-Medium schützende Wirkweise, wobei diese Resultate zeigen, dass das HN-Polypeptid von außerhalb auf die Zellen einwirkt. Cys an Position 8 und Ser an Position 14 wurden als entscheidend gemäß eines Experiments, welches die Aktivität von Polypeptiden mit modifizierter Struktur nachwies, herausgefunden. C8A-Substitution entzog dem Polypeptid vollständig die Zell-Absterben-rettende Aktivität. Auf der anderen Seite verstärkte S14G-Substitution merklich die rettende Aktivität des Polypeptids. S14G HN-Polypeptide (HNG) zeigten vollständig schützende Wirkungsweise gegen alle der vier Typen von FAD-Genen bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen (1 bis 10 nM). Anti-AD-Aktivität von HN wurde auch in primären, kultivierten, kortikalen Neuronen beobachtet. Genauer gesagt schützen μM-Spiegel von HN und nM-Spiegel von S14G-Derivaten (HNG) Zellen gegen Zell-Absterben und Zellschädigung, verursacht durch Aβ, wohingegen C8A (HNA) keine solche Aktivität zeigte. Des Weiteren wurden nach Analyse eines detaillierten Struktur-Funktions-Zusammenhangs Aminosäuren von Pro an Position 3 bis Pro an Position 19 als wichtig für die neuroschützende Funktion identifiziert, und unter diesen wurden sieben Reste identifiziert als essenzielle Reste für die Aktivität. Darüber hinaus könnte die C8-Aminosäure von S14G HN-Polypeptid (HNG) mit basischen Aminosäuren substituiert werden, wie z.B. His, Arg oder Lys, während seine Anti-AD-Aktivität beibehalten wurde. Des Weiteren hat der vorliegende Erfinder erfolgreich realisiert, die neuroschützende Wirkweise durch das Einführen von zwei Aminosäuremutationen in das S14G HN-Polypeptid zu verstärken. Basierend auf diesen Ergebnissen ist es möglich, Polypeptide zu entwickeln, welche höhere Aktivität aufweisen und welche geeignet sind zur biologischen Verabreichung. Die Polypeptide öffnen einen neuen Weg, therapeutische Wirkstoffe für AD zu entwickeln und man erwartet zur gleichen Zeit von ihnen, dass sie in starkem Maße beitragen werden, eine AD-Therapie zu entwickeln, welche auf den Schutz von Neuronen gegen zelluläres Absterben zielt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, welche Zellen gegen neuronales Absterben, assoziiert mit AD, schützen sowie die Verwendung der gleichen. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung folgendes:
    • (1) ein Polypeptid, welches neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung unterdrückt mit einer Aminosäuresequenz von Formel (I): Pro-(Xaa)3-5-(Cys/bXaa)-(Leu/Arg)-(Xaa)1-3Leu-Thr-(Gly/Ser)-(Xaa)3-5-Pro (I),wobei "Cys/bXaa" Cys oder eine basische Aminosäure anzeigt; "(Leu/Arg)" Leu oder Arg anzeigt; "(Gly/Ser)" Gly oder Ser anzeigt; und (Xaa)3-5 und (Xaa)1-3 unabhängig voneinander 3 bis 5 zufällige Aminosäurereste bzw. 1 bis 3 zufällige Aminosäurereste anzeigen;
    • (2) ein Polypeptid gemäß (a) oder (b), wie unten gezeigt:
    • (a) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NRN: 5 bis 8, 10, 12, 13, 20 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60;
    • (b) ein Polypeptid, welches neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung unterdrückt, mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRN: 5 bis 8, 10, 12, 13, 20 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60, wobei eine bis acht Aminosäuren substituiert wurden durch konservative Substitution;
    • (3) das Polypeptid von (2), welches verwendet wird zur Unterdrückung von neuronalem Absterben;
    • (4) ein Fusions-Polypeptid, umfassend das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (2), fusioniert mit anderen Polypeptiden;
    • (5) ein DNA, kodierend das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4);
    • (6) einen Vektor, in welchen die DNA von (5) insertiert wird;
    • (7) eine Wirtszelle, welche den Vektor von (6) beherbergt;
    • (8) ein Verfahren zur Erzeugung des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4), umfassend die Schritte des Kultivierens der Wirtszellen von (7) und des Wiedergewinnens des exprimierten Polypeptids aus der Wirtszelle oder des Kultivierungs-Überstandes davon;
    • (9) ein in-vitro-Verfahren zum Unterdrücken von neuronalem Absterben, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens einer neuronale Zelle mit dem Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4);
    • (10) ein Verfahren zum Nachweis einer Zell-Absterben-unterdrückenden Aktivität des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4), umfassend die Schritte von:
    • (a) Induzieren des Zelltods in der Gegenwart des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4); und
    • (b) Nachweis des Grades des Zell-Absterbens;
    • (11) ein Verfahren zum Nachweis des Effekts einer chemischen Verbindung, auf die neuronales Absterben unterdrückende Aktivität eines Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4), umfassend die Schritte von:
    • (a) Induzieren des neuronalen Absterbens in der Gegenwart einer Testverbindung und des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4); und
    • (b) Nachweis des Grades des neuronalen Absterbens;
    • (12) ein Verfahren zum Screenen für eine chemische Verbindung, welche die das neuronale Absterben unterdrückende Aktivität des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4) reguliert, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Induzieren des neuronalen Absterbens in der Gegenwart einer Testprobe und des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4);
    • (b) Nachweisen des Grades des neuronalen Absterbens und
    • (c) Auswahl der Verbindung, welche neuronales Absterben verstärkt oder unterdrückt;
    • (13) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als effektive Komponente das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4);
    • (14) die pharmazeutische Zusammensetzung von (13), wobei die Zusammensetzung eine unterdrückende, hinsichtlich neuronalen Absterbens ist;
    • (15) die pharmazeutische Zusammensetzung von (13), welche verwendet wird zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Neurodegeneration einhergehen;
    • (16) die pharmazeutische Zusammensetzung von (13), welche verwendet wird zur Vorbeugung oder Behandlung der Alzheimer-Erkrankung;
    • (17) ein Antikörper, welcher an das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (3) bindet;
    • (18a) die Verwendung des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (4) oder des Vektors (6) zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdruckung von neuronalem Zellabsterben;
    • (18b) die Verwendung einer neuronalen Zelle, exprimierend das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4) zur Herstellung eines Medikaments oder einer Zusammensetzung zur Unterdrückung von neuronalem Zellabsterben.
    • (19) Ein Verfahren zum Screenen nach einer chemischen Verbindung, welche an das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4) bindet; umfassend die Schritte von:
    • (a) das Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4);
    • (b) Nachweis der Bindungs-Aktivität zwischen der Testprobe und dem Polypeptid und
    • (c) Auswahl der Verbindung, welche die Aktivität aufweist, an das Polypeptid zu binden.
  • Die Bezeichnung "Polypeptid" bezieht sich hier auf ein Peptid oder ein Protein, bestehend aus zwei oder mehreren Aminosäuren oder Aminosäurederivaten, die aneinander gebunden sind. Peptidisostere sind als Polypeptid der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Bezeichnung "Polypeptid" enthält normalerweise kurz-strängige Polypeptide, wie z.B. Peptide, Oligopeptide und Oligomere. Sie schließt auch langkettige Polypeptide, wie z.B. Proteine ein. Das Polypeptid kann natürlich modifiziert durch posttranslatorische Modifikation und dergleichen sein. Die Polypeptide können auch modifiziert werden durch artifizielle Modikationen. Modifikationen schließen Modfikationen des Peptidrückgrates, der Aminosäuren-Seitenketten, des Amino-Endes oder des Carboxyl-Endes ein. Das Polypeptid kann verzweigt oder zyklisch sein. Modikationen schließen Acetylierung; Acylierung; ADP-Ribosylierung; Amidierung; kovalentes Binden mit Flavin, Nukleotiden, Nukleotidderivaten, Lipiden, Lipidderivaten oder Phosphatidylinositol und dergleichen; Quervernetzungs-Ausbildung; Zyklisieren; Disulfidbindungsausbildung; Demethylierung; Pyroglutamylation; γ-Carboxylierung; Glycosylierung; Hydroxylierung; Iodisierung; Methylierung; Myristoylation; Oxidation; Phosphorylation; Ubichination; usw. ein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele limitiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide zur Verfügung, welche Neuronen gegen Zell-Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung schützen. Die Aminosäuresequenz des Humanin-(HN)-Polypeptids, isoliert durch den vorliegenden Erfinder, wird in SEQ ID NO: 5 wiedergegeben und die cDNA-Sequenz des offenen Leserahmens, ko dierend das Polypeptid, wird in SEQ ID NO: 4 angegeben. Humanin antagonisiert das neuronale Absterben, assoziiert mit AD, und zeigt eine Sättigungs-Aktivität bei einer Konzentration von etwa 10 μM. Darüber hinaus zeigte HNG (S14G)(SEQ ID NO: 8), welches ein Humanin mit einer Aminosäuresubstitution ist, einen 100- bis 1000-fach höher antagonisierenden Effekt im Vergleich zu Humanin. Des Weiteren kann Cys an der Position 8 von HNG mit basischen Aminosäuren substituiert sein, beispielsweise His, Arg und Lys, ohne dass Veränderungen in der Aktivität durch die Modifikation der SH-Gruppe des Polypeptids auftreten. Des Weiteren zeigte AGA-HNG (SEQ ID NO: 60), welches ein Derivat von HNG ist, eine mehrfach erhöhte Aktivität im Vergleich zu HNG. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen Humanin, HNG, AGA-HNG und substituierte Formen davon ein, wobei der Zysteinrest (bezeichnet als C8) mit einer basischen Aminosäure substituiert ist.
  • Des Weiteren demonstrierte die vorliegende Erfindung, dass die Addition eines FLAG-tags (DYKDDDDK) an den C-Terminus von Humanin die neuroschützende Wirkweise davon (Beispiel 3) nicht beeinträchtigt. Des Weiteren lag, selbst wenn die vier C-terminalen Aminosäuren (KRRA) von Humanin mit anderen Aminosäuren substituiert wurden, eine neuroschützende Wirkweise äquivalent zu derjenigen des ursprünglichen Humanins im substituierten Polypeptid vor (Beispiel 6). Diese Tatsachen demonstrieren, dass Polypeptide mit äquivalenter oder höherer neuroschützender Wirkweise im Vergleich zu Humanin hergestellt werden können durch das Einbringen von Mutationen in die Aminosäuresequenz von Humanin, HNG, AGA-HNG und substituierten Formen davon, worin C8 mit einer basischen Aminosäure substituiert wird.
  • Der vorliegende Erfinder führte weitere detaillierte Analysen unter Verwendung von Deletionsmutanten von Humanin durch und fand heraus, dass sogar ein Polypeptid, bestehend aus 17 Aminosäuren von Position 3 bis 19 von Humanin (HN-17, SEQ ID NO: 21) hinreichend ist, um Neuronen zu schützen (Beispiel 13). Des Weiteren können die Hälfte oder mehr der Aminosäurereste von HNG substituiert werden, während die Aktivität beibehalten wird, gemäß der Verifikation der neuronalen Absterben-Unterdrückungs-Aktivität von Polypeptiden, bestehend aus dem 3. Pro bis zum 19. Pro von HNG (HNG-17, SEQ ID NO: 24), wobei jeder Aminosäurerest des Polypeptids mit einer anderen Aminosäure substituiert wurde. Dieses Experiment erläutert, dass 7 Aminosäuren in HNG-17 essenziell für die neuronale Absterben-Unterdrückung sind: Pro an Position 1; Cys an Position 6; Leu an Position 7; Leu-Thr-Gly an den Positionen 10 bis 12 und Pro an Position 17. Folglich können Polypeptide mit verschiedenen Aminosäuresequenzen durch Modifikation hergestellt werden, beispielsweise durch Substitution, Deletion und/oder Insertion von Resten, verschieden von denjenigen, wie oben beschrieben, unter Beibehalten der Reste, wie oben erwähnt.
  • Es ist noch viel wichtiger, dass selbst die 7 Aminosäuren, die oben als essenzielle Aminosäuren für die Aktivität erwähnt worden sind, auch mit anderen Aminosäuren substituiert werden können. Beispielsweise bewahrt das Polypeptid die neuroschützende Aktivität selbst wenn Gly an der Stelle 12 von HNG-17 Ser ist (d.h. HN-17). Darüber hinaus zeigte ein synthetisches Polypeptid (HNR; SEQ ID NO: 7), wobei die Position korrespondierend mit Leu an der Position 7 mit Arg substituiert wurde, eine neuroschützende Aktivität ähnlich zu derjenigen des synthetischen HN (Beispiel 12). Des Weiteren zeigt, wie oben erwähnt, ein HNG mit basischer Aminosäure, wie z.B. His, Arg oder Lys anstelle von Cys, korrespondierend mit der Position 6 von HNG-17 neuroschützende Aktivität. Insbesondere die HNG-Mutante, in welcher Cys substituiert ist mit Arg oder Lys demonstrierte eine neuroschützende Aktivität, äquivalent zu derjenigen von originalem HNG (Beispiel 14). Gemäß diesen Fakten erwartet man die Herstellung von Polypeptiden mit äquivalenter oder höherer neuronales Absterben unterdrückender Aktivität gegenüber denjenigen Polypeptiden, deren Aktivität in den Beispielen der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurden, durch Mutation von Aminosäuren, welche nicht essenziell sind und/oder essenziell für die Aktivität dieser Polypeptide sind.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung schließt Polypeptide ein, welche neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung (AD) unterdrücken und eine Aminosäuresequenz, bestehend aus Formel (I) oben aufweisen.
  • Basische Aminosäuren beziehen sich auf Aminosäuren, in welchen ihre R-Gruppe (Seitenkette) positiv bei pH 7,0 geladen ist. Beispiele natürlicher, basischer Aminosäuren schließen Arg, Lys und His ein. Diese Aminosäuresequenzen eines Polypeptids dieser Erfindung, welches Arg, Lys oder His als basische Aminosäuren aufweisen, kann beispielsweise repräsentiert werden als: Pro-Xn1-(Cys/Arg/Lys/His)-(Leu/Arg)-Xn2-Leu-Thr-(Gly/Ser)-Xn3-Pro (III), wobei "(Cys/Arg/Lys/His)" Cys, Arg, Lys oder His anzeigt; "(Leu/Arg)" Leu oder Arg anzeigt; "(Gly/Ser)" Gly oder Ser anzeigt; und Xn1, Xn2 und Xn3 unabhängig voneinander zufällig ausgewählte Aminosäuren mit jeweils nicht mehr als 10 Resten anzeigen). Hier sind Arg und Lys insbesondere bevorzugt als die basischen Aminosäuren an dieser Stelle.
  • Xn1, Xn2 und Xn3 sind unabhängig voneinander zufällig ausgewählte Aminosäuren von 3 bis 5, 1 bis 3 bzw. 3 bis 5 Resten (d.h. Xn1 = (Xaa)3-5, Xn2 = (Xaa)1-3 und Xn3= (Xaa)3-5); vorzugsweise von 2 bzw. 4 Resten (d.h. Xn1 = (Xaa)4, Xn2 = (Xaa)2 und Xn3= (Xaa)4). Hinzugefügte Aminosäuren von ungefähr 6 Resten bilden manchmal eine α-Helix aus und zeigen Eigenschaften eines einzelnen Aminosäurerestes. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid sein, worin zufällige Aminosäurereste mit nicht mehr als 6 Resten zu allen oder irgendeinem der Xn1, Xn2 und Xn3, bestehend aus zufällig ausgewählten Aminosäuren von 4 Resten, 2 Resten bzw. 4 Resten, hinzugefügt worden sind.
  • Solche Polypeptide können hergestellt werden gemäß bekannten Peptidsynthese-Techniken und auch durch die Expression von DNA, welche solche Polypeptide kodiert.
  • Vorzugsweise schließt die Sequenz von Xn1 beispielsweise Sequenzen ein, welche bestehen aus (Arg/Ala)-(Gly/Ala)-(Phe/Ala)-(Ser/Ala) und Sequenzen mit konservativer Substitution davon. Hier zeigt beispielsweise "Arg/Ala" Arg oder Ala an ("/" zeigt, dass es irgendeiner dieser Reste ist; das gleiche wird angezeigt über die ganze Beschreibung hier hinweg). Beispiele solcher Sequenzen schließen ein Arg-Gly-Phe-Ser, Ala-Gly-Phe-Ser, Arg-Ala-Phe-Ser, Arg-Gly-Ala-Ser, Arg-Gly-Phe-Ala usw. Andere Beispiele schließen ein Arg-Gly-Ala-Ala, Arg-Ala-Phe-Ala, Arg-Ala-Ala-Ser, Arg-Ala-Ala-Ala, Ala-Gly-Phe-Ala, Ala-Gly-Ala-Ser, Ala-Gly-Ala-Ala, Ala-Ala-Phe-Ser, Ala-Ala-Phe-Ala, Ala-Ala-Ala-Ser, Ala-Ala-Ala-Ala und dergleichen. Konservative Substitutionen können beispielhaft ausgeführt werden durch Substitution innerhalb einer Gruppe von Aminosäuren, korrespondierend mit konservativer Substitution, was später beschrieben werden wird. Auf der anderen Seite schließen Sequenzen von Xn2 vorzugsweise beispielsweise Sequenzen ein, bestehend aus (Leu/Ala)-(Leu/Ala) und Sequenzen mit konservativen Substitutionen davon. Solche Sequenzen schließen ein Leu-Leu, Ala-Leu, Leu-Ala und dergleichen. Ala-Ala kann auch beispielhaft als eine solche Sequenz dargestellt werden. Des Weiteren schließt die Sequenz von Xn3 vorzugsweise beispielsweise Sequenzen ein, welche bestehen aus (Glu/Ala)-(Ile/Ala)-(Asp/Ala)-(Leu/Ala) und Sequenzen mit konservativen Substitutionen davon. Solche Beispiele schließen ein Glu-Ile-Asp-Leu, Ala-IIe-Asp-Leu, Glu-Ala-Asp-Leu, Glu-lle-Ala-Leu, Glu-Ile-Asp-Ala und dergleichen. Andere Beispiele sind Glu-Ile-Ala-Ala, Glu-Ala-Asp-Ala, Glu-Ala-Ala-Leu, Glu-Ala-Ala-Ala, Ala-Ile-Asp-Ala, Ala-Ile-Ala-Leu, Ala-Ile-Ala-Ala, Ala-Ala-Asp-Leu, Ala-Ala-Asp-Ala, Ala-Ala-Ala-Leu, Ala-Ala-Ala-Ala usw. Die Sequenzen von Xn1, Xn2 und Xn3 können ausgewählt sein aus zufälligen Kombinationen.
  • Neuronales Absterben assoziiert mit AD wird induziert durch die Expression von APP, PS-1- oder PS-2-Mutanten (beispielsweise V642I/F/G APP, NL-APP, M146L PS-1 und N141I PS-2) in etablierten neuronalen Zelllinien (beispielsweise F11-Zellen) sowie primären neuronalen Kulturen (beispielsweise Rattengehirn kortikale primäre Kulturen); und auch durch die Zugabe von Aβ (beispielsweise Aβ1-43) zu primären neuronalen Kulturen. Die Bezeichnung "Unterdrückung von neuronalem Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung" definiert hier, dass zumindest eine unter den Arten des neuronalen Absterbens, assoziiert mit AD einschließen diejenigen, wie oben erwähnt, unterdrückt wird. Genauer gesagt schließen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung diejenigen ein, welche zumindest eine dieser neuronalen Absterbearten assoziiert mit AD unterdrücken. Die Unterdrückung von Zell-Absterben muss nicht eine vollständige Unterdrückung sein, solange als die Unterdrückung signifikant ist. Die Aktivität der Proteine, neuronales Absterben zu unterdrücken, kann nachgewiesen werden entsprechend den Verfahren, wie in den Beispielen beschrieben, oder in anderen veröffentlichten Verfahren (siehe beispielsweise die Internationale Veröffentlichungsnummer WO00/14204).
  • Genauer gesagt kann eine Methode beispielhaft wie folgt sein: (1) Transfizieren von Neuronen (beispielsweise F11-Zellen) mit Vektoren, welche FAD-Gene exprimieren, beispielsweise V642I/F/G APP, NL-APP, M146L PS-1 und N141I PS-2 allein oder in Kombination mit einem Vektor, welcher ein Polypeptid exprimiert, welches untersucht werden soll; (2) Kultivieren der Zellen über einen definierten Zeitraum (beispielsweise 72 Stunden); und (3) Nachweis des Grades des Zell-Absterbens durch einen Trypan-Blau- Ausschluss-Assay. Alternativ wird ein Polypeptid, welches untersucht werden soll, im voraus hergestellt und Zell-Absterben kann gemessen werden nach Transfektion von FAD-Genen in Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit des Polypeptids. FAD-Gene können auch konditional exprimiert werden unter Verwendung eines induktiven Promotors. Ein Polypeptid wird als neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer, unterdrückend bestimmt, wenn der Zelltod unter der Existenz des Proteins signifikant vermindert ist im Vergleich zu denjenigen Situationen in der Abwesenheit des zu untersuchenden Polypeptids. Darüber hinaus können andere Zellen, wie z.B. primär kultivierte Neuronen verwendet werden und die Induktion des Zell-Absterbens kann auch ausgeführt werden durch die Zugabe von Aβ. Zelltod kann gemessen werden durch Nachweis von morphologischen Veränderungen, LDH-Freisetzung oder Apoptose (morphologische Veränderungen des Nukleus, Fragmentation der DNA und dergleichen) zusätzlich zur Trypan-Blau-Exklusion.
  • Des Weiteren schließen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Polypeptide ein, welche eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe folgender SEQ ID NRN. aufweisen: 5 bis 8, 10, 12, 13, 21 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60; sowie Polypeptide, welche neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung (AD) unterdrücken, worin eine bis acht Aminosäuren des Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRN: 5 bis 8, 10, 12, 13, 20 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60 substituiert wurden durch konservative Substitution. Es wird betrachtet, dass die Anzahl der Reste, die durch Substitution mutiert werden sollen, in Aminosäuresequenzen generell 8 Reste oder weniger beträgt (beispielsweise 5 Reste oder weniger). Artifiziell erzeugte Aminosäuresequenzen und natürlich vorkommende Polypeptidsequenzen sind in der Aminosäuresequenz eingeschlossen, worin die Aminosäuren substituiert worden sind.
  • Die ursprüngliche Aktivität eines Polypeptids dürfte durch artifizielle Substitution von Aminosäuren zwischen Aminosäuren mit ähnlichen Charakteristika beibehalten werden. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen Polypeptide ein, welche neuronales Absterben, assoziiert mit AD unterdrücken, welche eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NRN.: 5 bis 8, 10, 12, 13, 21 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60 wie folgt aufweisen, mit konservativer Substitution der Aminosäuren der Polypeptide. Konservative Substitutionen werden als bedeutsam für das Substituieren von Aminosäuren essenziell für das Unterdrücken von neuronalem Absterben erachtet (beispielsweise die 7 Aminosäuren essenziell für HNG-17, wie oben erwähnt). Solche konservativen Substituionen der Aminosäuren sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Gruppen von Aminosäuren zwischen welchen konservative Substitutionen beispielsweise realisiert werden können sind: (1) basische Aminosäuren (beispielsweise Lysin, Arginin und Histidin); (2) saure Aminosäuren (beispielsweise Asparaginsäure und Glutaminsäure); (3) ungeladene polare Aminosäuren (beispielsweise Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin und Cystein); (4) nicht-polare Aminosäuren (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan); (5) β-verzweigte Aminosäuren (beispielsweise Threonin, Valin und Isoleucin); (6) aromatische Aminosäuren (beispielsweise Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und Histidin) und dergleichen. Alternativ kann die Aktivität neuronales Absterben zu unterdrücken, die Stabilität, die Gewebs-Lokalisation und dergleichen des Polypeptids verstärkt oder vermindert werden durch nicht-konservative Substitution.
  • Das Polypeptid dieser Erfindung kann erzeugt werden als ein synthetisches Polypeptid durch bekannte Peptidsynthese-Techniken (Japanese Biochemical Society edition, "Shin Seikagaku Jikken Koza Tanpakushitu (New Course on Biochemistry Experiments, Proteins) VI," Seiten 3–74, Tokyo Kagakudojin, 1992). Das Verfahren zur Peptidsynthese kann des Weiteren entweder eine Festphasen-Synthese oder eine Flüssigphasen-Synthese sein. Des Weiteren können Polypeptide mit zufälligen Aminosäure-Mutationen hergestellt werden durch das Einbringen der Mutation in Humanin-cDNA (beispielsweise SEQ ID NO: 4) durch Erzeugung von synthetischer DNA wer durch ortsgerichtete Mutagenese; und anschließendes Exprimieren der mutierten cDNA in einer Wirtszelle. Es bestehen keine Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und der Position der zu modifizierenden Aminosäuren, solange das erhaltene Polypeptid neuronales Absterben assoziiert mit AD unterdrückt.
  • Obwohl keine Einschränkung im Hinblick auf die Anzahl der Aminosäurereste in den Polypeptiden dieser Erfindung besteht, sind jedoch beispielsweise, wenn das Polypeptid als eine pharmazeutische Zusammensetzung verwendet wird, Polypeptid von kleiner molekularer Größe im Allgemeinen bevorzugt. Die Abwesenheit von Stellen (beispielsweise Aminosäureresten oder funktionellen Gruppen), die unnötig für die Aktivität sind, vermindern die Antigenizität und nicht-spezifische Interaktionen mit anderen Molekülen können vermieden werden, was als ein Ergebnis nachteilhafte Nebeneffekte reduzieren dürfte. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bestehen vorzugsweise aus 500 Aminosäureresten oder weniger, mehr bevorzugt 100 Resten oder weniger, viel mehr bevorzugt 50 Resten oder weniger und noch mehr bevorzugt 30 Resten oder weniger. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Polypeptide ist vorzugsweise 60 kDa oder weniger, mehr bevorzugt 15 kDa oder weniger, mehr bevorzugt 6 kDa oder weniger und noch mehr bevorzugt 4 kDa oder weniger.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Fusions-Polypeptide der obengenannten Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit anderen Polypeptiden. Ein Fusions-Polypeptid ist ein Polypeptid, in welchem zumindest zwei Polypeptide, welche nicht in der Natur verknüpft sind, verbunden sind und kann erzeugt werden durch Peptidsynthese oder durch Exprimieren von Nukleinsäuren, wobei die Polypeptid kodierende Regionen in einem Rahmen ligiert sind. Beispiele von anderen Polypeptiden, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert sind, schließen zufällige Polypeptide ein, umfassend kurze Peptide mit wenigen Resten, wie z.B. tags und lange Polypeptide, wie z.B. Proteine. Genauer gesagt schließen solche Beispiele His tag, HA tag, GFP, Maltose bindendes Protein und Glutathion-S-Transferase (GST) ein. Des Weiteren können Antikörper-Fragmente (Fc-Fragment) und dergleichen auch verwendet werden. Andere Beispiele schließen Leader-Sequenzen, Sekretions-Signale und Präprotein- oder Proprotein-Sequenzen ein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele limitiert. Des Weiteren kann eine Gruppe von Polypeptiden, welches ermöglicht, dass das Polypeptid dieser Erfindung effizient die Blut-Hirn-Schranke passiert, an das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert werden.
  • Des Weiteren schließen die Polypeptide der Erfindung Salze davon ein. Solche Salze sind abgeleitet von Säuren oder Basen der Polypeptide. Genauer gesagt können solche Salze beispielsweise dargestellt werden durch Salze, ausgebildet mit anorganischen Säuren (beispielsweise Salzsäure, Phosphat, Hydrobromid, Hydrosulfat, Nitrat, etc.); Salze, ausgebildet mit organischen Säuren (beispielsweise Acetat, Lactat, Formiat, Butyrat, Glycolat, Propionat, Fumarat, Maleat, Succinat, Tartrat, Citrat, Malat, Oxalat, Benzoat, Methansutfonat, Benzensulfonat, etc.); und Salze, ausgebildet mit Basen (beispielsweise Ammonium-Salz, Alkalimetallsalze, wie z.B. Natriumsalz und Kaliumsalz, Erdalkalimetallsalze, wie z.B. Calciumsalz und Magnesiumsalz und Salze, ausgebildet mit organischen Basen und Salze, ausgebildet mit Aminosäuren, wie z.B. Arginin und Lysin).
  • Des Weiteren schließen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Derivate davon ein. Hier bezeichnet der Begriff "Derivate" Moleküle, die eine Form aufweisen, welche durch Modifikation, Addition, Mutation, Substitution oder Deletion der funktionellen Gruppen des Polypeptids der Erfindung gemäß konventionellen Verfahren verändert worden sind. Solche Veränderungen von funktionellen Gruppen werden beispielsweise durchgeführt, um funktionelle Gruppen der Polypeptide zu schützen, die Stabilität oder histologische Lokalisierung der Polypeptide zu regulieren oder die Aktivität der Polypeptide zu regulieren usw. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden beispielhaft dargelegt durch diejenigen Polypeptide, in welchen entweder der N-Terminus, der C-Terminus oder funktionelle Gruppen der Polypeptide, die Aminosäure-Seitenketten konstituieren, durch Substituenten modifiziert werden, z.B. durch Schutzgruppen. Die Substitutionen schließen beispielsweise ein verschiedene Alkylgruppen, Acylgruppen, Amidgruppen, Phosphatgruppen, Aminogruppen, Carboxylgruppen und Estergruppen; jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele limitiert.
  • Des Weiteren schließt die vorliegende Erfindung Polymere ein, wie z.B. Dimere, wobei die Polypeptide aneinander geknüpft sind; verzweigte Moleküle und zyklische Moleküle. Des Weiteren können die Polypeptide an einen Träger gebunden sein. Beispielsweise können die Polypeptide dieser Erfindung an Polyethylenglykol (PEG), Dextran, andere Polymere usw. gebunden sein.
  • Aminosäuren, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung konstituieren, können in der L-Form und/oder D-Form vorliegen. Die Verwendung von D-Aminosäuren ist effektiv für das Vermindern des Abbaus durch Peptidasen. Des Weiteren sind Aminosäuren nicht limitiert auf natürliche Aminosäuren und können auch unnatürliche Aminosäuren darstellen. Unnatürliche Aminosäuren werden beispielhaft dargestellt durch Homoserin, β-Hydroxyvalin, 0-4-Hydroxyphenyltyrosin, α-t-Butylglycin, 2-Aminobutyrat, α-Zyklohexylglycin, α-Phenylglycin und dergleichen. Des Weiteren können die Peptidbindungen der Polypeptide geeignet mit kovalenten Bindungen verschieden von Peptidbindungen substituiert werden. Die Sensitivität der Polypeptide gegen Peptidasen kann vermindert werden durch die Substitution durch Nicht-Peptidbindungen, was die Wirk substanz-Effizienzdauer erhöht, und somit eine breite Selektion der Verabreichungswege anbietet. Die Nicht-Peptidbindungen werden beispielhaft dargestellt durch Imino-Bindungen, Esterbindungen, Hydrazin-Bindungen, Semicarbazid-Bindungen und Azo-Bindungen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt.
  • Des Weiteren können chemische Verbindungen, welche die Struktur der Polypeptide der vorliegenden Erfindung nimen, konzipiert werden. Beispielsweise wird, basierend auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften (welche durch konventionelle Verfahren, einschließend aktiver Orts-Modifikation, NMR und Röntgenstrahl-Kristallografie analysiert werden können), die sich auf die Struktur der Polypeptide der Erfindung beziehen, eine Kartierung der physikalischen und chemischen Funktionen, welche wichtig für die neuroschützende Wirkweise der Polypeptide sind, konstruiert. Anschließend werden Moleküle, welche diese Funktionen simulieren, konzipiert und synthetisiert. Alternativ erwartet man, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung an einen Rezeptor binden aufgrund ihrer hohen Aktivität und folglich können Verbindungen, welche den gleichen Rezeptor binden, konzipiert werden. Ob Moleküle, die in dieser Art und Weise abgeleitet werden, eine neuroschützende Aktivität aufweisen oder nicht, kann in Assays gemäß dem Verfahren, wie in den Beispielen beschrieben, untersucht werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA zur Verfügung, welche ein Polypeptid dieser Erfindung kodiert. Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich des Ursprungs der DNA der vorliegenden Erfindung und enthalten ist synthetische DNA, genomische DNA, cDNA und dergleichen. Die DNA dieser Erfindung schließt eine cDNA ein, welche Humanin kodiert, beschrieben in SEQ ID NO: 4. Eine DNA mit irgendeiner Nukleinsäuresequenz, basierend auf der Entartung des genetischen Codes, kann enthalten sein solange, als sie die Aminosäuren, beschrieben in SEQ ID NRN: 5 bis 8, 10, 12, 13, 21 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 oder 60 kodiert. Über die kodierende Region hinaus kann eine DNA der vorliegenden Erfindung nicht-kodierende Sequenzen enthalten (einschließend nicht-transkriptionelle Sequenzen, nicht-translatorische Sequenzen, Promotor, Enhancer, Suppressoren, Transkriptionsfaktor Bindungssequenzen, Splice-Sequenzen, Poly(A)-Additionssequenzen, IRES, mRNA stabilisierende/destabilisierende Sequenzen und dergleichen) und zwar an ihren 5'- und 3'-Enden.
  • Die DNA der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu erzeugen durch Insertieren der DNA in einen Vektor. Des Weiteren ist es auch möglich, die DNA zur Anwendung in der Gentherapie, wie unten beschrieben, einzusetzen.
  • Der Wirt zur Erzeugung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist in keinster Weise begrenzt und Zellen oder Einheiten, wie z.B. Escherichia coli, Hefe, Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und dergleichen können verwendet werden. Das Wirt-Vektor-System kann beispielsweise die Baculovirus-Sf-Zellinie sein (Okamoto et al., J. Biol. Chem. 270: 4205–4208, 1995); die pcDNA-CHO-Zellinie (Takahashi et al., J. Biol. Chem. 270: 19041–19045, 1995); die CMV-Promotor-Plasmid-COS-Zellinie (Yamatsuji et al., EMBO J. 15: 498–509, 1996); und dergleichen, ist jedoch nicht darauf limitiert.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können sekretiert werden aus Wirtszellen. Wie in den Beispielen beschrieben, wurden Humanin, HNG und dergleichen aus Zellen sekretiert, wobei die Polypeptide in die extrazelluläre Region exprimiert wurden und die sekretierten Polypeptide neuronales Absterben antagonisierten. Wenn sie in das Zelläußere sekretiert werden, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung konventionell aus den Kulturüberständen der Wirtszellen zurückgewonnen werden.
  • Die Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder die DNAs, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können in Reagenzien eingebracht werden zum Unterdrücken des neuronalen Absterbens. Eine DNA der vorliegenden Erfindung kann geeignet insertiert werden in einen Vektor und der Vektor kann verwendet werden als ein Reagenz. Zusätzlich zur Verwendung eines Polypeptids oder einer DNA selbst als das Reagenz kann ein Reagenz, welches ein Polypeptid der Erfindung oder eine DNA, welche ein Polypeptid dieser Erfindung kodiert, geeignet mit sterilisiertem Wasser, Salzlösung, Puffer, Salzen, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Detergenzien und anderen Proteinen (BSA, etc.), Transfektionsreagenzien (einschließend eines Lipofektionsreagenzes) und dergleichen kombiniert werden. Diese können vorteilhaft vermischt werden oder getrennt gehalten werden, bis sie vor der Anwendung gemischt werden.
  • Zell-Absterben von Neuronen kann unterdrückt werden durch Inkontaktbringen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit dem Neuron. Ein Polypeptid dieser Erfindung wird mit dem Äußeren einer Zelle in Kontakt gebracht. Genauer gesagt wird ein Polypeptid der Erfindung zum Kulturmedium in einem Zell-Kultivierungs-System hinzugegeben. Zur In-vivo-Anwendung wird ein Polypeptid der Erfindung verabreicht, so dass das Polypeptid mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, welche das Target darstellt, um das zelluläre Absterben zu unterdrücken. Obwohl die Konzentration eines Polypeptids der Erfindung von der Stärke der Aktivität zur Unterdrückung des neuronalen Absterbens abhängt und dem Zweck seiner Anwendung, wird die maximale Aktivität des Polypeptids bei einer Konzentration von ungefähr 10 μM oder weniger erreicht, falls das Polypeptid eine Aktivität besitzt, welche äquivalent zu derjenigen von HN ist und bei ungefähr 10 nM oder weniger, falls das Polypeptid eine Aktivität äquivalent zu derjenigen von HNG besitzt. Falls die Polypeptide sekretorische Polypeptide sind, werden die Polypeptide in das Zelläußere sekretiert, selbst wenn sie eingebracht worden sind oder intrazellulär exprimiert worden sind, und folglich kann das zelluläre Absterben unterdrückt werden. Beispielsweise wird zur Unterdrückung des zellulären Absterbens mit sekretorischen Polypeptiden eine DNA, kodierend ein Polypeptid der Erfindung intrazellulär exprimiert. Zelluläres Absterben von Neuronen kann unterdrückt werden in Zellkultur-Systemen oder in vivo durch Einbringen eines Vektors, welcher ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Zelle exprimiert Des Weiteren ermöglicht das Co-Kultivieren mit Zellen, welche ein sekretorisches Polypeptid der Erfindung exprimieren oder die Ex-vivo-Verabreichung eines sekretorischen Polypeptids die Unterdrückung von Zellabsterben von umgebenden Zellen.
  • Demgemäß können ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, eine DNA, welche das Polypeptid kodiert, und ein Vektor, enthaltend die DNA verwendet werden, zur Unterdrückung von neuronalem Absterben. Diese agieren als Unterdrücker des neuronalen Absterbens. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Verfügung, von DNAs, welche die Polypeptide kodieren und Vektoren, enthaltend die DANN, zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung von neuronalem Zell-Absterben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, enthaltend ein Polypeptid dieser Erfindung oder einen Vektor, wobei eine DNA, kodierend ein Polypeptid der Erfindung, insertiert worden ist, als ein aktives Ingredienz. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann Zellen gegen Neurodegeneration durch extrazelluläre Zugabe des Polypeptids schützen oder durch intrazelluläre Expression einer sekretorischen Form des Polypeptids. Folglich ist ein Polypeptid dieser Erfindung bedeutsam als eine pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere aktiv gegen Erkrankungen assoziiert mit Neurodegeneration.
  • Wie in den Beispielen beschrieben, unterdrückt chemisch synthetisiertes Humanin (HN) Polypeptid neuronales Absterben bei Konzentrationen von ungefähr 10 nM oder mehr in der extrazellulären Lösung und maximale Unterdrückung wird erreicht bei einer Konzentration von 1 bis 10 μM. Auf der anderen Seite zeigten HNG und AGA-HNG-Polypeptide signifikante oder hinreichende neuroschützende Wirkweise bei ungefähr 1 nM. Die neuroschützende Wirkweise wird durch Einbringen und Exprimieren einer DNA präsentiert, welche die Polypeptide in der Zelle kodiert. Folglich kann ein Vektor, exprimierend ein Polypeptid dieser Erfindung als ein Medikament verwendet werden, um Gentherapie durchzuführen. Sekretorische Typen von Polypeptiden oder Polypeptide, modifiziert mit einem sekretorischen Signal-Anhängsel können für die Gentherapie exprimiert werden. Verabreichungs-Verfahren für Vektoren schließen in vivo und ex vivo-Verfahren ein. Vektorsysteme für die Gentherapie schließen ein: Adenovirus-Vektoren; AAV (Adenovirus-assoziierter Virus) -Vektoren; Herpesvirus-Vektoren (alte beziehen sich auf Robbins und Ghivizzani, Pharmacol. Ther. 80: 35–47, 1998); Retrovirus-Vektoren (Engel und Kohn, Front. Biosci. 4: e26–33, 1999); Lentivirus-Vektor (Lundstrom, K., 1999, J. Recept. Signal. Transduct. Res. 19: 673–686); und dergleichen, sind jedoch nicht darauf limitiert.
  • Die Ziel-Erkrankungen, die verhindert oder behandelt werden sollen unter Verwendung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder unter Verwendung eines Vektors, welcher das Polypeptid exprimiert, sind in keinster Weise limitiert, solange als das verwendete Polypeptid der vorliegenden Erfindung effektiv für die Behandlung der Erkrankung ist. Beispiele von bevorzugten Ziel-Erkrankungen schließen neuronspezifische Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, ein. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Zell-Absterben von Neuronen bei Alzheimer-Erkrankung auftritt (I. Nishimoto et al., 1997, Adv. Pharmacol., 41: 337–368). Eine Art der Aktivierung von APP (I. Nishimoto et al., 1998, Neurobiol. Aging., 19: S33–S38) und Presenilin (Nishimura et al., 1999, Clin. Genet. 55: 219–225) wird als assoziiert mit dem zellulären Absterben vorgeschlagen. Folglich erwartet man, dass pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung anwendbar sind als Medikament zum Schutz gegen Neurodegeneration, welche bei Alzheimer-Erkrankung auftritt. Zusätzlich zur Alzheimer-Erkrankung können beispielsweise Erkrankungen, verursacht durch zelluläres Absterben von Neuronen aufgrund von zerebraler Ischämie (T. Kirino, 1982, Brain Res., 239: 57–69) verhindert werden durch die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Des Weiteren sind Parkinson-Krankheit, welche mit Demenz einhergeht (M. H. Polymeropoulos et al., 1997, Science, 276: 2045–2047) diffuse Lewy-Körper-Erkrankung (M. G. Spillantini et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6469–6473), Demenz, die mit der Down-Krankheit einhergeht und dergleichen auch Targets für die Behandlung und Vorbeugung unter Verwendung eines Proteins der Erfindung. Des Weiteren sind auch, da APLP1, welches ein APP-Analog ist, angeblich das verursachende Gen für das kongenitale nephrotische Syndrom ist (U. Lenkkeri, et al., 1998, Hum. Genet. 102: 192–196), renale Erkrankungen, wie z.B. das nephrotische Syndrom, auch das Ziel für die Behandlung und Vorbeugung.
  • Zusätzlich zur direkten Verabreichung des aktiven Ingrediens an einen Patienten kann eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung formuliert werden entsprechend konventionellen Wirkstoff-Implementationen. Beispielsweise kann die Zusammensetzung verabreicht werden nach einer geeigneten Formulierung in pharmakologisch akzeptablen Carriem oder Medium, insbesondere sterilisiertem Wasser oder Salzlösung, Pflanzenölen, Emulgatoren, suspendierenden Agentien, Detergentien, Stabilisatoren, verzögerten Freisetzungs-Präparationen und dergleichen. Eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung kann in der Form einer wässrigen Lösung, von Tabletten, Kapseln, Pastillen, bukkalen Tabletten, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Nasentropfen, Inhalations-Lösungen und dergleichen vorliegen. Der Gehalt des Polypeptids in diesen Formulierungen erzeugt eine geeignete verabreichbare Dosis.
  • Die Verabreichung an Patienten kann durchgeführt werden, abhängig von den Eigenschaften des verwendeten aktiven Ingradienzes. Beispiele geeigneter Verabreichung-Verfahren schließen ein perkutan, intranasal, transbronchial, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, intraspinal, intrazerebroventrikular oder orale Verabreichungsformen, sind jedoch nicht darauf limitiert. Bei der Verwendung der pharmazeutischen Zusam mensetzung in der Behandlung von zerebralen neurodegenerativen Erkrankungen ist es bevorzugt, die pharmazeutische Zusammensetzung in das zentrale Nervensystem einzubringen auf einem geeigneten zufälligen Weg, einschließend einer intravenösen, intraspinalen, intrazerebroventrikulären oder intraduralen Injektion. Die Dosis variiert gemäß dem Alter, dem Körpergewicht, dem Zustand eines Patienten, dem Verfahren der Verabreichung und dergleichen, aber ein Fachmann auf dem Gebiet kann sie geeignet auswählen. Die Dosis- und Verabreichungs-Verfahren variieren abhängig von der histologischen Lokalisierung des aktiven Ingredienz der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, dem therapeutischen Zweck, dem Körpergewicht und dem Zustand des Patienten und dergleichen, können aber in geeigneter Form von Fachleuten auf dem Gebiet ausgewählt werden.
  • Beispielsweise wird es empfohlen, zum Schutz von zerebralen Neuronen gegen Degeneration bei der Alzheimer-Krankheit-Behandlung, ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu verabreichen, so dass die Konzentration um die Target-Zelle hinreichend ist, um effektiv Neurodegeneration zu unterdrücken. Genauer gesagt sollten Humanin-Polypeptid oder Verbindungen, welche äquivalente schützende Wirkweise gegen neuronales Absterben mit Humanin aufweisen, bei einer Konzentration von zumindest 1 nM oder mehr verabreicht werden, vorzugsweise 10 nM oder mehr, mehr bevorzugt 100 nM oder mehr und noch mehr bevorzugt 1 μM oder mehr. HNG oder Verbindungen, welche äquivalente schützende Wirkweise gegen neuronales Absterben mit HNG aufweisen, sollten bei einer Konzentration von zumindest 1 pM oder mehr, vorzugsweise 10 pM oder mehr, noch mehr bevorzugt 100 pM oder mehr und am meisten bevorzugt 1 nM oder mehr verabreicht werden. Auf der anderen Seite kann ein vergleichbarer Effekt mit HNG durch die Anwendung von AGA-HNG erwartet werden, bei einer Konzentration eines Zehntels der HNG-Konzentration. Die Dosierung, um diese Konzentrationen zu erreichen, kann geeignet bestimmt werden, wenn man den Weg der Verabreichung berücksichtigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper zur Verfügung, die an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Die Antikörper dieser Erfindung schließen polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper ein. Polyklonale Antikörper können hergestellt werden, beispielsweise wie folgt: Polypeptide der Erfindung, wie z.B. HN und HNG oder partielle Peptide davon werden hergestellt; Kaninchen, Ziege, Schaf und dergleichen werden sensitiviert mit diesen Peptiden als dem Antigen. Antigene Peptide können an andere Proteine je nach Bedarf gebunden werden. Beispielsweise können sie mit Carrier-Proteinen, wie z.B. dem Key-Hole-Limpet-Hämocyanin und Albumin zur Immunisierung gebunden werden. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden unter Verwendung von Splenozyten von immunisierten Mäusen und Ratten, um Hybridoma zu erhalten, welche monoklonale Antikörper erzeugen. Die Produktion von Antikörpern kann durchgeführt werden gemäß konventioneller Verfahren (Ed. Harlow und David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • Unter Verwendung von konventionellen biochemischen Techniken, wie z.B. Ammoniumsulfat Fraktionierung, Protein-G-Sepharose-Säule und Affinitäts-Säule mit immobilisierten Antigenen können polyklonale Antikörper aufgereinigt werden aus dem Serum und monoklonale Antikörper können aufgereinigt werden aus Hibridoma-Kultur-Überstand oder aus Ascites von Tieren, welche mit Hybridoma inokuliert worden sind.
  • Zusätzlich zur Verwendung der Antikörper, hergestellt in dieser Art und Weise, so dass die Polypeptde der Erfindung adsorbieren, können Antikörper verwendet werden, beispielsweise um strukturelle Veränderungen eines Polypeptids der Erfindung zu testen und zu diagnostizieren und die Expressions-Spiegel eines Polypeptids der Erfindung zu selektieren.
  • Abnahme in der Blut oder interstitiellen Konzentration von Humanin oder Humanin-artigem Polypeptid, einschließend Konzentration in Nervengewebe, können zur Diagnose oder zur Prognose von degenerativen Erkrankungen der Nerven, einschließlich AD, und degenerativen Erkrankungen anderer Organe verwendet werden. Beispielsweise ist es möglich, dass das Voranschreiten der Erkrankung von AD-Patienten mit geringer HN-Aktivität im Blut schneller ist bei schlechter Prognose im Vergleich zu Patienten der gleichen Art von AD mit hoher HN-Aktivität. Verständliche Verfahren zum Testen werden exemplarisch dargestellt durch das Messen der Konzentrationen eines Peptids der vorliegenden Erfindung in Blut- oder Gewebsproben durch RIA unter Verwendung von Anti-Humanin-Antikörpern oder durch Testen von Biopsie-Proben durch immunohistologisches Anfärben. Des Weiteren kann der Polypeptid-Spiegel beispielsweise überwacht werden während der Behandlung, was die Verabreichung eines Polypeptids dieser Erfindung einschließt.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können Antikörperfragmente davon sein, solange als sie an ein Protein der Erfindung binden. Beispielsweise kann das Antikörperfragment Fab, F(ab')2, Fv oder modifizierte Antikörper davon darstellen. Des Weiteren sind humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper und dergleichen auch in den Antikörpern der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden als ein "Testreagenz für ein Polypeptid dieser Erfindung" und des Weiteren kann er geeignet kombiniert werden mit sterilisiertem Wasser, Salzlösung; Puffer, Salzen, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Detergentien, anderen Proteinen (BSA, etc.) und dergleichen. Diese können vorab gemischt werden oder voneinander getrennt gehalten werden, bis sie zum Zeitpunkt der Anwendung vermischt werden.
  • Solche DNA schließt Sonden und Primer zum Nachweis oder Amplifizieren von DNAs oder RNAs, welche ein Polypeptid der Erfindung kodieren, ein; wie auch Nukleotide und Nukleotidderivate (beispielsweise Antisense-Oligonukleotide, DNAs, kodierend Ribozyme und dergleichen) zum Unterdrücken der Expression eines Polypeptids der Erfindung. Bei der Verwendung als ein Primer ist solch eine DNA komplementär an ihrem 3'-Ende und Restriktions-Enzym-Erkennungs-Sequenzen oder tags können an das 5'-Ende hinzugefügt werden.
  • Des Weiteren liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Aktivität eines Polypeptids der Erfindung zur Unterdrückung von zellulärem Absterben. Das Verfahren umfasst: (a) das Induzieren zellulären Absterbens in der Gegenwart eines Polypeptids der Erfindung und (b) den Nachweis des Grades des zellulären Absterbens. Spezifische Manipulation des Verfahrens kann durchgeführt werden gemäß dem hier beschriebenen Verfahren. Das Verfahren kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Polypeptid dieser Erfindung den Effekt aufweist, zelluläres Absterben in verschiedenen Zellen zu unterdrücken und den unterdrückenden Effekt zu quantifizieren. Es gibt keine speziellen Begrenzungen hinsichtlich der zu verwendenden Zellen in dem Verfahren und verschiedene Zellen, welche zellulärem Absterben ausgesetzt sind, können eingesetzt werden. Des Weiteren kann die Induktion von zellulärem Absterben durchgeführt werden unter Verwendung eines zellulären Absterben-Induktionssystems für entsprechende im Stand der Technik bekannte Zellen. Neuronen können verwendet wer den, um den Effekt eines Polypeptids der Erfindung unter verschiedenen Bedingungen nachzuweisen, wie z.B. neuronales Absterben induzierende Stimulie, umweltbedingte Veränderungen und Genexpression. Das Nachweisverfahren kann auch Unterschiede der Sensitivität gegen ein Polypeptid der Erfindung bei neuronalem Absterben nachweisen, welche zwischen den biologischen Spezies oder Subspezies und zwischen Individuen existieren. Dies ermöglicht, die Effektivität eines Polypeptids der Erfindung zu analysieren, beispielsweise unter ethnischen Gruppen, Rassen oder Individuen. Gemäß dem Verfahren kann beispielsweise eine detaillierte Analyse der Bedingungen der klinischen Anwendung eines Polypeptids der Erfindung durchgeführt werden.
  • Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Effekts von chemischen Verbindungen auf das Unterdrücken von neuronalem Absterben durch ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte von: (a) Induzieren von neuronalem Absterben in der Gegenwart eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung; und (b) Nachweisen des Grades des neuronalen Absterbens. Das Verfahren kann verwendet werden, um chemische Verbindungen in einem Assay zu untersuchen, welche die Unterdrückung des neuronalen Absterbens durch ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung verstärken oder unterdrücken. Es wird nahegelegt, dass ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung einen Zell-Absterben-unterdrückenden Effekt durch Wirken auf die neuronale Oberfläche zeigt. Die Wirkweise einer Kandidaten-Verbindung, welche den Kontakt eines Polypeptids der Erfindung und die zelluläre Oberfläche inhibiert oder auf der anderen Seite verstärkt, kann gemäß dem Verfahren untersucht werden. Alternativ ermöglicht die Verwendung des Nachweis-Verfahrens das Screening von chemischen Verbindungen, welche die Unterdrückung von neuronalem Absterben durch ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung regulieren. Das Verfahren umfasst die Schritte von: (a) Induzieren des neuronalen Absterbens in der Genwart einer Testverbindung und eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung; (b) Nachweisen des Grades des neuronalen Absterbens und (c) Auswählen der chemischen Verbindung, welche neuronales Absterben verstärkt oder unterdrückt. Im Schritt (c) kann das Resultat mit demjenigen verglichen werden mit zufälligen Standards. Genauer gesagt kann man beispielsweise im Schritt (c) die chemische Verbindung auswählen, welche neuronales Absterben in der Gegenwart einer Test-Probe verstärkt oder unterdrückt, verglichen mit denjenigen, nachgewiesen in Abwesenheit einer Testprobe. Chemische Verbindungen, welche neuronales Absterben verstärken, dienen als Kandidaten-Verbindungen, die das Unterdrücken des neuronalen Absterbens durch ein Polypeptid der Erfindung inhibieren; wohingegen chemische Verbindungen, welche das neuronale Absterben unterdrücken, als Kandidaten-Verbindungen dienen, die des Weiteren das Unterdrücken des neuronalen Absterbens durch ein Polypeptid der Erfindung verstärken. Alternativ kann eine weitere Verbindung verschieden von der Testprobe als ein Standard in dem obengenannten Screening-Verfahren verwendet werden. Genauer gesagt wird zelluläres Absterben nachgewiesen unter Verwendung von Verbindungen, verschieden von der Testprobe, welche die Unterdnückung des neuronalen Absterbens durch ein Polypeptid der Erfindung regulieren, wobei in Schritt (c) die chemischen Verbindungen von den Testproben in Schritt (a) ausgewählt werden, und diese Verbindungen neuronales Absterben im Vergleich zum Ergebnis, erhalten mit anderen Verbindungen, unterdrücken oder verstärken. Dementsprechend können gemäß dem Screening-Verfahren chemische Verbindungen mit stärkeren Effekten im Vergleich zu existierenden Verbindungen gescreent werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die Unterdrückung von neuronalem Absterben durch ein Polypeptid der Erfindung zu regulieren.
  • Testverbindungen zum Screening schließen beispielsweise ein: aufgereinigte Proteine (einschließend Antikörper); Expressions-Produkte von Gen-Bibliotheken; synthetische Peptid-Bibliotheken; zelluläre Extrakte; Zellkultur-Überstände; Bibliotheken von niedermolekulargewichtigen synthetischen Verbindungen; natürliche Materialien, wie z.B. Erdreich; Lösungen, enthaltend Substanzen, freigesetzt von Bakterien, wie z.B. Actinomyces-Brühen; usw., sind jedoch nicht darauf limitiert.
  • Die Induktion des neuronalen Absterbens und die Verabreichung eines Polypeptids der Erfindung können entsprechend den Beispielen durchgeführt werden. Es gibt keine speziellen Begrenzungen hinsichtlich des Zeitpunkts der Verabreichung der Testprobe an Zellen und sie können vor, nach oder zugleich mit der Verabreichung eines Polypeptids der Erfindung durchgeführt werden. Des Weiteren besteht keine Begrenzung für die Verabreichung einer Testprobe und beispielsweise wird die Probe zum Medium einer kultivierten Zellinie hinzugegeben. Falls die Probe eine Nukleinsäure ist, kann sie in eine Zelle eingebracht werden. Zusätzlich zu dem Verfahren oben kann die Testprobe durch zufällige Verabreichungs-Verfahren verabreicht werden.
  • Chemische Verbindungen, evaluiert durch die Wirkweise der Verbindungen in dem oben genannten Test oder Verbindungen, erhalten durch Screenen, dienen als Kandiaten-Verbindungen, welche die Aktivität eines Polypeptids der Erfindung regulieren. Diese Verbindungen können angewandt werden, um Erkrankungen, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung zu vefindern oder zu behandeln.
  • Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen für Verbindungen zur Verfügung, welche an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Solch ein Screenen kann durchgeführt werden durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte von: (a) Inkontaktbringen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einer Testprobe, (b) Nachweis der Bindungsaktivität zwischen dem Polypeptid der Erfindung und der Testprobe und (c) Auswählen der Probe, welche an das Polypeptid der Erfindung bindet.
  • Abhängig vom Screening-Verfahren kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet werden zum Screenen als ein lösliches Polypeptid oder in der Form, gebunden an den Träger. Ein Polypeptid der Erfindung kann gelabelt sein. Beispiele des Labelns schließen Labeln mit radioaktiven Isotopen, fluoreszierenden Substanzen und Biotin oder Biotin oder Digoxigenin; tag-Sequenz-Addition und dergleichen ein.
  • Testproben zum Screenen können beispielsweise aufgereinigte Proteine (einschließlich Antikörper); Expressionsprodukte von Gen-Bibliotheken; synthetische Peptid-Bibliotheken; Zellextrakte; Zellkultur-Überstände; Bibliotheken von niedermolekulargewichtigen synthetischen Verbindungen; natürliche Materialien, wie z.B. Erdreich; Lösungen, enthaltend Substanzen, freigesetzt von Bakterien, wie z.B. Actinomyces-Brühe; und dergleichen sein, sind jedoch nicht darauf limitiert. Testproben, die in dem Screening verwendet werden können, können geeignet gelabelt sein, je nach Bedarf. Die Label schließen beispielsweise radioaktive Label, fluoreszierende Label und dergleichen ein, sind jedoch nicht darauf limitiert. Beispielsweise kann das Screenen für Proteine, welche an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden, durchgeführt werden durch Anwenden von Zellextrakten von Geweben oder Zellen, von denen zu erwarten ist, dass sie Proteine exprimieren, welche an ein Polypeptid der Erfindung binden, an eine Affinitäts-Säule, an welche ein Polypeptid dieser Erfindung immobilisiert ist; und Aufreinigen der Proteine, welche spezifisch an die Säule binden.
  • Alternativ wird eine cDNA-Bibliothek, aus Geweben oder Zellen hergestellt, von denen zu erwarten ist, dass sie Proteine exprimieren, welche an ein Polypeptid der Erfindung binden (beispielsweise Gehirn-kortikales Gewebe, und Neuronen, wie z.B. F11) und zwar unter Verwendung von Phasen-Vektoren; anschließend werden Plaque auf Agarose ausgebildet; und das Screenen durch Western-Blotten wird durchgeführt unter Verwendung von gelabelten Polypeptiden dieser Erfindung. Das Screenen kann auch durchgeführt werden durch ein "Zwei-Hybrid-System" und dergleichen. Genauer gesagt wird ein Verfahren, welches ein "Zwei-Hybrid-System" einsetzt, wie folgt durchgeführt: (1) ein DNA-bindendes Peptid, wie z.B. GAL4-DNA-bindende Region und ein Transkriptions-aktivierendes Peptid, wie z.B. GAL4-Transkriptions-Aktivierungs-Region, werden als ein Fusionsprotein mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung bzw. einem Testprotein exprimiert; und (2) das Binden des Proteins der vorliegenden Erfindung und des Testproteins wird nachgewiesen als die Expression eines Reportergens eines strangabwärts angebundenen Promotors, welcher eine Bindungssequenz des DNA-bindenden Peptids aufweist.
  • Des Weiteren können Rezeptoren eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung kloniert werden durch Screening-Verfahren dieser Erfindung. Im Falle des Screenens von Rezeptoren ist es bevorzugt, die Testproben oder das Gewebe oder Zellen zu präparieren, von denen man erwarten kann, dass sie Rezeptoren exprimieren (beispielsweise Gehirn-kortikales Gewebe, Nervenzellinien, Neuroblastomzellen und Teratokarzinom-Zellen). Beispiele von Nervenzellinien schließen F11-Zellen; PC12-Zellen (L. A. Greene und A. S. Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2424–2428); NTERA2-Zellen (J. Skowronski und M. F. Singer, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6050–6054); SHSY5Y Zellen (L. Odelstad et al., 1981, Brain Res., 224: 69–82) und dergleichen ein.
  • Alternativ können Moleküle, welche an Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden, gescreent werden durch Inkontaktbringen mit synthetischen Verbindungen; einer natürlichen Produkt-Bank und zufälligen Phagen-Peptid-Präsentations-Bibliotheken, mit einem immobilisierten Polypeptid der Erfindung. Des Weiteren ist das Screenen durch den Nachweis des Bindens unter Verwendung von Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Bildern (beispielsweise hergestellt durch BIAcore) möglich. Diese Screening-Verfahren können durchgeführt werden durch High-Throughput-Screenen unter Einsatz von kombinatorischen chemischen Techniken.
  • Verbindungen, welche an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden, erhalten gemäß dem Screening-Verfahren dieser Erfindung, dienen als Kandidatenverbindungen und regulieren die Aktivität eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Folglich sind diese Verbindungen anwendbar zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine schematische Illustration einer Region in einem Humanin-cDNA-Klon, welcher ein Polypeptid kodiert, das Zelltod, verursacht durch V642I APP, antagonisiert.
  • DNA-Fragmente wurden abgeglichen im Hinblick auf die längste Sequenz (von –934 bis 600; das erste Nukleotid entspricht dem ersten Nukleotid des Humanin ORFs und das Nukleotid, das ihm benachbart ist, ist mit – 1 bezeichnet). Aktivitäten der Fragmente gegen F11/EcR-Zell-Absterben, induziert durch V642I APP, werden angegeben unter dem Begriff "rettende Aktivität". F11/EcR-Zellen wurden transfiziert für 3 Stunden mit pIND (1 μg), kodierend V642I APP und 1 μg entweder von pEF-BOS oder pEF-BOS, welche jedes der DNA-Fragmente kodieren; und anschließend wurden sie mit Ekdyson für 72 Stunden behandelt. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypanblau-Exklusions-Assay. Ein DNA-Fragment wurde als zelluläres Absterben antagonisierend bestimmt (beschrieben als "Y" unter dem Begriff "rettende Aktivität") wenn die Mortalität der Zellen transfiziert mit dem DNA-Fragment einen statistischen Signfikanz-Unterschied mit derjenigen von Zellen, transfiziert mit pEF-BOS zeigte. "N" zeigt die Abwesenheit von solch einer signifikant antagonisierenden Aktivität.
  • 2 stellt einen Graph dar, welcher die Effekte des DT63-Klons und des DT171-Klons auf das neuronale Absterben, verursacht durch Ekdyson-induzierte Expression von V642I APP demonstriert. F11/EcR-Zellen wurden transfiziert mit Ekdyson-induzierbarem V642I APP-Plasmid und irgendeinem von pEF-BOS, DT63 oder DT171 (DT63 und DT171 wurden in pEF-BOS kloniert) und wurden mit Ponasteron (Ekdyson) behandelt. Eine Gruppe ohne Ekdysonbehandlung wurde auch durchgeführt. 72 Stunden nach Ekdysonbehandlung wurde zelluläres Absterben durch Trypanblau-Exklusions-Assay gemessen. Zelluläre Absterben der Gruppe ohne Ekdysonbehandlung wurde zu gleicher Zeit gemessen. Die Werte mit Fehlerbalken in der Abbildung repräsentieren Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Transfektions-Experimenten. DT63 und DT171 sind in 1 gezeigt.
  • 3 stellt einen Graph dar, welcher den Effekt des DT63-Klons auf das neuronale Absterben, induziert durch die Expression des FAD-Gens demonstriert. F11-Zellen wurden mit pcDNA transfiziert oder pcDNA, kodierend V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 und pEF-BOS (vec); oder pEF-BOS, kodierend DT63; und wurden für 72 Stunden kultiviert. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Werte mit Fehlerbalken in der Abbildung zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Transfektions-Experimenten.
  • 4 zeigt einen Graphen, welcher die Effekte von DT29-, DT44- und DT171-Klonen auf F11-Zell-Absterben, verursacht durch FAD-Gen-Transfektion anzeigt. In ähnlicher Art und Weise wie in 3 wurden die F11-Zellen mit pcDNA transfiziert oder pcDNA, kodierend entweder V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2; und pEF-BOS(pBOS); oder pEF-BOS, kodierend DT-Klon; und wurden kultiviert für 72 Stunden. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Tryptan-Blau-Exklusions-Assay. DT29 und DT44 sind in 1 gezeigt. Basale Zell-Mortalität (keine Transfektion, pcDNA + pBOS) war in den drei Beispielen, welche zur gleichen Zeit durchgeführt wurden, übereinstimmend. Ähnliche Experimente wurden zumindest dreimal durchgeführt. Die Werte mit Fehlerbalken in der Grafik zeigen Mittelwert ± Standardabweichungen.
  • 5 stellt Graphen dar, welche den Effekt von Humanin-kodierendem Plasmid pHN auf neuronales Absterben, induziert durch Expression eines FAD-Gens zeigen. F11-Zellen wurden transfiziert mit einem leeren Vektor (pcDNA) oder pcDNA, kodierend V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2; und pFLAG oder pFLAG, kodierend HN (pHN); und wurden kultiviert für 72 Stunden. Zelluläres Absterben wurde durch Tryptan-Blau-Exklusions-Assay gemessen. Die Werte sind Mittelwert ± Standardabweichungen, erhalten durch drei unabhängige Experimente.
  • 6 stellt einen Graphen dar, welcher den unterdrückenden Effekt eines Kultur-Überstandes von pHN-transfizierten F11-Zellen auf neuronales Absterben, induziert durch V642I APP, demonstriert. F11-Zellen wurden transfiziert für 3 Stunden entweder mit pcDNA oder pcDNA, kodierend V642I APP, in der Abwesenheit von Serum; kultiviert in HamF-12, enthaltend 18% FBS für 2 Stunden und kultiviert in CM/F11-pHN (CM/pHN), CM/F11-vec (CM/vec) oder frischem Medium (frisches HamF-12, enthaltend 18% FBS) für 67 Stunden. 72 Stunden nach der Transfektion wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Werte, die angegeben werden, sind Mittelwert ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten. p < 0,01 gemäß eines Student-t-Tests.
  • 7 stellt Fotografien dar, welche die Immunoreaktivität von HN-Polypeptiden, enthalten in dem Kulturüberstand von F11-Zellen, transfiziert mit pHN, demonstrieren. Das linke und mittlere Panel demonstrieren die Ergebnisse des Immonoblottens unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörper auf zelluläre Extrakte (30 μg Protein) und Kulturüberstand (20 μl) folgend auf Tris/Tricin-Gel Elektrophorese (Zeile 1: Zellen ohne Transfektion; Zeile 2: pFLAG-transfizierte Zellen; Zeile 3: pHN-transfizierte Zellen). Das rechte Panel demonstriert die Ergebnisse einer ähnlichen Analyse auf dem Kultur-Überstand von Zellen, transfiziert mit pHN, pHNG oder pHNA. Die 3 Zeilen auf der rechten Seite demonstrieren die Ergebnisse des Immunoblottens auf sHN-FLAG (MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRAGTDYKDDDDK: die unterstrichene Region ist ein FLAG tag)(SEQ ID NO: 6) mit angegebenen Konzentrationen, um die Titer von HN-Polypeptiden, enthalten in dem Kulturüberstand, zu bestimmen. Ähnliche Experimente wurden viermal oder mehr wiederholt.
  • 8 stellt Fotografien dar, welche die Ergebnisse der Analyse der zellulären Sekretion von HN-Polypeptid und Mutanten davon demonstrieren. Oberes Panel: Fotografien, welche demonstrieren, dass zelluläre Sekretion von HN inhibiert wird aufgrund der L9R-Mutation. F11-Zellen wurden transfiziert mit pHN, pHNA, oder pHNR (pFLAG, welches L9R HN kodiert); anschließend 72 Stunden später, wurden die Zellextrakte und Kulturüberstände eingesammelt und durch anti-FLAG-Antikörper analysiert, ähnlich zu 7.
  • Unteres Panel: Fotografien, demonstrierend Signalsequenz artige Sekretions-Aktivität von HN. F11-Zellen wurden transfiziert mit EGFP cDNA (Zeile 2), HN-EGFP-Fusions-cDNA (Zeile 3) oder HNR-EGFP cDNA (Zeile 4); nach 72 Stunden wurden zelluläre Extrakte (unteres linkes Panel, 10 μg/Zeile) oder Kulturüberstand (unteres rechtes Panel, 20 μg/Zeile) analysiert durch immunoblotten mit anti-EGFP-polyklonalem Antikörper (1/2000) und HRP-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1/5000). Proben, abgeleitet von nicht-transfizierten F11-Zellen, wurden auf Zeile 1 von beiden Panels geblottet. Der linke Balken zeigt Molekulargewichte in Dalton.
  • 9 stellt Graphen dar, welche den Effekt von synthetischem HN (sHN) und strukturellen Derivaten davon auf neuronales Absterben demonstrieren, induziert durch V642I APP. F11-Zellen wurden transfiziert mit pcDNA, kodierend V642I APP; und wurden behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von sHN (authentisches HN)(SEQ ID NO: 5), sHNG (S14G)(SEQ ID NO: 8), sHNA (C8A) (SEQ ID NO: 9), die in einer Dimerform von sHN durch C8 (C8-C8) und sHN, in welchen das C-terminale KRRA ersetzt wurde durch AAAA (KRRA21/22/23/24AAAA)(SEQ ID NO: 10). 72 Stunden nach der Transfektion wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Mittelwerte ± Standardabweichungen dieser drei unabhängigen Experimente sind angegeben.
  • 10 stellt Graphen dar, welche den Effekt von sHN, sHNG oder sHNA auf neuronales Absterben, induziert durch M146L PS-1, N141I PS-2 oder NL-APP demonstrieren. Ähnlich zu 9 wurden F11-Zellen transfiziert mit M146L PS-1, N141I PS-2 oder NL-APP cDNA; und wurden mit verschiedenen Konzentrati onen von sHN (authentisches HN), sHNG (S14G) oder sHNA (C8A) behandelt. 72 Stunden nach der Transfektion wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind angegeben.
  • 11 stellt Balkengrafiken dar, welche den Effekt von pHN, pHNG oder pHNA auf neuronales Absterben demonstrieren, induziert durch die Expression von FAD-Genen. F11-Zellen wurden transfiziert mit leerem Vektor (pcDNA) oder pcDNA, kodierend V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 und pFLAG oder pFLAG, kodierend HN (pHN, pHNG oder pHNA); und wurden für 72 Stunden kultiviert. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Tryptan-Blau-Exklusions-Assay. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind angegeben.
  • 12 stellt Graphen dar, welche das Nichtauftreten des Effekts von HN und strukturellen Derivaten davon auf neuronales Absterben, induziert durch Polyglutamin-Repeat Q79 demonstrieren. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • Panel A: demonstriert das Nichtauftreten des Effekts von pHN, pHNG oder pHNA auf das neuronale Absterben, verursacht durch die Expression von Q79, induziert durch Ekdyson. F11/EcR-Zellen wurden transfiziert mit Ekdyson-induzierbarem Typ-Q79-Expressionsplasmid und leerem Vektor (pFLAG), pHN, pHNG oder pHNA und wurden für 72 Stunden in der Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von Ekdyson kultiviert. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay.
  • Panel B: demonstriert einen signfikanten unterdrückenden Effekt durch pHN-Co-Transfektion auf neuronales Absterben, verursacht durch Ekdyson-induzierte Expression von NL-APP, V642I APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2. Unter denselben Bedingungen wie in Panel A wurden F11/EcR-Zellen, transfiziert mit Ekdyson-induzierbarem FAD-Gen-Plasmid und pFLAG oder pHN und anschließend wurden sie für 72 Stunden in der Gegenwart (+) oder Abwe senheit (–) vpm Edyson kultiviert. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay.
  • Panel C: demonstriert das Nichtauftreten des Effekts von sHN, sHNG oder sHNA auf neuronales Absterben, induziert durch Ekdyson-induzierbare Expression von Q79. F11/EcR-Zellen wurden transfiziert mit Ekdyson-induzierbaren Q79-Plasmiden; behandelt mit 1 μM sHN, sHNG oder sHNA und wurden anschließend in der Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von Ekdyson kultiviert. 72 Stunden nach dem Beginn der Ekdysonbehandlung wurde zelluläres Absterben durch Trypen-Blau-Exklusions-Assay gemessen.
  • Panel D: demonstriert einen signifikanten unterdrückenden Effekt durch sHN auf neuronales Absterben, verursacht durch Ekdyson-induzierte Expression von NL-APP, V642I APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2. Unter den gleichen Bedingungen wie in Panel C wurden F11/EcR-Zellen, transfiziert mit Ekdyson-induzierbarem FAD-Gen-Plasmid; behandelt mit 1 μM sHN und anschließend wurden sie in der Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von Ekdyson kultiviert. 72 Stunden nach der Initiation der Ekdyson-Behandlung wurde zlluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay.
  • 13 stellt Graphen dar, die das Nichtauftreten des Effekts von HN und strukturellen Derivaten davon auf das neuronale Absterben, induziert durch ALS-assoziierte SOD1-Mutanten, demonstrieren. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • Panel A: demonstriert das Nichtauftreten des Effekts von pHN-co-Transfektion auf neuronales Absterben, induziert durch Expression der ALS-verwandten SOD1-Mutanten. F11-Zellen wurden transfiziert mit pEF-BOS, kodierend die ALS-assoziierte Mutante SOD1- (A4T-, G85R- oder G93A-Mutanten von SOD1) und leerem Vektor (pFLAG) oder pHN. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Tryptan-Blau-Exklusions-Assay.
  • Panel B: demonstriert das Nichtauftreten des Effekts von sHN, sHNG oder sHNA auf neuronales Absterben, induziert durch die Expression von ALS- assoziierten SOD1-Mutanten. F11-Zellen wurden transfiziert mit pEF-BOS, kodierend A4T, G85R oder G93A SOD1 und wurden behandelt mit 100 μM sHN, sHNG oder sHNA. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay.
  • 14 stellt Phasen-Kontrast-fotomikroskopische Aufnahmen dar, welche den Effekt von HN- auf Aβ-induziertes zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen demonstriert. Repräsentative mikroskopische Fotografien sind dargestellt. Primäre kultivierte kortikale Neuronen wurden für 72 Stunden mit 25 μM Aβ1-43 in der Gegenwart oder Abwesenheit von sHN (10 μM, 10 μM), 10 nM sHNG oder 10 μM sHNA behandelt. HN-Polypeptide wurden 16 Stunden vor der Initiation der Aβ1-43-Behandlung hinzugegeben, so dass die letztendlichen Konzentrationen der Polypeptide diejenigen waren, die in den Figuren angegeben sind. Die Zugabe von Aβ1-43 wurde durchgeführt durch ursprüngliches Entfernen der Hälfte des Mediums und anschließendes Versorgen mit gleicher Menge an frischem Medium, enthaltend 50 μM des Aβ1-43 und sHN oder sHNA mit einer Konzentration, wie oben angegeben. Unbehandelte Zellen (keine Behandlung), welche nicht mit Aβ behandelt wurden, wurden auch betrachtet. Ähnliche Experimente wurden zumindest dreimal durchgeführt und reproduzierbare Ergebnisse wurden erhalten.
  • 15 stellt Graphen dar, welche den Effekt von HN auf Aβ-induziertes zelluläres Absterben von primär kultivierten Neuronen demonstrieren. 25 μM Aβ1-43 wurde zu primären kultivierten kortikalen Neuronen in der Gegenwart (bei den angegebenen Konzentrationen) oder Abwesenheit von sHN, sHNG oder sHNA hinzugegeben. Die Zugabe von HN-Polypeptiden wurde in ähnlicher Art und Weise durchgeführt zu derjenigen, beschrieben in 14. 72 Stunden nach der Initiation der Aβ-Behandlung wurde zelluläres Absterben durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay gemessen. Primär kultivierte Neuronen, welche in ähnlicher Art und Weise für 72 Stunden mit 20 μM Etoposid in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μM sHN- oder HN-Derivaten behandelt wurden, wurden als positive Kontrollen in diesem Experiment verwendet. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt zumindest dreimal und reproduzierbare Ergebnisse wur den erhalten. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen dargestellt.
  • 16 stellt einen Graphen dar, welcher den Effekt von HN auf Aβ-induziertes zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen demonstriert. Zelluläre Schäden wurden überwacht in Form der Menge von LDH, freigesetzt in das Kulturmedium. 25 μM Aβ1-43 wurden zu den primär kultivierten kortikalen Neuronen in der Gegenwart (in angegebenen Konzentrationen) oder Abwesenheit von sHN, sHNG oder sHNA hinzugegeben. Die Zugabe von HN-Polypeptiden wurde in ähnlicher Art und Weise zu derjenigen, beschrieben in 14 durchgeführt. 24, 48 oder 72 Stunden nach der Initiation der Aβ-Behandlung wurde die Menge von LDH im Kulturmedium gemessen. LDH-Freisetzung von Neuronen, behandelt mit 20 μM Etoposid in der Gegenwart oder Abwesenheit von HN-Polypeptiden wurde auch gemessen. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt zumindest dreimal und reproduzierbare Ergebnisse wurden erhalten. Mittelwert ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • 17 stellt Fotografien dar, welche den Effekt von HN auf Aβ1-43-induziertem zellulärem Absterben von primär kultivierten Neuronen demonstrieren. Die Ergebnisse von Calcein-AM-Anfärbung sind als fluoreszenzmikroskopische Fotografien dargestellt. 25 μM Aβ1-43 wurde zu primär kultivierten kortikalen Neuronen in der Gegenwart (zu den angegebenen letztendlichen Konzentrationen) oder Abwesenheit von HN-Polypeptid hinzugegeben. Zugabe von HN Polypeptiden wurde durchgeführt in ähnlicher Art und Weise zu derjenigen, beschrieben in 14. 72 Stunden nach Aβ1-43-Behandlung wurde Calcein-AM-Anfärben durchgeführt. Unbehandelte Zellen (keine Behandlung), welche nicht mit Aβ behandelt wurden, wurden auch beobachtet. Cytoplasmische Fluoreszenz zeigt Zell-Lebensfähigkeit an. Ähnliche Experimente wurden zumindest dreifach durchgeführt und reprozierbare Ergebnisse wurden erhalten. Repräsentative Ergebnisse sind in der Figur dargestellt.
  • 18 stellt einen Graphen dar, welcher die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen von Calcein-AM-Anfärbung demonstrieren. 25 μM Aβ1-43 wurde zu primär kultivierten kortikalen Neuronen in der Gegenwart (in den angegebenen letztendlichen Konzentrationen) oder Abwesenheit von HN-Polypeptiden hinzugegeben. Die Zugabe von HN-Polypeptiden wurde in ähnlicher Art und Weise zu derjenigen durchgeführt, beschrieben in 14. Calcein-AM-Anfärben wurde durchgeführt nach 72 Stunden für die Aβ1-43-Behandlung und die Fluoreszenzintensität eines jeden Wells wurde gemessen. Die Untergrund-Fluoreszenz-Intensität wurde als 36 960 (Einheit/Well) berechnet und diese wurde von den Werten subtrahiert, welche für jedes Well gemessen wurden. Ähnliche Experimente wurden zumindest dreifach durchgeführt und reproduzierbare Ergebnisse wurden erhalten. Mittelwert ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen dargestellt.
  • 19 stellt Fotografien dar, welche die Expression von HN mRNA in verschiedenen menschlichen Geweben demonstrieren. Radiogelabeltes Antisense-HN (Panel a) 19mer, kodierend die 5'-Region (Panel b) oder DT77 (Panel c) wurde als eine Sonde an das Blatt hybridisiert, geblottet mit menschlicher Gewebe PolyA-RNA (Zeile 1: Gehirn; Zeile 2: Nerz; Zeile 3: skelettale Muskeln; Zeile 4: Dickdarm; Zeile 5: Thymus; Zeile 6: Milz; Zeile 7: Niere; Zeile 8: Leber, Zeile 9: Dünndarm; Zeile 10: Pankreas; Zeile 11: Lunge; Zeile 12: peripherale Leukozyten). Die Ergebnisse des Northern-Blottings auf dem gleichen Blatt unter Verwendung von β-Actin als die Sonde sind in Panel d dargestellt. Die Zahlen auf der linken Seite geben die molekularen Größen wieder. Ähnliche Experimente wurden zumindest dreifach durchgeführt und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.
  • 20 zeigt Fotografien, welche die Expression von HN mRNA in Mausgeweben demonstrieren. PolyA-RNA (2 μg/Zeile), extrahiert aus verschiedenen Mausorganen, wurde einer 1,2% Agarosgelelektrophorese unterzogen und nach Blotten wurde Hybridisierung durchgeführt unter Verwendung von gelabeltern Antisense-HN (oben links) oder β-Actin (weiter unten links) als Sonden (Zeile 1: Gehirn; Zeile 2: Herz; Zeile 3: skelettale Muskeln; Zeile 4: Thymus; Zeile 5: Milz; Zeile 6: Niere; Zeile 7: Leber; Zeile 8: Dünndarm; Zeile 9: Magen; Zeile 10: Haut; Zeile 11: Lunge).
  • Das rechte Panel demonstriert die HN mRNA-Expressionsregion im Maus-Gehirn. Gelabeltes Antisense-HN (oberes Panel auf der rechten Seite) oder (β-Actin-Sonde (unteres Panel auf der rechten Seite) wurden an das Blatt hybridisiert, geblottet mit PolyA-RNA, abgeleitet von verschiedenen Regionen des Maus-Gehirns (Zeile 1: vorderer Lappen; Zeile 2: temporaler Lappen; Zeile 3: parietaler Lappen; Zeile 4: okzipitaler Lappen; Zeile 5: Zerebellum; Zeile 6: Lunge). Für quantitative Vergleiche zwischen den Blättern wurden die gleichen Mengen an Lungen-abgeleiteter PolyA-RNA wie im linken Panel in Zeile 6 für die Hybridisierung elektrophorsiert.
  • 21 stellt Balkengrafiken dar, welche die Ergebnisse einer detaillierten Analyse der Struktur/Funktions-Beziehung, betreffend die schützende Aktivität von HN demonstrieren. Der Effekt von HN-trunkierten Derivaten auf V642I APP-induziertes neuronales Absterben wird demonstriert. Wie in 9 dargestellt, wurden die F11-Zellen mit V642I APP cDNA in der Gegenwart oder Abwesenheit eines jeweiligen synthetischen HN-Derivats transfiziert; und 72 Stunden später wurde das zelluläre Absterben durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay gemessen. Das obere Panel zur Linken demonstriert das Ergebnis der Untersuchung auf die N-terminal trunkierten HNs, wobei die Sequenzen im Panel darunter angegeben werden. Das obere Panel auf der rechten Seite demonstriert das Ergebnis der Untersuchung auf C-terminal trunkierte Polypeptide von ΔN2 HN, wobei diese Sequenzen im Panel darunter angegeben werden. Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind angegeben. Die Ergebnisse, erhalten in den Experimenten, angegeben im den Panel, sind in dem unteren Panel zusammengefasst.
  • 22 stellt Balkendiagramme dar, welche den Effekt von ΔN3 HN und HN-17 auf neuronales Absterben, induziert durch vier verschiedene Typen von FAD-Genen, demonstrieren. F11-Zellen wurden transfiziert mit V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 cDNA in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μM ΔN3 HN oder HN-17; und 72 Stunden später wurde zelluläres Abster ben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay (oberes linkes Panel). Das oberste Panel auf der rechten und die unteren Panel zeigen Dosis-Antwort-Kurven des Effekts von HN-17 auf die neuronales Absterben unterdrückende Wirkung von FAD-Genen. F11-Zellen wurden transfiziert mit jeweiligen FAD-Genen (V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 cDNA) in ähnlicher Art und Weise in der Abwesenheit oder Gegenwart von graduell ansteigenden Konzentrationen, wie in der Figur von synthetischem HN-17 dargestellt. 72 Stunden später wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Das Ergebnis der nicht-transfizierten Zellen mit FAD-Genen wird als "keine T" angegeben. Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • 23 stellt Balkendiagramme dar, welche den Effekt von Ala-substituiertem (Ala-gescanntem) HNG-17 auf neuronales Absterben, verursacht durch vier verschiedene Typen von FAD-Genen und Aβ1-43 demonstrieren. Primär kultivierte Neuronen wurden mit 25 μM Aβ1-43 (oberes Panel auf der linken Seite) behandelt oder F11-Zellen wurden mit V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 cDNA (andere Panel) transfiziert und zwar in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 nM Ala-substituiertem HNG-17; und 72 Stunden später wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Ein antagonisierender Effekt für zelluläres Absterben von jedem Ala-substituiertem HNG-17 wurde bestimmt. Substituierte Reste werden unten in dem Graphen angegeben. Aminosäuresequenzen von jeder Ala-substituierten Form sind in ihrer Reihenfolge von SEQ ID NO: 25 bis 41 angegeben. Beispielsweise zeigten im obersten Panel auf der linken Seite die primär kultivierten Neuronen, inkubiert für 72 Stunden mit 25 μM Aβ1-43 in der Gegenwart von 10 nM ARGFSCLLLLTGEUDLP (das unterstrichene A ist substituiert von P)(SEQ ID NO: 25) eine Zell-Mortalität von 75,3 ± 4,4% (Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten), was vergleichbar war mit der Zell-Mortalität von Neuronen, inkubiert mit Aβ1-43 (76,1 ± 4,7%). Wenn Neuronen mit 25 μM Aβ1-43 in der Gegenwart von 10 nM HNG oder HNG-17 inkubiert wurden, war die Zell-Mortalität 29,3 ± 0,9% bzw. 28,8 ± 1,3%, was vergleichbar war mit der basalen Zell-Mortalität (30,0 ± 1,6%). Die Ergebnisse zeigten an, dass "no T" Ergebnisse von Zellen, nicht transfiziert mit FAD-Genen sind; "vec" von Zellen, transfiziert mit einem leeren Vektor; und "no" von Zellen, unbehandelt mit Polypeptiden. Mittelwert ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • 24 stellt Balkendiagramme dar, welche den Effekt von mutierten HNG-Polypeptiden demonstrieren, wobei Cys an Position 8 von HNG substituiert ist mit anderen Aminosäuren, um zelluläres Absterben zu unterdrücken.
  • Oberstes Panel: F11-Zellen in ihrer ursprünglichen Form oder F11-Zellen, transfiziert mit V642I-APP cDNA (1 μg) wurden behandelt mit irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM), wobei C8 substituiert ist mit irgendeinem von 19 möglichen Aminosäureresten (angegeben durch einen Einbuchstaben-Code in der Figur). 72 Stunden nach der Initiation der Transfektion wurde die Zell-Mortalität gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Ergebnisse von Behandlung ohne Peptid werden angegeben als "no T"; und "vec" für transfektion mit einem leeren pcDNA-Vektor. "C" zeigt das ursprüngliche HNG (SEQ ID NO: 8). "A" ist HNA (SEQ ID NO: 9). Die Aminosäuresequenzen von Polypeptiden "D" bis "Y" werden angegeben in der Reihenfolge von SEQ ID NO: 42 bis 59. Die Zell-Mortalität wird angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichungswerten von drei unabhängigen Experimenten. Der Anteil an toten Zellen unter allen Zellen (% toter Zellen) wird angegeben.
  • Mittlere Panels: F11-Zellen in ihrer ursprünglichen Form oder F11-Zellen, transfiziert mit 1 μg an FAD-Gen (linkes Panel: K595N/M596L-APP; mittleres Panel: M146L-PS-1; rechtes Panel: N141I-PS-2) wurden mit irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM) behandelt, wobei C8 substituiert ist mit irgendeinem der angegebenen Aminosäurereste. 72 Stunden nach der Initiation und Transfektion wurde die Zell-Mortalität gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Ergebnisse der Behandlung ohne Polypeptid sind angegeben als "no T" und "vec" für Transfektion mit einem leeren pcDNA-Vektor. Die Werte sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten.
  • Unteres Panel: primär kultivierte kortikale Neuronen wurden mit 25 μM Aβ1-43 in der Gegenwart von irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM) behandelt, wobei C8 substituiert ist mit dem angegebenen Aminosäurerest. Zell-Mortalität wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay 72 Stunden nach der Initiation der Aβ-Behandlung (linkes Panel) und ein Zell-Lebensfähigkeit-Assay wurde durchgeführt durch Calcein-Anfärben (rechtes Panel). Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung-Werte von drei unabhängigen Experimenten.
  • 25 stellt Graphen dar, welche den Effekt von AGA-HNG (SEQ ID NO: 60) auf neuronales Absterben, induziert durch vier verschiedene Typen von FAD-Genen und Aβ1-43 demonstrieren. Primäre kultivierte Neuronen wurden mit 25 μM Aβ1-43 in Abwesenheit oder Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von AGA-HNG (Panel B) behandelt oder F11-Zellen wurden transfiziert mit V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2 cDNA (Panels C bis F) und 72 Stunden später wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. In dem primären, kultivierten Neuronen-Experiment unter Verwendung von Aβ wurden verschiedene Konzentrationen von HNG verwendet, um ähnliche Experimente als Kontrollen durchzuführen. Die Ergebnisse der nicht-transfizierten Zellen werden angegeben als "no T" und die Ergebnisse der Zellen, transfiziert mit dem leeren Vektor als "pcDNA". Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten sind in den Graphen angegeben.
  • Beste Art und Weise zum Durchführen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird im Detail beschrieben unter Verwendung der Beispiele unten, jedoch sollte die Erfindung nicht so konstruiert werden, als ob sie auf diese Beispiele limitiert sei. Die Experimentellen Prozeduren, beschrieben in diesen Beispielen waren wie folgt:
    V642I APP cDNA wurde bereits früher beschrieben (Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349–1352). Die M146L-Mutante von PS-1 cDNA und die N141I-Mutante von PS-2 cDNA waren Geschenke von Dr. Peter St. George-Hyslop (Sherrington, R. et al. (1995) Nature 375, 754–760) bzw. Dr. Luciano D'Admio (Wolozin, B. et al. (1996) Science 274, 1710–1713). Alle der in den Beispielen verwendeten FAD-Gene wurden kodiert in pcDNA-Vektoren (Funk, C. D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5638–5642). Die ALS-assoziierte Mutante von SOD1 cDNA (A4T, G85R, G93A)(Takahashi, H. et al. (1994) Acta Neuropathol. 88, 185–8) und pDN-E/G5H-Q79 waren Geschenke von Dr. Shoji Tsuji, (Niigata University School of Medicine, Niigata, Japan) bzw. Dr. Akira Kakizuka (Osaka Biomedical Research Center, Osaka, Japan).
  • Die pHN-Plasmide, kodierend Numanin, wurden konstruiert durch Insertieren von HN cDNAs in Polyklonierungsstellen von pFLAG-CMV-5a-Vektoren (pFLAG)(Eastman Kodak). Genauer gesagt wurden pFLAG-CMV-5a-Plasmide verdaut mit EcoRI und KpnI und das HN-kodierende Sense-Oligonukleotid (5'-AATTCACCATGGCTCAACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCAGGTAC-3'/SEQ ID NO: 1) und Antisense-Oligo-nukleotid (5'-CTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGACAGCTGAACCCTCGTGGAGCCATGGTG-3'/SEQ ID NO: 2) wurden ligiert. Das Plasmid exprimiert Humanin-Polypeptid, fusioniert mit FLAG-tag (DYKDDDDK) am C-Terminus.
  • Die pFLAG-Plasmide (pHNG und pHNA), kodierend mutiertes HN, wurden konstruiert aus pHN unter Verwendung von Quick-Change-ortsgerichtetem Mutagenese-Kit (Stratagene). Die Sequenz wurde bestätigt durch direktes Sequenzieren. Um HN-EGFP-Plasmid zu konstruieren, wurden zuerst HN-kodierende Sens- und Anti-Sens-Oligonukleotide phosphoryliert; und nach Annealen bei 95°C für 3 Minuten wurde das Oligonukleotid in die EcoRI-KpnI-Stelle von pEGFP-N3-Vektor (Clontech Laboratories) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase subkloniert. Synthetische HN-Polypeptide (sHN) und strukturell modifizierte synthetische Polypeptide, aufgereinigt auf 95% oder höhere Reinheit, wurden verwendet. Synthetisches HN (sHN) und verschiedene andere synthetische HN-abgeleitete Polypeptide wurden erhalten aus zwei verschiedenen Quellen, und führten essenziell zu den gleichen Ergebnissen. Anti-FLAG-Antikörper wurden käuflich erworben von Eastman Kodak (M2 monoklonaler Antikörper, Cat. #IB13010).
  • Aβ1-43 wurde käuflich erworben von BACHEM (Cat. #H-1586). Andere Reagenzien waren alle kommerziell verfügbar.
  • Die Expressions-cDNA-Bibliothek, kodiert in pEF-BOS, wurde konstruiert von Poly(A)+RNA, extrahiert von Gehirnproben (okzipitales Kortex) eines Patienten mit sporadischer AD, bestätigt durch Biopsie gemäß den Richtlinien des Instituts. Die Poly(A)+RNA wurde revers transkribiert unter Verwendung eines modifizierten Oligo-dT-Primers, enthaltend eine NotI-Stelle. Doppelsträngige cDNA wurde ligiert mit EcoRI-BstXI-Adapterprimern (5'-pGAA TTC ACC. ACA-3' und 3'-CTT AAG GTGp-5') und wurden mit NotI geschnitten. Nach Entfernen niederrnolekulargewichtiger DNA's wurde die cDNA mit BstXI-NotI-Fragment von pEF-BOS ligiert und in XL1-Blue-MRF'-Strang durch Elektroporation transformiert. Die primäre Bibliothek-Größe und die mittlere Insert-Größe waren 3,2 × 106 cfu/16 ml bzw. 0,9 kb.
  • F11-Zellen (Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499–3503; Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349–1352) wurden in HamF-12-Medien kultiviert, enthaltend 18% fötales Rinderserum (FBS) und Antibiotika. 7 × 104/Well von F11-Zellen wurden ausgesät in eine 6-Well-Platte; kultiviert in HamF-12, enthaltend 18% FBS für 12 bis 16 Stunden; transfiziert 3 Stunden mit Plasmiden, kodierend FAD-Gene und Plasmiden, kodierend HN (pHN und dergleichen) durch Lipofektion in der Abwesenheit von Serum (1 μg von FAD-cDNA-Expressionsplasmid, 1 μg von HN-cDNA-Expressionsplasmid, 4 μl an LipofectAMINE, 8 μl an Plus-Reagenz); und wurden dann anschließend für 2 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS, kultiviert. Anschließend wurde Kulturmedium ausgetauscht mit HamF-12-Medium, enthaltend 10% FBS; und die Zellen wurden für weitere 67 Stunden kultiviert. 72 Stunden nach Transfektion wurde zelluläres Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Experimente unter Verwendung von HN-Polypeptiden wurden durchgeführt wie folgt: F11-Zellen (bei 7 × 104/Well in einer 6-Well-Platte) wurden 3 Stunden mit FAD-Genen transfiziert in der Abwesenheit von Serum, wie oben erwähnt; nach Kultivierung für 2 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS, wurden die Zellen für 67 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 10% FBS, mit verschiedenen Konzentrationen an HN-Polypeptiden kultiviert; und zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. ALS-assoziierte Mutanten-cDNAs von SOD1 wurden zur gleichen Zeit transfiziert und hinsichtlich Neurotoxizität untersucht.
  • Um Kulturüberstand von F11-Zellen, transfiziert mit pHN (CM/F11-pHN) zu erhalten, wurden F11-Zellen, mit pHN in der Abwesenheit von Serum durch Lipofektion für 3 Stunden transfiziert (1 μg von pHN, 2 μl an LipofectAMIN, 4 μl ab Plus-Reagenz); und wurden für 2 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS, kultiviert. Anschließend wurde das Medium ausgetauscht mit HamF-12-Medium, enthaltend 10% FBS und die Zellen wurden zusätzlich für 67 Stunden kultiviert. CM/F11-pHN wurde erhalten durch einmaliges Frieren und Auftauen des Kulturmediums. CM/F11-vec wurde in ähnlicher Art und Weise aus pFLAG-transfizierten F11-Zellen hergestellt. Für die Immunoblot-Analyse von CM/F11-pHN, CM/F11-pHNG, und CM/F11-pHNA wurde Protease-Inhibitor-Cocktail (Boehringer Mannheim, Cat. #1697498; eine Tablette wurde in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst und ein Volumen, 1/25 von demjenigen der Probe, wurde zu der Probe hinzugefügt) zum Kulturmedium hinzugefügt, das nicht eingefroren und aufgetaut worden war. Für die Immunoblot-Analyse unter Verwendung von Zell-Lysaten wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 30 μl eines homogenisierenden Puffers [10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100 und 1 Tablette/50 ml an Protease-Inhibitor-Cocktail] suspendiert. Nach zwei Einfrier-Auftau-Zyklen wurde das Zellhomogenat zentrifugiert bei 15.000 rpm für 10 Minuten bei 4°C und der Überstand wurde zur Immunoblotanalyse mit Tris/Tricin-Gelelektrophorese unterzogen. Tris/Tricin-Gelelektrophorese wurde durchgeführt gemäß der Literatur (Schagger, H. und von Jagow, G. (1987) Analytical Biochemistry 166, 168–179).
  • F11/EcR/V642I-Zellen wurden etabliert unter Verwendung von Ekdysone-induzierbaren V642I APP-Expressions-Plasmid. Zunächst wurde der Co-Expressionsvektor pVgRXR in F11-Zellen transfiziert (Invitrogen) und die Zellen wurden einer Zeocin-Selektion unterzogen, um F11-Zellen zu etablieren (F11/EcR-Zellen), welche stabil sowohl Ekdyson-Rezeptor (EcR) als auch den Retinoid-X-Rezeptor RXR überexprimierten. V642I APP cDNA wurde in pIND-Vektor insertiert (Invitrogen) mit einer Vielzahl von Kopien von Ekdyson-responsiven Sequenzen; und nach Transfektion des Vektors in F11/EcR-Zellen wurde G418-Selektion durchgeführt. F11/EcR/V642I-Zellen wurden kloniert durch limitierende Verdünnung. F11/ECR/V642I-Zellen wurden kultiviert in HamF-12-Medien, enthaltend 18% FBS und Antibiotika. Vor Ekdyson-Behandlung wurden die Zellen für 24 Stunden in der Ge genwart von 10% FBS kultiviert. Anschließend wurde Ekdyson (40 μM Ponasteron; Invitrogen Cat. #H101-01) dem Zell-Kultur-Medium in der Gegenwart von 10% FBS hinzugefügt. Zelluläres Absterben trat bei jeder der F11/EcR/V642I-Zellen als Antwort auf die Ekdyson-Behandlung auf und die zelluläre Mortalität 72 Stunden nach der Behandlung in allen Zellen betrug 60 bis 70% was 80 bis 90% nach 96 Stunden der Behandlung ausmachte. Eine detailliertere Analyse von F11/EcR/V642I-Zellen ist anderswo beschrieben (siehe Internationale Anmeldung Nr. WO00/14204).
  • F11/EcR-Zell-Experimente unter Verwendung von Ekdyson wurden durchgeführt wie folgt: F11/EcR-Zellen wurden ausgesät bei 7 × 104/Welt in eine 6-Well-Platte; kultiviert für 12 bis 16 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS; und wurden zugleich transfiziert in der Abwesenheit von Serum für 3 Stunden mit 1 μg an Ekdyson-induzierbarem Plasmid allein oder mit 1 μg an HN-kodierendem Plasmid, wie oben erwähnt. Nach Kultivieren für 12 bis 16 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS, wurden die Zellen kultiviert für 2 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 10% FBS, und anschließend wurde Ekdyson (Ponasteron) zum Medium hinzugefügt (letztendliche Konzentration von 40 μM). Zelluläres Absterben wurde 72 Stunden nach Ekdyson-Behandlung gemessen. Experimente unter Verwendung von synthetischen HN-Polypeptiden wurden wie folgt durchgeführt: Zellen wurden zur gleichen Zeit transfiziert für 3 Stunden mit FAD-Genen in der Abwesenheit von Serum; kultiviert für 12 bis 16 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 18% FBS; kultiviert für 2 Stunden in HamF-12-Medium, enthaltend 10% FBS und verschiedenen Konzentrationen von HN-Polypeptid; und anschließend wurde 40 μM Ponasteron zum Medium hinzugegeben. Zelluläres Absterben wurde gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay nach 72 Stunden, ausgehend von der Ekdyson-Behandlung. ND/SCA-assoziierte Q79 cDNAs wurden auch in ähnlicher Art und Weise transfiziert und die Neurotoxiztät wurde getestet.
  • Die primäre Kultur von Maus-kortikalen Neuronen wurde durchgeführt in Poly-D-Lysingecoateden 24-Well Platten (Sumitomo Bakelite), in der Abwesenheit von Serum und in der Gegenwart von N2-Supplement, wie in der Literatur beschrieben (Eksioglu, Y. Z. et al. (1994) Brain Res. 644, 282–90). Die Reinheit von Neuronen, hergestellt gemäß dem Verfahren, betrug > 98%. Die hergestellten Neuronen (1,25 × 105/Well, 250 μl Mdium/Well) wurden vorinkubiert in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 nM oder 10 μM sHN-Polypeptiden für 16 Stunden; und wurden behandelt mit 25 μM Aβ1-43 in der Abwesenheit oder Anwesenheit von sHN-Polypeptiden bei den gleichen Konzentrationen für 24 bis 72 Stunden. Da die primär kultivierten Neuronen selbst durch temporäre Trockenheit während des Mediumsaustausch geschädigt werden, wurde die Behandlung von Zellen durch Aβ1-43 wie folgt durchgeführt. Zuerst wurde die Hälfte des Volumens des alten Mediums (125 μl) verworfen. Anschließend wurden 125 μl von vorgewärmtem frischem Medium, enthaltend 50 μM Aβ1-43 und sHN in einer Konzentration, wie oben angegeben, zur Kultur hinzugegeben.
  • Trypan-Blau-Exklusions-Assay wurde wie folgt durchgeführt. Ohne Vorwaschen wurden die Zellen unter mildem Pipettieren in ein serumfreies Medium suspendiert. 50 μl an 0,4% Trypan-Blau-Lösung (Sigma, Cat. #T-8154) wurden (letztendliche Konzentration von 0,08%) zu 200 μl der Zellsuspension hinzugegeben, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur vermischt. Innerhalb von 3 Minuten der Trypan-Blau-Lösung-Zugabe wurden die angefärbten Zellen gezählt. Die Zell-Mortalität wurde bestimmt [100-Zell-Überlebensrate (%)], basierend auf der angefärbten Zell-Zahl. LDH-Assay wurde durchgeführt unter Verwendung eines Kits (LDH-Cytotoxic Test; Wako Pure Chemical Industries, Cat. #299-50601) durch Abstecken von Proben von 6 μl an Medium, in welchem Neuronen kultiviert wurden. Calcein-Anfärben wurde durchgeführt, wie in der Literatur beschrieben (Bozyczko-Coyne, D. et al. (1993) Journal of Neuroscience Methods 50, 205–216). Genauer gesagt wurden 6 μM an Calcein-AM {3',6'-Di-(O-Acetyl)-2',7'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, Tetraacetoxymethylester, Dojindo, Cat. #349-07201} zu den Neuronen hinzugegeben; und 30 Minuten oder länger nach der Calcein-AM-Behandlung wurde die Fluoreszenz (ex = 490 nm, em = 515 nm) durch Fluoreszenz- Mikroskopie beobachtet und durch ein Spektrometer gemessen. Spezifische Fluoreszenz wurde berechnet durch Abziehen der Untergrund-Fluoreszenz von der gesamten Fluoreszenz. Die Untergrund-Fluoreszenz wurde dem Wert zugeschrieben, der aus der linearen Trypan-Blau-Positivität-Fluoreszenz-Intensität Beziehung berechnet werden konnte, korrespondierend mit 100% Trypan-Blau-Positivität.
  • Der Assay wurde zumindest dreimal durchgeführt durch Wiederholen der unabhängigen Transfektion oder Behandlung. Der Student-t-Test wurde durchgeführt als statistische Analyse.
  • Radio-Labeln von Oligonukleotiden für Northern-Blot-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung von Renaissance-3'-End-Labeling-System (NEN) mit terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase (TdT). Genauer gesagt wurden 75 pmol des Sonden-Oligonukleotids, 100 pmol von 3'-[32P]-dATP (185TBq/mmol, NEN) und 36 Einheiten von TdT bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend wurden die gelabelten Oligonukleotide durch Gelfiltration abgetrennt. 1 × 106 bis 5 × 106 cpm/μl gelabelte Proben wurden erhalten gemäß dieser Prozedur. 5'-CTG CCC GCC TCT TCA CGG GCA GGT CAA TTT CAC TGG TTA AAA GTA AGA GAC AGC TGA ACC CTC GTG GAG CCA TGT GGT G-3' (SEQ ID NO: 3) wurde als Antisense-HN verwendet. Das cDNA-Fragment wurde radiogelabelt unter Verwendung des Ready-To-Go zufälligen Labelsystems (Amersham Pharmacia). Genauer gesagt wurden nach Inkubation von 50 bis 500 ng von denaturierten DNA-Fragmenten und 1,85 MBq[α-32P]dCTP für 30 Minuten bei 37°C die gelabelten DNA-Fragmente durch Gelfiltration abgetrennt. Ungefähr 5 × 107 cpm/μg DNA von gelabelten Proben wurden durch diese Prozedur erhalten. Northern-Blot-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung von ExpressHyb (Clontech). Genauer gesagt wurden nach Prähybridisierung Membranen geblottet mit Gewebs-PolyA+-RNA (menschliche Gewebsmembranen, erhalten von Clontech; Maus-Gewebsmembran, erhalten von Origene) mit radiogelabelten Sonden vollgesogen (2 bis 5 × 107 cpm) für 18 Stunden. Nach Waschen der Membrane durch zwei Schritte gemäß den Richtungen wurden die Membrane röntgenfotografischen Filmen bei –70°C ausgesetzt unter Verwendung von zwei intensivierenden Screens.
  • [Beispiel 1]
  • Identifikation von Humanin
  • Die F11-Zelle, etabliert durch Fusionieren von E17.5 primär kultivierten Ratten-Neuronen und Maus-Neuroblastom NTG18 ist ein immortalisiertes Zell-Modell von primären kultivierten Neuronen (Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499–3503). Ohne ein Differentationsstimulus behält die Zelle typische Eigenschaften von primär kultivierten Neuronen, wie z.B. die Produktion eines Aktivierungspotenzials (Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499–3503). Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass nach Transfektion von F11-Zellen mit cDNA kodierend V642I/F/G APP, d.h. drei Arten von FAD-causativen Genen, vorübergehende Ex pression von V642-Mutanten APP zelluläres Absterben erzeugt (Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349–1352). Dementsprechend verwendete der vorliegende Erfinder das jüngst entwickelte Ekdyson-induzierbare System (No, D. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 3346–51), um F11-Klone zu konstruieren, wobei das V642I APP induzierbar ist. F11-Zellen, worin die Expression von V642I APP induziert werden kann, wurden wie folgt etabliert: zunächst wurden F11-Klone (F11/EcR), welche sowohl Ekdyson-Rezeptor als auch RXR überexprimierten, etabliert; und anschließend wurden die Zellen stabil transfiziert mit pIND-V642I APP, welcher V642I APP cDNA kodiert, die durch einen HSV-Promotor platziert unter Kontrolle von Ekdyson-responsiven Sequenzen exprimiert wird. In ihrer ursprünglichen Form exprimieren F11/EcR/V642I-Klon-Zellen, wie oben etabliert, kaum V642I APP. Jedoch wurde konditionierte Überexpression von V642I APP aus den Zellen aufgrund von Ekdyson-Behandlung bestätigt. Des Weiteren wurde zelluläres Absterben als Antwort auf Ekdyson-Behandlung in allen der F11/EcR/V642I-Zellen induziert; und Zell-Mortalität in allen F11/EcR/V642I-Zellen erreichte 60 bis 70% nach 72 Stunden der Behandlung und 80 bis 90% nach 96 Stunden der Behandlung.
  • Unter Verwendung dieser Zellen und unter grundlegendem Folgen des Verfahrens, wie von D'Adamio et al. beschrieben (D'Adamio, L. et al. (1997) Semin. Immunol. 9, 17–23), wurde "Absterben-Fallen-Screenen" durchgeführt unter Verwendung einer modifizierten Version des Verfahrens von D'Adamio et al. In dem ursprünglich beschriebenen "Absterben-Fallen-Screening" transfizierten Vito et al. Jurkat-Zellen mit normaler T-Zell-cDNA-Bibliothek; induzierten zelluläres Absterben durch Stimulieren von T-Zell-Rezeptoren; und sammelten Gene, welche zelluläres Absterben antagonisierten. Der vorliegende Erfinder führte Absterben-Fallen-Screening durch, um nach Genen zu screenen, welche zelluläres Absterben, induziert durch AD-Gene antagonisierten. Zunächst wurden F11/EcR/V642I-Zellen mit Säuge-Expressions-cDNA-Bibliothek transfiziert [cDNA wurde hergestellt aus Gehirn-Proben (okzipitales Cortex) von Alzheimer-Patienten; und die Bibliothek wurde konstruiert unter Verwendung eines Säuger-Zell-Expressionsvektors-pEF-BOS mit dem Elongationsfaktor-Promotor](Mizushima und Nagata, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 5322); die Zellen wurden für 72 Stunden in Ekdyson behandelt und die Plasmide wurden aus überlebenden Zellen gesammelt. Die Prozedur wurde dreimal wiederholt und ultimativ wurden Plasmide von ungefähr 250 Klonen erhalten. Die Klone wurden in 36 Gruppen kategorisiert, welche miteinander kreuzhybridisieren durch Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung der entsprechenden Plasmide. Die größe Gruppe umfasste 28 Klone.
  • Fokusierend auf diese Grupp von cDNAs hat der vorliegende Erfinder alle Klone sequenziert. Als ein Ergebnis zeigte sich, dass Klone, welche zu dieser Gruppe gehören, im Allgemeinen aus einer cDNA bestanden mit einer daran fusionierten Sequenz von 1535 bp; genauer gesagt einer 5'-Sequenz, homolog zu nicht-kodierenden Regionen von Wnt-13, einer 3'-Sequenz, homolog zu mitochondrialer 16S ribosomaler RNA und einer Poly(A)-Region am C-Terminus. Die gesamte Sequenz war neu (1). Nach Sequenzieren eines jeden Klones wurde untersucht, ob die vorübergehende Transfektion der jeweiligen Klone signifikant das zelluläre Absterben, induziert durch Ekdyson, in F11/EcR-Zellen co-transfiziert mit pIND-V642I APP unterdrückte. Als ein Ergebnis des Vergleichs der Sequenzen, welche eine ein zelluläres Absterben-unterdrückende Aktivität demonstrierten, wurde eine antagonisierende Aktivität gegen zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP, gefunden als kodiert durch einen 75 Basenpaar großen offenen Leserahmen (open reading frame, ORF)(5'-ATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATGA-3'/SEQ ID NO: 4), kodierend ein neues 24 Aminosäuren großes Polypeptid "MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA" (SEQ ID NO: 5). Der vorliegende Erfinder bezeichnete dieses Molekül als Humanin (HN).
  • [Beispiel 2]
  • Unterdrückender Effekt der entsprechenden Klone auf zelluläres Absterben, induziert durch FAD-Gene
  • 2 bis 4 demonstrieren die Effekte der Co-Transfektion der jeweiligen Klone, welche zu dieser Gruppe gehören. Wenn F11/EcR-Zellen (F11-Klone stabil exprimierend EcR und RXR, worin die Expression der Gene kodiert durch pIND-Plasmide induziert wird durch Ekdyson) transient mit pIND, kodierend V642I APP, in der Abwesenheit von Ekdyson (nicht-V642I APP induzierende Bedingungen) transient transfiziert wurden, trat 72 Stunden später Zell-Absterben in ungefähr 20% der Zellen auf, wohingegen Zell-Absterben in einem signifikant höheren Anteil (50 bis 60%) an Zellen in der Anwesenheit von Ekdyson (V642I APP induzierende Bedingungen)(2) auftrat. F11/EcR- Zellen, transfiziert mit DT63-kodierenden pEF-BOS zusätzlich zu V642I APP-kodierendem pIND demonstrierte keinen signifikanten Anstieg des Zell-Absterbens, induziert durch Ekdyson selbst in der Gegenwart von Ekdyson. Auf der anderen Seite demonstrierten Zellen, transfiziert mit pEF-BOS oder pEF-BOS, kodierend DT171 signifikanten Anstieg an Zell-Absterben als Antwort auf Ekdyson. 3 demonstriert das Ergebnis, bestätigend den Effekt von DT63 auf neuronales Absterben, induziert durch vier FAD-Gene (V642I APP, NL APP, M146L PS-1 und N141I PS-2), jeweils unter Verwendung einerfacher transienter Transfektion. Wenn F11-Zellen mit leeren pEF-BOS induziert wurden zusätzlich zu pcDNA, kodierend irgendeines der FAD-Gene (V642I APP, NL APP, M146L PS-1 oder N141I PS-2), führte die Inkubation für 72 Stunden zu Zell-Absterben in 50 bis 70% der Zellen. Die Transfektions-Effizienz unter dieser Bedingung betrug ungefähr 60 bis 70%, was darauf hindeutet, dass Zell-Absterben nach 72 Stunden von der Transfektion ab gerechnet in den meisten der Zellen auftrat, welche eines der FAD-Gene exprimierten. Zunahme im Zell-Absterben wurde dramatisch unterdrückt durch das Transfizieren von F11-Zellen mit DT63-kodierendem pEF-BOS zusätzlich zu einem der FAD-Gene. Dies zeigt an, dass DT63 cDNA das Zell-Absterben, induziert durch die vier Gene mit einer hohen Effizienz antagonisiert. 4 demonstriert den Effekt von anderen DT-Klonen, welche die gesamte HN-Sequenz enthalten und anderen DT-Klonen, welche nicht die gesamte Sequenz enthalten (DT29, DT44 und DT171 cDNA). Obwohl merkliche Unterdrückung des Zell-Absterbens, induziert durch ein jedes der FAD-Gene mit DT29 und DT44 demonstriert wurde, was Klone sind, welche die gesamte HN-Sequenz kodieren, konnte die Wirkweise des Antagonisierens des Zell-Absterbens nicht mit DT171 bestätigt werden, welcher das erste ATG-Kodon von HN fehlt. Diese Daten deuten darauf hin, dass der offene Leserahmen, kodiert durch HN-Neuronen gegen zelluläres Absterben schützt, verursacht durch alle vier FAD-Gene.
  • Folglich subklonierte der vorliegende Erfinder HN cDNA in den pFLAG-Vektor (pHN) und untersuchte direkt den Effekt von pHN gegen neuronales Absterben, verursacht durch ein jedes der FAD-Gene V642I APP, NL-APP, M146L PS-1 und N141I PS-2. Wie zu erwarten war, zeigt die Transfektion von pHN in F11-Zellen kaum Toxizität und des Weiteren wurde die Toxizität durch die FAD-Gene enttoxizitiert (5). Die antagonisierende Aktivität ist nicht das Ergebnis der Unterdrückung der Expression der jeweiligen FAD-Gene durch pHN. Dies wird durch die Tatsache verifiziert, dass co- transfiziertes pHN nicht die Expression von FAD-Genen verändert, welche durch den CMV-Promotor exprimiert werden, was angezeigt wurde aus dem Ergebnis, dass pHN Co-Transfektion die Expression von EGFP, exprimiert mit dem CMV-Promotor nicht veränderte. (Daten nicht gezeigt). Des Weiteren bestätigte das Immunoblotten von V642I APP, NL-APP und N141I PS-2, dass die Transfektion von pHN kaum irgendeinen Effekt auf die Expression dieser Gene aufweist (Daten nicht gezeigt).
  • [Beispiel 3]
  • Extrazelluläre Sekretion von HN
  • Im Verlauf der Experimente wurde gezeigt, dass der Kulturüberstand von F11-Zellen transfiziert mit pHN (CM/F11-pHN) signifikant zelluläres Absterben induziert durch FAD-Gene, umfassend V642I APP, induzierte. Zelluläres Absterben wurde induziert in höchsten Raten in F11-Zellen, transfiziert mit V642I APP cDNA in der Gegenwart von frischem Medium oder Kulturüberstand von F11-Zellen, transfiziert mit leerem pFLAG-Vektor (CM/F11-vec), jedoch im Gegensatz dazu verminderte sich in der Gegenwart von CM/F11-pHN das zelluläre Absterben dramatisch in F11-Zellen, transfiziert mit V642I APP cDNA (6). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit DT-Klonen. Vollständige Unterdrückung von V642I APP-induziertem Zell-Absterben von F11-Zellen wurde beobachtet mit CM/DT29 und CM/DT63, jedoch nicht mit CM/DT171. Dieses Ergebnis zeigt, dass HN-Polypeptide trankribiert von HN oder cDNA kodierend HN in das Kulturmedium sekretiert werden und so zelluläres Absterben induziert durch V642I APP unterdrücken. 7 demonstriert das Ergebnis der Untersuchung auf die Immunoreaktivität von HN in CM/F11-pHN unter Verwendung von anti-FLAG-Antikörpern. CM/F11-pHN und das Lysat von Zellen, transfiziert mit pHN, zeigte eine einzelne Bande bei 3 bis 4 kDa, was die Immunoreaktivität von HN anzeigt, wobei deren Größe mit dem erwarteten Molekulargewicht für FLAG-fusioniertes HN übereinstimmt (3837 Da; 7, linke und mittlere Panels). Konzentrationsbestimmung unter Verwendung von synthetischen FLAG-fusionierten HN-Polypeptid (MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRAGTDYKDDDDK: Flag-tag ist unterstrichen)(SEQ ID NO: 6) demonstrierte, dass HN in CM/F11-pHN bei einer Konzentration von 8 bis 9 μM vorliegt (7, rechtes Panel). Dieses Ergebnis zeigt an, dass HN von pHN transkribiert wird und in den Kulturüberstand sekretiert wird.
  • [Beispiel 4]
  • HN-kodierte Signalsequenz-artige Aktivitäten
  • 23 bis 24 N-terminale Reste der gesamten 24 Aminosäuren der HN-Sequenz erfüllen die Anforderungen, welche nötig sind als eine Signalsequenz (Nielsen, H. et al., 1999, Protein Eng. 12, 3–9; determination program provided at <http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/>). Die Tatsache, dass intrazellulär exprimiertes HN in das Kulturmedium sekretiert wird bei mikromolaren Konzentrationen legt nahe, dass HN keine Signalsequenz-Aktivität selbst hat, sondern eine Aktivität ähnlich zu derjenigen einer Signalsequenz. Da das Flag-tag am C-Terminus positioniert ist und das sekretierte HN-Polypeptid ein Molekulargewicht, übereinstimmend mit der Größe, erwartet für FLAG-fusioniertes HN aufweist, ist nahegelegt, dass die gesamte HN-Sequenz eine Signalsequenz-artige Sekretions-Aktivität kodiert.
  • Um die Hypothese zu bestätigen, wurde der Effekt der L9R-Mutation, welche zum Verlust der Signalsequenz-Eigenschaften der HN-Sequenz führen sollte, auf die HN-Sekretion untersucht. Wie zu erwarten war, wurde die L9R-Mutante von HN (HNR) (SEQ ID NO: 7) innerhalb der Zelle, transfiziert mit der cDNA, kodierend die Mutante, exprimiert und die Sekretion in dem Kulturüberstand konnte nicht beobachtet werden (8, oberes Panel). Das Ergebnis demonstriert, dass die Sekretions-Aktivität der Signalsequenz-ähnlichen HN-Sequenz auf der Primär-Struktur von HN kodiert wird. Gemäß einer anderen Untersuchung wurde die Signalsequenz-Aktivität von HN direkt untersucht durch Fusionieren der HN-Sequenz an den N-Terminus von EGFP (HN-EGFP). EGFP mit HN fusioniert an den N-Terminus, wurde in den Kulturüberstand von transfizierten Zellen sekretiert, jedoch das ursprüngliche EGFP wurde überhaupt nicht außerhalb der Zelle sekretiert (8, unteres Panel). Ähnlich zu EGFP wurde EGFP mit HNR, fusioniert an den N-Terminus überhaupt nicht sekretiert. Diese Daten demonstrieren, dass HN selbst eine Signalsequenz-ähnliche Aktivität kodiert. Dies zeigt, dass HN ein einzigartiges sekretorisches Protein ist, welches eine Signalsequenz-ähnliche Sekretions-Aktivität und eine biologische Aktivität zur selben Zeit kodiert.
  • [Beispiel 5]
  • Unterdrückender Effekt von synthetischem HN-Polypeptid auf zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP
  • Als nächstes synthetisierte der vorliegende Erfinder ein synthetisches HN-Polypeptid MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA (SEQ ID NO: 5) und untersuchte seine Wirkweise auf neuronales Absterben, induziert durch V642I APP durch extrazelluläre Polypeptid-Zugabe. Zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP wurde dramatisch unterdrückt durch Transfizieren von F11-Zellen mit V642I APP cDNA und Kultivieren der Zellen in der Gegenwart von 10 μM synthetischem HN-Polypeptid (sHN)(9). Nur eine extrem schwache Unterdrückung zeigte sich bei 10 nM sHN. Die unterdrückende Wirkweise war abhängig von der Konzentration des hinzugegebenen sHN und bei einem Spiegel von 1 bis 10 μM an Polypeptid konnte vollständige Unterdrückung erzielt werden. Der IC50-Wert betrug ungefähr 100 nM. Die dosisabhängige Kurve stimmte mit der Tatsache überein, dass HN, sekretiert bei einem Grad von ungefähr 10 μM in CM/F11-pHN, effizient zelluläres Absterben induziert durch V642I APP unterdrückte.
  • [Beispiel 6]
  • Unterdrückender Effekt des HN-Polypeptids und von strukturellen Derivaten davon auf zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP
  • Der vorliegende Erfinder untersuchte des Weiteren, ob die das Zellabsterben unterdrückende Wirkweise von sHN abhängig von der spezifischen Primärstruktur ist (9). Ein vollständiger antagonisierender Effekt auf zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP konnte beobachtet werden bei einer Konzentration von 10 nM oder weniger mit S14G (MAPRGFSCLLLLTGEIDLPVKRRA: das unterstrichene G ersetzt S; genannt HNG)(SEQ ID NO: 8) als das Polypeptid und der IC50 des Polypeptids war ungefähr 100 pM. Im Gegensatz dazu unterdrückte C8A HN-Polypeptid (MAPRGFSALLLLSEIDLPVKRRA: das unterstrichene A ersetzt C; genannt HNA)(SEQ ID NO: 9) nicht signifikant das zelluläre Absterben, induziert durch V642I APP bei Konzentrationen bis zu 100 μM. Die Bedeutung von Cys an der Stelle 8 wurde auch von dem Ergebnis erhalten unter Verwendung eines HN-Dimers (C8-C8 HN), gebunden über Cys an Position 8. nahegelegt. Der antagonisierende Wirkgrad von C8-C8 HN lag zwischen demjenigen des ursprünglichen HN und HNA. Im Gegensatz dazu zeigte ein Derivat, in welchem HN C-terminales KRRA mit AAAA (SEQ ID NO: 10) substituiert war, ähnliche funktionelle Aktivität mit ursprünglichem HN-Polypeptid. Diese Ergebnisse zeigen, dass die primäre Struktur eine funktionelle Rolle in der unterdrückenden Aktivität von HN spielt und dass spezielle Aminosäurereste eine vorbestimmte Rolle einnehmen.
  • [Beispiel 7]
  • Unterdrückender Effekt von HN-Polypeptiden und strukturellen Derivaten davon auf zelluläres Absterben, induziert durch FAD-Gene
  • Als Nächstes wurde der Effekt von sHN, synthetischem HNG (sHNG) und synthetischem HNA (sHNA) auf zelluläres Absterben induziert durch andere FAD-Gene, genauer gesagt, diejenigen, induziert durch NL-APP, M146L PS-1 und N141I PS-2, untersucht. Wie in 10 angegeben, demonstrierte das ursprüngliche sHN ähnliche Dosis-Antwort auf zelluläres Absterben, induziert durch irgendeines der drei FAD-Gene und blockierte neuronales Absterben, induziert durch FAD-Gene bei einer Konzentration von 1 μM. Bis zu einer Konzentration von 100 μM antagonisierte sHNA nicht das zelluläre Absterben durch irgendeines der FAD-Gene. Im Gegensatz dazu unterdrückte sHNG vollständiges zelluläres Absterben, verursacht durch irgendeines der FAD-Gene bei einer Konzentration von 10 nM oder weniger. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkweise von HN um 100- bis 1000-fach durch S14G-Substitution verstärkt wird. Nimmt man die Wirkweise von sHNG auf zelluläres Absterben, induziert durch V642I APP (9) damit zusammen, so antagonisiert sHNG bei einer Konzentration von 10 nM oder weniger vollständig neuronales Absterben, induziert durch alle der vier verschiedenen Typen von FAD-Genen.
  • [Beispiel 8]
  • Für zelluläres Absterben unterdrückender Effekt durch Transfektion von Vektoren, exprimierend HN und strukturelle Derivate davon
  • Als Nächstes wurde der für das zelluläre Absterben unterdrückende Effekt von HNG oder HNA-kodierendem Plasmid (pHNG bzw. pHNA), verglichen mit pHN untersucht, um die Daten, erhalten für synthetische Polypeptide zu besätigen. Wie in 11 demonstriert, induzierte, ähnlich zum Fall mit pHN, die co-Transfektion von pHNG vollständig zelluläres Absterben, induziert durch alle der 4 verschiedenen Typen von FAD-Genen. Im Gegensatz dazu konnte, selbst wenn HNA-Polypeptide produziert und in das Medium durch pHNA co-Transfektion sekretiert wurden (7), ähnlich wir für die Fälle mit pHN und pHNG, Unterdrückung des zellulären Absterben, verursacht durch irgendeines der FAD-Gene nicht beobachtet werden. Diese Daten, erhalten für jedes der Plasmide, unterstützen nicht nur die Ergebnisse der zuvor erwähnten Polypeptidanalyse, sondern schlagen auch vor, dass HNG-Konzentration mit CM/F11-pHNG (Kulturüberstand von F11-Zellen, transfiziert mit pHNG) über 10 nM hinausgeht. Übereinstimmend mit diesem Ergebnis enthielt gemäß der Immuno-Blot-Analyse der Kulturüberstand von F11-Zellen, transfiziert mit pHNG (CM/F11-pHNG) ungefähr 10 μM an HNG-Polypeptid (7, rechtes Panel). Diese Daten zeigen, dass die das zelluläre Absterben unterdrückende Aktivität von HN determiniert ist durch seine spezifische Aminosäurestruktur, und dass die das zelluläre Absterben unterdrückende Wirkweise, verur sacht durch extrazelluläres Hinzugeben von Polypeptiden auch durch intrazelluläre HN-cDNA-Expression verursacht werden kann.
  • [Beispiel 9]
  • Spezifizität des für das zelluläre Absterben unterdrückenden Effekts von HN
  • Um die Spezifizität der HN-Wirkungsweise zu erläutern, wurde die Fähigkeit von HN, cDNA oder HN-Polypeptid, zelluläres Absterben, induziert durch causative Gene von anderen neurodegenerativen Erkrankungen zu antagonisieren, untersucht. Polyglutamin Q79 mit 72 Repeats gilt gemeinhin als Ursache der Huntington-Erkrankung (Huntington's disease, HD) und von bestimmten Typen von spinozerebellarer Ataxia (spinozerebellar ataxia, SCA)(Ikeda, H. et al. (1996) Nat. Genet. 13, 196–202; Kakizuka, A. (1997) Curr. Opin. Neurol. 10, 285–90). In Übereinstimmung mit dem Bericht, dass Q79-Expression neuronales Absterben verursacht, erlebten F11-Zellen zelluläres Absterben aufgrund der Expression von Q79 (12). Die Untersuchung der Neurotoxizität wurde durchgeführt in der Gegenwart oder Abwesenheit von Ekdyson durch Transfizieren von F11/EcR-Zellen mit Q79-Plasmid, dessen Expression durch Ekdyson induziert wird (pDN-E/GSH-Q79). In diesem System stieg die Zell-Mortalität merklich als Antwort auf die Ekdyson-Behandlung, wenn F11/EcR-Zellen mit pDN-E/G5H-Q79 zusammen mit dem leeren Vektor (pFLAG) transfiziert wurden (12A). Ähnlich wurden hohe Ausmaße an zellulärem Absterben von F11/EcR-Zellen, transfiziert mit pDN-E/G5H-Q79 zusammen mit pHN, pHNG oder pHNA durch Ekdyson-Behandlung induziert. Des Weiteren wurde F11/EcR-zelluläres Absterben verursacht durch Ekdyson-induzierte Expression, von irgendeinem der FAD-Gene effizient durch die Co-Transfektion von pHN unterdrückt (12B). Zelluläres Absterben, induziert durch Q79, wurde nicht nur in dem Experiment unter Verwendung von sHN unterdrückt (12C). Extensive zelluläres Absterben wurde verursacht durch Ekdyson, wenn F11/EcR-Zellen transfiziert wurden mit pDN-E/G5H-Q79, selbst in der Gegenwart von sHN, sHNG oder sHNA bei einer Konzentration von sHN oder sHNG, welche die vollständige Unterdrückung des F11/EcR-Zell-Absterbens verursacht durch irgendeines der 4 Typen von FAD-Genen, gerade so, wie in der Abwesenheit von sHN, sHNG oder sHNA ermöglicht (12D).
  • Des Weiteren untersuchte der vorliegende Erfinder den Effekt von HN auf neuronales Absterben, induziert durch Mutanten von Cu/Zn-abhängiger Superoxid-Dismutase (SOD1), d.h. A4T, G85R oder G93A, assoziiert mit familiärer amyotropher Lateral-Sklerose (familial amyotrophic lateral sclerosis, familial ALS). In Übereinstimmung mit früheren Berichten, welche von der Expression von familiären ALS-assoziierten SOD1-Mutanten berichten, welche zelluläres Absterben von Säuger-Neuronen verursachen (Rabizadeh, S. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 3024–8; Ghadge, G. D. et al. (1997) J. Neurosci. 17, 8756–66), wurde signifikantes zelluläres Absterben induziert mit allen der Mutanten durch Transfizieren von F11-Zellen mit einer cDNA, welche eine der Mutanten exprimiert. Des Weiteren wurde eine ähnlich hohe Zell-Mortalität induziert, wenn F11-Zellen mit pHN co-transfiziert wurden zusätzlich zu jedem der SOD1-Mutanten-Gene (13A). Wie in 13B demonstriert, konnte zelluläres Absterben, verursacht durch irgendeine der familiären ALS-assoziierten SOD1-Mutanten, nicht mit 100 μM von irgendeinem von sHN, sHNG oder sHNA unterdrückt werden. Diese Daten legen nahe, dass das HN den intrazellulären Mechanismus des zellulären Absterbens-Exekutions-Mechanismus, getriggert durch die FAD-Gene aktiviert, jedoch nicht auf zelluläres Absterben, verursacht durch andere neurodegenerative Erkrankungs-Gene wirkt und Verifizieren, dass die antagonisierenden Effekte von HN cDNA und HN-Polypeptiden allgemein gültig und spezifisch für neuronales Absterben, assoziiert mit AD sind.
  • [Beispiel 10]
  • Unterdrückender Effekt von HN auf zelluläres Absterben von primären neuronalen Kulturen
  • Der vorliegende Erfinder untersuchte den Schutz von primären kultivieren Neuronen durch HN gegen Schäden, assoziiert mit AD. Aβ ist die hauptsächliche Peptid-Komponente von senilen Plaquen und eine extrazelluläre Ablagerung, welche pathologisch ein AD-Gehirn charakterisiert und man glaubt, dass es mit dem pathologischen Mechanismus von AD assoziiert ist (Selkoe, D. J. (1994) J. Neuropathot. Exp. Neurol. 53, 438–47; Cummings, J. L. et al. (1998) Neurology 51, S2-17; discussion S65–67). Von der Aβ-Behandlung wurde berichtet, dass sie zelluläres Absterben von primären, kultivierten Neuronen induziert (Loo, D. T. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7951– 7955; Gschwind, M. und Huber, G. (1995) J. Neurochem. 65, 292–300). Wie in 14 demonstriert, wurde extensives zelluläres Absterben, einhergehend mit dystrophen neuritischen Veränderungen des Axons induziert in primär kultivierten kortikalen Neuronen, behandelt mit 25 μM Aβ1-43 für 48 bis 72 Stunden in der Gegenwart oder Anwesenheit von N2-Supplement. Zelluläres Absterben, induziert durch Aβ, wie auch dystrophe neuritische Veränderungen des Axons, wurde drastisch unterdrückt in primären kultivierten Neuronen, welche mit 10 μM sHN vorbehandelt waren. Zelluläres Absterben (gemessen durch Trypan-Blau-Exklusion; 15, linkes Panel) und zelluläre Schäden (gemessen durch LDH-Freisetzung von den Zellen; 16) wurden infolge der Behandlung mit Aβ1-43 beobachtet. Diese Anzeichen von zellulärem Überleben (d.h. gegen zelluläres Absterben und Zellschäden) wurden vollständig wieder hergestellt auf einen Grad, beobachtet unter Ausgangsbedingungen durch Behandlung mit 10 μM sHN. Unter den gleichen Bedingungen zeigten 100 ng/ml an NGF keine Effekte hinsichtlich des Antagonisierens von erhöhter LDH-Freisetzung sowie zelluläres Absterben von Neuronen, induziert durch Aβ (Daten nicht gezeigt). Obwohl sHN einen drastischen Effekt beim Antagonisieren des neuronalen Absterbens, induziert durch Aβ zeigte, konnte ähnliche Behandlung von Neuronen mit 10 μM sHN nicht den toxischen Effekt von 20 μM Etoposid in primären kultivierten Neuronen (15, rechtes Panel; und 16) verhindern. Etoposid ist ein Anti-Krebs-Wirkstoff und von ihm wurde berichtet, dass er zelluläres Absterben von primären kultivieren Neuronen induziert (Nakajima, M. et al. (1994) Brain Res. 641, 350–2). Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass HN neuronales Absterben induziert durch Aβ1-43 durch einen selektiven Mechanismus induziert. Wie in dem Experiment von FAD-Genen unter Verwendung von F11-Zellen gezeigt, schützten 10 nM sHNG vollständig Zellen gegen zelluläres Absterben und dystrophe neuritische Veränderungen des Axons verursacht durch Aβ1-43, jedoch 10 nM sHN oder 10 μM sHNA zeigten beide keinerlei Effekte gegen Neurotoxizität von Aβ (14). Das Ergebnis wurde nicht nur bestätigt durch den LDH-Freisetzungs-Assay (16), welcher ein Assay für Zellschäden ist und durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay (15), sondern auch durch Calcein-Anfärbungs-Assay (17 und 18), welcher in Assay von entwicklungsfähigen Zellen ist. Folglich konnte gezeigt werden, dass HN ähnliche Effekte auf primäre, kultivierte Neuronen, wie auch klonierte Neuronen zeigte. Des Weiteren legen diese Daten die Existenz eines Rezeptors (einer Gruppe von Rezeptoren) nahe, welche spezifische die HN-Struktur erkennt und gemeinsam bei F11-Zellen und primären kultivierten Neuronen vorliegt.
  • [Beispiel 11]
  • Expression von HN mRNA
  • Unter Verwendung von β-Actin mRNA als positive Kontrolle wurde die Expression von HN mRNA in verschiedenen Geweben untersucht. Via Northern-Blot-Analyse von menschlichem Gewebe wurde merkliche HN mRNA-Expression im Herz, skelettalen Muskeln, Niere und Leber (19a) nachgewiesen. Obwohl weniger als in den obengenannten Geweben, wurde auch eine signifikante Expression im Gehirn und im Gastrointestinaltrakt nachgewiesen. Im Immunsystem, einschließend Thymus, Milz und peripherale Leukozyten, wurde mRNA kaum detektiert. Die Größe der hauptsächlich exprimierten mRNA betrug ungefähr 1,6 kb, was mit der Größe korrespondiert, welche für die längste DT cDNA, umfassend HN, zu erwarten ist. Des Weiteren wurden mRNAs von verschiedenen Größen von ungefähr 3 kb und ungefähr 1 kb auch nachgewiesen. Ähnliche Resultate wie diejenigen, die oben erwähnt wurden, wurden erhalten und alle der Banden wurden nachgewiesen, wenn DT77, kodierend die 3'-Region von HN, jedoch nicht das HN (siehe 1) oder ein Antisense-Primer (GGGTGTTGAGCTTGAACGC SEQ ID NO: 11) gegen die 5'-Region, –440 bis –422 von HN als eine Sonde verwendet wurde. Folglich ist zu erwarten, dass die mRNAs Vollängen-HN-mRNA und Splice-Varianten davon sind. Der vorliegende Erfinder isolierte verschiedene cDNAs von menschlicher Herz-cDNA-Bibliothek. Die Größe der isolierten cDNAs überschritt 1 kbp und die Positionen der cDNAs waren substanziell die gleichen wie diejenigen bei DT44. Ähnliche Ergebnisse außer mit Hinblick auf die Unterschiede, wie unten erwähnt, wurden in Maus-Geweben erhalten (20). Ein Unterschied war, dass der Skelettmuskel und die Leber der Maus niedrigere Spiegel von HN mRNA im Vergleich zu menschlichen Geweben aufwiesen. Jedoch schienen quantitative Unterschiede durch Bedingungen der Individuen beeinflusst zu werden, da der HN mRNA-Grad in skelettalen Muskeln und der Leber von anderen Mäusen (Daten nicht gezeigt) höher war. Ein weiterer Unterschied war, dass die kleine 1 kb mRNA in einer Menge exprimiert wurde, vergleichbar oder größer der Menge der 1,6 kb mRNA in Maus-Herz und Nieren. Des Weiteren wurde eine zusätzliche mRNA von ungefähr 0,4 kb spezifisch exprimiert in Maus- Gehirn, Herz und skelettalen Muskeln. Detailliertere Analyse der Expressionsregionen im Gehirn förderten Zutage, dass vergleichbar große Mengen von mRNA im Zerebellum und im okzipitalen Lappen zwischen den Regionen exprimiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen an, dass HN mRNA hauptsächlich in Organen, verschieden vom zentralen Nervensystem, produziert wird. Folglich wird HN möglicherweise in den Blutkreislauf sekretiert und zu den granialen Nerven transportiert. Alternativ kann lokal synthetisiertes HN im Gehirn eine schützende Wirkung zeigen. Es ist interessant festzuhalten, dass der Großteil der HN mRNA im Zerebellum und im okzipitalen Lappen synthetisiert wird, welche Regionen darstellen, welche die stärkste Resistenz gegen neuronales Absterben in Alzheimer-Gehirnen zeigen.
  • [Beispiel 12]
  • Effekt von Sekretions-defektiven Mutanten von HN
  • Es geht klar aus den obengenannten Daten hervor, dass extrazellulär hinzugefügte HN-Polypeptide von außerhalb der Zelle wirken. Jedoch die Möglichkeit, dass HN-Polypeptide, welche von der Zelloberfläche aufgenommen werden, Effekte innerhalb der Zelle zeigen, kann nicht ausgeschlossen werden. HN kann innerhalb des ER fungieren, wie für zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen, verursacht durch Aβ1-40 berichtet wurde, was durch Caspase-12 mediatisiert wird, wobei die Hauptmenge an Caspase im endoplasmatischen Retikulum (ER) existiert (Nakagawa, T. et al. (2000) Nature 403, 98–103). Wenn HN innerhalb des ERs wirkt, sollte HN synthesiert im ER in der Lage sein, schützende Signale in situ zu erzeugen. Dementsprechend wurde die Sekretions-defiziente Mutante L9R HN verwendet, um die Hypothese zu verifizieren.
  • F11-Zellen, transfiziert mit V621I APP cDNA und L9R HN (HNR) cDNA demonstrierten hohe Zell-Mortalität, ähnlich zu denjenigen in Zellen transfiziert mit V621I APP cDNA allein (Tabelle 1, rechte Spalte). Zelluläres Absterben von Zellen, transfiziert mit V621I APP cDNA und HNR cDNA wurde vollständig unterdrückt, wenn sHN im kultivierten Medium vorlag, was das Fehlen der schützenden Aktivität von intrazellulär exprimiertem HNR bestätigte. Im Gegensatz dazu wurde demonstriert, dass die Transfektion mit V642I APP cDNA unter den gleichen Bedingungen kein zelluläres Absterben induzierte, wenn sHNR extrazellulär hinzugegeben wurde (Tabelle 1, linke Spalte). HNR, transla tiert von HNR cDNA im ER wird nicht in das kultivierte Medium sekretiert (8, oberes Panel). Folglich mus HN-Polypeptid außerhalb und nicht innerhalb der Zelle existieren, um die Funktion von HN zum Retten der Zellen zur Geltung zu bringen. Tabelle 1
    Figure 00610001
    (F11-Zellen, transfiziert mit pcDNA oder V642I APP cDNA, wurden simultan co-transfiziert mit pFLAG oder pHN-Plasmid (rechts), oder wurden mit 10 μM sHN-Polypeptid (links) behandelt. 72 Stunden nach Kultivierung wurde die Zell-Mortalität (%) gemessen mit Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Transfektionen und Behandlungen. *: signifikante Unterdrückung von zellulärem Absterben, induziert durch V642I APP (p < 0.01); **: keine signifikante Unterdrückung von zellulärem Absterben, induziert durch V642I APP).
  • [Beispiel 13]
  • Detaillierte Struktur/Funktions-Beziehung der schützenden Aktivität von HN
  • Die detaillierte Beziehung zwischen der primären Struktur und der schützenden Wirkweise von HN wurde untersucht. 21 demonstriert das Ergebnis der Analyse, welche untersuchte, ob ein trunkiertes HN-Polypeptid V642I APP antagonisiert F11-Zellen wurden transfiziert mit V642I APP cDNA und wurden kultiviert in der Gegenwart von 10 μM HN-Derivat. Kaum ein Effekt auf die zellschützende Aktivität wurde beobachtet durch die Deletion von zwei N-terminalen Resten vom HN-Polypeptid im System. Auf der anderen Seite verschwand die Aktivität von HN durch Deletion von drei Resten am N-Terminus. Dies legt nahe, dass obwohl Met-Ala am N-terminalen Ende nicht not wendig ist, das dritte Pro essenziell für die Aktivität ist. Gemäß ähnlichen Experimenten auf die Deletion des C-Terminus, wie in 21 demonstriert, ist Val-Lys-Arg-Arg-Ala am C-terminalen Ende nicht notwendig, wohingegen das neunzehnte Pro essenziell für das Aufrechterhalten der vollständigen schützenden Aktivität von HN war. Folglich ist die minimale Region, welche für maximale Effektivität benötigt wird, zwischen Pro3 bis Pro19, was HN-17 genannt wurde (SEQ ID NO: 21).
  • Das obere Panel auf der linken Seite von 22 demonstriert den Effekt von HN, welchem die drei N-terminalen Reste (ΔN3) fehlen und von HN-17 auf neuronales Absterben, induziert durch die vier FAD-Gene. HN-17 demonstriert eine hinreichend antagonisierende Aktivität auf zelluläres Absterben, induziert durch alle der drei FAD-Gene, verschieden von dem oben erwähnten V642I APP, wohingegen ΔN3-Peptid keine Aktivität auf zelluläres Absterben, verursacht durch irgendeines der Gene, zeigt. Die anderen Panels von 22 demonstrieren die Dosis-Antwort-Beziehung des Effekts von synthetischem HN-17 auf neuronales Absterben, induziert durch ein jedes der vier FAD-Gene. Obwohl HN-17 im Vergleich mit originalem HN eine leicht niedrigere Aktivität bei der Unterdrückung von zellulärem Absterben, induziert durch M146L PS-1 zeigte und höhere Konzentrationen für die Aktivität nötig waren, zeigte HN-17 im Bereich weniger μM eine allgemein hinreichende schützende Wirkung gegen zelluläres Absterben, verursacht durch irgendeines der vier FAD-Gene. Das Ergebnis legt nahe, dass die beiden N-terminalen Reste und die fünf C-terminalen Resten nicht notwendig für die allgemein schützende Wirkung sind.
  • Des Weiteren wurde verifiziert, ob die HN-17-Reste essenziell für die HN-17-schützende Wirkung sind. Zuerst wurde für 10 nM S14G HN-17 (HNG-17)(SEQ ID NO: 24) demonstriert, dass es vollständiges zelluläres Absterben von F11-Zellen, induziert durch die vier FAD-Gene und von primären kultivierten Neuronen durch Aβ1-43 vollständig antagonisierte, ähnlich zum Fall unter Verwendung von 10 nM HNG. Anschließend wurden HNG-17-Derivate (SEQ ID NO: 25 bis 41), in welchen jeder der Reste von Pro3 bis Pro19 von HNG-17 mit Ala, immer einer zu einer gegebenen Zeit, substituiert wurde, synthetisiert; und der Effekt der Derivate auf zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen, induziert durch 25 μM Aβ1-43 wurde untersucht. 23 demonstriert das Ergebnis des Testens des unterdrückenden Effekts auf das zelluläre Absterben von jedem Ala-substituierten HNG-17-Derivat. Die substituierten Reste werden unter dem Graphen angegeben, welcher die Werte für das zelluläre Absterben angibt. Gemäß der Untersuchung wurden sieben Reste essenziell für neuronalen Schutz gegen zelluläres Absterben, induziert durch Aβ klar identifiziert: Pro an Position 3; Cys an Position 8; Leu an Position 9; Leu an Position 12; Thr an Position 13; Gly an Position 14 (ursprünglich Ser) und Pro an Position 19. Die Rolle der anderen Reste wird nicht für nichtig in der Untersuchung erklärt, es wurde jedoch demonstriert, dass sie mit Ala ersetzbar sind, ohne dass die schützende Aktivität beeinträchtigt wurde. Das Ergebnis, dass Pro an Position 3, Cys an Position 8, Gly an Position 14 und Pro an Position 19 essenziell für die Aktivität sind, stimmt mit den Daten, erhalten durch die HN-defizitären Experimente (21) überein sowie mit den HN-Aminosäurerest-Ersetzungs-Experimenten, wie oben beschrieben (9 und 10). Es ist erwähnenswert, dass die Substitution von Ser an Position 14 zu Gly die schützende Wirkweise verstärkt, wohingegen die Substitution zu Ala im Verlust der schützenden Aktivität resultiert. Dies zeigt an, dass leichte Veränderungen von spezifischen Resten und Seitenketten die schützende Wirkweise von HN gegen Aβ1-43 verstärken oder vermindern.
  • Die anderen Panels von 23 demonstrieren die Ergebnisse der Untersuchung hinsichtlich des Effekts von Ala-substituiertem (Ala-gescanntem) HNG-17 gegen zelluläres Absterben von F11-Neuronen, induziert durch jedes der vier FAD-Gene. Gemäß den Daten waren die Reste mit einer essenziellen Rolle für den Antagonismus exakt die gleichen wie diejenigen, notwendig für das Antagoniseren des zellulären Absterbens von primär kultivierten Neuronen, induziert durch Aβ. Dies legt nahe, dass HN Neuronen gegen ein großes Spektrum von AD-Schäden durch einen gemeinsamen Mechanismus schützt. Die sieben essenziellen Reste können eine gewisse Art einer sekundären Struktur notwendig für das Erkennen eines spezifischen Mechanismus (Rezeptoren und dergleichen) auf der Zelloberfläche erhalten.
  • Die überlegene Fähigkeit von HN und HNG-Aktivität und die Tatsache, dass die Aktivität streng von der primären Struktur abhängt, legt die Existenz eines spezifischen Rezeptors nahe. Antagonismus von HN gegen neuronales Absterben, induziert durch vier FAD-Gene und durch Aβ1-43, zeigt extrem ähnliche Dosis-Antwort-Charakteristika, wie oben erwähnt, was auch die Hypothese unterstützt (Existenz eines spezifischen Rezeptors). Der Dosis-Antwort-Charakter wurde auch beobachtet sowohl für HN-Derivate mit positiven (S14G) als auch negativen (C8A) Funktionen. Detaillierte Analyse der Struktur/Funktions-Beziehung verifizierte, dass die Regionen und Reste von HN notwendig für den Antagonismus gegen verschiedene AD-Schäden präzise in allen Typen von HN zusammenfielen. Des Weiteren brachten Experimente bezüglich der Sekretion von Fähigkeits-defizienten Mutanten zutage, dass die extrazelluläre Sekretion von HN essenziell zur Ausübung der schützenden Aktivität ist. Diese Daten deuten an, dass die Wirkweise von HN von außerhalb der Zelle durch spezifische Zelloberflächen-Rezeptoren verursacht wird.
  • [Beispiel 14]
  • Produktion von C8-substituiertem HNG
  • HN-Peptid weist ein Cystein (Cys) als achten Rest auf und Substitution dieses Cysteins mit Alanin (Ala) verursacht den Verlust der Aktivität, wie oben erwähnt. Des Weiteren zeigte die Dimerform (C8-C8) sHN, welche keine keine SH-Gruppe von Cystein an Position 8 aufwies, verminderte antagonisierende Aktivität auf zelluläres Absterben. Dies legt nahe, dass Modifikationen der SH-Gruppe von Cystenrest, korrespondierend mit Position 8 des HN-Peptids die antagonisierende Eigenschaft des Peptids auf zelluläres Absterben beeinträchtigen. Viele Enzyme, welche die SH-Gruppe eines Cysteinrests modifizieren können, existieren im Blut in dem menschlichen Körpergewebe. Folglich sind für die klinischen Anwendungen eines Polypeptids der Erfindung solche Polypeptide bevorzugt, welche keine Cysteinreste enthalten, oder in welchen die Modifikation der SH-Grupp des Cysteinrests die Aktivität des Polypeptids nicht beeinträchtigt wird. Folglich wurden mutierte Polypeptide erzeugt, in welchen das Cys an Position 8 von HNG-Polypeptid mit anderen Aminosäuren substituiert war, und die antagonisierende Aktivität dieser mutierten Polypeptid auf zelluläres Absterben wurde gemessen.
  • F11-Zellen in ihrer ursprünglichen Form oder F11-Zellen, transfiziert mit V642I-APP cDNA (1 μg) wurden mit irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM) behandelt, wobei Cystein an Position 8 (C8) mit irgendeinem der anderen 19 möglichen Aminosäureresten substituiert war. 72 Stunden nach Transfektionsbeginn wurde das zelluläre Absterben gemessen durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Polypeptide, in welchen C8 mit einer basischen Aminosäure, wie z.B. His (SEQ ID NO: 46), Lys (SEQ ID NO: 48) oder Arg (SEQ ID NO: 54) substituiert wa ren, signifikante unterdrückende Aktivität auf neuronales Absterben zeigten (24, oberes Panel).
  • Als Nächstes wurde die antagonisierende Aktivität mutierter Polypeptide auf zelluläres Absterben, induziert durch FAD-Gene, verschieden von V642I-APP cDNA, untersucht. F11-Zellen in ihrer ursprünglichen Form oder nach Transfektion mit 1 μg an FAD-Genen (K595N/M596L-APP, M146L-PS-1 oder N141I-PS-2 cDNA) wurden mit irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM) behandelt, deren C8 mit einer anderen Aminosäure substituiert war. 72 Stunden nach Transfektionsbeginn wurde das zelluläre Absterben durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay gemessen. Als ein Ergebnis inhibierte mutiertes HNG-Polypeptid, dessen C8 substituiert war mit einer basischen Aminosäure, wie z.B. His, Lys oder Arg, neuronales Absterben von F11-Zellen, wie zu erwarten war. Die Charakteristik der Inhibierungs-Aktivität war ähnlich zu derjenigen, beobachtet in den Zellen, transfiziert mit V642I-APP cDNA (24, zentrales Panel).
  • Des Weiteren wurde der Effekt von mutierten Polypeptiden auf zelluläres Absterben von primären kultivierten kortikalen Neuronen, induziert durch Aβ auch untersucht. In der Gegenwart von irgendeinem der mutierten HNG-Polypeptide (10 nM), in welchen C8 mit anderen Aminosäureresten substituiert worden ist, wurden primäre kultivierte kortikale Neuronen mit 25 μM Aβ1-43 behandelt. 72 Stunden nach Beginn der Aβ-Behandlung wurde die Zell-Mortalität durch Trypan-Blau-Exklusions-Assay gemessen und ein Assay für das Überleben von Zellen wurde durch Calcein-Anfärben durchgeführt. Als ein Ergebnis unterdrückten Polypeptide, in welchen das C8 substituiert war mit His, Lys, oder Arg, zelluläres Absterben von primär kultivierten kortikalen Neuronen, induziert durch Aβ, ähnlich zu denjenigen, wie oben angegeben (24, unteres Panel). Mutierte HNG-Polypeptide, in welchen das C8 substituiert war mit Lys oder Arg demonstrierten eine starke unterdrückende Aktivität auf neuronales Absterben in allen Typen von Zellabsterben, vergleichbar mit ursprünglichem HNG. Diejenigen Polypeptide, in welchen C8 mit His substituiert war, zeigten schwache Abnahme in der unterdrückenden Aktivität für zelluläres Absterben. Diese Resultate demonstrieren, dass der Cysteinrest des Polypeptids dieser Erfindung mit anderen Aminosäuren substituiert werden kann, welche keine SH-Gruppe aufweisen und dass Substitution mit basischen Aminosäuren, wie z.B. His, Lys und Arg, vorzugsweise Lys oder Arg bedeutsam ist
  • [Beispiel 15]
  • Produktion von HNG-Derivaten
  • Die Verstärkung der HNG-Wirkweise durch Mutation von HNG (S14G HN) wurde verifiziert. Gemäß eines Experimentes, welches die neuroschützende Wirkweise von HNGs untersuchte, in welchen multiple Aminosäurereste mit anderen Aminosäureresten substituiert worden sind, wurden Polypeptid mit höherer rettendet Aktivität im Vergleich zu HNG durch Mutieren von zwei Positionen erhalten, R4A/F6A (SEQ ID NO: 60). Das Polypeptid mit dem Namen AGA-HNG rettete nicht nur vollständig gegen zelluläres Absterben von Nervenzell-Linien, induziert durch FAD Gene bei einer Konzentration von gerade einmal 0,1 nM, sondern rettete auch vollständig gegen zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen durch Aβ bei einer Konzentration von 0,3 nM (25). Arg und Phe an Position 4 bzw. 6 von HNG sind Positionen, welche durch die Trypsin-artige Protease bzw. die Chymotrypsin-artige Protease (siehe 25A) geschnitten werden. Folglich ist es wahrscheinlich, dass R4A/F6A-Substitution von HNG die Widerstandsfähigkeit gegen den Abbau erhöht. Eine merklich hohe Aktivität für AGA-HNG ist impliziert durch die Tatsache, dass AGA-HNG die Neurotoxizität von Aβ einer hohen Konzentration detoxifisiert, einer 100000-fach höheren Konzentration als AGA-HNG. Von einem Anti-AD-Wirkstoff, der ein solch breites Spektrum mit hoher neuroschützender Wirkweise aufweist, wurde bislang nichts berichtet. Die Anwendung von AGA-HNG oder Derivaten davon für die Chemotherapie von AD ist zu erwarten.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung stellt das Humanin-Polypeptid zur Verfügung, welches die Fähigkeit aufweist, Neurodegeneration, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung, zu antagonisieren. Das Polypeptid ist das erste Molekül, welches die Fähigkeit hat, zelluläres Absterben von Neuronen, induziert durch vier Arten von FAD-Genen und Aβ zu antagonisieren. Des Weiteren kann das Polypeptid zelluläres Absterben von klonierten Neuronen, induziert durch V642I APP, NL-APP, PS-1-Mutanten und PS-2-Mutanten und zelluläres Absterben von primären kultivierten Neuronen, induziert durch Aβ1-43, antagonisieren. Schützende Faktoren, welche extrazellulär wirken und ein breites Spektrum aufweisen, Aβ antagonisieren und alle bekannten Typen von früh (onset) anfallenden FAD-Genen wurden zuvor niemals charakterisiert. Die Bedeutung von HNG FAD-Genen wurden zuvor niemals charakterisiert. Die Bedeutung von HNG für die Aufklärung des Mechanismus von neuronalem Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung, wie auch die extreme Bedeutung von HNG für klinische Anwendungen wurde speziell unterstrichen durch die Tatsache, dass die Neurotoxizität assoziert mit AD vollständig mit 10 nM oder weniger an HNG antagonisiert wird. Die schützende Wirkung von HNG ist extrem hoch und HNG trägt allumfassende Wirkungen und stringente Spezifität. Folglich sind HNG, AGA-HNG und Derivate, erzeugt aus diesen extrem bedeutsam als Pharmazeutika, um neuronales Absterben, assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung zu verhindern, sowie als Leitverbindungen für die Entwicklung neuer Pharmazeutika für die Alzheimer-Erkrankung.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (21)

  1. Ein Polypeptid, welches neuronales Absterben assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung unterdrückt und eine Aminosequenz der folgenden Formel (I) aufweist: Pro-(Xaa)3-5-(Cys/bXaa)-(Leu/Arg)-(Xaa)1-3-LeuThr-(Gly/Ser)-(Xaa)3-5Pro (I),wobei „(Cys/bXaa)" Cys oder eine basische Aminosäure anzeigt; „(Leu/Arg)" Leu oder Arg anzeigt; „(Gly/Ser)" Gly oder Ser anzeigt; und (Xaa)3-5 3 bis 5 zufällig ausgewählte Aminosäurereste anzeigt; und (Xaa)1-3 1 bis 3 zufällig ausgewählte Aminosäurereste anzeigt.
  2. Ein Polypeptid gemäß (a) oder (b), wie unten dargestellt: (a) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nrn.: 5 bis 8, 10, 12, 13, 20, 21 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54, und 60; (b) ein Polypeptid, welches neuronales Absterben assoziiert mit Alzheimer-Erkrankung unterdrückt und eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe aufweist, die besteht aus SEQ ID Nrn.: 5 bis 8, 10, 12, 13, 20, 21 bis 24, 26 bis 29, 32, 33, 37 bis 40, 46, 48, 54 und 60, in welchen 1 bis 8 Aminosäuren durch konservative Substitution substituiert worden sind.
  3. Das Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, welches verwendet wird, um neuronales Absterben zu unterdrücken.
  4. Ein Fusions-Polypeptid umfassend das Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, fusioniert mit anderen Polypeptiden.
  5. Eine DNA codierend für das Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Ein Vektor, in welchen die DNA von Anspruch 5 eingebaut wird.
  7. Eine Wirtszelle, die den Vektor von Anspruch 6 beinhaltet.
  8. Ein Verfahren zum Herstellen des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfassend die Schritte des Kultivierens der Wirtszelle aus Anspruch 7 und des Wiedergewinnens des exprimierten Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Überstand der Kultur derselben.
  9. Ein in vitro-Verfahren zum Unterdrücken von neuronalem Absterben umfassend die Schritte von Inkontaktbringen einer neuronalen Zelle mit dem Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
  10. Ein Verfahren zum Ermitteln einer das Zell-Absterben unterdrückenden Aktivität des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die folgenden Schritte von: (a) Induzieren des Zell-Absterbens in der Gegenwart des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 und (b) Ermitteln des Grades des Zell-Absterbens.
  11. Ein Verfahren zum Ermitteln des Effekts einer chemischen Verbindung auf die das neuronale Absterben unterdrückende Aktivität eines Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die folgenden Schritte von: (a) Induzieren des neuronalen Absterbens in der Gegenwart einer Test-Verbindung und des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4; und (b) Ermitteln des Grades des neuronalen Absterbens.
  12. Ein Verfahren zum Screenen hinsichtlich einer chemischen Verbindung, welche die das neuronale Absterben unterdrückende Aktivität des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 reguliert, umfassend die folgenden Schritte von: (a) Induzieren des neuronalen Absterbens in der Gegenwart einer Test-Probe und des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4; (b) Ermitteln des Grades des neuronalen Absterbens; und (c) Auswählen der Verbindung, welche das neuronale Absterben verstärkt oder unterdrückt.
  13. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als die effektive Komponente das Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
  14. Die pharmazeutische Zusammensetzung von Anspruch 13, wobei besagte Zusammensetzung ein Mittel zum Unterdrücken von neuronalem Absterben darstellt.
  15. Die pharmazeutische Zusammensetzung von Anspruch 13, welche verwendet wird, um Krankheiten zu verhindern oder zu behandeln, die mit Neurodegeneration einhergehen.
  16. Die pharmazeutische Zusammensetzung von Anspruch 13, die verwendet wird, um Alzheimer-Erkrankungen zu verhindern oder zu behandeln.
  17. Ein Antikörper, welcher an das Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 bindet.
  18. Ein Verfahren zum Screenen nach einer chemischen Verbindung, welche an das Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 bindet, umfassend die folgenden Schritte von: (a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit dem Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4; (b) Detektieren der Bindungs-Aktivität zwischen der Testprobe und dem Polypeptid; und (c) Auswählen der Verbindung, welche die Aktivität aufweist, an das Polypeptid zu binden.
  19. Verwendung des Polypeptids von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zum Unterdrücken von neuronalem Zell-Absterben.
  20. Verwendung eines Vektors gemäß Anspruch 6 zur Herstellung eines Medikaments zum Unterdrücken von neuronalem Zell-Absterben.
  21. Verwendung von neuronalen Zellen, welche das Polypeptid gemäß Anspruch 1 bis 4 exprimieren, zur Herstellung eines Medikaments oder einer Zusammensetzung zum Unterdrücken von neuronalem Absterben.
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