DE60019825T2

DE60019825T2 - MutienzymKomposition mit Glucoamylase, Protease und Xylanase Aktivität, und Verfahren zu deren Herstellung durch Aspergillus Gärung im festen Getreideweizenmedium

Info

Publication number: DE60019825T2
Application number: DE60019825T
Authority: DE
Inventors: Pierre Jean Labeille; Jean-Luc Alain Guy Baret; Francis Lucien Duchiron
Original assignee: Gie Agro Industrie
Current assignee: Gie Agro Industrie
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: US6667066B2; TR200102156T2; CA2361264C; JP2002534973A; EP1022329A1; CA2361264A1; PL201768B1; AU775240B2; EP1022329B1; WO2000043496A1; CN1203170C; AU3059800A; RU2246536C2; PL350672A1; DK1022329T3; BR0007600A; CN1337998A; PT1022329E; US20020037342A1; ATE294852T1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbindung mit Glucoamylase-, Protease- und Xylanase-Aktivitäten und ein Verfahren für ihre Herstellung durch Fermentierung von Weizenkleie im festen Zustand mit Aspergillus niger.
Es ist bekannt, Ethanol von Maisstärke ausgehend, durch ein Enzymverfahren herzustellen, das einen Schritt zur Verflüssigung der Stärke durch eine Alpha-Amylase umfasst, der darauf zielt, die Stärke zu Dextrinen zu hydrolisieren, anschließend einen Schritt zur Verzuckerung durch eine Glucoamylase (auch Amyloglukosidase genannt), der darauf zielt, die Dextrine zu Glukose zu hydrolisieren, und schließlich einen Schritt zur Fermentierung dieser letzteren zu Ethanol.
Der Einsatz von Alpha-Amylase- und Glucoamylase-Enzymen ist im Allgemeinen zufriedenstellend, wenn von relativ reiner Stärkemilch ausgegangen wird, die durch Zermahlen von Mais auf nassem Wege erhalten wird, wenn es allerdings gewünscht wird, Maisstärke durch Weizenstärke oder Weizenmehl zu ersetzen, werden keine zufriedenstellenden Ergebnisse nur mit diesen beiden einzigen Enzymen erreicht, und zwar aufgrund des Vorhandenseins von Hemizellulosen, welche die Viskosität der verzuckerten Mehlmaische so sehr erhöhen, dass dies ein Problem für die Ausführung des Verfahrens darstellt. In dem Schritt zur Verzuckerung müssen Hilfsenzyme, wie beispielsweise Zellulasen und Hemizellulasen verwendet werden, um die Viskosität zu reduzieren und um dieses Problem abzustellen. Darüber hinaus ist es wünschenswert, außerdem Proteasen im Verlaufe der Verzuckerung zu verwenden, um die Proteine des Mehls zu hydrolisieren, und infolgedessen die Maische im Hinblick auf den weiteren Schritt zur alkoholischen Fermentierung mit löslichem Stickstoff anzureichern. Die Zufuhr einer für das Wachstum von Hefen notwendigen Stickstoffquelle, die traditionell während dieser Gärung durchgeführt wird, kann infolgedessen reduziert werden.
All diese Enzyme sind individuell im Handel in gereinigter Form erhältlich, weisen allerdings den Nachteil auf, dass sie relativ kostspielig sind und demnach die Herstellungskosten des Ethanols aus Weizen infolgedessen belasten. Darüber hinaus müssen Verbindungen ausgehend von den einzelnen Enzymen formuliert werden, wodurch das Verfahren komplizierter wird.
In dem Artikel von ABRAHAM et al. „Development of an alternate route for the hydrolysis of cassava flour" (Entwicklung eines alternativen Weges für die Hydrolyse von Cassavamehl), Starch Starke, Band 41, Nr. 12, 1989, Seiten 472–476, wird die Zubereitung und Verwendung von Weizenkleie, die im festen Zustand mit Aspergillus niger fermentiert wird, als Amyloglukosidase-Quelle für die Hydrolyse von Maniokmehl beschrieben. Die Weizenkleie wird angefeuchtet und mit Wärme behandelt und anschließend im festen Zustand ein bis zwei Tage lang fermentiert. Das von ABRAHAM beschriebene Verfahren ermöglicht, eine schwache Glucoamylase-Aktivität (110 – 224 IU/g) zu erhalten.
LABEILLE P et al.: „Comparative study of wheat flour saccharification and ethanol production with two Glucoamylase preparations" (Vergleichende Untersuchung von Weizenmehlverzuckerung und Ethanolherstellung mit zwei Glucoamylase-Zubereitungen), Industrial crops and products (Industrielle Getreide und Produkte), Band 6, Nr. 3 – 4, 1. August 1997, Seiten 291 – 295, beschreibt eine Zubereitung einer Verbindung auf der Grundlage von Stämmen von Aspergillus niger, welche AAI genannt wird und Glucoamylase-, Protease-, Hemizellulase-Aktivitäten aufweist, die zur Verzuckerung von Weizenmehl vorgesehen sind. In dem Artikel von LABEILLE P et al. wird das Herstellungsverfahren der AAI-Verbindung nicht genau ausgeführt.
Infolgedessen besteht ein Bedarf an einer preiswerten Ver bindung, welche Glucoamylase-, Protease- und Hemizellulase-Aktivitäten kombiniert, um bei reduzierten Kosten Ethanol ausgehend von Weizenmehl herstellen zu können.
Die Erfindung zielt darauf, diesem Bedarf gerecht zu werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung nach Anspruch 1. Vorzugsweise beträgt die Glucoamylase-Aktivität mindestens 1500 UG pro Gramm Trockensubstanz und/oder die Xylanase-Aktivität beträgt mindestens 400 UX pro Gramm Trockensubstanz. Vorzugsweise beträgt die Protease-Aktivität ebenfalls mindestens 400 UP pro Gramm Trockensubstanz.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren nach Anspruch 8.
Vorzugsweise beträgt die Glucoamylase Aktivität mindestens 1500 UG pro Gramm Trockensubstanz und/oder die Xylanase-Aktivität beträgt mindestens 400 UX pro Gramm Trockensubstanz.
Vorzugsweise beträgt die Protease-Aktivität ebenfalls mindestens 400 UP pro Gramm Trockensubstanz.
Vorzugsweise wird der Stamm von Aspergillus niger aus dem Stamm NRRL 3112, dem Stamm ATCC 76061 und den Stämmen ausgewählt, die ausgehend von den genannten Stämmen durch Auswähl oder durch Mutation erhalten werden, wenn eine erhöhte Glucoamylase-Aktivität angestrebt wird. Der Stamm ATCC 76061 wird insbesondere bevorzugt.
Wenn eine erhöhte Glucoamylase-Aktivität angestrebt wird, muss die als Ausgangsmaterial benutzte Weizenkleie eine Kleie sein, der keine Stärke entzogen wurde. Außer dieser Einschränkung kann eine beliebige Kleie verwendet werden. Allerdings enthält die Kleie vorzugsweise einen beachtli chen Anteil (mindestens 40 Gew.%) an Partikeln, die kleiner als 1 mm sind.
Nachfolgend werden zum Zweck der Anschauung und nicht einschränkend die Eigenschaften von zwei geeigneten Kleien aufgeführt.
Korngrößenverteilung

% Nasssubstanz(Matière humide, MH) = % im Verhältnis zur Nasssubstanz.

Die Weizenkleie muss angefeuchtet und mit Wärme behandelt werden, damit sie pasteurisiert oder sterilisiert wird. Es ist vorteilhaft, dass die thermische Behandlung der Anfeuchtung nicht vorausgeht, weil in dem Fall, wenn die Kleie vor der Anfeuchtung mit Wärme behandelt wurde, nur mittelmäßige Fermentierungsergebnisse beobachtet wurden. Die thermische Behandlung kann aus einer Erhitzung bestehen, beispielsweise in einer Autoklave. Eine Behandlung in einer Autoklave von 20 Minuten bei 120 bis 121 °C hat sich als sehr zufriedenstellend erwiesen, allerdings sind auch weniger strikte Bedingungen (Pasteurisierung 15 Minuten lang bei 105 °C in einem Trockenapparat) ebenfalls angemessen. Außerdem ist es möglich, die thermische Behandlung der Kleie durch Einspritzen von Wasserdampf vorzunehmen, wodurch es ermöglicht werden kann, die Anfeuchtung der Kleie gleichzeitig vorzunehmen.
Vorteilhafterweise kann der pH-Wert während der Anfeuchtung in dem Bereich von 4 bis 5,5 eingeregelt werden, damit die Pasteurisierungswirkung während der thermischen Behandlung und die Einleitung der gewünschten Fermentierung verbessert wird.
Außer der Sterilisierungsfunktion erfüllt die thermische Behandlung die Aufgabe, die Gelatinierung der in der Weizenkleie enthaltenen Stärke zu begünstigen, und von daher die Verfügbarkeit dieses Substrats für den Pilz Aspergillus niger, wodurch wirkungsvollere Fermentierungen ermöglicht werden.
Die Anfeuchtung der Kleie ist wichtig, weil der Wassergehalt die Fermentierungsleistung beeinflusst. Der anfängliche Wassergehalt der Kleie wird zunächst auf 50 bis 60 %, vorzugsweise 50 bis 55 %, der gesamten Masse von Kleie und Wasser eingeregelt, und er wird während der Fermentierung im wesentlichen in diesem Bereich gehalten, beispielsweise indem zeitweise Wasser zugeführt wird, um den Wasserverlust des Mediums auszugleichen. Der Ausdruck „im Wesentlichen gehalten" bedeutet, dass es akzeptiert werden kann, wenn der Feuchtigkeitsgehalt einen Wert annimmt, der während eines relativ kurzen Zeitraumes zwischen zwei aufeinander folgenden Anpassungen des Feuchtigkeitsgehaltes oder am Ende der Fermentierung von dem Bereich von 50 bis 60 % ein wenig abweicht (± 5 Prozenteinheiten). Auf jeden Fall ist es vorteilhaft, wenn der Feuchtigkeitsgehalt nicht unter 45 % abfällt. Der Feuchtigkeitsgehalt des Kulturmediums neigt dazu, im Verlaufe der Kultivierung unter der Einwirkung der durch das Pilzwachstum erzeugten Temperaturerhöhung durch Verdampfung abzufallen, wobei das Medium ein schlechter Wärmeleiter ist. Die verwendete Wasserqualität spielt außerdem eine nicht zu vernachlässigende Rolle. Es kann qualitativ gutes Fließwasser oder destilliertes Wasser verwendet werden.
Die Inokulation der Weizenkleie kann mit jedem geeigneten Inokulum vorgenommen werden. Dem Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten zur Vorbereitung eines passenden Inokulums auf der Grundlage eines ausgewählten Stammes bekannt. Die Inokulationsdosis beträgt vorteilhafterweise mindestens 1 × 10⁷ Sporen/Gramm anfänglicher Trockensubstanz.
Die Fermentierung kann in jedem geeigneten Reaktor durchgeführt werden. Beispiele eines verwendbaren Reaktors sind diejenigen, die in dem Artikel von A. DURAND et Coll. beschrieben werden, welcher in Agro-Food-Industry Hi-Tech (Mai-Juni 1997, Seiten 39 – 42) veröffentlicht ist.
Die Fermentierung kann während eines Zeitraumes von 1 bis 3 Tagen durchgeführt werden, vorzugsweise von 30 bis 60 Stunden. Bei weniger als einem Tag ist die Fermentierung gar zu unvollständig. Nach drei Tagen ist die Fermentierung abgeschlossenen oder fast abgeschlossen, so dass es nicht wirtschaftlich wäre, sie weiter zu verlängern. Die Temperatur des Mediums wird typischerweise zwischen 28 und 38 °C gehalten, vorzugsweise zwischen 32 und 36 °C, was dem optimalen Aktivitätsbereich entspricht, der für die in der Erfindung zu verwendenden Stämme von Aspergillus niger bekannt ist. Vorteilhafterweise wird zu diesem Zweck die Lufttemperatur während der ersten Stunden der Fermentierung auf 34 bis 38 °C eingeregelt, um die Keimbildung der Sporen zu begünstigen, anschließend wird sie für die verbleibende Fermentierung auf 28 bis 32 °C reduziert, um zur Regelung der Temperatur des Mediums beizutragen.
Der pH-Wert des Fermentierungsmediums wird gewöhnlicherweise nicht reguliert. Wenn sein Ausgangswert in der Nähe von 6,0 bis 6,4 liegt, fällt der pH-Wert im Verlaufe der Kultivierung auf 3,8 bis 4,2 ab und steigt am Ende wieder an. Dieser Wechsel korreliert im Allgemeinen mit der Phase der Sporenbildung des Pilzes. Der Verlauf der Entwicklung des pH-Werts gilt als guter Indikator für den Zustand der Kultur.
Der Fermenter muss belüftet werden, vorzugsweise kontinuierlich, um den zur Fermentierung notwendigen Sauerstoff zuzuführen und um eine übermäßige Ansammlung von Kohlendioxid zu vermeiden, das durch die Fermentierung produziert wird. Darüber hinaus trägt die Belüftung zur Steuerung der Temperatur und der Feuchtigkeit des Kulturmediums bei. Die Luft sollte vorzugsweise im Wesentlichen mit Wasser gesättigt sein, um die Austrocknungsneigung des Mediums einzuschränken. Es ist schwierig, quantitative Angaben über den Belüftungsdurchsatz zu machen, weil vielfache Variable, insbesondere die Größe und Geometrie des Reaktors, die Menge der Kleieladung, usw. ..., zu berücksichtigen sind.
Einfache Routineversuche werden es dem Fachmann allerdings leicht ermöglichen, für jeden Praxisfall einen geeigneten Belüftungsdurchsatz zu bestimmen.
Die Beladung des Fermenters mit Kleie muss zeitweise mittels Rührmitteln, wie beispielsweise Rührarmen, Schabern oder Spachteln, oder Endlosschnecken während der Fermentierung ergänzt werden, um die Bildung von undurchlässigen Massen zu vermeiden und damit die Belüftung auf die gleichmäßigste Weise der gesamten Kleiemasse nützt. Trotzdem muss ein zu starkes Rühren vermieden werden, das dem Pilz schaden könnte.
Die Verbindung der Erfindung besteht aus einer festen Verbindung, die insbesondere für die Ethanolproduktion auf der Grundlage von Weizen nützlich ist. Sie kann der verflüssigten Stärke (Dextrinen), die in dem Verflüssigungsschritt erhalten wird, direkt hinzugefügt werden, um die Verzuckerung vorzunehmen. Bei dieser Anwendung ist die Glucoamylase-Aktivität der wichtigste Faktor. Infolgedessen wird vorzugsweise eine Verbindung der Erfindung verwendet, welche eine Glucoamylase-Aktivität beispielsweise von mindestens 750 UG, vorzugsweise von mindestens 1500 UG pro Gramm Trockensubstanz aufweist.
Eine weitere mögliche Verwendung der Verbindung der Erfindung betrifft die Herstellung von Futtermitteln auf Weizenbasis für monogastrische Tiere, wie beispielsweise Geflügel oder Schweine. Bei dieser Anwendung ist es die Xylanase-Aktivität, die den wichtigsten Faktor darstellt. Infolgedessen wird bei dieser Anwendung vorzugsweise eine Verbindung verwendet, welche eine hohe Xylanase-Aktivität aufweist, beispielsweise von mindestens 400 UX pro Gramm Trockensubstanz.
Die Verbindung der Erfindung kann im Hinblick auf ihre Aufbewahrung, falls gewünscht, getrocknet oder tiefgefroren werden.
Die Trocknung muss bei einer mittelmäßigen Temperatur durchgeführt werden, um die Enzymaktivität nicht zu beeinträchtigen. Eine Erhitzung im Trockenapparat auf 40 °C hat sich beispielsweise als geeignet erwiesen. Das Gefrieren kann seinerseits mit der feuchten Verbindung bei niedriger Temperatur, beispielsweise bei –20 °C, durchgeführt werden.
In den Beispielen werden unterschiedliche Enzym-Aktivitäten mit den nachfolgenden Methoden gemessen:
a) Glucoamylase-Aktivität
Das Einwirken einer Glucoamylase-Zubereitung (GA) auf eine Stärkelösung bewirkt die Freisetzung von reduzierendem Zucker. Wenn diese Verbindungen in Gegenwart von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS) auf 100°C erhitzt werden, nehmen sie eine braune Farbe an, die mit dem Spektralphotometer (Kontron Instruments, Mailand, Italien) gemessen 540 nm beträgt.
Das Reaktionsmedium enthält:

• Stärkelösung 1 %: 500 μl

• Zitratpuffer 0,1 bei pH-Wert von 4,5: 450 μl

• Enzymlösung: 50 μl
Die Reaktion findet 30 Min. lang bei 60 °C statt (55 °C bei den GA von A, oryzae). Alle 5 Minuten werden Probeentnahmen vorgenommen, mit DNS vermischt und in ein Eisbad gegeben. Anschließend werden sie 5 Minuten lang auf 100 °C erhitzt, schnell abgekühlt und bei 540 nm bestimmt.
Diese Bestimmungsbedingungen sind aufgestellt worden, nachdem der Einfluss der Temperatur und des pH-Wertes auf die Aktivität unserer GA-Zubereitungen untersucht worden ist. Lösliche Stärke von Merck (Darmstadt, Deutschland) wurde als Substrat für diese Enzymhydrolyse verwendet. Das DNS wird nach dem Protokoll zubereitet, das von P. Bernfeld, Methods in enzymology (Verfahren in der Enzymologie), 1, 149–158 (1955) vorgeschlagen wird; es lautet folgendermaßen:

– Zuvor auflösen: • 10 g 3,5-Dinitrosalicylsäure • 200 ml von 2 Mol Natriumkarbonat • 200 ml destilliertes Wasser.
– Anschließend hinzufügen: • 300 g Kaliumnatriumtartrat.
– Nach vollständiger Auflösung die Menge mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen:

Sobald dieses Reagens zubereitet ist, muss es vor Licht geschützt aufbewahrt werden. Die Eichkurven werden mit Glu kose als Referenzprodukt für die Bestimmung der Glucoamylase-Aktivität oder für die Überwachung der Reaktionen der Verflüssigung-Verzuckerung mit Xylose aufgestellt, um die Xylanase-Aktivität zu messen.
Eine Einheit der Glucoamylase-Aktivität (UG) entspricht der Enzymmenge, die zur Freisetzung eines Mikromols von Reduktionsenden pro Minute unter den Bestimmungsbedingungen notwendig ist, wobei Glukose als Referenz dient. Die Glucoamylase-Aktivität, die mit Hilfe der nachfolgend aufgeführten Formel berechnet wird, wird zu der Menge anfänglicher Trockensubstanz (MSI) in Beziehung gesetzt: A = (P/Venz)·(Vferm/Mferm)– A entspricht der GA-Aktivität, die in UG.gMSI^–1 (μmol.min^–1.gMSI^–1) ausgedrückt wird,
– P entspricht der Freisetzungsgeschwindigkeit von Glukoseäquivalenten in μmol.min^–1,
– Venz stellt das Volumen der Enzymlösung dar, das in ml bestimmt wird,
– Vferm ist das Gesamtvolumen von destilliertem Wasser in ml, das verwendet wird, um die Enzymlösung zu extrahieren,
– Mferm, ausgedrückt in g der anfänglichen Trockensubstanz (MSI), entspricht der anfänglichen Masse an Trockenprodukt, aus dem die Enzymlösung extrahiert wird.
b) Protease-Aktivität
Diese Bestimmung wird auf Azokasein nach dem Verfahren von Béinon abgestimmt, das in dem Werk „Proteins Purification Methods – a Practical Approach" (Verfahren zur Proteinreinigung – ein praktischer Lösungsvorschlag), Harris E.L.V. und Angal, S (Verleger), IRL-Press, Oxford University Press, 1–66 (1989) beschrieben wird. Die Abbaureaktion dieses Substrats durch die Proteasen führt zu der Freiset zung von Azo-Gruppen, welche UV bei 340 nm absorbieren. Die Entwicklung des Absorptionsvermögens während der Hydrolysekinetik dieses Proteins weist auf die Bedeutung der Reaktion hin.
Das Reaktionsmedium enthält:

• Azokaseinlösung von 1 %, pH-Wert 5,0 1000 μl

• Enzymlösung: 200 μl
Das Azokasein (Sigma, Saint-Louis, USA) wird in einem Azetatpuffer 0,1 M bei einem pH-Wert von 5,0 aufgelöst. Die Protease-Aktivitäten werden bei diesem pH-Wert bestimmt, weil sich das Azokasein in dem Azetatpuffer bei niedrigeren pH-Werten nicht auflöst. Die Enzymreaktion wird bei 60 °C durchgeführt. Während 20 Minuten werden alle 5 Minuten Probeentnahmen vorgenommen und mit 5 %iger Trichlorazetatsäure (TCA) gemischt, um die Reaktion zu stoppen.
Eine Einheit der Protease-Aktivität (UP) entspricht der Enzymmenge, die zur Erhöhung um 0, 01 Einheit A_340nm pro Minute notwendig ist, welche durch die Freisetzung von Azo-Gruppen unter den vorgenannten Bedingungen erzeugt werden. Diese Aktivität, welche nach der nachstehend aufgeführten Formel berechnet wird, wird zu der anfänglichem Trockensubstanz (UP.G^–1 MSI) oder der Glucoamylase-Aktivität (UP.UG^–1) in Beziehung gesetzt: A = (P/Venz)·(Vferm/Mferm)– A entspricht der Protease-Aktivität, die in UP.gMSI^–1 ausgedrückt wird,
– P entspricht der Freisetzungsgeschwindigkeit von Azo-Gruppierungen, die als Erhöhung um 0,01 Einheit A_340nm.Min.^–1 ausgedrückt wird,
– Venz stellt das Volumen der Enzymlösung dar, das in ml bestimmt wird,
– Vferm ist das Gesamtvolumen von destilliertem Wasser in ml, das verwendet wird, um die Enzymlösung zu extrahieren,
– Mferm, ausgedrückt in g der anfänglichen Trockensubstanz (MSI), entspricht der Ausgangsmasse an Trockenprodukt, aus dem die Enzymlösung extrahiert wurde.
c) Xylanase-Aktivität
Um diese Enzymaktivität nachzuweisen, werden die GA-Zubereitungen auf einer löslichen Xylanlösung zur Reaktion gebracht, und der reduzierende Zucker, der durch das Verfahren mit DNS freigesetzt wird, wird gemessen.
Das Reaktionsmedium besteht aus:

• Xylanlösung, 1 %, pH-Wert 4,5: 900 μl

• Enzymlösung: 100 μl
Die 1 %ige Xylanlösung aus Lärchen (Sigma) wird in einem Zitratpuffer bei einem pH-Wert von 4,5 zubereitet und die Reaktion findet bei 60 °C statt. Während 20 Minuten werden alle 5 Minuten Probeentnahmen vorgenommen, mit DNS vermischt und in ein Eisbad gegeben. Sie werden anschließend gemäß einem Protokoll bestimmt, das zu demjenigen identisch ist, das für die Messung der GA-Aktivitäten ausgeführt wurde, wobei Xylose als Referenz dient.
Eine Einheit der Xylanase-Aktivität (UX) entspricht der Enzymmenge, die zur Freisetzung eines Mikromols von reduzierendem Zucker pro Minute notwendig ist. Diese Aktivität wird zu der anfänglichen Trockensubstanz (UX.g^–1 MSI) oder der Glucoamylase-Aktivität (UX.UG^–1) in Beziehung gesetzt. Um diese Aktivität zu berechnen, wird auf die Formel zurückgegriffen, welche für die Berechnung der GA-Aktivitäten definiert wurde, wobei:

– A der Xylanase-Aktivität entspricht, die in UG.gMSI^–1 (μmol.min^–1.gMSI^–1) ausgedrückt wird,
– P der Freisetzungsgeschwindigkeit von Xylose-Äquivalenten in μmol.min.^–1 entspricht,
– die anderen Ausdrücke der Formel sind nicht verändert worden.

Die nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele werden aufgeführt, um die Erfindung zu veranschaulichen.
BEISPIEL 1 – Auswahl von Aspergillus Stämmen
Auf vergleichende Weise wird die Fähigkeit von sieben unterschiedlichen im Handel erhältlichen Aspergillus Stämmen untersucht, Glucoamylase durch Fermentierung in festem Medium von Weizenkleie herzustellen.
Die Versuche werden an 50 g Fermentierungsmedium in einem Erlenmeyer-Kolben durchgeführt. Das Medium besteht aus 21,5 g Weizenkleie, 27,5 g Wasser und 1 g Weizenstärke. Der anfängliche pH-Wert des Mediums beträgt 6,0 bis 6,5. Das Medium wird 20 Min. lang in einer Autoklave bei 120 °C sterilisiert.
Jedes Medium wird mit 2 × 10⁷ Sporen des zu testenden Stammes pro Gramm anfänglicher Trockensubstanz inokuliert. Die Sporen sind 3 Tage alt . Die Fermentierung wird 40 oder 50 Stunden lang durchgeführt, wobei die Erlenmeyer-Kolben in einem Trockenapparat bei 35 °C angeordnet sind. Am Ende der Fermentierung wird das fermentierte Medium mit 150 ml destilliertem Wasser gemischt, um die erzeugten Enzyme zu solubihisieren, danach wird es gefiltert, um die Enzymlösung zu gewinnen. Die Lösung wird zentrifugiert, um die Sporen und Rückstandspartikel auszusondern, anschließend wird die Lösung in Flakons zu 100 ml abgefüllt, die bei –20 °C bis zur Analyse der Glucoamylase-Aktivität aufbewahrt wird.
Die getesteten Stämme und die erhaltenen Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefasst:
Es ist ersichtlich, dass die Stämme A. niger NRRL 3112, A. niger ATCC 76061 und A. oryzae ATCC 226788 hinsichtlich der Produktion von Glucoamylase die besten Aktivitäten aufweisen.
Eine weitere wichtige zu berücksichtigende Eigenschaft ist allerdings die Stabilität der produzierten Glucoamylase. Infolgedessen werden Versuche der Wärmebeständigkeit durchgeführt, indem thermische Behandlungen der Enzymlösungen bei 55 und 60 °C über 30 Minuten durchgeführt werden und indem die Aktivität der Glucoamylase am Ende dieser Zeit gemessen wird. Diese Behandlungen kommen den Anwendungsbedingungen für die Verzuckerung der Stärke nahe. Es wird herausgefunden, dass die Stämme A. niger ATCC 76061 und A. niger NRRL 3112 die stabilsten Glucoamylasen produzieren (100 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 55 °C und ungefähr 50 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 60 °C), wohingegen die Stämme A. oryzae ATCC 22788 und ATCC 42149 Glucoamylasen erzeugen, welche 0 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 60 °C und 46 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 55 °C aufweisen. Dies hat infolgedessen dazu geführt, die Stämme ATCC 76061 und NRRL 3112 von A. niger auszuwählen. Darüber hinaus hat sich der Stamm A. niger NRRL 3112 als genetisch recht instabil erwiesen (Aktivitätsverlust nach einigen Reproduktionszyklen), so dass der bevorzugteste Stamm der Stamm ATCC 76061 von A. niger ist. Dieser Stamm wird infolgedessen in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
BEISPIEL 2
Herstellung von Glucoamylasen in nicht sterilen 50 l Pilotkesseln, die von INRA geliefert werden: Bedeutung der Vorbehandlung der Weizenkleie.
Versuche werden mit einem nicht sterilen 50 l Fermenter, der demjenigen entspricht, welcher in dem vorgenannten Artikel von A. DURAND und Mitarbeitern (1) beschrieben wird, und BCE-Weizenkleie durchgeführt (die von der Brennerei Brie Champagne Ethanol, Provins, Frankreich, geliefert wird). Es werden zwei Zubereitungsverfahren der Kleie eingesetzt, um 5 kg Kulturmedium bei 55 % Feuchtigkeit zu erhalten.

• Trockene Kleie: die Kleie wird 1 Stunde lang bei 105 °C in der Autoklave behandelt, anschließend mit Wasser vermischt (Versuch F4C3);
• nasse Kleie: die Kleie wird auf 45 % in einem Rührwerk angefeuchtet und 20 Minuten lang bei 121 °C in der Autoklave behandelt (Versuch F4C4).

In beiden Fällen wird eine Inokulierung mit 2 × 10⁷ Sporen.g^–1 Trockensubstanz durchgeführt und der Wassergehalt der Medien wird auf ungefähr 55 % eingeregelt. Anschließend fermentieren sie auf einer 10 cm hohen Schicht in belüfteten Kesseln. Im Verlaufe dieser Kultivierungen, wird das Medium in Abständen mit einem Spachtel gestrichen, um seine Temperatur zu reduzieren. Während der Fermentierung wird die Umgebungsluft ständig durch klimatisierte Luft ersetzt, deren Temperatur, Feuchtigkeit und Durchsatzmenge den in den Tabellen aufgeführten werten entspricht.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 (Versuch F4C3) und 3 (Versuch F4C4) dargestellt.
Diese Daten ermöglichen, mehrere Schlussfolgerungen zu ziehen:

– Die Anfeuchtung der Weizenkleie vor der thermischen Behandlung ist für eine leistungsfähige Produktion von Glucoamylasen notwendig. Außer der Dekontaminierung begünstigt die thermische Behandlung der Weizenkleie höchstwahrscheinlich die Gelatinierung der Stärke;
– Der pH-Wert scheint ein guter Qualitätshinweis für die Entwicklung des Wachstums und die Herstellung von Schimmelpilz-GA zu sein, ohne allerdings die Schätzung der erhaltenen GA-Menge zu ermöglichen;
– ein leichtes Bewegen des Mediums (Streichen) beeinträchtigt die Herstellung von Enzymen nicht;
– Die Entwicklung des Wassergehalts während dieser beiden Fermentierungen weist auf ein bedeutendes Austrocknen des Kulturmediums hin, das für das Schimmelpilzwachstum nachteilig sein könnte.

BEISPIEL 3
Herstellung von Glucoamylasen in einem Pilotfermenter, der von der Firma FUJIWARA geliefert wird: Bedeutung der Beibehaltung der Feuchtigkeit des Mediums während der Fermentierung.
Dieser Versuch wird mit einem Pilotfermenter, der von der Firma FUJIWARA, Okayama, Japan, verkauft wird, und BCE-Weizenkleie durchgeführt. Er unterscheidet sich insbesondere von dem in Beispiel 2 verwendeten Fermenter durch seinen Kesseldurchmesser, der 0,66 m beträgt, im Gegensatz zu 0,35 m der INRA-Kessel. Für diesen Fermenter werden 20 kg Medium benötigt, die auf 55 % Wasser gemäß dem Verfahren mit nasser Weizenkleie zubereitet werden, das in Beispiel 2 beschrieben wird, um eine Kultur auf 12 cm Dicke einzuset zen. Die Bewegung wird durch drei vertikale Endlosschnecken mit konstanter Drehung sichergestellt, welche das Medium in dem sich drehenden Kessel (5 bis 10 Minuten/Umdrehung) mischen. Während der Fermentierung wird, wie bei den INRA-Kesseln von Beispiel 2, die Gasatmosphäre ständig durch klimatisierte Luft erneuert, deren Temperatur, Feuchtigkeit und Durchsatzmenge den in Tabelle 4 angegebenen Werten entspricht.
Im Verlaufe dieses FII genannten Versuchs wird die Möglichkeit der Regulierung der Feuchtigkeit untersucht. Es werden punktuelle Messungen der Feuchtigkeit der Kultur, die mit einem Infrarotapparat durchgeführt werden, und der Masse des Mediums verwendet, um die Wassermenge zu bestimmen, die hinzugefügt werden muss, um den Wassergehalt des Mediums über 50 % zu halten.
Die Ergebnisse dieses FII-Versuchs sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse führen zu den nachfolgenden Kommentaren:

– FII weist deutlich darauf hin, dass die Beibehaltung des Wassergehalts zwischen 50 und 55 % die Enzymproduktion mit 1600 UG/g Trockensubstanz begünstigt, die nach 44 Std. Fermentierung freigesetzt werden, dies bedeutet die Verdoppelung der Aktivität, die im Verlaufe des Versuchs F4C2 von Beispiel 2 erhalten wird, der von dieser Regulierung nicht profitiert hat;
– die Stabilisierung der Enzymproduktion nach 44 Std. Kultivierung, in wechselseitiger Beziehung mit dem Erscheinen von Schimmelpilzsporen, zeigt, dass es nicht notwendig ist, die Kultur über diese Phase hinaus weiter fortzusetzen;
– eine zufriedenstellende Regulierung der Temperatur des Mediums auf ungefähr 35 °C kann durch eine passende Kombination der Klimatisierung der Luft zusammen mit dem Rühren des Mediums erreicht werden;
– die Kultur gestattet das zeitweilige Umrühren ohne Schäden, das durch das Rührsystem des Fermenters von FUJIWARA eingesetzt wird.

BEISPIEL 4
Produktion von Glucoamylasen in einem gerührten 50 l Pilotfermenter von INRA: Zweckmäßigkeit einer thermischen Vorbehandlung der Weizenkleie mit Dampf und einer Kultivierung unter „sterilen Bedingungen".
Dieser Pilotfermenter gleicht demjenigen, der in WO A 94 18306 und in 4 des vorgenannten Artikels von A. DURAND und Mitarbeitern dargestellt ist. Dieses Gerät ermöglicht die Kleie in dem Fermenter direkt mit Dampf zu behandeln, ein Zubereitungsverfahren, das auf industrieller Ebene bevorzugt wird. Auch diese Kultur wird zubereitet, inokuliert und mit Ausnahme der Probeentnahmen unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wodurch dieser Versuch einen halb-sterilen Charakter erhält und sich von den zwei vorgenannten Beispielen unterscheidet.
A) Versuchsbedingungen
Es werden 9 kg zuvor mit 1,5 1 Wasser angefeuchtete BCE-Kleie in den Fermenter eingegeben, anschließend vor Ort 20 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert, in regelmäßigen Abständen von 5 Sekunden alle 5 Minuten umgerührt. Mit dieser Behandlung kann ein Feuchtigkeitsgehalt von 46 % erreicht werden, der anschließend während der Inokulierung auf 55 % angepasst wird.
Die Kleie wird mit einer Koji-Zubereitung inokuliert:
Es werden 180 g BCE-Kleie (55 % anfängliche Feuchtigkeit), die 4 Tage lang bei 35 °C fermentiert wurden, mit 3 Liter sterilisiertem Wasser derart gemischt, dass eine Sporensuspension erhalten wird, welche das Inokulum darstellt.
Die anfänglichen Bedingungen der Fermentierung sind die nachfolgenden:
18,3 kg Kultur bei 55 % Feuchtigkeit und einem anfänglichen pH-Wert von 5,7;

40 cm Schichthöhe;

Belüftungsdurchsatz: 314 l.min^–1;

T_{Eintrittsluft}: 35 °C;

Relative Feuchtigkeit der Luft beim Eintritt: 95 %.
B) Überwachung der Fermentierung
Außer der Messung des pH-Werts, der Temperatur des Mediums, dem Prozentsatz der Trockensubstanz und der Produktion von GA, wird die Entwicklung der Kulturmasse in dem gerührten 50 l Fermenter kontinuierlich aufgezeichnet, wohingegen bei dem nicht sterilen Reaktor die Kultur nach 21 Std. und nach 42 Std. Fermentierung gewogen wird.
Diese Messungen der Masse sind von zweifachem Interesse:
Beibehaltung der Feuchtigkeit im Verlauf der Kultivierung durch Schätzung des Prozentsatzes der Trockensubstanz.
Während der Fermentierung tragen zwei Vorgänge zu der Reduzierung der Masse der Kultur bei, und zwar handelt es sich um:

– einerseits die Austrocknung des Mediums, die durch eine Zufuhr von Wasser kompensiert werden soll;
– andererseits den Verlust an Trockensubstanz, der an das Wachstum des Pilzes gebunden ist.

Dieser Verlust an Trockensubstanz ist nicht zu vernachlässigen, 20 % der Trockensubstanz gehen während 40 Std. der Kultivierung verloren, das bedeutet 0,5 % an Trockensubstanz pro Stunde, wenn das Annäherungsverfahren auf einem linearen Verlust beruht.
Davon ausgehend, weil die Masse der Kultur (M(t)zu jedem Zeitpunkt bekannt ist, ist es möglich, davon den Prozentsatz der theoretischen Trockensubstanz zum Zeitpunkt t durch die Beziehung abzuleiten:
wobei MSI die Menge anfänglicher Trockensubstanz ist.
Wenn dieser infolgedessen berechnete Prozentsatz der Trockensubstanz (MS) 50 % übersteigt, erfolgt eine Zugabe von sterilisiertem Wasser dergestalt, dass dieser Prozentsatz auf 45 % zurückgeführt wird.
Ausdrücken der Ergebnisse pro Gramm anfänglicher Trockensubstanz (MSI)
Die Entwicklungen der Masse und diejenigen des gemessenen Prozentsatzes an Trockensubstanz ermöglichen es, den Verlust an reeller Trockensubstanz (P_MS ausgedrückt in %) im Verlauf der Kultivierung zu berechnen. Infolgedessen kann die GA-Menge, die bis dahin in UG.g^–1 MS ausgedrückt wurde, aufgrund der nachfolgenden Beziehung in UG.g^–1 MSI ausgedrückt werden: (UG.g–1 MSI) = (UG.g–1 MS)·(100 – PMS)/100
C) Ergebnisse
Die Tabellen 5 und 6 fassen die Betriebsbedingungen und die Ergebnisse zusammen, die im gerührten Reaktor auf mit Dampf behandelter Kleie erhalten werden.
Trotz der Belüftung der Kultur durch eine mit Feuchtigkeit gesättigte Luft, ist das Medium so sehr ausgetrocknet, dass es zweimal notwendig ist, seinen Wassergehalt anzupassen, weil er unter 50 % abfiel, wie in Tabelle 5 angezeigt.
Die Temperatur des Mediums kann auf einem mittleren Wert von 35 °C aufgrund der Absenkung der Eintrittsluft gehalten werden, aber insbesondere durch ein zeitweiliges Rühren.
Das Wachstum des Pilzes, dessen Entwicklung durch Messen des pH-Wertes verfolgt wird, wird unter diesen Kultivierungsbedingungen über 60 Std. aufrecht erhalten und ermöglicht, eine Produktion von 1436 UG.g^–1 MS in 44 Std. und von 1990 UG.g^–1 MS in 63 Std. zu erzielen. Bezogen auf die anfängliche Trockensubstanz, beträgt die produzierte GA-Menge jeweils 1160 und 1540 UG.g^–1 MSI. Im Vergleich dazu werden im Rahmen von Beispiel 3 innerhalb von 44 Std. Kultivierung 1605 UG.g^–1 MS erhalten, was 1067 UG.g^–1 MSI entspricht. Diese Information ist interessant, weil sie darauf hinweist, dass die Produktivität dieser beiden Versuche identisch ist, aber dass es die Versuchsbedingungen des Beispiels 4 ermöglicht haben, die Enzymproduktion sogar bei 40 cm Schichthöhe zu verlängern.
Die Behandlung der Kleie mit Dampf und anschließend ihre Fermentierung in dem gerührten 50 l INRA-Reaktor verlängert also die Schimmelpilzkultur und die Produktion von Enzymen.
Bezogen auf die anfängliche Trockensubstanz beträgt die produzierte GA-Menge 1540 UG.g^–1 MSI.
Bestimmungen von Xylanase- und Proteasen-Aktivitäten werden an denselben Proben vorgenommen. Die erhaltenen Ergebnisse sind bei 50 Std. Fermentierung sehr zufriedenstellend, mit einem Maximum im Durchschnitt von:
350 UX.g^–1 MSI bei den Xylanasen;
400 UP.g^–1 MSI bei den Proteasen.
Dank der kontinuierlichen Aufzeichnung der Masse ist es möglich, den Verlust an Trockensubstanz im Verlaufe der Kultivierung zu berechnen. Sie beträgt ungefähr 23 % nach 60 Std. Kultivierung (bis auf 2 % Genauigkeit, unter Berücksichtigung der Präzision der Wägungen).
BEISPIEL 5
Verwendung von in Beispiel 4 produzierter fermentierter Kleie für die Hydrolyse von Weizenmehl
Eine Serie von Verzuckerungen mit fermentierter Kleie, die in Beispiel 4 erhalten wird, wird mit Weizenmehl durchgeführt, das zuvor einer klassischen enzymatischen Verflüssigungsbehandlung unterzogen wird. Die Zubereitung von Glucoamylasen AMG 300Z , die durch die Firma NOVO vertrieben wird, dient als Kontrolle. Diese Versuche werden mit herkömmlichem Mehl des Typs 45 durchgeführt. Die Betriebsbedingungen sind die Tabelle 7 für 750 g Maische zusammengefasst.
TABELLE 7
Im Verlaufe dieser Hydrolysen von Weizenmehl werden jeweils drei Proben aus dem Medium entnommen. Die Ergebnisse der Konzentrationen von reduzierendem Zucker (S.R., sucres reducteurs) zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Verzuckerung, die in Tabelle 8 dargestellt werden, stellen den Durchschnitt dieser drei Probeentnahmen dar. Diese Bestimmungen, welche gemäß der Technik mit DNS durchgeführt werden, werden an den an der Oberfläche schwimmenden zentrifugierten Probeentnahmen durchgeführt. Die Endviskosität der verzuckerten Produkte wird ebenfalls gemessen.
TABELLE 8
Darüber hinaus wird in den Maischen ein Ansteigen des Gehaltes an löslichem Stickstoff nach der Verzuckerung auf Grund der Protease-Wirkung der fermentierten Kleie festgestellt.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die in Beispiel 4 hergestellten fermentierten Kleien, ungeachtet ihrer Lagerungsart, in der Lage sind, Weizenmehl mit derselben Leistungsfähigkeit wie eine standardmäßige GA-Zubereitung zu hydrolisieren.
Verglichen mit einer herkömmlichen Enzymzubereitung sorgt die Hydrolyse des Mehls mit fermentierter Kleie außerdem für eine bedeutende Reduzierung der Viskosität.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel stellt die Möglichkeit dar, eine beachtliche Menge von Xylanase und wenig Glucoamylase mit dem Stamm von Aspergillus niger zu produzieren.
Dieser Versuch wird in dem Pilotfermenter von Fujiwara mit BCE-Kleie und einem Stamm von Aspergillus niger der Bezeichnung ATCC 201202 durchgeführt, der für seine Fähigkeit, Xylanase zu produzieren, bekannt ist. Die Funktionsweise des Pilotfermenters ist in Beispiel 3 ausführlich erläutert. In diesem Beispiel werden 20 kg Medium bei 55 Feuchtigkeit gebraucht, die wie in Beispiel 2 zubereitet werden. Während der Fermentierung wird, wie in Beispiel 3, die Feuchtigkeit des Mediums auf über 50 % gehalten und die Temperatur des Mediums wird bei ungefähr 35 °C eingeregelt.
Am Ende hat der Stamm Aspergillus niger ATTC 201202 nach 37 Stunden unter diesen Fermentierungsbedingungen fermentierte Kleie hergestellt, die 727 UX/g Trockensubstanz und 162 UG/g Trockensubstanz aufweist.
BEISPIEL 7
Die Bedeutung des Beimengens fermentierter Kleie gemäß der Erfindung in Futtermittel für Geflügel, das auf Weizen basiert und für Masthähnchen bestimmt ist.
Es ist bekannt, dass die Hemizellulasen von Weizenmehlen teilweise in Wasser löslich sind und die Viskosität des Darminhaltes erhöhen, wodurch die Freisetzung und Aufnahme von Nährstoffen reduziert werden.
In dem Artikel von A. VELDMRN AND H.A. VAHL: „Xylanase in broiler diets with differences in characteristics and content of wheat" (Xylanase in Geflügelnahrung mit Unterschieden in den Eigenschaften und dem Gehalt von Weizen) Br Poult Sci, 1994, Sept.; 35(4) Seiten 537 – 550, werden Experimente beschrieben, die dazu bestimmt sind, die Auswirkung einer Zugabe von reinen Xylanasen auf die zuchttechnischen Leistungen von Geflügel zu messen, das mit einem Futtermittel auf der Basis von Weizen ernährt wird.
Es ist bewiesen worden, dass die Zugabe von Hemizellulasen eine Abbaureaktion der Hemizellulasen nach sich zieht, wodurch infolgedessen ermöglicht wird, die Viskosität des Darminhaltes zu reduzieren, und die zuchttechnische Leistung von monogastrischen Tieren, wie beispielsweise Masthähnchen, zu verbessern, die mit Futtermitteln gefüttert werden, deren einziges Getreide aus Weizen besteht.
Es wird ein Experiment an 1200 Ross-Masthähnchen durchgeführt, um die Bedeutung der Verwendung von fermentierter Kleie, dem Träger von Hemizellulase-Aktivität (Xylanase), im Vergleich zu einem Futtermittel ohne Enzyme und einem Futtermittel nachzuweisen, das eine Quelle standardmäßiger Xylanase enthält, das Produkt Avizyme. Futtermittel mit oder ohne Enzyme werden dergestalt zubereitet, dass 4 Chargen zu 300 Küken gefüttert werden. Ihre Zusammensetzung ist in Tabelle 9 ausgeführt. Die Wachstumsfuttermittel (AL CR) werden während der ersten 21 Aufzuchttage verwendet, und anschließend während 18 Tagen durch Endfuttermittel (AL FI) ersetzt.
TABELLE 9
Das Futtermittel 1 erhält keinerlei Enzyme. Den Futtermitteln 2 und 3 werden jeweils 3 und 5 kg fermentierte Kleie pro Tonne Futtermittel zugefügt. Dem Futtermittel 4 wird 0,6 kg Avizyme^® pro Tonne Futtermittel zugefügt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs nach 39 Aufzuchttagen sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
TABELLE 10

a) Diese fermentierte Kleie weist eine Glucoamylase-Aktivität von 1000 UG/g Trockensubstanz auf, eine Protease-Aktivität von 125 UP/g Trockensubstanz und eine Xylanase-Aktivität von 600 UX/g Trockensubstanz;
b) Avizyme^® wird von der Firma Finfeed, Finnland, geliefert;
c) Verhältnis von Gewicht des aufgenommenen Futtermittels/Gewichtszunahme;
d) Reduzierung in % des Gewichtes von aufgenommenem Futtermittel im Verhältnis zum Gewicht von verzehrtem Futtermittel 1 (ohne Enzyme).

Das Beimischen von fermentierter Kleie zu einem Geflügelfuttermittel (3 oder 5 kg/Tonne) hat ermöglicht, den Futterkoeffizienten bedeutend zu reduzieren. Unter Versuchsbedingungen erscheint die Verwendung von fermentierter Kleie in einer höheren Bestimmung als 3 kg/Tonne ohne praktische Bedeutung. Die beobachteten Verbesserungen sind mit denjenigen vergleichbar, die für das Handelsprodukt mit der Bezeichnung Avizyme (0,6 kg/Tonne) beobachtet werden. Die Verwendung von fermentierter Kleie weist allerdings den Vorteil auf, dass sie weniger kostspielig ist als die Verwendung des Enzymproduktes aus dem Handel.

Claims

Verbindung, welche Glukoamylase-, Protease- und Xylanase-Aktivitäten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie Weizenkleie umfasst, die mit einem Stamm von Aspergillus fermentiert wird, der unter den Stämmen ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 ausgewählt wird, oder mit einem Stamm von Aspergillus oryzae, der unter den Stämmen ATCC 22788 und ATCC 42149 ausgewählt wird, wobei die Glukoamylase-, Protease- und Xylanase-Enzymaktivitäten bei den nachfolgenden minimalen Werten vorhanden sind: – Glukoamylase: mindestens 100 UG pro Gramm Trockensubstanz – Protease: mindestens 100 UP pro Gramm Trockensubstanz – Xylanase: mindestens 100 UX pro Gramm Trockensubstanz unter der Bedingung, dass die Glukoamylase Aktivität mindestens 750 UG pro Gramm Trockensubstanz ausmacht und/oder die Xylanase-Aktivität mindestens 300 UX pro Gramm Trockensubstanz ausmacht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Glukoamylase-Aktivität aufweist, die mindestens 750 UG/g Trockensubstanz ausmacht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Glukoamylase-Aktivität aufweist, die mindestens 1500 UG/g Trockensubstanz ausmacht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Xylanase-Aktivität aufweist, die mindestens 300 UX pro Gramm Trockensubstanz ausmacht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Xylanase-Aktivität aufweist, die mindestens 400 UX pro Gramm Trockensubstanz ausmacht.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Aspergillus niger unter dem Stamm NRRL 3112 und dem Stamm ATCC 76061 ausgewählt wird.
Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Aspergillus niger aus dem Stamm ATCC 76061 besteht.
Herstellungsverfahren der in Anspruch 1 definierten Verbindung, wobei die Kleie in Gestalt einer mindestens 10 cm dicken Schicht vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, die daraus bestehen, (a) Weizenkleie zu nehmen; (b) die Kleie anzufeuchten und sie anschließend mit Wärme zu behandeln, damit sie pasteurisiert oder sterilisiert wird; (c) die daraus hervorgehende Weizenkleie mit einem Stamm von Aspergillus zu inokulieren, der unter den Stämmen ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 ausgewählt wird, oder mit einem Stamm von Aspergillus oryzae, der unter den Stämmen ATCC 22788 und ATCC 42149 ausgewählt wird; (d) sie im festen Zustand in einem Reaktor, der in regelmäßigen Abständen belüftetet und gerührt wird, während eines Zeitraumes von 1 bis 3 Tagen bei einer Temperatur von 28 bis 38 °C zu fermentieren, wobei ein anfänglicher Feuchtigkeitsgehalt der Kleie auf 50 bis 60 Gew.-% eingeregelt wird, der während der Fermentierungsdauer unter Belüftungsbedingungen beibehalten wird, die geeignet sind, um eine Ansammlung von Kohlendioxyd, die für die Fermentierung in dem Reaktor schädlich ist, und um aufgrund der Fermentierung einen Anstieg der Temperatur über den angegebe nen Bereich hinaus zu vermeiden, bis die Fermentierungsverbindung die nachfolgenden minimalen Werte von Enzymaktivitäten aufweist: – Glukoamylase: mindestens 100 UG pro Gramm Trockensubstanz – Protease: mindestens 100 UP pro Gramm Trockensubstanz – Xylanase: mindestens 100 UX pro Gramm Trockensubstanz unter der Bedingung, dass die Glukoamylase Aktivität mindestens 750 UG pro Gramm Trockensubstanz ausmacht und/oder die Xylanase-Aktivität mindestens 300 UX pro Gramm Trockensubstanz ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Aspergillus niger unter dem Stamm NRRL 3112 und dem Stamm ATCC 76061 ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Aspergillus niger aus dem Stamm ATCC 76061 besteht.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Inokulationsdosis aus mindestens 1·10⁷ Sporen/Gramm anfänglicher Trockensubstanz besteht.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es den zusätzlichen Schritt aufweist, welcher daraus besteht, die in Schritt (d) erhaltene Verbindung zu gefrieren oder zu trocknen.
Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 und 4 bis 7 für die Herstellung von Ethanol aus Weizen.
Futtermittel für monogastrische Tiere, welchem eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 4 bis 7 beigemengt wird.