DE60018416T2

DE60018416T2 - Verwendung des transkriptionsaktivators bnm3 zur kontrolle pflanzlicher embryogenese und regenerationsprozesse

Info

Publication number: DE60018416T2
Application number: DE60018416T
Authority: DE
Inventors: Kim Boutilier; Therèse OUELLET; Jan Custers; Jiro Hattori; Brian Miki; Michiel Van Lookeren Campagne
Original assignee: Agriculture and Agri-Food Canada; Plant Research International BV
Current assignee: Canada, as Re Ca; Nederlanden Staat
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2020-06-03
Also published as: AU776411B2; BRPI0011101B1; CA2375535A1; CN1367831A; US7151170B1; ATE290082T1; JP2003501093A; WO2000075330A1; EP1185656B1; DE60018416D1; AU4907700A; EP1057891A1; EP1185656A1; BR0011101A; CA2375535C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein üblicher Samen von Angiospermen besteht aus drei wesentlichen Bestandteilen, dem Embryo, dem Endosperm und dem mütterlichen Samenmantel. Die Samenentwicklung beginnt mit einem Doppelbefruchtungsereignis, bei dem der Kern einer Spermienzelle mit dem Kern einer Eizelle verschmilzt, um ein Embryo zu bilden, und ein zweiter Kern einer Spermienzelle mit zwei zentralen Zellkernen verschmilzt, um das Endosperm zu bilden. Die embryonale Entwicklung selbst kann in drei Entwicklungsphasen aufgeteilt werden. Die erste Phase der Embryonalentwicklung besteht aus Zellteilung und Morphogenese, wobei sich die wesentlichen Gewebearten und Organsysteme der reifen Pflanze ausbilden. Die zweite Phase umfasst einen Zeitraum schneller Zellexpansion und wird durch die Synthese von Vorratsreserven gekennzeichnet, die den Embryo während der Keimung und der frühen Sämlingsentwicklung erhalten. In der letzten Phase embryonaler Entwicklung trocknet das Embryo und betritt eine Phase des Entwicklungsstillstandes oder der Dormanz. Alle hier genannten Ereignisse laufen normalerweise ab, während der Samen mit der mütterlichen Pflanze verbunden ist.
Viele Pflanzensorten sind jedoch in der Lage Embryos in Abwesenheit einer Befruchtung zu erzeugen. Dieses Verfahren ungeschlechtlicher embryonaler Entwicklung kann natürlich auftreten, beispielsweise auf den Blattränder von Bryophyllum (Yarborough, 1923) und Malaxis (Taylor, 1967) oder innerhalb des Ovulums apomiktischer Pflanzen (Koltunow, 1995). Als Apomixis wird die Herstellung eines Samens aus mütterlichem Gewebe des Ovulums in Abwesenheit der Befruchtung einer Eizelle bezeichnet. Ungeschlechtliche embryonale Entwicklung kann in vitro auch ausgehend von gametophytischem oder somatischem Gewebe induziert werden (Mordhorst et al., 1997) oder, wie kürzlich gezeigt, durch genetische Veränderung der Genexpression induziert werden (Ogas et al., 1997; Lotan et al., 1998).
Drei primäre Mechanismen der Apomixis, Diplosporie, Aposporie und adventive Embryonie wurden beobachtet. Jeder Verlauf unterscheidet sich im Hinblick auf die Quelle der Zelle, aus der das Embryo erwächst, und im Hinblick auf den Zeitpunkt der Entwicklung des Ovulums, während der das apomiktische Verfahren begonnen wird. Diplosporie und Aposporie werden als gametophytische Formen der Apomixis bezeichnet, da sie die Bildung diploider embryonaler Säcke umfassen. Adventive Embryonie umfasst die Bildung eines durch Mitose erhältlichen embryonalen Sackes nicht.
Während der Diplosporie durchläuft die Megasporen-Mutterzelle keine normale Meiose, sondern teilt sich mitotisch, um einen diploiden Embryosack anstelle eines normalen haploiden Embryosacks zu bilden. Eine der Zellen des Embryosacks fungiert als Eizelle und teilt sich parthenogentisch (ohne Befruchtung), um einen Embryo zu bilden. Bei einigen Arten können die nicht-reduzierten polaren Kerne des Embryosacks verschmelzen, um das Endosperm zu bilden (autonome Endospermbildung), das Nährgewebe des Samen, während andere Arten Bestäubung für die Endospermbildung benötigen (Pseudogamie).
In aposporösen Apomikten werden parthenogenetische Embryonen aus weiteren Zellen erzeugt, die aposporösen Initialzellen, die aus dem Nucellus differenzieren. Wie bei den Megagametophyten der diplosporösen Arten durchlaufen die aposporösen Initialzellen methotische Teilung, um einen diploiden Embryosack auszubilden. Aposporöse Embryonen stammen nicht von den Megagematophyten ab und können daher in einem einzigen Ovulus mit sexuell erzeugten Embryonen zusammen existieren. Die autonome Erzeugung des Endosperms ist bei aposporösen Arten selten. Für die Erzeugung des Endosperms hängen aposporöse Apomikten daher von einer Befruchtung der polaren Kerne eines meiotisch erzeugten Embryosacks ab.
Bei adventiver Embryonie werden Embryonen direkt aus dem sporophytischen Gewebe des Ovulums gebildet, wie den Integumenten oder dem Nucellus, über Parthenogenese. Samen, der von Arten erhalten wurde, die adventive Embryonie aufweisen, enthält üblicherweise eine Vielzahl sexuell erhaltener Embryonen und kann ferner ein einziges sexuell erhaltenes Embryo enthalten. Pflanzen, die adventive Embryonen ausbilden, basieren ferner auf der Gegenwart eines meiotisch erhaltenen Embryosacks innerhalb desselben Ovulums zur Endospermbildung.
In den meisten Pflanzenarten erscheint das apomiktische Merkmal unter der Kontrolle eines einzigen dominanten Genorts. Dieser Genort kann für einen oder für mehrere Regulatoren der Entwicklung kodieren, wie Transkriptionsfaktoren, welche in sich sexuell vermehrenden Pflanzen Genexpressionskaskaden auslösen, die zu einem Embryosack und/oder zur Embryogenese führen, die aber in apomiktischen Pflanzen heterochronisch oder ektopisch exprimiert werden (Peacock, 1995; Koltunow, 1993; Koltunow et al., 1995).
Apomixis ist eine wertvolle Eigenschaften für die Verbesserung von Nutzpflanzen, da apomiktische Samen klonale Nachkommen hervorbringen und daher für die Herstellung genetisch fixierter Hybridlinien geeignet sind. Die Herstellung von Hybridsamen ist ein zeit- und kostenaufwendiges Verfahren, da man Populationen genetisch reiner parentaler Linien erhalten muss, getrennte Pollen-Spender und männlich-sterile Linien verwenden muss und die Linien isolieren muss. Die Herstellung von Samen mittels Apomixis vermeidet diese Probleme dadurch, dass man einen einmal erzeugten Hybrid klonal erhält, wodurch die Notwendigkeit verschiedener parentale Linie zu erhalten und zu kreuzen eliminiert wird. Die Verwendung apomiktischer Samen stellt ferner ein kostensparendes Verfahren zur Vermehrung vegetativ erzeugter Nutzpflanzen dar, da die Verwendung von Schnitten oder Gewebekulturverfahren zur Erzeugung der Linien eliminiert, die Verbreitung von Erkrankungen, die durch vegetativ erzeugtes Gewebe leicht verbreitet werden, reduziert wird und in vielen Arten die Größe des propagierenden Gewebes reduziert, wodurch die Transport und Pflanzkosten verringert werden.
Obwohl Apomixis in einer Vielzahl von Pflanzenarten vorkommt, sind wenige Nutzpflanzen apomiktisch. Versuche, apomiktische Eigenschaften in Nutzpflanzen durch Introgression aus Wildtyp-Verwandten einzuführen (Ozias-Akins et al., 1993; WO 97/10704; WO 97/11167) oder durch Kreuzungen zwischen Verwandten, aber entwicklungsgeschichtlich divergenten, sich sexuell vermehrenden Arten (WO 98/33374) haben bis jetzt keine marktfähigen Produkte erzeugt. Andere Ansätze waren auf die Identifizierung von Gensequenzen gerichtet, die für die Identifizierung oder Manipulation apomiktischer Verfahren geeignet sein könnten (WO 97/43427; WO 98/36090), aber diese Ansätze haben keine Verfahren für die Routineherstellung apomiktischer Pflanzen hervorgebracht.
Mutagenese-Experimente wurden ferner dazu verwendet, um sexuell reproduzierende Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) in apomiktische Pflanzen zu überführen (Peacock et al., 1995). Bei einer Anzahl rezessiver Mutanten mit der Bezeichnung "Befruchtungs-unabhängige Samen" ("fertilizationindependent seed", fis) wurde beispielsweise festgestellt, dass Teile von Embryonen und/oder des Endosperms in geringer Frequenz in Abwesenheit einer Befruchtung ausgebildet werden konnte (Chaudhury et al., 1997). Eine Vielzahl weiterer Merkmale müssen jedoch verändert werden, um wahre diploide apomiktische Samen aus den fis-Mutanten zu erhalten.
Die Bildung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen kann aus einer Vielzahl gametophytischer und somatischer Pflanzen gewebe in Zellkultur induziert werden (Yeung, 1995). Somatische Embryonen können aus der Zellkultur somatischer Gewebe erhalten werden, wenn diese mit Pflanzenwachstumsregulatoren behandelt werden, wie beispielsweise Auxine oder Auxine in Kombination mit Cytokininen. Die Bildung von Embryonen kann auch aus gametophytischen Geweben des Ovulums (Gynogenese) und der Antheren (Androgenese, Pollen oder Mikrosporen-Embryogenese) in Zellkultur induziert werden, entweder durch Zugabe von Pflanzenwachstumsregulatoren oder durch einfache Stressbehandlung.
Eine Vielzahl von Mutanten wurde identifiziert, die dazu verwendet werden können, die effiziente Ausbildung von Embryonen in vitro zu induzieren. Diese umfassen rezessive Arabidopsis-Mutanten mit veränderten Triebmeristemen, beispielsweise Primordia timing (pt), Clavata (clv)I and clv3, von denen gezeigt werden konnte, dass sie die embryone Kallusbildung steigerten, wenn die Sämlinge in Gegenwart eines Auxins zur Keimung gebracht wurden (Mordhorst et al., 1998). Die veränderte Expression der beiden Arabidopsis-Gene, LEAFY COTYLEDON, (LEC1; WO 98/37184, Lotan et al., 1998) and pickle, von denen gezeigt werden konnte, dass sie die Bildung somatischer Embryonen in Abwesenheit weiterer Wachstumsregulatoren steigern. Das LEC1-Gen kodiert für ein Homolog der HAP3-Untereinheit eines CCAAT Box-bindenden Transkriptionsfaktors (CBF). Das LEC1-Gen kontrolliert viele Aspekte der zygotischen Embryoentwicklung, darunter die Toleranz gegenüber Austrocknung und Cotyledonen-Identität. Eine ektopische Überexpression des LEC1-Gens in einem LEC1-mutierten Hintergrund bewirkt die Erzeugung von zwei transgenen Linien, die zeitweilig Embryo-ähnliche Strukturen auf den Blättern ausbilden. Diese Embryo-ähnlichen Strukturen exprimieren Gene, wie solche die für die Samenvorratsproteine und die Ölkörperproteine kodieren, die üblicherweise primär in sich entwickelnden Embryonen exprimiert werden. Pflanzen, die eine rezessive PICKLE-Genmutation aufweisen erzeugen ein verdicktes, primäres Wurzelmeristem. Mutierte pickle-Wurzeln erzeugen Embryonen-bildenden Kallus, wenn das Wurzelgewebe von dem Rest der Pflanze abgetrennt wird und auf ein Minimalmedium ohne Wachstumsregulatoren aufgebracht wird (Ogas et al., 1997). Mutanten mit pickle-Wurzeln zeigen morphologische Eigenschaften von sich entwickelnden Samen, wie Ölkörper und wie bei den LEC1-überexprimierenden, akkumulierenden Gene, die vorzugsweise in sich entwickelnden Samen exprimiert werden.
Die wirksame Herstellung apomiktischer Samen kann wahrscheinlich nur über eine Identifizierung und nachfolgende Veränderung der Regulatoren der Entwicklung, wie Transkriptionsfaktoren, die Genexpressionskaskaden aktivieren, welche sowohl bei sich sexuell vermehrenden und apomiktischen Pflanzen zur Embryogenese führen, realisiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft diese Aufgabe, indem Verfahren für die Herstellung apomiktischer Samen bereitgestellt werden und umfasst eine ektopische Überexpression einer embryonal-exprimierten AP2-Domäne, die den Transkriptionsfaktor BNM3 oder dessen Homologe enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Aufgabe, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile auszuräumen.
Diese Aufgabe wird durch die Kombination der Merkmale der Hauptansprüche gelöst, wobei die abhängigen Ansprüche weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung offenbaren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bildung ungeschlechtlicher Embryonen und die Regeneration zu Pflanzen. Sie betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung ungeschlecht lich erhaltener Embryonen und zur Steigerung der Regenerationskapazität von Pflanzen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die:

– mit der SEQ ID NO:5 oder 6, die nicht die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region enthält, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert;
– mit der SEQ ID NO:1 oder 3, die nicht die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region enthält, unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
– mindestens 27 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO's:1; 3, 5 oder 6 umfasst; oder die
– mindestens eine Ähnlichkeit von 70% mit der Nukleotidsequenz aufweist, die in den SEQ ID NO's:1, 3, 5 oder 6 definiert wird.

Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes DNA-Molekül, das mit den SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6, die nicht die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region umfasst, unter moderaten und stringenten Bedingungen hybridisiert und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, wobei das Protein, wenn es in ausreichender Menge innerhalb einer Pflanzenzelle vorliegt, die Pflanzenzelle embryogen macht, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht oder die Pflanzenzelle sowohl embryogen macht und die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht. Von der vorliegenden Erfindung wird ferner ein isoliertes DNA-Molekül wie zuvor definiert umfasst, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit den Nukleotiden 1–2014 der SEQ ID NO:1, 1–2011 der SEQ ID NO:3, 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, die nicht die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat1 Region umfasst, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert. Die vor liegende Erfindung betrifft ferner einen Vektor, der ein wie zuvor definiertes isoliertes DNA-Molekül umfasst, wobei das isolierte DNA-Molekül unter Kontrolle eines Regulationselements steht, welches die Expression der DNA in einer Pflanzenzelle kontrolliert. Das regulatorische Element kann ein konstitutives, induzierbares, Gewebe-spezifisches oder entwicklungsabhängiges aktives Regulationselement sein.
Die Erfindung umfasst ferner eine transfomierte Pflanzenzelle, eine transformierte Pflanze oder Samen, der von einer transformierten Pflanze erhältlich sind, wobei jede den oben definierten Vektor umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes Protein, für das ein isoliertes DNA-Molekül kodiert, das mit der in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 6 angegebenen Nukleotidsequenz, wobei die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfasst ist, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei das Protein, wenn es in ausreichender Menge innerhalb einer Pflanzenzelle vorliegt die Pflanzenzelle embryogen macht oder regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht. Ferner umfasst ist ein Protein, für das ein isoliertes DNA-Molekül kodiert, das mit den Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, wobei die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfasst ist, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, oder mit der Nukleotidsequenz, die in der SEQ ID NO:1 oder 3 definiert ist, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert. Die Erfindung umfasst ferner ein isoliertes DNA-Molekül, das für ein wie in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:7 definiertes Protein kodiert. Die Erfindung betrifft ferner ein Protein, das mindestens 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:7 aufweist oder von etwa 30 bis etwa 541 Aminosäuren der in SEQ ID NO:2 offenbar ten Sequenz umfasst oder von etwa 30 bis etwa 561 Aminosäuren der in SEQ ID NO:4 offenbarten Sequenz umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen, Schritte umfassend, bei denen man:

i) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, welche mit einer der SEQ ID NO's:1, 3, 5 oder 6, die die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfassen, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, und das für ein Protein kodiert, das, wenn es in ausreichender Menge innerhalb der Pflanzenzelle vorliegt, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit den Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5, oder mit den Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, wobei die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfasst ist, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert oder mit der in EQ ID NO:1 oder 3 definierten Nukleotidsequenz unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert;
ii) die Pflanzenzelle zieht, um transformiertes Gewebe zu erhalten;
iii) ausgewähltes transformiertes Gewebe auf die Gegenwart des isolierten DNA-Moleküls hin selektiert; und
iv) das transformierte Gewebe auf ungeschlechtliche Embryonenbildung hin untersucht.

Die Erfindung betrifft ferner das obige Verfahren, bei dem der Schritt der Untersuchung (Schritt iv)) eine Untersuchung somatischer Embryonen, gametophytisch erhältlicher Embryonen, adventive Embryonie, Diplosporie oder bei haploider Parthenogenese des Embryosacks umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung apomiktischer Pflanzen, Schritte umfassend, bei denen man:

i) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das mit den Nukleotiden 1–2014 der SEQ ID NO:1, Nukleotiden 1–2011 der SEQ ID NO:3, Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, welche die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfasst, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, und die für ein Protein kodiert, das, wenn in ausreichender Menge in der Pflanzenzelle vorhanden, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht;
ii) die transformierten Zellen auf die Gegenwart des isolierten DNA-Moleküls hin selektiert; und
iii) die transformierten Pflanzen auf ungeschlechtliche Embryobildung hin untersucht.

Die Erfindung betrifft ferner das obige Verfahren, bei dem der Nachweisschritt (Schritt ii)) eine Untersuchung auf ungeschlechtlich erhaltene Embryonen, somatische Embryonen, gametophytisch erhältliche Embryonen, adventive Embryonie, Diplosporie oder auf haploide Parthenogenese des Embryosacks umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen, Schritte umfassend denen man;

i) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor transient transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das mit den Nukleotiden 1–2014 der SEQ ID NO:1, Nukleotiden 1–2011 der SEQ ID NO:3, Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, welche die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfassen, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert und der für ein Protein kodiert, das, wenn in ausreichender Menge in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht;
ii) die transient transformierten Pflanzenzelle vermehrt, um transient transformiertes Gewebe zu erzeugen;
iii) das transient transformierte Gewebe auf ungeschlechtliche Embryobildung hin untersucht.

Die Erfindung betrifft das obige Verfahren, bei dem der Schritt der Untersuchung (Schritt iii)) den Nachweis sexuell erhältlicher Embryonen, somatischer Embryonen, gametophytisch erhältlicher Embryonen, adventiver Embryonie, Diplosporie oder haploidier Parthenogenese des Embryonalsacks umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Veränderung der regenerativen Kapazität einer Pflanze zur Verfügung, Schritte umfassend, bei denen man:

i) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das mit der SEQ ID NO:5 oder der SEQ ID NO:6 unter moderaten oder strin genten Bedingungen hybridisiert und der für ein Protein kodiert, das, wenn in ausreichender Menge in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder der eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mit den Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, welche die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfassen, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, oder mit der Nukleotidsequenz wie in den Nukleotiden der 1–2014 der SEQ ID NO:1 oder den Nukleotiden 1–2011 der SEQ ID NO:3 unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
ii) die transient transformierten Pflanzenzelle wachsen läßt, um transient transformiertes Gewebe zu erzeugen;
iii) das transient transformierte Gewebe auf im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Regeneration hin untersucht.

Die Erfindung umfasst ferner das obige Verfahren, bei dem Schritt iii) einen Nachweis in Abwesenheit eines Wachstumsregulators umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Veränderung der regenerativen Kapazität einer Pflanze, Schritte umfassend, bei denen man:

i) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor transient transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das mit der SEQ ID NO:5 oder der SEQ ID NO:6 unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert und der für ein Protein kodiert, das, wenn in ausreichender Menge in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder der eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mit den Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, welche die AP2 Repeat1-Linker AP2 Repeat2 Region nicht umfassen, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, oder mit der Nukleotidsequenz wie in den Nukleotiden der 1–2014 der SEQ ID NO:1 oder den Nukleotiden 1–2011 der SEQ ID NO:3 unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
ii) die transient transformierten Pflanzenzelle wachsen läßt, um transient transformiertes Gewebe zu erzeugen;
iii) das transient transformierte Gewebe auf im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Regeneration hin untersucht.

Die Erfindung umfasst die obigen Verfahren, bei dem Schritt iii) den Nachweis in Abwesenheit eines Wachstumsregulators umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Auswahl einer transformierten Pflanze, Schritte umfassend, bei debeb man:

i) eine üblicherweise nicht regenerative Pflanzenzelle mit einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das mit der SEQ ID NO:5 oder der SEQ ID NO:6 unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert und der für ein Protein kodiert, das, wenn in ausreichender Menge in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Pflanzenzelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder der eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mit den Nukleotiden 1620–4873 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 2026–5035 der SEQ ID NO:6, welche die AP2 Repeat1-Linker AP2 Re peat2 Region nicht umfassen, unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert, oder mit der Nukleotidsequenz wie in den Nukleotiden der 1–2014 der SEQ ID NO:1 oder den Nukleotiden 1–2011 der SEQ ID NO:3 unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
ii) untersucht, ob die transformierte Pflanze unter Bedingungen regeneriert werden kann, unter denen die üblicherweise nicht regenerierende Pflanze sonst nicht regeneriert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein isoliertes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die mindestens etwa 70% Ähnlichkeit mit den Nukleotiden 1–1619 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 1–2025 der SEQ ID NO:6 aufweist oder die mindestens 22 aufeinander folgende Nukleotide innerhalb der Nukleotide 1–1619 der SEQ ID NO:5 oder 1–2025 der SEQ ID NO:6 umfasst. Der Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst ferner einen Vektor, der das wie zuvor definierte isolierte DNA-Molekül umfasst, das operativ mit einem ausgewählten Gen verknüpft ist, wobei das isolierte DNA-Molekül die Expression des ausgewählten Gens innerhalb einer Pflanzenzelle kontrolliert. Das ausgewählte Gen kann im Hinblick auf das isolierte DNA-Molekül heterolog sein. Das ausgewählte Gen kann aus der Gruppe bestehend aus einem pharmazeutisch aktiven Protein, Antikörper, industriellen Enzym, Proteinsupplement, Nutraceutical, Vorratsprotein, Tierfutter und Tierfutterzusatz ausgewählt werden. Die Erfindung betrifft ferner eine transformierte Pflanzenzelle, eine transformierte Pflanze oder Samen, der von der transformierten Pflanzen erhältlich ist, die den wie zuvor definierten Vektor umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Steuerung der Expression eines ausgewählten Gens innerhalb eines sich entwickelnden Embryos einer Pflanze, Schritte umfassend, bei denen man die Pflanze mit einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül enthält, das mindestens etwa 70 Ähnlichkeit mit den Nukleotiden 1–1619 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 1–2025 der SEQ ID NO:6 aufweist oder das mindestens 22 aufeinanderfolgende Nukleotide aus den Nukleotiden 1–1619 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotiden 1–2025 der SEQ ID NO:6 umfasst.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Proteins, Schritte umfassend, bei denen man:

i) eine Pflanzenzelle mit mindestens einem Vektor transformiert, der ein isoliertes DNA-Molekül umfasst....
ii) ausgewählte transformierte Pflanzen auf die Gegenwart des isolierten DNA-Moleküls hin selektiert; und
iv) die transformierten Pflanzen vermehrt, um das ausgewählte Protein zu erzeugen, wobei die Expression des ausgewählten Proteins durch das Expressionsprodukt der isolierten DNA induziert wird.

Das Verfahren kann ferner die Transformation der Pflanze mit einem zweiten Vektor umfassen, welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, die für das ausgewählte Protein unter Kontrolle eines Regulationselementes kodiert, wobei das Regulationselement durch das Expressionsprodukt der isolierten DNA induziert wird. Das Verfahren kann ferner dazu verwendet werden, das ausgewählte Protein zu erzeugen, wobei das ausgewählte Protein ein natives Protein ist.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle wesentlichen Merkmale der Erfindung, da die Erfindung auch durch eine Unterkombination der offenbarten Merkmale ausgeführt werden kann.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER FIGUREN
Diese und weitere erfindungsgemäße Figuren werden aus der nachfolgenden Beschreibung verständlicher, in der auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird:
1 zeigt eine schematische Darstellung der Auswirkung der Temperatur der Zellkultur auf das Schicksal der Entwicklung isolierter Mikrosporen und Pollen von Brassica napus. Späte einkernige Mikrosporen und frühe zweikernige Pollen bei 25°C oder darunter in Kultur gezogen, setzen die Teilung fort und bilden funktionale Pollenkörner (gametophytisch) aus, während dieselben Mikrosporen und Pollen, die bei 32°C in Kultur gezogen wurden, eine Vielzahl sporophytischer Teilungen durchläuft, die zur Bildung haploider Embryonen führt (embryonal). Späte einkernige Mikrosporen und frühe zweikernige Pollen, die für einen Tag bei 25°C in Kultur gezogen wurden, gefolgt von einer Kultur bei 32°C können gametophytische Teilungen durchlaufen, jedoch weder Embryonen noch reife Pollenkörner ausbilden (nicht-embryogen).
2 zeigt die Anlagerung der DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3 abgebildet werden. Die ATG und TAG Translationsinitiations- und Translationsterminationskodons sind fett markiert. Identische Nukleotide werden durch (*) und Unterbrechungen durch (–) angezeigt.
3 zeigt die Anlagerung der abgeleiteten Proteinsequenzen, welche von den DNA der SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3 kodiert werden. Die Aminosäuresequenz der ersten AP2 Re peat-Domäne (Repeat 1) und der zweiten AP2 Repeat-Domäne (Repeat 2) sind fett markiert. Identische Aminosäuren werden durch ein Sternchen dargestellt (*) und Mismatches durch einen Punkt (.) unter der Sequenzanlagerung.
4 zeigt die Gegenwart von BNM3-Genen in dem Brassica napus-Genom. Ein DNA-Gelblot, der einen Restriktionsverdau der B. napus c.v. Topas genomischen DNA enthält, wurde mit einem BNM3A cDNA-Fragment unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert. Die BNM3A cDNA hybridisiert an zwei DNA-Fragmente unter diesen Bedingungen. Diese Fragmente entsprechen den BNM3A- und BNM3B-Genen. Die Position des Molekulargewichtsmarkers (Lambda DNA Hind III Restriktionsfragmente) wird am linken Rand der Figur gezeigt. Die Restriktionsenzyme, die für den Verdau der DNA verwendet wurden, werden oberhalb des Blots dargestellt.
5 zeigt die Anlagerung der abgeleiteten Proteinsequenz, die von der DNA der SEQ ID NO:1 kodiert wird (BNM3A) zusammen mit der abgeleiteten Proteinsequenz weiterer Proteine mit AP2-Domänen. Die Aminosäuresequenz des BNM3A, beginnend bei Rest Nr. 208 und bis über die erste AP2-Repeat-Domäne (AP2-Domäne-Repeat-1), die zweite AP2-Repeat-Domäne (AP2-Domäne-Repeat-2) und den Linkerbereich, der zwischen den beiden Repeats liegt (Linker), wurde mit der Aminosäuresequenz weiterer Proteine, die zwei AP2-Domänen enthalten, aneinander gelagert. Die Aminosäureähnlichkeit in diesem Bereich reicht von 53% für APETALA2 bis zu 80% für ZMMHCF1. Identische Aminosäuren werden durch ein (*) und Unterbrechungen der Sequenz durch ein (–) angezeigt. Die Namen der Proteine werden am rechten Rand angegeben und werden wie folgt abgekürzt: ANT, AINTEGUMENTA (Zu griffsnummer U41339); ZM, ZMMHCF1 (Zugriffsnummer Z47554); GL15, GLOSSY15 (Zugriffsnummer U41466); AP2, APETALA2 (Zugriffsnummer I12546).
6 zeigt das Ergebnis einer Gelblot-Analyse mit einem BNM3A cDNA-Fragment, die auf der Grundlage von RNA ausgeführt wurde, die aus den genannten Geweben extrahiert wurde. RNA-Gelblots enthalten entweder 5 μg (a) oder 20 μg (b, c) an Gesamt-RNA. 6A zeigt die Verteilung der BNM3-Expression in Mikrosporen-Embryokulturen. RNA wurde aus späten einkernigen Mikrosporen und frühe zweikernige Pollen isoliert, die zur Zeit der Sammlung (Pollen 0D), nach 4 Tagen in Zellkultur bei 32°C (+ Embryo), nach 4 Tagen in Zellkultur bei 25°C (Pollen 4D), nach einem Tag Zellkultur bei 25°C, gefolgt von 3 Tagen Zellkultur bei 32 C (-Embryo) und von Mikrosporen erhaltene Embryonen zum Zeitpunkt der globulären, Herz, Torpedo, 21 Tage alten Cotyledonen (21 D cot), 28 Tage alten Cotyledonen (28D cot) Phasen der Entwicklung. BNM3-Expression wurde in embryogenen Mikrosporen und in sich entwickelnden aus Mikrosporen erhältlichen Embryonen, jedoch nicht in sich entwickelnden Mikrosporen und Pollen, die vor der Gewebekultur gesammelt wurden, und in nicht-embryogenen Proben nachgewiesen. Die Kontaktzeit betrug 7 Tage. 6B zeigt die BNM3-Genexpression, die in sich entwickelnden Samen nachgewiesen wurde. Samen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestäubung gesammelt (DAP). Diese Punkte der Entwicklung entsprechen etwa der globulären (7 T), herzförmigen (14T), Torpedo (18 T), frühe Cotyledonen (21 T), mittlere Cotyledonen (28 T, 35 T) und späte Cotyledonen (42 T) Phase der Entwicklung. Die Entwicklungszeit betrug 14 Tage. 6C zeigt, dass die BNM3 Genexpression in anderen als Samengeweben nicht nachgewiesen wurde. Wurzeln und Blätter wurden von Pflanzen gesammelt, die über 14 Tage im Gewächshaus gezogen wurden. Vollständige Blüten, sowie ausgeschnittene Antheren und Stempel wurden aus geöffneten Blütenknospen unmittelbar vor der Anthese gesammelt. Kleine und große Knospen bezeichnen geschlossene Blütenstände mit einer Länge von weniger als 5 mm oder größer als 5 mm, respektive. Schoten wurden 16 Tage nach der Bestäubung gesammelt. Die Entwicklungszeit betrug 14 Tage.
7 zeigt den Phänotyp von Brassica napus und Arabidopsis Pflanzen, die mit Konstrukturen transformiert wurden, welche das BNM3-Gen enthielt unter der Kontrolle eines veränderten POLYUBIQUITIN-Promotors (B) oder unter einem doppelt-verstärkten 35S-Promotor, welcher einen AMV-Translationsenhancer enthielt (A, C–E). 7A zeigt Embryonalstrukturen am Blattrand eines Brassica T1 Sämlings. 7B zeigt Embryonalstrukturen auf dem Blattstiel eines Arabidopsis T2 Sämlings. 7C zeigt Embryonalstrukturen auf der Cotyledone eines Arabidopsis T1 Sämmlings. 7D zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Abaxialseite einer Arabidopsis T1 Cotyledone. Die bipolare Natur der Embryonen ist bemerkenswert, genau wie die Entstehung sekundärer Embryonen auf der Oberfläche eines Primärembryos (Sternchen). 7E zeigt einen halbdünnen Schnitt durch eine der Cotyledonen des T1 Sämlings, der in 7C gezeigt wird. Man beachte die Gegenwart aller wesentlichen Organe und Gewebeelemente des Embryos, sowie die Entwicklung neuer Embryonen an den Seiten des Apikalmeristems des Triebs und der Cotyledonen.
8 zeigt die verstärkte regenerative Kapazität von Arabidopsis Pflanzen, die mit einem Konstrukt transformiert wurden, das ein BNM3B Gen unter der Kontrolle eines veränderten POLYUBIQUITIN-Promotors enthält. 8A zeigt Wildtyp und transgene Blatt- und Hypocotyl-Explantate auf einem Medium, das Wachstumsregulatoren enthält. 8B zeigt Wildtyp und transgene Wurzeln auf einem Medium, das Wachstumsregulatoren enthält. 8C zeigt Wildtyp und transgene Blatt- und Hypocotyl-Explantate auf einem Medium ohne Wachstumsregulatoren. 8D zeigt Wildtyp und transgene Wurzelexplantate auf einem Medium ohne Wachstumsregulatoren.
9 zeigt eine Beschreibung des AtBBM Gens; das Arabidopsis-Ortholog des BNM3. 9A zeigt die Position der AtBBM Sequenz und ausgewählte Restriktionsendonukleasestellen auf etwa 8 kb überlappender Arabidopsis thaliana Ecotyp C24 genomischer DNA. Die abgeleiteten Proteinkodierende Region des einzelnen Arabidopsis BNM3 Homologs überspannt die Reste 3426 bis 6435 der genomischen Sequenz. Die Exons des abgeleiteten kodierenden Bereichs werden als schwarze Rahmen oberhalb der Restriktionskarte angezeigt. Ein vertikaler Pfeil bei Position 7479 verweist auf den Beginn der IXR3 (Irreguläres xylem3) Sequenz. Der horizontale Skalierungsbalken gibt Kilobasen an. 9B zeigt, dass der genomische Arabidopsis-Klon AtBBM und das Arabidopsis-Homolog, das durch DNA-Gel-Blot-Analyse unter Verwendung einer Brassica napus BNM3 cDNA-Sonde identifiziert wurde, identisch sind. Genomische DNA von Arabidospsis der Ecotypen Landsberg erecta (L) und Columbia (C) wurden mit den in (A) gezeigten Restriktionsenzymen verdaut und gegen eine BNM3A cDNA-Probe vollständiger Länge (SEQ ID NO:1) hybridisiert. Der in (A) gezeigte Vergleich der Restriktionskarten mit dem Muster hybridisierender Restriktionsfragmente zeigt, dass die cDNA-Probe vollständiger Länge von Brassica ein einziges Arabidospsis-Homolog unter Waschbedingungen moderater Stringenz nachweist (0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 25°C). Die Molekulargewichtsmarker werden rechts von dem Blot angegeben (in Kilobasen).
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung betrifft die ungeschlechtliche Embryobildung und Regeneration in Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen und zur Verstärkung der Regenerationskapazität von Pflanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Systeme zur Erzeugung heterologer Proteine in Pflanzen und deren Verwendungen.
Die nachfolgende Beschreibung stellt eine bevorzugte Ausführungsform lediglich beispielhaft dar und ohne eine Beschränkung auf die Kombination der Merkmale, die für die Ausführung der Erfindung notwendig sind.
Gene, die bevorzugt bei der Induktion der Brassica napus c.v. Topas Mikrosporen Embryogenese exprimiert werden, wurden mittels Subtraktionsscreening isoliert. Es wurde festgestellt, dass sieben unabhängige cDNA-Klone, die sechs einzigartige DNA Sequenzen umfassen, in cDNA-Bibliotheken, die von embryogenen und nicht-embryogenen Mikrosporenkulturen erzeugt wurden, differentiell exprimiert werden. Mehrere dieser BNM (für Brassica napus Mikrosporen Embryo)-Klone, BNM3A (SEQ ID NO:1) und BNM3B (SEQ ID NO:3) wurden durch die nachfolgende Beschreibung gekennzeichnet. BNM3A und BNM3B kodieren für Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:4, respektive, beschrieben werden. Die genomische Sequenz des BNM3A (SEQ ID NO:5), welche einen regulatorischen Bereich (die Nukleotide 1–1619 der SEQ ID NO:5) umfasst, wurde ebenfalls erhalten. Das Arabidopsis-Ortholog des BNM3-Gens, das AtBBM genannt wird, wurde ebenfalls identifiziert. Die genomische Sequenz des AtBBM wird in SEQ ID NO:6 dargestellt, während die abgeleitete Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:7 dargestellt wird.
Der Begriff "Regeneration" wird in der vorliegenden Anmeldung dazu benutzt, eine morphogenetische Reaktion zu beschreiben, welche die Erzeugung neuer Gewebe, Organe, Embryonen ganzer Pflanzen oder Fragmente ganzer Pflanzen, die von einzelnen Zellen oder einer Gruppe von Zellen abstammen, hervorbringt. Die Regeneration kann indirekt über eine Kallusphase oder direkt, ohne eine dazwischenliegende Kallusphase ablaufen. "Regenerative Kapazität" bezeichnet die Fähigkeit einer Pflanzenzelle Regeneration zu durchlaufen.
Mit dem Begriff "embryogene Zelle" wird eine Zelle bezeichnet, die den Übergang entweder von einer somatischen oder einer gametophytischen Zelle zu einem Zustand abgeschlossen hat, in dem keine weiteren Stimuli verabreicht werden müssen, um einen Embryo zu erzeugen.
Als "regulatorisches Element" werden solche bezeichnet, die entwicklungsbiologische, Gewebe-spezifische, induzierbare und konstitutive regulatorische Elemente umfassen. Ein regulatorisches Element, das entwicklungsbiologisch reguliert wird oder das die differentielle Expression eines Gens unter seiner Kontrolle bestimmt, wird in bestimmten Organen oder Geweben eines Organs zu bestimmten Zeiten während der Entwicklung dieses Organs oder Gewebes aktiviert. Einige regulatorische Elemente, welche die Entwicklung steuern, können jedoch vorzugsweise in bestimmten Organen oder Geweben zu bestimmten Entwicklungsstadien aktiv sein, aber auch in einer entwicklungsbiologisch regulierten Art aktiv sein oder in einer Grundmenge in anderen Geweben oder Organen innerhalb der Pflanze, solche regulatorischen Elemente werden als "Gewebe-spezifisch" bezeichnet. Regulatorische Elemente werden entweder oberhalb, innerhalb, un terhalb des kodierenden Bereichs eines Gens oder als Kombination dieser Möglichkeiten gefunden.
Ein induzierbares regulatorisches Element ist ein solches, das in der Lage ist, direkt oder indirekt die Transkription eines oder mehrerer DNA-Sequenzen oder Gene als Reaktion auf ein Induktionsmittel zu aktivieren. In Abwesenheit des Induktionsmittels werden die DNA-Sequenzen oder Gene nicht transkribiert. Der Proteinfaktor, der typischerweise an das induzierbare regulatorische Element bindet, um die Transkription zu aktivieren, liegt in inaktiver Form vor, die anschließend direkt oder indirekt von dem Induktionsmittel in die aktive Form überführt wird. Das Induktionsmittel kann ein chemischer Wirkstoff, wie ein Protein, Metabolit, Wachstumsregulator, Herbizid oder eine Phenolverbindung oder ein physiologischer Stress sein, der unmittelbar durch Hitze, Kälte, Salz oder toxische Elemente oder indirekt durch die Einwirkung eines Pathogens oder eines Krankheitserregers, wie eines Virus, induziert wird. Eine Pflanzenzelle, die ein induzierbares regulatorisches Element enthält, kann dem Induktionsmittel ausgesetzt werden, indem man extern das Induktionsmittel an die Zelle oder Pflanze, beispielsweise durch Aufsprühen, Wässerung, Hitze oder ähnliche Verfahren verabreicht.
Ein konstitutives regulatorisches Element steuert die Expression eines Gens in verschiedenen Teilen einer Pflanze und über die. Entwicklung der Pflanze hinweg kontinuierlich. Beispiele für bekannte konstitutive regulatorische Elemente umfassen Promotoren, die mit dem CaMV 35S Transkript assoziiert werden (Odell et al., 1985, Nature, 313:810–812), dem Reis Actin 1 (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3:1155–1165) und der Triphosphatisomerase I Gene (Xu et al., 1994, Plant Physiol., 106:459–467), dem Mais Ubiquitin 1-Gen (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol., 29:637–646), den Arabidopsis Ubiquin 1- und 6-Genen (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol., 29:637–646) und dem Tabak-Translationsinitiationsfaktor 4A-Gen (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol., 29:995–1004).
Als "ausgewähltes Gen" wird irgendein Gen bezeichnet, das in einer transformierten Pflanze exprimiert werden soll. Ein entsprechendes, ausgewähltes Gen kann umfassen, ist jedoch nicht beschränkt auf ein Gen, das für ein pharmazeutisch aktives Protein kodiert, beispielsweise Wachstumsfaktoren, Wachstumsregulatoren, Antikörper, Antigene, deren Derivate, die für die Immunisierung und Impfung und Ähnliches nützlich sind. Entsprechende Proteine umfassen sind jedoch nicht beschränkt auf, Interleukine, Insulin, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF oder Kombinationen davon, Interferone, beispielsweise Interferon-α, Interferon-β, Interferon-τ, Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise Faktor VIII, Faktor IX oder tPA oder Kombinationen davon. Ein ausgewähltes Gen kann auch für ein industrielles Enzym kodieren, ein Proteinsupplement, ein Nutraceutical oder ein wertsteigerndes Produkt für Futtermittel, Nahrungsmittel oder sowohl Futter- als auch Nahrungsmittelverwendung. Beispiele entsprechender Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Proteasen, Oxidasen, Phytasechitinasen, Invertasen, Lipasen, Cellulasen, Xylanasen, Enzyme, die bei der Ölbiosynthese beteiligt sind, etc. Weitere Proteinsupplemente, Nutraceuticals oder wertsteigernde Produkte umfassen native oder veränderte Samenvorratsproteine und Ähnliche.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein chimäres Genkonstrukt, das eine ausgewählte DNA enthält, die operativ mit einem regulatorischen Element der vorliegenden Erfindung verknüpft ist. Irgendein exogenes Gen oder ein ausgewähltes Gen kann verwendet und gemäß der vorliegenden Erfindung verändert werden, um die Expression des exogenen Gens herbeizuführen.
Die Aktivierung der Expression eines ausgewählten Gens kann auch unter der Kontrolle eines regulatorischen Elements erfol gen, das selbst durch ein BNM3-Protein aktiviert wird. Ein nicht-beschränkendes Beispiel stellt ein ausgewähltes Gen dar, das an den Napin-Promotor fusioniert wurde, wobei der Napin-Promotor durch BNM3 induziert wird. Ein ausgewähltes Gen kann ferner in somatischen Geweben unter der Kontrolle eines oder mehrerer regulatorischer Elemente exprimiert werden, die durch BNM3 induziert werden, sodass, wie nachfolgend detaillierter beschrieben, das somatische Gewebe sich zu einer Samenähnlichen Struktur entwickelt, die embryogene Zellen umfasst, und die Samen-ähnliche Struktur die Produkte des ausgewählten Gens erzeugt.
Das erfindungsgemäße chimäre Gen-Konstrukt kann ferner einen 3' nicht-translatierten Bereich umfassen. Ein 3' nicht-translatierter Bereich bezeichnet einen Teil eines Gens, das ein DNA-Segment umfasst, welches ein Polyadenylierungssignal und irgendein anderes regulatorisches Signal umfasst, das in der Lage ist, mRNA-Prozessierung oder Genexpression zu bewirken. Das Polyadenylierungssignal wird üblicherweise dadurch gekennzeichnet, dass es die Addition von Polyadenylsäureresten an das 3'-Ende des mRNA-Vorläufers bewirkt. Polyadenylierungssignale werden allgemein durch die Gegenwart einer Homologie zu der kanonischen Form 5' AATAAA-3' erkannt, obwohl Variationen der Sequenz nicht ungewöhnlich sind. Beispiele für geeignete 3'-Bereiche sind 3'-transkribierte, nicht-translatierte Bereiche, die ein Polyadenylierungssignal des Agrobacterium Tumor-induzierenden Plasmid-Gens (Ti) enthalten, wie beispielsweise die Nopalinsynthase (nos Gen) und Pflanzengene, wie das Sojabohnenvorratsprotein-Gen und die kleine Untereinheit des Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase-Gens (ssRUBISCO). Der 3' nicht-translatierte Bereich des Strukturgens des vorliegenden Konstrukts kann daher zur Herstellung chimärer Gene für die Expression in Pflanzen verwendet werden.
Die chimären Genkonstrukte der vorliegenden Erfindung können ferner Enhancer umfassen, wobei es sich je nach Bedarf um Translations- oder Transkriptions-Enhancer handelt. Diese Enhancer-Bereiche sind dem Fachmann gut bekannt und können das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen umfassen. Das Initiationskodon muss in Übereinstimmung mit dem Leseraster der kodierenden Sequenz vorliegen, um eine Translation der Gesamtsequenz zu ermöglichen. Die Translationskontrollsignale und Initiationskodons können von einer Vielzahl von Quellen abstammen, sowohl natürlicher als auch synthetischer Art. Translationale Initiationsbereiche können aus derselben Quelle wie die transkriptionalen Initiationsbereiche oder von demselben Strukturgen bereitgestellt werden. Die Sequenz kann auch dem regulatorischen Element entnommen werden, das für die Expression des Gens ausgewählt wurde, und spezifisch verändert werden, um die Translation der mRNA zu steigern.
Zur Erleichterung der Identifizierung transformierter Pflanzenzellen können die erfindungsgemäßen Konstrukte ferner verändert werden, sodass sie für Pflanzen selektierbare Marker umfassen. Geeignete selektierbare Marker umfassen Enzyme, die für die Resistenz gegen ein Antibiotikum, wie Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin und Ähnliche kodieren. In ähnlicher Weise können Enzyme verwendet werden, welche die Herstellung einer Verbindung bereitstellen, die mittels eines Farbumschlags, wie GUS (β-Glucuronidase), Fluoreszenz oder Lumineszenz, identifizierbar sind.
Als Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden ferner transgene Pflanzen betrachtet, die ein Gen oder ein chimäres Genkonstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, das ein BNM3-Gen, ein regulatorisches Element, das von BNM3 abstammt, oder den kodierenden Bereich des BNM3 in operativer Verknüpfung mit einem konstitutiven, entwicklungsbiologisch regulierten oder induzierbaren regulatorischen Element oder mit einer Kombination davon umfasst. Verfahren zur Regeneration ganzer Pflanzen und Pflanzenzellen sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen werden transformierte Pflanzenzellen in einem geeigneten Medium in Kultur gezogen, wobei das Medium Selektionsmittel, wie Antibiotika, enthalten kann, wenn selektive Marker eingesetzt wurden, um die Identifizierung transformierter Pflanzen zu erleichtern. Sobald Kallusgewebe gebildet wird, kann die Triebbildung durch Nutzung geeigneter Pflanzenhormone in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren verstärkt werden, und die Triebe auf Wurzelbildungsmedium zur Generation von Pflanzen überführt werden. Die Pflanzen werden zur Begründung repetitiver Generationen verwendet, entweder aus Samen oder unter Verwendung von vegetativen Vermehrungsverfahren. Die erfindungsgemäßen Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plassmiden, Ri-Plasmiden, viralen Pflanzenvektoren, unmittelbarer DNA-Transformation, Mikro-Injektion, Elektroporation, biolistischen Verfahren, etc. eingeführt werden. Eine Übersicht entsprechender Verfahren wird beispielsweise in Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York VIII; S. 421–463 (1988); Geierson und Corey, Plant Molecular Biology, 2. Ausgabe (1988); und Miki und Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants, In Plant Metabolism, 2. Ausgabe, D.T. Dennis, D.H. Turpin, D.D. Lefebrve, D.B. Layzell (Hrsg.), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, S. 561–579 (1997) gegeben. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner geeignete Vektoren, die das Gen oder chimäre Genkonstrukt umfassen.
Eine neue Klasse von Genen wurde aus Embryokulturen von Brassica napus Mikrosporen isoliert. Durch die Fähigkeit die Bildung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen bei ektopischer Expression in vegetativen Geweben von Pflanzen zu induzieren, konnte festgestellt werden, dass diese Gene wichtige Regulatoren der Embryogenese sind. Die Gene werden nachfolgend als BNM3-Gene (Brassica napus Mikrosporen Embryo) bezeichnet. SEQ ID NO:1 zeigt die cDNA des BNM3A, SEQ ID NO:3 zeigt die cDNA des BNM3B und die genomische Sequenz des BNM3A wird in SEQ ID NO:5 gezeigt. Der regulatorische Bereich des BNM3A liegt innerhalb der Nukleotide 1–1619 der SEQ ID NO:5. Die abgeleiteten Proteinsequenzen, die durch die DNA der SEQ ID NO:1 und 3 kodiert werden, werden in SEQ ID NO:2 und 4, respektive, dargestellt.
Das Ortholog des BNM3-Gens wurde ferner in Arabidopsis identifiziert und wird nachfolgend als AtBBM bezeichnet. SEQ ID NO:6 zeigt die genomische Sequenz des AtBBM. Die regulatorische Region des AtBBM liegt in den Nukleotiden 1–2025 der SEQ ID NO:6. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO:7 dargestellt.
Die BNM3-Translationsprodukte enthalten zwei Kopien einer AP2-Domäne, die durch einen Linkerbereich getrennt sind (3, Aminosäuren 208–378 der SEQ ID NO:2, und SEQ ID NO:4, Nukleotide 2694–4252 der SEQ ID NO:5, Nukleotide 2938–4416 der SEQ ID NO:6), die nachfolgend als "AP2-Domäne" oder "AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2" bezeichnet wird. Es ist davon auszugehen, dass die AP2-Domäne Protein-Protein-Interaktionen bewirkt. Die Fähigkeit eines Proteins, das eine Anzahl von AP2-Domänen enthält, DNA zu binden, verknüpft mit der Gegenwart von möglichen nukleären Lokalisationssignalen und sauren Bereichen, die als Transkriptionsaktivatoren wirken können, lässt es wahrscheinlich erscheinen, dass diese Proteine als Transkriptionsfaktoren wirken. Die AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2 des BNM3 weist etwa 99% Homologie mit der AP2-Domäne des AtBBM auf (95% Nukleotidähnlichkeit zwischen BNM3 und AtBBM), und ein hohes Ausmaß an Ähnlichkeit mit weiteren AP2-umfassenden Proteinen, beispielsweise ANT etwa 85% (75% Nukleotidähnlichkeit), MOE17 (Chromosom 3), etwa 85% (78% Nukleotidähnlichkeit; sofern die Introns in den Vergleich aufgenommen werden, beispielsweise die AP2-Region der SEQ ID NO:5, weist mit MOE17 etwa 63% Nukleotidähnlichkeit über einen Bereich von 285 bp innerhalb der zweiten AP2-Domäne auf), ZMMHCF1, 88%, oder GLOSSY15, 66%. Außerhalb der zwei AP2-Domänen ist die Ähnlichkeit der Sequenz zwischen BNM3 und diesen weiteren AP2-tragenden Proteinen wesentlich reduziert.
Als "BNM3" oder "BNM3-Gen" wird die Sequenz der Oligonukleotide bezeichnet, die in SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 offenbart wird oder Fragmente, Derivate oder Mutationen davon oder Oligonukleotidsequenzen, die mindestens Folgendes aufweisen:

i) 70% Homologie oder Ähnlichkeit mit einem Fragment oder Derivat der Sequenzen, die in SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 offenbart werden, nicht umfassend die AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2-Region, die durch die Nukleotide 741–1257 der SEQ ID NO:1, Nukleotide 672–1188 der SEQ ID NO:3, der entsprechenden Sequenz innerhalb des kodierenden Bereichs der Nukleotide 2694–4252 der SEQ ID NO:5 oder der Nukleotide 2938–4416 der SEQ ID NO:6 (die Bereiche, die als Nukleotide 2694–4252 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotide 2938–4416 der SEQ ID NO:6 definiert werden, werden durch 7 Introns unterbrochen; siehe 9) definiert wird; oder
ii) 70% Homologie oder Ähnlichkeit mit den Sequenzen vollständiger Länge, die in SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 offenbart werden, darunter die AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2-Region.

Entsprechende Homologiebestimmungen können unter Verwendung von Algorithmen der Oligonukleotidanlagerung ausgeführt werden, z.B. aber nicht beschränkt auf BLAST (GenBank URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/cqi-bin/BLAST/, unter Verwendung der folgenden Standardeinstellungen: Programm: blastn; Database: nr; Expect 10; Filter: default, Alignment: pairwise; Query genetic Codes: Standard (1) oder FASTA, wiederum unter Verwendung der Standardeinstellungen. Unter Verwendung der Sequenzähnlichkeitsrecherchen weist AtBBM etwa 85% Homologie zu der Gesamtlänge des BNM3 auf, AtBBM ist daher ein BNM3-Gen. Ein BNM3-Gen kann ferner durch Bezugnahme auf die Fähigkeit definiert werden mit den erfindungsgemäßen Sequenzen zu hybridisieren. Daher umfasst "BNM3" oder "BNM3-Gen" ferner:

iii) Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als etwa 15 Nukleotiden, vorzugsweise einer Länge von 20 bis 25 Nukleotiden, die mit irgendeiner der SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 assoziieren oder mit einem Fragment oder Derivat der Sequenzen, die in SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 offenbart werden, darunter nicht der Bereich, der für die AP2-Domäne kodiert (AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat1) wie oben definiert unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf unter Verwendung von Gel-Blots hybridisieren (Southern-Hybridisierung) bei etwa 65°C bei 5×SSC, gefolgt von Waschbedingungen bei 0,1×SSC, bei 65°C; oder
iv) Nukleotidsequenzen mit im Wesentlichen vollständiger Länge oder Nukleotidsequenzen mit einer Länge von mehr als etwa 1000 Nukleotiden, die mit SEQ ID NO:1 oder 3, oder ein Fragment oder Derivat der Sequenzen, die in SEQ ID NOs:1, 3 offenbart sind, mit einer Länge von mehr als etwa 1000 Nukleotiden, darunter nicht der Bereich, der für die AP2-Domäne kodiert (AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2), wie oben definiert, unter Bedingungen moderater oder hoher Stringenz hybridisieren, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Hybridisierungen unter Verwendung von Gel-Blots (Southern-Hybridisierungen) bei etwa 25°C und 0,2×SSC, 0,1% SDS oder 65°C 5×SSC, respektive, gefolgt von Waschbedingungen bei 0,2×SSC, 0,1% SDS bei 25°C.

Unter Bedingungen moderater Stringenz hybridisiert die BNM3-cDNA vollständiger Länge nur mit Fragmenten des AtBBM (siehe 9B), AtBBM ist daher ein BNM3-Gen. Die Sequenzanalysen des genomischen Klons des AtBBM positioniert das 5'-Ende des IRREGULAR XYLEM3 (IXR3)-Gen stromabwärts des erwarteten AtBBM kodierenden Bereichs (Position 7479, 9A). IXR3 wurde zuvor auf eine 150 kb-Region des Chromosoms 5 zwischen den Markern nga 106 (33,26 cM) und mi438 (33,34 cM) kartiert (Taylor et al., 1999). Die Daten weisen darauf hin, dass das Arabidopsis-Ortholog des Brassica napus-Gens durch ein einziges Gen kodiert wird, das auf Chromosom 5 kartiert ist. Eine Sequenz, die der AtBBM-Sequenz in hohem Maße ähnlich ist, TAMU BAC Klon: T10B6 (Zugriffsnummer AP002073; Nakamura, 18. Mai 2000) wurde ebenfalls auf Chromosom 5 kartiert.
"BNM3-Gen" umfasst ferner DNA-Moleküle, die mindestens 27 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6 oder mindestens 22 aufeinanderfolgende Nukleotide innerhalb des regulatorischen Bereichs der Nukleotide 1–1619 der SEQ ID NO:5 oder Nukleotide 1–2025 der SEQ ID NO:6 umfassen. Ein Fragment des BNM3, wie in der vorliegenden Anmeldung definiert, kann als Sonde für die Identifizierung von Nukleotiden benutzt werden, die mit den BNM3 regulatorischen oder kodierenden Bereichen innerhalb eines Organismus verwandt sind, oder als Primer für die Amplifikation dieser Nukleotidsequenzen. Moleküle werden ebenfalls als BNM3-Gene angesehen, wenn sie mindestens 27 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen und vorzugsweise mehr als etwa 30 bis etwa 35 Nukleotide der Sequenz der SEQ ID NOs:1, 3, 5 oder 6, die für ein Protein oder ein aktives Fragment davon kodieren, die wenn sie in einer Pflanzenzelle in ausreichender Menge vorliegen die Zelle embryogen machen, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle steigern oder die Zelle embryogen machen und die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle steigern. Ein BNM3-Gen umfasst vorzugsweise etwa 50 bis etwa 1981 Nukleotide der SEQ ID NOs:1 oder 3, von etwa 50 bis etwa 3538 Nukleotiden des kodierenden Bereichs (1620–4858) der SEQ ID NO:5 oder von etwa 50 bis etwa 3009 Nukleotiden des kodierenden Bereichs (2025–5035) der SEQ ID NO:6.
Die genomischen BNM3-Sequenzen, die von Brassica napus und Arabidopsis erhältlich sind, können dadurch gekennzeichnet werden, dass sie 8 Introns umfassen. Diese Introns werden bei den Nukleotiden 1846–2298, 2720–2952, 3036–3160, 3170–3314, 3403–3553, 3628–3797, 3849–3961 und 4039–4148, der SEQ ID NO: 5; und Nukleotiden 2249–2578, 2994–3220, 3304–3420, 3429–3521, 3611–3770, 3845–3969, 4020–4151 und 4229–4310 der SEQ ID NO:6 gefunden. Das Startkodon der SEQ ID NOs:5 und 6 liegt bei Nukleotiden 1620 und 2026, respektive, während die Stoppkodons bei den Positionen 4856 und 5035, respektive, gefunden werden.
Als "BNM3-regulatorischer Bereich" wird eine Sequenz von Oligonukleotiden bezeichnet, welche die Eigenschaft aufweist, die Expression zu regulieren (entweder positiv, beispielsweise als Enhancer oder Promotorbereich, oder negativ, beispielsweise als Silencerbereich), und in operativer Verknüpfung mit einem BNM3-Gen vorliegt. Typischerweise umfasst die BNM3-regulatorische Region die Nukleotide oberhalb der Startstelle des BNM3-Gens, Sequenzen innerhalb weiterer Bereiche des Gens können jedoch ebenfalls regulatorische Eigenschaften aufweisen und werden als eine BNM3-regulatorische Region angesehen, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Sequenzen innerhalb der Introns. Ein Beispiel für eine BNM3-regulatorische Region, das jedoch nicht als beschränkend erachtet werden sollte, umfasst:

– eine mit einem BNM3-Gen operativ verknüpfte Sequenz, die eine regulatorische Funktion aufweist, beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, eine regulatorische Region stromaufwärts der Startstelle des BNM3-Gens oder innerhalb eines Introns oder ein Fragment, Derivat, oder Mutationen davon;
– Nukleotide von etwa 1 bis etwa 1619 der SEQ ID NO:5 oder ein Fragment oder Derivat davon;
– Nukleotide von etwa 1 bis etwa 2025 der SEQ ID NO:6 oder ein Fragment oder Derivat davon;
– eine Nukleotidsequenz, die mit einer Nukleotidsequenz von etwa 1000 bis etwa 1619 der SEQ ID NO:5 oder von etwa 1500 bis etwa 2025 der SEQ ID NO:6 oder einem Fragment oder Derivat davon unter Bedingungen hoher Stringenz assoziiert, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Hybridisierung an Gel-Blots bei etwa 65°C in 5×SSC, gefolgt von Waschbedingungen bei 0,1×SSC, 65°C;
– eine Nukleotidsequenz, die mit einer Nukleotidsequenz von etwa 1 bis etwa 1000 der SEQ ID NO:5 oder von etwa 1 bis etwa 1500 der SEQ ID NO:6 oder einem Fragment oder Derivat davon unter Bedingungen moderater oder hoher Stringenz assoziiert, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Hybridisierung an Gel-Blots bei etwa 25°C in 0,2×SSC, 0,1% SDS oder 65°C in 5×SSC, respektive, gefolgt von Waschbedingungen bei 0,1×SSC bei 65°C; oder
– eine Nukleotidsequenz, die mindestens 70% Ähnlichkeit mit der Nukleotidsequenz von etwa 1000 bis etwa 1619 der SEQ ID NO:5 oder von etwa 1500 bis etwa 2025 der SEQ ID NO:6 oder einem Fragment davon von mindestens 22 Nukledotiden aufweist, wie mittels Oligonukleotidanlagerung bestimmt (beispielsweise, aber nicht beschränkt auf BLAST- oder FAST-Recherchen, unter Verwendung der Standardparameter; siehe oben).

Als "BNM3-Protein" wird ein Protein oder ein biologisch aktives Fragment davon bezeichnet, das eine Pflanzenzelle em bryogen macht, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht oder die Pflanzenzelle embroygen macht, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht und durch ein BNM3-Gen, wie oben definiert, kodiert wird. Ein BNM3-Protein umfasst vorzugsweise von etwa 30 bis etwa 579 Aminosäuren der Sequenz, die in SEQ ID NO:2 offenbart wird, von etwa 30 bis etwa 579 Aminosäuren der Sequenz, die in SEQ ID NO:4 offenbart wird oder von etwa 30 bis etwa 581 Aminosäuren der Sequenz, die in SEQ ID NO:7 offenbart wird. BNM3-Protein kann jedoch auch als ein Protein definiert werden, das eine Homologie von mindestens 70% entweder mit SEQ ID NO:2, 4 oder 7 aufweist, darunter nicht die AP2-Repeat1-Linker-AP2-Repeat2-Region (Aminosäuren 208–378 der SEQ ID NOs:2 und 3, Aminosäuren 205–375 der SEQ ID NO:7).
Die Recherche nach Sequenzen in Datenbanken hat gezeigt, dass die BNM3-Translationsprodukte zwei Kopien einer AP2-Domäne enthalten (3, siehe ebenfalls SEQ ID NO:2 für BNM3A, SEQ ID NO:4 für BNM3B, und SEQ ID NO:7 für AtBBM). Die AP2-Domäne wurde zunächst in APETALA2 identifiziert, einem Arabidopsis-Protein, das die Meristemidentität, Blütenorganspezifikation, Samenmantelentwicklung und homeotische Genexpression der Blüte reguliert (Jofuku et al., 1994), konnte jedoch nachfolgend bei einer großen Breite von Proteinen mit verschiedenen Funktionen identifiziert werden.
Die AP2-Domäne weist üblicherweise eine Länge zwischen 58 und 68 Aminosäuren auf und enthält einen konservierten Zentralbereich von 18 Aminosäuren, der durch die Eigenschaft gekennzeichnet ist, eine amphipatische α-Helix zu bilden, eine Struktur, von der angenommen wird, dass sie Protein-Protein-Interaktionen bewirkt. Die Fähigkeit einer Anzahl von Proteinen, die AP2-Domänen enthalten, DNA zu binden, verknüpft mit der Gegenwart eines möglichen nukleären Lokalisationssignals und saurer Bereiche, die als Transkriptionsaktivatoren wirken können, liegt die Schlussfolgerung nahe, dass diese Proteine als Transkriptionsfaktoren wirken.
Zwei phylogenetisch verschiedene Klassen von Proteinen mit AP2-Domänen wurden identifiziert; Proteine mit einer einzelnen AP2-Domäne (EREBP-ähnlich) und Proteine mit zwei AP2-Domänen (AP2-ähnlich; (Zhou, 1997)). Die Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Gene kodiert werden, stellen einzigartige Mitglieder der letzteren Proteinklasse dar.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung demgemäß ein isoliertes DNA-Molekül zur Verfügung, das eine Sequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das zwei AP2-Domänen enthält. Wenn das Protein in ausreichender Menge in einer Pflanzenzelle vorliegt, macht es die Pflanzenzelle embryogen, steigert die regenerative Kapazität der Zelle oder macht die Zelle sowohl embryogen und steigert die regenerative Kapazität der Zelle.
Analysen der BNM3-Expression während der von Mikrosporen abstammenden Embryoentwicklung, Samenentwicklung oder Nicht-Samengewebeentwicklung unter Verwendung von Northerns (6) wiesen darauf hin, dass BNM3-Gene vorzugsweise in embryogenen Mikrosporenkulturen, Embryonen, die aus Mikrosporen erhalten wurden, und Samen exprimiert werden. BNM3-Transkripte wurden in keinem der Nicht-Samengewebe nachgewiesen, die untersucht wurden.
BNM3 mRNA wurde in Mikrosporenkulturen nachgewiesen, die induziert wurden, um Embryogenese zu durchlaufen, sowie in den nachfolgenden globulären-, herzförmigen, Torpedo- und Cotyledonen-Phasen der aus Mikrosporen erhältlichen Embryonalentwicklung (z.B. 6A). RNA wurde ebenfalls innerhalb sich entwickelnder Samen, 14 Tage nach der Bestäubung (14 DAP) nachgewiesen, was der herzförmigen Phase der Embryonalentwick lung entspricht. BNM3-Expression steigt während der frühen (21 DAP) und mid-Cotyledonen (28 DAP) Phasen der Embryonalentwicklung und bleibt anschließend konstant (6B).
Die konstitutive Expression des BNM3 führt zur Bildung somatischer. Embryonen auf vegetativen Strukturen, wie Cotyledonen, Blattstiele, Blätter und dem Apikalmeristem des Triebs von Pflanzen (7). In diesen Experimenten wurde die BNM3-cDNA unter die Kontrolle von zwei getrennten konstitutiven Promotorkonstrukten gesetzt, einem modifizierten Sonnenblumen POLYUBIQUITIN-Promotorkonstrukt und einem doppeltverstärktem 35S-Promotorkonstrukt, das ein AMV-translationales Enhancerelement enthält, es sollte jedoch klar sein, dass irgendein geeigneter Promotor für diesen Zweck verwendet werden kann. Entsprechende BNM3-erzeugte ektopische Embryonen enthalten alle Organsysteme und Gewebeschichten, die bei der Entwicklung - zygotischer Embryonen gefunden werden, wobei diese Embryonen bipolar sind (7B), eine Achse aufweisen, einen Hypocotyl- und Radikulumbereich, Trieb- und Wurzelmeristeme und Cotyledonen. Jedes Organsystem enthält ferner die typische radiale Anordnung der drei spezialisierten Gewebeschichten (Epidermis, Basisparenchym und provaskuläres Gewebe), die bei zygotischen Embryonen gefunden werden. Fortgesetzte Expression des BNM3-Gens innerhalb des sich entwickelnden ektopischen Embryos führt zu einer Reiteration des Embryo-bildenden Prozesses mit dem Ergebnis, dass neue Embryonen kontinuierlich auf der Oberfläche der bestehenden Embryonen gebildet werden (7E).
Die konstitituve Expression des BNM3 führt zu der gesteigerten Fähigkeit einer Pflanze Triebe in vitro in Gegenwart von zugesetzten Wachstumsregulatoren zu regenerieren. Wurzelexplantate transgener Pflanzen, die BNM3 ektopisch exprimieren, zeigen mindestens eine fünffache Steigerung in der Wurzelregeneration in Gegenwart von Hormonen, wenn diese mit Wur zelexplantaten verglichen werden, die von Wildtyp-Pflanzen erhalten wurden (8A, B). Die Triebe entwickeln sich in den transgenen Explantaten oft schneller im Vergleich zum Wildtyp. Wildtyp-Blatt und Hypocotyl-Explantate reagieren ursprünglich durch die Erzeugung von Kallus an dem geschnittenen Ende des Blattstiels (8B), gefolgt von Kallusbildung entlang der Länge des Blattstiels. Im Gegensatz dazu erzeugen Explantate transgener Linien unmittelbar neue Triebe (8B) oder Wurzeln an der Schnittstelle des Blattstiels. Explantate, die ursprünglich Wurzeln ausgebildet haben, bilden schließlich auch Triebe.
Transgene Explantate, die BNM3 konstitutiv exprimieren, konnten auch in Abwesenheit von zugefügten Wachstumsregulatoren regeneriert werden. Wenn diese Explantate auf ein Medium gebracht wurden, das keine Wachstumsregulatoren aufweist, wurden Triebe entweder von der Schnittstelle der Blatt- und Hypocotyl-Explantate oder von den Knötchen-ähnlichen Strukturen der Wurzel-Explantate regeneriert (8C, D). In allen Fällen bildeten sich regenerierte Triebe, Wurzeln, Blüten und Samen. Im Gegensatz dazu erzeugen Wildtyp-Blatt- und Hypocotyl-Explantate, die auf Medium ohne Wachstumsregulatoren platziert werden, gelegentlich Kallus oder Wurzeln an der Schnittstelle des Blattstiels, es bilden sich jedoch keine Triebe aus diesen Strukturen (8C, D).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Expression des BNM3 dazu verwendet werden, die Entwicklungskaskade innerhalb transformierter Pflanzen oder Pflanzenzellen zu initiieren. Diese Kaskade kann das Ergebnis der stabilen Integration eines auf DNA-basierenden Vektors sein, der BNM3 innerhalb der Pflanzenzelle exprimiert, eine solche Kaskade kann jedoch auch das Ergebnis einer transienten Epxression des BNM3 sein und fordert nicht die stabile Integration des BNM3-basierten Vektors innerhalb der Pflanzenzelle. Diese transienten Ansätze können für die Induktion somatischer Embryogenese, von Gametophyten erhältlicher Embryogenese oder zur Steigerung der regenerativen Kapazität einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle nützlich sein.
Pflanzen, in denen das BNM3-Gen ektopisch exprimiert wird, weisen bevorzugte Eigenschaften auf, darunter:

– Bildung ungeschlechtlich erhaltener Embryonen;
– Gesteigerte regenerative Kapazität der Gewebeexplantate;
– die Fähigkeit der Gewebeexplantate in Abwesenheit von zugegebenen Wachstumsregulatoren zu regenerieren; und
– die Expression der Samenkomponenten in Nicht-Samenorganen, in denen BNM3 ektopisch exprimiert wird.

Pflanzen, die mindestens ein BNM3-Gen ektopisch exprimieren können ferner für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden, wobei Samen-spezifische regulatorische Elemente verwendet werden.
Für die nachfolgend beschriebenen Anwendungen des BNM3 ist es vorteilhaft, eine große Menge des BNM3-Transkriptes und/oder BNM3-Proteins zu erhalten, um Pflanzen zu erzeugen, in denen sich der Phänotyp stark durchsetzt. Dies kann erzielt werden, indem genetische Elemente verwendet werden, wie Introns, transkriptionale Enhancer oder translationale Enhancer, von denen man weiß, dass sie die Gen- oder Proteinexpressionsmengen steigern.
Die BNM3-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können für verschiedene Anwendungen genutzt werden, darunter, jedoch nicht beschränkt auf, die Kontrolle der embryonalen Entwicklung, die Kontrolle bei Regenerationsverfahren, die Verwendung von regulatorischen Sequenzen für die gezielte Genexpression, die Verwendung der BNM3-Sequenzen als selektierbaren Marker für transformierte Pflanzen oder für embryogene Zellen. Diese Anwendungen werden nachfolgend noch detaillierter offenbart.
Verwendung von BNM3-Sequenzen zur Kontrolle embryogener Prozesse
Wie hierin beschrieben, spielen BNM3-Gene eine wichtige Rolle bei der Initiation und Aufrechterhaltung der embryonalen Entwicklung. BNM3-Gene wurden in einem weiten Bereich von Mitgliedern des Königreiches der Pflanzen gefunden. Regulatorische Bereiche, die von diesen Genen erhalten wurden, können dazu verwendet werden, die Transkription des BNM3 oder eines Derivates oder Fragmentes davon oder von irgendeinem ausgewählten Gen nach im Stand der Technik bekannten Verfahren zu kontrollieren.
Die ektopische Expression eines BNM3-Gens reicht aus, die sich wiederholende Bildung von ungeschlechtlich erhaltenen Embryonen auf vegetativen Pflanzengeweben zu induzieren (siehe Beispiel 4). In Abhängigkeit des verwendeten Promotors kann die exktopische Überexpression des BNM3-Gens dazu verwendet werden, somatische oder gametophytische Embryonen zu erzeugen. Somatische oder gametophytische Embryonen können durch Expression des BNM3-Gens unter der Kontrolle eines konstitutiven regulatorischen Elementes erhalten werden, wie in Beispiel 5 gezeigt, oder können durch Expression eines BNM3-Gens unter der Kontrolle eines Gewebe-spezifischen oder entwicklungsbiologisch regulierten Elementes, induzierbarer Elemente, die entweder von Pflanzen- oder Nicht-Pflanzengenen oder durch transiente Expression erhalten werden. In dieser Hinsicht können ferner chemische Induktionssysteme (z.B. siehe Gatz und Lenk, 1998, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) oder transiente Expression unter Verwendung von Verfahren, die nicht in einer stabilen Integration des BNM3-Gens resultieren oder die unmittelbar das BNM3-Protein nutzen, z.B. Mikroprojektilbeschuss einer DNA oder eines Proteins, verwendet werden.
Temporäre und/oder räumliche Beschränkung der BNM3-Expression unter Verwendung induzierbarer Gewebe-spezifischer oder entwicklungsbiologisch regulierter Elemente wird bevorzugt, wenn eine sich wiederholende Embryogenese kein gewünschtes Merkmal ist. Die regulatorischen Elemente, die dazu verwendet werden, BNM3 auf eine bestimmte Entwicklungsphase oder einen Zelltyp zu beschränken, hängen von der gewünschten Anwendung ab. Regulatorische Elemente, die dazu verwendet werden können, BNM3 zur Erzeugung von Embryonen, die aus Mikrosporen abstammen, zu exprimieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf solche der Klasse I Hitzeschock-induzierbaren Gene mit geringem Molekulargewicht, GMHSP17.3B (Zarsky et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), oder Mikrosporen/Pollen-exprimierte Gene wie NTM19 (Custers et al., 1997, EP 790 311 , die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden), BCP1 (Xu et al., das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), LAT52'' (Twell et al., 1989, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), BNM1 (Treacy et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), und APG (Robers et al., 1993, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird).
Beispiele regulatorischer Elemente, die zur Expression des BNM3 für die Herstellung somatischer Embryonen verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf solche Gene, die durch Pflanzenwachstumsregulatoren aktiviert werden, die üblicherweise zur Induktion somatischer Embryogenese in Gewebekulturen verwendet werden. Bestimmte Beispiele, die jedoch nicht als beschränkend erachtet werden, umfassen die Cytokin-induzierbaren IB6- und CKI1-Gene (Brandstatter und Kieber, 1998, Kakimoto, 1996, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden) und das Auxin-induzierbare Element DR5 (Ulmasov et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird). Es sollte jedoch klar sein, dass andere regulatorische Elemente für die Expression des BNM3 in Pflanzen verwendet werden können.
Beispiele von Genen für regulatorische Elemente, welche für die Kontrolle der Expression des BNM3 zur Erzeugung adventiver Embryonie geeignet sind, umfassen ferner, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die aus dem Ovulum- und Embryoexprimierten SERK-Gen erhältlich sind (Schmidt et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), dem Ovulumexprimierten AGL11-Gen (Roundsley et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), die in Nucellusexprimierten NUC1-Gene (Doan et al., 1996; WO 98/08961, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) oder den von den inneren Integument-exprimierten Genen FBP7 (Argenent et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) und SC4 (US-Anmeldung 09/059,909, die am 13. April 1998 eingereicht wurde, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird).
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur effizienten Erzeugung von Embryonen, die von Mikrosporen abstammen, in Pflanzen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst:

i) die Transformation einer ausgewählten Pflanze, beispielsweise Brassica napus (unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Transformationsverfahren, beispielsweise DeBlock et al., 1989, Clough und Bent, 1998, Vergunst et al., 1998, Klein. et al, 1997, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden) mit einem Vektorkonstruktur oder isolierter DNA, bestehend aus einem BNM3-Gen unter Kontrolle eines geeigneten regulatorischen Elements, das konstitutiv, Gewebespezifisch, entwicklungsbiologisch reguliert oder induzierbar und gegebenenfalls einem Markergen zur Selektion auf Transformanden versehen sein kann;
ii) transformierte Pflanzen auswählt;
iii) Linien erzeugt, die das BNM3-Gen oder das BNM3-Protein ektopisch überexprieren;
iv) Mikrosporen und Pollen aus den transgenen Linien isoliert und Mikrosporen und Pollen in Kultur zieht, um Embryogenese zu induzieren.

Embryogenese kann unter Verwendung irgendeines Protokolls induziert werden, beispielsweise, was jedoch nicht als beschränkend. erachtet wird, können Mikrosporen und Pollen für etwa 4 Tage bei etwa 28°C bis etwa 35°C, vorzugsweise bei etwa 33°C in Kultur gezogen werden, wonach die embryogenen Zellen oder Embryonen auf etwa 25°C überführt werden.
Unter Verwendung des obigen Verfahrens weisen Brassica napus Kultivare, die BNM3 ektopisch überexprimieren eine Steigerung der embryogenen Zellen und Embryonen auf im Vergleich zu Mikrosporen oder Pollen, die von Wildtyp-Pflanzen erhalten wurden, welche BNM3 nicht ektopisch exprimieren.
Beispiele für regulatorische Elemente, die dazu verwendet werden können, BNM3 für die Erzeugung von Embryonen, die von Mikrosporen abstammen, zu exprimieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, solche der Klasse I Hitzeschockinduzierbaren Gene mit geringem Molekulargewicht GMHSP17.3B (Zarsky et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), oder Mikrosporen/Pollen-exprimierte Gene, wie NTM19 (Oldenhof et al., 1996, EP 790 311 , die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden), BCP1 (Xu et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), LAT52 (Twell et al., 1989, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), BNM1 (Treacy et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), und APG (Roberts et al., 1993, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird). Induzierbare regulatorische Elemente die ferner verwendet werden können, sind beispielsweise, aber nicht beschränkt auf den Tetracyclin-induzierbaren Promotor (Gatz 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), Steroidinduzierbaren Promotor (Aoyama und Chua 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) und Ethanol-induzierbaren Promotor (Slater et al., 1998, Caddick et al., 1998, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden).
In ähnlicher Art und Weise können Embryonen, die von Mikrosporen erhalten werden, ebenfalls in Pflanzen erzeugt werden, indem das BNM3-Protein in eine ausgewählte Pflanze eingeführt wird (z.B. mit biolistischen Verfahren, Klein et al., 1987) und Pflanzen ausgewählt werden, die eine verstärke Mikrosporen-Embryogenese aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die effiziente Erzeugung somatischer Embryonen in vitro. Das Verfahren umfasst Schritte, bei denen man:

i) eine Pflanze transformiert, beispielsweise Arabidopsis, unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Transformationsverfahren (beispielsweise, aber nicht beschränkt auf DeBlock et al., 1989, Clough and Bent, 1998, Vergunst et al., 1998, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden) oder eine Pflanzenzelle transient transformiert unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren (beispielsweise biolistische Verfahren, Klein et al., 1987) mit einem Vektorkonstrukt, das ein BNM3-Gen unter der Kontrolle eines geeigneten regulatorischen Elements enthält, das konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsbiologisch reguliert sein kann, und gegebenenfalls ein Markergen für die Selektion auf Transformanden aufweist,
ii) transformierte Pflanzen auswählt, und
iii) ausgewählte Explantate aus den ausgewählten transformierten Pflanzen in Kultur zieht, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Wurzeln, Blatt, Sämlinge in vitro, in einem Medium mit oder ohne geeignete Wachstumsregulatoren, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf 2,4-D (z.B. Mordhorst et al., 1998), um unmittelbare Embryogenese oder embryogenen Kallus zu erzeugen; und
iv) die Embryonen, nicht-embryogenen Kallus oder sowohl Embryonen als auch nicht-embryogenen Kallus auf geeignetes Medium überführt, um die Herstellung von-Embryonen, Pflänzchen oder sowohl von Embryonen oder Pflänzchen zu bewirken.

Wenn die Ergebnisse des obigen Verfahrens beispielsweise mit der Erzeugung somatischer Embryonen in vitro unter Verwendung einer Anzahl von Arabidopsis Ecotypen verglichen wird, kann festgestellt werden, dass gerichtete Embryogenese oder embryogener Kallus in höherer Frequenz aus den transgenen Linien initiiert wird, die BNM3 ektopisch überexprimieren als in den Wildtyp-Kontrollen.
Beispiele regulatorischer Elemente, die dazu verwendet werden können, BNM3 zur Erzeugung somatischer Embryonen zu exprimieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf solche Gene, die durch Pflanzenwachstumsregulatoren aktiviert werden, die üblicherweise zur Induktion somatischer Embryogenese in Gewebekultur verwendet werden. Bestimmte Beispiele, die jedoch nicht als beschränkend angesehen werden sollten, sind Cytokinin-induzierbare IB6- und CK11-Gene (Brandstatter und Kieber, 1998; Kakimoto, 1996, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden) und das Auxin-induzierbare Element, DR5 (Ulmasov et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird). Induzierbare regulatorische Elemente sind ferner nützlich, bei spielsweise, aber nicht beschränkt auf einen Tetracyclininduzierbaren Promotor (Gatz, 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), ein Steroid-induzierbarer Promotor (Aoyama und Chua, 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor (Slater et al., 1998, Caddick et al., 1998, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden).
Ektopische Initiation der Embryonalentwicklung ist einer der wesentlichen Schritte bei der Apomixis. Wie in Beispiel 4 gezeigt, reicht die ektopische Expression eines BNM3-Gens aus, um die Embryobildung in Gewebe zu induzieren, das anderenfalls Nicht-Embryo-bildendes Gewebe ist. Ein BNM3-Gen kann daher dazu verwendet werden, adventive Embryonie oder Parthenogenese einer reduzierten oder nicht-reduzierten Embryosackzelle durch Expression des Gens in sporophytischen oder gametophytischen Geweben des sich entwickelnden Ovulums zu initiieren.
Adventive Embryonie wird durch Expression des BNM3 in sporophytischen Ovlumgeweben, wie dem Nucellus, den inneren Integumente, oder anderen Geweben, die neben oder in Nähe zu dem sich entwickelnden Embryosack liegen, erreicht. Das Verfahren umfasst Schritte, bei denen man:

i) eine ausgewählte Pflanze mit einem Vektorkonstrukt, das aus einem BNM3-Gen unter der Kontrolle eines geeigneten regulatorischen Elements besteht, das konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsbiologisch reguliert sein kann, und gegebenenfalls einem Markergen zur Selektion auf Transformanten unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren transformiert (siehe obige Verfahren);
ii) transformierte Pflanzen auswählt;
iii) die transformierten Pflanzen emaskuliert;
iv) die transformierten Pflanzen mit Pollen bestäubt, die eine oder mehrere dominante, selektierbare Marker tragen, beispielsweise GUS oder Kanamycin-Resistenz; und
v) auf die Erzeugung klonaler Nachkommen hin untersucht.

Wenn die Ergebnisse des obigen Verfahrens mit der Bestäubung einer Wildtyp-Arabidopsis-Pflanze mit Pollen, die einen dominanten selektierbaren Marker tragen, verglichen werden, weisen alle F1-Embryonen, die aus dieser Kreuzung resultieren, den dominanten Marker auf, während die Embryonen, die aus Pflanzen abstammen, die das BNM3-Gen oder Protein ektopisch überexprimieren und über sexuelle Embryobildung klonal erhalten wurden, den dominant selektierbaren Marker nicht aufweisen.
Bestimmte Beispiele regulatorischer Elemente, die für die Kontrolle der Expression des BNM3 geeignet sind, um adventive Embryonie, Diplosporie oder haploide Parthenogenese der Komponenten eines Embryosacks zu erzeugen, umfassen das Ovulumexprimierte SERK-Gen (Schmidt et al., 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), das Meiose-exprimierte AtDMC1-Gen (Klimyuk und Jones, 1997; WO 98/28431, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden), das Ovulum-exprimierte AGL1-Gen (Roundsley et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), das Nucellus-exprimierte NUC1-Gen (Doan et al., 1996; WO 98/08961), das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) und die von den inneren Integumenten exprimierten Gene FBP7 (Angenent et al., 1995, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) und SC4 (US-Anmeldung 09/059,909, die am 13. April 1998 eingereicht wurde und hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Induzierbare Systeme können ferner verwendet werden, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, den Tetrazyklin-induzierbaren Promotor (Gatz 1997), Steroid induzierbaren Promotor (Aoyama und Chua 1997, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), Ethanol-induzierbaren Promotor (Slater et al., 1998, Caddick et al., 1998, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden). Parthenogenese der Zellen des Embryosacks bedarf eines regulatorischen Elements, das in einer oder mehreren Zellen des weiblichen Gametophyten oder dessen Vorläufers aktiv ist. Die Befruchtung der meiotisch abstammenden polaren Kerne ist bevorzugt, wenn die Entwicklung von Samen von der Gegenwart des Endosperms abhängt.
Verwendung der BNM3 Sequenzen zur Kontrolle des Regenerationsverfahrens
Pflanzen, die BNM3 Gene ektopisch überexprimieren, weisen eine gesteigerte regenerative Kapazität auf und die Fähigkeit, zu ganzen Pflanzen in Abwesenheit von zugegebenen Wachstumsfaktoren zu regenerieren (siehe Beispiel 5). BNM3 Genexpression kann daher dazu verwendet werden, die Regenerationskapazität von Pflanzengeweben in vivo oder in vitro zu verstärken oder zu induzieren. Die regulatorischen Elemente, die zur Expression des BNM3 verwendet werden, werden daher teilweise davon abhängen, ob das Zielgewebe für die Regeneration benutzt werden soll. Regeneration von Pflanzengeweben kann durch Expression eines BNM3 Gens unter der Kontrolle eines konstitutiven regulatorischen Elements erreicht werden, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf 35S oder durch Expression eines BNM3 Gens unter der Kontrolle eines fewebespezifischen oder entwicklungsbiologisch regulierten Elements, induzierbaren Elements, das entweder von Pflanzen oder nicht-Pflanzengenen abstammen kann (z. B. Gatz und Lenk, 1998, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird) oder durch transiente Expressionsverfahren, die nicht in einer stabilen Integration des BNM3 Gens resultieren oder die eine direkte Verwendung des BNM3 Proteins umfassen (z. B. der Mikroprojektilbeschuß mit DNA oder Protein). Chemische Induktionssysteme (siehe Gatz und Lenk, 1998) oder regulatorische Elemente von Genen, die auf Pflanzenwachstumsregulatoren reagieren, können für die Induktion der Regeneration verwendet werden, wie beispielsweise Cytokinin (Brandstatter und Kieber, 1998; Kakimoto, 1996) oder Auxin (Ulmasov et al., 1997) oder Gene, die an der Wundstelle eines Gewebeexplantats exprimiert werden (Xu et al., 1993) können verwendet werden.
Eine weitere Verwendung besteht in der Nutzung des BNM3 Gens als selektierbare Marker für die Wiedergewinnung transgener Pflanzen. Ein Beispiel für diese Anwendung, das nicht als in irgendeiner Form beschränkend erachtet werden sollte, sind Wurzeln eines Sämlings, beispielsweise des Arabidopsis Ecotyp C24 Sämlings, die mit einem einzigen Agrobacterium tumefaciens Stamm cokultiviert werden, der zwei binäre Konstrukte enthält (per Vergunst et al., 1998; mit Ausnahme aller Schritte, die in Abwesenheit der zugegebenen Wachstumsregulatoren durchgeführt werden):

– ein erster binärer Vektor trägt eine Reportergenfusion, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, 35S:GUS;
– ein zweiter binärer Vektor einhält ein BNM3 Gen unter der Kontrolle eines geeigneten regulatorischen Elements.

BNM3 Genexpression wird durch Integration der obigen Konstrukte in das Arabidopsis-Genom aktiviert und die transgenen Pflanzen werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit selektiert unter Bedingungen zu regenerieren, bei dem Wildtyp-Explantate nicht regeneriert werden können, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, die Abwesenheit von Wachstumsregulatoren. Bei vielen Ausführungsformen wird die T-DNA, die das BNM3 Gen trägt, und die T-DNA, die das ausgewählte Gen trägt, an nicht-verknüpfte Genorte integrieren. Die T-DNA, welche die BNM3 Sequenz enthält und der damit assoziierte Phänotyp mit gesteigerter regenerativer Kapazität, kann daher bei den Nachkommen der Pflanze durch einfache Segregation entfernt werden (Daley et al., 1998). Es wird dem Fachmann unmittelbar klar sein, daß andere Verfahren, wie transiente Expression genutzt werden können, welche nicht in einer stabilen Integration des BNM3 Gens resultieren oder das unmittelbar das BNM3 Protein verwenden.
Verwendung der BNM3 Sequenzen zur zielgerichteten Genexpression in dem Embryo
Da BNM3 Gene vorzugsweise in sich entwickelnden Embryonen exprimiert werden (siehe Beispiel 3), besteht eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung in der Verwendung der BNM3 regulatorischen Bereiche zur zielgerichteten Expression mindestens eines ausgewählten heterologen Gens in dem sich entwickelnden Embryo für einen beliebigen Zweck, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf die Änderung der Embryo- und Sameneigenschaften, wie Samenvitalität oder -größe, die Zusammensetzung der Bestandteile des Samens, Krankheitsresistenz oder Erzeugung von hochwertigen Produkten, wie Impfstoffen, Antikörpern, Biopharmazeutika oder anderen Spezialchemikalien.
Verwendung der BNM3 Expression als Marker für Embryogene Zellen
Wie in den Beispielen 3 und 4 gezeigt, wird die BNM3 Genexpression während der frühesten Phase der Pflanzenembryogenese beobachtet und reicht selbst aus, um die Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren, welche zur Embryoentwicklung führen. Die BNM3 Genexpression ist daher ein spezifischer Marker für den Übergang einer Pflanzenzelle in den embryogenen Weg.
Die BNM3 Expression wird mit Embryo-bildenden Zellteilungen in vitro und in vivo assoziiert und kann daher dazu verwendet werden, Kulturbedingungen zu definieren, welche die Embryo-bildende Kapazität eines Gewebes in vitro verändert. Zellen mit embryogener Kapazität oder Zellen, die eine beschränkte Anzahl von Embryo-bildenden Teilungen durchlaufen, sind in Abwesenheit von Strukturen, die Embryonen morphologisch ähneln, schwer zu identifizieren. Diese Zellen können jedoch auf der Grundlage ihrer BNM3 Expression identifiziert werden. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wurde ein Vektor, der den BNM3 regulatorischen Bereich an ein Reportergen fusioniert, enthält, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, GUS (Jefferson et al., 1987) Luciferase (Ow et al., 1987) oder GFP (Haselhoff und Amos, 1995) in eine ausgewählte Pflanze eingebracht. Homozygote transgene Linien, die große Mengen an Reportergenexpression im Embryo aufwiesen, wurden unter in vitro Bedingungen in Kultur gezogen. Embryogene Zellen, sowie Kulturbedingungen, welche die Bildung embryogener Zellen erleichtern oder verstärken wurden auf der Grundlage der Expression des Reportergens in den in Kultur gezogenen Geweben identifiziert.
Eine verwandte Anwendung besteht in der Nutzung des BNM3 Gens als Marker für apomiktische Arten zur Identifizierung individuellen Zellen, die in dem Verfahren zur Bildung ungeschlechtlich erhältlicher Embryonen sind. Bei dieser Anwendung werden Zellen, die eine autonome Embryoentwicklung verfolgen, mittels mRNA in situ Hybridisierung verwendet, wobei eine RNA Sonde benutzt wird, die von einer BNM3 Gensequenz abstammt, mittels Immunocytochemie unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen ein BNM3 Protein gerichtet ist, durch Transformation von Pflanzen mit einem DNA Konstrukt, das eine Genfusion zwischen den BNM3 regulatorischen Bereichen und einem Reportergen enthält oder durch ähnliche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Identifizierung der Signaltransduktionskomponenten
Signaltransduktionskomponenten, welche die BNM3 Genexpression aktivieren oder von dieser aktiviert werden, können durch Identifizierung von Proteinen und DNA Sequenzen, die mit einem BNM3 Gen und dem Proteinprodukt interagieren, identifiziert werden. Diese Sinaltransduktionskomponenten können unter Verwendung von Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, darunter beispielsweise, aber nicht beschränkt auf:

– Mutagenese zur Identifizierung von intro- und/oder extragenen Suppressoren oder Enhancern des BNM3 gain-of-function Phänotyps;
– Yeast one Hybrid Screens zur Isolierung von Proteinen, die an BNM3 regulatorische Bereiche binden, um die BNM3 Genexpression zu beeinflussen;
– genetische Selektion in Hefe, um Gene zu identifizieren, welche die unmittelbaren Ziele der BNM3 Bindung sind;
– DNA Arrays oder Proteomic zur Identifizierung von Genen, die in einer BNM3 Signaltransduktionskaskade aktiviert werden; und
– Yeast two Hybrid Screens zur Identifizierung von Proteinen, die mit BNM3 interagieren, um die Expression der stromabwärts liegenden Zielgene zu beeinflussen.

Verfahren zur Analyse der Signaltransduktionskomponenten und Signalkomponenten sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Meijer et al., 1998, Lipshutz et al., 1999, und Anderson und Anderson, 1998).
Pflanzen, welche das BNM3 Gen unter Kontrolle eines starken konstitutiven regulatorischen Elementes überexprimieren, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf den Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor, weisen starke ektopische Embryobildung, verstärkte Regeneration via Organogenese oder eine Kombination dieser Merkmale auf (Beispiele 4 und 5). Die Fähigkeit der ektopischen BNM3 Überexpression sowohl Embryobildung zu induzieren, als auch regenerative Verfahren zu steigern, kann dazu verwendet werden, Mutationen zu identifizieren, die in ihrer Embryobildung oder regenerativen Kapazität verändert sind. In der vorliegenden Anmeldung wurde ein Vektorkonstrukt bestehend aus dem kodierenden Bereich eines BNM3 Proteins unter Kontrolle eines regulatorischen Elements hergestellt, das ausreicht, um entweder ektopische Embryobildung oder den Phänotyp der verstärkten Regeneration auszubilden, und in ausgewählte Pflanzen eingeführt. Homozygote transgene Linien, die eine hohe Penetranz der ektopischen Embryobildung aufwiesen, einen gesteigerten GenerationsPhänotyp oder eine Kombination davon, wurden identifiziert. Diese Linien werden durch irgendein verfügbares und dem Fachmann bekanntes Verfahren mutagenisiert, darunter EMS Mutagenese, schnelle Neutronenmutagenese, Transposonmutagenese oder T-DNA Mutagenese. Mutagenisierte Pflanzen werden anschließend auf Veränderungen in der ektopischen Embryobildung oder des regenerativen Phänotyps hin untersucht. Diese Veränderungen umfassen beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf die Eliminierung oder Verstärkung der Fähigkeit ektopische, ungeschlechtliche Embryobildung oder die Regeneration in Abwesenheit zu gegebener Wachstumsregulatoren zu fördern.
Heterologe Proteinexpressionssysteme
Die genetische Kontrolle der Signaltransduktionswege, die zur Embryogenese und Organogenese in nicht-Samenorganen transgener Pflanzen führen, können durch die ektopische Expression eines BNM3 Gens aktiviert werden. Die Expression eines BNM3 Gens in Assoziation mit einem heterologen Promotor kann dazu verwendet werden, um veränderte Samenkomponenten zu erzeugen, darunter beispielsweise Proteine, Öle und andere Metabolite. Die Biotransformation gewünschter Organe kann ferner die Veränderung des nutritiven Werts beispielsweise von Blättern von Futterpflanzen verändern oder kann dazu verwendet werden alternative Verwendungen für Nutzpflanzen bereitzustellen. Die Verwendung von Promotoren, die durch die Signaltransduktionskaskade induziert werden, welche durch Expression des BNM3 initiiert werden, kann dazu verwendet werden, hochwertigere kombinante Proteine in anderen Organen als Samen zu exprimieren. Beispiel für einen solchen Promotor ist der Napin Promotor, der aus den 2S Samen Vorratsprotein Napin erhältlich ist. Die Erzeugung. von Proteinen ausgehend von einer BNM3 induzierten Kaskade kann in Organen erzielt werden, die eine größere Biomasse als Samen aufweisen. Diese Technologie kann daher dazu verwendet werden, Alternativen zu Pflanzen als Nutzpflanzen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß ein binäres System, in dem das BNM3 Protein unmittelbar oder indirekt an eine Embryonal exprimierte regulatorische Sequenz (Zielsequenz) bindet und die Transkription eines chimären Genkonstrukts in irgendeiner Pflanzenzelle, einem Gewebe oder einem Organ aktiviert. BNM3 kann daher dazu verwendet werden unmittelbar oder indirekt Transkription eines chimären Genkonstrukts zu aktivieren. Dieser Ansatz umfaßt, daß BNM3 entweder unmittelbar mit mindestens einer Zielsequenz eines Embryoexprimierten Gens interagiert oder indirekt durch Auslösung einer embryogenen Signalkaskade, welche einen Transkriptionsfaktor aktiviert, der wiederum mindestens eine Zielsequenz bindet und die Transkription aktiviert. Dieses binäre System kann für die Expression von Proteinen in somatischen Geweben mit den Eigenschaften einer Expression in Samen verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wurden transgene Pflanzen erzeugt, die das BNM3 Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven regulatorischen Elements, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf den 35S Promotor (35S:BNM3) enthalten, um eine BNM3 Aktivatorlinie zu erzeugen. Die BNM3 Expression kann in einer Vielzahl von Geweben der BNM3 Aktivatorlinie mittels RNA Gel Blot Analyse gezeigt werden. Stabile homozygote Akti vatorlinien mit hoher Menge an BNM3 Expression wurden identifiziert. Somatische Gewebe, welche BNM3 überexpremieren, können auf die Expression anderer Embryo-exprimierter Gene, wie Arabin (Guerche et al., 1990) Cruceferin (Pang et al., 1988) oder Oleosin oder für morphologische Eigenschaften, die üblicherweise Samen kennzeichnen, wie die Gegenwart von Lipid- oder Proteinkörpern, untersucht werden.
Transgene Pflanzen derselben Art, die für die oben beschriebene Erzeugung der BNM3 Aktivatorlinie verwendet wurden, wurden ebenfalls erzeugt, wobei diese einen in Embryonen exprimierten Promotor an ein ausgewähltes Gen enthalten, um eine Linie mit einem ausgewählten Gen zu erzeugen. Zur Vereinfachung der Beschreibung dieser Ausführungsform exprimiert das ausgewählte Gen ein Reportergen, wie beispielsweise GUS und Beispiele, die nicht als beschränkend erachtet werden sollten, solcher Linien umfassen, Brassica napus 2S Albumin-Samen Vorratsprotein-Gen, BngNAP1:GUS Fusion (Baszczynski et al., 1994) oder eine SERK:GUS Fusion (Schmidt et al., 1997; ein nicht-Samen exprimiertes Reporterkonstrukt, wie BNM1:GUS (Treacy et al., 1997) kann als Negativkontrolle verwendet werden). Das Ausmaß der Expression des ausgewählten Gens in den bestimmten Organen und Geweben dieser Linie für das ausgewählte Gen wird für jedes Konstrukt gezeigt. Stabile homozygote Linien mit hoher Expressionsmenge des ausgewählten Gens wurden erzeugt.
Transgene Linien, welche die BNM3 Aktivatorlinie und die Linie mit dem ausgewählten Gen enthalten, wurden gekreuzt und die Nachkommensamen wurden gesammelt. Die BNM3 Genexpression und in diesem Beispiel die GUS Aktivität, die Expression weiterer Embryo-exprimierter Gene, sowie die morphologischen Ei genschaften transformierter Gewebe wurden untersucht. Die BNM3 Expression in nicht-Samengeweben aktiviert typischerweise sowohl Embryoentwicklung als auch die Expression des ausgewählten Gens (d.h. GUS), jedoch kann eine Aktivierung der Expression des ausgewählten Gens in Abwesenheit morphologisch ausgebildeter Embryonen auch beobachtet werden. Die Expression des ausgewählten Gens in Abwesenheit eines morphologisch feststellbaren Embryos stellt einen ersten Hinweis auf die unmittelbare Interaktion des BNM3 mit der Zielsequenz dar.
Die direkte Interaktion des BNM3 mit einer Zielsequenz kann ferner dadurch gezeigt werden, daß transiente Expression des BNM3 in Pflanzenprotoplasten zusammen mit der transienten Koexpression eines Embryo-exprimierten Promotors, der an ein ausgewähltes Gen fusioniert wurde (d. h. ein Konstrukt mit einem ausgewählten Gen) gezeigt werden. Die 35S:BNM3 DNA und das ausgewählte Genkonstrukt werden in Protoplasten eingeführt, die aus nicht-Samenzellen gewonnen wurden, wie Blattmesophyllzellen, mittels Elektroporation. Die Expression des ausgewählten Gens wird nach mehreren Stunden untersucht, um die Aktivierung der Zielsequenz zu bestätigen. Unmittelbare Interaktion des BNM3 mit der Zielsequenz kann ferner dadurch gezeigt werden, daß man die Zielsequenz alleine als kompetitive DNA cotransformiert.
Um zu ermitteln, ob Gewebe verschiedener Pflanzenarten durch BNM3, 35S:BNM3 DNA und ein Reportergen (beispielsweise, aber nicht beschränkt auf GUS) transaktiviert werden, kann das Konstrukt. mittels Mikroprojektilbeschuß in somatische Gewebe einer Pflanze eingeführt werden. Sofern BNM3 unmittelbar mit einer Zielsequenz interagiert, sollte die Expression des Re portergens mit der transienten Expression des BNM3 in allen Arten und Geweben übereinstimmen.
Einen unmittelbaren Beweis für eine BNM3-Zielsequenz Interaktion kann ferner durch Isolierung des in Bakterien, Insekten oder Hefen exprimierten BNM3 Proteins erhalten werden. BNM3 wird unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Expressionssystemen in Bakterien, Insekten oder Hefen exprimiert und bis zur Reinheit isoliert. Gelmobilitäts Shift Assays (Gustavson et al., 1991) werden durchgeführt unter Verwendung einer BNM3-Zielsequenz, beispielsweise einer Embryo-exprimierten Zielsequenz, um eine unmittelbare Bindung des BNM3 an die BNM3-Zielsequenz zu zeigen. Footprint Analysen können ferner durchgeführt werden, um die Region der BNM3 Bindung zu identifizieren. Fragmente der Zielsequenz, die BNM3 binden, können anschließend subkloniert werden und als Kompetitoren für die BNM3 Bindung in transienten Nachweisverfahren, wie oben beschrieben, benutzt werden.
Die nachfolgende Beschreibung stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar und erfolgt in Form eines Beispiels ohne Beschränkung auf eine Kombination der Merkmale, die für die Ausführung der Erfindung notwendig sind.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele erläutert. Es sollte jedoch klar sein, daß diese Beispiele nur erläuternden Charakter haben und nicht zur Beschränkung des Umfangs vorliegenden Erfindung in irgendeiner Art und Weise verwendet werden können.
Beispiele
Allgemeine Verfahren: Mikrosporenembryokultur
Brassica napus c.v. Topas wurde als Quelle für das Pflanzenmaterial der Mikrosporenembryokultur verwendet. Spenderpflanzen für die Mikrosporenkultur wurden in einem Wachstumskabinett bei 20°C/15°C (Tag/Nacht) mit einer Photoperiode von 16 Stunden (400 μE/m/s) die von VHO kalten weißfluoreszierenden Lampen erzeugt wurde (165W, Sylvania) mit Glühbirnen (40W, Duro-test).
Vier Wochen nach der Keimung der Pflanzen wurden diese in Wachstumskabinette unter denselben Lichtbedingungen überführt, die jedoch auf 10°C/5°C (Tag/Nacht) eingestellt wurden. Mikrosporen und Pollen wurden isoliert und wie in Keller et al. (1987) beschrieben in Kultur gezogen, wobei nach 21 Tagen in Zellkultur Embryonen der Cotyledonen Phase auf ein Reifungsmedium überführt wurden, das aus 1/2 × NLN Salzen, 1% Sukrose, 0,35 M Mannitol und 5 μM ABA bestand. Nicht-induzierte Kulturen (Mikrosporen und Pollen, welche die gametophytische Entwicklung fortsetzten) und durch Hitze gestreßte, nicht-embryogene Kulturen (zur Herstellung einer Subtraktionssonde), wurden aus demselben Ausgangsmaterial in Kultur gezogen, das für die Erzeugung embryogener Kulturen verwendet wurde. Nicht-induzierte Proben wurden durch Kultur von Mikrosporen und Pollen für vier Tage bei 25°C erhalten. Hitze-gestreßte, nicht-embryogene Proben wurden durch Kultur der Mikrosporen und Pollen für einen Tag bei 25°C, gefolgt von drei Tagen bei 32°C erhalten.
Proben von Mikrosporen und Pollen, die für weniger als 10 Tage in Kultur gezogen wurden, wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Ältere Proben, die globuläre, herzförmige, Torpedo und Cotyledonen Phasen der aus Mikrosporen erhaltenen Embryonen aufwiesen wurden durch Filtration unter Verwendung von Nylonnetzen verschiedener Porengröße gesammelt, wie in Ouellet et al. (1992), beschrieben. Alle anderen Pflanzengewebe wurden aus Material gesammelt, das im Gewächshaus gezogen wurde. Samenmaterial wurde durch Handbestäubung von Blüten am Tag der Anthese und durch Sammlung sich entwickelnder Samen an verschiedenen Tagen nach der Bestäubung (DAP) erhalten.
Nukleinsäureisolierung und Analyse
Gesamt RNA wurde entweder unter Verwendung eines Cäsiumchlorid/Guanidiniumisothiozyanatverfahrens (Ouellet, 1992) oder des TRIZOL Reagenzes (Gibco-BRL) isoliert. RNA Gel Blot Analysen wurden durch Auftrennung von 5 bis 20 μg Gesamt RNA pro Bahn auf 1,5% Agarosegelen, die 0,62 M Formaldehyd enthielten, im wesentlichen wie in Sambrook et al. (1989) durchgeführt, gefolgt von einem Kapillartransfer auf Hybond-N Nylonmembranen (Amersham). Poly(A)⁺RNA wurde aus der Gesamt RNA unter Verwendung von Oligo(dT)-Zellulose Chromatographie isoliert (Sambrook, 1989).
Genomische DNA wurde aus Blattgewebe nach dem in Fobert et al (1991) beschriebenen Verfahren isoliert und mit bestimmten Restriktionsenzymen unter Verwendung von Standardverfahren verdaut (Sambrook, 1989). Die DNA Gel Blot Analyse wurde mittels Elektrophorese von 10 μg DNA auf 0,8% Agarosegelen durchgeführt, gefolgt von einem Kapillartransfer auf Hybond-N Membranen.
Die 1,2 kb BNM3A cDNA Insertion wurde als Sonde für DNA und RNA Gel Blot Hybridisierungen verwendet. Die Hybridisierung an geblottete Gele wurde bei 65°C gemäß dem Hybond-N Protokoll ausgeführt. Die letzte Waschbedingungen waren 0,1 × SSC, 65°C.
Herstellung der Subtraktionssonde und cDNA Bibliothekscreening
Poly(A)mRNA wurde von späten einkernigen Mikrosporen und frühen zweikernigen Pollen isoliert, die für vier Tage bei 32°C in Zellkultur gezogen wurden, um Embryogenese zu induzieren (embryogene Probe) und wurde zur Synthese einer Erststrang cDNA verwendet (Riboclone cDNA kit; Promega). Die cDNA wurde anschließend mit einem fünffachen Überschuß (Gewicht) an poly(A)⁺RNA aus späten einkernigen Mikrosporen und frühen zweikernigen Pollen hybridisiert, die für einen Tag bei 25°C in Kultur gezogen wurden, gefolgt von drei Tagen bei 32°C, um Embryogenese zu inaktivieren (nicht-embryogene Probe; Pechan et al., 1991). Die Subtraktionshybridisierung wurde im wesentlichen wie im Sambrook et al. (1989) beschrieben ausgeführt. Die einzelsträngige cDNA, die durch Subtraktion gewonnen wurde, wurde mittels [α–³²P] dCTP unter Verwendung eines random Primer Kits (BRL) markiert und als Subtraktionssonde zum Screenen einer Lambda Phagen cDNA Bibliothek verwendet, welche aus derselben embryogenen Probe erstellt wurde, die oben beschrieben wurde (Boutilier, 1994). Dreifache Nylonfilter Abzüge (Hybond-N) von etwa 1,5 × 10⁵ Plaque-bildenden Einheiten der Bibliothek wurden unter Verwendung der Subtraktionssonde untersucht, wobei mittels eines random Primers der erste Strang der nicht-embryogenen Sonde markiert wurde und mittels eines random Primers eine Napinsamenvorratsprotein cDNA Probe markiert wurde (pN2; Crouch, 1983). Napin mRNA wurde überwiegend in der Bibliothek aus embryogenen Mikrosporen gefunden (Boutilier, 1994) und Plaques, die mit der Napinsonde hybridisierten, wurden daher von nachfolgenden Screeningschritten ausgeschlossen. Plaques, die mit der Subtraktionssonde aber nicht mit der nicht-embryogenen oder Napinsonde hybridisierten, wurden ausgewählt und zwei weiteren Durchläufen eines differenziellen Screeningverfahrens unterworfen, die beide die Subtraktions- und nicht-embryogenen cDNA Sonden verwendeten. DNA ausgewählter Lambda Klone wurde isoliert (Sambrook, 1989), teilweise mit Eco RI und XbaI verdaut und in pGEM-4Z (Promega) subkloniert.
Sieben cDNAs, die 6 einzigartige Gene umfassen, von denen eines eine trunkierte BNM3A cDNA umfaßt, wurden identifiziert. Zwei verschiedene BNM3 cDNA Klone vollständiger Länge (BNM3A und BNM3B) wurden anschließend durch Screening von ca. 2,5 × 10⁵ Plaque-bildenden Einheiten einer cDNA Bibliothek unter stringenten Bedingungen erhalten (UniZAPII, cDNA Synthesekit, Stratagene), die aus cDNA von 10 Tage alten globulären bis herzförmigen Embryonen erstellt wurde, die von Mikrosporen von B. napus c.v. Topas abstammen. Die BNM3 cDNA Insertionen wurden durch in vivo Excision in Bluescript SK(–)(Stratagene) gewonnen.
Isolierung der Brassica napus genomischen DNA Sequenzen
Das universelle Genom Walker Kit (Clonetech) wurde zur Isolierung genomischer DNA-Fragmente verwendet, die stromaufwärts des BNM3 ATG-Startkodons liegen. Vereinigte Proben aus nicht-klonierten Adaptor-ligierten genomischen DNA-Fragmenten von Brassica napus cv Topas wurden erzeugt und zur Isolierung von BNM3 genomischen Squenzen mittels nested PCR verwendet. Die primäre PCR nutzt den äußeren Adapter-Primer (AP1), der von dem Hersteller geliefert wird und einen BNM3-spezifischen Primer mit der Sequenz
Die nested PCR verwendete den nested-Adapter-Primer (AP2), der vom Hersteller bereitgestellt wurde, und einen BNM3-spezifischen Primer mit der Sequenz:
Die primäre PCR-Mischung wurde anschließend 1 : 50 verdünnt und als Matrize für die nested PCR verwendet. Sowohl die pri märe als auch die nested PCR wurde wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Die nested PCR-Produkte wurden in den pGEMT-Easy-Vektor (Promega) kloniert und sequenziert. Die PCR-Produkte, welche der 5'-nicht-translatierten genomischen Region sowohl von BNM3A und BNM3B cDNA entsprechen, wurden identifiziert.
Die genomische cDNA-Sequenz, die das BNM3A ATG-Translationsstart- und TAG-Translationsstoppkodon überspannt, wurde mittels PCR aus B. napus cv Topas genomischer DNA isoliert, wobei eine Pfu Polymerase (Stratagene) und nachfolgende Primerkombination verwendet wurden:
Die Primer wurden in Standard-PCR-Bedingungen eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden in den pGEMT-Easy-Vektor kloniert und sequenziert.
DNA-Gel-Blot-Analyse und Kartierung in Arabidpsis thaliana
500 ng Arabidopsis genomischer DNA (Ecotypen Columbia und Landsberg erecta) (Shure et al., 1983) wurde mit 20 verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, durch Elektrophorese auf einem 0,8 Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung von Standarsdverfahren auf Hybond N⁺ Nylon-Membranen (Amersham) geblottet. Die Blots wurden hybridisiert (1,5 M NaCl, 65°C) mit einer ³²P[dATP] Random-Primer markierten Sonde (Megaprime, Amersham), entsprechend entweder:

1) etwa den ersten 405 bp der BNM3A cDNA (SEQ ID NO:1), oder
2) etwa den letzten 1200 nt der BNM3A cDNA (SEQ ID NO:1) und anschließend unter Bedingungen geringer Stringenz (2×SSC, 0,1% SDS bei 65°C) oder bei moderater Stringenz (0,2×SSC, 0,1% SDS bei 25°C) gewaschen.

Ein Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) wurde zwischen den Ecotypen Columbia und Landsberg erecta unter Verwendung der Cfo I Restriktionsendonuklease identifiziert. Dieser RFLP wurde zur Kartierung der Position des BNM3-Homologs in dem Arabidopsis-Genom verwendet, wobei die rekombinanten, ingezogenen (RI) Linien Lister und Dean verwendet wurden (Lister and Dean, 1993). DNA aus 100 rekombinanten ingezogenen Linien wurde aus einer Kreuzung zwischen den Ecotypen Columbia und Landsberg erecta erhalten und mit Cfo I verdaut, auf Hybond N⁺ Nylon-Membranen überführt, mit der BNM3A cDNA hybridisiert (wie oben beschrieben) und unter Bedingungen geringer Stringenz gewaschen. Die resultierenden RFLP-Daten wurden an die RI-Datenbank des Nottingham Arabidopsis Stock Center zur Bestimmung des Ortes auf der Karte übermittelt (Lander et al., 1987). Die Ergebnisse werden in Beispiel 2-2, unten, diskutiert.
Isolierung der Arabidopsis thaliana genomischen DNA-Sequenzen
Drei genomische Äquivalente einer genomischen Lambda-Phagenbibliothek eines amplifizierten Arabidopsis Ecotyps C24 (Lambda-GEM11, Promega) wurden unter Verwendung einer trunkierten BNM3A cDNA-Probe gescreent (etwa die letzten 1200 nt der SEQ ID NO:1). Die Blots wurden mit ³²P-[dATP] Random-primer markierter Sonde (wie oben beschrieben) hybridisiert und anschließend unter Bedingungen geringer Stringenz gewaschen (2×SSC, 0,1% SDS bei 65°C). Sieben Lambda-Phagen wurden ursprünglich identifiziert. Drei Lambda-Phagenklone, die möglicherweise das vollständige Arabidospsis-Homolog des BNM3-Gens (SEQ ID NO:6) enthielten, wurden anschließend durch Hybridisierung unter Bedingungen geringer Stringenz mit einer Sonde identifiziert, die vom 5'-Ende der Brassica napus BNM3 cDNA abstammt (nt 1–405 der SEQ ID NO:1). Einzelne Klone, die etwa 0,8 kb überlappender Sequenz aufwiesen, wurden in jedem der drei Phagen identifiziert und in pBR322 subkloniert und sequenziert.
Plasmidherstellung für die Pflanzentransformation
Die Herstellung eines Plasmidvektors, der die BNM3 cDNA unter der Kontrolle eines POLYUBIQUITIN oder Blumenkohlmosaik-Virus 35S-Promotors enthält, werden nachfolgend beschrieben. Das Plasmid pRAP2TUBI enthält einen veränderten Helianthus annus POLYUBIQUITIN-Promotor (Binet et al., 1991) in dem Plasmid pRAP2T. Das Plasmid pRAP2T enthält das pUCAP Plasmid (van Engelen et al., 1995) und einen Nopalin-Synthase (nos) Terminator, der in die Sac I und Eco RI Restriktionsschnittstellen eingeführt wurde. Ein PCR-Fragment des POLYUBIQUITIN UbBI-Promotors, welches das 5'-Ende des Promotors bis zum 3'-Ende des ersten Exons umfasst, wurde aus dem Vektor unter Verwendung eines M13 Reversen Primers und des UBIQ-3'-Primers amplifiziert:
der Nco I und Bam HI Restriktionsschnittstellen enthält. Das POLYUBIQUITIN-Promotorfragment wurde mit Pst I und Bam HI verdaut, über ein Gel gereinigt und in die Pst I und Bam HI Stellen des pRAP2T ligiert, wodurch der Vektor pRAP2TUBIHa erzeugt wurde. Die BNM3B cDNA vollständiger Länge wurde mit Eco RI und Xho I Restriktionsenzymen verdaut, die Enden wurden mit Klenow-Enzym geglättet, das Fragment wurde über ein Gel gereinigt und in die Sma I Schnittstelle des pRAP2TUBI ligiert, wodurch das Plasmid pKBIS erhalten wurde. Ein Asc I/Pac I DNA-Restriktionsfragment, das in veränderten POLYUBIQUITIN-Promotor, die BNM3B cDNA und den nos-Terminator enthielt, wurde über ein Gel gereinigt und in die Asc I/Pac I Stelle des binären Vektor pBINPLUS (van Engelen et al., 1995) ligiert, wodurch das Plasmid pKBBINIS erzeugt wurde.
Die Herstellung eines BNM3A cDNA enthaltenden Vektors unter der Kontrolle eines doppeltverstärkten 35S-Promotors und AMV-translationalen Enhancers wurde wie folgt ausgeführt. Das Hind III/Xba I DNA-Restriktionsfragment, das den doppelten 35S-Promotor und den AMV-Translationsenhancer des Plasmids pBI525 (Datla, et al., 1993) enthielt, wurde in den Hind III/Xba I verdauten pRAP2T ligiert, wodurch das Plasmid pRAP2T35S erzeugt wurde. Eine Nco I Schnittstelle wurde in den BNM3A cDNA-Klon mittels zielgerichtete Mutagenese eingeführt. Die Sequenz des BNM3ANCOI-Primers, der für die Mutagenese verwendet wurde, ist:
Ein zweiter Primer, BNM3AHINDIII:
wurde zusammen mit dem BNM3ANCOI-Primer für die Amplifikation eines 305 bp Fragmentes der BNM3A cDNA verwendet. Dies PCR-Fragment wurde mittels Nco I und Hind III verdaut und in Nco I/Kpn I verdauten pRAP2T35S ligiert und ein Hind III/Kpn I Fragment, das den Bereich der BNM3A cDNA stromabwärts der Hind III Stelle enthielt, erzeugte den Vektor p35S:BNM3. P35S:BNM3 wurde mit den Restriktionsenzymen Asc I und Pac I verdaut und das Fragment, das den doppelten 35S-Promotor, den AMV-translationalen Enhancer und die BNM3A cDNA und den nos-Terminator enthielt, wurde über ein Gel gereinigt und in den mit Asc I/Pac I verdauten binären Vektor pBINPLUS ligiert, wodurch das Plasmid p35S:BNM3BIN erzeugt wurde.
Sowohl die Plasmide pKBBINIS und p35S:BNM3BIN wurden in den Agrobacterium tumefaciens C58C1 Stamm überführt, der ein ent waffnetes Ti-Plasmid pMP90 trägt, und für die Transformationsversuche verwendet.
Pflanzentransformation
Arabidopsis thaliana Ecotyp C24 wurde als Empfänger für die Transformationsversuche verwendet. Die Pflanzen wurden entweder unter Verwendung des Blüten-Dip-Verfahrens, das von Clough and Bent, (1998) entwickelt worden war, oder mittels des Wurzeltransformationsverfahrens transformiert, das in Vergunst et al. (1998) beschrieben wird.
Transgene Pflanzen von Brassica napus c.v. "Topas" wurden mittels Agrobacterium tumefaciens-vermittelter Transformation von Mikrosporen abstammender Embryonen erzeugt. Embryonen, die von Mikrosporen abstammen, wurden für 5 Wochen bei einer Dichte von etwa 1000 Embryonen pro ml in Kultur gezogen. Übernachtkulturen von Agrobacterium wurden in B5-Medium, das 9% Sucrose enthielt, 100fach verdünnt. Die Embryonen wurden mit den verdünnten Bakterien für 48 Stunden bei 24°C in der Dunkelheit bei leichtem Schütteln co-kultiviert. Die Embryonen wurden anschließend auf NLN13-Medium für mindestens zwei Wochen in der Dunkelheit bei 25°C überführt, das mit 350 mg/L Cefotaxim und 200 mg/L Vancomycin supplementiert wurde.
Die Embryonen keimten bei schwachem Licht 25°C für etwa zwei Wochen auf festem B5-Medium, was mit 2% Sucrose, Cefotaxim (200 mg/L) und Vancomycin (100 mg/L) supplementiert wurde. Gut entwickeltes Hypocotyl aus gekeimten Embryonen wurde isoliert und. auf frisches Keimungsmedium überführt, das mit 100 mg/L Kanamycin supplementiert wurde. Nach zwei Wochen auf diesem Medium wurden Explantate in einem ähnlichen Medium subkultiviert, das mit Kanamycin supplementiert wurde (25 mg/L). Grüne, möglicherweise transgene, sekundäre Embryonen wurden nach einem Monat Selektion sichtbar.
Mikroskopische Untersuchungen
Alles Pflanzenmaterial wurde über Nacht bei 4°C in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 fixiert, der 4% Paraformaldehyd enthielt. Die Proben wurden in 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen und anschließend in gereinigtem Ethanol-Reihen bis 100% Ethanol dehydriert. Die Proben für die Rasterelektronenmikroskopie wurden bei einem kritischen Punkt in flüssigem CO₂ getrocknet (Balzers CDP020) und auf SEM-Stümpfe unter Verwendung von leitendem Kohlenstoffkleber angebracht. Die Proben wurden mit 30 nm Palladium/Gold beschichtet, wobei ein Polaron E5100 Sprühbeschichter verwendet wurde. Die Proben mit einem JEOL JSM 5200 Rasterelektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 15 kV beobachtet. Digitale Bilder wurden unter Verwendung eines Orion Framegrabbers erzeugt. Die Proben für die Lichtmikroskopie wurden in Technovit 7100 (Kulzer) eingetaucht. Abschnitte wurden für 10 Sekunden in 1% Toluidinblau in 1% Natriumtetraborat gefärbt, mit Wasser gewaschen und in Euparal angebracht. Digitale Bilder wurden unter Verwendung einer Sony 3 CCD Kamera aufgenommen.
Regenerationsexperimente
Wildtyp- und transgene Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert, auf ½ MS Medium, das 20% Sucrose (1/2 MS-20) enthielt, ausplattiert und bei 21°C gezogen, wobei die Platten in einem 60° Winkel geneigt wurden. Acht Wildtyp-Sämlinge und 8 Sämlinge von jeweils 7 unabhängigen transgenen Linien wurden 10 Tage nach Keimung geerntet und in Wurzel, Hypocotyl und Blattbestandteile aufgeteilt. Dies Material wurde anschließend in zwei Teile aufgeteilt. Die Hälfte der Explantate wurde auf B5-Medium, das 20% Glucose enthielt (B5-20), kontinuierlich in Kultur gezogen. Die Explantate wurden auf frisches B5-20 Medium alle zwei Wochen überführt. Die verbleibenden Explantate wurden auf B5-20 Medium in Kultur gezogen, das Pflanzenwachstumsregulatoren enthielt, um die Triebbildung zu induzieren (Vergunst et al., 1998). Diese Explantate wurden zunächst für zwei Tage auf Kallus-induzierende Medien gesetzt (CIM; hohes Verhältnis Auxin zu Cytokinin) und anschließend für den Rest der Kulturphase auf Wurzelinduzierendes Medium transferiert (SIM; hohes Verhältnis Cytokinin zu Auxin). Die Explantate wurden auf frisches SIM-Medium für zwei Wochen überführt.
Beispiel 1: Isolierung und Kennzeichnung des BNM3-Gens von Brassica napus
Ein Subtraktionsscreeningansatz wurde verwendet, um Gene zu isolieren, die vorzugsweise während der Induktion der Brassica napus c.v. Topas Mikrosporenembryogenese induziert werden (1). Zwei Arten von Mikrosporen-Kulturen wurden für die Herstellung einer Subtraktionssonde verwendet: embryogene und nicht-embryogene. Die embryogenen Kulturen wurden erhalten, indem späte einkernige Mikrosporen und frühe zweikernige Pollen einer Hitzestressbehandlung für 4 Tage bei 32°C unterworfen wurden. Die nicht-embryogenen Proben wurden erhalten, indem dieselbe Ausgangspopulation später einkerniger Mikrosporen und früher zweikerniger Pollen für einen Tag bei 25°C, gefolgt von 3 Tagen bei 32°C in Kultur gezogen wurden (Pechan et al., 1991). Poly(A) mRNA wurde aus den embryogenen Proben isoliert und zur Synthese einer Erststrang-cDNA verwendet. Die cDNA wurde anschließend mit einem Überschuss an poly(A)⁺ RNA hybridisiert, die von nicht-embryogenen Mikrosporen/Pollenproben isoliert wurde. Die nicht-hybridisierende, einzelsträngige cDNA, die Sequenzen, welche in der embryogenen Probe vorliegen, aber nicht oder nur in geringerer Menge in der nicht-embryogenen Probe, in angereicherter Menge enthält, wurden wiedergewonnen, radioaktiv markiert und als Substraktionssonde für das Screening einer cDNA-Bibliothrk verwendet, die wie oben beschrieben von der embryogenen Probe erhalten wurde. Plaques, die mit der Subtraktionssonde hybridisieren, aber nicht mit einer Sonde, die von der nicht-embryogenen Probe erhalten wurde, wurden ausgewählt und zwei weiteren Runden eines differentiellen Screeningsverfahrens unterworfen. Sieben unabhängige cDNA-Klone, die sechs einzigartige DNA-Sequenzen umfassen, wurden identifiziert und es wurde festgestellt, dass diese in embryogenen und nicht-embryogenen Proben differentiell exprimiert werden. Einer dieser sieben Klone, 42A1, später als BNM3A bezeichnet (steht für Brassica napus Mikrosporen Embryo) wurde weiter analysiert.
Beispiel 2-1: Die BNM3-Gene kodieren für neue Mitglieder einer AP2-Domäne enthaltenden Klasse von Transkriptionsaktivatoren
Ein einzelner BNM3 cDNA-Klon, BNM3A, wurde nach dem Screening einer embryogenen Mikrosporen-cDNA-Bibliothek mit einer Subtraktionsprobe, die für Gene, die in embryogenen Mikrosporen und Pollen exprimiert werden angereichert war, isoliert. Die Diskrepanz zwischen der Größe des cDNA-Klons (1,2 kb) und der Größe des mittels RNA-Gel-Blots detektierten Transkripts (2,2 kb) weist darauf hin, dass der Klon keine cDNA vollständiger Länge repräsentiert. Zwei längere cDNA-Klone, die die cDNA des ursprünglichen Klons in vollständiger Länge enthalten, BNM3A (SEQ ID NO:1), und ein neuer Klon, BNM3B (SEQ ID 0:3), wurden aus einer cDNA-Bibliothek eines 10 Tage alten Brassica napus Mikrosporen-Embryos isoliert. Die Gegenüberstellung der DNA-Sequenzen dieser Klone wird in 2 gezeigt. Die zwei BNM3 cDNA-Klone sind 2011 und 1992 nt lang und auf Nukleotidebene 97% ähnlich, wobei sie sich nur geringfügig in der Länge und Sequenz der 5' und 3' nicht-translatierten Bereiche unterscheiden. Beide cDNA-Klone kodieren für ein voraussichtlich 579 Aminosäuren langes Polypeptid (vorhergesagtes Molekulargewicht 63,9 kDa, pI von 5,7), das auf Aminosäureebene etwa 97% Ähnlichkeit aufweist (3).
Die genomische Komplexität der BNM3-Gene wurde durch Hybridisierung der BNM3 cDNA an Gel-Blots, die Brassica napus genomische DNA enthielten, bestimmt (4). Die BNM3 cDNAs hybridisierten mit zwei DNA-Fragmenten unter Bedingungen hoher Stringenz. Die zwei hybridisierenden Fragmente stellen zwei BNM3-Gene dar, BNM3A und BNM3B. B. napus ist eine amphidiploide Art, die durch die Hybridisierung der diploiden B. rapa und B. oleracea Genome erhalten wurde, und die beiden BNM3-Sequenzen stammen daher wahrscheinlich von einem einzigen Genort von jedem der parentalen diploiden Vorgänger.
Die Recherche mit der Sequenz in Datenbanken konnte zeigen, dass die BNM3-Translationsprodukte zwei Kopien einer AP2-Domäne enthalten (3). Die AP2-Domäne wurde zuerst in APETALA2 (AP2) identifiziert, einem Arabidopsis-Protein, das Meristemidentität, Blütenorganspezifizierung, Samenmantelentwicklung und homeotische Genexpression der Blüte reguliert (Jofuku et al., 1994; WO 98/07842), und dass bei einer Vielzahl von Proteinen mit verschiedenen Funktionen identifiziert wurde. Diese Funktionen reichen von der Aktivierung von Genen, die mit Stress zusammenhängen (Zhou, 1997; Stockfinger, 1997) Ethylenreaktion (Ohme-Takagi, 1995), der Regulierung der Blatt-, Blüten- und Ovulumentwicklung (Moose, 1996; Jofuku, 1994; Elliot, 1996; Klucher, 1996). Die AP2-Domäne stellt ein repetitives Motiv mit einer Länge von 56–68 Aminosäuren dar, das mindestens zwei konservierte Bereiche enthält: ein hochbasisches YRG-Element, das ein konserviertes YRG-Aminosäuremotiv enthält, und das RAYD-Element. Das RAYD-Element weist einen konservierten zentralen Bereich von 18 Aminosäuren auf, von dem angenommen wird, dass er eine amphipathische α-Helix ausbildet, eine Struktur, von der angenommen wird, dass sie Protein-Protein-Interaktionen bewirkt. Die Fähigkeit einer Anzahl von Proteinen, die AP2-Domänen enthalten, DNA zu binden, verknüpft mit der Gegenwart eines möglichen nukleären Lokalisationssignals und saurer Bereiche, die als transkriptionale Aktivatoren wirken können, weisen darauf hin, dass diese Proteine als Transkriptionsfaktoren wirken.
Zwei phylogenetisch getrennte Klassen von Proteinen mit AP2-Domänen, bestehend entweder aus einer AP2-Domäne (EREBP-ähnlich) oder zwei AP2-Domänen, die mit einem Linkerbereich verknüpft sind (AP2-ähnlich), wurden identifiziert (Zhou, 1997) BNM3 gehört zu der letzteren Klasse. Die Recherche in Datenbanken mit dem Bereich, der den zwei AP2-Domänen und dem Linkerbereich des BNM3 entspricht, konnte zeigen, dass BNM3 dem Arabidopsis AINTEGUMENTA (ANT; Elliot, 1996; Klucher, 1996) und dem Zea mays ZMMHCF1 AP2-Domänen enthaltenden Protein (ZM; Daniell, 1996) am ähnlichsten ist. 5 zeigt eine Anlagerung der beiden AP2-Domänen des BNM3 mit solchen anderer Proteine, die zwei AP2-Domänen enthalten. BNM3 teilt 85% Aminosäuresequenzähnlichkeit mit ANT und 88% mit ZMMHCF1 in diesem Bereich, jedoch nur 66% Aminosäureähnlichkeit mit AP2 und GLOSSY15 in diesem Bereich. Eine 10 Aminosäureinsertion in der ersten AP2-Domäne der BNM3-Proteine unterscheidet diese drei Proteine ferner von anderen Proteinen mit AP2-Domäne (Elliot, 1996). Die BNM3, AINTEGUMENTA- und ZMMHCF1-Proteine teilen ferner ein kleines hydrophobes Aminosäuremotiv, LG/SFSLS, in ihrem aminoterminalen Bereich, weisen jedoch sonst keine wesentliche Ähnlichkeit in ihrer DNA oder Aminosäuresequenz außerhalb der AP2-Domänen und Linker auf. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die BNM3-Sequenzen einzigartige Mitglieder der Proteinfamilie mit AP2-Domänen kodieren.
Eine paarweise Anlagerung der BNM3B cDNA und Aminosäuresequenzen mit ANT- oder ZMMHCF-1-Sequenzen zeigt, dass die BNM3B-Nukleotidsequenz:

– zu 65% identisch mit der ANT cDNA ist (über die 1905 Nukleotide des ANT) und zu 50% identisch mit ZMMHCF1 cDNA ist (über die 1773 Nukleotidsequenz des ZM); und für die BNM3B-Aminosäuresequenz:
– das BNM3B-Protein ist zu 41% identisch mit dem ANT-Protein (über die 555 Aminosäuresequenzen des ANT) und zu 46% identisch mit dem ZMMHCF1-Protein (über die 485 Aminosäuresequenz des ZM).

Beispiel 2-2: Die Brassica napus BNM3-Gene entsprechen einem einzigen Arabidopsis thaliana-Ortholog
DNA-Gel-Blot-Analysen genomischer DNA von Arabidopsis hybridisierte zu einer Anzahl von Brassica napus BNM3A cDNA (SEQ ID NO:1) Sonden unter Bedingungen geringer und mittlerer Stringenz, was auf die Gegenwart eines einzigen Homologs des Brassica napus BNM3-Gens in dem Arabidopsis-Genom hindeutet. Ein RFLP wurde ferner zwischen den Ecotypen Columbia und Landsberg erecta unter Verwendung der Cfo I-Restriktionsendonuklease identifiziert. Dieses RFLP wurde zur Kartierung der Position des einzigen BNM3-Homologs auf dem Arabidopsis-Genom etwa bei 34 cM auf Chromosom 5 verwendet (Lister und Dean, 1993).
Screening von drei genomischen Äquivalenten einer Arabidopsis genomischen Bibliothek identifizierte drei Lambda-Klone, welche das Arabidopsis BNM3-Homolog möglicherweise vollständiger Länge enthielten (AtBBM). Die Sequenzanalyse der drei AtBBM-Klone zeigte, dass sie identisch sind (SEQ ID NO:6). Die 9A und B zeigen respektive das Restriktionsfragmentmuster der isolierten genomischen Klone von Arabidopsis und das Muster der Restriktionsrfragmente, die nach Hybridisierung der genomischen DNA von Arabidopsis mit der Brassica BNM3A cDNA- Probe erhalten wurden. Ein Vergleich der fünf Figuren zeigt, dass die genomischen AtBBM Arabidopsis-Klone und das mittels DNA-Gel-Blot-Analyse unter Verwendung einer heterologen Sonde identifizierte Homolog identisch sind. Die Squenzanalyse der AtBBM genomischen Klone positionierte das 5'-Ende des IRREGULAR XYLEM3 (IXR3) Gens stromabwärts der vorhergesagten AtBBM kodierenden Region (Position 7479, 9A). Es konnte zuvor gezeigt werden, dass IXR3 in einem 150 kb Bereich des Chromosoms 5 zwischen den Markern nga 106 (33,26 cM) und mi438 (33,34 cM); Taylor et al., 1999) vorliegt. Diese Daten zeigen, dass das Arabidopsis-Ortholog des Brassica BNM3-Gens durch ein einziges Gen kodiert wird, das auf Chromosom 5 liegt. Eine Sequenz, die sehr ähnlich zu AtBBM ist, TAMU BAC Klone: T10B6 (Zugriffsnummer AP002073; Nakamura, 18. Mai 2000) liegt ebenfalls auf Chromosom 5.
Ein Vergleich der Struktur des genomischen Brassica-Klons BNM3A (SEQ ID NO:5) und des genomischen Arabidopsis-Klons AtBBM (SEQ ID NO:6) zeigt, dass die vorhergesagten Intron/Exon-Grenzen zwischen den beiden Sequenzen hochkonserviert sind. Es wird davon ausgegangen, dass beide Sequenzen neun Exon- und 8 Intronsequenzen umfassen.
Ein Vergleich der DNA-Sequenz des AtBBM-Gens (SEQ ID NO:6) und der beiden Brassica cDNA-Sequenzen (SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3) zeigt, dass die drei Sequenzen zu 85% ähnlich über die gesamte abgeleitete Protein-kodierende Region und zu 95% ähnlich in der 546 nt Region sind, welche die zwei AP2 und die Linkerregio überspannt, die zwischen den beiden AP2-Domänen liegt. Die Nukleotidähnlichkeit zu anderen Genen, die für AP2-Domänen kodieren, wie ANT und zu der Sequenz auf dem Klon MOE17 auf Chromosom 3 (Zugriffsnummer AB025629) in dem Bereich, welcher die beiden AP2-Domänen und die Linker-Region, welche zwischen den beiden AP2-Domänen liegt, beträgt 67% und 78%, respektive. Weder ANT noch die Sequenz auf Chromosom 3 zeigt signifikante Ähnlichkeit auf DNA-Ebene zu AtBBM außerhalb der für die AP2-Domäne kodierenden Region.
Die Ähnlichkeit zwischen der abgeleiteten Aminosäuresequenz des AtBBM und der beiden Brassica cDNA-Sequenzen (SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3) beträgt etwa 80% über die gesamte Proteinkodierende Sequenz und etwa 99% in dem 182 Aminosäurebereich, der die beiden AP2-Domänen und die Linker-Region, die zwischen den beiden AP2-Domänen liegt, überspannt. Die Aminosäureähnlichkeit sowohl zu ANT als auch der AP2-Domänen-Sequenz, die auf Klon MOE17, Chromosom 3 liegt, in der Region der Aminosäuren, welche die beiden AP2-Domänen und die Linker-Region überspannt, die zwischen den beiden AP2-Domänen liegt, beträgt etwa 85%. Keine dieser beiden Proteinsequenzen zeigt signifikante Ähnlichkeiten zu AtBBM außerhalb des Bereichs der AP2-Domänen des Proteins.
Beispiel 3: Die BNM3-Gene werden vorzugsweise in sich entwickelnden Embryonen exprimiert
RNA-Gel-Blot-Analysen (6) wurden dazu verwendet, um das Muster der BNM3-Gen-Expression während der Entwicklung von Embryonen, die von Mikrosporen abstammen, während der Samenentwicklung, und in Nicht-Samengeweben bestimmt. Alle Analysen zeigten, dass die BNM3-Gene vorzugsweise in sich entwickelnden Embryonen exprimiert werden.
Die RNA-Gel-Blot-Analysen zeigten, das BNM3 mRNA Mikrosporenkulturen, die Embryogenese durchlaufen, sowie in den nachfolgenden globulären, herzförmigen, Torpedo- und Cotyledon-Phasen der Entwicklung von Embryonen, die von Mikrosporen abstammen, nachgewiesen werden konnte (6A). BNM3 mRNA wurde nicht in nicht-embryogenen Mikrosporenkulturen, in frisch isolierten Mikrosporenpollen oder in Mikrosporen und Pollen, die eine gametophytische Entwicklung in Zellkultur fortsetz ten, nachgewiesen (6A). RNA-Gel-Blot-Analysen sich entwickelnder Samen zeigte, dass die BNM3-Expression zum ersten Mal 14 Tage nach Bestäubung nachgewiesen wird (14 DAP), was der herzförmigen Phase der Embryonalentwicklung entspricht. Die BNM3-Expression steigt während der frühen (21 DAP) und mittleren Cotyledon-Phase (21 DAP) der Embryonalentwicklung an und bleibt anschließend konstant (6B). BNM3-Transkripte wurden in keinen der Nicht-Samengewebe gefunden, die untersucht wurden, was eine geringe Menge oder Abwesenheit der Transkripte in diesen Geweben anzeigt.
Beispiel 4: Expression von BNM3 in vegetativen Geweben verstärkt die Bildung ungeschlechtlicher Embryonen
Um die Funktion der Brassica napus BNM3-Proteine zu bestimmen, wurde die BNM3 cDNA unter die Kontrolle von zwei verschiedenen Promotorkonstrukten, einem veränderten Sonnenblumen POLYUBIQUITIN-Promotorkonstrukt, nachfolgend als UBI:BNM3 bezeichnet) und einem doppeltverstärkten 35S-Promotorkonstrukt, das ein AMV Translationsenhancer-Element enthält (nachfolgend als 35S:BNM3 bezeichnet), und in Arabidopsis eingeführt. Die Analyse des Phänotyps der transfomierten Pflanzen zeigte, dass ektopische Überexpression der BNM3 cDNA die Bildung somatischer Embryonen auf vegetativen Strukturen, wie Cotyledonen, dem Blattstiel, den Blättern und dem apikalen Meristem des Triebs verstärkt (7). Die Frequenz der transformierten Pflanzen, welche ektopische Embryonen produzieren, sowie die Penetranz des ektopischen Embryo-Phänotyps, war stärker wenn das BNM3-Gen unter der Kontrolle des stärkeren, doppeltverstärkten 35S-Promotor-AMV Translationsenhancers im Vergleich zu dem POLYUBIQUITIN-Promotors exprimiert wurde. Es wird daher offenbar eine hohe Grenzmenge an Proteinprodukt benötigt, um die Frequenz und Penetranz des ektopischen Embryo-Phänotyps zu steigern.
Von BNM3 abstammende ektopische Embryonen enthalten alle Organsysteme und Gewebeschichten, die in sich entwickelnden zygotischen Embryonen gefunden werden. Von BNM3 abstammende ektopische Embryonen sind bipolar (7D und E) und bestehen aus einer Achse, welche die Hypocotyl- und Radiculumbereiche, die Trieb- und Wurzelmeristeme und Cotyledonen umfasst (7E). Jedes Organsystem enthält ferner die typischen radialen Anordnungen der drei spezialisierten Gewebetypen (Epidermis, Basisparenchym und provaskuläres Gewebe), die in zygotischen Embryonen gefunden werden (7E). Die kontinuierliche Expression des BNM3-Gens innerhalb sich entwickelnder ektopischer Embryonen führt zu einer Reiteration des embryobildenden Verfahrens mit dem Ergebnis, dass neue Embryonen kontinuierlich auf der Oberfläche von bereits existierenden Embryonen erzeugt werden (7D und E). Diese Ergebnisse zeigen in schlüssiger Art und Weise, dass die Expression eines einzigen Gens, BNM3, ausreicht, um die Signaltransduktionskaskade zu induzieren, welche zur Bildung von vollständig differenzierten ungeschlechtlich-erhaltenen Embryonen führt.
Beispiel 5: Expression von BNM3 steigert die Regenerationskapazität von Pflanzengeweben
Wir haben die Wirkung der BNM3-Genexpression auf die Fähigkeit von Arabidopsis-Pflanzen untersucht, Triebe in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit von zugegebenen Wachstumsregulatoren zu erzeugen. Blatt-, Wurzel- und Hypocotyl-Explantate von 10 Tage alten Sämlingen von Wildtyp Arabidopsis und transgenen Arabidopsis-Linien, welche BNM3 unter der Kontrolle des POLYUBIQUITIN-Promotors exprimierten, wurden auf ein Medium überführt, das Wachstumsregulatoren enthielt, um eine erste Kallusbildung und anschließend Trieborganogenese zu induzieren. Wurzelexplantate von transgenen Linien zeigten eine mindestens fünffache Steigerung in der Triebbildung in Gegenwart der Hormone, im Vergleich zu Wildtyp-Wurzelexplantaten (8A). Diese Triebe entwickelten sich oft schneller in den transgenen Explantaten im Vergleich zum Wildtyp. Wildtyp-Blatt- und Hypocotylexplantate reagierten durch die Bildung von Kallus an der Schnittfläche des Blattstiels (8B). Im Gegensatz dazu bildeten die Explantate transgener Linien unmittelbar neue Triebe (8B) oder Wurzeln von der Schnittfläche des Blattstiels. Transgene Explantate, die zunächst Wurzeln bildeten, erzeugten später Triebe.
Transgene Explantate waren ferner in der Lage, in Abwesenheit von zugegebenen Wachstumsregulatoren zu regenerieren. Wildtyp-Blatt- und Hypocotylexplantate, die auf Medium ohne Wachstumsregulatoren überführt wurden, erzeugten gelegentlich Kallus oder Wurzeln an der Schnittfläche des Blattstiels, es konnten jedoch keine Triebe aus diesen Strukturen regeneriert werden (8C, D). Wildtyp-Wurzeln wurden grün und bildeten verdickte Knötchen-ähnliche Strukturen an der Grenze zu den lateralen Wurzeln, entwickelten sich jedoch nicht weiter. Im Gegensatz dazu bildeten die Explantate transgener Pflanzen, die auf Medium ohne Wachstumsregulatoren gezogen wurden, Triebe entweder aus der Schnittfläche des Blattes und der Hypocotylexplantate oder Knötchen-ähnliche Strukturen der Wurzelexplantate (8C, D).
Alle Zitate werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Es wird jedoch dem Fachmann klar sein, dass eine Vielzahl von Änderungen und Variationen ausgeführt werden können, ohne vom Umfang der hierin offenbarten Erfindung abzuweichen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül umfassend eine ein Protein kodierende Nucleotidsequenz, wobei das Protein, wenn zureichend in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Zelle embryogen macht, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder sowohl die Pflanzenzelle embryogen macht und die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, wobei die Nucleotidsequenz mit der Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO's:1, 3 und 5 oder einem Fragment oder einem Derivat davon, ausgenommen einer AP2-Domain-Repeat1-Linker-AP2-Domain-Repeat2 Region unter gemäßigten oder stringenten Hybridisierungsbedingungen, hybridisiert.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das isolierte DNA-Molekül zumindest 27 aufeinanderfolgende Nucleotide einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1, 3 und 5 umfaßt.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das isolierte DNA-Molekül eine Nucleotidsequenz umfaßt, die zumindest 70% homolog ist mit einer Nucleotidsequenz oder einem Fragment oder einem Derivat davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1, 3 und 5.
Isoliertes DNA-Molekül umfassend eine ein Protein kodierende Nucleinsäuresequenz, wobei das Protein, wenn zureichend in einer Pflanzenzelle vorhanden, die Zelle embryogen macht, die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder sowohl die Pflanzenzelle embryogen macht und die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, wobei das isolierte DNA-Molekül zumindest 70% homolog ist mit einer Nucleotidsequenz oder einem Fragment oder einem Derivat davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO's: 1, 3 und 5.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 4, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit den Nucleotiden 1620–4873 von SEQ ID NO:5 oder einem Fragment oder einem Derivat davon hybridisiert, unter gemäßigten oder stringenten Bedingungen.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 4, umfassend eine Nucleotidsequenz die mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 oder einem Fragment oder einem Derivat davon hybridisiert, unter gemäßigten oder stringenten Bedingungen.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 4, umfassend eine Nucleotidsequenz die mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:3 oder einem Fragment oder einem Derivat davon hybridisiert, unter stringenten Bedingungen.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei die DNA ein durch SEQ ID NO:2 definiertes Protein kodiert.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei die DNA ein durch SEQ ID NO:4 definiertes Protein kodiert.
Vektor umfassend das isolierte DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das isolierte DNA-Molekül einem Regelelement untergestellt ist, das Expression von der DNA in einer Pflanzenzelle richtet.
Vektor nach Anspruch 10, wobei das Regelelement ein konstitutives Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 10, wobei das Regelelement ein induzierbares Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 10, wobei das Regelelement ein Gewebespezifisches Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 10, wobei das Regelelement ein in der Entwicklung aktives Regelelement ist.
Transformierte Pflanzenzelle umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
Transformierte Pflanze umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
Samen von der transformierten Pflanze nach Anspruch 16 erhalten.
Isoliertes Protein durch das isolierte DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 9 kodiert.
Verfahren zum Produzieren von ungeschlechtlich erlangten Embryonen umfassend: i) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14; ii) Wachsen der Pflanzenzelle zum Produzieren von transformiertem Gewebe; iii) Selektieren des transformierten Gewebes für das Auftreten des isolierten DNA-Moleküls; und iv) Prüfen der transformierten Pflanze für ungeschlechtliche Embryoproduktion.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für nebensächliche Embryonie umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für somatische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für gametofytische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für haploide Parthenogenese des Embryosacks umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für Diplosporie umfaßt.
Verfahren zum Modifizieren der regenerativen Kapazität einer Pflanze, umfassend: v) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14; vi) Wachsen der transformierten Pflanzenzelle zum Produzieren von transformiertem Gewebe; vii) Prüfen des transformierten Pflanzengewebes für erhöhte Regeneration im Vergleich zu Wildtyp-Gewebe.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Wachstumsschritt der transformierten Pflanzenzelle, der Prüfungsschritt des transformierten Pflanzengewebes, oder sowohl der Wachstumsschritt der transformierten Pflanzenzelle und der Prüfungsschritt des transformierten Pflanzengewebes in der Abwesenheit eines Wachstumsreglers ausgeführt werden.
Verfahren zum Selektieren einer transformierten Pflanze umfassend: i) Transformieren einer normalerweise nicht-regenerativen Pflanze mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14; und ii) Feststellen ob die transformierte Pflanze imstande ist unter Bedingungen zu regenerieren worin die normalerweise nicht-regenerative Pflanze nicht regeneriert.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend eine DNA- Sequenz die zumindest ungefähr 70% Ähnlichkeit mit den Nucleotiden 1–1619 von SEQ ID NO:5 oder einem Fragment davon umfaßt.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das isolierte Molekül zumindest 22 aufeinander folgende Nucleotide innerhalb den Nucleotiden 1–1619 von SEQ ID NO:5 umfaßt.
Vektor umfassend das isolierte DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 28 oder 29, operabel mit einem Gen von Bedeutung verbunden, wobei das isolierte DNA-Molekül die Expression des Gens von Bedeutung innerhalb einer Pflanzenzelle richtet.
Vektor nach Anspruch 30, wobei das Gen von Bedeutung heterolog ist bezüglich des isolierten DNA-Moleküls.
Vektor nach Anspruch 31, wobei das Gen von Bedeutung aus der Gruppe bestehend aus einem pharmazeutisch aktiven Protein, Antikörper, industriellen Enzym, Proteinzusatz, Nutrazeutikum, Speicherprotein, Tierfutter und Tierfutterzusatz ausgewählt ist.
Transformierte Pflanzenzelle umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 30, 31 oder 32.
Transformierte Pflanze umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 30, 31 oder 32.
Samen von der transformierten Pflanze nach Anspruch 34 erhalten.
Verfahren zum Richten der Expression eines Gens von Bedeutung innerhalb eines entwicklenden Embryos einer Pflanze umfassend das Transformieren der Pflanze mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 30, 31 oder 32.
Benutzung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 4, 5, 6 oder 7 als ein selektierbarer Marker.
Verfahren zum Produzieren von ungeschlechtlich erlangten Embryonen umfassend: i) vorübergehend Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, oder das Einführen in die Pflanzenzelle des Proteins nach Anspruch 18, zum Produzieren einer modifizierten Pflanzenzelle; ii) Wachsen der modifizierten Pflanzenzelle zum Produzieren von Gewebe; und iii) Prüfen des Gewebes für ungeschlechtliche Embryoformation.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für nebensächliche Embryonie umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für somatische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für gametofytische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für haploide Parthenogenese des Embryosacks umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für Diplosporie umfaßt.
Verfahren zum Modifizieren der regenerativen Kapazität einer Pflanze, umfassend: i) vorübergehend Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14; oder das Einführen in die Pflanzenzelle des Proteins nach Anspruch 18, zum Produzieren einer modifizierten Pflanzenzelle; ii) Wachsen der modifizierten Pflanzenzelle zum Produzieren von Gewebe; iii) Prüfen des Gewebes für erhöhte Regeneration im Vergleich zu Wildtyp-Gewebe.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Wachstumsschritt der modifizierten Pflanzenzelle, der Prüfungsschritt des Gewebes, oder sowohl der Wachstumsschritt der modifizierten Pflanzen-zelle und der Prüfungsschritt des Gewebes in der Abwesenheit eines Wachstumsreglers ausgeführt werden.
Verfahren zum Produzieren einer apomixischen Pflanze, umfassend: i) Transformieren einer Pflanze mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, zum Produzieren einer transformierten Pflanze; ii) Selektieren der transformierten Pflanze für das Auftreten des isolierten DNA-Moleküls; und iii) Prüfen der transformierten Pflanze für ungeschlechtliche Embryoproduktion.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für nebensächliche Embryonie umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für somatische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für gametofytische Embryonen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Prüfungsschritt das Prüfen für Parthenogenese des Embryosacks umfaßt.
Verfahren zum Modifizieren der regenerativen Kapazität einer Pflanze, umfassend i) vorübergehend Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14; oder das Einführen in die Pflanzenzelle des Proteins nach Anspruch 18; ii) Wachsen der transformierten Pflanzenzelle zum Bilden von Gewebe; iii) Prüfen des Gewebes für erhöhte Regeneration im Vergleich zu Wildtyp-Gewebe.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei der Wachstumsschritt der Pflanzenzelle, der Prüfungs-schritt des Gewebes, oder sowohl der Wachstumsschritt der Pflanzenzelle und der Prüfungs-schritt des Gewebes in der Abwesenheit eines Wachstumsreglers ausgeführt werden.
Verfahren zum Selektieren einer modifizierten Pflanze, umfassend: i) vorübergehend Transformieren einer normalerweise nicht-regenerativen Pflanze mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, oder das Einführen in die normalerweise nicht-regenerative Pflanze des Proteins nach Anspruch 18, um die modifizierte Pflanze zu produzieren; und ii) Bestimmen ob die modifizierte Pflanze imstande ist, um unter Bedingungen bei denen die normalerweise nicht-regenerative Pflanze nicht keimt, zu regenerieren.
Isoliertes DNA-Molekül umfassend eine ein Protein kodierende Sequenz umfassend zwei AP2 DNA Bindungsbereiche, wobei die zwei AP2 DNA Bindungsbereiche aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 von der Aminosäure auf Position 208 zu der Aminosäure auf Position 378, die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 von der Aminosäure auf Position 208 zu der Aminosäure auf Position 378, und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7 von der Aminosäure auf Position 205 zu der Aminosäure auf Position 375 bestehen, welche, wenn das Protein zureichend in einer Pflanzenzelle exprimiert wird, die Zelle embryogen macht oder die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht, oder sowohl die Pflanzenzelle embryogen macht und die regenerative Kapazität der Pflanzenzelle erhöht.
Verfahren zum Produzieren eines Proteins von Bedeutung umfassend: i) Transformieren einer Pflanze mit zumindest einem Vektor, wobei der zumindest eine Vektor aus einem der Ansprüche 10 bis 14 ausgewählt ist zum Produzieren einer transformierten Pflanze; ii) Selektieren der transformierten Pflanze für das Auftreten des isolierten DNA-Moleküls; iii) Wachsen der transformierten Pflanze zum Produzieren des Proteins von Bedeutung, wobei Expression des Proteins von Bedeutung durch das Expressionsprodukt von der isolierten DNA induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei die transformierte Pflanze mit einem zweiten Vektor transformiert wird, umfassend eine das Protein von Bedeutung kodierende Nucleotidsequenz unter Kontrolle eines Regelelements, wobei das Regelelement durch das Expressionsprodukt von der isolierten DNA induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei das Protein von Bedeutung ein natives Protein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 55 oder 56, wobei das Protein von Bedeutung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem pharmazeutisch aktiven Protein, Antikörper, industriellen Enzym, Proteinzusatz, Nutrazeutikum, Speicherprotein, einem Enzym beteiligt in Öl-Biosynthese, Tierfutter und Tierfutterzusatz.
Isoliertes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das isolierte DNA-Molekül ein Protein das zumindest 70% ähnlich ist mit der durch SEQ ID No:2 definierten Aminosäure, kodiert.
Isoliertes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das isolierte DNA-Molekül ein Protein das zumindest 70% ähnlich ist mit der durch SEQ 10 NO:4 definierten Aminosäure, kodiert.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein ungefähr 30 bis ungefähr 541 Aminosäuren der in SEQ ID NO:2 gezeigten Sequenz umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein ungefähr 30 bis ungefähr 561 Aminosäuren der in SEQ ID NO:4 gezeigten Sequenz umfaßt.
Isoliertes DNA-Molekül umfassend eine Nucleotidsequenz die mit SEQ ID NO:6 hybridisiert, ausgenommen einer AP2-Domain-Repeat-1-Linker-AP2-Domain-Repeat 2 Region, unter stringenten Bedingungen.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 4, umfassend eine Nucleotidsequenz die mit Nucleotiden 1620–4873 von SEQ ID NO:6 oder einem Fragment oder einem Derivat davon, unter gemäßigten oder stringenten Bedingungen, hybridisiert.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 64, wobei die DNA ein durch SEQ ID NO:7 definiertes Protein kodiert.
Vektor umfassend das isolierte DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 63 bis 65, wobei das isolierte DNA-Molekül einem Regelelement untergeordnet ist, das die Expression der DNA in einer Pflanzenzelle kontrolliert.
Vektor nach Anspruch 66, wobei das Regelelement ein konstitutives Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 67, wobei das Regelelement ein induzierbares Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 67, wobei das Regelelement ein Gewebespezifisches Regelelement ist.
Vektor nach Anspruch 67, wobei das Regelelement ein in der Entwicklung aktives Regelelement ist.
Transformierte Pflanzenzelle umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 66 bis 70.
Transformierte Pflanze umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 66 bis 70.
Samen aus der transformierten Pflanze nach Anspruch 72 erhalten.
Isoliertes Protein durch das isolierte DNA-Molekül nach Anspruch 65 kodiert.