DE60016393T3

DE60016393T3 - Metabolische intervention mit glp-1 zur verbesserung der funktion von ischämischem und wiederdurchblutetem gewebe

Info

Publication number: DE60016393T3
Application number: DE60016393T
Authority: DE
Inventors: Thomas Coolidge; Mario EHLERS
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2012-07-12
Anticipated expiration: 2020-04-28
Also published as: WO2000066138A3; ES2233366T5; EP1512410A1; NO20015294L; DE60016393D1; MXPA01010859A; EP1173197B2; JP2002543142A; AU777019B2; AU2004240247A1; US6284725B1; NO325601B1; AU2004240247B2; US20020147131A1; EP1173197A2; NO20015294D0; CN1349409A; AU4493500A; CA2372947C; CA2372947A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die metabolische Intervention mit GLP-1 zur therapeutischen Verbesserung der Funktion von ischämischem und reperfundiertem Gewebe.
Hintergrund der Erfindung
Als Folge von Ischämie sind Zellschäden in aeroben Organgeweben bekannt, die entweder endogen, wie im Fall eines spontanen Koronargefäß-Verschlusses, oder iatrogen, wie bei Operationen am offenen Herzen, Koronar-Bypass-Operationen oder Transplantations-Operationen des Herzens oder anderer Organe wie der Lunge, der Leber, der Niere, der Bauchspeicheldrüse und des Gastrointestinaltrakts sind. Das Ausmaß und die Dauer der die ischämie verursachenden Ereignisse ist für das Ausmaß des Zelltods und/oder der reversibelen zellulären Disfunktionen entscheidend. Es ist außerdem bekannt, dass ein großer Anteil des Gewebeschadens in der Tat erst bei Reperfusion (d. h. bei der Wiederaufnahme der Durchblutung) und der Reoxygenierung des vorher anoxischen Gewebes auftritt. Viele jüngere Studien haben sich mit Reperfusionsschäden befasst, angespornt durch die medizinischen Fortschritte insbesondere in der Behandlung von Reperfusionsschäden nach Myokard-Infarkten und anderen Verfahren zur Verbesserung des Myokard-Zustands, wie z. B. Koronar-Bypass-Operationen, andere Operationen am offenen Herzen, und Organ-Transplantationen.
Als ein Nebenprodukt der normalen aerobischen Atmung gehen regelmäßig Elektronen aus der mitochondrialen Elektronentransportkette verloren. Solche Elektronen können mit molekularem Sauerstoff reagieren, und das reaktive freie Radikal Superoxid bilden, das über andere Reaktionswege in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Eisen das außerordentlich reaktive und giftige Hydroxyl-Radikal bildet. Metabolisch aktive aerobe Gewebe besitzen Verteidigungsmechanismen, die auf den Abbau der giftigen freien Radikale gerichtet sind, bevor diese reaktiven Sauerstoff-Spezies mit zellulären Organellen, Enzymen oder DNA interagieren können, was ohne diese Schutzmechanismen den Zelltod zufolge haben konnte. Diese Verteidigungsmechanismen umfassen die Enzyme Superoxid-Dismutase (SOD), die Superoxid abbaut, Katalase, die Wasserstoffperoxid abbaut, und das Peptid Glutathion, bei dem es sich um einen unspezifischen freien Radikalfänger handelt.
Obwohl noch nicht vollständig verstanden, wird angenommen, dass in Zusammenhang mit der Ischämie metabolischer Gewebe und der anschließenden Reperfusion eine komplexe Abfolge von Ereignissen auftritt. Zunächst scheint während der Ischämie-Periode die intrazelluläre antioxidative Enzymaktivität abzunehmen, einschließlich der Aktivität von SOD, Katalase und Glutathion. Es gibt außerdem Hinweise darauf, dass während des Ischämie-Ereignisses das Niveau der Xanthinoxidase-Aktivität in vaskulärem Endothelgewebe zeitgleich zunimmt. Die Kombination aus der erhöhten Fähigkeit, freie Sauerstoff-Radikale zu erzeugen (über die erhöhte Xanthinoxidase-Aktivität) und der reduzierten Fähigkeit, dieselben Sauerstoff-Radikale zu fangen (aufgrund der verminderten Aktivität von SOD, Katalase und Glutathion) macht die ischämische Zelle sehr empfindlich für einen Sauerstoff-Schub, und damit für einen Schade, wenn diese Zellen anschließend mit Blut – und damit Sauerstoff – reperfundiert werden. Ein solcher Sauerstoff-Schub, der innerhalb von Sekunden bis Minuten nach der Reperfusion auftritt, könnte zu reversibelen und irreversibelen Schäden an Endothel-Zellen und anderen Zellen, aus denen das ischämische, reperfundierte Organ zusammengesetzt ist, führen. Wenn zum Beispiel das Herz das betreffende Organ ist, kann ein reversibeler oxidativer Schaden zu einer Myokardialen Dysfunktion führen, während sich ein irreversibler Schaden als ein Myokard-Infarkt darstellt. Begleitet wird dieser anfängliche Sauerstoff-Schub durch einen oxidativen Schaden der Zellmembranen. Die Lipid-Oxidation der Zellmembranen scheint eine Rolle bei der Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten in post-ischämische Bereiche zu spielen. Solche aktivierten neutrophilen Granulozyten heften sich an das vaskuläre Endothel, leiten die Umwandlung von Xanthindehydrogenase in Xanthinoxidase in diesen Endothel-Zellen ein und verstärken so die Zerstörung der Endothel-Struktur. Aktivierte neutrophile Granulozyten wandern auch aus dem Gefäßsystem in das myokardiale Interstitium, wo die Entzündungszellen unmittelbar Myocyten töten können. Hinzu kommt, dass Störungen der normalen Kalzium-Freisetzung aus dem sarcoplasmatischen Reticulum, die als Folge der Reperfusion nach Ischämie auftreten, zu einer reversibelen Funktionsstörung des Myokards beitragen können, die als „myocardial stunning” bezeichnet wird.
Die Folgen der Reperfusion nach der Ischämie sind ein reversibeler und ein irreversibler Zellschaden, Zelltod, und eine verminderte Organfunktion. Genauer gesagt umfassen die Folgen im Fall eines myokardialen Reperfusionsschadens myokardiale Dysfunktionen, Herzrhythmusstörungen, und Herzinfarkt und, als Folge, kardiogenen Schock und möglicherweise Herzinsuffizienz.
Das Paradoxe des Zellschadens, der mit einer kurzen Ischämie-Periode, der eine Reperfusion folgt, einhergeht, ist, dass der Zellschaden und -Tod nicht allein direkt auf die Periode des Sauerstoff-Entzugs zurückzugehen scheinen, sondern zusätzlich als eine Folge der Reoxygenierung der Gewebe, die während der Ischämie-Periode hoch empfindlich gegenüber oxidativen Schäden geworden sind, erscheint. Der Reperfusions-Schaden beginnt mit dem ersten Sauerstoff-Schub unmittelbar nach der Wiederdurchblutung und nimmt kontinuierlich über einige Stunden zu, da sich in denselben post-ischämischen Geweben entzündliche Prozesse entwickeln. Es wurde gezeigt, dass Maßnahmen, die darauf gerichtet sind, die Empfindlichkeit postanoxischer Zellen gegenüber oxidativen Schäden zu reduzieren, und außerdem Maßnahmen zur Verminderung der entzündlichen Antworten in denselben Geweben, die reversibelen und irreversibelen Schäden in postanoxischen, reperfundierten Organen reduzieren. Eine Kombination aus Verfahren, die sowohl den anfänglichen Sauerstoff-Schub und den folgenden, mit der Entzündung zusammenhängenden Schaden reduzieren, würde einen synergistischen Schutz gegen Reperfusions-Schäden zur Verfügung stellen.
Hinsichtlich der Behandlung von Ischämien, die bei Myokardinfarkt-Patentien auftreten, verwenden übliche, heute angewandte Therapien Thrombolytika wie z. B. Streptokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) oder Angioplastie-Verfahren. Die U.S. Pat. No. 4,976,959 offenbart die Verabreichung von t-PA und SOD zur Verhinderung von Gewebe-Schäden während der Reperfusion und/oder der perkutanen transluminalen Koronar-Angioplastie, die mit der Ischämie einhergeht, um den ursprünglichen Blutfluss wiederherzustellen. Daher wird eine zunehmende Zahl von Patienten, insbesondere Herzpatienten, der Gefahr eines Reperfusions-Schadens und seiner Folgen ausgesetzt werden.
Reperfusionsschäden in Organen außer dem Herz werden sich in der Regel in einer erheblich geminderten Funktionsweise äußern, was als Folge eine frühzeitige Degeneration des Organs oder einfach dessen Funktionsende zur Folge haben kann. Außerdem erfahren transplantierte Organe erhöhte Abstoßungsraten, wenn sie einen erheblichen Reperfusions-Schaden aufweisen.
Obgleich die genauen Mechanismen des Reperfusions-Schadens noch nicht klar bestimmt worden sind, zeigen, wie oben kurz diskutiert, die vorliegenden Daten, von denen die meisten in verschiedenen Untersuchungen an Herzmodellen gesammelt wurden, dass die Bildung von Sauerstoff-abgeleiteten freien Radikalen einschließlich dem Superoxid-Anion (O₂)^–, dem freien Hydoxyl-Radikal (•OH) und H₂O₂ als Folge des Wiedervorhandenseins molekularen Sauerstoffs anläßlich der Reperfusion auftritt und eine wichtige Rolle für die Gewebsnekrose spielt. Agenzien, die entweder die Bildung dieser aus Sauerstoff abgeleiteten freien Radikale reduzieren (einschließlich Allopurinol and Deferroxamin) oder den Abbau dieser Stoffe erhöhen, wie z. B. Superoxid-Dismutase, Katalase, Glutathion, und Kupferkomplexe, scheinen das Ausmaß des Infarkts zu begrenzen und können möglicherweise die Erholung der Funktionen des linken Ventrikels von der myokardialen Dysfunktion verbessern.
Die Verwendung einer metabolischen Intervention zu Therapiezecken besonders während eines akuten Myokard-Infarkts ist weit verbreitet, obwohl nicht unumstritten. Es gibt viele experimentelle und klinische Belege, die die Verwendung einer Glukose-Insulin-Kalium-Infusion (GIK) – der ersten Form der metabolischen Intervention – nach einem akuten Myokard-Infarkt stützen, insbesondere nach dem Erfolg der schwedischen DIGAMI-Studie (Malmberg, K, und DIGAMI Study Group (1997), Prospective randomized study of intensive insulin treatment an long term survival after acute myocardial infarction in patients with diabetes mellitus. Brit. Med. J. 314, 1512–1515). Die DIGAMI-Studie hob die Wirksamkeit einer Glukose-Insulin-Infusion bei akutem Myokard-Infarkt bei Diabetes-Patienten hervor, aber diese Art der Therapie wurde niemals für die Reperfusion vorgeschlagen oder verwendet.
Es ist daher erkennbar, dass ein Bedarf für eine sichere, wirkungsvolle Zusammensetzung mit einer breiten Anwendbarkeit für die Verhinderung oder Linderung der gefährlichen Folgen der Ischämie und der Reperfusion auf Gewebe im allgemeinen, insbesondere Organ-Gewebe einschließlich, aber nicht begrenzt auf das Myokard, besteht. Die vorliegende Erfindung hat das hauptsächliche Ziel, diesen Bedarf zu erfüllen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Behandlung der Reperfusion nach Ischämie bereitzustellen, ohne die Nebenwirkungen aufzuweisen, die normalerweise mit den derzeit verfügbaren Therapien einhergehen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine pharmazeutisch akzeptierbare Träger-Zusammensetzung bereitzustellen, die für die intravenöse Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ohne irgendwelche erheblichen, unerwünschten Nebeneffekte aufzuweisen, und ohne die antigenen oder die das Immunsystem stimulierenden Eigenschaften negativ zu beeinflussen.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der anschließenden Beschreibung und den begleitenden Ansprüchen erkennbar.
In der Veröffentlichung ”Circulation vol. 98, 1998, pp 2223–2226” wird die Behandlung von Myokardinfarkten mit Glukose-Insulin-Kalium (GIK) in Form einer akuten Reperfusionstherapie offenbart. Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 9808531 offenbart die Möglichkeit, bei der Behandlung akuter Myokard-Infarkte GIK durch GLP-1 zu ersetzen, allerdings erfordert diese Behandlung weiterhin die Verabreichung von Glukose und in einigen Fällen sogar von Kalium.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die GLP-1 oder ein biologisch wirksames Analoga davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Individuen, die eine Verbesserung von Organgewebeverletzungen bedürfen, die durch Reperfusion des Blutflusses gefolgt von einer Ischämiephase verursacht sind, wobei die Behandlung nicht die Co-Verabreichung von Glukose einschließt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
GLP-1 ist ein Glukose-abhängiges insulinotropes Hormon, das die periphere Glukose-Aufnahme wirksam erhöht, ohne eine gefährliche Hypoglykämie zu verursachen. Weiterhin unterdrückt GLP-1 unabhängig von seiner insulinotropen Wirkung die Glukagon-Sekretion stark, und reduziert dadurch wirksam den Gehalt an freien Fettsäuren (FFA) im Plasma, und zwar wesentlich stärker, als dies mit Insulin erreicht werden kann. Hohe FFA-Gehalte wurden als einer der wichtigen toxischen Mechanismen während der myokardialen Ischämie identifiziert.
Wir haben nun die Idee der Verwendung von GLP-1 als metabolische Therapie für Reperfusions-Schäden nach Ischämie entwickelt. Diese Entwicklung basierte auf der Erkenntnis, dass es zwei klinische Situationen gibt, in denen Ischämie ein u. U. gefährliches Routineereignis ist: Thrombolytische Prozesse bei akutem Myokard-Infarkt, und Reperfusion des Herzens nach ischämischer Kardioplegie während einer Herzoperation. Darüber hinaus haben jüngste experimentelle und klinische Daten belegt, dass das Phänomen der Reperfusion nach Ischämie besonders gut auf metabolische Therapie mit einer GIK-Infusion anspricht, sogar stärker als eine isolierte Ischämie ohne Reperfusion (Apstein, CS (1998) Glucose-insulin-potassium for acute myocardial infarction. Remarkable results from a new prospective, randomized trial. Circulation 98, 2223–2226).
Die zwei wichtigsten therapeutischen Fortschritte der letzten zehn Jahre bei der Behandlung von akuter, mit einem Myokard-Infarkt einhergehender Ischämie waren die Einführung von Thrombolyse und β-Blockern. Trotz dieses allgemeinen Erfolgs haben einige Studien über Thrombolyse jedoch eine erhöhte frühe Mortalität aufgedeckt, für die die durch Reperfusion verursachten Schäden und myokardiale Dysfunktionen verantwortlich gemacht werden. Die Mechanismen, die den Dysfunktionen zugrunde liegen, sind komplex, aber es besteht inzwischen Konsens, dass diese wahrscheinlich mit intrazellulärer Azidose zusammenhängt, die zu dysfunktionalen Ca²⁺-Pumpen im Sarkolemma und zu einem Überschuss von Ca²⁺ im Cytosol führen. Im Ergebnis stellt sich eine Verschlechterung der kontraktilen Funktionen des Myokards ein, die zu einer verschlechterten mechanischen Wirkung und ventrikulären Reperfusions-Arrythmien führt. Darüber hinaus haben jüngste Forschungen bestätigt, dass die intrazelluläre Azidose wiederum auf ein Ungleichgewicht zwischen Glykolyse und vollständiger Glukoseoxidation zurückzuführen ist, und zwar in dem Sinn, dass die Glykolyse-Rate von der Oxidation des Pyruvats (das Endprodukt der Glykolyse) im Citratzyklus abgekoppelt wird. Diese Abkopplung führt zu einer Netto-H⁺-Produktion durch Überführung von Pyruvat zu Laktat. Die wahrscheinlichste Ursache für dieses Ungleichgewicht ist die Anwesenheit von hohen Plasmagehalten an freien Fettsäuren (FFA), die bevorzugt in die Mitochondrien eindringen und die Pyruvat-Oxidation inhibieren, ein Mechanismus, der die häufig gemachte Beobachtung, dass Herzen, die mit FFA perfundiert werden, sich in der Reperfusionsphase schlechter erholen als Herzen, die mit Glukose perfundiert werden, elegant erklärt. Es wurde hier festgestellt, und es ist eine der Grundlage dieser therapeutischen Erfindung, dass GLP-1 FFA absenkt, und zwar über das Maß, das für Insulin erwartet wird, nämlich uber 50%, hinaus, da die FFA-Absenkung durch GLP-1 bis zu 90% betragen kann.
Diese Überlegungen haben unsere Überzeugung bestärkt, eine Reperfusion nach Ischämie mit Glukagon-ähnlichen Peptiden zu behandeln. Es ist wohlbekannt, dass bei normaler Perfusion und ausreichender Oxygenierung das Herz auf aeroben Stoffwechsel angewiesen ist und FFA als bevorzugten Brennstoff verwendet. im Gegensatz dazu ist die β-Oxidation von Fettsäuren während einer Ischämie (reduzierter Blutfluss) oder einer Hypoxie (reduzierter O₂-Partialdruck) beeinträchtigt (da sie strikt aerob ist), so dass eine weitere Bereitstellung von ATP zunehmend von der anaeroben Glykolyse abhängt. Während der Ischämie-Periode ist Glukose-Insulin vorteilhaft, weil es die Glukose-Aufnahme verbessert und die Glykolyse fördert, wodurch ATP für die Aufrechterhaltung der wichtigsten Membranfunktionen, insbesondere des Ionentransports, produziert wird. Außerdem unterdrückt Glukose-Insulin die Lipolyse von Fettgewebe, wodurch die Plasmagehalte an freien Fettsäuren (FFA) und die Aufnahme von FFA ins Myokard reduziert werden. Hohe FFA-Gehalte sind toxisch für das ischämische Myokard, und zwar sowohl durch direkte Detergenz-Wirkung auf die Membranen und die Zunahme von cAMP als auch durch die Anhäufung von Acylcamitin, das Ca²⁺-Pumpen inhibiert. Der Netto-Effekt ist eine Störung des Ionen-Austauschs, ein Überschuss an cytosolischem Ca²⁺, sowie eine resultierende Kontraktions-Dysfunktion und Arrhythmien.
Während der Reperfusions-Periode ist Glukose-Insulin von Vorteil, da, wie oben erklärt, diese Therapie das metabolische Ungleichgewicht, das die Dysfunktion verursacht, lindern kann. Dies wird durch direkte Förderung der PDH und damit der Pyruvat-Oxidation erreicht, und indirekt durch die Reduktion der FFA-Aufnahme, folglich also durch ein verbessertes Verhältnis von Pyruvat-zu FFA-Oxidation.
Aus der obigen Diskussion wird klar, dass die doppelte Wirkung von Glukose-Insulin – erhöhte Glukose-Aufnahme und -Stoffwechsel, und reduzierte FFA-Gehalte – bei einer Reperfusion erhebliches therapeutisches Potenzial aufweist. Es wurde von einigen die Besorgnis geäußert, das sich während einer tiefen Ischämie, also praktisch einer Ischämie bei einem Durchblutungsstop, Endprodukte der Glykolyse, nämlich Laktat, wegen nicht ausreichender Abfuhr anhäufen werden. Die Anhäufung von Laktat führt wiederum zu hohen intrazellulären Protonenkonzentrationen und zur Unfähigkeit, NADH zu reoxidieren; hohe H⁺-Konzentrationen und NADH/NAD⁺-Verhältnisse inhibieren die produktive Glykolyse. Unter diesen Umständen kann Glukose für Zellen toxisch sein, da ATP für die Bildung von Fructose-1,6-Eisphosphat benötigt wird, und hohe hohe H⁺-Konzentrationen die Myocytennekrose verschlimmern können (Neely, JR, and Morgan, HE (1974) Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Ann. Rev. Physiol. 36, 413–459). Allerdings werden diese Bedenken nicht von experimentellen und klinischen Daten gestützt, die darauf hinweisen, dass Glukose-Insulin vorteilhafte Ergebnisse liefert. Obwohl hier nicht an Theorien festgehangen werden soll, ist eine mögliche Erklärung hierfür, dass bei Menschen eine akute spontane Ischämie nicht durch einen Durchblutungsstop verursacht wird, sondern anstelle dessen einen Bereich geringer Durchblutung darstellt, in welchem die verbleibende Durchblutung ausreicht, Substrate heranzuführen und Laktat abzuführen. Diese Erkenntnis führte nun zu starken physiologischen Argumenten für die Verwendung einer metabolischen Therapie bei Reperfusion nach Ischämie.
Die moderne Herzchirurgie, egal ob sie den Austausch einer Herzklappe oder das Legen eines Korionararterien-Bypass betrifft, erfordert routinemäßig die Herbeiführung eines hypothermischen Herzstillstandes, die Abklemmung der Aorta und das Legen eines cardiopulmonaren Bypass während der Operation. Aus diesem Grunde wird in der routinemäßigen Herzchirurgie praktisch ein Zustand einer gewollten globalen Ischämie herbeigeführt, der eine Reperfusion folgt, die das Herz all den begleitenden Risiken und Schäden aussetzt, die eine Reperfusion nach myokardialer Ischämie auszeichnen. Daher bleibt die Verhinderung von Myokard-Schäden während und nach Herzoperationen eine Hauptsorge. Eine gewollt herbeigeführte, von einer Reperfusion gefolgte kardioplegische Ischämie, hat offensichtliche Parallelen zu einer Reperfusion nach Ischämie, die während eines akuten Myokardinfarkts und anschließender Revaskularisation auftritt, so dass viele der pathophysiologischen Prinzipien, die in den vorherigen Abschnitten berücksichtigt worden sind, auch während einer Herzoperation zutreffen. Allerdings gibt es einige bemerkenswerte Unterschiede zwischen der Reperfusion nach einer chirurgischen cardioplegischen Ischämie und einer Reperfusion nach einer mit einem Myokard-Infarkt einhergehenden Ischämie. Während der Operation wird der Herzschlag angehalten (Cardioplegie) und das Herz mit einer kalten (hypothermischen) Losung infundiert, die dafür entwickelt worden ist, die Erhaltung des Myokards zu optimieren. Nach Beendigung der Operation wird das Herz reaktiviert und mit oxygeniertem Blut mit Körpertemperatur reperfundiert. So wird eine Abfolge einer hypothermischen Ischämie und einer normothermischen Reperfusion erzeugt, wodurch die Anreicherung von hohen H⁺- und Laktat-Gehalten im Gewebe verhindert werden kann. Außerdem stellt eine hypothermische Cardioplegie anders als ein akuter Myokard-Infarkt einen Zustand einer globalen, durch einen Durchblutungsstop verursachten Ischämie dar, der eine globale Reperfusion folgt.
In unserer früheren Anmeldung (Serial No. 60/103,498), von welcher diese Anmeldung eine Continuation In-Part-Anmeldung ist, haben wir die Nachteile von Glukose-Insulin-Infusionen und die Vorteile, diese durch eine GLP-1-Infusion zu ersetzen, was sicherer ist als Insulin, diskutiert. Zusammengefasst bergen GIK-Infusionen die erheblichen Risiken sowohl einer Hypoglykämie als auch einer Hyperglykämie, und sind technisch anspruchsvoll und personalintensiv. Die Gefahren einer Hypoglykämie sind offensichtlich.
Im Gegensatz dazu bestehen diese Gefahren nicht bei einer GLP-1-Infusion. Das Glukagon-ähnliche Peptid(7-36)-Amid (GLP-1) ist ein natürliches, aus dem Darm abgeleitetes, insulinotropes Peptid, das einen großen Anteil am so genannten Inkretin-Effekt hat. GLP-1 übt seine hauptsächliche Wirkung auf die endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse aus, wo es (1) die Insulin-Expression und Sekretion der β-Zellen in Glukose-abhängiger Weise reguliert; (2) die Sekretion von Somatostatin fördert; und (3) die Sekretion von Glukagon aus den α-Zellen unterdrückt. Obwohl noch nicht ausdrücklich aufgeklärt, wird angenommen, dass der starke glukagonostatische Effekt auf einen oder alle der folgenden Gründe zurückgeht: (1) direkte Unterdrückung durch Stimulation der GLP-1-Rezeptoren auf den α-Zellen, obwohl dies unwahrscheinlich ist; (2) parakrine Unterdrückung der Glukagon-Sekretion durch intra-insulare Freisetzung von Somatostatin; oder (3) parakrine Unterdrückung durch intra-insuläre Freisetzung von Insulin. Was auch immer die zellulären Mechanismen sein mögen, so ist GLP-1 einzigartig in seiner Fähigkeit, gleichzeitig die Insulin-Sekretion zu stimulieren und die Glukagon-Freisetzung zu inhibieren. Obwohl eine therapeutische Insulin-Infusion ebenfalls die Freisetzung von Glukagon inhibiert, ist diese Wirkung nicht so stark wie die von GLP-1, das eine direkte, intra-insulare parakrine Inhibition der Glukagon-Sekretion ausübt.
Die Doppelwirkung von GLP-1, nämlich die starke Anregung der Insulin-Freisetzung und die Inhibition der Glukagon-Sekretion in Verbindung mit der strengen Glukose-Abhängigkeit seiner insulinotropen Wirkung verleihen diesem Molekül ein einzigartiges therapeutisches Potenzial bei der Handhabung von Reperfusionen nach Ischämie. Erstens stimuliert GLP-1 die Sekretion von endogenem Insulin und kann daher verwendet werden, um all die vorteilhaften Wirkungen, die einer Insulin-Infusion bei der metabolischen Behandlung von Reperfusion nach Ischämie zugesprochen werden, zu erzielen. Obwohl hochdosierte GIK-Infusionen typischerweise 25–33% Glukose und 50–100 U Insulin/l enthalten, sind die Voraussetzungen für eine Einführung einer Hyperglykämie an sich zur Erreichung einer therapeutischen Wirksamkeit, im Vergleich zu der lediglichen Bereitstellung eines metabolischen Milieus für die sichere Verabreichung hoher Insulindosen, unklar. Es ist wahrscheinlich, dass angemessene Blutzucker-Spiegel erforderlich sind, um die Zuführung der Substrate zu ermöglichen, allerdings schließt dies nicht notwendigerweise die Erforderlichkeit einer Hyperglykämie ein und sollte nicht von der Tatsache ablenken, dass Insulin außer der Glukose-Aufnahme auch andere wichtige Wirkungen ausübt.
Glukose wird nicht als Sicherheitsmaßnahme benötigt, da Blutzuckerspiegel von kleiner gleich ≤ 3.5 mM die Insulin-stimulierende Wirkung von GLP-1 unterbinden, und 50 vollständig gegen die Gefahren einer Hypoglykämie schützen.
Zweitens übt GLP-1 eine starke glukagonostatische Wirkung aus, die zusammen mit seiner insulinotropischen Wirkungen zu einer starken Unterdrückung von FFA führen wird. Einer der Hauptvorteile von Glukose-Insulin-Infusionen ist die Reduktion der zirkulierenden FFA-Gehalte und die Unterdrückung der FFA-Aufnahme. FFA und deren Metaboliten haben direkte toxische Wirkungen auf das ischämische Myokard und auch während der Reperfusionsphase, wo sie zur Dysfunktion beitragen, und daher ist eine Reduktion der FFA-Gehalte ein hauptsächliches therapeutisches Ziel der metabolischen Intervention bei Reperfusion nach Ischämie. Da Glukagon ein starker Förderer der Lipolyse des Fettgewebes und der Bildung von FFA ist, erhöht die GLP-1-vermittelte Glukagon-Suppression die Insulin-induzierte Reduktion zirkulierender FFA zusätzlich. Daher ist die GLP-1-Therapie einer Glukose-Insulin-Infusion in dieser Hinsicht überlegen. Tatsächlich zeigen vorläufige, an gesunden Freiwilligen erhobene Daten, dass eine intravenöse GLP-1-Infusion die FFA-Plasmagehalte bei Nüchternen auf < 10% der Kontrollwerte reduziert.
GLP-1 sollte bei der Mehrzahl der Patienten wirksam sein, ohne dass eine gleichzeitige Verabreichung von Glukose erforderlich ist. Allerdings könnte ein geringer Anteil der Patienten Glukose/GLP-1 benötigen, um eine ausreichende Insulin-Antwort hervorzurufen.
Zusätzlich kann es auch erforderlich sein, Kalium zu verabreichen, um übermäßige Verschiebungen des Kalium-Gehalts in den Zellen zu korrigieren.
Zusätzlich zu GLP-1 oder seiner biologischen Analoga kann diese Therapie auch die Verwendung von freien Radikalfängern wie Glutathion, Melatonin, Vitamin E, und Superoxid-Dismutase (SOD). einschließen. Bei solchen Kombinationen wird das Risiko eines Reperfusion-Schadens noch weiter verringert.
Der Begriff ”GLP-1”, oder Glukagon-ähnliches Peptid, umfasst Nachahmer, und kann, so wie er im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, aus Glukagon-ähnlichen Peptiden, verwandten Peptiden und Analoga des Glukagon-ähnlichen Peptids 1, die an ein Rezeptor-Protein für Glukagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1) wie z. B. das GLP-1 (7-36) Amid-Rezeptorprotein, binden, bestehen, die eine vergleichbare biologische Wirkung auf die Insulin-Sekretion haben wie GLP-1 (7-36) Amid, wobei es sich um eine native, biologisch aktive Form des GLP-1 handelt. Siehe Goke, B und Byrne, M, Diabetic Medicine, 1996, 13: 854–860. Die GLP-1-Rezeptoren sind Zelloberflächen-Proteine, die zum Beispiel auf Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse gefunden werden. Glukagon-ähnliche Peptide und Analoga umfassen Spezies mit insulinotroper Wirkung, die Agonisten, d. h. Aktivatoren, des GLP-1 Rezeptormoleküls und seiner Second Messenger-Aktivität auf u. a. Insulin-produzierende Zellen sind. Agonisten des Glukagon-ähnlichen Peptids, die eine Wirkung über diesen Rezeptor aufweisen, wurden bereits beschrieben: EP 07081 79A2 ; Hjorth, S. A. et al., J. Biol. Chem. 269 (48): 30121–30124 (1994); Siegel, E. G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter, A. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 269(9): 6275–6278 (1994); Deacon C. F. et al. 16th International Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irwin, D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 7915–7920 (1997); Mosjov, S., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 333–343 (1992).
Glukagon-ähnliche Moleküle umfassen Polynukleotide, die Agonisten des GLP-1, d. h. Aktivatoren des GLP-1-Rezeptormoleküls und seiner Second Messenger-Aktivität, die u. a. auf Insulin-produzierenden β-Zellen gefunden werden, exprimieren. GLP-1-Nachahmer, die ebenfalls Agonisten sind, umfassen z. B. chemische Zusammensetzungen, die spezifisch für die Aktivierung des GLP-1-Rezeptors entwickelt wurden. Antagonisten für das Glukagon-ähnliche Peptid 1 sind ebenfalls bekannt, siehe zum Beispiel Watanabe, Y et al., J. Endocrinol. 140(1): 45–52 (1994), und umfassen Exendin(9-39)-Amin, ein Exendin-Analogon, das ein wirkungsvoller Antagonist der GLP-1 Rezeptoren ist (siehe z. B. WO97/46584 ). Jüngste Veröffentlichungen offenbaren GLP-1 und Ser²GLP-1 aus der schwarzen Witwe, siehe G. G. Holz, J. F. Hakner/Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 121 (1998) 177–184 and Ritzel, et al., A synthetic glucagon-like peptide-1 analog with improved plasma stability, J. Endocrinol 1998 Oct. 159(1): 93–102.
Weitere Ausgestaltungen umfassen chemisch synthetisierte Glukagon-ähnliche Polypeptide sowie alle Polypeptide oder deren Fragmente, die im Wesentlichen homolog sind. ”Im Wesentlichen homolog”, das sich sowohl auf die Nukleinsäure- als auch auf die Aminasäure-Sequenzen beziehen kann, bedeutet, dass eine bestimmte betreffende Sequenz, z. B. eine mutante Sequenz, sich von einer Referenz-Sequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheidet, deren Gesamtwirkung nicht zu einem nachteiligen Funktionsunterschied zwischen Referenz und betreffender Sequenz führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen mit mehr als 50% Homologie, bevorzugt mehr als 90% Homologie, vergleichbarer biologischer Aktivität bei Erhöhung der β-Zell-Antworten gegenüber Plasmazuckerspiegeln, und vergleichbarer Expressionseigenschaften als im Wesentlichen homolog betrachtet. Um die Homologie zu beurteilen, sollte eine Trunkierung der reifen Sequenz nicht beachtet werden. Sequenzen mit geringeren Homologie-Graden, vergleichbarer Bioaktivität und vergleichbaren Expressionseigenschaften werden als Äquivalente betrachtet.
GLP-Peptide und Glukagon werden bei Säugetieren im gleichem Gen codiert. Im Ileum wird der Phänotyp dann in zwei Hauptklassen von GLP-Peptidhormonen prozessiert, nämlich GLP-1 und GLP-2. Es sind vier GLP-1-verwandte Peptide bekannt, die aus den phänotypischen Peptiden prozessiert werden.
GLP-1 (1-37) hat die Sequenz
(SEQ. ID NO: 1).
GLP-1 (1-37) wird durch posttranslationale Prozessierung zu GLP-1 (1-36) NH₂ amidiert, das die Sequenz
(SEQ. ID NO: 2)
hat, oder es wird enzymatisch zu GLP-1 (7-37) prozessiert, das die Sequenz
hat. GLP-1 (7-37) kann ebenfalls zu GLP-1 (7-36)-Amid amidiert werden, wobei es sich um die natürliche Form des GLP-1-Moleküls handelt, das die Sequenz
hat und die natürliche Form des GLP-1-Moleküls darstellt.
L-Zellen des Darms sezernieren GLP-1 (7-37) (SEQ. ID NO: 3) und GLP-1 (7-36)-NH₂ (SEQ. ID NO: 4) in einem Verhältnis von 1 zu 5. Diese trunkierten Formen des GLP-1 haben in situ kurze Halbwertszeiten, d. h. weniger als zehn Minuten, und werden durch eine Aminodipeptidase IV inaktiviert, wobei
entsteht. Es wurde vermutet, dass die Peptide
die Glukose-Produktion in der Leber beeinflussen, aber die Insulin-Produktion oder -Freisetzung im Pankreas nicht fördern.
Im Gift der Gilaechse gibt es sechs Peptide, die homolog zu GLP-1 sind. Deren Sequenzen werden in Tabelle 1 mit der Sequenz des GLP-1 verglichen.
Tabelle. 1
Die wichtigsten, in Tabelle 1 durch die umrissenen Regionen dargestellten Homologien sind: Die Peptide c und h sind aus b bzw. g abgeleitet. Alle 6 natürliche vorkommenden Peptide (a, b, d, e, f und g) sind an den Positionen 1, 7, 11 und 18 homolog. GLP-1 und die Exendine 3 und 4 (a, b und d) sind außerdem an den Positionen 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 und 29 homolog. An Position 2 sind A, S und G strukturell endlich. An Position 3 sind die Reste D und E (Asp und Glu) strukturell ähnlich. An den Positionen 22 und 23 sind F (Phe) und I (Ile) strukturell ähnlich zu Y (Tyr) beziehungsweise L (Leu). Ebenso sind an Position 26 L und I strukturell ähnlich.
Daher sind zu den 30 Resten des GLP-1 die Exendine 3 und 4 an 15 Positionen identisch und an 5 weiteren Positionen ähnlich. Die einzigen Positionen, an denen radikale Strukturänderungen erkennbar sind, liegen an den Resten 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 und 30. Exendine haben außerdem 9 weitere Reste am Carboxyterminus.
Die GLP-1 ähnlichen Peptide können durch chemische Festphasen-Peptidssynthese hergestellt werden. GLP-1 kann auch durch konventionelle rekombinante Techniken mit Standardverfahren, die z. B. in Sambrook und Maniaitis beschrieben sind, hergestellt werden. Der Begriff ”Rekombinant”, so wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass ein Protein aus rekombinanten (z. B. mikrobiellen oder Säugetier-)Expressionssystemen, die genetisch modifiziert werden können, um ein Expressionsgen für GLP-1 oder ein biologisch aktives Analog aufzunehmen, abgeleitet werden kann.
Die GLP-1 ähnlichen Peptide können aus den rekombinanten Zellkulturen mit Verfahren einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, saure Extraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatograpie, Phosphozellulose-Chromatograpie, Hydrophobische Wechselwirkungs-Chromatograpie, Affinitäts-Chromatograpie, Hydroxylapatit-Chromatograpie und Lektin-Chromatograpie, isoliert und gereinigt werden. Als abschließender Reinigungsschritt kann eine Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatograpie (HPLC) angewendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürliches, gereinigtes Produkt sein, ein chemisch synthetisiertes Produkt, oder mittels rekombinanter Techniken aus prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten (wie z. B. Bakterien, Hefe, höheren Pflanzen, Insekten- und Säugetierzellen in Kultur oder in vivo) produziert werden. In Abhängigkeit von dem bei einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirt sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung grundsätzlich nicht glykosyliert, sie können aber glykosyliert sein.
Die GLP-1-Aktivität kann mit Standard-Verfahren bestimmt werden, im allgemeinen durch Screening-Verfahren der Rezeptor-Bindungsaktivität, welche die Bereitstellung geeigneter Zellen, die den GLP-1-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, z. B. Insulinoma-Zelllinien wie z. B. asRINmSF-Zellen oder INS-1-Zellen, umfasst. Siehe auch Mosjov, S. (1992) und EP0708170A2 . Zusätzlich zur Messung der spezifischen Bindung von Tracern an die Membran mit Radioimmunoassay-Verfahren, kann auch die cAMP-Aktivität oder die Glukose-abhängige Insulin-Produktion gemessen werden. In einem Verfahren wird ein Polynukleotid, das für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um Zellen transfizieren, und so das GLP-1-Rezeptorprotein zu exprimieren. So können diese Verfahren z. B. für das Screening eines Rezeptoragonisten verwendet werden, indem diese Zellen mit den zu screenenden Verbindungen kontaktiert werden und bestimmt wird, ob diese Verbindungen ein Signal generieren, d. h. den Rezeptor aktivieren.
Für die Detektion, Reinigung und Identifikation von GLP-1-ähnlichen Peptiden, die in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, können polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet werden. Antikörper wie ABGA1178 erkennen intaktes, ungespleißtes GLP-1 (1-37) oder N-terminal trunkiertes GLP-1 (7-37) oder (7-36)-Amid. Andere Antikörper erkennen das äußerste Ende des C-Terminus des Vorläufermoleküls, ein Verfahren, das durch Subtraktion die Berechnung der Menge des biologisch aktiven, trunkierten Peptids, d. h. GLP-1 (7-37) or (7-36)-Amid, ermöglicht (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42: 658–661; Orskov et al. J. Clin. Invest. 1991, 87: 415–423).
Andere Screening-Methoden umfassen die Verwendung von Zellen, die den GLP-1-Rezeptor exprimieren, z. B. transfizierte CHO-Zellen, in einem System, das den intrazellulären pH oder Ionenänderungen, die durch die Aktivierung des Rezeptors verursacht werden, misst. Zum Beispiel können mögliche Agonisten mit einer Zelle kontaktiert werden, die den GLP-1-Proteinrezptor exprimiert, und es eine Second Messenger-Antwort, wie z. B. eine Signaltransduktion oder ionale der pH-Änderungen, gemessen werden, um festzustellen, ob der mögliche Agonist wirksam ist.
Die den GLP-1-Rezeptor bindenden Proteine der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Solche Kombinationen weisen eine therapeutische effektive Menge des Polypeptids sowie einen pharmazeutischen akzeptierbaren Träger oder Hilfsstoff auf. Solch ein Träger umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Saline, gepufferte Saline, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol, Lactose, Phosphat, Mannitol, Arginin, Trehalose und deren Kombinationen. Die Rezepturen sollten auf die Verabreichungsweise abgestimmt sein und können durch Fachleute leicht festgestellt werden. Das GLP-1-Peptid kann auch in Kombination mit aus dem Stand der Technik bekannten Agenzien verwendet werden, die die Halbwertszeit des Peptids in vivo verlängern, um so die biologische Aktivität des Peptids zu verstärken oder zu verlängern. Z. B. kann ein Molekül oder ein chemischer Rest kovalent mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verbunden werden, sofort diese verabreicht wird. Alternativ kann das verstärkende Agenz gleichzeitig mit der Zusammensetzung verabreicht werden. Weiterhin kann das Agenz ein Molekül aufweisen, von dem bekannt ist, dass es den enzymatischen Abbau von GLP-1-ähnlichen Peptiden inhibiert, und gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der GLP-1-Peptid-Zusammensetzung verabreicht werden. Solch ein Molekül kann zum Beispiel oral oder durch Injektion verabreicht werden.
Bei Patienten, denen GLP-1 oder dessen Analoga in Verbindung mit den hier aufgezählten Trägersystemen verabreicht wurde, insbesondere solchen, die vor einem geplanten Ereignis oder innerhalb der ersten 4 Stunden nach einem ischämischen Ereignis behandelt wurden, wurde beobachtet, dass sie seltener Arrhythmien aufweisen, weniger Gewebeschäden aufweisen, und weniger Beschwerden haben, ohne dass Nebenwirkungen auftraten.
Anhand dieser Überlegungen wird erkennbar, dass von einer Infusion mit GLP-1 erwartet werden kann, dass diese eine wichtige therapeutische Wirkung bei der myokardialen Reperfusion ausübt. Es wird erwartet, dass GLP-1 entweder intravenös oder subkutan verabreicht werden kann, und zwar bei kontinuierlicher Infusion intravenös zwischen 0.1 pmol/kg/min und 10 pmol/kg/min, und subkutan zwischen 0.1 pmol/kg/min und 75 pmol/kg/min, und bei einmaliger Injektion (Bolus) intravenös zwischen 0.005 nmol/kg und 20 nmol/kg und subkutan zwischen 0.1 nmol/kg und 100 nmol/kg als geeignete Dosen für die Verabreichung. Die GLP-1-Infusion kann zusammen mit Glukose (5%) verabreichi werden, wenn es erforderlich ist, den Blutzuckerspiegel oberhalb von 5 mM zu halten (um eine wirksame Insulinsekretion aufrecht zu erhalten). Ebenso wird eine gleichzeitige Verabreichung von Kalium (K⁺) erwogen werden, und zwar in Abhängigkeit von dem Ausmaß, in welchem die Aktivierung der Membran-Na⁺/K⁺-ATPase zu einer Verschiebung von K⁺ in den Intrazellulärraum führt. Die GLP-1-Behandlung wird so früh wie möglich in der post-ischämischen Periode, beispielsweise nach einer akuten spontanen Ischämie noch zuhause oder im Krankenwagen, und noch vor der Reperfusions-Therapie, begonnen, und auch danach weitergeführt. Im Fall einer Herzoperation sollte die GLP-1-Infusion 12–24 Stunden Vor der Operation beginnen, während der Operation vom Beginn der Anästhesie bis zur Abklemmung der Aorta fortgeführt werden, und direkt nach Beendigung der Abklemmung über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden postoperativ fortgeführt werden. Wie bereits vorher erklärt, kann die gleichzeitige Verabreichung von freien Radikalfängern die Erholung nach der Reperfusion zusätzlich unterstützen.
Aus dem oben Gesagten ist erkennbar, dass die Erfindung alle ihre erwähnten Ziele erreicht.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die GLP-1 oder ein biologisch wirksames Analoga davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Individuen, die einer Verbesserung von Organgewebeverletzungen bedürfen, die durch Reperfusion des Blutflusses gefolgt von einer Ischämiephase verursacht sind, wobei die Behandlung nicht die Co-Verabreichung von Glukose einschließt.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin der pharmazeutische Träger aus Saline, gepufferter Saline, Wasser, Glycerol, Ethanol, Lactose, Phosphat, Mannitol, Arginin, Trehalose und Kombinationen daraus ausgewählt ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Zusammensetzung mit einer Dosierung von 0,1 pmol/kg/min. bis 10 pmol/kg/min. des GLP-1 zu verabreichen ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine gleichzeitige Verabreichung eines freien Radikalfängers zu bewirken ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verabreichung innerhalb von 4 Stunden nach dem ischämischen Vorfall zu beginnen ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin die Verabreichung innerhalb von 4 Stunden nach dem ischämischen Vorfall und kontinuierlich danach zu bewirken ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verabreichung intravenös zu bewirken ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 7, worin die Verabreichung durch subkutane oder Mikrodruckinjektion, Tiefe-Lungen-Insufflation, externe oder implantierte Pumpen, Depot-Injektionen und andere verzögerte Freisetzungsmechanismen, orale Verabreichung und Pflaster, buccale und andere Durch-die-Haut- und Membranmechanismen zu bewirken ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Organgewebe Myokardium ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Bedürfnis zur Verbesserung des Gewebeschadens durch metabolische Intervention einem medizinischen Verfahren entspringt, welches ein operativer Eingriff ist, der aus kardialoperativen Verfahren, Organtransplantationen, traumatische Weichamputation und Wiederbefestigung ausgewählt ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die medizinischen Verfahren einen ischämischen Reperfusionsvorfall einschließen, und dieser Vorfall gleichzeitig mit einem Darmverschluss und einem Myokardialinfarkt einhergeht.