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Die
Erfindung bezieht sich auf das Beeinflussen von Teilchen in flüssigen Medien.
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In
den letzten Jahren richtete sich viel Aufmerksamkeit auf die Entwicklung
von Systemen zum Beeinflussen von Teilchen in flüssigen Medien. Die Grunde,
aus denen Teilchen zweckmäßigerweise
in flüssigen Medien
beeinflußt
werden sollen, sind zahlreich und vielfältig. Beispielsweise machen
verschiedene Arten von Trennverfahren von der Tatsache Gebrauch,
daß verschiedene
Arten von Teilchen innerhalb eines Volumens einer Teilchen enthaltenden
Flüssigkeit
getrennt werden können
und dann an einem speziellen Punkt innerhalb des Flüssigkeitsvolumens
abgezogen werden, wobei die so abgezogenen Teilchen dann andere
Eigenschaften aufweisen als andere Teilchen, die von anderen Punkten
innerhalb des Volumens abgenommen worden sind. Derartige Trennverfahren
können
auf die Anwendung bei nichtteilchenförmigen Materialien ausgedehnt werden,
z. B. auf den Fall großer
Moleküle
oder biologischer Objekte, wenn sie mit Trägerteilchen verbunden werden
können,
um verbesserte Teilchen zu bilden, die dann unterschiedliche Eigenschaften
aufweisen, welche eine Trennung der Teilchen erlauben. Ein anderes
Gebiet mit zunehmender Bedeutung ist das Fördern erwünschter Reaktionen, üblicherweise
in einem mikroskopischen Maßstab,
durch Inkontaktbringen von Reaktionspartnern. Dabei liegen die Reaktionspartner
selbst in Form von Teilchen vor, oder sie sind in Form von einem
oder mehreren Teilchen in irgendeiner Teilchenform vorhanden, die
mit einem im allgemeinen nichtteilchenförmigen Reaktionspartner verbunden
ist.
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Durch
die vorliegende Beschreibung hindurch wird der Ausdruck "Teilchen" im Sinne von beispielsweise
biologischen Zellen, Bakterien, Viren, parasitischen Mikroorganismen,.
DNA, Proteinen, Biopolymeren, nichtbiologischen Teilchen oder anderen
Teilchen, die in einer Flüssigkeit
suspendiert sein können,
in welcher dielektrophoretische Kräfte und Ultraschallkräfte ausgeübt werden
können,
benutzt. Der Ausdruck umfaßt auch
chemische Verbindungen oder Gase, die in einer Flüssigkeit
gelöst
oder suspendiert sind, worin dielektrophoretische Kräfte und
Ultraschallkräfte
ausgeübt
werden können.
Der Ausdruck umfaßt
ferner irgendwelche Teilchen, die an größere Teilchen gebunden werden
können,
worin dann dielektrische Kräfte
und Ultraschallkräfte
induziert werden können.
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Es
können
zwei Basisarten der Bewegung eines Teilchens in einem flüssigen Medium
leicht identifiziert werden, nämlich
die Gesamtbewegung von Teilchen in einem flüssigen Medium als Ergebnis
einer Gesamtbewegung des flüssigen
Mediums selbst, und die Bewegung der Teilchen relativ zu dem umgebenden flüssigen Medium,
wobei das Medium als im wesentlichen stationär betrachtet werden kann. Natürlich treten bei
den praktischen Anwendungen, welche das Beeinflussen von Teilchen
in einem flüssigen
Medium beinhalten, beide Bewegungsarten auf.
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In
den letzten Jahren gab es bei der Nutzbarmachung des physikalischen
Phänomens,
das als Dielektrophorese bekannt ist, große Fortschritte, um nützliche
Wirkungen der Teilchenbeeinflussung hervorzurufen. Beispielsweise
wird auf Veröffentlichungen
von Markx et al., Dielectrophoretic Characterisation and Separation of
Microorganisms, Microbiology (1994), 140, Seiten 585-591, und Pethig,
Dielectrophoresis: Using Inhomogenous AC Electrical Fields to Separate
and Manipulate Cells, Critical Review in Biotechnology, 16(4), Seiten 331-348
(1996), Bezug genommen. Wie aus den ausführlichen Literaturlisten in
diesen beiden Veröffentlichungen
ersichtlich ist, gab es auf dem Gebiet der Anwendung der Dielektrophorese
viel Aktivität.
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Auch
die Patentliteratur enthält
Beschreibungen über
dielektrophoretische Trennmethoden sowie verallgemeinerte Methoden
zur Teilchenbeeinflussung unter Anwendung der Dielektrophorese.
In diesem Zusammenhang wird auf die Internationalen Veröffentlichungen
WO 91/11262, WO 93/16383, WO 94/22583, WO 97/34689 und die US-A-5454472
Bezug genommen.
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Wir
haben nun gefunden, daß bei
der Beeinflussung von Teilchen deutliche Vorteile erreicht werden können, wenn
eine Kombination von dielektrophoretischen Methoden der Beeinflussung
von Teilchen mit einer Beeinflussung durch Ultraschall angewandt
wird.
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Eine
solche Kombination wurde in einem begrenzten Umfang im USSR-Urheberzertifikat
Nr. 744285 von Fomchenkov und Miroshnikov beschrieben, wobei eine
zylindrische dielektrophoretische Kammer von einem koaxialen Ultraschallkopf
umgeben ist sowie ein Ultraschallsignal und ein dielektrophoretisches
Signal mit der gleichen Frequenz in der gleichen radialen Richtung
und mit synchronisierten Phasen zugeführt werden. Der Durchmesser
der zylindrischen Kammer übersteigt
nicht die Länge
der Ultraschallwelle.
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Es
wird angegeben: "Die
geometrischen Dimensionen des Ultraschallstrahlers 8 werden
derart gewählt,
daß an
dem Ort, wo die Kammer angeordnet ist, eine stehende Welle erzeugt
wird, deren Schwingungsfrequenz über
den gesamten Querschnitt der Kammer entlang des Radius in der Richtung
zu der axialen Elektrode hin oder von ihr weg gerichtet ist. Auf
diese Weise übersteigt
der Durchmesser der Kammer nicht die Länge der Ultraschallwelle". Dann wird angegeben: "Die Schwingungsfrequenzen
der Quellen 16 und 17 werden derart gewählt, daß sie gleich
sind, und ihre Phasen werde unter Einsatz eines Synchronisators 18 synchronisiert". Die Quellen 16 und 17 beziehen
sich auf die Signalquellen für
den Ultraschall und die Dielektrophorese, und die für sowohl
den Ultraschall als auch für
die Dielektrophorese benutzten Signale selbst liegen bei der gleichen
Frequenz, wobei ihre Phasen verbunden sind. Der Grund für die Benutzung
der gleichen Frequenz und das Verbinden ihrer Phasen wird später angegeben,
wo auch angegeben ist: "Als
Ergebnis werden die dispergierten Teilchen zuerst durch das elektrische
Feld und dann durch das Ultraschallfeld polarisiert, das ihnen ein
zusätzliches
elektrisches Dipolmoment verleiht, welches durch die Deformation
ihrer elektrischen Doppelschicht hervorgerufen wird. Die Wechselwirkung
des Dipolmoments eines Teilchens mit dem elektrischen Feld führt zu einer
entstehenden Kraft, die im Bereich der maximalen Feldstärke an der
axialen Elektrode 4 ausgerichtet ist".
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Ein
Nachteil einer solchen Anordnung besteht darin, daß die Einschränkungen,
welche dem Ultraschallfrequenzbereich (z. B. 1 bis 6 MHz) durch
die Kammergröße auferlegt
werden, in entsprechender Weise auch das dielektrophoretische Ansprechen
auf einen sehr kleinen Bereich begrenzen. Damit die Dielektrophorese
von praktischem Nutzen ist, wird ein Frequenzbereich benötigt, der
sich von mindestens 1 kHz bis 10 MHz erstreckt.
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Wir
haben nun gefunden, daß ein
solcher Frequenzbereich durch Anwenden des Verfahrens und der Vorrichtung
gemäß der vorliegenden
Erfindung erreicht werden kann.
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Ferner
wird bei Fomchenkov ein externer Fluidstrom zusätzlich benötigt, um eine Teilchentrennung herbeizuführen. Die
Trennung kann nicht durch Anwenden von Ultraschall und von dielektrophoretischen
Kräften
erzielt werden. Wir haben jetzt gefunden, daß durch Anwenden eines Verfahrens
und einer Vorrichtung gemäß der Erfindung
eine Teilchentrennung ohne den Einsatz eines Fluidstroms erfolgen
kann.
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Allgemein
wird gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zum Beeinflussen von Teilchen zur Verfügung gestellt,
wobei in einer Flüssigkeit
suspendierte Teilchen einer stehenden Ultraschallwelle und einem
variierenden elektrischen Feld, das auf die Teilchen eine dielektrophoretische
Kraft ausüben
kann, unterworfen werden.
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Im
Gegensatz zu der Anordnung von Fomchenkow müssen die relativen Phasen der
zwei Signale nicht gesteuert werden.
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Weiterhin
weist die erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Behandeln von in einer Flüssigkeit
suspendierten Teilchen eine Kammer, eine Einrichtung zum Zuführen von
suspendierten Teilchen in die Kammer und zum Abführen aus dieser heraus, eine
Elektrodenanordnung an mindestens einer Wand der Kammer, eine Einrichtung
zum Anlegen einer elektrischen Wechselspannung an die Elektrodenanordnung,
wodurch in suspendierten Teilchen in der Nähe der Anordnung eine dielektrophoretische
Kraft erzeugt wird, und eine Einrichtung, mit der die Flüssigkeit
in der Kammer einer sich bewegenden stehenden Ultraschallwelle unterworfen
wird, auf.
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Die
Technik der Anwendung von Ultraschall zum Beeinflussen von Teilchen
in einem flüssigen
Medium wurde früher
beschrieben, z. B. in einer Veröffentlichung
von Petersen et al., "Development
of an ultrasonic blood cell separator", IEEE eighth annual conference of the
Engineering in Medicine and Biology Society, 1986, Seiten 154-156.
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Wie
in jener Veröffentlichung
dargestellt wird, ist die Ultraschallkraft auf ein komprimierbares
Teilchen, verursacht durch eine stehende akustische Druckwelle,
durch den Ausdruck
gegeben.
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Die
dielektrophoretische (DEP) Kraft, welche auf ein Teilchen ausgeübt wird,
wie sie in der oben angegebenen Veröffentlichung von Markx et al.
auf Seite 585 aufgeführt
wird, ist durch den Ausdruck
gegeben.
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Die
Erklärung
der Bedeutungen der in diesen beiden Gleichungen verwendeten Symbole
wird in den entsprechenden Veröffentlichungen
angegeben. In den zwei oben aufgeführten Gleichungen ist zu erkennen, daß, wie durch
die Äquivalenzen
zum Ausdruck gebracht wird, die Kraft direkt von der dritten Potenz
des Radius des Teilchens abhängt,
wobei alles andere gleich ist. Mit anderen Worten, die Kraft hängt vom
Teilchenvolumen ab.
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Es
ist klar, daß durch
Anpassen der Bedingungen, d. h. durch Variieren der Parameter des
Ultraschalls und durch Variieren des angelegten elektrischen Felds,
die willkürlichen
Konstanten a und b gleichgemacht werden können, d. h. die auf ein Teilchen
wirkende dielektrophoretische Kraft kann bezüglich der auf jenes Teilchen
ausgeübten
Ultraschallkraft größer, gleich
oder kleiner eingestellt werden. Da die beiden Kräfte vom
Teilchenvolumen abhängen,
beeinflussen Veränderungen
im Volumen nicht die Fähigkeit,
einen Ausgleich der Ultraschallkraft und der dielektrophoretischen
Kraft herbeizuführen
oder diese Größen derart
einzustellen, daß die
eine die andere übersteigt.
Dementsprechend wird die Fähigkeit,
die Teilchen zu beeinflussen, in wirksamer Weise von ihrem Volumen
unabhängig,
und dies ermöglicht
es, wesentlich verbesserte Einflußnahmen durchzuführen. Insbesondere
hat die relative Größe der Teilchen
keine Wirkung auf ihre Fähigkeit,
unter Anwendung von Techniken getrennt zu werden, welche die kombinierte
Anwendung von Ultraschallkraft und dielektrophoretischer Kraft auf
die Teilchen beinhalten.
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Bei
der praktischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die
dielektrophoretische Kraft und die Ultraschallkraft gleichzeitig
angewandt werden. Jedoch können
sie auch nacheinander ausgeübt werden,
um eine geeignete Bewegung der Teilchen sicherzustellen. Insbesondere
kann eine Ultraschallbestrahlung in Abwesenheit einer auf die Teilchen
ausgeübten
dielektrophoretischen Kraft benutzt werden, um Teilchen in Suspension
in einem flüssigen
Medium in einer gewünschten
Weise zu bewegen. Gemäß einem besonders
wertvollen Verfahren der Erfindung wird zuerst eine Ultraschallbestrahlung
durchgeführt,
um zu beeinflussende Teilchen aus einem ersten flüssigen Medium,
in dem sie suspendiert sind, in ein zweites flüssiges Medium zu bewegen, wobei
die Leitfähigkeit,
die dielektrische Permittivität,
der pH-Wert und andere physikochemische Eigenschaften des zweiten
flüssigen
Mediums geeignet sind, die Erzeugung einer geeigneten dielektrischen
Kraft auf die einzelnen Teilchen zu ermöglichen. Dies ist besonders
wertvoll in Verbindung mit Trennverfahren, bei denen die Dielektrophorese
angewandt wird, da dies eine Alternative zur üblicherweise angewandten Zentrifugierung
der Teilchen darstellt, so daß sie
aus der ersten suspendierenden Flüssigkeit entfernt und dann
in einer zweiten bekannten Flüssigkeit
erneut dispergiert werden, die normalerweise Eigenschaften, wie
eine ausgewählte
Leitfähigkeit,
aufweist, um die dielektrophoretische Trennung zu unterstützen.
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In
gleicher Weise können
Teilchen, die einer dielektrophoretischen Trennung unterworfen worden
sind, z. B. gemäß einigen
der oben angegebenen Techniken des Standes der Technik, einem Ultraschall
ausgesetzt werden, um die Teilchen in wirksamer Weise zusammen zu
konzentrieren oder sie sogar aus dem flüssigen Medium auszusedimentieren,
in dem sie während
der dielektrophoretischen Trennung suspendiert worden sind. Dieses
Konzentrationsverfahren kann benutzt werden, um die Leistungsfähigkeit
der praktischen Trennvorrichtung zu erhöhen.
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Wie
in dem oben angegebenen extensiven Stand der Technik zur dielektrophoretischen
Beeinflussung angegeben ist, müssen
die Teilchen in großer
Nähe zu
Elektrodenanordnungen, welche ein elektrisches Feld erzeugen, angeordnet
werden, um angemessene dielektrophoretische Kräfte hervorzurufen. Üblicherweise wird
dies oft einfach durch die Ausnutzung der Schwerkraft erreicht,
um es Teilchen in Suspension zu ermögliche, sich neben den Elektrodenoberflächen anzusammeln.
Dies kann aber eine wesentliche Zeit in Anspruch nehmen, insbesondere
dann, wenn die relativen Dichten der Teilchen und die suspendierenden
Flüssigkeiten einander
sehr nahe stehen. Wir haben gefunden, daß durch Anwenden der Ultra schallbeeinflussung
Teilchen, welche in einer Flüssigkeit
suspendiert sind, rasch in eine große Nähe zu einer geeigneten Elektrodenanordnung
bewegt werden können.
Durch Anwendung einer sich bewegenden stehenden Ultraschallwelle
ist es auch möglich,
Teilchen durch eine Elektrodenanordnung hindurch zu bewegen.
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Bei
der praktischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Vorrichtung
benutzt, die derart konstruiert und ausgebildet ist, daß sie es
den Teilchen ermöglicht,
sowohl einer Ultraschallkraft als auch einer dielektrophoretischen
Kraft unterworfen zu werden. Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung
zum Behandeln von Teilchen bereit, die in einem flüssigen Medium
suspendiert sind, wobei die Vorrichtung eine Kammer, eine Einrichtung
zum Zuführen
von suspendierten Teilchen in die Kammer und zum Abführen aus
dieser heraus, eine Elektrodenanordnung an mindestens einer Wand
der Kammer, eine Einrichtung zum Anlegen einer elektrischen Wechselspannung
an die Elektrodenanordnung, wodurch in suspendierten Teilchen in
der Nähe
der Anordnung eine dielektrophoretische Kraft erzeugt wird, und
eine Einrichtung, mit der die Flüssigkeit
in der Kammer einer sich bewegenden stehenden Ultraschallwelle unterworfen
wird, aufweist.
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Mit
einer in geeigneter Weise dimensionierten Behandlungskammer, d.
h. einer Kammer, die relativ zur Wellenlänge des angewandten Ultraschalls
niedrig ist, ist es möglich,
Teilchen zu den Wänden
der Kammer hin, an denen Elektrodenstrukturen angeordnet sind, wandern
zu lassen. Somit kann gemäß einer
typischen Anwendung ein Volumen einer Flüssigkeit, die Teilchen in Suspension
enthält,
welche nach geeigneten Kriterien getrennt werden müssen, in
eine Kammer eingeführt
werden und die Kammer dann einem Ultraschall ausgesetzt werden,
um die Teilchen zu den Kammerwänden
zu bewegen. Sodann können
die Teilchen an den Wänden,
welche Elektrodenanordnungen tragen, unter Anwendung einer Kombination
aus Ultraschallkräften und
dielektrophoretischen Kräften,
welche auf die Teilchen einwirken, getrennt werden.
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Bei
einer derartigen Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann im Vergleich
zur Benutzung der dielektrophoretischen Trennverfahren allein eine
wesentliche Trennleistung erreicht werden. Insbesondere können bei
Anwendung der kombinierten Ultraschallkräfte und der dielektrophoretischen
Kräfte
Teilchen auf der Basis sowohl ihrer mechanischen als auch ihrer
dielektrischen Eigenschaften getrennt werden. Da sowohl Ultraschallkräfte als
auch dielektrophoretische Kräfte
genau gesteuert werden können,
ist eine bessere Steuerung der Teilchentrennung möglich, verglichen
mit der Anwendung eines Fluidstroms.
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Die
dielektrophoretischen Kräfte
liegen. naturgemäß bezüglich ihrer
Wirkung in einem engen Bereich. Somit muß entweder eine deutliche Zeit
zugestanden werden, um den Teilchen ein Sedimentieren an den Elektroden
zu ermöglichen,
oder die Vorrichtung muß derart
ausgebildet sein, daß sich
die Teilchen innerhalb einer kurzen Entfernung von den Elektroden,
normalerweise in einer Entfernung von nicht mehr als 300 μm, insbesondere
von nicht mehr als 100 μm,
befinden. Der Ultraschall kann benutzt werden, um die Zellen rasch
an die Elektroden an den Kammerwänden
zu bewegen, um nachfolgend eine wirksame dielektrophoretische Trennung
zu erleichtern. Unter den Bedingungen, bei denen die Kammerhöhe in der
Größenordnung
der Wellenlänge
der Schallwelle ist, beginnen Zellen sich zu den Wänden der
Kammer hin zu bewegen (die genauen Dimensionen hängen von der Art und Weise,
in welcher der Ultraschall angewandt wird, und auch von den akustischen Eigenschaften
der Kammerwände
ab). Die Wellenlänge
des Ultraschalls in Wasser bei 20 °C, und zwar für einen
Ultraschallfrequenzbereich von 500 kHz bis 10 MHz, liegt bei etwa
150 bis 3000 Mikron. Somit kann die Dielektrophoresekammer in einer
Größenordnung
liegen, welche eine Kammer übersteigt,
die keinen. Ultraschall benutzt.
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Die
Erfindung wird beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
erläutert.
Darin zeigen:
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1 eine
einfache Trennvorrichtung;
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2 und 3 Fotografien,
die durch die Elektrodenanordnung hindurch aufgenommen wurden und die
Teilchenverteilung um die Elektroden herum aufzeigen;
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4a und 4b eine
alternative Trennzelle;
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4c die
Verbindung der Elektroden;
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4d die
Teilchenbewegung;
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4e schematisch
ein vollständiges
Trennsystem; und
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5 DEP-Spektren
der Teilchen.
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Unter
Bezugnahme auf 1 wird darin schematisch eine
Trenneinheit gezeigt, die im wesentlichen. aus einer zentralen Trennkammer 1 besteht,
die eine Flüssigkeitsverbindung
mit einer Eingabekammer 2 und einer Ausgabekammer 3 aufweist,
welche mit zwei Probenausgabeöffnungen 4 und 5 versehen
ist. An jedem Ende der Kammer 1 sind Ultraschallköpfe 10, 11 angeordnet,
und ebenso befinden sich zwei Ultraschallköpfe 12 und 13 an
jedem Ende der Eingabekammer 2, die bezüglich der Kammer 1 quer
angebracht ist.
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An
den Wänden
der Kammer 1 befindet sich eine Anordnung aus zinnenartigen
Elektroden mit einer geeigneten Größe und einem geeignetem Abstand,
um zu ermöglichen,
daß dielektrophoretische
Kräfte
auf Teilchen innerhalb der Kammer 1 einwirken, wenn geeignete
elektrische Wechselspannungen an die Elektroden angelegt werden.
Die Elektrodenanordnung wird schematisch in vergrößertem Maßstab bei 20 in 1 dargestellt.
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Der
Einfachheit halber sind die Einrichtung zum Zuführen einer Flüssigkeit
mit darin suspendierten Teilchen zu der Eingabekammer 2,
durch die Trennkammer 1 und dann durch die Ausgabekammer 3 weggelassen.
Dies gilt auch für
die elektrischen Verbindungen, welche nötig sind, um die Ultraschallköpfe zu betreiben
und die Wechselspannungen an die bei 20 dargestellte Elektrodenanordnung
anzulegen. Auch ist in der Darstellung eine Einrichtung zum selektiven Öffnen der
Auslässe 4 und 5 aus
der Auslaßkammer 3 nicht
dargestellt.
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Beim
Gebrauch der Vorrichtung wird eine Flüssigkeitsprobe, welche suspendierte
Teilchen enthält,
in der Kammer 2 angeordnet. Durch Zuführen geeigneter Signale zu
den Ultraschallköpfen 12 und 13 kann
innerhalb des Flüssigkeitsvolumens
in der Kammer 2 eine stehende Welle mit Ultraschallfrequenz
erzeugt werden. Diese stehende Welle veranlaßt die Teilchen, sich entweder
in Bereiche mit einem geringen Ultraschalldruck oder in Bereiche
mit einem hohen Ultraschalldruck zu bewegen, und zwar in Abhängigkeit
ihrer relativen akustischen Eigenschaften. Dementsprechend bringt
die stehende Welle die Teilchen dazu, sich in Bändern gruppenweise anzusammeln.
Wenn die einzelnen Teilchen einmal in Gruppen vorliegen, können sie als
größere Gruppenteilchen
betrachtet werden, die leichter sedimentieren und leichter kontrolliert
werden können. Sie
können
dann auf eine gesteuerte Art und weise durch Sedimentieren aus der
suspendierenden Flüssigkeit in
die Kammer 2 bewegt und in der Flüssigkeit der Kammer 1 erneut
suspendiert werden. Vor irgend einer Trennung füllt eine Flüssigkeit alle Kammern 1, 2 und 3 sowie
die Ausgabepunkte 4, 5.
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Wenn
die Ultraschallköpfe 10 und 11 in
die Trennkammer 1 einmal eingeführt worden sind, werden sie mit
einem geeigneten Signal betrieben, um eine stehende Ultraschallwelle
zu erzeugen, die sich entlang der Kammerlänge von links nach rechts bewegt.
Unter der Annahme, daß die
senkrechte Abmessung (wie in 1 dargestellt
ist) der Kammer 1 im Bereich der Wellenlänge des
durch die Ultraschallköpfe 10 und 11 erzeugten
Ultraschalls liegt, werden die Teilchen zu den Wänden der Kammer 1 hin
getrieben, an denen die Elektrodenanordnung 20 angeordnet
ist. Durch Zuführen
von elektrischen Signalen mit einer geeigneten Frequenz und einer
geeigneten Amplitude zu der Elektrodenanordnung 20 sowie
durch Einstellen der auf die Ultraschallköpfe 10 und 11 einwirkenden
Signale ist es möglich,
die Teilchen in der Nähe
der Elektrodenanordnung sowohl einer dielektrophoretischen Kraft
als auch einer auf dem Ultraschallweg erzeugten Kraft auszusetzen. Insbesondere
können
in einer sich bewegenden stehenden Ultraschallwelle Teilchen mit
speziellen Eigenschaften an der Elektrodenanordnung gehalten werden,
während
andere Teilchen, welche jene Eigenschaften nicht aufweisen, entlang
der Kammer 1 von der Eingabekammer 2 weg und zur
Ausgabekammer 3 hin bewegt werden.
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Beim
Erreichen des Endes der Kammer 1 stoßen die Teilchen auf eine Sperre,
welche sie daran hindert, sich weiterzubewegen. Diese Sperre kann
aus einem dünnen
Material bestehen und ähnliche
akustische Eigenschaften aufweisen wie jene des suspendierenden
Mediums (um so eine nur minimale Unterbrechung des Ultraschallfelds
zu erreichen), z. B. in Form eines angepaßten dünnen Mikroskop-Deckplättchens
vorliegen. Die Teilchen beginnen dann damit, sich zu den Sammelöffnungen 4 und 5 hin
zu sedimentieren. Zwischen den Sammelöffnungen 4 und 5 sowie
der Hauptkammer 1 befindet sich ein Schaltventilsystem
in Form einer Klappe. Diese führt
die Teilchen zum Sammeln entweder zu der Öffnung 4 oder der Öffnung 5.
Im vorliegenden Fall werden die Teilchen zu der Öffnung 4 geführt.
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Anschließend wird
die Ausgabeöffnung 4 geschlossen
und die Ausgabeöffnung 5 geöffnet, und
die an die Ultraschallköpfe 10 und 11 sowie
die Elektrodenanordnung 20 geführten Signale können verändert werden, um
die vorher festgehaltenen Teilchen freizugeben und dementsprechend
es zu ermöglichen,
daß sie
aus der Öffnung 5 heraus
gesammelt werden. wenn somit an den Öffnungen 4 und 5 geeignete
Sammelbehälter,
wie kleine Flaschen, angeordnet werden, sedimentieren die Teilchen
in diese hinein. Teilchen einer Art sedimentieren an der Öffnung 4 und
Teilchen einer davon verschiedenen Art sedimentieren an der Öffnung 5.
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Beim
Einsatz einer geeignet programmierten Steuerung kann die in 1 gezeigte
Vorrichtung schrittweise verwendet werden, um eine Anzahl von Flüssigkeitsansätzen zu
behandeln, von denen jede beide Arten von Teilchen enthält, um zwei
Behälter
bereitzustellen, von denen einer eine gewünschte Teilchenart oder gewünschte Teilchenarten
und der andere die ungewünschten
Teilchenarten enthält.
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In
den 2 und 3 sind Fotografien dargestellt,
welche die Elektrodenanordnung 20 zeigen, wobei in jedem
Fall gerade vier einzeln zinnenartig ausgebildete Elektrodnstreifen
dargestellt werden. In den Fotografien wurde die Beleuchtung so
eingestellt, daß die
Anwesenheit von Hefezellen als blaßgraue Bereiche gegenüber dem
klaren Flüssigkeitshintergrund
und zwischen den dunkler grauen zinnenförmigen Elektroden ersichtlich
ist.
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2 zeigt
eine Stufe in dem Verfahren, bei dem eine Probe der suspendierten
Hefezellen, einige lebend und einige tot, in die Kammer eingeführt und
sowohl Ultraschallkräften
als auch dielektrophoretischen Kräften ausgesetzt worden ist.
Wie klar ersichtlich ist, besteht die Wirkung des Ultraschalls darin,
die Zellen in Bändern
parallel zur Längserstreckung
der zinnenförmigen
Elektroden zu gruppieren. Wenn die Zellen sich einmal in diesen
Bändern
befinden, werden sie dielektrophoretischen Kräften ausgesetzt, die derart
eingestellt werden können,
daß sich
die Zellen in einer Weise bewegen, daß sie durch die Anordnung gehalten
werden. Im Beispiel gemäß 2 ist
die an die Elektroden angelegte elektrische Wechselspannung eine
Spannung von drei Volt, die mit einer Frequenz von 500 kHz in einem
Medium mit einer Leitfähigkeit
von 50 μS/cm
swingt. Wie ersichtlich ist, konzentrieren sich die grauen Bänder der
Zellen zwischen den zinnenförmigen
Elektroden und werden durch positive DEP-Kräfte gehalten.
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Nach
einem geeigneten Zeitraum, z. B. 1-20 Sekunden, wird die an die
Elektrodenanordnung 20 angelegte Wechselspannung in eine
Spannung abgeändert,
die beispielsweise zwölf
Volt von Peak zu Peak und eine Frequenz von sechs MHz aufweist.
Dies bewirkt, daß lebende
Hefezellen bezüglich
der Elektrodenanordnung viel stärker
stationär
gehalten werden, als tote Hefezellen. Durch geeignetes Betreiben
der Ultraschallköpfe 10 und 11 am
Ende der Kammer 1 kann die stehende Ultraschallwelle veranlaßt werden,
sich von der Kammer 2 weg und zur Kammer 3 hin
zu bewegen, wobei tote Hefezellen entlang der Kammer mitgenommen werden.
Diese Zellen gelangen dementsprechend in die Kammer 3 und
können
entfernt werden. Inzwischen werden die lebenden Hefezellen in der
Elektrodenanordnung gehalten, von wo aus sie, wenn es erwünscht ist, abgenommen
werden können,
und zwar durch ändern
der an die Elektrodenanordnung angelegten Spannung und der Frequenz.
Anschließend
können
sie in der gleichen Weise an der Ausgabekammer 3 gesammelt
werden.
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3 zeigt
das "Ziehen" durch den Ultraschall
und das Bewegen der Zellen, die durch die Elektroden mit Hilfe positiver
DEP-Kräfte
gehalten werden, wie dargestellt ist. Dies zeigt klar das Niveau
der Steuerung, die durch Benutzen der Ultraschallkraft und der dielektrophoretischen
Kraft in Kombination erreichbar ist, wobei durch eine starke positive
DEP-Kraft gehaltene Teilchen durch marginal differierende Werte
unterschieden und getrennt werden können. Dieses Steuerungsniveau
ist nicht nur erwünscht,
sondern findet eine breite Anwendung.
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Die
vorstehende Erläuterung
zeigt, wie die Vorrichtung gemäß 1 benutzt
werden kann, um eine Trennung von Teilchen innerhalb eines Ansatzes
einer Flüssigkeit,
der in die Kammer 2 eingeführt worden ist, zu bewirken.
Bei einer alternativen Lösung
kann eine Menge von in Suspension befindlichen Teilchen aus der Kammer 2 in
die Kammer 1 überführt und
z. B. durch Ultraschallsedimentation und Bewegung zu dem Elektrodenbereich
gebracht werden. Die Teilchen in flüssiger Suspension können dann
entlang der Kammer 1 rückwärts und
vorwärts
bewegt werden, wobei stehende Ultraschallwellen benutzt werden,
welche durch die Ultraschallköpfe 10 und 11 erzeugt
worden sind. Dies kann in Verbindung mit dem Abgeben eines geeigneten
Signals an die Elektrodenanordnung 20 ermöglichen,
daß Teilchen
selektiv gehalten werden, wenn sich die fortschreitende Welle in
eine Richtung bewegt, und freigegeben werden, wenn sie sich in die
andere Richtung bewegt. Somit können
eine Teilchenart zu dem einen Ende der Kammer 1 hin und
andere Teilchenarten zu dem anderen Ende der Kammer 1 hin
bewegt werden. Wenn die Teilchen aus der Kammer 2 irgendwo
in den Mittelabschnitt der Kammer 1 eingeführt werden,
kann die Vorrichtung kontinuierlich mit zwei getrennten Teilchenströmen betrieben
werden, die an Stellen beider Enden der Kammer 1 gesammelt
werden. Alternativ kann dieses Verfahren auch durch Einführen von
Teilchen mittels eines Fluidstroms in die Kammer 1 durchgeführt werden,
wenn die Kammer 2 nicht benötigt wird. Dies kann dann vorteilhaft
sein, wenn die Teilchen z. B. in einem Medium mit der gewünschten
Leitfähigkeit
schon suspendiert sind und eine erneutes Suspendieren nicht erforderlich
ist.
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Die
Bewegung der stehenden Welle kann durch eine Anzahl bekannter elektronischer
Techniken erreicht werden, z. B. durch Phasenablenkung, Frequenzablenkung
oder Frequenzverschiebung der relativen Signale, die an die Ultraschallköpfe 10 und 11 geführt werden,
oder alternativ mechanisch durch Ändern der Kammerabmessungen.
In ähnlicher
Weise kann die stehende Ultraschallwelle durch einen einzigen Ultraschallkopf
und einen Reflektor oder durch zwei oder mehr Köpfe erzeugt werden.
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Bei
einer Abwandlung für
den Einsatz bei zerbrechlichen Teilchen, wie Blutzellen, oder in
Fällen,
in denen das Minimieren des Einfangens und/oder des Haftens von
Teilchen an den Kammerwänden
und/oder den Elektroden kritisch ist, kann der Ultraschall benutzt
werden, um die Teilchen zur Mitte der Kammer hin statt zu den Kammerwänden hin
zu bewegen. In diesem Fall kann entweder eine höhere Ultraschallfrequenz (für eine Kammer
mit unveränderten
Abmessungen) oder eine größere Kammerhöhe verwendet
werden, um dieses Ziel zu erreichen. Unter diesen Umständen, bei
denen Teilchen zur Mitte der Kammer hin gerichtet sind, ist es vorteilhaft,
die Modulation der Kammerwände
zu minimieren. Somit kann die Kammer vorzugsweise aus einem Material
mit einem niedrigen Young-Modul,
wie einem Weichkunststoff, hergestellt sein.
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Umgekehrt
ist es dann, wenn sich die Teilchen zu den Kammerwänden hin
bewegt werden, günstig, die
Modulation der Wände
zu maximieren. Die Kammer besteht vorzugsweise aus einem Material
mit einem hohen Young-Modul, wie Glas.
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Es
wurde gefunden, daß eine
Vibration der Kammerwände
zusätzlich
helfen kann, das Haften von Teilchen an den Kammerwänden zu
minimieren. Die Kammerwände
können
zu diesem Zweck in Schwingung versetzt werden, und zwar entweder
unter Verwendung der zum Erzeugen der stehenden Welle in der Kammer eingesetzten
Ultraschallköpfe,
unter Verwendung eines externen Ultraschallkopfes oder durch Herstellen
der Wände
der Kammer aus einem piezoelektrischen Material.
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Die
Vibration der Kammerwände
kann auch günstig
sein, nachdem eine Abtrennung beendet ist, wobei ein sehr energiereicher
Ultraschall zum Zerstören
und/oder Abbauen und/oder Auflösen
der in der Mitte der Kammer und/oder an den Kammerwänden zurückgelassenen
Teilchen angewandt werden kann. Auf diese Weise kann eine Ultraschallreinigung
und/oder -sterilisierung der Kammer nach dem dielektrophoretischen Trennen
erreicht werden.
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Es
können
eine oder mehrere dieser Varianten in Kombination derart Anwendung
finden, daß z.
B. die Ultraschallfrequenz verändert
wird, wobei eine Abtrennung der Teilchen stattfindet, die hauptsächlich in
der Mitte der Kammer gebildet und durch den Ultraschall bewegt worden
sind, gefolgt von einer zweiten Abtrennung bezüglich der Teilchen, die hauptsächlich an
den Kammerwänden
gebildet und dort durch die stehende Ultraschallwelle bewegt werden.
Für komplexe
Trennungen ist die Anwendung einer oder mehrerer Varianten günstig.
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Es
wurde gefunden, daß ein
Erhitzen ein beträchtliches
Problem mit sich bringt, wenn Ultraschall angewandt wird. Dies ist
hauptsächlich
auf die akustische Impedanz von wirksamen piezoelektrischen Ultraschallköpfen, wie
PZT, zurückzuführen, die
von der akustischen Impedanz des Fortpflanzungsmediums, in dem die
Teilchen suspendiert sind, z. B. Wasser, sehr verschieden ist. Dies
führt zu
einer fehlenden Übereinstimmung
an der Grenzfläche,
wobei eine beträchtliche
Energiemenge zurückreflektiert
und als Wärme
verbraucht wird.
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Die
akustische Impedanz kann als ein Analogon der elektrischen Impedanz
betrachtet werden. Somit können
die Grundsätze
des Anpassens der Impedanz der Radiofrequenz angewandt werden, wie
bekannt ist. Unter Anwendung dieser Grundsätze wurde berechnet, daß eine Größenordnung
von 92% der durch einen PZT-Kopf übertragenen Energie an der
Wassergrenzfläche
zurückreflektiert
und als Wärme
verbraucht wird. Unter Anwendung der Zwischichteninpedanzanpassung,
beim Verbinden eines Viertelwellenabschnitts (λ/4) aus Aluminium mit der Vorderseite
eines PZT-Kopfes und Verbinden eines λ/4-Abschnitts aus PMMA mit der Oberseite
davon, kann die Situation beträchtlich
verbessert werden, wobei λ die
Wellenlänge
bedeutet. Die Wahl, Aluminium einzusetzen, erfolgt deshalb, weil
seine akustische Impedanz zwischen jener im Fall von PZT und im
Fall von Wasser liegt, und Polymethylmethacrylat (PMMA) wird verwendet,
weil sie zwischen jener von Aluminium und Wasser liegt. Somit ist
die Impedanz des Aluminiums dem PZT, das PMMA dem Aluminium und
dann das PMMA dem Wasser angepaßt.
Dieser Grund für
die λ/4-Dicke
oder das ungerade Vielfache von z. B. λ/4, 3 λ/4, 5 λ/4 usw. ist: gut bekannt.
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Es
wurde gefunden, daß die
Zweischichtenimpedanzanpassung unter Einsatz von Aluminium und PMMA
die Sache wesentlich verbessert, wobei nun etwa 92 % der Energie übertragen
werden. Somit wurde die Leistungsfähigkeit beträchtlich
verbessert und das Erhitzen minimiert. Anstelle von Aluminium und
PMMA können
für diesen
Zweck alternative Materialien eingesetzt werden. Auch können zusätzliche
Anpassungsschichten benutzt werden, um die Leistungsfähigkeit
weiter zu erhöhen.
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Durch
eine mathematische Behandlung eines Modells der Schallwellen innerhalb
der Kammer wurde gefunden, daß die
Anwendung der Impedanzanpassung zusätzliche Vorteile bietet, nicht
nur den Vorteil des minimierten Erhitzens. Eine Schallwelle, die
entlang einer Kammer fortschreitet, bewegt sich sowohl in der Zeit als
auch im Raum. Beim Erreichen des Kammerendes wird sie reflektiert
und bewegt sich somit zurück
entlang der Kammer in der Richtung, aus der sie kam. Sie überlagert
sich dann konstruktiv und destruktiv mit der nach außen laufenden
Welle. Wenn über
die Zeit gemittelt wird, erzeugt sie das, was als eine stehende
Welle bekannt ist. Aus diesem Grund können die Kammern 1 und 2 gemäß der 1 alternativ
jeweils mit einem einzigen Ultraschallkopf und einem Reflektor ausgerüstet sein.
Zwei gegenüberliegende
Köpfte
sind nicht erforderlich, aber bevorzugt. Wenn zwei gegenüberliegende
Ultraschallköpfe
verwendet werden, sind die Reflexionen an den Enden der Kammer nachteilig.
Aus der Modellbildung dieser Effekte wurde gefunden, daß beim Anwenden
der Phasenablenkung zum Bewegen der stehenden Welle, wenn die Phase über einen
Zyklus (d. h. 0 bis 360 Grad) verändert wurde, die Amplitude
der stehenden Welle deutlich verändert
wurde. Dies war ein Ergebnis der Reflexionen zweiter, dritter, vierter
usw. Ordnung von der Vorderseite des gegenüberliegenden Ultraschallkopfes,
die sich mit den primär
ausgesandten wellen überlagerten.
Bei Anwendung der Impedanzanpassung an der Vorderseite der Ultraschallköpfe (wie
schon erläutert)
werden diese sekundären
Reflexionen minimiert. Das Ergebnis ist, daß die Amplitude der stehenden
Welle während
eines Zyklus relativ konstant bleibt, wobei deutliche Verbesserungen
des Niveaus der Steuerung der Teilchen erreicht werden.
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Die
Anwendung der Impedanzanpassung für Trennungen mit einer Kombination
aus Ultraschall und Dielektrophorese ist deshalb bevorzugt. Die
Vorteile des Einsatzes der Impedanzanpassung beziehen sich nicht
nur auf die Phasenablenkung, sondern auch auf alle anderen Methoden
der elektrischen und der mechanischen Steuerung der stehenden Welle
und auf die Fälle
der Benutzung eines oder mehrerer Ultraschallköpfe.
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Unter
Bezugnahme auf 1 kann als Abwandlung eine vertikale
Kammer anstelle der Kammer 2, also nicht die im allgemeinen
bevorzugte horizontal angebrachte Kammer, benutzt werden. Die Verwendung einer
vertikalen Kammer führt
normalerweise dazu, daß die
Teilchen sich über
größere Entfernungen
bewegen müssen.
Es wurde gefunden, daß dann,
wenn sich Bänder
von Teilchen über
größere Entfernungen
bewegen, ein Aufbrechen dieser Bänder
leichter geschieht, wobei die Leistungsfähigkeiten der Sedimentation
bewirkt werden.
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Die
Sedimentation in der Kammer 2 kann entweder durch Benutzen
einer sich bewegenden stehenden Welle, durch eine Kombination einer
sich bewegenden stehenden Welle und einer stationären stehenden
Welle oder durch Pulsieren der den Ultraschallköpfen 12, 13 zugeführten Signale
erreicht werden. Das Pulsieren der Signale führt dazu, daß die stehende
Welle vorübergehend
beseitigt wird, wobei die Teilchen sedimentieren, sich aber auch
von ihren Bändern
aus verteilen. Das Verfahren des Anwendens der stehenden Welle,
des vorübergehenden
Entfernens derselben und dann das erneute Ausbilden (d. h. das Ergebnis
des Pulsieren des Signals) erlaubt es, daß die Teilchen in einer gesteuerten
Art und Weise sedimentieren.
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Es
ist bevorzugt, daß die
Kammer im Querschnitt kreisförmig
ist, so daß eine
tonnenförmige
Kammer gebildet wird. Es resultieren eine verbesserte Sedimentationszeit
und eine höhere
Leistungsfähigkeit.
Durch Verwenden eines Bessel-Schallfelds können bevorzugte Bedingungen
weiter verbessert werden. Durch Einstellen des Bereichs des Ultraschallkopfes,
der mit 2/3 des Kammerdurchmessers angeregt wird, und auch (nicht
notwendigerweise, aber in bevorzugter Weise) durch den Durchmesser
des Ultraschallkopfes, der mit dem Dreifachen der Dicke des Kopfes
angeregt wird, wird ein Bessel-Schallfeld erzeugt, das in der Mitte
der Kammer einen maximalen Druck und an der Kammerwand einen minimalen
Druck erzeugt, wie bekannt ist. Dies konzentriert die Teilchen zum
Mittelbereich der Kammer hin und erlaubt eine weiterhin verbesserte
Sedimentation und Steuerung.
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Zusätzlich werden
deutliche Verbesserungen der Leistungsfähigkeit der Sedimentation erreicht,
wenn die Impedanzanpassung erfolgt, wobei die Impedanz des Ultraschallkopfes
an das Suspensionsmedium angepaßt
wird. Dies verbessert die Wirksamkeit der Übertragung der Schallenergie
in die Kammer und vermindert so das Erhitzen. Das Erhitzen beeinträchtigt nicht
nur beispielsweise die Gesamtheit der biologischen Zellen sondern
führt auch
zur Bildung einer regionalen Fluidbewegung innerhalb der Kammer,
die ihrerseits die Bänder
unterbricht und eine deutliche Wirkung auf die Steuerung und die Leistungsfähigkeit
der Sedimentation hat. Durch Anordnen einer dünnen Sperre, z. B. eines Mikroskop-Deckglases
(etwa 0,1 mm dick) an der Vorderseite der Ultraschallköpfe, wobei
ein festgelegtes Flüssigkeitsvolumen
von der Hauptkammer isoliert wird, können die Wirkungen des Erhitzens
und des Unterbrechens der Zellbänder
weiter deutlich vermindert werden. Die Verwendung einer dünnen Sperre,
die ein festgelegtes Flüssigkeitsvolumen
vor den Ultraschallköpfen einschließt, und
ihre Vorteile, gelten in gleicher Weise für die Anwendung bei der Kammer 1,
wo Teilchen getrennt werden, wie in der Kammer 2, wo die
Teilchen sedimentiert und erneut suspendiert werden. Sie wird somit
vorzugsweise in beiden Kammern benutzt.
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Die
obigen Variationen können
einzeln oder in Kombination angewandt werden. Wenn alle kombiniert werden,
wird eine sehr hohe Leistungsfähigkeit
der Sedimentation erreicht. Leistungsfähigkeiten von über 99 %
(Prozentsatz der aus der Suspension entfernten Teilchen) kann bei
besonderen Teilchen und Konzentrationen erreicht werden.
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Alle
oben erwähnten
Beispiele der Anwendung von Ultraschall in Verbindung mit der Dielektrophorese gelten
in gleicher Weise für
statische DEP-Felder (d. h., wo ein stationäres, nicht fortschreitendes
Feld an die Elektroden angelegt wird), wie es auf die Dielektrophorese
mit fortschreitender Welle (travelling wave dielectrophoresis, TWD)
zutrifft, wo fortschreitende Felder benutzt werden. Fortschreitende
Felder werden durch Aufgeben von mehrphasigen Signalen auf benachbarte
Elektroden erzeugt, wie es auf dem Gebiet der Elektrophorese bekannt
ist. Ultraschall kann in Verbindung mit TWD benutzt werden, um eine
Teilchentrennung durchzuführen.
Beispielsweise können
in der 1 die Elektroden 20 der Kammer 1 durch
gerade parallele Elektroden entlang der Kammerlänge ersetzt werden, wobei diese
Elektroden ihrerseits mit einem Mehrphasensignal verbunden sind,
um ein wanderndes Feld zu erzeugen. Die in die Kammer 1 eingeführten Teilchen können dann
durch eine Kombination aus Ultraschallkräften und TWD-Kräften getrennt
werden.
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Die
Teilchen in der Kammer 1 gemäß 1. können auch
durch Anwenden der Grundsätze
der Feldflußfraktionierung
(FFF) in Kombination mit der Dielektrophorese (DEP) getrennt werden.
In diesem Fall wird Ultraschall benutzt, um die Teilchen und nicht
den Gesamtfluidstrom zu transportieren. Der Gesamtfluidstrom und
der Ultraschall können
auch in Kombination mit der Dielektrophorese benutzt werden.
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Veränderungen
in den Eigenschaften des Suspensionsmediums in der Kammer 1 können eine
deutliche Wirkung auf die Teilchentrennungen und die Leistungsfähigkeit
ausüben.
Unter Bezugnahme auf 1 kann es auch dann, wenn eine
Trennung in der Kammer 1 durch Kombination von Ultraschall
und DEP erfolgt, es vorteilhaft sein, einen Fluidstrom einzuführen. Beispielsweise
kann eine kleine Menge eines Fluidstroms entlang der Kammer eingeführt werden,
um die Eigenschaften des suspendierenden Mediums zu stabilisierten.
Wenn die Kammer 2 verwendet wird, um die Teilchen aus einem
unbekannten Suspensionsmedium in der Kammer 1, die ein
bekanntes Medium enthält,
erneut zu suspendieren, kann es leicht geschehen, daß die Teilchen
weitere Elemente mit sich bringen, welche die physikochemischen
Eigenschaften des suspendierenden Mediums verändern, z. B. einen Ionenüberschuß, der die
Leitfähigkeit ändern kann.
Um die diesbezügliche Wirkung
auszugleichen, kann Fluid mit einer bekannten Eigenschaft in die
Kammer 1 eingeführt
werden. Ein Fluidstrom kann auch in die Kammer 1 als eine
zusätzliche
Kraft in Kombination mit dem Ultraschall und der Dielektrophorese
eingeführt
werden.
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Unter
Bezugnahme auf 1 kann ein Fluidstrom, der in
Verbindung mit der Kammer 2 benutzt wird, auch für eine kontinuierliche
Trennung vorteilhaft sein. Dieses Verfahren hat gewisse Vorteile
gegenüber
einem diskontinuierlichen Verfahren, bei dem 10 ml mit suspendierten
Teilchen wiederholt eingeführt,
werden, die Teilchen in der Kammer 1 sedimentieren und
das Fluid entfernt sowie durch eine andere Suspension ersetzt wird.
Für eine
kontinuierliche Trennung kann die Kammer 2 mit dem Fluid
gefüllt
bleiben, und die suspendierten Teilchen können kontinuierlich in diese
Kammer strömen
sowie durch Ultraschall sedimentieren.
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Es
steht eine Anzahl von Optionen zur Verfügung, wenn es erwünscht ist,
Trennungen mit einer Kombination aus Ultraschall und Dielektrophorese
bei den Teilchen durchzuführen,
die zuerst in der Kammermitte gebildet werden, und dann in einer
späteren
Stufe bei den an den Kammerwänden
gebildeten Teilchen durchzuführen
oder umgekehrt. Eine Option besteht darin, die Abmessungen der Kammer
zu ändern.
Es ist aber mehr bevorzugt, die Ultraschallfrequenz zu verändern, um
dies zu erreichen. Die Leistungsfähigkeit des Ultraschallkopfes
kann vermindert werden, was es ermöglichen würde, daß er über einen breiteren Frequenzbereich
verwendet wird. Alternativ kann der Kopf mit der gleichen hohen
Wirksamkeit benutzt werden, aber es werden die Oberschwingungen
des Ultraschallkopfes angeregt. Beispielsweise weist ein 1-MHz-Kopf
normalerweise Oberschwingungen bei gerade über 3 MHz und 5 MHz auf. Der
gleiche Kopf kann bei diesen Frequenzen benutzt werden, was es erlaubt,
Teilchen zur Mitte oder zu den Wänden
der Kammer hin zu bewegen. Es kann auch vorteilhaft sein, zu verschiedenen
Zeitpunkten nicht nur unterschiedliche Frequenzen an die Ultraschallköpfe anzulegen,
sondern auch gleichzeitig ein kombiniertes Frequenzsignal an die
Ultraschallköpfe zu
geben.
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Normalerweise
kann das zu einem der Ultraschallköpfe geführte Signal als Bezugsgröße betrachtet und
das andere Signal variiert werden, d. h. phasen- oder frequenzverschoben
oder frequenzversetzt, relativ hierzu, um die stehende Welle und
somit die Teilchen zu bewegen. Bei einer weiteren Variation können beide Signale
relativ zueinander zur gleichen Zeit verändert werden. Das Ergebnis
ist entweder, daß sich
Teilchen von beiden Enden aus zur Mitte der Kammer hin bewegen (zur
gleichen Zeit), oder daß die
Bewegung der Teilchen von der Mitte aus zu beiden Enden hin erfolgt.
Die gleiche Wirkung kann auch mechanisch erreicht werden. Eine solche
Lösung
kann besonders wertvoll sein, wenn eine Variation der FFF (Feldflußfraktionierung) angewandt
wird.
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4 zeigt eine Vorrichtung auf der Grundlage
von negativen dielektrophoretischen Kräften (DEP-Kräften) zum
Trennen von zwei oder mehr Teilchenarten. 4a zeigt
eine Kammer 30, die normalerweise ein oberes und ein unteres
Glassubstrat aufweist, die sandwichartig angeordnet sind und einen
Mittelspalt von 100-300 Mikron freilassen. Die Kammer ist mit einem
ersten Paar Durchflußöffnungen 32, 34 an
einem Eingabeende und mit einem zweiten Paar Durchflußöffnungen 36, 38 an
einem Ausgabeende ausgerüstet.
An dem Ausgabeende und stromaufwärts
von den Öffnungen 36, 38 sind
an gegenüberliegenden
Seiten der Kammer Ausgabeöffnungen 40, 42 vorgesehen.
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An
jedem Ende der Kammer 30 befindet sich ein Ultraschallkopf 44, 46,
der zum Erzeugen einer stehenden Welle mit Knoten und Bäuchen, welche
durch die dicken Striche 48 dargestellt werden, in der
Kammer betrieben werden kann.
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Die
stehende Welle ist derart ausgebildet, daß sie sich in der Figur von
links nach rechts bewegt.
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Wenn
man eine Teilchensuspension von der Öffnung 32 zu der Öffnung 34 strömen läßt, wie
durch den Pfeil I dargestellt ist, kann die sich bewegende stehende
Welle zwischen den Ultraschallköpfen 44 und 46 die
Teilchen aus dieser Suspension des Querstromfluids entfernen und
sie entlang der Kammer verteilen, wie durch den Pfeil I' gezeigt wird.
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Die 4b zeigt
die DEP-Elektroden 50 in paarweiser Anordnung entlang den
gegenüberliegenden Seiten
der Kammer 30 in Winkeln zur Strömungsrichtung, um eine Fischgrätanordnung
auszubilden. Die Elektroden erstrecken sich in einem Winkel zur
Richtung der Bewegung der Teilchen, verursacht durch das Ultraschallfeld,
mit Ausnahme eines mittleren Streifens, der keine Elektroden aufweist. 4c zeigt,
daß die
Elektroden jedes Paars mit gegenüberliegenden
Seiten einer Wechselstrom-Signalquelle 52 mit Hilfe von
Verbindungselementen 54, 56 verbunden sind. Die
Verbindungselemente bilden ein Spiegelbild entlang der Anordnung,
so daß bei
allen Elektrodenpaaren die stromaufwärtige Elektrode mit dergleichen
Seite der Quelle 52 verbunden ist.
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Der
Spalt zwischen einzelnen Elektrodenpaaren ist deutlich geringer
als zwischen benachbarten Elektrodenpaaren, wie es bei den Elektroden 50 ersichtlich
ist, die in den 4b, 4c und 4d dargestellt ist.
Beispielsweise gibt es 40 μm
breite Elektroden, einen 40-μm-Spalt
zwischen den Elektrodenpaaren und einen 250-μm-Spalt zwischen benachbarten
Paaren. Durch Zuführen
eines Signals mit einer gewünschten Frequenz
wird eine starke (relativ) negative DEP-Kraft in dem Bereich zwischen
den Elektrodenpaaren erzeugt. Jedoch ist zwischen benachbarten Paaren
der Spalt deutlich größer, und
so wird eine sehr viel schwächere
negative DEP-Kraft erzeugt. Das Ergebnis hiervon ist, daß dann,
wenn ein spezielles Teilchen entlang der Kammer wandert, es den
Bereichen zwischen den Elektrodenpaaren als "Wänden" oder sehr starken Sperren
mit negativer DEP begegnet, wodurch es von diesen Bereichen abgestoßen wird.
Bei den Elektroden, die in einem Winkel zur Kammermitte hin geneigt
sind, wird das Teilchen durch die Sperren aus negativer DEP zu diesem
Bereich in der Kammermitte geführt.
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Es
wird angenommen, daß sich
in der Suspension zwei Arten von Teilchen befinden und eine Signalfrequenz
gewählt
wird, bei der ein Teilchen, der Typ S, eine starke negative DEP-Kraft
erfährt,
während
das andere Teilchen des Typs W einer schwachen negativen DEP-Kraft
unterworfen ist. Da sich beide Typen entlang der Kammer 30 und über die
Elektroden 50 hinwegbewegen, werden die Teilchen des Typs
S vorzugsweise zur Mitte der Kammer hin geführt, wie in 4d durch
die Pfeile G dargestellt ist, während
die Teilchen des Typs W sich entlang der Kammer bewegen, da sie
relativ unbeeinflußt
sind. Das Ergebnis ist, daß sich
die Wirkung einer Teilchenkonzentration ergibt.
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Unter
Bezugnahme auf 4b ist zwischen den Öffnungen 40 und 36 auf
der einen Seite der Kammer und zwischen den Öffnungen 42 und 38 an
der anderen Seite ein Paar Winkelsperren 60, 62 angeordnet,
um die Teilchen in der Nähe
der Ränder
der Kammer 30 aus den Öffnungen 40, 42 abzulenken.
Die Sperren bestehen aus einem Material mit einer ähnlichen
akustischen Impedanz wie Wasser, z. B. aus Glas, und sind im Vergleich
zu der Wellenlänge
der Ultraschallwelle dünn,
so daß bei
der sich bewegenden stehenden Welle nur eine minimale Störung eintritt.
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Um
das Entfernen der Teilchen an den Öffnungen 40 und 42 zu
unterstützen,
kann aus diesen Öffnungen
eine kleine Menge an Fluid entnommen werden, wobei an zusätzlichen Öffnungen
stromabwärts
von den Öffnungen 32 und 34 Fluid
eingeführt
wird, um dies auszugleichen (nicht dargestellt). Das Niveau des
für diesen
Zweck verwendeten Fluidstroms ist normalerweise niedrig, damit es
die Trennung in der Kammer 30 nicht beeinflußt. Als
eine Variation können
alternativ TWD-Elektroden (Elektroden für die Dielektrophorese mit
Wanderwelle) benutzt werden, um diese Teilchen an den Öffnungen 40 und 42 abzunehmen,
oder es können
sowohl ein Fluidstrom als auch TWD in Kombination angewandt werden.
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Weiter
stromabwärts
von den Öffnungen 40, 42 wird
ein Querstrom aus Fluid zwischen den Öffnungen 36, 38 eingerichtet,
wie durch den Pfeil O argestellt ist. Teilchen, die entlang des
Ultraschallfeldes wandern, erreichen vor dem Ultraschallkopf 46 eine
Sperre. Sie sind nicht in der Lage, weiterzuwandern, und werden durch
den Fluidquerstrom durch die Öffnung 38 abgeführt. Die
Sperre kann ähnlich
sein wie jene gemäß 60, 62,
beispielsweise kann sie aus einem dünnen Glas oder einem dünnen Polyimidfilm
bestehen und hat normalerweise eine Dicke von 100 μm.
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Somit
wird ein an Teilchen des Typs S angereicherter Strom von dem Strom
der Teilchen des Typs W abgetrennt.
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4e erläutert schematisch
das gesamte Strömungssystem.
Eine Eingabekammer 64 enthält eine Suspension aus den
zu trennenden Teilchen des Typs S sowie des Typs W und ist durch
Leitungen 66, 68 mit den Querstromöffnungen 32, 34 verbunden.
Am Ausgabeende der Kammer 30 befindet sich eine optionale
sekundäre
DEP-Trenn- und Reinigungsstufe 17, die durch eine Leitung 72, 74 mit
den Querstromöffnungen 36, 38 verbunden
ist sowie eine Ausgabeöffnung 76 aufweist.
Wenn eine sekundäre
Trennung nicht nötig
ist, kann die Öffnung 38 eine
direkte Ausgabeöffnung
bilden.
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Die
Anwendung der negativen DEP-Kraft in einem Trennverfahren ist besonders
wirksam, wenn Teilchen mit hoher Konzentration getrennt werden sollen,
z. B. bei einer Konzentration von 100 Millionen Teilchen pro Milliliter
oder mehr, und wenn ein großes
Volumen der Suspension verarbeitet werden soll, normalerweise zig
Milliliter Suspension.
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Unter
Bezugnahme auf 4e ist die Ausstattung besonders
vielseitig insofern, als sie die Durchführung einer kontinuierlichen
Trennung erlaubt. Die Eigenschaften des suspendierenden Mediums
des Querstromfluids zwischen den Öffnungen 32 und 34 können von
jenen der zentralen Kammer 30 verschieden sein. Zusätzlich können auch
die Eigenschaften des suspendierenden Mediums des Querstromfluids
zwischen den Öffnungen 36 und 38 sowohl
von jenen der Kammer 30 als auch von jenen zwischen den Öffnungen 32 und 34 verschieden
sein. Dies ermöglicht
es beispielsweise, daß in
einem unbekannten Fluid suspendierte Teilchen in die Kammer 64 eingeführt werden.
Diese Suspension strömt
dann zwischen den Öffnungen 32 und 34 durch
die Kammer 30. Die Leitfähigkeit und andere physikochemische
Eigenschaften des suspendierenden Mediums in der Kammer 30 werden
derart gewählt,
daß sie
für die
Trennung dieser Teilchen bevorzugt sind. Die Teilchen in dem Querstromfluid
zwischen den Öffnungen 32 und 34 werden
entfernt und in der stehenden Ultraschallwelle entlang der Kammer
mitgenommen. Wenn die Teilchen über
die Elektroden 50 wandern, werden jene des gewünschten
Typs in der Mitte der Kammer angereichert und an das Ende geführt. Wenn
diese Teilchen das Ende der Kammer erreichen, werden sie durch das
Querstromfluid zwischen den Öffnungen 36 und 38 entfernt
sowie in die Kammer 70 geleitet. Die Leit fähigkeit
und die anderen physikochemischen Eigenschaften des suspendierenden
Mediums in der Kammer 70 und somit auch das zwischen den Öffnungen 36 und 38 strömende Fluid
werden vorzugsweise für
eine sekundäre
DEP-Trennstufe, z. B. eine TWD (Dielektrophorese mit Wanderwelle),
gewählt.
Zusätzlich
kann die Durchflußgeschwindigkeit
zwischen den Öffnungen 32 und 34 variiert
und eingestellt werden, um unterschiedliche Konzentrationen der
Teilchen in der Lösung
in der Kammer 64 auszugleichen. So kann notwendigerweise
von der Kammer 64 ein breiter Bereich der Teilchenkonzentrationen
gehandhabt werden, während
die Konzentration der Teilchen in der Kammer 30 konstant bleibt.
Die Geschwindigkeit, mit der die stehende Welle entlang der Kammer
wandert, kann auch in Übereinstimmung
hiermit eingestellt werden. Das Ergebnis hiervon besteht darin,
daß optimale
Trennbedingungen erreicht werden können, selbst dann, wenn die
eingeführte
Probe eine unterschiedliche Leitfähigkeit und unterschiedliche
Eigenschaften des suspendierenden Mediums aufweist, und daß eine Vorstufe
zum erneuten Suspendieren der Teilchen und/oder Verdünnen und/oder
Anreichern der Probe nicht erforderlich ist. In ähnlicher Weise kann auch die
Strömungsgeschwindigkeit
zwischen den Öffnungen 36 und 38 eingestellt
werden.
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Als
eine weitere Variation können
die Öffnungen 32 und 34 und/oder
die Öffnungen 36 und 38 von
jenen, die in der 4e dargestellt sind, verlegt
werden, so daß das
Querstromfluid zwischen den Öffnungspaaren
in einem Winkel relativ zur Länge
der Kammer 30 und der stehenden Ultraschallwelle verläuft. Dies
kann für
die Leistungsfähigkeit
des Einführens
und/oder des Entfernens von Teilchen aus dem Ultraschallfeld in
der Kammer 30 vorteilhaft sein.
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Bei
einer weiteren Variante kann das Fluidvolumen in diesem System auch
festgelegt und in jenem Fluid eingeschlossen sein, das zwischen
den Öffnungen 32 und 34 sowie
der Kammer 64 strömt,
wie im Fall des Fluids, das zwischen den Öffnungen 36 und 38 sowie
der Kammer 70 strömt.
Das Ergebnis hiervon besteht darin, daß die Benutzung des Fluidstroms
nicht zu einer Verdünnung
der Probe führt.
Wenn ein nichtgeschlossenes System verwendet wird, kann sich eine
beträchtliche
Verdünnung
der Probe ergeben.
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4c zeigt
Elektroden, die paarweise mit gegenüberliegenden Seiten einer Wechselstromsignalquelle
verbunden sind. Zusätzlich
ist die Elektrode des benachbarten Paars auch mit der gegenüberliegenden Seite
der Wechselstromsignalquelle verbunden, wie in 4c dargestellt
ist. Dies bedeutet, daß zwischen dem
Elektrodenpaar nicht nur eine DEP-Kraft erzeugt wird, sondern zwischen
den Elektroden der benachbarten Paare eine viel schwächere DEP-Kraft
entsteht. Die Elektroden können
alternativ derart verbunden sein, daß zwischen den Elektroden von
benachbarten Paaren keine DEP-Kraft erzeugt wird. Dies wird durch
Verbinden der Elektroden in der Weise erreicht, daß die Elektrode
des benachbarten Paars mit der gleichen Seite der Wechselstromsignalquelle
verbunden ist. Sie weisen somit die gleiche Spannung auf, und es
ergibt zwischen ihnen keine DEP-Kraft.
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Zusätzlich können gemäß einer
weiteren Variante die dielektrischen Eigenschaften von einer oder mehreren
Teilchen, die getrennt werden, geändert werden, um die gewünschte Trennung
zu erreichen. Dies kann Faktoren beinhalten, wie das Ändern der
physiologischen Eigenschaften der Teilchen, das Belasten der Teilchen,
das Ändern
der Temperatur der Probe, das Zusetzen von chemischen Stoffen zu
der Teilchensuspension, das Anbringen zusätzlicher Teilchen, wie von
Antikörpern
oder Proteinen, oder insbesondere bei biologischen Teilchen das selektive
Abtöten
oder Zerstören
von speziellen Teilchen, um somit die Trennung zu verbessern, wofür das Belasten
oder Auflösen
von roten Blutzellen ein Beispiel sein kann.
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Es
hat sich gezeigt, daß im
allgemeinen die praktische Anwendung von Ultraschall zur Beeinflussung von
Teilchen vorzugsweise im niedrigeren MHz-Frequenzbereich (normalerweise
1 bis 6 MHz) liegt, insbesondere bei biologischen Zellen oder Mikron-
oder Submikronteilchen, wie gut bekannt ist (Peterson et al., Development
of an ultrasonic blood cell separator, IEEE 8th annual
conference of the Engineering in Medicine and Biological Society,
1986, Seiten 154 – 156,
insbesondere Seite 154).
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Als
ein Beispiel zeigt 5 Dielektrophoresespektren,
die für
menschliche rote Blutzellen (rbc's)
und T-Lymphozyten/weiße
Blutzellen (wbc's)
in einem Medium mit einer Leitfähigkeit
von 200 μS/cm
erwartet werden. Das T-Lymphozyten-Spektrum ist als eine gestrichelte
Linie dargestellt, während
das Spektrum der roten Blutzellen (rbc) als eine durchgezogene Linie
gezeigt wird. Für
die Trennung dieser zwei Teilchen besteht der bevorzugte Fall darin,
daß eine
Art der Teilchen durch eine positive DEP-Kraft gehalten wird, während die
andere eine negative DEP-Kraft erfährt und von den Elektroden
abgestoßen
wird. Die Frequenz, die vorzugsweise zum Trennen dieser zwei Teilchen
benutzt werden würde,
ist als F1 angegeben, etwa 130 kHz.
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Aus 5 ist
ersichtlich, daß die
Ultraschallfrequenz (normalerweise 1 bis 6 MHz – entsprechend einem log-Wert
von 6 bis 6,8) von der bevorzugten DEP-Frequenz 130 kHz, F1 (log-Wert
5,1) sehr verschieden ist. Unterschiedliche Frequenzen für den Ultraschall
und die DEP sind bevorzugt.