DE60013585T2

DE60013585T2 - Kulturraum und Bioreaktor zur ausserkörperlichen Tierzellenkultur

Info

Publication number: DE60013585T2
Application number: DE60013585T
Authority: DE
Inventors: Jerôme Vetillard; Francis Herodin; Richard Caterini
Original assignee: Technodop Ltd (societe De Droit Irlandais); TECHNODOP Ltd SOC DE DROIT IRL
Current assignee: Technodop Ltd (societe De Droit Irlandais); TECHNODOP Ltd SOC DE DROIT IRL
Priority date: 2000-07-19
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: CN1460122A; JP2004504023A; ATE275625T1; US20040132175A1; CA2416301A1; EP1174497A1; CN1258588C; EP1301586A1; EP1174497B1; WO2002006441A1; AU2001278542A1; DE60013585D1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Zellkulturraum und einen ihn enthaltenden Bioreaktor zur außerkörperlichen Tierzellenkultur.
Die Erfindung betrifft noch spezieller einen Zellkulturraum mit wenigstens zwei planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle, abgegrenzt durch eine achsensymmetrische Umhüllung, und einen Bioreaktor, der die Tierzellenkultur in dem genannten Kulturraum ermöglicht und dabei die Umgebung regelt und kontrolliert, in der die Zellen kultiviert werden.
Der Zellkulturraum und der Bioreaktor der Erfindung, bestimmt zur äußerkörperlichen Tierzellenkultur, ermöglichen eine Tierzellenkultur unter sterilen Bedingungen.
Die Erfindung dient der Erzeugung von tierischen Zellen wie zum Beispiel hämatoplastische oder blutbildende Zellen, Leberzellen, Hautzellen (Keratinozyte genannt), Pankreaszellen, Nervenzellen, in einer Gewebestruktur organisiert oder nicht, für einen therapeutischen Zweck.
Stand der Technik
Die Transplantation von Organen, Gewebe oder Zellen stellt einen beträchtlichen Fortschritt der medizinischen Technologie dar. Als Folge hat sich ein lebhaftes wirtschaftliches Interesse an der Herstellung von Bioreaktoren entwickelt, die zur Tierzellenkultur für therapeutische Zwecke bestimmt sind, wobei die genannten Zellen entweder transplantiert werden oder in externen Vorrichtungen verwendet werden, an die der Patient im Falle einer Organschwäche angeschlossen wird.
Ein Hauptnachteil der zur Eukaryonten-Kultur bestimmten aktuellen Bioreaktoren ist der Massentransfer, das heißt der Massentransfer der Nährstoffe und des gelösten Sauerstoffs bis zu den Eukaryonten, da diese Zellen empfindlich sind und durch die mechanische Beanspruchung zerstört werden, die mit dem der Belüftung dienenden Umrühren des Nährbodens verbunden sind.
Das amerikanische Patent Nr. 6,048,721 beschreibt einen Bioreaktor für das Wachstum und die Ex-vivo-Haltung von Säugetierzellen. In diesem Bioreaktor ist der diskusförmige Kulturraum durch ein planes Zellenbett und eine Membran abgegrenzt, die für Gas durchlässig und für Flüssigkeit undurchlässig ist. Der in die untere Abteilung des Bioreaktors eingespeiste Nährboden breitet sich radial aus und die in die obere Abteilung eingeblasene Luft versorgt diesen Nährboden mit Sauerstoff. Entsprechend der Funktionsweise dieses Bioreaktors wird der mit Abfallstoffen belastete Nährboden aus der Zellkultur ausgeschieden. Die Gewinnung der kultivierten Zellen erfolgt durch eine enzymatische Behandlung. Bei diesem Vorrichtungstyp läuft man Gefahr, dass die Breite des Kulturraums einen Sauerstoffpartialdruck-Gradienten einführt, der nicht günstig ist für eine gute Zellvitalität.
Der Nachteil der bekannten Bioreaktoren nach dem Stand der Technik, wie zum Beispiel der in EP-A-0155237 beschriebene und zur Kultur der Eukaryonten-Kultur bestimmte, beruht auf der Tatsache, dass diese Bioreaktoren mit einer kontinuierlichen Infusion ihres Kulturraums arbeiten, wobei der Nährbodenfluss nicht zurückgewonnen sondern direkt als Abfall ausgeschieden wird, was folglich die Selbstkosten der Kultur erhöht.
Nun erweist sich aber für die Tierzellenkultur – zum Beispiel von blutbildenden Zellen oder Leberzellen – ein an Wachstumsfaktoren reicher Nährmittelfluss als unerlässlich für die Vervielfachung und Differenzierung der genannten Zellen. Da die genannten Wachstumsfaktoren sehr teuer sind und der Betrieb eines Bioreaktors kein Recycling dieser Faktoren ermöglicht, stellen diese Faktoren einen finanziellen Aufwand dar, der mit einer klinischen Nutzung nicht vereinbar ist.
Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, alle diese Nachteile zu beseitigen.
Gegenstand der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Kulturraum und einen Bioreaktor zur außerkörperlichen Tierzellenkultur zu schaffen, die ermöglichen, die Selbstregulation des die kultivierten Zellen umgebenden Nährbodens aufrechtzuerhalten und ihnen derart zu ermöglichen, unter den bestmöglichen Bedingungen zu vermehren.
Zur Lösung dieser Aufgabe verfolgt die Erfindung die nachfolgenden Ziele.
Ein Ziel der Erfindung ist die Aufrechterhaltung einer guten Zellvitalität im Innern des genannten Kulturraums und des Bioreaktors, und dies, indem den Zellen des Nährbodens einerseits Nährstoff in ausreichender Menge geliefert wird und andererseits die erzeugten Abfälle und Hemmstoffe entleert werden, um eine Wachstum der Zellenpopulation zu ermöglichen.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, die Wachstumsfaktoren des Nährbodens recyceln zu können, dabei aus dem Nährboden ausreichend Zellabfall auszuscheiden und derart die wirtschaftliche Optimierung der Zellkultur zu realisieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, bei den kultivierten Zellen einen gezielten Gentransfer durchführen zu können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zellennährbodens aufrechtzuerhalten, trotz der durch das Zellenwachstum eingeführten Störung.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die Sterilität, die Aseptik des Kulturraums und des Bioreaktors zu garantieren, und dies insbesondere während der gesamten Dauer der Zellenkultur.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die kultivierten Zellen im Innern des Kulturraums und des Bioreaktors der Erfindung zu gewinnen.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass bei einem Kulturraum und einem Bioreaktor zur außerkörperlichen Tierzellenkultur die verschiedenen oben erwähnten Nachteile beseitigt werden könnten, wenn es möglich wäre, zugleich eine gute Zellvitalität der kultivierten Zellen und ein Recycling der Wachstumsfaktoren des Nährbodens zu realisieren und derart ein gutes Zellenvermehrungsniveau zu gewährleisten.
Die Erfindung hat also einen Kulturraum zur außerkörperlichen Tierzellenkultur zum Gegenstand, abgegrenzt durch eine Umhüllung mit Symmetrieachse, gebildet durch eine Außenseitenwand, zwei Endwände und Eingänge und Ausgänge für flüssige dynamische Mittel, wobei dieser Kulturraum dadurch gekennzeichnet ist, dass er umfasst:

a) wenigstens zwei plane Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle, senkrecht zu der Symmetrieachse;
b) zwischen den Membranen ein biokompatibles Makroträgerbett, das die Haftung der Zellen im Kulturzustand begünstigt;
c) zwei Endwände mit Verteilungsrillen der flüssigen dynamischen Mittel;
d) drei Eingangs- und Ausgangspaare der flüssigen dynamischen Mittel, bestimmt zur Versorgung des Kulturraums der Zellen und zur selektiven Entnahme der kultivierten Zellen, der aus ihrer Kultivierung resultierenden Abfälle und der überschüssigen Nährstoffe, wobei zwei der genannten Paare an die Verteilungsrillen aufweisenden Endwänden angeschlossen sind und das dritte zwischen den beiden planen Filtermembranen angeschlossen ist.

Die Erfindung hat auch einen Bioreaktor zur außerkörperlichen Tierzellenkultur zum Gegenstand, mit einem Kulturraum, abgegrenzt durch eine Umhüllung mit Symmetrieachse, gebildet durch eine Außenseitenwand, zwei Endwände und Eingänge und Ausgänge für flüssige dynamische Mittel, und mit Zirkulationseinrichtungen der genannten Mittel in dem genannten Kulturraum, wobei dieser Bioreaktor dadurch gekennzeichnet ist, dass er umfasst:

a) einen Kulturraum der genannten Zellen mit wenigstens zwei planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle, senkrecht zu der Symmetrieachse, und zwischen den Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle ein biokompatibles Makroträgerbett, das die Haftung der Zellen im Kulturzustand begünstigt, wobei der genannte Kulturraum durch eine Umhüllung mit Symmetrieachse abgegrenzt wird, die zwei Endwände mit Verteilungsrillen der flüssigen dynamischen Mittel umfasst und drei Eingangs- und Ausgangspaare der flüssigen dynamischen Mittel F1 ,F2 und F3, bestimmt zur Versorgung des Kulturraums der Zellen und zur selektiven Entnahme der kultivierten Zellen, der aus ihrer Kultur resultierenden Abfälle und der überschüssigen Nährstoffe, wobei zwei der genannten Paare an die Verteilungsrillen aufweisenden Endwänden angeschlossen sind und das dritte zwischen den beiden planen Filtermembranen angeschlossen ist;
b) Zirkulationseinrichtungen des ersten flüssigen dynamischen Mittels F1 als Closed-loop-Kreislauf und ein das genannte Mittel enthaltendes Expansionsgefäß R1, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind;
c) Zirkulationseinrichtungen des zweiten flüssigen dynamischen Mittels F2 als geschlossene Schleife oder als offene Schleife, abhängig von der jeweiligen Funktion des genannten Mittels, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind;
d) Zirkulationseinrichtungen des dritten flüssigen dynamischen Mittels F3 gemäß einem Closed-loop-Kreislauf und einem das genannte Mittel enthaltenden Speicher R3, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind;
e) Einrichtungen zur Kontrolle und Regelung sowie solche zur Konditionierung der flüssigen dynamischen Mittel, verbunden mit einer Regelungs-Steuerungsgruppe.

Beschreibung der Figuren
– Die 1 zeigt einen schematischen Schnitt eines Zellkulturraums, abgegrenzt durch eine Hülle von hexagonaler Form mit Symmetrieachse.
– Die 2 zeigt schematisch die dynamische Zirkulation der flüssigen Mittel F1 und F3 in "Abwärtsphase" bei einem Druckgradienten p1>p3 im Innern des Kulturraums eines Bioreaktors der Erfindung.
– Die 3 zeigt schematisch die dynamische Zirkulation der flüssigen Mittel F1 und F3 in "Aufwärtsphase" bei einem Druckgradienten p3>p1 im Innern des Kulturraums eines Bioreaktors der Erfindung.
– Die 4 zeigt schematisch einen Druckgradienten p1>p3 in "Abwärtsphase" im Innern des Kulturraums eines Bioreaktors der Erfindung.
– Die 5 zeigt schematisch einen Druckgradienten p3>p1 in "Aufwärtsphase" im Innern des Kulturraums eines Bioreaktors der Erfindung.
– Die 6 zeigt ein Montageschema eines Bioreaktors, in dem der Regelungs-Steuerungsblock nicht dargestellt ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Zellkulturraum mit Symmetrieachse, der zugleich die Zellen und den Nährboden umschließt und in dem ein biokompatibles Makroträgerbett zwischen zwei planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle abgegrenzt ist, wobei der genannte Kulturraum durch eine Hülle mit Symmetrieachse abgegrenzt ist, gebildet durch eine Außenseitenwand und zwei Endwände.
Nach der Erfindung umfasst dieser Zellkulturraum wenigstens zwei plane Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle und biokompatible Makroträger, die das Haften der Zellen im Kulturzustand ermöglichen und die sich zwischen zwei der genannten Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle befinden.
So ermöglicht eine erste plane Filtermembran mit einer Durchlassschwelle in der Größenordnung von 0,12 μm bis 0,44 μm die biochemischen Austausche im Innern des Kulturraums, indem sie den Durchgang der Moleküle des Nährmittels zulässt, zum Beispiel Proteine und Makromoleküle, aber die kultivierten Zellen einschließt und sie daran hindert, die Selbstregulationszone zu verlassen, und auch den Durchgang von kontaminierenden Teilchen verhindert, indem sie insbesondere als Barriere für die Bakterien dient, welche den Kulturraum kontaminieren könnten.
Eine weitere plane Filtermembran mit einer Durchlassschwelle von höchstens 15 Kilodalton (kDa) schließt alle Moleküle mit einer Molekularmasse über 15 kDa ein. Das Vorhandensein dieser planen Filtermembran im Innern des Kulturraums ermöglicht, einen Kulturzellen-Einschließungsraum zu definieren. Folglich schließt die plane Filtermembran mit der Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa die Kulturzellen sowie die Wachstumsfaktoren und die großen Proteine in dem Kulturraum ein.
Nach einer Charakteristik der Erfindung hat wenigstens eine der Membranen eine Durchlassschwelle zwischen vorzugsweise 0,18 μm und 0,26 μm und die andere eine Durchlassschwelle zwischen 10 und 12 kDa.
Nach der Erfindung kann die Anzahl der in dem Kulturraum vorhandenen Membranen höher als zwei sein. In diesem Fall haben die zusätzlichen Membranen Durchlassschwellen, die an diejenigen der vorerwähnten beiden Membranen angepasst sind.
Nach der Erfindung können die beiden planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle mineralische oder organische Membranen sein. Man kann zum Beispiel Membranen nennen, die aus biokompatiblem organischem Polymer, aus Zellulose oder aus Polysulfon sind.
Zudem haben diese beiden Membranen einen Abstand von höchstens 400 μm voneinander, da dieser Abstand eine gute Entwicklung der Zellen begünstigt, da sie praktisch immer Kontakt haben mit den Nährmittel- und Sauerstoffquellen.
Zwischen den beiden Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle ist ein biokompatibles Makroträgerbett eingeschlossen, dessen größte Teilchen, die kugelförmig sein können, ein Durchmesseräquivalent von 400 μm nicht überschreiten dürfen. Dieses Makroträgerbett, gebildet durch Teilchen mit diversen Größen, die eventuell durchgehend zusammengeballte gesinterte Blöcke aus Granulatselementen sein können, darf nicht dicker sein als 400 μm. Dieses Makroträgerbett spielt einerseits die Rolle eines Trägers der Zellen im Kulturzustand und andererseits eine mechanische Rolle der Aufrechterhaltung des Zelleneinschließungsraums, ausgespart zwischen den beiden planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle. Je nach Art der im Innern des erfindungsgemäßen Kulturraums kultivierten Zellen wird der Typ der biokompatiblen Makroträger entsprechend und mit adäquater Größe gewählt.
Die zwischen den beiden Membranen des Kulturraums verwendeten Membranen können eine zylindrische oder sphärische oder auch polyedrische Form wie bearbeitete massive Blöcke haben, deren Dicke höchstens 400 μm beträgt.
Nach der Erfindung können die Makroträger mineralischen Ursprungs (zum Beispiel Edelkoralle) oder metallischen Ursprungs (zum Beispiel Titan und seine Legierungen) sein, oder auch durch biokompatible Polymere gebildet werden.
Beispielsweise können einerseits im Falle einer Blutbildungszellenkultur hinsichtlich einer Knochenmarktransplantation und andererseits im Falle einer Osteoblastekultur zum Zwecke einer Knochenwiederherstellung die Makroträger Mikro-Edelkorallenkugeln sein, die einen Durchmesser von höchstens 400 μm haben. Edelkorallenkugeln der erwünschten Granulometrie erweisen sich nämlich als geeignete Makroträger für die oben genannten Anwendungen, da sie insbesondere durch die blutbildenden Progenitoren besiedelt werden können. Im Falle der Knochenvorläufer würden die Edelkorallenkugeln außerdem metabolisiert, was ihre Verwendung in der plastischen Chirurgie begünstigt.
Wenn zum Beispiel im Falle einer Leberzellenkultur hinsichtlich einer Ex-vivo-Anwendung zur Blutentgiftung eines Patienten mit Leberinsuffizienz mittels einer außerkörperlichen Biomasse von Hepatozyten können die geeignetsten Makroträger Kugeln aus Nylon^® (Polyamide) mit einem Durchmesser unter 400 μm sein.
Das Vorhandensein von Makroträgern zwischen den genannten Membranen und die Tatsache, dass die planen Filtermembranen mit einer Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa weder den Durchgang der kultivierten Zellen noch der Wachstumsfaktoren zulassen, ermöglicht also die Einschließung der kultivierten Zellen – die an den genannten biokompatiblen Makroträgern haften – in diesen Zelleneinschließungsraum zwischen den beiden Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle.
Die Versorgung des Kulturraums mit flüssigen dynamischen Mitteln erfolgt homogen aufgrund der Aufteilung und Verteilung dieser Mittel im Innern des genannten Kulturraums dank der optimal positionierten Eingänge und Ausgänge dieser Mittel.
Der Zellkulturraum, wie oben beschrieben, umfasst eine Umhüllung mit Symmetrieachse, gebildet durch eine Außenseitenwand und zwei Endwände, die man mit zwei flachen Böden vergleichen kann, die sich den beiden Enden der genannten Seitenwand befinden.
Diese achsensymmetrische Umhüllung kann zum Beispiel durch ein biokompatibles polymeres Material oder durch nichtrostenden Stahl gebildet werden. Als biokompatible polymere Materialien kann man zum Beispiel die Polyolefine, die Polyamide, die Polyester und andere nennen.
Die beiden Endwände der achsensymmetrischen Umhüllung weisen Verteilungsrillen auf, die ermöglichen, den Kulturraum mit zwei der drei flüssigen dynamischen Mittel zu versorgen. Diese Verteilungsrillen bilden ein Hauptnetzwerk sogenannter Hauptrillen. Dieses Rillenhauptnetzwerk in der Fläche jeder der beiden Endwände, dem Zellkulturraum gegenüberstehend, kann ab dem in der genannten Wand vorgesehenen Eingangsrohrstutzen divergieren.
Nach der Erfindung ermöglicht das Netzwerk der sogenannten Hauptrillen, auch Versorgungsnetzwerk genannt, eine gleichmäßige Verteilung der beiden flüssigen dynamischen Mittel, die durch biokompatible Leitungen, deren Ende oder Enden in den Endwänden stecken, dem Kulturraum zugeführt werden. Die Anzahl der Verteilungsrillen, die sich gegenüber dem Zellkulturraum befinden in jeder der beiden Endwände befinden, ist so definiert, dass man eine gute Verteilung des flüssigen dynamischen Mittels in dem Kulturraum erhält, und wird in Abhängigkeit von der Form der achsensymmetrischen Umhüllung festgelegt.
Das genannte Hauptnetzwerk wird durch ein Sekundärnetzwerk vervollständigt, gebildet durch sogenannte Sekundärrillen, die weniger tief und im Wesentlichen senkrecht sind in Bezug auf das Hauptnetzwerk, um die Zirkulation zwischen den durch das Hauptnetzwerk abgegrenzten Zonen zu begünstigen. Folglich sind die Sekundärrillen des Sekundärnetzwerks im Wesentlichen senkrecht zu den Rillen des Hauptnetzwerks. Die Abstände der Rillen dieses Sekundärnetzwerk können variieren, so dass die Sekundärrillen auf der Seite, die dem Eintritt des Mittelstroms gegenübersteht, enger beieinander und zahlreicher sind, um den Abfluss und die Entleerung des genannten Mittels zu erleichtern.
Zwei benachbarte Rillen des Hauptnetzwerks bilden eine Verteilungszone, und zwei benachbarte Rillen des Hauptnetzwerks, geschnitten von benachbarten Rillen des Sekundärnetzwerks, bilden eine Verteilungszelle.
Das Hauptnetzwerk und das Sekundärnetzwerk bilden ein feines "kariertes" Ausbreitungsnetzwerk der flüssigen dynamischen Mittel. Das System aus diesen beiden Netzwerken kann zum Beispiel ein waffelförmiges Netzwerk bilden.
Das Hauptnetzwerk, das sich in der dem Zellkulturraum gegenüberstehenden Fläche befindet, besitzt eine bestimmte Höhe und eine bestimmte Breite, die der Fachmann problemlos definieren kann, wobei er weiß, dass das Rillennetzwerk aus einem Stück mit der planen Filtermembran sein muss bzw. mit ihr verbunden sein muss, um die Kohäsion des Ganzen sicherzustellen. Tatsächlich bildet das Volumen, das ausgespart wird durch das mit dem Rillennetzwerk verbundene Ganze und der Membran, das Verteilungsgitter des flüssigen Stroms, der ungefähr 50 % der Oberfläche der Membran darstellen kann.
Das Hauptnetzwerk kann also durch Hauptrillen gebildet werden, deren Tiefe bis höchstens 5 mm geht und die Breite bis höchstens 2 mm, wobei die Teilung bzw. der Abstand zwischen zwei benachbarten Rillen des Hauptnetzwerks höchstens 2 mm betragen kann. In gleicher Weise kann das Sekundärnetzwerk durch Sekundärrillen gebildet werden, deren Tiefe bis höchstens 2 mm geht und die Breite bis höchstens 2 mm, wobei die Teilung bzw. der Abstand zwischen zwei benachbarten Rillen dieses Netzwerks von der Eintrittsseite bis zum Austritt dieses Mittelstroms des Mittelstroms progressiv abnimmt. Daher beträgt die Teilung des Sekundärnetzwerks in seinem entfernten Teil, das heißt auf der Austrittsseite des Mittels, höchstens 2 mm.
Das Hauptnetzwerk in den Endwänden kann in der Praxis zum Beispiel eine Tiefe von 1 mm und eine Breite von 500 μm haben, mit einer Teilung von 500 μm, und das Sekundärnetzwerk kann zum Beispiel eine Tiefe von 500 μm und eine Breite von 500 μm haben, mit einer minimalen Teilung von 500 μm.
Die Endwände können folglich so vorgesehen werden, dass sie ein feines Zellmuster des Waffeltyps bilden, auf dem sich die Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle abstützen oder auf dem sie festgeklebt sind mit einem biokompatiblen Klebstoff des Typs Polymerkleber.
Die achsensymmetrische Umhüllung kann die Form von zwei Halbhüllen wie zum Beispiel zwei Halbzylindern aufweisen, von denen jede eine Außenseitenwand und eine Endwand umfasst, die dicht miteinander verbunden sind, abgedichtet mittels einer Dichtung.
Die Form der achsensymmetrischen Umhüllung des erfindungsgemäßen Zellkulturraums kann so gewählt werden, dass es zum Beispiel möglich ist, mehrere Zellkulturräume auf einem Träger zu stapeln. Der Fachmann ist wieder fähig, die Form der Umhüllung des Zellkulturraums entsprechend der vorgesehenen Verwendung zu wählen. Man kann zum Beispiel eine Umhüllung wählen, die durch zwei Halbhüllen von zylindrischer, kubischer oder polygonaler Form gebildet wird.
Für eine achsensymmetrische Umhüllung von hexagonaler Form kann die Anzahl der Hauptverteilungsrillen jeder der beiden Endwände wenigstens sieben betragen, wobei diese Zahl sehr viel höher sein kann.
Zu betonen ist, dass ein Stapel von Zellkulturräumen mit elementaren Mustern unter der Bedingung realisiert werden kann, dass diese Muster dieselbe Form aufweisen, um einen stabilen Stapel dieser Muster auf einem entsprechenden Träger zu erhalten.
Nach einer Ausführungsart eines Zellkulturraum-Stapels mit elementaren Mustern kann zum Beispiel eine hexagonale Form das sukzessive Stapeln mehrere Zellkulturräume auf einem entsprechenden Sockel erleichtern, der zum Beispiel sechs Säulen besitzt. In diesem Fall können die sechs Säulen des Sockels, welche die Rolle des Trägers des Zellkulturraum-Stapels spielen, zum Beispiel auch als Versorgungs- und Entleerungsleitungen der flüssigen dynamischen Mittel dienen.
Die Versorgung der erfindungsgemäßen Zellkulturräume mit flüssigen dynamischen Mitteln kann durch ein System mit drei flüssigen dynamischen Mitteln (nämlich ein System mit drei Strömen von unterschiedlichen Mitteln).
Ein erstes flüssiges dynamische Mittel, mit F1 bezeichnet, das durch biokompatible Rohrstutzen ein- und austritt, die in Höhe einer der Endwände der Umhüllung stecken (zum Beispiel der oberen Endwand), versorgt den Nährboden mit Nährmittel (auch nährstoffreiches Mittel genannt), wobei dieses Mittel reich an Wachstumsfaktoren ist. Dieses erste flüssige dynamische Mittel wird durch Elemente gebildet, die zur Zellenkultur notwendig sind, zum Beispiel, wie zum Beispiel Proteine, Spurenelemente, Glukose, Wasser und Wachstumsfaktoren, und versorgt den Nährboden mit frischem Nährmittel.
Ein zweites flüssiges dynamisches Mittel, mit F2 bezeichnet, das in Höhe der Außenseitenwand der achsensymmetrischen Umhüllung des Zellkulturraums ein- und austritt, hat drei unterschiedliche Funktionen, je nach vorgesehener Verwendung.
Gemäß einer ersten Funktion dient dieses zweite flüssige dynamische Mittel, das durch einen biokompatiblen Rohrstutzen in Höhe einer Seitenwand des Zellkulturraums eintritt, dazu, die Zellen in den genannten Zellkulturraum einzuführen, die im Innern dieses Zellkulturraums kultiviert und nach ihrer Kultivierung zurückgewonnen werden müssen (zum Beispiel blutbildende Zellen oder Leberzellen).
Gemäß einer zweiten Funktion kann dieses zweite flüssige dynamische Mittel dem Gentransfer dienen. Es können sich nämlich bei der Einführung der suspendierten Kulturzellen in den Kulturraum durch dieses zweite flüssige dynamische Mittel Viruspartikel, enthalten in diesem flüssigen dynamischen Mittel, an den suspendierten Zellen in Höhe ihrer Membrane festsetzen und so den erwünschten Transfer der Gene ermöglichen. Dieser zweite Mittelstrom kann ermöglichen, die erwünschten Kulturzellen, die man kultivieren will, genetisch modifiziert zu erhalten. Dieses Mittel transportiert nämlich die Gentransfervektoren und ermöglicht die Kontaktherstellung mit den Zellen, um zwischen der Zielzelle und dem Gentransferträger eine Membranverschmelzung zu realisieren. Diese Gentransfervektoren sind von jeglicher Art. Beispielsweise kann man die Viren wie zum Beispiel die Adenoviren bzw. Kalifornische Enzephalitis, die Retroviren, die Liposome und Plasmidgen-Komplexe nennen.
Eine solche Markierung der Zellen (durch Injektion von Gentransferträgern), außerhalb des menschlichen Körpers realisiert, ermöglicht, genau auf das genetisch zu modifizierende Gewebe zu zielen. Zudem kann man zum Beispiel einen synthetischen Virus mit einmaligem Gebrauch verwenden, um beim Gentransfer genau auf eine therapeutisch interessante Zellpopulation zu zielen. Dieser Virus, dadurch gekennzeichnet, dass die codierenden Gene für die Hülle und diejenigen, welche die eigentliche genetische Information tragen, getrennt sind, ist unfähig, sich im Innern der Zellen zu reproduzieren, nachdem er die erwünschte genetische Information transferiert hat. Die Risiken der Entstehung eines neukombinierten Virus aus dem verwendeten synthetischen Virus und einem wilden Virus, der bei dem Patienten vorhanden sein könnte, sind also begrenzt.
Gemäß einer dritten Funktion kann dieses zweite flüssige dynamische Mittel die Rolle des Spülungsstroms der inhibierenden Makromoleküle spielen, die in Höhe des Zelleneinschließungsraums vorhanden sind. Diese kultivierten Zellen können nämlich vor ihrer Ernte oder während ihrer Beimpfungs-Vorbehandlung oder auch während ihrer Beimpfung in dem Zellkulturraum gestresst worden sein. Dieser Stress kann die Produktion (durch diese Zellen) von Proteinen bewirken, die ihre Fähigkeit, sich zu vermehren, hemmen, indem sie sie in einen Dämmer- bzw. Ruhezustand versetzen (état quiescent). Während dieses Zustands sind diese Zellen physiologisch nicht mehr imstande, auf die durch die Wachstumsfaktoren realisierten Stimulierung zu reagieren, wenn sie sich vermehren.
Im Falle der Blutbildungszellen kann man den "radio-induzierten" Stress nennen, der durch ionisierende Strahlungen (vorsätzlich durch radiotherapeutischen Gebrauch oder ungewollt) verursacht wird und sich später durch Stress ausdrückt. Diese Art Stress hat die Produktion von Inhibitoren wie zum Beispiel "Transforming Growth Factor-beta" oder "Tumor Necrosis Factor-alpha" zur Folge. Da diese inhibierenden Moleküle ebenso Cytokine sind wie die für die Kultur von Blutbildungszellen eingebrachten Wachstumsfaktoren, werden sie folglich durch die beiden Filtermembranen des Zellkulturraums eingeschlossen.
Um eine Zellkultur richtig durchzuführen, müssen diese inhibierenden Moleküle aus dem Nährboden und folglich aus dem Kulturraum eliminiert werden. Das zweite flüssige dynamische Mittel dient in seiner dritten Funktion also der Reinigung der Zelleneinschließungszone, um die genannten inhibierenden Moleküle zu eliminieren.
Ein drittes flüssiges dynamisches Mittel, F3 genannt, das durch biokompatible Rohrstutzen ein- und austritt, die in der zweiten der Endwände der achsensymmetrischen Umhüllung stecken (zum Beispiel der unteren Endwand), versorgt das Kulturmittel mit Basisnährmittel (auch Regenerations-Basisnährmittel genannt). Diese Basisnähmittel ist ein Nährmittel ganz ohne Wachstumsfaktoren. Ein solches Basisnährmittel wird also gebildet durch Glukose, Wasser, Spurenelemente wie zum Beispiel Vitamine und Mineralien, Farbstoffe um den pH-Wert zu bestimmen, und Proteinen des Typs Albumin.
Nach der Erfindung hat dieser Zellkulturraum, der dazu bestimmt ist, durch das System mit drei verschiedenen flüssigen dynamischen Mitteln versorgt zu werden (auch Dreistromsystem genannt), charakteristisch drei Eintritts- und Austrittspaare für die verwendeten flüssigen Mittel. Zwei dieser Paare sind mit den Endwänden verbunden, um die Verteilungsrillen zu versorgen. Das dritte Paar ist mit der Außenseitenwand verbunden, zwischen den beiden planen Filtermembranen unterschiedlicher Durchlassschwelle.
Die versetzte Anordnung dieser Eintritts- und Austrittspaare der flüssigen Mittel auf der den Zellkulturraum abgrenzenden Umhüllung ermöglicht, eine gleichmäßige Verteilung dieser flüssigen Mittel im Innern des Kulturraums zu erhalten (s. 1).
Gemäß den Charakteristika der Erfindung sind die Eintritts- und Austrittsrohrstutzen des Dreistromsystems folglich gut über die achsensymmetrische Umhüllung des Zellkulturraums verteilt.
Gemäß 1 steckt der biokompatible Eintrittsrohrstutzen des mit EF1 bezeichneten ersten Stroms in der oberen Endwand der Umhüllung des Kulturraums, während der mit SF1 bezeichnete Austrittsstutzen des ersten Flusses ebenfalls – aber dem Eintrittsrohrstutzen entgegengesetzt – in dieser Endwand steckt.
Der biokompatible Eintrittsrohrstutzen EF3 des mit F3 bezeichneten dritten Stroms steckt so in der unteren Endwand der genannten Umhüllung, dass dieser Rohrstutzen zu dem Eintrittsrohrstutzen des an Wachstumsfaktoren reichen Nährmittelstroms EF1 um einen Winkel von 120° versetzt ist, um eine gute Verteilung der genannten Mittel im Innern der Kulturkammer zu ermöglichen. Außerdem steckt der biokompatible Austrittsrohrstutzen SF3 dieses mit F3 bezeichneten dritten Stroms ebenfalls – aber dem Eintrittsrohrstutzen EF3 des genannten Stroms F3 entgegengesetzt – in derselben Endwand.
Gemäß 1 steckt der Eintrittsrohrstutzen des mit EF2 bezeichneten zweiten flüssigen dynamischen Mittels zwischen den beiden mit M1 und M3 bezeichneten Filtermembranen, die jeweils eine Durchlassschwelle von 0,22 μm und 10 kDa haben, in der Außenseitenwand der Hülle entsprechend einem Winkel von ungefähr 60° in Bezug auf den Eintrittsstutzen des ersten Stroms EF1. Der mit SF2 bezeichnete Austrittsstutzen steckt in entgegengesetzt zum Eintrittsstutzen des genannten Stroms in der Seitenwand.
Die drei Paare Eintritts- und Austrittsstutzen der flüssigen dynamischen Mittel befinden sich in drei vertikalen Ebenen, die durch die Symmetrieachse der Umhüllung verlaufen, wobei diese Ebenen zwischen dem ersten Eintritt und dem zweiten Eintritt der flüssigen dynamischen Mittel um einen Winkel von ungefähr 60° versetzt sind und zwischen dem ersten und dem dritten Eintritt um einen Winkel von ungefähr 120°, und die Austritte der genannten flüssigen dynamischen Mittel haben dieselbe Winkelanordnung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Bioreaktor mit dem oben beschriebenen Zellkulturraum. Dieser Zellkulturraum ist durch die drei Eintritts- und Austrittspaare der flüssigen dynamischen Mittel über Verbindungsleitungen mit Versorgungs- und/oder Entleerungsspeicher dieses Zellkulturraums verbunden. Der erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst außerdem Einrichtungen zur Regelung der Kulturbedingungen und zur Massentransferkontrolle der genannten flüssigen dynamischen Mittel, verbunden mit dem Regelungs-Kontrollblock des genannten Bioreaktors.
Dieser Bioreaktor umfasst außer dem Kulturraum einen "Regelungsblock" auch "Steuerungsblock" genannt, der die Kontrolle und Regelung des pH-Werts, der Sauerstoffkonzentration und der Temperatur des Nährbodens ermöglicht. Der "Steuerungs-Regelungsblock" kann den gesamten Betrieb des Bioreaktors automatisch verwalten. Diese Regelung ist vom Typ Numerischer P.I.D.-Regler (numerische Proportional-, Integral- und Abweichungsregelung) und die durch die verschiedenen Sonden gesendeten Daten können durch Informatik aufgezeichnet und analysiert werden.
Der den oben beschriebene Zellkulturraum enthaltende erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst austauschbare Funktionsmoduleinheiten, die für einen bestimmten Massen- oder Energietransfenniert dimensioniert sind (zum Beispiel Belüftungs- oder Wärmetauschermodule) und die ein neudimensionierbares modulares System bilden – ausgestattet mit einem programmierbaren Regelungs-Steuerungsblock -, indem man identische Funktionseinheiten parallel oder seriell nebeneinander anordnet.
Der Regelungs-Steuerungsblock erhält die Gesamtheit der Informationen bezüglich der flüssigen dynamischen Mittel F1, F2, F3 von den Kontroll- und Regelungseinrichtungen sowie die Informationen bezüglich diverser Speicher, Pumpen, Ventile und Drücke, die in den Zonen C1, C2, C3 des Kulturraums herrschen, verwaltet sie und sendet die nötigen Betriebsbefehle.
Daher ist es möglich, auf Verlangen die internen Charakteristika des Kulturraums zu modifizieren und die bei der Selbstregulation des Nährbodens zusammenwirkenden Parameter und Regelungsprogramme zu verändern und an den kultivierten Zellentyp anzupassen.
Das Regelungssystem kann auch eine Kristallzelle zur Messung des infraroten Spektrums umfassen, die durch Entfaltung des Reemissionsspektrums ermöglicht, die Konzentration bestimmter in dem Nährboden gelöster Stoffe zu messen. Es ist dann möglich, "online" und in Echtzeit die Glukose- und Lactatkonzentrationen zu messen.
So kann die Temperatur des Nährbodens auf einen zwischen 30 und 38 °C enthaltenen Sollwert eingestellt werdend. Während des Zellwachstums kann der pH-Wert des Nährbodens auf einen Einstellwert festgelegt werden, der zwischen 6,5 und 7,7 enthalten ist. Der Regelungs-Steuerungsblock ermöglicht auch die Regelung des Luftdurchsatzes und des Gehalts an CO₂, das durch seine Auflösung Amphoter HCO₃ liefert, das den Nährboden puffert, zu der Stabilität des pH-Werts beiträgt und die pH-Wert Regelung bewirkt.
Nach einer der Charakteristika des erfindungsgemäßen Bioreaktors sind die Eintritts- und Austrittsstutzen (des Kulturraums) des ersten flüssigen dynamischen Mittels F1 durch Verbindungsleitungen mit einem Speicher R1 des an Wachstumsfaktoren reichen Nährmittels durch einen Closed-loop-Kreislauf verbunden, der das Recycling der für die Entwicklung der kultivierten Zellen notwendigen Wachstumsfaktoren ermöglicht. Dieser Speicher R1 kann die Rolle des Expansionsgefäßes spielen.
Nach einer der Charakteristika dieses Bioreaktors sind die genannte Verbindungsleitung zwischen dem Eintrittsstutzen des nährstoffreichen ersten Mittels F1 des Kulturraums und der genannte Speicher R1 dieses Mittels mit einer Pumpe P1 ausgerüstet, die ermöglicht, das Volumen und den Durchsatz des Mittels F1, das im geschlossenen Kreis in dem Kulturraum zirkuliert, zu kontrollieren und anzupassen.
Die geschlossene Schleife, in welcher der nährstoffreiche Strom F1 fließt, vertilgt über eine Belüftungseinrichtung, die sich auf dem Expansionsgefäß R1 befindet, wobei diese Belüftungseinrichtung einen Filter mit einer 0,22μm-Durchlassschwelle umfasst, der die Aseptik des Mittels garantiert. Diese Schleife ist auch mit einem Elektroventil V1 ausgestattet, gesteuert durch den programmierbaren Regelungs-Steuerungsblock, das bei Bedarf einen Druckausgleich mit dem atmosphärischen Druck ermöglicht. Das Expansionsgefäß R1 ist auch mit Sensoren für den oberen und den unteren Pegel des flüssigen Mittels ausgestattet, was dazu dient, die Zirkulationsumkehrung der Fluide auszulösen.
Nach einer anderen Charakteristik des Bioreaktors der Erfindung ist der Eintrittsstutzen EF3 des Basisnährmittels F3 des Kulturraums durch eine Verbindungsleitung mit einem mit R3 bezeichneten Speicher dieses Mittels verbunden, und der Austrittsstutzen SF3 ist durch eine Leitung mit dem Behälter für die Abfallstoffe verbunden (Abfallsammelabteil).
Nach der Erfindung ist die Verbindungsleitung, die mit dem Eintrittsstutzen EF3 des dritten flüssigen dynamischen Mittels F3 verbunden ist, mit einer Pumpe P3 ausgestattet, während die Leitung, die mit dem Ausgangsstutzen des genannten Stroms verbunden ist, mit einem Ventil V3 ausgerüstet, das eventuell durch den Regelungs-Steuerungsblock gesteuert wird, wobei das Ganze ermöglicht, das Volumen und den Durchsatz des genannten dritten Mittels F3 zu regeln und zu kontrollieren, das in einem offenen Kreislauf in dem Kulturraum zirkuliert.
Nach der Erfindung ist jeweils eine Belüftungseinrichtung des nährstoffreichen Mittels F1 und eine Belüftungseinrichtung des Basisnährmittels F3 in dem einen und dem anderen Kreislauf mit geschlossener und offener Schleife vorgesehen und jeweils zwischen den Eingängen der flüssigen dynamischen Mittel F1 und F3 in den Zellkulturraum und den Speichern R1 und R3 angeordnet.
Nach der Erfindung sind in jedem der beiden Kreisläufe beim Eingang der genannten Mittel F1 und F3 ein Wärmetauscher für das nährstoffreiche Mittels F1 und ein Wärmetauscher für das Basisnährmittel F3 vorgesehen.
Diese Vorrichtungen ermöglichen, die Selbstregulation des Kulturraums aufrechtzuerhalten, indem sie die einströmenden Mittel vorkonditionieren, um zu vermeiden, dass ein Nährboden-Volumenelement in den Kulturraum hineinströmt, das zu einer starken Störung seiner physikalisch-chemischen Parameter führt.
Nach einer anderen Charakteristik des Bioreaktors der Erfindung ist der Eintrittsstutzen EF2 des zweiten flüssigen dynamischen Mittels des Kulturraums, der sich in Höhe der Seitenwand der Umhüllung befindet, durch eine Verbindungsleitung mit einem Speicher R2 verbunden, der das zweite flüssige dynamische Mittel F2 enthält, das entsprechend der ihm zugeteilten Rolle ausgewählt wird, nämlich entweder den Kulturraum mit Zellen zu versorgen, die zur Kultivierung bestimmt sind, und den Kulturraum nach der Kultivierung zu entleeren, oder einen Gentransfer durchzuführen, oder als Reinigungsstrom zu dienen, der den Kulturraum von den inhibierenden Molekülen der zu kultivierenden Zellen entlastet.
Abhängig von der Funktion, die diesem zweiten Mittel zugeteilt wird, ist der Ausgangsrohrstutzen SF2, der dem Eingangsstutzen EF2 in der genannten Wand gegenübersteht, verbunden mit:

– einer Verbindungsleitung mit einem Rückgewinnungsspeicher der Zellen nach der Kultur (nämlich einer Sammeltasche) oder mit dem Abfallstoffbehälter (Abteil zur Eliminierung der inhibierenden Moleküle) entsprechend einer offenen Schleife, oder
– einer Verbindungsleitung mit einem das Mittel ohne geeignete Gentransfervektoren enthaltenden Speichers entsprechend einer geschlossenen Schleife.

Nach einer anderen Charakteristik des erfindungsgemäßen Bioreaktors können ein oder mehrere Mittel- bzw. Stoffaustauscher-Funktionsmodule, auch Dialysatoren oder Ultrafiltriereinrichtungen genannt, hinzugefügt werden, um das nährstoffreiche Mittel F1 am Ausgang des Kulturraums zu filtern. Dieser oder diese Mittel- Stoffaustauscher-Funktionsmodule befinden sich außerhalb des Kulturraums und sind in Serie in die Ausgangsverbindungsleitung des Closed-loop-Kreislaufs des ersten Mittels F1 eingebaut, und werden in offener Schleife in Gegenrichtung von dem Mittel F3 durchströmt.
In dem Falle der Ad-hoc-Verwendung von zwei in Serie in die geschlossene Schleife F1 eingebaute Funktionsmodule kann man zwei unterschiedliche Durchlassschwellen wählten, zum Beispiel 10 kDa und 30 kDa. Man kann, indem man den aus dem 10kDA-Modul austretenden Strom in den 30kDa-Modul einspeist und um das Permeat – das heißt den flüssigen Teil, der die 30kDa-Membran durchquert hat – wieder in die F1-Schleife einzuspeisen, eine Aufteilung der Proteine des Mittels in 10 und 30 kDa vornehmen, was der Größe der Wachstumsfaktoren entspricht.
Solche zusätzlichen Funktionsmodule können sich als nützlich erweisen, wenn zum Beispiel die Wachstumsfaktoren durch Träger- Unterstützungszellen in einem zugeordneten ersten Kulturraum erzeugt werden und man dieses Milieu bzw. diesen Nährboden konditionieren möchte (das heißt die erzeugten Wachstumsfaktoren zurückzugewinnen ohne die durch die Trägerzellen erzeugten Zellabfälle), um sie in der Schleife F1 wieder zu verwenden, um die Zellen von sogenanntem therapeutischem Interesse in dem Hauptkulturraum zu stimulieren.
Es sei angemerkt, dass das Verfahren zur Kultivierung der Blutbildungs- und/oder Blutzellen, Stromalzellen genannte Unterstützungs- bzw. Trägerzellen verwenden kann. Diese Stromalzellen (cellules stromales) können genetisch modifiziert werden, um menschliche Cytokine mit solchen Ausdruckniveaus zu erzeugen, dass sie teilweise den Cytokin-Bedart der Kultur bestreiten können.
Es muss im Übrigen unterstrichen werden, dass die achsensymmetrische Umhüllung eine gleichmäßige optimale Verteilung der Nährstoffe ermöglicht und den Vorteil hat, ebenso steril zu sein, wie alle Elemente des Bioreaktors, die mit dem Nährboden Kontakt haben. Die Sterilisierung des Bioreaktors erfolgt nämlich durch einen Autoklaven bei 121 °C während 20 Minuten und betrifft sowohl die Vorrichtung als auch alle Flaschen und Speicher. Die Verbindungsleitungen, die Speicher und andere Abdichtungselemente sind aus biokompatiblen Materialien, die im Falle eine Benutzung im Laboratorium ohne Schaden ungefähr zehn Sterilisationszyklen aushalten. Hingegen bildet im Falle einer klinischen Verwendung das gesamte System – bestehend aus Kulturraum, Verbindungsleitungen, Speicher für die Mittel und anderes – ein Kit bzw. einen Bausatz für den einmaligen Gebrauch.
Außerdem erfolgt die Neukonditionierung des Bioreaktors nach einen Zellkultur im Rahmen einer Benutzung des Labor-Typs durch eine Proteinaufschließung bzw. -digestion mit einer Molar-Salzsäure, gefolgt von einer ultrasauberen Reinigung und einer erneuten Sterilisierung.
Entsprechend der Funktionsweise des Bioreaktors und gemäß 2 wird das nährstoffreiche Mittel F1 in Höhe der oberen Endwand der Umhüllung eingespeist in die mit C1 bezeichnete Zone (Abteil C1) des Kulturraums, enthalten zwischen der genannten Wand und der planen Filtermembran mit Durchlassschwelle in der Größenordnung von 1,12 μm bis 0,44 μm, durch Öffnen bzw. Einschalten der Pumpe P1, die sich in der Verbindungsleitung befindet, die den Kulturraum mit dem Speicher R1 verbindet, der das genannte Mittel F1 enthält, während die Pumpe P3, die sich in der Verbindungsleitung befindet, die den Kulturraum mit dem Speicher R3 verbindet, der das Basisnährmittel F3 enthält, stillsteht. Zudem wird der Druck p3, der in der Zone C3 (Abteil C3) des Kulturraums herrscht, der sich zwischen der unteren Endwand der Umhüllung und der Filtermembran mit Durchlassschwelle 15 kDa befindet, durch das Gegendruckventil V3 geregelt, das sich in der Leitung befindet, welche den Kulturraum mit dem Abfallabteil verbindet, so dass der Druck p1, der in der Zone C1 des Kulturraums herrscht, höher ist als der Druck p3, und dass der Druck p2, der in der Zone C2 herrscht, entsprechend einem Druckgradienten zwischen p1 und p3 enthalten ist.
Bei der Einspeisung des ersten flüssigen dynamischen Mittels F1 in den Kulturraum durch das Öffnen bzw. Einschalten der Pumpe P1 durchqueren die Wachstumsfaktoren des Nährmittels die Zone C1 und die genannte Membran mit Durchlassschwelle 0,12 μm bis 0,44 μm des Kulturraums, werden aber zurückgehalten durch die plane Filtermembran mit einer Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa, welche die Rolle der Sperre für die Wachstumsfaktoren und die großen Proteine spielt.
Die Wachstumsfaktoren können folglich beiderseits der planen Filtermembran mit der Durchlassschwelle 0,12 μm bis 0,44 μm migrieren und ihre Funktion der Wachstumsstimulation und/oder der Kontrolle der Differenzierung der Zellen im Zustand der Kultivierung erfüllen, die eingeschlossen sind zwischen den beiden planen Membranen des Kulturraums, welche die mit C2 bezeichnete Zone dieses Kulturraums definieren (Abteil C2).
Entsprechend der 4 schließt die plane Filtermembran M3 mit einer Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa die Wachstumsfaktoren und die großen Proteine des frischen Nährmittels F1 in den Zonen C1 und C2 des Kulturraums ein. Hingegen werden die Spurenelemente des Mittels F1 und die Abfälle kleiner Größe (wie zum Beispiel NO, NH₄ ⁺, Laktat und anderes), erzeugt durch die Kultivierung der in der Zone C2 des Kulturraums eingeschlossenen Zellen, in Richtung der Zone C3 drainiert, wo sie in den Abfall ausgeschieden werden. Der die Membranen durchquerende Gesamtstrom bewegt sich folglich von der Zone C1 in Richtung Zone C3 des Kulturraums (s. 2).
Bei dieser Betriebsart des erfindungsgemäßen Bioreaktors, "Abwärtsphase" genannt, verliert das in einer geschlossenen Schleife zirkulierende frische Nährmittel F1 an Volumen aufgrund der Drainage der wässrigen Lösung in Richtung der Zone C3 und insbesondere in Richtung Abfall. Das Volumen des Mittels F1 in dem Speicher R1 nimmt folglich ab. Da die Wachstumsfaktoren und die großen Proteine des frischen Nährmittels F1 in den Zonen C1 und C2 eingeschlossen sind, werden die Abfälle aus den Zonen des Kulturraums in Richtung der Zone C3 entleert und mit durch das geöffnete Ventil V3 in Richtung Abfallabteil drainiert.
Sobald das Volumen des Speichers R1 oder Expansionsgefäßes der das frische Nährmittel F1 befördernden geschlossenen Schleife ein bestimmtes unteres Niveau erreicht, kehrt der entsprechend einer speziellen Sequenz programmierte Regelungs-Steuerungsblock des Bioreaktors die Zirkulation des Stroms um. Zu diesem Zweck wird die Pumpe P1, die eingeschaltet war, ausgeschaltet, die Pumpe P3, die ausgeschaltet war, wird eingeschaltet, und das bisher geöffnete Ventil V3 wird jetzt geschlossen.
Der in der Zone C1 herrschende Druck des Kulturraums wird also niedriger als der Druck p3, während der in der Zone C2 herrschende Druck p2 zwischen p1 und p3 enthalten ist, entsprechend einem in Bezug auf die vorhergehende Arbeitsweise umgekehrten Druckgradienten. Der Gesamtstrom zwischen den Membranen bewegt sich dann von der Zone C3 in Richtung Zone C2 des Kulturraums (s. 3). Bei dieser Betriebsart des Bioreaktors, den 3 und 5 entsprechend und "Aufwärtsphase" genannt, ermöglicht die Umkehrung des Stroms im Innern des Kulturraums dem frischen Nährmedium F1, das in der Kulturkammer zirkuliert, sich wieder aufzuladen mit frischen Nährelementen, die aus dem dritten flüssigen dynamischen Mittel F3 stammen, und die durch die "Abwärtsphase" verursachten Verluste zu kompensieren, unter anderem Wasser. Dieses (Regenerations) Basismittel F3 versorgt nämlich den Zellkulturraum wieder mit Glukose, Wasser und Spurenelementen.
Sobald das Volumen des Speichers R1 oder Expansionsgefäßes des Kreislaufs mit geschlossener Schleife, in dem das frische Nährmittel F1 zirkuliert, ein bestimmtes oberes Niveau erreicht, kehrt das entsprechend einer speziellen Sequenz programmierte Kontrollsystem des Bioreaktors erneut die Zirkulationsrichtung des Stroms um.
Die Wachstumsfaktoren sind also – aufgrund der in geschlossener Schleife realisierten Zirkulation des Mittels F1, das heißt des ersten flüssigen dynamischen Mittels, von dem sie ein Teil sind -, eingeschlossen in der geschlossenen Schleife und in den Abteilen C1 und C2 und ihre Konzentration schwankt zwischen einer Konzentration Co und Co+/–ΔC. Der reiche Nährboden wird also recycelt und die Nutzung der dank des Kulturraums und des Bioreaktors nach der Erfindung optimierten Wachstumsfaktoren optimiert.
Dieses Umkehrsystem des Stroms im Innern des Kulturraums ermöglicht, die Membranen durchquerende Ströme zu erzeugen, die schwache hydrodynamische Belastungen aufweisen, die kompatibel sind mit der Empfindlichkeit der kultivierten Zellen. Derart erhält man ein System langsamer "laminarer" Ströme. Diese Umkehrung der Ströme kann auch die Verstopfung der Filtermembranen verhindern, wobei der Membrandurchquerungs-Druckabfall (Index, der die Durchlässigkeit der Membran misst) in Echtzeit durch elektronische Manometer kontrolliert werden kann, die sich in jedem der Ströme des flüssigen dynamischen Mittels befinden.
Bei dieser Betriebsart des erfindungsgemäßen Bioreaktors zirkuliert das zweite flüssige dynamische Mittel, das in Höhe der Außenseitenwand eintritt und austritt, zwischen den beiden planen Filtermembranen des Kulturraums, im Innern des genannten Kulturraums entsprechend eines Kreislaufs mit offener Schleife oder geschlossener Schleife, abhängig von der im zugeteilten Funktion, wobei die Pumpen P1 und P3 stillstehen, und seine Eintritts- und Austrittskonfiguration wird festgelegt durch die Funktion, die man ihm zuteilen will.
Je nach Betriebsart des Bioreaktors – wenn zum Beispiel das zweite Mittel F2 in seiner ersten Funktion dazu dient, die in dem Kulturraum zu kultivierenden Zellen zu beimpfen und nach der Kultivierung zu entladen bzw. zu entnehmen, arbeitet es ebenso in offener Schleife wie in seiner dritten Funktion zur Reinigung des Zellkulturraums, um die inhibierenden Moleküle zu eliminieren. Wenn hingegen das flüssige dynamische Mittel F2 die Funktion des Gentransfers hat, arbeitet es während der Beimpfung und der Inkubation in geschlossener Schleife.
In ihrer ersten Funktion und gemäß der Betriebsart des Bioreaktors nach 6, wird das zweite flüssige dynamische Mittel F2, das die zu kultivierenden Zellen enthält, in der Zone C2 des Kulturraums mit einer Spritze beimpft, durch ein biokompatibles Septum hindurch, positioniert in einem der drei Zweige des Eintrittsstutzens EF2 (der Außenseitenwand), dessen Elektroventil V2E1 offen ist, während die Elektroventile V2E2 und V2E3 geschlossen sind. Während der Beimpfung des genannten Mittels sind die drei Elektroventile V2S1, V2S2 und V2S3, die sich in den drei Zweigen des Austrittsstutzens SF2 befinden, dem Eintrittsstutzen EF2 gegenüberstehend, geschlossen.
Bei der Rückgewinnung der Zellen nach der Kultivierung, sind die beiden Elektroventile V2E2 und V2E3 des Eintrittsstutzens EF2 geschlossen, das Elektroventil V2S1, in einem der drei Zweige des Austrittsstutzens SF2 befindlich, verbunden mittels einer Verbindungsleitung mit dem Rückgewinnungsspeicher der kultivierten Zellen, ist offen, während die Elektroventile V2S2 und V2S3 der beiden anderen Zweige des Austrittsrohrstutzens SF2 geschlossen sind. Dann wird durch Einschalten der Pumpe P2 das Regenerations-Basismittel aus dem Speicher R2 gepumpt, um den Inhalt des Abteils C2 (enthalten zwischen den beiden Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle) in die Zellensammeltasche zu entleeren. Eine Enzymbehandlung des Trypsin- oder Kollagen- und/oder DNA-Typs kann benutzt werden, um die extrazelluläre Matrix zu abzubauen, die von den Zellen während der Kultur erzeugt wurde, um ihre Verankerung zu erleichtern. Im Rahmen einer Blutbildungszellenkultur auf einem Makroträger des Edelkorallentyps, ermöglicht eine leichte Säuerung des Mittels auf pH=6.0 oder pH=6.5, die Edelkoralle aufzulösen und die Blutbildungszellen nach Reinigung zurückzugewinnen.
In ihrer dritten Funktion und entsprechend der Funktionsweise des Bioreaktors, wenn das zweite flüssige dynamische Mittel F2 die zur Reinigung des Zelleneinschließungsraums nötigen Elemente enthält und in offener Schleife arbeitet nach demselben Schließ- und Öffnungsprinzip der Elektroventile wie bei dem oben beschriebenen Betrieb mit der Ausnahme, dass der Eintrittsstutzen kein biokompatibles Septum aufweist, sondern mittels einer Verbindungsleitung mit dem Speicher R2 verbunden ist, der das gewählte Mittel F2 enthält.
Bei der Einspeisung des Reinigungsmittels F2 in die Zone C2 des Kulturraums in Höhe eines der drei Zweige der Eintrittsstutzens EF2 (der Außenseitenwand), dessen Elektroventil V2E2 geöffnet ist, sind die Elektroventile V2E1 und V2E2 geschlossen. Während der Einspeisung und der Rückgewinnung des genannten Reinigungsmittels sind die beiden Elektroventile V2S1, V2S2, die sich in den zwei Zweigen des Austrittsrohrstutzens SF2 befinden, geschlossen, das Elektroventil V2S3, das sich in dem anderen Zweig des Austrittsrohrstutzens SF2 befindet, ist offen, und der Reinigungsstrom zirkuliert kontinuierlich in offener Schleife. Der Ausgang des Elektroventils V2S3 kann an einen Stutzen angeschlossen sein, der zum Abfallbehälter führt. Der Abfallbehälter kann durch einen Mittelspeicher gebildet werden, der gleichzeitig mit der Gesamtheit der Stutzen des Bioreaktors, seiner Speicher, seiner Funktionsmodule und des Kulturraums sterilisiert wird, was die Sterilität des Stroms garantiert. Zwei 0,22μm-Filter können diesem Ganzen beim Abfall hinzugefügt werden, um die Sicherheit zu erhöhen und die Sterilität zu garantieren, insbesondere wenn man den Abfallspeicher wegen Überfüllung "warm" bzw. plötzlich austauschen muss.
In seiner zweiten Funktion und nach der Ausführungsart des Bioreaktors nach 6 wird das zweite Mittel F2, das die Gentransfervektoren enthält, in die Zone C2 des Kulturraums durch Öffnung des Elektroventils V2E2 eingespeist, das sich in einem der drei Zweige des Eintrittsstutzens EF2 befindet, wobei die Elektroventile V2E1 und V2E3 geschlossen sind. Bei der Einspeisung dieses Mittels sind die beiden Elektroventile V2S1, V2S3, die sich in dem zweiten Zweig des Stutzens SF2 befinden, geschlossen. Dieses Mittel F2 enthält die Gentransfervektoren, die während der für die Beimpfung und Inkubation notwendige Zeit im Closed-loop-Kreislauf zirkulieren. Wenn das Gentransferverfahren beendet ist, kehrt die Schleife F2 zum Reinigungsbetrieb zurück, wie oben beschrieben, um die eventuellen restlichen Vektoren zu beseitigen. Dann, nach Beendigung der Reinigung, wird die Kultivierung fortgesetzt entsprechend der Abwechslung der "Aufwärts-" und "Abwärtsphasen" der Ströme F1 und F3.
Anzumerken ist, dass eines der unerwünschten Epiphänomene während der Umkehrung des Stroms von der Abwärtsphase in die Aufwärtsphase die Möglichkeit ist, dass das Mittel F1 leicht kontaminiert wird durch die Abfälle, die aus den Zonen C2 und C3 stammen. Nun hat sich aber gezeigt, dass das Dilutionsphänomen diese mögliche Kontamination vernachlässigbar macht. Zudem wird der proximale Teil der Verbindungsleitung, die den Speicher des Basismittels F3 und den Kulturraum verbindet, mit direkt aus dem genannten Speicher stammendem frischem Mittel F3 gespeist und nur der distale, das heißt nahe beim Ventil V3 befindliche Teil der Leitung, die den Kulturraum mit dem Abfall verbindet, ist mit Abfällen belastet.
Der Kulturraum und der Bioreaktor nach der Erfindung können zur außerkörperlichen Tierzellenkultur benutzt werden und daher betrifft die Erfindung das Gebiet der Medizin. Beispielsweise können der Kulturraum und der Bioreaktor nach der Erfindung zur Erzeugung von Blutbildungszellen oder Leberzellen benutzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird also zur außerkörperlichen Kultur bzw. Züchtung von Knochenmarkzellen benutzt werden. Die Blutbildung ist der physiologische Prozess, der ermöglicht, alle korpuskuläre Elemente des Bluts zu erneuern (da die reifen Blutzellen eine begrenzte Lebensdauer haben) durch die Vermehrung und Differenzierung einer multipotenten primitiven ursprünglichen Zelle (Stammzelle genannt), die fähig ist, alle Zelltypen, Blutzellen, auch korpuskuläre Elemente des Bluts genannt, zu erzeugen. Dieser Prozess ist unter der Kontrolle von Blutbildungs-Wachstumsfaktoren, auch Cytokine genannt.
Das Transplantieren unreifer Blutbildungszellen, Blutbildungs-Progenitoren genannt, bei einem Patienten mit einer Aplasie, bedingt durch einen Unfall oder eine Krebsbehandlung, ist ein Mittel, um die Aktivität des verletzten Knochenmarks wieder anzuregen, um ein Wiedereinsetzen der Blutbildung auszulösen.
Dieser Prozell impliziert, dass Prognitoren – Zellen in einem frühreifen Entwicklungsstadium – dem Patienten durch Zytapherese (cytapherese) oder direkt durch Punktierung des Knochenmarks entnommen werden und nach Züchtung wieder injiziert werden, so dass diese Zellen das Blut- und Immunsystem des Patienten wieder herstellen können (im Falle einer kompletten Aplasie) oder die morbide Anzythämie-Übergangsphase (Neutropenie-, Lymphopenie- und Thrombopeniephase) kompensieren können, um das Wiedereinsetzen der endogenen Blutbildung des Aplasie-Opfers zu ermöglichen (im Falle einer zufälligen bzw. schädlichen Bestrahlung).
Ebenso ist es im Falle einer akuten Leberinsuffzienz mit kurzfristiger Todesgefahr notwendig, das Versagen der Lebfunktionen des Patienten durch eine außerkörperliche Blutentgiftungsbehandlung zu lindern, was eine große Menge Hepatozyten erforderlich macht, um die notwendigen metabolischen Funktionen zu bewirken. Der Zellraum sowie der Bioreaktor, wie oben beschrieben, können die Produktion von Leberzellen in ausreichender Menge für eine effiziente Behandlung und eine schnelle Entgiftung ermöglichen, die kompatibel sind mit den hämodynamischen Belastungen, welche die außerkörperliche Blutzirkulation für den Patienten bedeutet.
Zum Beispiel ermöglicht ein Bioreaktor mit einem Nutzvolumen, das zwischen 50 und 100 ml variieren kann, eine außerkörperliche Tierzellenkultur über einen Zeitraum von ungefähr 10 Tagen im Rahmen der Produktion einer zellularen Biomasse für den Transplantationsgebrauch oder als Palliativum eines Versagens. Im Rahmen der Wiederherstellung eines organisierten und hierarchisierten Gewebemodells können die durch den Bioreaktor erreichten Lebensdauern mehrere Monate erreichen.
Für eine Transplantation von Zellen des Typs Knochenmarkzellen (hämatoplastischen Zellen) ist es notwendig, dass 10⁶ bis 10⁷ CFU (Typ unreifer Zellen)/kg des Gewichts des Patienten aus der Kultur gewonnen werden. Diese klinische Schwelle, die teilweise den Erfolg der Transplantation bedingt, ermöglicht, die Zahl der aus der hämatoplastischen Kultur stammenden, für die Transplantation notwenigen Zellen auf 10¹⁰ zu schätzen. Der oder die Kulturräume sowie die Bioreaktoren wie oben beschrieben können für diesen Anwendungstyp dimensioniert werden.
Die pH-, Temperatur- und Sauerstoffpartialdruck-Bedingungen einer oben erwähnten Zellkultur betragen 7,4 für einen Wachstums-pH-Wert, 37,5 °C für die Temperatur und 15 % für den Sauerstoffpartialdruck (in Sättigungsprozent). Das Nährmittel ist ein synthetische Mittel, gebildet durch ultra-gereinigte oder synthetisierte Proteine und Spurenelemente (wie Eisen, Selen, Transferrin, Vitamine und andere) und einen lebenswichtigen Farbstoff. Dieses Nährmittel ist angereichert mit Wachstumsfaktoren, nämlich Cytokine, deren Konzentration je nach Bedarf zwischen 10 und 100 ng/ml variieren kann. Zudem können die Cytokine mit der Präsenz von Heparanen in einem biologisch aktiven Zustand stabilisiert werden. Das Regenerations-Basismittel wird vertrieben unter folgenden handelsüblichen Bezeichnungen: MEM-alpha oder RPMI1640 oder auch IMDM.

Claims

Kulturraum zur außerkörperlichen Tierzellenkultur, abgegrenzt durch eine Umhüllung, die eine Symmetrieachse aufweist, und gebildet durch eine äußere Seitenwand, zwei Endwände und Eingänge und Ausgänge für dynamische flüssige Medien, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: a) wenigstens zwei plane Filtermembrane mit unterschiedlicher Durchlassschwelle, senkrecht zu der Symmetrieachse; b) zwischen den Membranen ein biokompatibles Makroträgerbett, das die Haftung der Zellen im Kulturzustand begünstigt; c) zwei Endwände mit Verteilungsrillen der dynamischen flüssigen Medien; d) drei Eingangs- und Ausgangspaare der dynamischen flüssigen Medien, bestimmt zur Versorgung des Kulturraums der Zellen und zur selektiven Entnahme der kultivierten Zellen, der aus ihrer Kultivierung resultierenden Abfälle und der überschüssigen Nährstoffe, wobei zwei der genannten Paare an die Verteilungsrillen aufweisenden Endwänden angeschlossen sind und das dritte zwischen den beiden planen Filtermembranen angeschlossen ist.
Kulturraum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine der planen Filtermembrane eine Durchlassschwelle zwischen 0,12 μm und 0,44 μm hat, und die andere plane Filtermembran eine Durchlassschwelle von höchstens 15 Kilodalton (kDa) hat.
Kulturraum nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine der planen Filtermembrane eine Durchlassschwelle zwischen 0,18 μm und 0,26 μm hat, und die andere plane Filtermembran eine zwischen 10 und 12 kDa enthaltene Durchlassschwelle hat.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Membrane mit unterschiedlicher Durchlassschwelle einen Abstand von höchstens 400 μm haben.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zwischen den Membranen vorhandenen Makroträger eine zylindrische oder polyedrische oder sphärische Form aufweisen.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das die Makroträger bildende Material ausgewählt wird aus der Gruppe der mineralischen Materialien, der metallischen Materialien und der polymeren Materialien.
Kulturraum nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das die Makroträger bildende Material ausgewählt wird aus der Gruppe, die gebildet wird durch Edelkorallen, Titan und seine Legierungen, Polyamide.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das durch Makroträger gebildete und zwischen zwei Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle befindliche Bett eine Dicke von höchstens 400 μm hat.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verteilungsrillen der Endwände ein Hauptnetz bilden, wobei diese Rillen vorzugsweise in der Ausbreitungsrichtung der dynamischen flüssigen Medien divergieren.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verteilungsrillen der Endwände durch ein Sekundärnetz vervollständigt werden, das durch Sekundärrillen gebildet wird, die im Wesentlichen senkrecht sind zu den Rillen des Hauptnetzes.
Kulturraum nach dem einem oder dem anderen der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hauptnetz und des Sekundärnetz ein Gitternetz zur Ausbreitung der dynamischen flüssigen Medien bilden.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Rillen des Hauptnetzes und/oder des Sekundärnetzes der Endwände in Kontakt sind mit den Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Rillen des Hauptnetzes eine Tiefe von wenigstens 5 mm und eine Breite von höchstens 2 mm haben, und dass der zwischen zwei benachbarten Rillen enthaltene Abstand höchstens 2 mm beträgt.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Rillen des Sekundärnetzes eine Tiefe von höchstens 2 mm und eine Breite von höchstens 2 mm haben.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eines der beiden Eingangs- und Ausgangspaare F1 der dynamischen flüssigen Medien in Höhe einer Endwand angeschlossen ist und den Nährboden der Zellen durch die Verteilungsrillen mit einem Wachstumsfaktoren umfassenden Nährmedium versorgt, durch die plane Filtermembran mit einer zwischen 0,12 und 0,44 enthaltenen Durchlassschwelle hindurch.
Kulturraum nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Eingangs- und Ausgangspaar des dynamischen flüssigen Mediums F1 als geschlossener Kreis gemäß einer Schleife funktioniert.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Eingangs- und Ausgangspaar des dynamischen flüssigen Mediums F2, angeschlossen zwischen den beiden Filtermembranen, die Funktionen der Einführung der zu kultivierenden Zellen und der Rückgewinnung der kultivierten Zellen, des Transfers der Gene und der Rückgewinnung der genetisch modifizierten Zellen, und der Einführung einer Flüssigkeit zum Ausspülen und Eliminieren der die Entwicklung der Zellkultur hemmenden Moleküle.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das andere der beiden Eingangs- und Ausgangspaare des dynamischen flüssigen Mediums F3 als offener Kreislauf in Höhe der anderen Endwand angeschlossen ist und durch die Verteilungsrillen den Nährboden der Zellen mit einem Nährmedium ohne Wachstumsfaktoren versorgt, durch die plane Filtermembran mit der Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa hindurch.
Kulturraum nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die drei Eingangs- und Ausgangspaare der dynamischen flüssigen Medien sich in drei vertikalen Ebenen befinden, durchquert von der Symmetrieachse der Umhüllung, wobei diese Ebenen zwischen dem ersten Eingang und dem zweiten Eingang der dynamischen flüssigen Medien um einen Winkel von ungefähr 60° versetzt sind und zwischen dem ersten und dem dritten Eingang um einen Winkel von ungefähr 120°, wobei für die Ausgänge in Bezug auf die Winkel dieselbe Anordnung gilt.
Bioreaktor zur außerkörperlichen Tierzellenkultur, mit einem Kulturraum, abgegrenzt durch eine Umhüllung, die eine Symmetrieachse aufweist, und gebildet durch eine äußere Seitenwand, zwei Endwände und Eingänge und Ausgänge für dynamische flüssige Medien, und mit Zirkulationseinrichtungen der genannten Medien in dem genannten Kulturraum, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: a) einen Kulturraum der genannten Zellen mit wenigstens zwei planen Filtermembranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle, senkrecht zu der Symmetrieachse, und zwischen den Membranen mit unterschiedlicher Durchlassschwelle ein biokompatibles Makroträgerbett, das die Haftung der Zellen im Kulturzustand begünstigt, wobei der genannte Kulturraum durch eine Umhüllung mit Symmetrieachse abgegrenzt wird, die zwei Endwände mit Verteilungsrillen der dynamischen flüssigen Medien umfasst und drei Eingangs- und Ausgangspaare der dynamischen flüssigen Medien F1 ,F2 und F3, bestimmt zur Versorgung des Kulturraums der Zellen und zur selektiven Entnahme der kultivierten Zellen, der aus ihrer Kultur resultierenden Abfälle und der überschüssigen Nährstoffe, wobei zwei der genannten Paare an die Verteilungsrillen aufweisenden Endwänden angeschlossen sind und das dritte zwischen den beiden planen Filtermembranen angeschlossen ist; b) Zirkulationseinrichtungen des ersten dynamischen flüssigen Mediums F1 als Kreislauf in Form einer geschlossenen Schleife und ein das genannte Medium enthaltendes Expansionsgefäß R1, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind; c) Zirkulationseinrichtungen des zweiten dynamischen flüssigen Mediums F2 als Kreislauf in geschlossener Schleife oder in offener Schleife, abhängig von der jeweiligen Funktion des genannten Mediums, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind; d) Zirkulationseinrichtungen des dritten dynamischen flüssigen Mediums F3 gemäß einem Kreislauf in offener Schleife und einem das genannte Medium enthaltenden Speicher R3, wobei diese Einrichtungen mit dem genannten Kulturraum verbunden sind; e) Einrichtungen zur Kontrolle und Regelung sowie solche zur Konditionierung der dynamischen flüssigen Medien, verbunden mit einer Regelungs-Steuerungsgruppe.
Bioreaktor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zirkulationseinrichtungen der genannten flüssigen Medien F1, F2 und F3 jeweils mit einer Pumpe P1, P2 und P3 ausgerüstet sind, die mit der Regelungs-Steuerungsgruppe verbunden sind.
Bioreaktor nach den Ansprüchen 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zirkulationseinrichtungen des dritten dynamischen flüssigen Mediums F3 mit einem mit der Regelungs-Steuerungsgruppe verbundenen Ventil V3 ausgerüstet sind.
Bioreaktor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Expansionsgefäß R1 das wachstumsfaktorenreiche dynamische flüssige Medium F1 enthält und mit einem Filter mit einer 0,22μm-Durchlassschwelle und einem Eletroventil V1 ausgestattet ist, das durch die Regelungs-Steuerungsgruppe gesteuert wird.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Expansionsgefäß R1 mit Sensoren für ein oberes Niveau und ein unteres Niveau ausgestattet ist, die dazu dienen, die Umkehrung der Zirkulation der Fluide im Innern des genannten Kulturraums auszulösen.
Bioreaktor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionierungseinrichtungen der dynamischen flüssigen Medien Einrichtungen zur Regelung des Sauerstoffgehalts, der Temperatur und des pH-Werts dieser Medien umfassen.
Bioreaktor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionierungseinrichtungen der dynamischen flüssigen Medien funktionelle Einheitsmodule sind, dimensioniert für einen bestimmten Massen- oder Wärmeenergietransferwert.
Bioreaktor nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Module Belüfter, Wärmetauscher, pH-Regulatoren oder auch Module zur Dialyse, Ultrafiltrierung sind.
Bioreaktor nach den Ansprüchen 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Kulturraum nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfasst.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Druck p1 in der Zone C1 des genannten Kulturraums herrscht, die sich zwischen der oberen Endwand des genannten Raums und der planen Filtermembran mit der Durchlassschwelle 0,12 μm bis 0,44 μm befindet.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass ein Druck p2 in der Zone C2 des Kulturraums herrcht, die sich zwischen den beiden planen Filtermembranen mit unterschiedlichen Durchlassschwellen befindet.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass ein Druck p3 in der Zone C3 des genannten Kulturraums herrscht, die sich zwischen der planen Filtermembran mit der Durchlassschwelle von höchstens 15 kDa und der unteren Endwand der Umhüllung des genannten Raums befindet.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das wachstumsfaktorenreiche Nährmedium F1 aus der Zone C1 des Kulturraums in die Zone C3 des genannten Kulturraums dräniert wird, wenn der Druck p1 größer ist als der Druck p3, und dass der Druck p2 in dem Kulturraum zwischen p1 und p3 enthalten ist.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das wachstumsfaktorenlose Nährmedium F3 aus der Zone C3 des Kulturraums in die Zone C1 des genannten Kulturraums dräniert wird, wenn der Druck p3 größer ist als der Druck p1, und dass der Druck p2 in dem Kulturraum zwischen p1 und p3 enthalten ist.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Öffnung bzw. Inbetriebnahme der Pumpe P1 die Versorgung des Kulturraums mit wachstumsfaktorenreichem Nährmedium F1 ermöglicht, wobei die Pumpe P3 stillsteht, und dass das Gegendruckventil V3 so geregelt bzw. eingestellt ist, dass der in der Zone 1 des genannten Kulturraums herrschende Druck p1 höher ist als der in der Zone C3 des genannten Raums herrschende Druck p3, wissend dass der in der Zone C2 herrschende Druck p2 zwischen den Drücken p1 und p3 enthalten ist.
Bioreaktor nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der gemäß einer speziellen Sequenz programmierte Regelungs-Steuerungsblock die Zirkulationsrichtung der Flüsse umkehrt, indem er die Pumpe P1 ausschaltet und die Pumpe P3 einschaltet, sobald das in dem Expansionsgefäß R1 enthaltene Volumen ein unteres Niveau erreicht.
Bioreaktor nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ventil V3 geschlossen ist.
Bioreaktor nach den Ansprüchen 35 und 36, dadurch gekennzeichnet, dass das wachstumsfaktorenlose Grundstoff-Nährmedium die Neuversorgung des Kulturraums ermöglicht, wo bzw. wenn der Druck p3 in der Zone C3 des genannten Raums höher ist als der in der Zone C1 herrschende Druck p1, wissend dass der in der Zone C2 herrschende Druck p2 zwischen den Drücken p1 und p3 enthalten ist.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpen P1 und P3 stillstehen, wenn die Eingangs- und Ausgangszirkulationskonfiguration des zweiten dynamischen flüssigen Mediums F2 in Abhängigkeit von der ihr zugeteilten Funktion als geschlossener oder offener Kreis festgelegt ist.
Bioreaktor nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das dynamische flüssige Medium F2 zur Einführung der zu kultivierenden Zellen und der Rückgewinnung der kultivierten Zellen dient.
Bioreaktor nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das dynamische flüssige Medium F2 zur Einführung von Genen in den die Zellkultur enthaltenden Kulturraum und bei der Rückgewinnung der kultivierten, genetisch modifizierten Zellen als Transfervektor dient.
Bioreaktor nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das dynamische flüssige Medium F2 zur Einführung einer Flüssigkeit zum Ausspülen der die Entwicklung der Zellkultur hemmenden Moleküle und zur Elimination dieser Moleküle dient.
Bioreaktor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass für die Inokulation des genannten Mediums F2 in der Zone C2 des Zellkulturraums durch ein biokompatibles Disseptum hindurch, mit Hilfe einer Spritze, das Elektroventil V2E1 geöffnet wird, während die Elektroventile V2E2, V2E3, V2S1, V2S2 und V2S3 geschlossen werden.
Bioreaktor nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass für die Rückgewinnung der Zellen nach der Kultur aus dem Kulturraum das Elektroventil V2S1 geöffnet wird, die Elektroventile V2E2, V2E3, V2S2 und V2S3 geschlossen werden und die Pumpe P2 in Betrieb genommen wird, um den Inhalt der Zone C2 in den Zellensammelbehälter zu entleeren.
Bioreaktor nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass – zur Elimination der entwicklungshemmenden Moleküle – wenn das zweite Medium F2 die zum Spülen des Zelleneinschließungsraums nötigen Elemente enthält, bei der Einführung dieses Mediums das Elektroventil V2E3 geöffnet ist und die Elektroventile V2E1, V2E2 geschlossen sind.
Bioreaktor nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Spülmedium F2 kontinuierlich in einer offenen Schleife zirkuliert, und dass bei der Einführung und der Rückgewinnung dieses Spülmediums die Elektroventile V2E1, V2E2, V2S1, V2S2 geschlossen sind und die Elektroventile V2E3, V2S3 geöffnet sind.
Bioreaktor nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass für die Inokulation der genetischen Transfervektoren, enthalten in dem in einem geschlossenen Kreis in der Zone C2 des Kultunaums zirkulierenden Medium F2, das Elektroventil V2E2 geöffnet wird, während die Elektroventile V2E1, V2E3, V2S1, V2S3 geschlossen werden.
Bioreaktor nach wenigstens einem der Ansprüche 20 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Regelungs-Steuerungsgruppe die Gesamtheit der Informationen bezüglich der dynamischen flüssigen Medien F1, F2, F3 – geliefert durch die Kontroll- und Regelungseinrichtungen – und die Informationen bezüglich der diversen Speicher bzw. Behälter, Pumpen, Ventile und der in den Zonen C1, C2, C3 des Kulturraums herrschenden Drücke erhält, sie verarbeitet und die nötigen Betriebsbefehle aussendet.