DE60013580T2

DE60013580T2 - Verbesserung des keimens von somatischen pflanzlichen embryonen durch vorbehandlung

Info

Publication number: DE60013580T2
Application number: DE60013580T
Authority: DE
Inventors: Shihe Fan; Vesna Janic
Original assignee: Cellfor Inc
Current assignee: Arborgen Inc
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: DE60013580D1; EP1170986A1; AU3951900A; WO2000062599A1; AU776443B2; NZ514743A; CA2369751C; ATE275330T1; EP1170986B1; CA2369751A1; BR0009784B1; BR0009784A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Keimung von somatischen Pflanzenembryonen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung somatischer Pflanzenembryonen in einer Nährstoffbehandlungsstufe, um die anschließende Keimung solcher Embryonen zu verbessern.
STAND DER TECHNIK
Ein Pflanzensamen ist eine vollständige, in sich geschlossene Fortpflanzungseinheit, die im Allgemeinen besteht aus einem zygotischen Embryo, Nährstoffspeicherreserven in als Kotyledon, Endosperm oder Megagametophyten bezeichneten Strukturen, und einer schützenden Samenschale, die die Speicherreserven und den Embryo umgibt. In der Natur wird die Reifung von Pflanzensamen für gewöhnlich von einem allmählichen Wasserverlust über einen Zeitraum auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 10-35 % begleitet. Sobald dieser niedrige Feuchtigkeitsgehalt erreicht ist, können Pflanzensamen über längere Zeiträume gelagert werden.
Die Keimung von zygotischen Pflanzensamen wird im Allgemeinen durch einen oder mehr Umweltfaktoren ausgelöst, wie das Vorliegen von Wasser, Sauerstoff, optimaler Temperatur und Licht. Samen keimen durch eine Reihe von Vorgängen, die mit der Aufnahme von Wasser durch einen ruhenden, trockenen Samen beginnen, und dann von verschiedenen biophysikalischen, biochemischen und physiologischen Vorgängen gefolgt werden, was schließlich zu einer Streckung des Embryos entlang seiner Achse führt.
Um die Erörterung der vorliegenden Erfindung zu vereinfachen, wird der kontinuierliche Prozess der Samenkeimung in drei Phasen unterteilt. Phase 1 wird als Quellung oder Imbibition bezeichnet und ist gekennzeichnet durch ein schnelles anfängliches Einströmen von Wasser in den Samen. Weitere wichtige Vorgänge in Phase 1 umfassen das Einleiten der Reparatur von Schäden an DNA und Mitochondrien, die während des Samenaustrocknungs- und/oder Reifungsprozesses aufgetreten sein können, und den anschließenden Beginn der Proteinsynthese, die durch vorhandene mRNA ermöglicht wird.
Phase 2 ist durch eine deutliche Verringerung der Wasseraufnahmerate (d.h. die Quellung ist abgeschlossen) gekennzeichnet. Dies wird von einer Aktivierung oder De-Novo-Synthese von Enzymen begleitet, die auf die Hydrolyse der komplexen Speicherreserven von Kohlehydraten, Proteinen und Lipiden im Embryo und der Kotyledone oder Megagametophyten spezialisiert sind. Die Hydrolyse dieser komplexen Speicherreserven stellt die Substrate bereit, die für die Atmung und das Wachstum der zygotischen Embryonen erforderlich sind.
Phase 3 ist durch eine erneute stark gesteigerte Wasseraufnahme gekennzeichnet. Das in Phase 3 absorbierte Wasser wird in erster Linie für die Einleitung der meristematischen Zellteilung an den Wurzel- und Sprossspitzen des Embryos und zur Aufnahme in Zellen entlang der Embryonalachse verwendet. Das von den Axialzellen des Embryos aufgenommene Wasser übt einen Turgor aus, der zu einer axialen Streckung der Zellen führt. Das Ergebnis ist, dass der Embryo sich so weit streckt, dass er die Samenschale durchbricht. Das Durchbrechen eines Sprosses oder eines Wurzelkeimes der Samenschale kennzeichnet den Abschluss der Keimung und den Beginn des Wachstums und der Entwicklung der Setzlinge. Geschwindigkeit und Erfolg der Keimung zygotischer Samen können in Abhängigkeit verschiedener Faktoren stark schwanken, wie die Nachwirkungen der Umweltbedingungen, unter denen die Entwicklung und Reifung des Samens verlief, die Menge an Speicherreserveverbindungen, die während des Samenreifeprozesses gebildet wurden, die Lagerungsdauer und die Bedingungen der Lagerungsumgebung (z.B. Temperatur und Feuchtigkeit). Vom kommerziellen Standpunkt aus ist es wünschenswert, das Risiko des Fehlschlagens der Keimung zu verringern und sicherzustellen, dass die Samen schnell und gleichmäßig keimen.
Der gewerbliche Bedarf an einer optimalen Samenkeimung hat zur Entwicklung von Verfahren für zygotische Samen geführt, die im Stand der Technik als „Samenvorbehandlung" oder "Saatgut-Priming" bekannt sind. Dieser Begriff kann definiert werden als „Wasseraufnahme, die jedoch nicht ausreichend ist für ein Austreten von Keimwurzeln, zur Initiierung der frühen Keimungsvorgänge, vorzugsweise mit anschließender Trocknung (McDonald, 2000). Derzeit werden vier Verfahren kommerziell zur Saatgutvorbehandlung angewandt. Diese sind Hydrobehandlung, osmotische Behandlung, Matrixbehandlung und Vorkeimen. Ungeachtet des angewandten Verfahrens sind die Grundprinzipien der Saatgutvorbehandlung folgende: (1) Die einleitenden Keimungsphasen werden spezifisch und ausschließlich durch die Kontrolle der Wasserverfügbarkeit für die Samen aktiviert und (2) die Keimungsprozesse, die durch ein externes Vorbehandlungsverfahren initiiert werden, werden nachfolgend durch eine Austrocknungsphase gestoppt.
Eines der Probleme bei der Vermarktung von Techniken für somatische Embryonen besteht in der relativ geringen Umwandlungsrate zu Setzlingen und in der geringen Kraft der Setzlinge bei einer Umwandlung. Es wäre eindeutig vorteilhaft, diese Umwandlungsrate und die Kraft der Setzlinge zu verbessern.
Ein bedeutendes, zusätzliches Problem besteht jedoch darin, dass herkömmliche Ex-Vitro-Verfahren, Praktiken und Umge bungen aus dem Gartenbau nicht für die Aussaat und Keimung von somatischen Pflanzenembryonen verwendet werden können. Der Hauptgrund für die Schwierigkeiten bei der erfolgreichen Keimung von somatischen Pflanzenembryonen in nicht-sterilen, gewerblichen Wachstumsumgebungen mittels herkömmlicher Aufzuchtverfahren ist, dass gereifte somatische Pflanzenembryonen während der ersten Keimungsphasen keine eigenen Kohlenstoffverbindungen erzeugen oder Energie aus der Photosynthese beziehen können. Außerdem fehlen ihnen ihre eigenen Energie- und Nährstoffquellen, die den Speicherreserven entsprechen, die bei zygotischem Saatgut in Kotyledonen oder im Endosperm oder im Megagametophytengewebe enthalten sind. Folglich muss den somatischen Pflanzenembryonen eine exogene Energiequelle in Form eines ausgewählten Zuckers in einem Kulturmedium oder anderer Nährstoffe geliefert werden, damit die Keimung erfolgreich ablaufen kann. Derartige Kulturmedien sind hochanfällig für das Eindringen von Mikroorganismen, die unweigerlich zum Tod des Embryos führen oder das Überleben und die Keimung beeinträchtigen. Daher müssen Aussaat und erfolgreiche Keimung von somatischen Pflanzenembryonen auf Kulturmedien unter strikt sterilen Bedingungen erfolgen.
Obwohl zahlreiche Protokolle zur Aussaat und Keimung von somatischen Pflanzenembryonen und zum Ziehen derselben zu intakten, funktionsfähigen Setzlingen bekannt sind, hängen diese Protokolle alle von der Verwendung steriler Verfahren in Kombination mit In-Vitro-Systemen ab, die von kontaminierenden Mikroorganismen und Pilzen biologisch isoliert werden müssen, bis bei den somatischen Pflanzenembryonen die Keimung erfolgreich abgeschlossen ist und diese autotroph leben können. Daher ist keines dieser Protokolle mit herkömmlicher Ausrüstung und Verfahren aus dem Gartenbau vereinbar.
Die bekannten Protokolle zur Keimung von somatischen Pflanzenembryonen fallen im Allgemeinen unter zwei Kategorien. In der ersten Kategorie finden sich Protokolle, die auf verschiedenen In-Vitro-Verfahren basieren, bei denen im Allgemeinen nackte somatische Pflanzenembryonen, d.h. Embryonen ohne Samenschale, unter Verwendung steriler Verfahren auf sterilisierten, halbfesten oder flüssigen Medien ausgesät werden, die sich auf einem festen Träger wie einer Petrischale oder einem Phytatray^TM befinden, um die Keimung unter biologisch isolierten, sterilen Bedingungen zu ermöglichen (z.B. U.S. Patente 5,183,757; 5,294,549; 5,413,930; 5,464,769; 5,506,136) und bei denen anschließend die auskeimenden Samen in übliche Anbausysteme verpflanzt werden. Die wichtigsten Nachteile derartiger In-Vitro-Protokolle zur Aussaat nackter somatischer Pflanzenembryonen sind, dass (a) typischer Weise jeder Embryo bei den Keimungs- und Umpflanzungsschritten per Hand gehandhabt und behandelt werden muss und dass (b) die Verfahren und Kulturbedingungen während der Umpflanzung somatischer auskeimender Samen aus den In-Vitro-Keimungsmedien in die Gartenbau-Anbaumedien streng erhalten werden müssen. Obwohl zahlreiche Möglichkeiten der Automatisierung, einschließlich Robotik und maschinelles Sehen, auf ihre Nützlichkeit in der kostenwirksamen Verringerung oder Eliminierung der aufwändigen Handarbeit, die derzeit bei der Aussaat nackter Embryonen notwendig ist, untersucht wurden (Roberts et al., 1995), gibt es derzeit keine gewerbliche Ausrüstung, mit der die In-Vitro-Protokolle für die Keimung von nackten somatischen Pflanzenembryonen und anschließendes Umpflanzen in übliche Aufzuchtsysteme zuverlässig, steril und kostenwirksam ausgeführt werden können.
Die zweite Kategorie von Protokollen lehrt die Einkapselung (im Allgemeinen Gel-Einkapselung) von somatischen Embryonen (z.B. U.S. Patente 4,777,762; 4,957,866; 5,183,757; 5,482,857), um einen Weg bereitzustellen, auf dem die Embryonen voraussichtlich mittels mechanischer Geräte, wie Sämaschinen und Flüssigdrillmaschinen, in übliche Anbausysteme gesät werden können. Es gibt jedoch eine Reihe von Nachteilen bei in Gel eingekapselten somatischen Embryonen. Durch die physikalischen Eigenschaften der hydratisierten, halbfesten eingekapselten Embryonen sind diese nicht zur Verwendung mit konventioneller Säausrüstung geeignet, die derzeit für die kommerzielle Pflanzenaufzucht erhältlich ist, da die halbfesten, in Gel eingekapselten Embryonen dazu neigen bei der Handhabung zusammenzuklumpen und daher schwer zu trennen und zu verteilen sind. Außerdem verstopfen die Zusammensetzungen eingekapselter Embryonen, die nach dem Stand der Technik vorbereitet wurden, die konventionelle Ausrüstung und es ist daher derzeit nicht möglich, eingekapselte Embryonen mit konventionellen Sägeräten auszusäen. Folglich wurden neue Geräte speziell dafür entwickelt, eingekapselte somatische Embryonen in übliche Anbausysteme einzubringen. Sakamoto et al. (1995) gibt einen Überblick über derartige Sägeräte, die jedoch lediglich als Prototypen entwickelt und getestet wurden. Aufgrund mechanischer Einschränkungen und hoher Kosten, die mit den Prototypen mechanischer Sämaschinen verbunden sind, die für die Aussaat eingekapselter Embryonen entwickelt wurden, sind derzeit keine im Handel zum Kauf oder zur Verwendung erhältlich.
Ein weiterer Nachteil eingekapselter somatischer Embryonen ist die fehlende Verfügbarkeit von Nährstoffen, die zygotische Embryonen charakteristischer Weise aus dem vorhandenen Endosperm oder Megagametophytengewebe erhalten. Daher wurde die Einkapselungstechnik für somatische Embryonen dahingehend erweitert, dass dabei auch verschiedene Nährstoffe, wie Zucker, Düngemittel und Sauerstoff, in das Kapselmedium eingearbeitet werden (z.B. Carlson & Hartle, 1995; U.S. Patente 4,583,320; 5,010,685; 5,236,469). Ein deutlicher Nachteil in Verbindung mit eingekapselten Embryonen mit Nährstoffergänzung ist jedoch ihre Anfälligkeit für den Befall mit Mikroben während der Herstellung, Lagerung und Keimung, wenn die Keimung auf nicht-sterilen Medien statt findet.
Außerdem muss darauf hingewiesen werden, dass, obwohl ein bedeutender Teil des Standes der Technik (z.B. PCT-Anmeldung WO 94/24847 und U.S. Patente 5,010,685; 5,236,469; 5,427,593; 5,451,241; 5,486,218) Verfahren zur Herstellung von „künstlichem Saatgut" lehrt, das aus somatischen Embryonen besteht, welche in Gelen eingekapselt sind, die wahlweise mit Nährstoffen angereichert sein können oder nicht, und die von einer starren Umhüllung umgeben sein können oder nicht, und obwohl der Stand der Technik sich auf die Ex-Vitro-Aussaat besagten künstlichen Saatguts in Keimungsmedien bezieht, die aus Erd- oder erdfreien Mischungen bestehen, lehrt der Stand der Technik nur Verfahren zur In-Vitro-Keimung des künstlichen Saatguts, d.h. auf sterilisierten, halbfesten Labormedien. Es werden im Stand der Technik keine Verfahren für die Aussaat der eingekapselten somatischen Embryonen und/oder des hergestellten und/oder künstlichen Saatguts in konventionelle Anbausysteme unter Verwendung herkömmlicher Säausrüstung gelehrt oder anderweitig beschrieben.
Der entscheidenste Nachteil bei allen Verfahren nach dem Stand der Technik zur Einkapselung oder anderweitigen Ummantelung von somatischen Embryonen besteht jedoch darin, dass somatische Embryonen, die nach diesen Protokollen behandelt wurden, als Folge davon typischer Weise geringere Keimkraft und geringeren Keimerfolg aufweisen als entsprechende zygotische Samen (Carlson & Hartle, 1995). Carlson & Hartle (1995) kamen zu dem Schluss, dass noch beträchtlicher Forschungsaufwand nötig ist, bis „hergestelltes" oder „künstliches" Saatgut basierend auf der Einkapselung und/oder Umhüllung von somatischen Embryonen praktischen Nutzen aufweisen wird. Es ist jedoch anzumerken, dass die Keimkraft nackter somatischer Embryonen, d.h. ohne Umhüllung oder Einkapselung, die nach den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren hergestellt, und dann unter Verwendung steriler Verfahren auf In-Vitro-Keimungsmedien ausgesät, und dann unter sterilen Bedingungen zur Keimung gebracht worden sind, in etwa der der entsprechenden zygotischen Samen entsprechen kann (z.B. über 85 %) (Gupta & Grob, 1995).
Timmis et al. (U.S. Patent 5,119,588) lehren ein Verfahren, mit dem somatische Pflanzenembryonen in Gartenbaubehälter gesät werden können, die mit partikelförmigen erdähnlichen Substraten gefüllt sind. Lösungen mit Kohlenstoffverbindungen, die als Energiequellen dienen, und anderen Nährstoffen werden vor oder nach Aussaat der Embryonen zu den Substraten gegeben. Die Autoren lehren jedoch, dass es wesentlich ist, dass die Behälter, Substrate, Nährstofflösungen und anderen Bestandteile ihres Systems biologisch steril sein müssen. Außerdem muss nach Aussaat der somatischen Embryonen in ihr System unter Verwendung steriler verfahren jeder einzelne Behälter biologisch getrennt von den anderen und von der äußeren Umwelt und in sterilem Zustand gehalten werden, bis der Embryo erfolgreich gekeimt, funktionelle Wurzeln und Sprosse gebildet und den Autotrophiezustand erreicht hat. Erst wenn der Autotrophiezustand erreicht wurde, können die somatischen Setzlinge aus den sterilen Bedingungen ihres Systems entnommen werden und in eine übliche gewerbliche Anbauumgebung verpflanzt werden.
Auch wenn es möglich ist, somatische Pflanzenembryonen auf Kulturmedien unter Verwendung steriler Verfahren erfolgreich zur Keimung zu bringen und die auskeimenden Samen dann in eine Zucht-Produktions-Umgebung zu verpflanzen, sind derartige Verfahren arbeitsintensiv, langsam und sehr kostspielig. Außerdem sind somatische Embryonen, die nach dem Stand der Technik erhalten wurden, für die Systeme und die Ausrüstung, die üblicherweise bei der kommerziellen Herstellung von Pflanzenmaterial verwendet werden, nicht geeignet. Daher besteht immer noch ein Bedarf an einem praktischen Verfahren für die Versorgung somatischer Pflanzenembryonen mit exogenen Energie- und Nährstoffquellen in einer Art und Weise, dass die Ex-Vitro-Keimung von somatischen Embryonen sowie die anschließende Pflanzenentwicklung und das Pflanzenwachstum unter nicht-sterilen Bedingungen ermöglicht und maximiert werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, die Keimung von somatischen Pflanzenembryonen zu verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, die Zuverlässigkeit und die Synchronisierung der Keimung somatischer Pflanzenembryonen zu verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, das Wachstum von Pflanzen und Setzlingen aus somatischen Pflanzenembryonen zu fördern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, die Keimung von somatischen Pflanzenembryonen unter nicht-sterilen Bedingungen in Wachstumsmedien zu ermöglichen, die üblicher Weise im gewerblichen Pflanzschulbetrieb verwendet werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Nährstoffbehandlung von somatischen Pflanzenembryonen vor der Ex-Vitro-Aussaat bereitgestellt, das das In-Kontakt-Bringen von imbibierten, reifen, somatischen Pflanzenembryonen mit einer einen gelösten Nährstoff enthaltenden Lösung umfasst.
Der Nährstoff ist vorzugsweise ein Kohlehydrat, z.B. ein Zucker wie etwa Sucrose. Wenn Sucrose als Nährstoff zum Primen (Vorbehandlung) eingesetzt wird, wird sie vorzugsweise in einem wässrigen Medium in einer Konzentration von 6 % w/v oder geringer verwendet.
Die imbibierten somatischen Pflanzenembryonen werden vorzugsweise mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine Mischung von zwei oder mehr gelösten Nährstoffen umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Setzlingen oder ausgewachsenen Pflanzen aus somatischen Embryonen bereitgestellt, das die Vorbehandlung von somatischen Pflanzenembryonen mit Nährstoffen umfasst, bei der imbibierte somatische Pflanzenembryonen mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die einen gelösten Nährstoff enthält, und das das zur Keimung bringen der mit Nährstoffen behandelten Embryonen in einem Wachstumsmedium umfasst, um auskeimende Samen zu bilden, und das das Aufrechterhalten der Wachstumsbedingungen umfasst, um es den auskeimenden Samen zu ermöglichen, sich zu Setzlingen oder ausgewachsenen Pflanzen zu entwickeln.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Setzlingen oder ausgewachsenen Pflanzen aus somatischen Embryonen bereitgestellt, das die Behandlung von somatischen Pflanzenembryonen mit Nährstoffen umfasst, bei der imbibierte somatische Pflanzenembryonen mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die eine Mischung gelöster Nährstoffe enthält, und das das zur Keimung bringen der mit Nährstoffen behandelten Embryonen in einem Wachstumsmedium umfasst, um auskeimende Samen zu bilden, und das das Aufrechterhalten der Wachstumsbedingungen umfasst, um es den auskeimenden Samen zu ermöglichen, sich zu Setzlingen oder ausgewachsenen Pflanzen zu entwickeln.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Keimung von gereiften somatischen Pflanzenembryonen bereitgestellt, das die Vorbehandlung imbibierter Embryonen in Gegenwart eines Nährstoffmediums umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von somatischen Setzlingen bereitgestellt, das (i) die Vorbehandlung imbibierter, gereifter somatischer Pflanzenembryonen in einem Nährstoffmedium und (ii) die Ex-Vitro-Aussaat der Embryonen in ein Wachstumsmedium umfasst.
Die Erfindung betrifft außerdem somatische Embryonen, Setzlinge oder reife Pflanzen, die anhand der oben genannten Verfahren hergestellt wurden.
Der somatische Embryo gehört vorzugsweise einer Baumart an, am meisten bevorzugt einer Gymnosperme, z.B. einer Kiefer. Das Verfahren zeigt insbesondere bei somatischen Embryonen von Fichte und Kiefer Wirkung.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass dadurch ein Verfahren bereitgestellt werden kann, mit dem ein imbibierter somatischer Embryo in Lösungen, die einen oder mehrere Nährstoffe enthalten, nährstoffbehandelt werden kann, dann aus dem Medium zur Nährstoffbehandlung geerntet werden kann und anschließend ausgesät, zur Keimung gebracht und ex vitro unter Verwendung üblicher Geräte, Behälter, Wachstumssubstrate und Wachstumsumgebungen aus Gartenbau und Landwirtschaft angepflanzt werden kann. Außerdem können die Schritte der Aussaat, der Keimung und der Anpflanzung ohne biologisch isolierende Einfassungen oder sterile Medien und Anbauumgebungen durchgeführt werden. Nach Beendigung des Nährstoffbehandlungschrittes können die vorbehandelten somatischen Embryonen alternativ getrocknet und vor der Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung für eine gewisse Zeit gelagert werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass dadurch ein Verfahren bereitgestellt werden kann, mit dem die Nährstoffbehandlung somatischer Embryonen, gefolgt von Ernte und anschließender Ex-Vitro-Aussaat, -Keimung und -Pflanzung mit vielen verschiedenen Gymnosperm- und Angiospermarten durchgeführt werden kann. Geerntete somatische, nährstoffbehandelte Embryonen von sowohl Gymnosperm- als auch Angiospermarten können getrocknet und vor der Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung für eine gewisse Zeit gelagert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein mehrstufiges Verfahren zur Herstellung von Setzlingen aus gereiften somatischen Embryonen, bei dem zu Beginn somatische Embryonen imbibiert werden und dann die imbibierten somatischen Embryonen eine Zeit lang in Lösungen gegeben werden, die Nährstoffe enthalten. Dieser erste Teil des mehrstufigen Verfahrens wird als „Nährstoffbehandlung" bezeichnet. Es wurde überraschender Weise herausgefunden, dass mit Nährstoffen behandelte somatische Embryonen ex vitro unter Verwendung verschiedener nicht-steriler Verfahren in eine große Auswahl an Gartenbau-Anzucht-Container ausgesät werden können, die mit verschiedenen Arten nicht-steriler Wachstumsmischungen gefüllt sind, welche üblicher Weise für die gewerbliche Pflanzenaufzucht in Gartenbau und Landwirtschaft verwendet werden. Nachdem diese in herkömmliche nicht-sterile Zucht-Vermehrungssysteme gesetzt wurden, keimen die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen unter Verwendung üblicher Aufzuchtverfahren aus dem Gartenbau und entwickeln sich zu voll funktionsfähigen Pflanzen. Außerdem wurde überraschender Weise herausgefunden, dass Lösungen zur Nährstoffbehandlung unter Verwendung von herkömmlicher nicht-steriler Ausrüstung aus dem Garten bau zugeführt werden können, um die Keimung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen zu erleichtern und zu verbessern.
Es wurde außerdem überraschender Weise herausgefunden, dass nährstoffbehandelte somatische Embryonen auf einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich von 10-76 % getrocknet werden können. Es wurde außerdem herausgefunden, dass getrocknete, nährstoffbehandelte somatische Embryonen über lange Zeiträume hinweg gelagert werden können, ohne dass die physiologische Unversehrtheit oder das Keimpotential deutlich abnimmt. Es wurde außerdem gefunden, dass getrocknete, nährstoffbehandelte somatische Embryonen zur Aussaat mit üblichem Sägerät in herkömmliche Pflanzenaufzuchtmedien geeignet sind, um dort unter Verwendung üblicher nicht-steriler Pflanzenaufzuchtverfahren zur Keimung gebracht zu werden und weiter zu wachsen und sich zu entwickeln.
Somit umfasst das mehrstufige Verfahren von mindestens bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Schritte der Quellung somatischer Embryonen, der Nährstoffbehandlung der imbibierten somatischen Embryonen, das Versetzen der nährstoffbehandelten somatischen Embryonen in einen physiologischen Dormanzzustand, der Ex-Vitro-Aussaat der nährstoffbehandelten, physiologisch dormanten somatischen Embryonen auf oder in herkömmliche Keimungssubstrate aus dem Gartenbau, der Aufzucht der ausgesäten, nährstoffbehandelten somatischen Embryonen unter Umgebungsbedingungen, die so beeinflusst werden, dass sie die Quellung, Keimung und Entwicklung zu vollständigen Setzlingen mit Sprossen und Wurzeln ermöglichen.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt einige Vorteile mit sich. Ein Vorteil der Nährstoffbehandlung von somatischen Pflanzenembryonen ist beispielsweise, dass sie außergewöhnliche Kraft während der Keimung und der anschließenden Entwicklung zu vollständigen Setzlingen mit Sprossen und Wurzeln zeigen. Außerdem sind getrocknete, nährstoffbehandelte somatische Embryonen insbesondere geeignet, die physiologische Entwicklungsfähigkeit der Embryonen während längerer Lagerung vor der Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung zu erhalten. Ein weiterer Vorteil der Nährstoffbehandlung von somatischen Embryonen besteht darin, dass diese nach Größe, Länge und Gestalt sortiert werden können, um die Herstellung einheitlicherer Kulturen nach der Aussaat, Keimung und Anpflanzung zu ermöglichen.
Ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass, sobald die Stufe der Nährstoffbehandlung abgeschlossen ist, alle folgenden Teile des mehrstufigen Verfahrens in üblichen Pflanzenaufzuchtumgebungen durchgeführt werden können, ohne dass sterile Handhabungsverfahren oder sterile Wachstumsumgebungen benötigt werden. Genauer gesagt sind aseptische Verfahren und sterile oder keimfreie Einrichtungen und Keimungs-/Wachstumsumgebungen nicht erforderlich für eine erfolgreiche Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen und ihre spätere Entwicklung zu vollständigen, funktionsfähigen Setzlingen, so dass eine Durchführung sämtlicher Stufen der Aussaat, Keimung und Anpflanzung in gewerblichen Pflanzenaufzucht- oder Gewächshaus- oder Zucht-Anbau-Einrichtungen durchgeführt werden können.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen ex vitro mit üblicher Säausrüstung ausgesät werden können, wie, jedoch nicht ausschließlich, mit Vakuum-Trommelsägeräten (vacuum-drum seeders), Flüssigaussaatgeräten (fluid-drill seeders) oder Nadeldüsen-Sägeräten (needle-jet seeders).
Ein weiterer Vorteil ist, dass üblicher Weise verwendete Produkte aus Gartenbau und Landwirtschaft, wie, jedoch nicht ausschließlich, erdfreie Setzlings-Mischungen oder Steinwolle oder Schäume, als Träger verwendet werden können, auf die die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen ausgesät werden und in die sie später auskeimen und mit ihren Wurzeln eindringen.
Am meisten bevorzugt wird ebenfalls ein Nährstoff (idealer Weise derselbe Nährstoff wie der im Schritt der Nährstoffbehandlung verwendete) in das Wachstumsmedium eingearbeitet.
Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass, wenn aufgrund der Bedingungen in den gewerblichen Wachstumsumgebungen vorhandene kommerzielle Pestizidprodukte wie, jedoch nicht ausschließlich, Fungizide, Bakterizide, Antibiotika, Nematizide, Insektizide und dergleichen, die für die Verwendung für die Pflanzenarten registriert sind, aus denen die somatischen Embryonen hergestellt werden, auf die ausgesäten somatischen Embryonen gemäß Herstellerangaben zur wirksamen Schädlingsbekämpfung aufgebracht werden können oder alternativ vor der Aussaat der somatischen Embryonen auf die Anbausubstrate aufgebracht werden können.
Ein weiterer Vorteil ist, dass exogene Nährstoffe, die für erfolgreiche Keimung und Wachstum somatischer Embryonen erforderlich sind, mittels der verschiedenen zahlreichen Verfahren zugeführt werden können, die im gewerblichen Gartenbau üblicher Weise verwendet werden, wobei diese Verfahren umfassen, jedoch nicht eingeschränkt sind auf, Bedunsten, Nebeln, Sprühen, Wässern und Tränken. Die exogenen Nährstoffe können außerdem in Verbindung mit herkömmlichen Fertigationsverfahren aus dem Gartenbau zugeführt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die oben genannten Gegenstände und Merkmale als solche und in Kombination. Diese und andere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgende Beschreibung deutlicher.
DEFINITIONEN
Einige Begriffe haben bekannter Weise unterschiedliche Bedeutungen, wenn diese in der Fachliteratur des Gebiets verwendet werden. Es wird davon ausgegangen, dass die folgenden Definitionen die gebräuchlichsten im Bereich der Botanik und der somatischen Pflanzenembryogenese verwendeten sind und mit der Verwendung der Begriffe in der vorliegenden Beschreibung übereinstimmen.
Diese Definitionen helfen beim Verständnis der vorliegenden detaillierten Beschreibung.
„ABA" ist Abscisinsäure, ein Pflanzenwachstumsregulator.
„Autotroph" bezieht sich auf die Stufe der Pflanzenentwicklung, in der die photosynthetischen Organellen und die damit verbundenen Enzyme und biochemischen Reaktionswege voll funktionsfähig und in der Lage sind, Lichtenergie, atmosphärisches Kohlendioxid und Wasser in Kohlehydrate (z.B. Glucose) zu verwandeln, die Voraussetzung für weiteres Pflanzenwachstum und -entwicklung sind.
„BA" ist Benzyladenin, ein Pflanzenwachstumsregulator des Zytokinin-Typs. Die physiologische Hauptwirkung von BA besteht in der Stimulation der meristematischen Zellteilung.
„Klon" bezeichnet in Zusammenhang mit der Pflanzenaufzucht eine Sammlung von Individuen derselben genetischen Beschaf fenheit, die aus einer Kultur erzeugt worden sind, die aus einem einzelnen Explantat hervorgeht.
„Embryogene Kultur" ist eine Pflanzenzell- oder -gewebekultur, die in der Lage ist, somatische Embryonen zu bilden und Pflanzen durch somatische Embryogenese zu regenerieren.
„Endosperm" ist haploides Nährgewebe von Angiospermsamen mütterlichen Ursprungs, in dem sich die zygotischen Angiospermembryonen entwickeln.
„Explantat" bezeichnet das Organ, das Gewebe oder die Zellen, die von einer Pflanze abgeleitet sind und in vitro kultiviert werden, um eine neue Pflanzenzell- oder Gewebekultur anzulegen.
„GA" ist Gibberellin, eine Gruppe verwandter Wachstumsregulatorisomere (z.B. GA₃, GA₄, GA₇), die naturgemäß als normaler Teil des Pflanzenmetabolismus synthetisiert werden. Die physiologische Hauptwirkung von GA besteht in der Stimulation der Streckung individueller Pflanzenzellen. Die exogene Applikation von GA kann zur Stimulation, Beeinflussung und Beschleunigung der Einleitung und des Wachstums von Sprossen und Wurzeln verwendet werden.
„Keimung" ist die dreistufige Reihe von Vorgängen, die mit der Aufnahme von Wasser durch einen ruhenden, trockenen Samen beginnt und weiter über verschiedene biophysikalische, biochemische und physiologische Vorgänge verläuft, die zur Streckung des Embryos entlang seiner Achse führen, und schließlich mit dem Austreten eines Wurzel- oder Sprosskeimes durch die Samenschale abschließt. Die Samenkeimung verläuft in drei Phasen. Phase 1 ist gekennzeichnet durch ein schnelles anfängliches Einströmen von Wasser in den Samen, begleitet von der Einleitung der Reparatur von Schäden an DNA und Mitochondrien. Phase 2 ist durch eine deutliche Verringerung der Wasseraufnahmerate gekennzeichnet, begleitet von einer Aktivierung oder De-Novo-Synthese von Enzymen, die auf die Hydrolyse der komplexen Speicherreserven von Kohlehydraten, Proteinen und Lipiden im Embryo und der Kotyledone oder Megagametophyten spezialisiert sind. Die Hydrolyse dieser komplexen Speicherreserven in Phase 2 stellt die Substrate bereit, die für die Atmung und das Wachstum der zygotischen Embryonen erforderlich sind. Phase 3 ist gekennzeichnet durch eine erneute stark gesteigerte Wasseraufnahme, das in erster Linie für die Einleitung der meristematischen Zellteilung an den Wurzel- und Sprossspitzen des Embryos eingesetzt und in Zellen entlang der embryonalen Achse aufgenommen wird. Der Keimungsvorgang ist abgeschlossen, wenn der Embryo sich so weit gestreckt hat, dass er die Samenschale durchbricht.
„Hydrobehandlung" ist ein Verfahren zur Behandlung von Saatgut, bei dem Samen in Wasser eingenebelt oder getränkt werden und dann vor Abschluss des Keimungsprozesses wieder getrocknet werden.
„IAA" ist Indolessigsäure, ein Wachstumsregulator vom Auxintyp, der als normaler Bestandteil des Pflanzenmetabolismus natürlich gebildet wird. Die physiologische Hauptwirkung von IAA besteht in der Stimulation der meristematischen Zellteilung. Die exogene Applikation von IAA kann eingesetzt werden, um die Einleitung und das Wachstum von Sprossen und Wurzeln zu stimulieren, zu beeinflussen und zu beschleunigen.
„IBA" ist Indolbuttersäure, ein chemisches Analogon zu IAA. IBA kann verwendet werden, um die Initiierung von Wurzeln und Sprossen in derselben Art und Weise wie durch exogene Applikation von IAA zu beeinflussen.
„Imbibition" ist die Absorption und/oder Adsorption von Wasser durch bestimmte Kolloide, die in Samen oder Embryonen vorliegen, was zum Anschwellen der Gewebe und der Aktivierung enzymatischer und physiologischer Prozesse führt.
„Linie" ist eine andere Bezeichnung für „Klon".
„Matrixbehandlung" (Matrixprimen) bezeichnet die Verwendung fester Träger mit geringem Matrix-Wasserpotential, um die Geschwindigkeit und/oder die Menge des während des Saatgutbehandlungsprozesses absorbierten Wassers zu kontrollieren.
„Megagametophyt" ist haploides Nährgewebe mütterlichen Ursprungs des Gymnospermsamens, in dem sich die zygotischen Gymnospermembryonen entwickeln.
„Mikrotröpfchen" ist ein kleines Wassertröpfchen oder eine Lösung auf Wasserbasis, die sich in dem feinen Sprühnebel befindet, der entsteht, wenn Druck auf einen Wassertropfen oder eine Lösung auf Wasserbasis ausgeübt wird.
„Nährstoffe" sind die anorganischen Mikro- und Makromineralien, Vitamine, Hormone, organischen Zusätze und Kohlehydrate, die für das Kulturwachstum und die Keimung somatischer Embryonen benötigt werden.
„Nährstofflösung" bezeichnet Wasser, das einen gelösten Nährstoff oder eine Mischung von Nährstoffen enthält.
„Nährstoffbehandlung" beschreibt ein Verfahren, bei dem ein somatischer Pflanzenembryo in Phase 2 der Keimung für einen hinreichenden Zeitraum einer Nährlösung ausgesetzt wird, so dass er mineralische und organische Nährstoffe absorbieren kann, die notwendig sind, um die Phase 2- und Phase 3-Stufen der Keimung abzuschließen.
„Osmotische Behandlung" bezeichnet ein Verfahren, bei dem Samen in belüfteten Osmotika mit geringem Wasserpotential getränkt werden, um die Geschwindigkeit und/oder die Menge des während des Saatgutbehandlungsprozesses absorbierten Wassers zu kontrollieren.
„Physiologische Dormanz" bezeichnet die Einstellung der normalen metabolischen Prozesse, d.h. des Anabolismus und des Katabolismus, die mit Pflanzenwachstum und -entwicklung einhergehen, in einer Art und Weise, die sich nicht negativ auf die Entwicklungsfähigkeit auswirkt.
„Vorkeimung" ist ein Verfahren zur Behandlung von Saatgut, bei dem den Samen bis zum Austreten von Spross- oder Wurzelkeimen aus der Samenschale Wasser zur Verfügung steht, bevor der Trocknungsschritt durchgeführt wird.
„Saatgutbehandlung" bezeichnet ein Verfahren, bei dem die Verfügbarkeit von Wasser für die Samen kontrolliert und beeinflusst wird, um die frühen Keimungsvorgänge zu initiieren und zu beeinflussen, ohne dass dies für ein Austreten von Keimwurzeln ausreicht, und dann die Trocknung erfolgt.
„Somatische Embryogenese" ist das In-Vitro-Verfahren zur Initiierung und Entwicklung von Embryonen aus somatischen Zellen und Geweben.
„Somatischer Embryo" ist ein Embryo, der in vitro aus vegetativen (somatischen) Zellen durch mitotische Zellteilung gebildet wird. Somatische Embryonen in einer frühen Phase sind unreifen zygotischen Embryonen morphologisch ähnlich; ein Bereich embryonaler Zellen liegt gestreckten Suspensorzellen gegenüber. Die embryonalen Zellen entwickeln sich zu reifen somatischen Embryonen.
„Zygotischer Embryo" ist ein Embryo, der sich aus der geschlechtlichen Verschmelzung gametischer Zellen ableitet.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung im Allgemeinen aus einem mehrstufigen Keimungsverfahren für somatische Pflanzenembryonen, das die Verwendung von herkömmlichen Verfahren, Ausrüstung und Einrichtung aus dem Gartenbau ermöglicht, wobei das Verfahren einige oder alle der folgenden sequentiellen Stufen umfasst, ohne sich auf diese einzuschränken:

1. Einleitung von Phase 1 des Keimungsprozesses durch Quellung (Imbibition) von getrockneten, gereiften, somatischen Pflanzenembryonen. Bevorzugter Weise wird die Quellungsgeschwindigkeit in Phase 1 durch die Verwendung eines Verfahrens wie Matrixbehandlung kontrolliert. Es wird ferner bevorzugt, dass dieser Schritt unter Verwendung steriler Verfahren und unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
2. Nach Abschluss des Keimungsschritts in Phase 1, d.h. der Quellung, werden die imbibierten, reifen somatischen Pflanzenembryonen in ein Gefäß überführt, das eine flüssige Lösung zur Nährstoffbehandlung enthält. Die Lösung zur Nährstoffbehandlung muss mindestens eine Kohlehydratquelle enthalten. Obgleich das bevorzugte Kohlehydrat Sucrose ist, vorzugsweise im Bereich von 3-6 % (w/v), kann die vorliegende Erfindung mit Zuckern wie Fructose, Glucose, Maltose, Galactose, Mannose, Lactose und ähnlichen durchgeführt werden. Außerdem kann die Lösung zur Nährstoffbehandlung falls gewünscht eine Mischung von zwei oder mehr Kohlehydraten enthalten. Wenn in der Lösung zur Nährstoffbehandlung andere Kohlehydrate als Sucrose oder Kohlehydratmischungen verwendet werden, sollten die geeigneten Konzentrationen für jedes Kohlehydrat vorab durch Mengenbestimmungsversuche (rate-selection studies) bestimmt werden. Der Aufbau und die Durchführung solcher Geschwindigkeits-Auswahl-Versuche sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Ein weiteres Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Lösungen zur Nährstoffbehandlung zusätzlich zu Kohlehydraten falls gewünscht auch andere Nährstofftypen enthalten können, die die verschiedenen biochemischen und physiologischen Prozesse während Phase 2 und 3 der Keimung zusätzlich fördern können. Derartige Nährstoffe umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, anorganische Minerale, Vitamine und Hormone. Ein nicht-einschränkendes mögliches Ausführungsbeispiel besteht darin, zu einer Lösung, die Sucrose im Bereich von 3-6 % (w/v) enthält, eine Mischung von mineralischen Nährstoffen zuzugeben, die so formuliert jedoch nicht darauf eingeschränkt ist, dass sie 454 mg/l Stickstoff, 81 mg/l Phosphor, 704 mg/l Kalium, 50 mg/l Calcium, 39 mg/l Magnesium, 193 mg/l Schwefel, 3 mg/l Mangan, 0,5 mg/l Zink, 89 mg/l Chlor, 3 mg/l Eisen, 0,7 mg/l Jod, 0,6 mg/l Bor, 0,01 mg/l Molybdän, 0,01 mg/l Kobalt und 0,01 mg/l Kupfer zur Verfügung stellt. Außerdem kann falls gewünscht IBA, ein Pflanzenwachstumsregulator, allein in einer Konzentration von 0,1 μM/l oder in Kombination mit GA und BA oder beiden, jeweils in einer Konzentration von 0,1 μM/l zugegeben werden. Es kann falls gewünscht ebenfalls Ascorbinsäure (auch bekannt als Vitamin C) in einer Konzentration im Bereich von 10-1000 μM/l zugegeben werden. Außerdem können falls gewünscht Produkte zur Schädlingsbekämpfung wie Antibiotika oder Fungizide zur Nährstoffbehandlungslösung zugegeben werden. Ein nicht-einschränkendes Beispiel ist die Zugabe von Benlat (0,1 g/l) und/oder Ampicillin (0,1 g/l). Bei diesem Schritt sollten die Lösungen zur Nährstoffbehandlung vorzugsweise vor Zugabe der somatischen Embryonen sterilisiert werden und ein steriles Verfahren zur Zugabe der Embryonen zur Lösung zur Nährstoffbehandlung verwendet werden.
3. Die imbibierten Embryonen werden in der Nährstofflösung über einen Zeitraum nährstoffbehandelt, der vorzugsweise im Bereich von 6 bis 168 Stunden liegt, weiter bevorzugt im Bereich von 48 bis 96 Stunden und am meisten bevorzugt zwischen 72 und 96 Stunden. Während des Verfahrens zur Nährstoffbehandlung werden die Embryonen außerdem bevorzugter Weise in den Lösungen zur Nährstoffbehandlung suspendiert und in ständiger Bewegung gehalten. Ein nicht-einschränkendes Ausführungsbeispiel dafür besteht darin, die Gefäße, in denen sich die Embryonen und die Lösungen zur Nährstoffbehandlung befinden, auf einem Schüttler zu befestigen, der sich mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 10-120 Upm dreht, vorzugsweise im Bereich von 30-60 Upm. Der Schritt der Nährstoffbehandlung kann in Gegenwart oder in Abwesenheit von Licht durchgeführt werden. Da aus dem Stand der Technik bekannt ist, dass zygotische Samen bestimmter Pflanzenarten nur im Dunkeln keimen, während zygotische Samen anderer Pflanzenarten Licht zur erfolgreichen Keimung benötigen, ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, zu bestimmen, ob die Nährstoffbehandlung der für die Ausführung der Erfindung gewählten somatischen Pflanzenembryonen unter Beleuchtung durchgeführt werden sollte. Bevorzugter Weise wird der Inhalt der Gefäße für die Nährstoffbehandlung während des Verfahrens zur Nährstoffbehandlung unter sterilen Bedingungen gehalten.
4. Die nährstoffbehandelten somatischen Pflanzenembryonen werden in Anzuchtcontainer ausgesät, die ein übliches dreiphasiges Wachstumssubstrat aus dem Gartenbau enthalten, wobei die drei Phasen Feststoffe, Flüssigkeiten und Luft umfassen. Wenn mit diesem Schritt begonnen wird, sind ein steriles Verfahren oder sterile Bedingungen für eine erfolgreiche Ausführung der Erfindung nicht notwendig.
5. Die Anzuchtcontainer, in die die nährstoffbehandelten somatischen Pflanzenembryonen eingesät sind, werden in eine übliche Pflanzenaufzuchtumgebung gesetzt, in der Licht, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Feuchtigkeitsgehalt des wurzelungssubstrats kontrolliert und beeinflusst werden können, um die erneute Keimung der somatischen Embryonen und ihre weitere Entwicklung zu Setzlingen zu erleichtern.
6. Falls gefordert wird ein Aerosol in Form eines Nebels oder Sprays auf der Oberfläche der Anzuchtcontainer bereitgestellt, in die die somatischen Embryonen eingesät sind, wobei das Aerosol die notwendigen Kohlehydratverbindungen enthält, die erforderlich sind, um den Abschluss der Phase 3-Keimungsprozesse der somatischen Embryonen zu unterstützen und zu erleichtern.
7. Die mikro- und makromineralischen Elemente, die erforderlich sind, um den Abschluss der Phase 3-Keimungsprozesse der somatischen Embryonen und deren spätere Entwicklung zu Setzlingen zu unterstützen und zu erleichtern, werden in Form eines Aerosols und/oder einer flüssigen Suspension verabreicht.
8. Während des Abschlusses der Keimungsprozesse der somatischen Embryonen und der späteren Entwicklung zu Setzlingen können die Umgebungslichtstärke und diurnale Photoperiode, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und andere derartige Faktoren entsprechend den Erfordernissen während der Keimung der somatischen Embryonen und ihrer Umwandlung zu voll funktionsfähigen Setzlingen angepasst werden.

Alternativ können nährstoffbehandelte Embryonen bei Abschluss von Schritt 3 aus den Lösungen zur Nährstoffbehandlung herausgenommen und auf einen Feuchtigkeitsgehalt getrocknet werden, der vorzugsweise im Bereich von 10 % bis 75 %, weiter bevorzugt im Bereich von 15 % bis 50 % und am meisten bevorzugt im Bereich von 20 % bis 25 %, liegt. Die Embryonen können beispielsweise getrocknet werden, indem man die Lösungen zur Nährstoffbehandlung mit den nährstoffbehandelten Embryonen auf Filterpapier in einer Vakuumfilterapparatur gießt, um die überschüssige Lösung zu entfernen; weitere Trocknungsverfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Das Filterpapier mit den behandelten Embryonen auf der Oberfläche kann dann für 3-96 Stunden, vorzugsweise 12-24 Stunden, in eine Durchströmtrockenkammer gegeben werden. Nach der Trocknung können die getrockneten, nährstoffbehandelten Embryonen in versiegelten, mit Kunststoff gefütterten Beuteln gelagert werden. Obwohl getrocknete, nährstoffbehandelte Embryonen bei Raumtemperatur gelagert werden können, werden sie vorzugsweise bei gekühlter Temperatur, z.B. bei 2 bis 10 °C, und am meisten bevorzugt gefroren, z.B. bei -20 bis -80 °C, gelagert. Obwohl während der Trocknung und Lagerung der nährstoffbehandelten Embryonen bevorzugt sterile Verfahren verwendet werden, ist dies für die erfolgreiche Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich. Getrocknete, nährstoffbehandelte Embryonen können aus der Lagerung genommen werden und ex vitro wie oben ab Schritt 4 beschrieben ausgesät werden.
Ein Hauptmerkmal dieses neuen Verfahrens, mindestens in seinen bevorzugten Ausführungsformen, besteht darin, dass keine speziellen hygienischen und/oder aseptischen und/oder sterilen Bearbeitungsverfahren und/oder Vorrichtungen und/oder Einrichtungen erforderlich sind, um feuchte oder getrocknete, nährstoffbehandelte somatische Pflanzenembryonen erfolgreich handzuhaben, auszusäen und zur Keimung zu bringen. Entsprechend können die Schritte 4 bis 8 unter nicht-sterilen, nicht-hygienischen und/oder septischen Bedingungen ausgeführt werden, d.h. die Art von Bedingungen, die man typischer Weise in herkömmlichen Pflanzenaufzuchtumgebungen im Gartenbau antrifft.
Obwohl die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen mit allen Arten von üblichen Sägeräten ausgesät werden können, die für die Aussaat von zygotischem Saatgut verwendet werden, wird vorzugsweise eine Ausrüstung verwendet, die vereinzelte Samen in Anzuchtcontainer mit mehreren Kammern verteilt, die üblicher Weise als Anzuchtschalen (miniplug trays) oder Zellgebinde (cell-packs) bezeichnet werden, wobei diese Behälter üblicher Weise verwendet werden, um Pflanzballen (plant plugs) herzustellen, die mechanisch in größere Behälter oder zur Freilandaufzucht verpflanzt werden können.
Ein Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung, mindestens in ihren bevorzugten Ausführungsformen, besteht darin, dass die Aussaat und Aufzucht von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen mit einer großen Auswahl an nicht-sterilisierten Anbausubstraten durchgeführt werden kann, die üblicher Weise in der herkömmlichen Pflanzenaufzucht verwendet werden. Das bevorzugte Anbausubstrat basiert auf Torf und wurde spezifisch für die Keimung von zygotischen Samen formuliert und als Beispiele solcher Mischungen dienen (a) ein 100 % kurzfaseriges Torfprodukt, das mit einem wasserbindenden Polymer polymerisiert wurde, angeboten von Firmen wie Grow Tech Inc. (San Juan Bautista, CA, USA), Preforma Inc. (Oberlin, OH, USA), (b) 15,2 Kubikfuß Torf, 8 Kubikfuß Vermiculit, 680 g Dolomitkalk und 300 g Micromax^® und (c) 16,2 Kubikfuß Torf, 6,75 Kubikfuß Perlit, 4 Kubikfuß Vermiculit, 6 kg Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat,250 g Micromax^® und 35 g Benetzungsmittel. Alternativ können auch kommerziell formulierte Mischungen wie PRO-MIX-G^® oder PRO-MIX-PGX^® (Premier Peat Moss Ltd., Montreal, PQ, Kanada), Sunshine Mix # 3 (Sun-Gro Horticulture Inc., Hubbard, OR, USA) und Redi-Earth^® (The Scotts Co., Marysville, OH, USA) mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Anbausubstrat auf Torfbasis wird vorzugsweise bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt im Bereich von 59-75 % befeuchtet und dann auf Mehrkammer-Topfplatten ver teilt, die üblicher Weise zur Herstellung von Pflanzballen verwendet werden. Obwohl Beispiele solcher Topfplatten als "styrofoam #252 miniplug tray", hergestellt von Beaver Plastics Inc. (Edmonton, AB, Kanada), und "hard plastic #288 oder #512 miniplug trays", hergestellt von TLC Polyform Inc. (Plymouth, MN; USA, 55441) umfassen, kann die vorliegende Erfindung mit anderen derartigen Mehrkammer-Topfplatten oder alternativ mit einzelnen Töpfen durchgeführt werden. Es ist anzumerken, dass die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht auf Mischungen auf Torfbasis eingeschränkt ist, sondern auch andere Substrate umfasst wie Jiffy-7 Torfballen (peat plugs), kompostierte oder geschredderte Kokosschalenfasern, die üblicher Weise als „Kokosbast" (cor/coir) bezeichnet werden (1993 Crystal Co., St. Louis, MO, USA), extrudierte Schäume wie Oasis^® (Smithers-Oasis Ltd., Kent, OH, USA), Steinwolle (Rockwool International A/S, Hovedgaden 584, DK-2640, Dänemark) und dergleichen. Ungeachtet des gewählten Wurzelungssubstrats, sollten dessen physikalische Eigenschaften die Entwicklung und Aufrechterhaltung einer hohen relativen Luftfeuchte in der Gasphase im Substrat ermöglichen, d.h. über 75 % relative Luftfeuchte, und gleichzeitig die Sättigung des Substrats mit der flüssigen Phase minimieren.
Nach Aussaat der vorgekeimten somatischen Embryonen auf die Oberfläche der Wurzelungssubstrate können die Embryonen falls gewünscht mit einer dünnen Schicht zusätzlichen Wurzelungssubstrats bedeckt werden, das aus dem selben Material bestehen kann wie das unter den Embryonen, oder alternativ mit einem anderen Materialtyp. Ein nicht-einschränkendes Beispiel besteht darin, die vorgekeimten Embryonen auf ein PRO-MIX-PGX^®-Medium auszusäen und dann die Embryonen mit einer dünnen Schicht von Kokosschalenfasern zu bedecken.
Vorzugsweise werden Anzuchtcontainer, in die die vorgekeimten somatischen Embryonen eingesät sind, in eine übliche Pflanzenaufzuchtumgebung gesetzt, in der die Bedingungen sich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, im Bereich von Temperaturen von 15-35 °C, einer relativen Luftfeuchte von 75-100 %, einer Lichtstärke von 10-500 fc und einem diurnalen Zyklus von 6 h Tag/18 h Nacht – 22 h Tag/2h Nacht bewegen.
Vorzugsweise wird für die ersten 3-7 Tage nach der Aussaat ein sehr hoher Grad an Luftfeuchte, d.h. über 90 % relativer Luftfeuchte, um die Anzuchtcontainer herum beibehalten, in die die vorgekeimten somatischen Embryonen eingesät sind, um die Quellung und Keimung der somatischen Embryonen zu fördern. Es kann eine Reihe von Verfahren verwendet werden, um die Luftfeuchte auf diesem Niveau zu halten, die umfassen, jedoch nicht eingeschränkt sind auf, das Einbringen der Container in eine Gewächshausumgebung mit einer Bedunstungs- oder Nebelungseinrichtung, die in geregelten Intervallen eingesetzt wird, das Einstellen der Behälter in ein Bedunstungs- oder Nebelungszelt oder -kammer, das Anordnen von transparenten Kunststoffhauben über die Anzuchtcontainer, und das periodische Entfernen der Hauben, um die eingesäten Embryonen zu bedunsten oder einzunebeln, und das sofortige Wiederaufsetzen der Hauben. Ein weiteres nicht-einschränkendes Verfahren besteht darin, einen Freiraum von 2 mm bis 10 mm über der Oberfläche des Wurzelungssubstrats, auf das die Embryonen ausgesät sind, und dem oberen Ende des Behälters bereitzustellen und dann den oberen Teil des Anzuchtcontainers mit einer Kunststoffolie zu bedecken, die entfernt wird, um ein Bedunsten oder Einnebeln der ausgesäten Embryonen zu ermöglichen, und anschließend sofort wieder auf dem Behälter angeordnet wird. Nachdem die Keimung der somatischen Embryonen anhand der Entwicklung von Epikotyl- und Wurzelstrukturen festgestellt wurde, können die auskeimenden Samen von den Umgebungen mit hoher relativer Luftfeuchte entwöhnt werden und in übliche Aufzucht-Kultur-Verfahren integriert werden, indem man allmählich die Menge der angewandten Bedunstung/Einnebelung verringert und/oder die Zeiträume zwischen den Bedunstungs- oder Einnebelungsschritten verlängert.
Vorzugsweise werden die ausgesäten, vorgekeimten Embryonen für 3-7 Tage nach der Aussaat in einer Umgebung mit hoher relativer Luftfeuchte, d.h. über 90 %, belassen, um die Quellung der Embryonen vor der Zufuhr exogener, für die Embryonalkeimung erforderlicher Nährstoffe zu fördern.
Ein weiteres Hauptmerkmal der Erfindung, mindestens in ihren bevorzugten Ausführungsformen, ist, dass die exogenen Nährstoffe, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich Kohlehydrate und Mineralien, die für die erfolgreiche erneute Keimung und späteres Wachstum und Entwicklung der somatischen Embryonen erforderlich sind, als Aerosole angewandt werden können. Die Nährstofflösungen können mittels, jedoch nicht ausschließlich, üblicher Bedunstungs- und/oder Einnebelungsvorrichtungen zugeführt werden. Obwohl die Nährstoffe einzeln oder kombiniert in einer Lösung zugeführt werden können, werden die Kohlehydrate vorzugsweise als eine Lösung und die übrigen Nährstoffe in einer getrennten Lösung zugeführt. Ein nicht-einschränkendes Beispiel zur Durchführung besteht in der Zufuhr einer 3%-igen w/v-Sucroselösung als Dunst auf die Oberfläche des Wachstumssubstrats, das einen ausgesäten, vorgekeimten Embryo enthält, und der späteren Zufuhr einer Lösung, die eine Mischung mineralischer Nährstoffe enthält, die so formuliert ist, dass sie 454 mg/l Stickstoff, 81 mg/l Phosphor, 704 mg/l Kalium, 50 mg/l Calcium, 39 mg/l Magnesium, 193 mg/l Schwefel, 3 mg/l Mangan, 0,5 mg/l Zink, 89 mg/l Chlor, 3 mg/l Eisen, 0,7 mg/l Jod, 0,6 mg/l Bor, 0,01 mg/l Molybdän, 0,01 mg/l Kobalt und 0,01 mg/l Kupfer zur Verfügung stellt. Alternativ können die Makronährstoffe auch als handelsübli che Formulierung zugeführt werden, wie PlantProd^® Plant Starter Fertilizer 10-52-10 (Stickstoff-Phosphat-Kalium) oder PlantProd^® Forestry Seedling Starter 11-41-8 (Stickstoff-Phosphat-Kalium) (Plant Products Ltd., Brampton, ON, Kanada), ohne dass jedoch eine Beschränkung auf diese Produkte besteht.
Ein alternatives nicht-einschränkendes Mittel zur Zufuhr exogener Nährstoffe zu vorgekeimten somatischen Embryonen, die auf dreiphasige Wachstumsmedien in Anzuchtcontainer ausgesät sind, besteht in der Berieselung oder „Tränkung" der Medien mit Nährstofflösungen, die wie zuvor beschrieben formuliert sind.
Da Mikroorganismen wie Pilze, Bakterien, Hefen und Algen in üblichen Pflanzenaufzuchtsubstraten, Ausrüstungen, Behältern und Aufzuchtumgebungen allgegenwärtig sind, steht eine große Auswahl an chemischen und biologischen Pestizidprodukten zur Verfügung, um Pflanzenpathogene zu bekämpfen und zu vernichten. Es wurde überraschender Weise herausgefunden, dass aseptische Handhabungsverfahren und sterilisierte Wachstumssubstrate, Anzuchtcontainer und Umgebungen für die erfolgreiche Keimung und Aufzucht somatischer Pflanzenembryonen nicht erforderlich sind. Die Erfindung kann in der Tat in üblichen Pflanzenaufzuchtumgebungen ausgeführt werden, wobei nur die normalen gewerblichen Hygieneverfahren verwendet werden. Es wurde außerdem überraschender Weise gefunden, dass Pestizide wie Benlate^®, Rovril^®, Trumpet^® und ähnliche, die für die Schädlingsbekämpfung bei Pflanzenkulturen registriert sind, mit somatischen Embryonen verwendet werden können, die vorgekeimt wurden und anschließend mittels des neuen vorliegenden mehrstufigen Verfahrens ausgesät wurden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen und sind nicht so auszulegen als würden sie die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
BEISPIEL 1
Keimung mit Nährstoffen behandelter somatischer Embryonen der Interior Spruce auf einem Träger mit und ohne Sucrosezusätze
Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, die Auswirkungen von Nährstoffbehandlungen auf die spätere Keimung von somatischen Embryonen der Interior Spruce zu ermitteln.
Somatische Embryonen des Interior-Spruce-Genotyps 1-1278 und 107-1917 wurden nach HRHT (HRHT, „high relative humidity treatment", ist eine Behandlung mit hoher relativer Luftfeuchte, die in Roberts et al., 1993, beschrieben wird) in Gruppen zu 80 Embryonen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde getrennt in einen 250 ml-Schikanekolben gegeben, der 25 ml m24GMD-Medien (siehe Tabelle 1.1 zur Nährstoffzusammensetzung des m24GMD-Mediums) mit einem der folgenden Sucrosegehalte enthielt: 1, 2, 3, 4 % (w/v). Nach dem Verschließen der Kolben mit einem Stopfen aus Baumwolle und Gaze wurden diese auf einen Schüttler gestellt und bei 60 Upm kontinuierlich geschüttelt und mit 30-40 mol m^-2s^-1 in Höhe der Flüssigkeitsoberfläche beleuchtet. Das Licht wurde mit zwei 25 W-Leuchtstofflampen erzeugt. Die Umgebungstemperatur schwankte nach Messungen im Allgemeinen zwischen 20-23 °C. Die Embryonen wurden unter diesen Bedingungen drei Tage lang nährstoffbehandelt.
Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurden die 80 Embryonen jeder Behandlungsgruppe in vier Gruppen zu je 20 Emb ryonen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde als Replikat der jeweiligen Behandlung in eine Keimbox ausgesät. Die Keimboxen waren Sigma^TM Polycarbonat-Boxen. Jede Box enthielt 150 ml groben Gartenbau-Vermiculit und 120 ml m24GMD-Medien ohne Sucrose. Vor der Verwendung wurden die Boxen 20 Minuten lang mit einem Flüssigzyklus (liquid cycle) autoklaviert.
Um systematische Fehler zu verhindern, die hätten auftreten können, wenn die Versuchseinheiten nicht zufällig ausgewählt worden wären, befand sich in jeder Keimbox ein Replikat aus den vier verschiedenen Behandlungsgruppen. Die Verteilung der Replikate auf die Keimboxen wurde durch die Verwendung einer Zufallszahlentabelle erleichtert.
Nährstoffbehandelte Embryonen wurden per Hand in die Keimboxen ausgesät. Nach der Aussaat wurden die Keimboxen zweifach mit Parafilm^TM versiegelt. Die Embryonen wurden zur Keimung gebracht und eine Woche bei 50-70 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss mit einer 16-stündigen Photoperiode bei einer Temperatur von 16 °C gezogen. Die auskeimenden Samen wurden anschließend geerntet und es wurden Fotokopien von den einzelnen auskeimenden Samen gemacht. Anhand dieser Fotokopien wurde die Länge der auskeimenden Samen mit einem auf Folie übertragenen Millimeterpapier bis auf 1 mm genau gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1.2 zusammengefasst, woraus sich die folgenden Beobachtungen ergeben:

1) Nach der ersten Keimungswoche auf einem Vermiculit-Träger ohne Sucrosezufuhr wurden bei den „Kontroll"-Embryos der Interior Spruce Linien 1-1278 und 107-1917 keine Veränderungen beobachtet.
2) Alle nährstoffbehandelten somatischen Embryonen wiesen unabhängig von der Nährstoffbehandlung eine grüne Farbe und gestreckte Epikotyle auf. Embryonen, die in 3 und 4 % w/v Sucrose m24GMD nährstoffbehandelt wurden, streckten sich mehr als die in 1 und 2 % w/v Sucrose m24GMD behandelten mit einer Ausnahme bei Genotyp 107-19717, dessen auskeimende Samen nach der Behandlung in 2 % w/v Sucrose m24GMD am längsten waren.
3) Keiner der in den Keimboxen ausgesäten Embryonen bildete Wurzeln.

Zusammenfassend gesagt, ist eine Nährstoffbehandlung vor der Keimung förderlich, nach der Aussaat ist jedoch eine zusätzliche externe Sucrosezufuhr für die Bildung von Wurzeln erforderlich.
Tabelle 1.2: Länge der auskeimenden Samen nach einwöchigem Wachstum auf einem Vermiculit-Träger ohne Sucrosezufuhr
BEISPIEL 2
Auswirkung des Sucrosegehalts in Nährstoffbehandlungslösungen und der Dauer der Nährstoffbehandlung auf die Keimung und das Wachstum von somatischen Embryonen der Interior Spruce
Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, optimale Kombinationen von Sucrosegehalt und Dauer der Nährstoffbehandlung zu bestimmen, bei denen die beste Keimung und das beste Wachstum von somatischen Embryonen der Interior Spruce erzielt werden.
Somatische Embryonen des Interior-Spruce-Genotyps 143-2695 wurden nach HRHT in Gruppen zu 60 Embryonen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde getrennt in einen 250 ml-Schikanekolben gegeben, der 25 ml m24GMD-Medien mit einem der folgenden Sucrosegehalte enthielt: 1, 2, 3, 4 % (w/v). Die Embryonen wurden 5 Minuten (nur mit einem Sucrosegehalt von 2, 3 und 4 % w/v), 3 Stunden, 1, 2, 3, 4, oder 5 Tage lang unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen nährstoffbehandelt.
Dadurch wurden verschiedene Kombinationen von Sucrosegehalt und Nährstoffbehandlungsdauer erzeugt.
Am Ende der Nährstoffbehandlungen wurden aus jeder Nährstoffbehandlungsgruppe 10 Embryonen zufällig ausgewählt und deren Länge gemessen. Anschließend wurden die 60 Embryonen in jeder Nährstoffbehandlungsgruppe in vier Gruppen zu je 15 Embryonen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde als Replikat der jeweiligen Behandlungen in eine Keimbox ausgesät. Jede Keimbox enthielt 150 ml Vermiculit und 120 ml 3 % w/v Sucrose m24GMD-Medien und beherbergte ein zufällig zugeordnetes Replikat aus den vier verschiedenen Nährstoffbehandlungsgruppen. Nach der Aussaat wurden die Embryonen zur Keimung gebracht und zwei Wochen in einem Keimungsraum unter den im vorangehenden Beispiel beschriebenen Bedingungen angezogen, woraufhin die auskeimenden Samen geerntet und gemessen wurden.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2.1 – 2.4 zusammengefasst, woraus sich die folgenden Beobachtungen ergeben:

1) Nach zweitägiger Nährstoffbehandlung setzte eine Streckung der somatischen Embryonen ein. Die Streckung war um fast 65 % größer als bei den Kontrollbehandlungen ohne Nährstoffbehandlung. Die Streckung war bei der Behandlung mit allen vier Sucrosegehalten ähnlich (Tabelle 2.1).
2) Die Wasserüberaufnahmerate (hyperhydric rate) nahm mit der Dauer der Nährstoffbehandlung und dem Sucrosegehalt zu (Tabelle 2.2).
3) Das Sprosswachstum der auskeimenden Samen wurde durch die Nährstoffbehandlungen stimuliert. Für alle vier Sucrosegehalte trat das beste Wachstum ein, wenn die Embryonen zwei Tage lang mit Nährstoffen behandelt wurden (Tabelle 2.3).
4) Obwohl das Wurzelwachstum der auskeimenden Samen bei einer 5-tägigen Nährstoffbehandlung der Embryonen optimal zu sein schien, waren die Unterschiede zwischen allen Kombinationen von Dauer der Nährstoffbehandlung und Sucrosegehalt gering (Tabelle 2.4).
5) Diese Ergebnisse weisen auf wesentliche Wechselbeziehungen zwischen Dauer der Nährstoffbehandlung und Sucrosegehalt in der Nährstoffbehandlungslösung hin. Optimale Keimung und Wachstum können erreicht werden (a) durch die Kombination eines geringeren Sucrosegehalts in den Nährstofflösungen mit einer längeren Dauer der Nährstoffbehandlung oder (b) durch einen höheren Sucrosegehalt in den Lösungen zur Nährstoffbehandlung, was eine kürzere Dauer der Nährstoffbehandlung ermöglichen würde.

Tabelle 2.1: Auswirkungen von Nährstoffbehandlungen auf die Länge der auskeimenden Samen (mm)
Tabelle 2.2: Wasserüberaufnahmerate (hyperhydricity rates) [%] nach zweiwöchiger Keimungszeit
Tabelle 2.3: Sprosslänge nach zweiwöchiger Keimungszeit [mm]
Tabelle 2.4: Wurzellänge, gemessen nach zweiwöchiger Keimungszeit [mm]
BEISPIEL 3
Auswirkung des pH-Werts der Nährstoffbehandlungslösung auf die Keimung und das Wachstum der Interior-Spruce-Embryonen
Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, den optimalen pH-Wert oder den optimalen pH-Bereich der Nährstofflösungen zu ermitteln, der die Keimung nährstoffbehandelter somatischer Embryonen nicht negativ beeinflusst.
Somatische Embryonen des Interior-Spruce-Genotyps 4-2809 wurden nach HRHT in Gruppen zu 60 Embryonen aufgeteilt und in 2 % w/v Sucrose m24GMD-Medium drei Tage lang nährstoffbehandelt. Die Lösungen zur Nährstoffbehandlung wiesen vor der Autoklavierung einen pH-Wert von 5,0, 5,5, 5,8, 6,0, 6,2, 6,5, 6,8 und 7,0 auf. Der pH-Wert jeder Lösung wurde 24 Stunden nach der Autoklavierung, direkt vor und nach der Nährstoffbehandlung erneut gemessen. Nach der Nährstoffbehandlung wurden die Embryonen in Keimboxen ausgesät und, wie in vorangehenden Versuchen beschrieben, in einem Keimraum zwei Wochen lang zur Keimung gebracht. Die auskeimenden Samen wurden anschließend geerntet und gemessen.
Die Autoklavierung führte zu einem leichten Abfall des pH-Werts aller Nährstofflösungen (Tabelle 3). Nach dreitägiger Nährstoffbehandlung fiel der pH-Wert aller Nährstofflösungen weiter ab. Die Keimung von somatischen Embryonen, die in Nährstofflösungen mit pH-Werten vor der Autoklavierung im Bereich von 5,5-6,8 nährstoffbehandelt wurden, war vergleichbar oder verbessert gegenüber der Keimungsrate der Embryonen aus der Kontrollgruppe ohne Nährstoffbehandlung (Tabelle 3). Die Keimfähigkeit von Embryonen, die in Lösungen nährstoffbehandelt wurden, die einen anfänglichen pH-Wert von 5 oder weniger oder 7 oder mehr aufwiesen, wurde negativ beeinflusst. Die Werte für die Spross- und Wurzelentwicklung wurden nicht durch den pH-Wert der verschiede nen Lösungen zur Nährstoffbehandlung beeinflusst. Aufgrund dieser Ergebnisse ist offensichtlich, dass der pH-Wert von Nährstofflösungen im Bereich von 5,5-6,8 liegen kann.
Tabelle 3: Veränderungen des pH-Werts vor und nach der Autoklavierung, nach der Nährstoffbehandlung und die Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Interior Spruce
BEISPIEL 4
Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf die Ex-Vitro-Keimung und die Wurzelbildung bei somatischen Embryonen von Kiefer und Fichte.
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.), Patula-Kiefer (Pinus patula Scheide et Deppe), Radiata-Kiefer (Pinus radiata D. Don) und westlichen Weißkiefer (Pinus monticola Dougl. ex D. Don) wurden mit der HRHT-Behandlung getrocknet und dann drei Tage lang unter den zuvor beschriebenen Bedingungen in 3 % w/v Sucrose m24GMD-Lösungen nährstoffbehandelt. Die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen wurden dann zusammen mit Kontrollgruppen ohne Nährstoffbehandlung ex vitro ausgesät und drei Wochen lang angezogen. Bei der ersten Untersuchung wurden die Embryonen in Anzuchtschalen mit 288 Töpfen (288-cell miniplug trays, Blackmore Co.) in erdfreien Mischungen ausgesät, die zu 50 % aus gesiebtem Torf und zu 50 % aus feinem Perlit bestehen; jede Zelle enthielt ein Volumen von 10 ml. Bei der zweiten Untersuchung wurden die Embryonen in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit einem polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc., San Bautitsta, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Anzuchtbehälter eine Woche lang in eine nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 relative Luftfeuchte) bei einer 18-stündigen Photoperiode von 30-40 mol m^-2s^-1 photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit verbracht worden waren, unmittelbar und dann in täglichem Abstand über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer m24GMD-Lösung mit 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Nach den ersten sieben Tagen in der nicht-sterilen Keimungsumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die Topfplatten für zwei weitere Wochen zum Wachsen in eine nicht-sterile Dunstkammer (mit einer relativen Luftfeuchte im Bereich von 75-90 %) mit einer 18-stündigen Photoperiode von 120-150 mol m^-2s^-1 PAR mit Tag-Nacht-Temperaturen von 18-23 °C überführt. Bis zum Ende des zweiwöchigen Aufenthalts in der Dunstkammer wurde den auskeimenden Samen täglich durch Bedunsten die m24GMD-Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose zugeführt. Für die Verabreichung der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturzeit wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt.
Am Ende der dreiwöchigen Keimzeit wurden alle auskeimenden Samen gezählt und auf Wurzelansätze untersucht. Die Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate wurden auf Grundlage der Gesamtzahl der in jedem Replikat ausgesäten Embryonen errechnet. Die Bewurzelungsrate ist ein Maß für die Pflanzenumwandlungsrate, da auskeimende Samen sich sehr wohl gestreckt und Sprosse gebildet haben können, ohne jedoch Wurzelansätze zu bilden. Bei den Versuchen sind die Schwankungen bei der Replikation und Zahl der Embryonen in jedem Replikat auf die Verfügbarkeit von Embryonen oder Raum zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung zurückführen.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Es war offensichtlich, dass Embryonen sowohl nach HRHT als auch nach Nährstoffbehandlung direkt ex vitro ausgesät und in üblichen nicht-sterilen Aufzuchtumbebungen gezogen werden können. Dennoch war deutlich zu erkennen, dass Nährstoffbehandlungen vor der Ex-Vitro-Aussaat die Keimfähigkeit deutlich steigern und auch die Pflanzenumwandlungsrate im Vergleich zu den Kontrollgruppen nach HRHT-Behandlungen, die nicht nährstoffbehandelt wurden, steigern können.
Tabelle 4: Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf die Ex-Vitro-Keimung und -Wurzelbildung von somatischen Embryonen von Fichte und Kiefer
BEISPIEL 5
Ex-Vitro-Keimung von nährstoffbehandelten und getrockneten somatischen Embryonen von Fichte und Kiefer.
Reife somatische Embryonen von Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.), Patula-Kiefer (Pinus patula Scheide et Deppe) und Radiata-Kiefer (Pinus radiata D. Don) wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und anschließend drei Tage lang unter den zuvor beschriebenen Bedingungen in Lösungen mit 3 % (Interior Spruce) oder 4 % w/v Sucrose m24GMD (Patula- und Radiata-Kiefer) nährstoffbehandelt. Nach der Entnahme aus den Nährstofflösungen wurden die Embryonen auf Papiertüchern trockengetupft. Die getrockneten Embryonen wurden in Petrischalen gesetzt. Die Petrischalen wurden dann in Trockenkammern versiegelt, die ungesättigte NaCl-Lösungen enthielten, die durch Veränderungen der Molalität von NaCl-Lösungen für verschiedene relative Luftfeuchtebedingungen sorgen. Die Embryonen wurden bei 92,7 % relativer Luftfeuchte bei 23 °C in einer Kammer von Conviron für 24 Stunden getrocknet. Anschließend wurden die Embryonen in eine Kammer mit 88,5 % relativer Luftfeuchte überführt und weitere 48 Stunden bei 5 °C in einem Kühlschrank getrocknet. Vor und nach jeder Trocknungsbehandlung wurden drei Proben von drei Embryonen von jedem Genotyp genommen und auf den Wassergehalt (WG) und den relativen Wassergehalt (RWG) untersucht. Nach der Trocknung wurden die Embryonen zunächst in einer Kammer mit 100 % relativer Luftfeuchte, die Wasser enthielt und dann über Nacht auf Agar rehydriert. Nach der Rehydration wurden die getrockneten, nährstoffbehandelten Embryonen in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit einem polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc., San Bautitsta, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Topfplatten eine Woche lang in eine nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit verbracht worden waren, unmittelbar und dann in täglichem Abstand über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer m24GMD-Lösung mit 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Nach den ersten sieben Tagen in der nicht- sterilen Keimungsumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die Topfplatten für zwei weitere Wochen zum Wachsen in eine nicht-sterile Dunstkammer (mit einer relativen Luftfeuchte im Bereich von 75-90 %) mit einer 18-stündigen Photoperiode von 120-150 mol m^-2s^-1 PAR mit Tag-Nacht-Temperaturen von 18-23 °C überführt. Bis zum Ende des zweiwöchigen Aufenthalts in der Dunstkammer wurde den auskeimenden Samen täglich durch Bedunsten die m24GMD-Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose zugeführt. Für die Verabreichung der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturzeit wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt.
Am Ende der dreiwöchigen Keimungszeit wurden alle gekeimten Embryonen und Setzlinge gezählt und auf Wurzelansätze untersucht. Die Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate wurden auf Grundlage der Gesamtzahl der in jedem Replikat ausgesäten Embryonen errechnet. Die Bewurzelungsrate ist ein Maß für die Pflanzenumwandlungsrate, da die überlebenden auskeimenden Samen sich sehr wohl gestreckt und Sprosse gebildet haben können, ohne jedoch Wurzelansätze zu bilden.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass nährstoffbehandelte somatische Embryonen getrocknet, dann ex vitro in nicht-sterile Wachstumsmedien aus dem Gartenbau ausgesät und erfolgreich zur Keimung gebracht werden können.
Tabelle 5: Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen, die vor der Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung getrocknet wurden
BEISPIEL 6
Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf die Ex-Vitro-Keimung von somatischen Embryonen von Fichte und Kiefer in zwei verschiedenen Arten nicht-steriler Wachstumssubstrate aus dem Gartenbau.
Reife somatische Embryonen von Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.), Patula-Kiefer (Pinus patula Scheide et Deppe), Radiata-Kiefer (Pinus radiata D. Don) und westlicher Weißkiefer (Pinus monticola Dougl. ex D. Don) wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und dann drei Tage lang unter den zuvor beschriebenen Bedingungen in m24GMD-Lösungen mit 3 % w/v Sucrose nährstoffbehandelt. Nährstoffbehandelte somatische Embryonen der Interior-Spruce-Linie 4-2809 und der Pinus-patula-Linien 168-5074 und 2712-5071 wurden dann zusammen mit den HRHT-Kontrollgruppen ohne Nährstoffbehandlung ex vitro in Anzuchtschalen mit 288 Töpfen (288-cell miniplug trays, Blackmore Co.) ausgesät, die eine nicht-sterile Wachstumsmischung aus dem Gartenbau enthielten, die zu 50 % aus gesiebtem Torf und zu 50 % aus feinem Perlit bestand. Die Pinus-patula-Linie 168-308, Pinus-radiata-Linie B-7364 und Pinus-monticola-Linie 212M-4572 wurden ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit einem polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc., San Bautitsta, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Behälter für eine Woche bei einer 18-stündigen Photoperiode von 30-40 μmol m^-2s^-1 PAR in eine nicht-sterile Wachstumskammer gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit verbracht worden waren, unmittelbar und dann in täglichem Abstand über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer m24GMD-Lösung mit 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Nach den ersten sieben Tagen in der nicht-sterilen Keimungsumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die Topfplatten für zwei weitere Wochen zum Wachsen in eine nicht-sterile Dunstkammer (mit einer relativen Luftfeuchte im Bereich von 75-90 %) mit einer 18-stündigen Photoperiode von 120-150 mol m^-2s^-1 PAR mit Tag-Nacht-Temperaturen von 18-23 °C überführt. Bis zum Ende des zweiwöchigen Aufenthalts in der Dunstkammer wurde den auskeimenden Samen täglich durch Bedunsten die m24GMD-Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturzeit wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt.
Am Ende der dreiwöchigen Keimungszeit wurden alle auskeimenden Samen gezählt und auf Wurzelansätze untersucht. Die Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate wurden auf Grundlage der Gesamtzahl der in jedem Replikat ausgesäten Embryonen errechnet. Die Bewurzelungsrate ist ein Maß für die Pflanzen umwandlungsrate, da die auskeimenden Samen sich sehr wohl gestreckt und Sprosse gebildet haben können, ohne jedoch Wurzelansätze zu bilden.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Es war deutlich erkennbar, dass die Nährstoffbehandlung somatischer Embryonen vor der Ex-Vitro-Aussaat die Keimfähigkeit deutlich verbessert und die Pflanzenumwandlungsrate im Vergleich zu den HRHT-Kontrollgruppen steigert.
Tabelle 6: Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate von ex vitro ausgesäten somatischen Fichten- und Kiefernembryonen aus der HRHT-Kontrollgruppe und aus der Gruppe mit Nährstoffbehandlung
BEISPIEL 7
Auswirkung von Ascorbinsäure auf die Keimung und die Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) des Genotyps 4-2809 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und dann drei Tage lang wie zuvor beschrieben in 3 % w/v Sucrose m24GMD-Lösungen nährstoffbehandelt. Die Lösungen zur Nährstoffbehandlung wurden mit einer der folgenden drei Ascorbinsäurekonzentrationen formuliert: 0, 10 μM, 100 μM.
Die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen wurden dann in Keimboxen ausgesät, die 150 ml Vermiculit und 120 ml flüssiges Medium mit 3 % w/v Sucrose m24GMD enthielten. Das in die Keimboxen gegebene Flüssigmedium wies eine der vier folgenden Ascorbinsäurekonzentrationen auf: 0, 10 μM, 100 μM oder 1000 μM. Nährstoffbehandelte Embryonen aus jeder Nährstoffbehandlungsgruppe mit Ascorbinsäure wurden dann in Dreifachboxen zu je einem mit Ascorbinsäure ergänzten Keimungsmedium ausgesät. Nach der Aussaat wurden die Keimboxen zweifach mit Parafilm^TM versiegelt. Die Embryonen wurden zur Keimung gebracht und zwei Wochen lang bei 50-70 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss mit einer 16-stündigen Photoperiode bei einer Temperatur von 22 °C angezogen. Die auskeimenden Samen wurden anschließend geerntet und gemessen.
Die Auswirkungen der Zugabe von Ascorbinsäure auf Keimung und Wurzelbildung nährstoffbehandelter somatischer Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 4-2809 sind in Tabelle 7 dargestellt. Bei dieser Untersuchung war der Anteil der gekeimten somatischen Embryonen aus der HRHT-Kontroll gruppe sehr hoch und folglich traten keine signifikanten Verbesserungen aufgrund der Zugabe von Ascorbinsäure zu den Nährstoff- und Keimungsmedien auf. Die Bewurzelungsrate war jedoch bei den somatischen Embryonen deutlich erhöht, die Nährstoffbehandlungen mit Ascorbinsäure erhalten hatten. Es ist außerdem ersichtlich, dass bei dieser Untersuchung die stärkste Bewurzelungsantwort bei Embryonen zu beobachten war, die in Lösungen mit 10 μM Ascorbinsäure nährstoffbehandelt wurden.
Tabelle 7: Keimung und Wachstum von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 4-2809, die in Lösungen mit Ascorbinsäure nährstoffbehandelt wurden und auf Vermiculit-Medien mit Ascorbinsäure zur Keimung gebracht wurden
BEISPIEL 8
Auswirkungen von Wachstumsregulatoren auf die Keimung und Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) der Genotypen 4-2809, 23-2672 und I-1026 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet. Genotyp 2-1026 wurde bei einer relativen Luftfeuchte von 85 % drei Tage lang weiter getrocknet und dann bei – 20 °C gelagert. Vor der Nährstoffbehandlung wurde der Genotyp I-1026 in einem Matrixbehandlungsschritt imbibiert, bei dem der getrocknete Embryo auf ein Sieb gelegt wurde und das Sieb anschließend für 18 Stunden auf die Oberfläche eines Agarsubstrats gelegt wurde, das mit 3 Phytogel geliert wurde. Nach Abschluss dieses Imbibitionsschrittes für Genotyp I-1026 wurden alle drei Genotypen 84 Stunden in Nährstoffbehandlungslösungen mit 3 % w/v Sucrose m24GMD nährstoffbehandelt, denen die in Tabelle 8.1. beschriebenen Pflanzenwachstumsregulatoren zugesetzt waren.
Tabelle 8.1: Zusätze von Pflanzenwachstumsregulatoren zu Lösungen zur Nährstoffbehandlung mit 3 % w/v Sucrose m24GMD
Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurden die nährstoffbehandelten somatischen Embryonen ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit einem polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc., San Bautitsta, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Topfplatten eine Woche lang in eine nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit verbracht worden waren, unmittelbar und dann in täglichem Abstand über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer m24GMD-Lösung mit 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Nach den ersten sieben Tagen in der nicht-sterilen Keimungsumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die Topfplatten für zwei weitere Wochen zum Wachsen in eine nicht-sterile Dunstkammer (mit einer relativen Luftfeuchte im Bereich von 75-90 %) mit einer 18-stündigen Photoperiode von 120-150 mol m^-2s^-1 PAR mit Tag-Nacht-Temperaturen von 18-23 °C überführt. Bis zum Ende des zweiwöchigen Aufenthalts in der Dunstkammer wurde den auskeimenden Samen täglich durch Bedunsten die m24GMD-Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturzeit wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt.
Am Ende der dreiwöchigen Keimungszeit wurden alle gekeimten Embryonen und auskeimenden Samen gezählt und auf Wurzelansätze untersucht. Die Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate wurden auf Grundlage der Gesamtzahl der in jedem Replikat ausgesäten Embryonen errechnet. Die Bewurzelungsrate ist ein Maß für die Pflanzenumwandlungsrate, da die überleben den auskeimenden Samen sich sehr wohl gestreckt und Sprosse gebildet haben können, ohne jedoch Wurzelansätze zu bilden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 8.2 festgehalten. Die Daten zeigen, dass bei Interior Spruce des Genotyps 4-2809 die Nährstoffbehandlung sowohl die Keimfähigkeit als auch die Bewurzelungsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe mit HRHT-Behandlung deutlich erhöht. Die Zugabe von zusätzlichen Wachstumsregulatoren zu den Nährstofflösungen förderte die Keimungs- und Bewurzelungsleistung von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 4-2809 nicht. Eine Kombination von 0,05 μM IBA und 0,01 μM BA mit Lösungen, die zur Nährstoffbehandlung von somatischen Embryonen des Genotyps 23-2672 verwendet wurden, führte jedoch zur stärksten Keimungsantwort, während die Kombinationen von 0,05 μM IBA und 0,01 μM BA und Kombinationen von 0,05 μM IBA und 0,01 μM GA_4/7 die höchste Bewurzelungsrate erzielten. Die Zugabe von 0,05 μM IBA zu Nährstoffbehandlungslösungen von Interior Spruce des Genotyps I-1026 erzielte die maximale Keimungs- und Bewurzelungsantwort.
Tabelle 8.2: Auswirkungen von Pflanzenwachstumsregulatoren, die zu Lösungen zur Nährstoffbehandlung zugegeben werden, auf die Ex-Vitro-Keimung und Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Bei der zweiten Untersuchung zu den Auswirkungen von Pflanzenwachstumsregulatoren auf die Keimungsleistung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen wurden nach der Ex- Vitro-Aussaat der nährstoffbehandelten somatischen Embryonen Pflanzewachstumsregulatoren zu den Wachstumssubstraten aus dem Gartenbau zugegeben. Bei dieser Untersuchung wurden somatische Embryonen der Interior Spruce der Genotypen 4-2809, 23-2672 und I-1026 wie bei der ersten Untersuchung mit Wachstumsregulatoren beschrieben getrocknet und gelagert. Vor der Nährstoffbehandlung wurde der Genotyp I-1026 in einem Matrixbehandlungsschritt imbibiert, bei dem der getrocknete Embryo auf ein Sieb gelegt wurde und das Sieb anschließend für 18 Stunden auf die Oberfläche eines Agarsubstrats gelegt wurde, das mit 3 % Phytogel geliert worden war. Nach Abschluss dieses Imbibitionsschrittes für Genotyp I-1026 wurden alle drei Genotypen 84 Stunden in Nährstoffbehandlungslösungen mit 3 % w/v Sucrose m24GMD nährstoffbehandelt und dann ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit einem polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc., San Bautitsta, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat erhielten die nährstoffbehandelten Embryonen exogen eine der in Tabelle 8.3 beschriebenen Behandlungen.
Tabelle 8.3: Pflanzenwachstumsbehandlungen, die Gartenbausubstraten zugegeben werden, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte somatische Embryonen enthalten.
Nach Abschluss der exogenen Applikation der Behandlungen mit Pflanzenwachstumsregulatoren wurden die Blöcke für eine Woche in eine nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, wurden, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer mit hoher Luftfeuchtigkeit verbracht worden waren, unmittelbar und dann in täglichem Abstand über einen Zeitraum von 7 Tagen mit einer m24GMD-Lösung mit 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Nach den ersten sieben Tagen in der nicht-sterilen Keimungsumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die Topfplatten für zwei weitere Wochen zum Wachsen in eine nicht-sterile Dunstkammer (relative Luftfeuchte im Bereich von 75-90 %) bei einer 18-stündigen Photoperiode von 120-150 mol m^-2s^-1 PAR mit Tag-Nacht-Temperaturen von 18-23 °C überführt. Bis zum Ende des zweiwöchigen Aufenthalts in der Dunstkammer wurde den auskeimenden Samen täglich durch Bedunsten die m24GMD-Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturzeit wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt.
Am Ende der dreiwöchigen Keimungszeit wurden alle überlebenden auskeimenden Samen gezählt und auf Wurzelansätze untersucht. Die Keimfähigkeit und Bewurzelungsrate wurden auf Grundlage der Gesamtzahl der in jedem Replikat ausgesäten Embryonen errechnet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 8.4 festgehalten. Wie in der vorangehenden Untersuchung verbesserte die exogene Zufuhr von Pflanzenwachstumsregulatoren die Keimungs- oder Bewurzelungsleistung bei nährstoffbehandelten somatische Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 4-2809 nicht. Die exogene Zufuhr von IBA allein oder in Kombination mit 0,02 μM BA steigerte die Keimungsleistung jedoch deutlich.
Tabelle 8.4: Auswirkungen von Pflanzenwachstumsregulatoren, die zu Gartenbauwachstumssubstraten zugegeben werden, auf die Ex-Vitro-Keimung und Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Diese Beispiele zeigen, dass die Zugabe von ausgewählten Pflanzenwachstumsregulatoren zu Nährstofflösungen oder alternativ die exogene Zufuhr zu ex vitro ausgesäten, nährstoffbehandelten somatischen Embryonen die Keimung und Wurzelbildung von somatischen Embryonen deutlich verbessern kann. Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, die hier beschriebenen Informationen zu verwenden, um zu entscheiden, welche Pflanzenwachstumsregulatoren, allein oder in Kombination, und in welcher Menge verwendet werden können, um die Ex-Vitro-Keimung und Entwicklung von somatischen Embryonen ihrer bevorzugten Art zu fördern.
BEISPIEL 9
Diese Untersuchungen hatten zum Ziel, die Auswirkungen von Umweltbedingungen während des Nährstoffbehandlungsschrittes auf die spätere Ex-Vitro-Keimung und das Wachstum nährstoffbehandelter somatischer Embryonen zu bestimmen.
Die erste Untersuchung diente der Feststellung der Auswirkungen von Licht- und Temperaturbedingungen während der Nährstoffbehandlung auf die spätere Keimungs- und Entwicklungsleistung. Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) des Genotyps 23-2672 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und dann in fünf Gruppen von 160 somatischen Embryonen pro Gruppe aufgeteilt. Ein Gruppe wurde nicht vorbehandelt und diente als HRHT-Kontrollgruppe für diese Untersuchung. Die verbliebenen vier Gruppen wurden für die Nährstoffbehandlung zufällig auf 250 ml-Kolben verteilt, die Nährstofflösungen mit 3 % w/v Sucrose m24GMD enthielten. Die Nährstoffbehandlung wurde bei einer Temperatur von 5 °C mit oder ohne Beleuchtung oder bei Raumtemperatur (d.h. 20-23 °C) mit oder ohne Beleuchtung durchgeführt. Wenn das Verfahren zur Nährstoffbehandlung unter Lichteinfluss durchgeführt wurde, betrug die Photoperiode 24 Stunden bei 30 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss. Die Behandlung in Dunkelheit erfolgte, indem die Kolben in Aluminiumfolie eingewickelt wurden. Die Dauer jeder Nährstoffbehandlung betrug 72 Stunden.
Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurde jede Behandlungsgruppe in acht Gruppen von 20 Embryonen aufgeteilt und per Hand auf Vermiculit-Medien in Sigma Polycarbonat-Boxen ausgesät. Die flüssigen Medien in diesen Keimboxen waren m24GMD mit oder ohne 3 % w/v Sucrose. Vier der acht Gruppen wurden auf Medien ohne Sucrose ausgesät, während die übrigen vier Gruppen auf Medien ausgesät wurden, die 3 % w/v Sucrose enthielten. Der Versuchsaufbau war ein vollständiges Blockdesign mit zufälliger Zuteilung (random complete block design) für jeden Medientyp. Die Keimboxen wurden in einen Keimraum gestellt und zwei Wochen bei 50-70 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss mit einer 16-stündigen Photoperiode bei einer Lufttemperatur von 23 °C aufgezogen.
Die auskeimenden Samen wurden dann geerntet und auf Keimungsraten, Wasserüberaufnahemegrad (hyperhydricity rates) und Länge der Sprosse und Wurzeln untersucht. Keimung wurde definiert durch ausgekeimte Samen mit einer Wurzel von mehr als 2 mm Länge und einem gestreckten Hyperkotyl. Wasserüberaufnahme wurde definiert durch die Verdickung des Hypokotyls und das wässrige Aussehen sowohl der gekeimten als auch der ungekeimten Samen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den Tabellen 9.1 und 9.2 zusammengefasst. Die Temperaturen, bei denen die Nährstoffbehandlung durchgeführt wurde, beeinflussten die spätere Keimung und Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen nicht, wenn 3 % w/v Sucrose zu den Nährstofflösungen zugegeben wurde. Wenn jedoch nicht 3 % w/v Sucrose in den Nähr stofflösungen vorlagen, keimten nur die Embryonen erfolgreich, die bei Umgebungstemperatur nährstoffbehandelt wurden. Die Wurzelentwicklung von somatischen Embryonen, die in Lösungen ohne Sucrose nährstoffbehandelt wurden, war im Vergleich zu denen, die in Lösungen mit Sucrose nährstoffbehandelt wurden, deutlich eingeschränkt. Zusammenfassend folgt daraus, dass die Nährstoffbehandlung falls gewünscht unter gekühlten Bedingungen (z.B. 4 °C) durchgeführt werden kann, wenn Sucrose Bestandteil der Nährstofflösung ist.
Tabelle 9.1: Auswirkungen von Temperatur und Licht während der Nährstoffbehandlung auf die Keimung von somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Tabelle 9.2: Auswirkungen von Temperatur und Licht während der Nährstoffbehandlung auf das Wachstum und die Entwicklung von somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Die zweite Untersuchung diente der Feststellung der Auswirkungen der Zugabe verschiedener Osmotika zu den Nährstoff lösungen auf die spätere Keimungs- und Entwicklungsleistung. Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) des Genotyps 23-2672 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und dann in zehn Gruppen von 160 somatischen Embryonen pro Gruppe aufgeteilt. Ein Gruppe wurde nicht vorbehandelt und diente als HRHT-Kontrollgruppe für diese Untersuchung. Die verbliebenen neun Gruppen wurden zufällig auf eine der folgenden Behandlungen mit Osmotika, die zu der m24GMD-Nährstofflösung zugegeben wurden, verteilt: 1 % w/v Betain, 1,65 % w/v Fructose, 1,65 % w/v Glucose, 1,65 % w/v Mannitol, 1,65 % w/v Sorbitol, 3 % w/v Lactose, 3 % w/v Maltose, 3 % w/v Sucrose oder 10 % w/v Polyethylenglycol (PEG) 4000. Das resultierende osmotische Potential lag bei allen Behandlungsgruppen bei – 0,35 MPa, ausgenommen bei der PEG-Lösung, die ein osmotische Potential von – 0,32 MPa aufwies. Die Lösungen zur Nährstoffbehandlung und die Embryonen wurden in 250 ml-Kimax^®-Schikanekolben gegeben. Die Dauer der Nährstoffbehandlung betrug 72 Stunden bei Temperaturen im Bereich von 20-23 °C und einer 24-stündigen Photoperiode von 30 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss.
Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurden die nährstoffbehandelten Embryonen aus jeder Behandlungsgruppe in acht Gruppen von 20 Embryonen aufgeteilt und per Hand auf Vermiculit-Medien in Sigma Polycarbonat-Boxen ausgesät. Die flüssigen Medien in diesen Keimboxen waren m24GMD mit oder ohne 3 % w/v Sucrose. Der Versuchsaufbau war ein "Random-Complete-Block-Design" für jeden Medientyp. Jede Nährstoffbehandlungsgruppe hatte vier Replikate von 20 Embryonen in jedem Keimungsmediumtyp. Die Keimboxen wurden in einen Keimraum gestellt und zwei Wochen bei 50-70 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss mit einer 16-stündigen Photoperiode bei einer Lufttemperatur von 23 °C aufgezogen. Die auskeimenden Samen wurden geerntet und auf Keimungsraten, Wasserüberaufnahemegrad (hyperhydricity rates) und Länge der Sprosse und Wurzeln untersucht. Keimung wurde definiert durch auskeimende Samen mit einer Wurzel von mehr als 2 mm Länge und einem gestreckten Hyperkotyl. Wasserüberaufnahme wurde definiert durch die Verdickung des Hypokotyls und das wässrige Aussehen sowohl der gekeimten als auch der ungekeimten Samen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den Tabellen 9.3 und 9.4 zusammengefasst.
Obwohl die Zugabe von Osmotika zu den Nährstofflösungen mit 3 % w/v Sucrose den Keimungswert nicht negativ beeinflussten, führten, zusammenfassend gesagt, alle Behandlungen mit Osmotika, außer bei Betain, Mannitol und Lactose, zu stärkerer Wasserüberaufnahme (hyperhydricity). Wenn die Osmotika zu Nährstofflösungen, die keine Sucrose enthielten, zugegeben wurden, traten Schwankungen in der Keimungsleistung auf und es wurde starke Wasserüberaufnahme beobachtet (Tabelle 9.3). Die nährstoffbehandelten Embryonen aus allen Behandlungsgruppen mit Osmotika bildeten Wurzeln und Sprosse, die beste Entwicklung wurde jedoch. bei Embryonen beobachtet, die in einer Nährstofflösung mit 3 % w/v Sucrose m24GMD nährstoffbehandelt wurden, die keine Osmotika enthielt (Tabelle 9.4).
Tabelle 9.3: Auswirkungen von Osmotika auf die Keimung von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Interior Spruce
Tabelle 9.4: Auswirkungen von Osmotika auf die Entwicklung von nährstoffbehandelten somatischen auskeimenden Samen der Interior Spruce
BEISPIEL 10
Das Ziel dieser Untersuchung bestand in der Feststellung der Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf die Entwicklung von Nährstoffreserven in den somatischen Embryonen der Interior Spruce.
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) des Genotyps 2-1026 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet.
Neun Gruppen von 20 Embryonen wurden zufällig aus der HRHT-behandelten Population ausgewählt. Die Länge jedes Embryos wurde gemessen. Anschließend wurden vier Gruppen von Embryonen in m24GMD-Lösungen mit 2 % w/v Sucrose 1, 2, 3 bzw. 4 Tage lang nährstoffbehandelt. Die verbliebenen vier Embryonengruppen wurden in m24GMD-Lösungen mit 4 % w/v Sucrose 1, 2, 3 bzw. 4 Tage lang nährstoffbehandelt. Nach Abschluss jeder Nährstoffbehandlung wurden die Embryonen mit einem 53-μm Nylonnetz gesammelt und drei Mal mit deionisiertem Wasser gespült. Die Embryonen wurden dann mit Filterpapier trockengetupft und ihre Länge nach der Nährstoffbehandlung wurde gemessen. Jede Gruppe wurde dann in fünf Sätze zu je vier Embryonen aufgeteilt und in tarierte Mikrozentrifugenröhrchen gesetzt. Nach der Frischgewichtsbestimmung wurden die Embryonen bei 60 °C 24 Stunden lang getrocknet und ihr Trockengewicht bestimmt. Die neunte Gruppe, die aus Embryonen, die nach HRHT-Behandlung nicht nährstoffbehandelt wurden, (d.h. die Kontrollgruppe) bestand, wurde ebenfalls zur Bestimmung der Länge, des Frisch- und Trockengewichts in fünf Sätze von je vier Embryonen aufgeteilt.
Zusätzliche acht Gruppen zu je 160 Embryonen pro Gruppe wurden aus den HRHT-behandelten Embryonen ausgewählt. Vier Embryonengruppen wurden in m24GMD-Lösungen mit 4 % w/v Sucrose für 1, 2, 3 bzw. 4 Tage nährstoffbehandelt. Nach Abschluss jeder Nährstoffbehandlung wurden die Embryonen mit einem 53-μm Nylonnetz gesammelt und drei Mal mit deionisiertem Wasser gespült. Die Embryonen wurden dann mit Filterpapier trockengetupft. Jede Gruppe wurde dann zufällig in 16 Proben von je 15 Embryonen aufgeteilt. Eine Probe wurde in ein tariertes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gesetzt und das Frischgewicht gemessen. Die Mikrozentrifugen röhrchen wurden dann für 10 min. in flüssiges N₂ gegeben und bei – 80 °C gelagert, bis die biochemischen Analysen wie unten dargestellt durchgeführt werden konnten.
Bestimmung des Triacylglycerid-Gehalts
Die Protokolle für die Extraktion, Reinigung und Prüfung von Triacylglycerid (TAG) folgten den Verfahren von Feirer et al. (1989). Kurz gesagt wurden Proben von (a) 15 nährstoffbehandelten somatischen Embryonen oder (b) 15 somatischen Embryonen ohne Nährstoffbehandlung oder (c) 10 zygotischen Embryonen, die aus trockenen Samen aus drei Chargen (SL# 28840; 60245; 08729) herausseziert wurden, in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zwei Minuten lang mit 0,1 ml wasserfreiem Isopropanol (Fisher, HPLC-Grad) unter Verwendung eines motorgetriebenen Stößels zermahlen. Der Stößel wurde drei Mal mit 0,3 ml Isopropanol gewaschen. Die Waschlösungen wurden im Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden dann für 15 Minuten auf einen Schüttler (150 Upm) gestellt und anschließend 15 Minuten lang bei 13.000 Upm zentrifugiert.
Zur Reinigung der Lipidextrakte wurde ein 0,8 ml Aliquot des Überstands von jeder Probe abgezogen und in ein 10 ml Reagenzglas gegeben, das 0,8 g Aluminiumoxid und 1,8 ml Isopropanol enthielt. Die Röhrchen wurden für 15 Minuten bei 150 Upm auf einen Schüttler gestellt und dann bei 3.000 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt. Das Pellet wurde in 2,6 ml Isopropanol erneut suspendiert. Die Röhrchen wurden wieder auf den Schüttler gestellt, erneut suspendiert und wieder zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde mit dem anfangs aus der Probe gewonnenen Überstand vereinigt. Um den TAG-Gehalt in den gereinigten Extrakten zu bestimmen wurde ein 1 ml Aliquot des vereinigten Überstands abgezogen, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und erneut bei 13.000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Ein 0,8 ml Aliquot des Überstands wurde abgezogen und in ein 5 ml Polypropylenröhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen wurde ein 0,2 ml Aliquot von N KOH zugegeben. Die Röhrchen wurden mit Kappen verschlossen, gevortexed und für 5 Minuten in ein Wasserbad mit 60 °C gegeben, um die folgende Reaktion zu ermöglichen: TAG + KOH → Glycerol + Fettsäure
Nach einer Reaktionszeit von 5 Minuten wurden die Röhrchen aus dem Wasserbad entnommen und in einem Becken mit laufendem Leitungswasser 2 Minuten lang abgekühlt. Anschließend wurde ein 0,2 ml Aliquot Natrium-meta-periodat zu jedem Röhrchen zugegeben, um die folgende Reaktion zu ermöglichen: Glycerol + Periodat → Formaldehyd
Nach zehnminütiger Inkubation wurde ein 1,2 ml Aliquot eines Farbreagens (einer Mischung von Ammoniumacetat und Acetylaceton in Isopropanol) zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen anschließend für 30 Minuten in ein Wasserbad mit 60 °C gegeben, um die folgende Reaktion zu ermöglichen: Formaldehyd + NH4 + Acetylaceton → Diacetyldihydrolutidin
Die Röhrchen wurden dann in einem Becken mit laufendem Leitungswasser 2 Minuten lang abgekühlt. Das Absorptionsvermögen jeder Lösung wurde in einem Spektralphotometer bei 410 nm bestimmt.
Ergebnisse
Die Nährstoffbehandlung beeinflusste das Einsetzen der biologischen Aktivität im Inneren somatischer Embryonen, wie durch die Streckung entlang der embryonalen Achse angezeigt (Tabelle 10.1) ist. Außerdem nahm das Ausmaß der Embryostreckung ebenfalls mit der steigenden Dauer der Nährstoffbehandlung zu (Tabelle 10.1). Βei dieser Untersuchung erfolgte eine deutlichere Streckung des Embryos, wenn den Lösungen zur Nährstoffbehandlung 2 % w/v Sucrose im Vergleich zu 4 % w/v Sucrose zugesetzt war. Es zeigte sich außerdem, dass die stärkste Antwort nach 3-4-tägigen Nährstoffbehandlungen auftrat.
Tabelle 10.1: Länge (mm) von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps I-1026 vor und nach den Nährstoffbehandlungen.
Es war weiterhin deutlich zu ersehen, dass eine Verlängerung der Nährstoffbehandlungszeiten zu einer deutlichen Erhöhung der embryonalen Biomassebildung führte, was durch eine Erhöhung des Trockengewichts von 32-54 % nach dreitägiger Nährstoffbehandlung und 65-75 % nach viertägiger Nährstoffbehandlung im Vergleich zum Trockengewicht der HRHT-Kontrollembryonen belegt wird (Tabelle 10.2).
Tabelle 10.2: Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf das Trockengewicht [mg] von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps I-1026 (Mittel aus 200 Embryonen)
Die Sucrosekonzentration in Lösungen zur Nährstoffbehandlung und die Dauer der Nährstoffbehandlung beeinflusste die Ansammlung von Speicherreservelipiden, d.h. TAG, in somatischen Embryonen der Interior Spruce deutlich (Tabelle 10.3). Während der TAG-Gehalt sich bei Embryonen, die einen Tag in Lösungen mit 2 % w/v Sucrose nährstoffbehandelt wurden, um über 90 % erhöhte, nahm der TAG-Gehalt danach mit wachsender Dauer der Nährstoffbehandlung ab, bis schließlich am vierten Tag der Nährstoffbehandlung der TAG-Gehalt nur 10 % über dem der Kontrollgruppen ohne Nährstoffbehandlung lag. Andererseits verdoppelte sich der TAG-Gehalt bei somatischen Embryonen, die in Lösungen mit 4 % w/v Sucrose nährstoffbehandelt wurden, im Laufe des ersten Tages und behielt dieses Niveau bis zum vierten Tag der Nährstoffbehandlung bei. Es ist außerdem anzumerken, dass, obwohl der TAG-Gehalt bei somatischen Embryonen der HRHT-Kontrollgruppe mit dem bei zygotischen Embryonen vergleichbar ist, Embryonen, die in Lösungen mit 4 % w/v Sucrose nährstoffbehandelt wurden, 85 % mehr TAG enthielten als in zygotischen Embryonen vorlag.
Tabelle 10.3: Vergleich des Lipidgehalts bei zygotischen Embryonen der Interior Spruce mit somatischen Embryonen des Genotyps 2-1026 aus der Kontrollgruppe und mit Nährstoffbehandlung
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Nährstoffbehandlung somatischer Embryonen in Lösungen, die Sucrose und mineralische Nährstoffe enthalten, die physiologischen und biochemischen Prozesse erleichtert und fördert, die mit den Abläufen nach der Quellung in Phase 2 der Keimung verbunden sind. Es ist außerdem ersichtlich, dass die somatischen Embryonen durch die Nährstoffbehandlung Speicherreservelipide ansammeln können, die die späteren Abläufe in Verbindung mit dem Abschluss der Keimung und dem Einsetzen des Wachstums und der Entwicklung der Setzlinge fördern.
BEISPIEL 11
Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, die Auswirkungen der Dauer der Nährstoffbehandlung, der Trocknung nach der Nährstoffbehandlung und die Lagerung nach der Trocknung auf die Ex-Vitro-Keimung von somatischen Embryonen der In terior Spruce in nicht-sterilen Substraten und Umgebungen zu untersuchen.
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) der Genotypen 4-2809 und 2-1026 wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und bei 4 °C gelagert. Die Embryonen wurden 1, 2 oder 3 Tage lang in ½ m24GMD Flüssigmedium mit 3 % w/v Sucrose, wie in vorhergehenden Beispielen beschrieben, in Kimax^® 250 ml Schikane-Erlenmeyer-Kulturkolben nährstoffbehandelt.
Die nährstoffbehandelten Embryonen aus jeder Behandlungsgruppe wurden zusammen mit der Kontrollgruppe nach HRHT-Behandlung in Gruppen von 155 Embryonen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde in einer 6 cm Petrischale auf ein 800 μm Nylonnetz gegeben und zufällig einer der zwei Trocknungsbehandlungen zugeordnet. Trocknungsbehandlung #1 fand bei 90,0 % relativer Luftfeuchte statt (die Embryonen wurden über einer 2,83 mol NaCl-Lösung getrocknet), während die Trocknungsbehandlung #2 bei 85,0 % relativer Luftfeuchte stattfand (die Embryonen wurden über gesättigten KCl-Lösungen getrocknet). Beide Trocknungsbehandlungen wurden über drei Tage in abgeschlossenen Kammern bei 20 °C durchgeführt. Für jede Kombination aus „Nährstoffbehandlungszeit und Trocknungsbehandlung" für jeden Genotyp gab es drei Gruppen, die in drei Kammern getrocknet wurden. Am Ende jeder Trocknungsbehandlung wurde eine Probe von fünf Embryonen zur Bestimmung des Wassergehalts auf Basis der Differenz des Frisch- und Trockengewichts (dreitägig Ofentrocknung bei 65 °C) aus jeder Kammer genommen. Eine Gruppe wurde sofort imbibiert, wobei ein Maxtrixbehandlungsverfahren auf halbfesten Substraten bestehend aus 0,6 % Agar, 3 % w/v Sucrose und ½ m24GMD-Keimungsmedium in 10 cm Petrischalen über 68 Stunden bei 23 °C in einer Conviron-Gewebekulturkammer (Conviron Ltd., Winnipeg, MA) eingesetzt wurde. Die imbibierten Embryonen wurden dann wie unten beschrieben in vitro oder ex vitro ausgesät.
Die anderen beiden Embryonengruppen wurden von den Nylonnetzen in sterilisierte 2,0 ml Polypropylenphiolen für Tieftemperaturgefrierschränke (VWR Canlab, Mississauga, ON) geschabt. Die Phiolen wurden verkappt. Eine Gruppe wurde bei – 20 °C in einem Gefrierschrank und die andere Gruppe bei 4,0 °C gelagert. Nach einwöchiger Lagerung wurden die getrockneten, nährstoffbehandelten Embryonen nach dem zuvor beschriebenen Matrixbehandlungsverfahren imbibiert und dann in vitro oder ex vitro ausgekeimt. Bei jeder Aussaatgruppe gab es ungetrocknete Kontrollgruppen, die in ähnlicher Weise HRHT-behandelt oder vorbehandelt wurden wie die getrockneten nährstoffbehandelten Embryonen.
Die In-Vitro-Keimung fand auf demselben Medium statt wie für die Imbibition beschrieben, d.h. auf einem halbfesten Substrat bestehend aus 0,6 % Agar, 3 % w/v Sucrose und ½ m24GMD-Keimungsmedium in 10 cm Petrischalen. Für jede Kombination aus „Genotyp und Nährstoffbehandlungszeit und Trocknungsbehandlung" gab es drei Replikate mit 10 Embryonen in einer 10 cm Petrischale. Die Keimung lief unter sterilen Bedingungen in einem Gewebekulturraum mit kontrollierten Bedingungen ab.
Die Ex-Vitro-Keimung wurde in einer polymergebundenen erdlosen Mischung auf Torfbasis durchgeführt, die auf Anzuchtschalen aus Styropor mit 504 Töpfen (Topfvolumen 4 ml) (504-cell (4ml/cell) styrofoam miniplug trays, Grow-Tech Inc., San Bautista, CA) verteilt war. Beim Ex-Vitro-Versuch gab es drei Replikate von 20 Embryonen für jede Behandlungskombination.
Die eingesäten Topfplatten wurden in eine übliche nicht-sterile Keimungskammer aus dem Gartenbau in einen Aufzucht raum mit kontrollierten Bedingungen gestellt. Die Umgebungsbedingungen waren 22-24 °C Lufttemperatur, 80-100 % relative Luftfeuchte, 0,10-0,15 % CO₂ und eine 16-stündige Photoperiode bei 40-120 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss. Die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, wurden, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer verbracht worden waren, unmittelbar mit einer 3 % w/v Sucrose bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Danach wurden die Topfplatten während einer zweiwöchigen Keimungszeit täglich mit der 3 % w/v Sucrose-Lösung bedunstet. Im Zwei-Tagesrhythmus wurden die keimenden Embryonen mit mineralischen Nährstoffen in Form einer "Plant-starter"-Düngelösung mit einem Gehalt von 1 g/l 11-41-8 N P K bedunstet. Es wurden weder für die Zufuhr der Nährstofflösungen noch für die Keimungsumgebung während der zweiwöchigen Kulturphase aseptische Verfahren oder Bedingungen eingesetzt. Außerdem wurden prophylaktisch 0,1 g/l Benlat, 0,05 g/l Ampicillin und 0,05 g/l Penicillin G (oder 0,1 g Ampicillin) und 5 ml/l Gnatrol im Fünf-Tagesrhythmus zugeführt, um Pilze, Bakterien und Pilzfliegenlarven zu bekämpfen.
Die Daten in Tabelle 11.1 zeigen, dass die nährstoffbehandelten Embryonen im Vergleich stärker austrockneten, wenn sie in Umgebungen mit einer relativen Luftfeuchte von 85 getrocknet wurden als in Trocknungsumgebungen mit einer relativen Luftfeuchte von 90 %.
Tabelle 11.1: Wassergehalt (auf Basis des Frisch- und Trockengewichts) von Embryonen am Ende der Trocknungsbehandlung und vor der Imbibition für die Keimung oder vor der Tieftemperaturlagerung
Die Daten in Tabelle 11.2 zeigen, dass somatische Embryonen nach Abschluss der Nährstoffbehandlungen getrocknet und gelagert werden können, ohne dabei deutlich an Keimkraft oder späterem Setzlingswachstum und -entwicklung zu verlieren. Die Daten zeigen außerdem, dass getrocknete, nährstoffbehandelte somatische Embryonen unter einer Vielzahl von Temperaturbedingungen gelagert werden können, die von einer Lagerung bei Umgebungstemperatur (d.h. 23 °C) bis zur gekühlten Lagerung (d.h. bei 4 °C) und Gefrierlagerung (d.h. bei – 20 °C) reichen. Es wurde überraschender Weise gefunden, dass Embryonen, die nach dreitägiger Nährstoffbehandlung in Lösungen mit 3 % w/v Sucrose getrocknet und bei Umgebungstemperatur gelagert wurden, 100 % ihrer Keimkraft beibehielten und sich im Falle einer Ex-Vitro-Aussaat und Keimung in nicht-sterilen Wachstumsmedien bei nicht-sterilen Umgebungsbedingungen zu 100 % zu intakten Setzlingen verwandelten, während die bei – 20 °C gelagerten Embryonen einen Keimungserfolg von 93 % und eine Umwandlung zu vollständig intakten Setzlingen von 80 % zeigten, wenn diese in die gleichen, nicht-sterilen Umgebungen ausgesät und dort gekeimt werden.
Tabelle 11.2: Auswirkungen von Trocknungsbehandlung und Lagerungsbedingungen auf die spätere Keimung und das Wachstum von nährstoffbehandelten somatischen Embryonen
BEISPIEL 12
Das Ziel dieser Untersuchung bestand in der Feststellung der Auswirkungen von: (a) erhöhtem Sucrosegehalt in Nährstoffbehandlungslösungen und (b) verlängerter Nährstoffbehandlungszeit auf die Keimungsleistung von somatischen Embryonen.
Reife somatische Embryonen der Interior Spruce (Picea glauca (Moench) Voss x P. engelmannii Parry ex Engelm.) der Genotypen 5-1378 und 107-2049 t wurden mittels HRHT-Behandlung getrocknet und bei 4 °C gelagert. Die Embryonen wurden nachfolgend aus der Lagerung genommen und für 3, 4 oder 5 Tage wie zuvor beschrieben in ½ m24GMD Flüssigmedium mit einer der folgenden Sucrosekonzentrationen nährstoffbehandelt: 4, 6, 8 und 10 % (jeweils w/v). Nach Abschluss der Nährstoffbehandlungen wurden die Embryonen ex vitro auf ein polymergebundenes Wachstumssubstrat auf Torfbasis aus dem Gartenbau in Anzuchtschalen aus Styropor mit 504 Töpfen (Topfvolumen 4 ml) (504-cell (4ml/cell) styrofoam miniplug trays, Grow-Tech Inc., San Bautista, CA) ausgesät. Die eingesäten Topfplatten wurden in eine übliche nicht-sterile Keimungskammer aus dem Gartenbau in einen Aufzuchtraum mit kontrollierten Bedingungen gestellt. Die Umgebungsbedingungen waren 22-24 °C Lufttemperatur, 80-100 % relative Luftfeuchte, 0,10-0,15 % CO₂ und eine 16-stündige Photoperiode mit 40-120 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss. Die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, wurden, nachdem sie in die nicht-sterile Keimkammer verbracht worden waren, unmittelbar mit einer ½ m24GMD-Nährstofflösung, angereichert mit 3 % w/v Sucrose-Lösung, bedunstet, bis die Oberflächen der nicht-sterilen Wachstumssubstrate gut befeuchtet waren. Danach wurden die Topfplatten während einer dreiwöchigen Keimungszeit täglich mit dieser Lösung bedunstet. Es wurden weder für die Zufuhr der Nährstofflösungen noch für die Keimungsumgebung während der zweiwöchigen Kulturzeit aseptische Verfahren oder Bedingungen eingesetzt. Außerdem wurden prophylaktisch 0,1 g/l Benlat, 0,05 g/l Ampicillin und 0,05 g/l Penicillin G (oder 0,1 g Ampicillin) und 5 ml/l Gnatrol^® im Fünf-Tagesrhythmus appliziert, um Pilze, Bakterien und Pilzfliegenlarven zu bekämpfen.
Die Daten der Tabellen 12.1. und 12.2 zeigen, dass der Bereich der Sucrosekonzentrationen, die zur Nährstoffbehandlung von somatischen Embryonen verwendet werden können, bis zu mindestens 10 % reichen kann und dass weiterhin die Nährstoffbehandlungszeit auf mindestens fünf Tage ausgedehnt werden kann.
Tabelle 12.1.: Auswirkungen von erhöhten Sucrosekonzentrationen und verlängerter Nährstoffbehandlungsdauer auf spätere Ex-Vitro-Keimung und Wachstum von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 5-1378.
Tabelle 12.2.: Auswirkungen von erhöhten Sucrosekonzentrationen und verlängerter Nährstoffbehandlungszeit auf spätere Ex-Vitro-Keimung und Wachstum von somatischen Embryonen der Interior Spruce des Genotyps 107-2049.
BEISPIEL 13
Ziel dieser Untersuchung war die Feststellung der Auswirkungen der Nährstoffbehandlung auf die Keimung einer Angiosperm-Pflanzenart, Brassica napus.
Ungetrocknete somatische Embryonen von Canola cultivar Topas (Brassica napus cv. Topas) wurden in 250 ml Schikane-Erlenmeyer-Kulturkolben, die ½ m24GMD-Flüssigmedium enthielten, dem 3 % w/v Sucrose und 80 Einheiten ml^-1 Penicillin G zugesetzt waren, sieben Tage lang auf einem Schüttler (80 Upm) in einem Raum mit kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20-23 °C und einer Photoperiode von 20-40 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss nährstoffbehandelt. Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurden die nährstoffbehandelten Canola-Embryonen ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity-styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc.; San Bautista, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Topfplatten für eine Woche in eine nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit gestellt worden waren, unmittelbar mit ½ m24GMD-Nährstofflösung, angereichert mit 3 % w/v Sucrose, fünf Tage lang einmal täglich bedunstet. Danach wurde für die Dauer der dreiwöchigen Keimungszeit drei Mal wöchentlich eine Lösung von 1 g l^-1 des 11-41-8-Düngemittels (Plant Products Co. Ltd., Brampton, ON) zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturphase wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt. Am Ende der drei Wochen keimten 97,3 der ex vitro ausgesäten nährstoffbehandelten somatischen Embryonen der Canola in einer nicht-sterilen Wachstumsmischung in einer nicht-sterilen Wachstumsumgebung.
Reife somatische Embryonen von Canola cultivar Topas (Brassica napus cv. Topas) wurden drei Wochen lang mittels HRHT-Behandlung getrocknet. Nach Abschluss der Trocknung wurden die somatischen Embryonen in 250 ml Schikane-Erlenmeyer-Kulturkolben, die ½ m24GMD-Flüssigmedium enthielten, dem 3 % w/v Sucrose und 80 Einheiten ml^-1 Penicillin G zugesetzt waren, sieben Tage lang auf einem Schüttler (80 Upm) in einem Raum mit kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20-23 °C und einer Photoperiode von 20-40 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss nährstoffbehandelt. Nach Abschluss der Nährstoffbehandlung wurden die nährstoffbehandelten Canola-Embryonen ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity- styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc.; San Bautista, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Topfplatten für eine Woche in eine nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit gestellt worden waren, unmittelbar mit ½ m24GMD-Nährstofflösung, angereichert mit 3 % w/v Sucrose, fünf Tage lang einmal täglich bedunstet. Danach wurde für die Dauer der dreiwöchigen Keimungszeit drei Mal wöchentlich eine Lösung von 1 g l^-1 des 11-41-8-Düngemittels (Plant Products Co. Ltd., Brampton, ON) zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturphase wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt. Am Ende der drei Wochen keimten 96,5 % der getrockneten und anschließend nährstoffbehandelten somatischen Canola-Embryonen im Falle der Ex-Vitro-Aussaat in einer nicht-sterilen Wachstumsmischung und einer nicht-sterilen Wachstumsumgebung.
Ungetrocknete somatische Embryonen der Canola cultivar Topas (Brassica napus cv. Topas wurden in 250 ml Schikane-Erlenmeyer-Kulturkolben, die ½ m24GMD-Flüssigmedium enthielten, dem 3 % w/v Sucrose und 80 Einheiten ml^-1 Penicillin G zugesetzt waren, sieben Tage lang auf einem Schüttler (80 Upm) in einem Raum mit kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20-23 °C und einer Photoperiode von 20-40 μmol m^-2s^-1 photosynthetischem Photonenfluss nährstoffbehandelt. Nach Abschluss der einwöchigen Nährstoffbehandlung wurden die nährstoffbehandelten Canola-Embryonen mittels einer einwöchigen HRHT-Behandlung getrocknet und dann in drei Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1 wurde in einer Umgebung mit 92,4 % relativer Luftfeuchte wei ter getrocknet; Gruppe 2 wurde in einer Umgebung mit 88,5 % relativer Luftfeuchte getrocknet, während Gruppe 3 in einer Umgebung mit 85 % relativer Luftfeuchte getrocknet wurde. Jede Gruppe wurde drei Tage lang getrocknet und dann wurden für die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts Unterstichproben genommen. Nach Abschluss der Trocknungsbehandlungen wurden die nährstoffbehandelten und anschließend getrockneten somatischen Embryonen von Canola ex vitro in Anzuchtschalen aus Styropor mit 400 Töpfen (400-cavity-styrofoam miniplug trays) ausgesät, die mit polymergebundenem Torf (Grow-Tech Inc.; San Bautista, CA) gefüllt waren. Nach der Aussaat wurden die Topfplatten für eine Woche in eine nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (≥ 95 % relative Luftfeuchte) gestellt. Bei beiden Untersuchungen wurden die Topfplatten, die ex vitro ausgesäte, nährstoffbehandelte Embryonen enthielten, nachdem sie in die nicht-sterile Keimungskammer mit hoher Luftfeuchtigkeit gestellt worden waren, mit ½ m24GMD-Nährstofflösung, angereichert mit 3 % w/v Sucrose, fünf Tage lang einmal täglich bedunstet. Danach wurde für die Dauer der dreiwöchigen Keimungszeit drei Mal wöchentlich eine Lösung von 1 g l^-1 des 11-41-8-Düngemittels (Plant Products Co. Ltd., Brampton, ON) zugeführt. Für die Zufuhr der Nährstofflösungen oder für die Keimungs- und Wachstumsumgebungen während der dreiwöchigen Kulturphase wurden keine aseptischen Verfahren oder Bedingungen eingesetzt. Die in Tabelle 13 festgehaltenen Daten zeigen, dass nährstoffbehandelte somatische Embryonen der Canola vor der Ex-Vitro-Aussaat und -Keimung getrocknet werden können.
Tabelle 13: Auswirkungen der Trocknung nach der Nährstoffbehandlung auf die Ex-Vitro-Keimung von somatischen Embryonen der Canola.
LITERATURVERZEICHNIS

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Claims

Verfahren zur Nährstoffbehandlung von somatischen Pflanzenembryonen vor der Ex-Vitro-Aussaat, dadurch gekennzeichnet, dass imbibierte, reife somatische Pflanzenembryonen mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die einen gelösten Nährstoff enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff ein Kohlehydrat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff ein Zucker ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff Sucrose ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sucrose in der Lösung in einer Menge von 6 % w/v oder weniger vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung einen weiteren gelösten Nährstoff umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff eine Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff ein Nitrat-Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff ein Ammonium-Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass einer der weiteren gelösten Nährstoffe ein Phosphat-Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff ein Kalium-Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff ein Mikronährstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere gelöste Nährstoff ein Vitamin ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Nährstoff ein Pflanzenwachstumsregulator ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo einer Baumart angehört.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo sich aus einer Gymnosperme entwickelt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Fichtenembryo ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Interior Spruce ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Kiefernembryo ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Taedaföhre ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus radiata ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus patula ist.
Verfahren zur Herstellung von Sämlingen oder ausgewachsenen Pflanzen aus somatischen Embryonen, bei dem imbibierte, reife somatische Embryonen in einem Wachstumsmedium zum Keimen gebracht werden, um Keimlinge zu bilden, und bei dem Wachstumsbedingungen beibehalten werden, um es den Keimlingen zu ermöglichen, sich zu Sämlingen oder ausgewachsenen Pflanzen zu entwickeln, dadurch gekennzeichnet, dass die imbibierten, reifen somatischen Embryonen vor der Ex-Vitro-Aussaat mit Nährstoffen behandelt werden, indem sie mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, welche einen gelösten Nährstoff enthält.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass dem Wachstumsmedium ein Nährstoff beigemischt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der dem Wachstumsmedium beigemischte Nährstoff derselbe ist wie der für den Schritt der Nährstoffbehandlung verwendete Nährstoff.
Verfahren nach Anspruch 23, Anspruch 24 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Keimen der mit Nährstoffen behandelten Embryonen und das Anpflanzen der Keimlinge unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der für den Schritt der Nährstoffbehandlung verwendete Nährstoff ein Kohlehydrat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der für den Schritt der Nährstoffbehandlung verwendete Nährstoff ein Zucker ist.
verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der für den Schritt der Nährstoffbehandlung verwendete Nährstoff Sucrose ist.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass Sucrose im Wachstumsmedium in einer Menge von 6 % w/v oder weniger vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo einer Baumart angehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo sich aus einer Gymnosperme entwickelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Fichtenembryo ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Interior Spruce ist.
verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Kiefernembryo ist.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Taedaföhre ist.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus radiata ist.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus patula ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung, die mit den imbibierten, reifen somatischen Embryonen in Kontakt gebracht wird, mindestens einen zusätzlichen gelösten Nährstoff enthält.
Verfahren zum Keimen von reifen somatischen Pflanzenembryonen, dadurch gekennzeichnet, dass imbibierte reife Embryonen in Gegenwart einer Nährstofflösung behandelt werden.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff aus der Gruppe gewählt ist, die Kohlehydrate umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff aus der Gruppe gewählt ist, die Zucker umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff Sucrose ist.
Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass Sucrose in der Nährstofflösung in einer Konzentration von unter 6 % w/v vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff aus der Gruppe gewählt ist, die Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Nitrat-Ion enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Ammonium-Ion enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Phosphat-Ion enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Kalium-Ion enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung einen Bestandteil aus der Gruppe enthält, die Mikronährstoffe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung einen Bestandteil enthält, der aus der Gruppe gewählt ist, die Vitamine umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium außerdem einen Pflanzenwachstumsregulator umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo einer Baumart angehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Embryo sich aus einer Gymnosperme entwickelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Fichtenembryo ist.
Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Interior Spruce ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Kiefernembryo ist.
Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Taedaföhre ist.
Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus radiata ist.
Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass der reife somatische Pflanzenembryo ein Embryo der Pinus patula ist.
Verfahren zur Herstellung von somatischen Sämlingen, dadurch gekennzeichnet, dass (i) imbibierte, reife somatische Pflanzenembryonen in einem Nährmedium behandelt werden und (ii) die Embryonen ex vitro in einem Saatmedium ausgesät werden.
Verfahren nach Anspruch 61, des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass den ausgesäten Embryonen Nährstoffe zugeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Art der Nährstoffzugabe zu den ausgesäten Embryo nen aus der Gruppe gewählt ist, die Sprühen, Nebeln, Tränken und Berieseln umfasst.
verfahren nach Anspruch 61, Anspruch 62 oder Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo einer Baumart angehört.
Verfahren nach Anspruch 61, Anspruch 62 oder Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass der somatische Pflanzenembryo sich aus einer Gymnosperme entwickelt.