DE60011789T2

DE60011789T2 - Verfahren zur Herstellung einer qualitätsgesicherten biologischen Probe und Zusammensetzung, welche diese enthält

Info

Publication number: DE60011789T2
Application number: DE60011789T
Authority: DE
Inventors: Doz. Gerold ZERLAUTH; Dr. Matthias GESSNER; Dr. Karl KOETTNITZ; Dr. Patricia GROSS
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-14
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2020-08-15
Also published as: NO20020828D0; ATE269909T1; JP2003517296A; WO2001014593A2; US6649339B1; AT410218B; NO329865B1; JP4578750B2; ES2223577T3; WO2001014593A3; CA2381969A1; AU771263B2; NO20020828L; EP1210465A2; JP2006087442A; AU7275300A; EP1210465B1; DE60011789D1; ATA144399A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Pools mit bezüglich der Belastung mit Mikroorganismen qualitätsgesicherten biologischen Proben unter Verwendung von Nukleinsäureamplifikationsverfahren.
Biologische Proben, wie z.B. Plasmaspenden oder Chargen von Zellkulturüberständen können mit unerwünschten Mikroorganismen, besonders mit Viren oder fremder DNA verunreinigt sein. Diese Verunreinigungen können zu unerwünschten Reaktionen in Präparaten führen, die aus solchen biologischen Präparaten hergestellt werden und an Menschen verabreicht werden.
Menschliches Plasma ist vor allem von außerordentlicher klinischer Bedeutung als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Plasmaderivaten, besonders für die Substitutionstherapie bei einem angeborenen oder erworbenen Mangel an Plasmabestandteilen. Pharmazeutische Präparate dieser Art werden im Regelfall nicht aus einzelnen Spenden hergestellt, sondern eher aus einem Plasmapool, der aus einer sehr großen Anzahl von einzelnen Spenden besteht.
Jedoch muss bei der Verwendung von menschlichem Plasma dafür gesorgt werden, dass es keine infektiösen Erreger enthält, die mit dem pharmazeutischen Präparat oder mit den Plasmaderivaten übertragen werden könnten. Unter den infektiösen Erregern, die möglicherweise im Blut vorkommen könnten, finden sich vor allem Viren, die über das Blut übertragen werden können (hämatogene Viren), z.B. HI-Viren oder Hepatitis-Viren (A, B, C, D, E oder G) wie auch Parvovirus.
Wegen des großen Bedarfs an Arzneimitteln, die Plasmaderivate enthalten, ist eine ökonomische Produktion dieser Arzneimittel nur in einem industriellen Maßstab möglich.
Plasma wird von Spendern erhalten und zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten gepoolt. Ein üblicher Pool besteht aus ca. 2000 – 6000 einzelnen Plasmaspenden. Darin liegt das Risiko, dass der gesamte Plasmapool durch eine einzelne virus-verunreinigte Plasmaspende verunreinigt werden könnte. Obwohl schon die Aufbereitung von humanem Albumin zu einem virussicheren Präparat durch Erhitzen am Ende der ersten Hälfte den zwanzigsten Jahrhunderts erfolgreich war, war dies anfänglich mit allen anderen Arzneimitteln, die aus Plasma erhalten wurden wegen ihrer Empfindlichkeit gegenüber Hitze nicht möglich. Bis heute hat es, obwohl es Millionen von Verwendungen von adäquat hergestellten Albuminpräparaten gegeben hat, nie Infektionen mit Viren gegeben, die im Blut in Menschen vorkommen.
Dagegen ist von mehreren viralen Infektionen, hauptsächlich mit Hepatitis-Viren mit vielen anderen Arzneimitteln, die aus Plasma hergestellt wurden, berichtet worden und seit den 1980er Jahren hat es vermehrte Berichte von Infektionen mit dem AIDS-Virus gegeben.
Um 1980 herum wurden Hitzebehandlungen zum ersten Mal mit geeignet stabilisierten Faktor VIII-Konzentraten durchgeführt, mit dem Ziel, dadurch eine Inaktivierung der viralen Verunreinigungen zu erreichen. Jedoch musste man zuerst einen großen Verlust der Faktor VIII-Aktivität in Kauf nehmen und das tatsächliche Inaktivierungspotential blieb jeweils unbekannt.
Schließlich war es durch Verbesserung der Hitzeinaktivierungsverfahren und durch die Verwendung von anderen neuen Inaktivierungsverfahren möglich, Arzneimittel aus Plasma herzustellen, die in den meisten Fällen nicht zu viralen Infektionen beim Empfänger geführt haben. Diese Entwicklung ging auch Hand in Hand mit der Verbesserung der Auswahl von Spender und Spende mit dem Ziel jeden Spender und jede Spende, bei denen die Möglichkeit einer Virämie und somit eines Virusenthaltenden Plasmas bestand, auszuschließen.
Seit langer Zeit ist versucht worden, entweder durch Nachweis von Antigenen oder Antikörpern für oder gegen einen bestimmten Virus im Blut solche Spenden, die ein positives Ergebnis ergeben, auszuschließen und sie nicht in einen größeren Plasmapool einzubringen, von dem beabsichtigt ist, dass er als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Blutprodukten dient. Im Fall von einzelnen Spendern, die in allen Tests keine Krankheitssymptome oder pathologische Testergebnisse aufweisen, können jedoch bestimmte Viren in deren Blut sogar in hoher Konzentration über einen anhaltenden Zeitraum vorhanden sein. Jetzt kann das Auftreten von solchen Virämien durch einen spezifischen Virus mit Hilfe eines Amplifikationsverfahrens eindeutig nachgewiesen werden.
Eine einzelne mit Viren verunreinigte Plasmaspende wird natürlich durch das Poolen von Plasmaeinheiten verdünnt, aber der Nachweis von viralen Genomsequenzen mit Hilfe von Amplifikationsreaktionen ist so empfindlich, dass sogar in diesen Verdünnungen jeweils Virusgenome oder deren Sequenzen eindeutig nachweisbar sind und wenn sie, wie oben erwähnt, unter eine bestimmte Nachweisgrenze fallen, dann besitzen sie keine klinische Relevanz mehr, was die Möglichkeit einer Infektion betrifft.
Die EG-Richtlinie schlägt in Übereinstimmung mit der „EEC Regulatory Document Note for Guidance", „Guidelines for Medicinal Products Derived from Human Blood and Plasma" (Biologicals 1992, 20: 159 – 164) ein Qualitätssicherungssystem für die Kontrolle von Plasmaspendern und Plasmaspenden vor. Dementsprechend muss jede Plasmaspende mit validierten Tests auf die Abwesenheit von viralen Markern wie z.B. Hepatitis B-Antigen, HIV-1- und HIV-2-Antigen getestet werden, da diese ein Anzeichen für eine entsprechende vitale Infektion des Plasmaspenders sind. Es sollen auch Tests zum Ausschließen einer Hepatitis C-Infektion durchgeführt werden.
Entsprechend der Europäischen Pharmakopöe sollen besondere Tests durchgeführt werden um Hepatitis B Oberflächen-Antigen, Hepatitis C-Virus-Antikörper und HIV-Antikörper in jeder Spende zu bestimmen (Europäische Pharmakopöe, 2. Aufl., Teil II, 1994, S. 853 – 4).
Die FDA-Leitlinie vom 14. März 1995 empfiehlt eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Untersuchung von einem Endprodukt (Immunglobulin-Produkt) als einen zusätzlichen Sicherheitsfaktor.
Trotz der vorgeschlagenen Tests wird in der EG-Richtlinie betont, dass die Sicherheit von einzelnen Plasmaspenden durch eine Kontrolle aller dieser Virusmarker alleine nicht ausreichend ist. Sogar wenn die Abwesenheit der genannten Marker in einer Plasmaprobe bestätigt ist, kann eine Virämie des Spenders nicht ausgeschlossen werden. Virale Antigene und die entsprechenden Antikörper sind nicht immer sofort nach einer Infektion nachweisbar. Die ersten Marker für eine virale Infektion treten meistens nicht vor Wochen oder Monaten nach einem Kontakt mit einem infektiösen Material auf. Dieser kritische Zeitraum nach einer Infektion und vor dem Auftreten von Antikörpern wird im Allgemeinen als „Fensterperiode" bezeichnet. Die Zeit nach einer Infektion, in der die ersten viralen Marker nachweisbar sind unterscheidet sich jedoch von Virus zu Virus.
Darüber hinaus ist auch bekannt, dass bei vielen Arzneimitteln, die aus Plasma hergestellt werden eine Verarmung oder eine Inaktivierung als Teil des Herstellungsprozesses auftritt und solche Produkte selbst in hohem Maße virussicher sind.
Die Virusinaktivierung von Plasmaderivaten ist jedoch äußerst erfolgreich im industriellen Maßstab durchgeführt worden. Dennoch hat es in seltenen Fällen Übertragungen von hämatogenen Viren wie AIDS, Hepatitis A, B und C gegeben. Daher muss angenommen werden, dass mit Viren verunreinigte Produkte von den Herstellern in ein paar Produktionschargen statt einem konstanten Produktionsverfahren hergestellt worden sind (Lancet 340, 305 – 306 (1992); MMWR 43 (28), 505 – 509 (1994); Thromb. Haemost. 68, 781 (1992)). Die Ursache dafür sollte wahrscheinlich in einer äußerst hohen Verunreinigung von bestimmten Ausgangschargen gesucht werden. Da nur indirekte Verfahren verfügbar sind, um mit Virus verunreinigte Plasmaspenden beim Herstellen von Plasma auszuschließen, besteht die Möglichkeit, dass das Ausgangsmaterial so stark verunreinigt sein könnte, dass die ansonsten erfolgreichen Virusinaktivierungs- und Virusdepletionsverfahren nicht mehr ausreichend sind, um virussichere Endprodukte herzustellen.
Da die humane infektiöse Dosis für die meisten humanpathogenen Viren unbekannt ist und gegenwärtig nicht einmal durch Testen des Plasmapools bestimmbar ist, ist es erwünscht, jede einzelne Verunreinigung durch Identifizieren der verunreinigten einzelnen Probe heraus zu suchen. Die Nukleinsäureamplifikationstests, die dafür verwendet werden, sind in der Tat äußerst empfindlich, aber sehr kostspielig. Daher ist ihre Verwendung bei bekannten humanpathogenen Viren gerechtfertigt, während dieser Aufwand für andere Mikroorganismen, von denen entweder keine humanpathogene Wirkung bekannt ist oder beschrieben ist oder für die nur eine sehr hohe pathogene Dosis infektiös ist, nicht erforderlich wäre.
Insbesondere beschreiben die WO 96/35437 und die US 5 591 573-A Testsysteme für Plasmapools unter Verwendung von Nukleinsäureamplifikationsverfahren und/oder Antikörper-Untersuchungen. Die US 5 591 573 offenbart ein Verfahren zum Testen von Plasmapools. Mit diesem Verfahren wird ein erster Pool hergestellt und mit Hilfe von PCR getestet. Wenn dieser PCR-Test positiv ist, wird ein zweiter kleinerer Subpool hergestellt und wieder mit Hilfe von PCR gestestet. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis die verunreinigte einzelne Spende identifiziert ist. Das Antikörpertesten oder Einhalten von bestimmten Standartgrenzwerten, offenbart als Teil des Screeningverfahrens, ist auch gemäß der WO 96/35437 vorgeschlagen worden.
Die beschriebenen Nukleinsäureamplifikationsverfahren haben jedoch die Tatsache gemeinsam, dass man immer versucht, das Amplifikationsverfahren einzusetzen, das die größte Empfindlichkeit ermöglicht. Jedoch sind diese Hochempfindlichkeits-PCR-Tests bekanntermaßen äußerst kostspielig besonders bei Serienuntersuchungen von Pools von einzelnen biologischen Proben. PCR-Tests mit geringerer Empfindlichkeit, die weit kostengünstiger wären, werden jedoch bei solchen Untersuchungen im Allgemeinen vermieden, da das Risiko von Verunreinigungen, die unter der (unteren) Nachweisgrenze liegen, gleichzeitig hoch wäre.
In gleicher Weise kommen sogar bei Überständen von rekombinanten Zellkulturen Verunreinigungen durch Mikroorganismen oder durch Nukleinsäurematerial von Wirtszellen weiterhin vor. Solche Verunreinigungen sollten natürlich nicht vorhanden sein oder sollten nur bis zu einem bestimmten Maximalwert (Grenzwert) in pharmazeutischen Präparaten, die aus den Überständen gereinigt werden müssen vorhanden sein.
Die Aufgabe dieser Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Herstellung eines Pools von biologischen Proben unter Verwendung von Nukleinsäureamplifikationsverfahren bereitzustellen, das im Hinblick auf die Belastung mit Mikroorganismen qualitätsgesichert ist, speziell auf die Belastung mit Viren, ein Verfahren, das auf der einen Seite eine zuverlässige Identifizierung von verunreinigten einzelnen Proben, insbesondere stark verunreinigten einzelnen Proben sowie das Einhalten von bestimmten Grenzwerten für solche Verunreinigungen in dem Pool ermöglicht, aber auf der anderen Seite eine Kostensenkung und ein Verfahren liefert, das einfacher ist für die Pooluntersuchungsverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß von einem Verfahren zur Herstellung eines Pools von biologischen Proben, das qualitätsgesichert ist, im Hinblick auf die Belastung mit Mikroorganismen unter Verwendung eines Nukleinsäureamplifikationsverfahrens gelöst, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
– das Entnehmen von Aliquots aus den biologischen Proben,
– das Kombinieren der Aliquots in einem Screening-Pool,
– das Testen des Screening-Pools auf das Vorhandensein oder den Gehalt von Genomäquivalenten von Mikroorganismen mit Hilfe eines ersten Nukleinsäureamplifikationsverfahrens, welches eine bestimmte Nachweisgrenze DL-1 im Hinblick auf die zu testenden Mikroorganismen aufweist,
– das Teilen des Screening-Pools in Screening-Subpools durch das Rekombinieren der Aliquots, die genommen wurden, in kleineren Pools, wenn ein Grenzwert, welcher zwischen DL-1 und 10⁵ Genomäquivalenten/mL festgesetzt ist beim Testen des Screening-Pools überschritten wird,
– das nochmalige Testen des Screening-Subpools auf das Vorhandensein oder den Gehalt von Genomäquivalenten der Mikroorganismen, welche zu testen sind, mittels eines weiteren Nukleinsäureamplifikationsverfahrens, welches eine bestimmte ausgewählte Nachweisgrenze DL-2 für die zu testenden Mikroorganismen aufweist, wobei DL-1 < DL-2,
– das Identifizieren und das Verwerfen derjenigen Proben, welche DL-2 überschreiten und
– das Kombinieren der nicht verworfenen Proben in einem qualitätsgesicherten Pool.
Durch das zur Verfügung stellen von mindestens zwei Nukleinsäureamplifikationsverfahren, die sich im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit unterscheiden, kann erfindungsgemäß ein effizientes (auf Grund der hohen Empfindlichkeit der Pooluntersuchung) und dennoch kostengünstiges Verfahren zur Verfügung gestellt werden. Da das Testen des Subpools bis zur einzelnen Probe hin durch ein weniger empfindliches Nukleinsäureamplifikationsverfahren ohne vorherige weitere Extraktion der Nukleinsäure durchgeführt wird (was deswegen entscheidend kostengünstiger und weniger teuer ist).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird auf diese Weise in einem ersten Schritt der Screening-Pool auf Nukleinsäureverunreinigung mit einem sehr empfindlichen und quantitativen Verfahren getestet. Die sehr kostspielige Bestimmung der einzelnen verunreinigten Probe oder Spende, die eine sehr viel höhere Anzahl an zusätzlichen Tests mit einschließt, wird mit einem weniger empfindlichen Nukleinsäureamplifikationsverfahren bestimmt. Indem so verfahren wird, wird kein Risiko eingegangen, dass eine relevante Verunreinigung übersehen werden könnte, da das Testen des Screening-Pools mit einem Verfahren erfolgt, das so empfindlich wie möglich ist. Aber auf der anderen Seite werden die Kosten und der Zeitaufwand des Eliminationsverfahrens für die verunreinigten einzelnen Proben oder Chargen entscheidend gesenkt. In diesen Fällen, in denen die Bestimmung von solchen verunreinigten einzelnen Spenden bis jetzt aus diesen Gründen noch nicht durchgeführt worden ist, bietet das Verfahren in Übereinstimmung mit der Erfindung zum ersten Mal die Möglichkeit, das wertvolle Rohmaterial, das die einzelnen Spenden darstellen, mit geringen Kosten zu verwenden und diese Proben davor zu bewahren verworfen zu werden.
Die Empfindlichkeit des Nukleinsäureamplifikationsverfahrens wird erfindungsgemäß als die Menge an Genomäquivalenten festgesetzt, die mit dem relevanten Nukleinsäureamplifikationsverfahren gerade noch nachweisbar ist. Verfahren dieser Art mit genau ermittelten Grenzwerten zur Verfügung zur stellen ist für den Fachmann leicht möglich und ist ein Teil seines üblichen Wissens.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vor allen für Qualitätssicherung von Pools in Bezug auf die Belastung mit Mikroorganismen geeignet, die eine geringe Pathogenität oder Toxizität besitzen oder von denen angenommen werden kann, dass eine Belastung, die unter dem ermittelten Grenzwert liegt, in jedem Fall im Zuge des nachfolgenden Reinigungsverfahrens bis zur Herstellung des pharmazeutischen Präparates beseitigt wird oder dass die Menge der Verunreinigung, die diesem Grenzwert entspricht in einem pharmazeutischen Präparat von dieser Art harmlos und ohne Nebenwirkungen ist. Ein besonderes Beispiel dafür sind die Verunreinigungen mit Parvoviren, insbesondere Parvo B19.
Parvovirus B19 ist ein Einzelstrang DNA-Virus mit einem Durchmesser von 32 nm, der keine Lipidmembran besitzt und daher relativ resistent gegenüber Virusinaktivierungsverfahren ist. Daher liefern die meisten Inaktivierungsverfahren, z.B. physikalische Verfahren wie Pasteurisierung (60 °C über 12 h hinweg) oder chemischen Behandlungen wie organische Lösungsmittel (TNBP und/oder Detergenzien) keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Nur trockene Wärmebehandlung scheint wirkungsvoll gewesen zu sein.
Der Parvovirus B19 ist der Erreger des harmlosen infektiösen Erythems (Erythema infectiosum), mit gelegentlich beobachteten Arthralgien und Arthritis. Intrauterine Infektionen sind gefürchtet, da sie oft mit dem Tod des Föten enden. Der begrenzte Kreis der B19-bedrohten Patienten schließt solche mit chronischer hämolytischer Anämie, Patienten im Anschluss an Knochenmarktransplantationen, Patienten mit angeborener/erworbener Immunschwäche sowie schwangere Frauen ein (Sibrowski et al., Beitr. Infusionsther. Basel, Karger, 1990, 26, 22 – 26).
Die Seroprävalenz in Industrieländern beträgt 2 – 10 % bei Kindern unter 5 Jahren und 40 – 60 % bei Erwachsenen über 20 Jahren und 85 % bei Erwachsenen über 70 Jahren. Diese hohe Seroprävalenz führt somit zu einer großen Anzahl an positiven Ergebnissen in Plasmapool-Untersuchungen und führt somit zum Bedarf an einer großen Anzahl zusätzlicher Tests um die stark verunreinigten einzelnen Proben zu bestimmen.
Das EP-A-0 922 771 beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen von hohen Viruskonzentrationen im Blutplasma, bei dem die Empfindlichkeit der PCR durch die Verwendung von suboptimalen Bedingungen bei der Extraktion, Amplifikation oder Detektion gesenkt wird, so dass die Parvovirus-DNA nur gerade noch in Proben nachgewiesen werden kann, deren DNA-Gehalt höher als 10⁶ – 10⁷ Genomäquivalente/mL ist. Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, dass es nicht zum Testen von Pools geeignet ist.
Dennoch können alle vorkommenden Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien oder Viren erfindungsgemäß da analysiert werden, wo vor allem Qualitätssicherung in Hinsicht auf Viren von besonderer Priorität beim Testen von Blut- und Plasmaspenden ist.
Vorzugsweise werden Hepatitisviren, insbesondere HAV, HBV, HCV, HDV, HEV und HGV, Retroviren, insbesondere HIV-1 und HIV-2 und Parvoviren, insbesondere Parvo B19 werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet oder die Qualität von Plasmapools wird im Bezug auf diese Art von Viren gesichert.
Durch das Testen von verschiedenen Chargen einer rekombinanten Produktion von Proteinen wird die Einhaltung von bestimmten (vorgeschriebenen) Grenzwerten der Verunreinigungen mit Wirtszell-Nukleinsäuren (hier werden eukaryotische oder prokaryotische Zellen oder DNA oder RNA als Mikroorganismen nachgewiesen) oder Verunreinigung mit bestimmten bakteriellen oder viralen Verunreinigungen getestet.
Eine besonders bevorzugte Variante des Verfahrens in Übereinstimmung mit der Erfindung besteht aus dem Festsetzen des Grenzwertes durch Testen des Screening-Pools zwischen der Nachweisgrenze des ersten Nukleinsäureamplifikationsverfahrens DL-1 und 10⁵ Genomäquivalente/mL, wobei sich insbesondere ein Wert um 10⁴ Genomäquivalente/mL als besonders wirkungsvoll für z.B. Parvo B19 erwiesen hat. Vorzugsweise kann die relevante Grenze auch mit der relevanten Nachweisgrenze übereinstimmen.
Die Nachweisgrenze für das ersten Nukleinsäureamplifikationsverfahren DL-1 liegt vorzugsweise im Bereich von 10² – 10⁴ Genomäquivalente/mL (sie kann jedoch bis zu 10 – 50 GE/mL oder in Ausnahmefällen sogar niedriger sein), wohingegen die Nachweisgrenze DL-2 üblicherweise bei 10⁴ – 10⁷ Genomäquivalente/mL gewählt wird. DL-1 und DL-2 unterscheiden sich vorzugsweise um mindestens eine Zehnerpotenz aber ein Unterschied von ungefähr zwei Zehnerpotenzen hat sich erfindungsgemäß als besonders wirkungsvoll erwiesen, da auf diese Art und Weise die verunreinigten einzelnen Spenden immer noch zuverlässig identifiziert werden können (dies ist erfindungsgemäß notwendig) und auf der anderen Seite können die Kosten und der Aufwand für den Screening-Prozess verglichen mit den bekannten Verfahren beträchtlich gesenkt werden.
Die Amplifikation von Nukleinsäuren kann erfindungsgemäß durch eine Reihe von Amplifikationprozessen, die in der Literatur beschrieben sind erfolgen; das PCR-Verfahren hat sich hier als besonders wirkungsvoll erwiesen und es wird auch wegen seiner weit verbreiteten Verwendung und seiner industriellen Verfügbarkeit sowie seiner Kosten bevorzugt. Das Amplifikationsverfahren wurde zuerst 1983 von Mullis et al. beschrieben (US 4.683.195 und US 4.683.202). Virale Genomsequenzen können auch durch „verschachtelte PCR" amplifiziert werden (Methods Enzymol. 155 (1987), 335 – 350). Für die Amplifikation und die Detektion von RNA muss die RNA zuerst in DNA transkribiert werden. Dieses Verfahren wird durch Verwenden der reversen Transkriptase durchgeführt und wird RT-PCR genannt (Cell 50 (1987), 831 – 840).
Die Analyse der Amplifikationsprodukte kann durch die Verwendung von gekennzeichneten Nukleotid- oder Oligonukleotidprimern in einem Elongationsprozess und nachfolgender Hybridisierung oder gelelektrophoretischer Auftrennung der Produkte erfolgen.
Die Detektion von amplifizierten DNA-Fragmenten kann z.B. mit Hilfe von einer Probe, die zwei Fluoreszenzfarbstoffe trägt erfolgen. Dieses Verfahren wird z.B. von Livak et al. beschrieben (PCR Method and Appl. 1995; 4: 357 – 362). Die besondere Eigenschaft dieser Probe liegt in der Tatsache, dass die Fluoreszenz des Farbstoffs (FAM), der an das 5'-Ende der Probe angeheftet ist, des Reporters, durch die Anwesenheit des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs (TAMRA), des Quenchers, der am 3'-Ende des Primers angeordnet ist, vermindert wird.
Während der Amplifikation wird nun der neue DNA-Strang unter der Wirkung einer thermostabilen DNA-Polymerase, vorzugsweise der Taq-Polymerase synthetisiert.
Bei diesem Verfahren löst die DNA-Polymerase die Probe nicht nur vom einzelnen Strang ab, sondern sie baut sie vielmehr mit Hilfe ihrer endonukleolytischen Aktivität ab und setzt somit die zwei Fluoreszenzfarbstoffe frei. Die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs wird nicht länger durch den Quencher-Farbstoff unterdrückt und steigt an. Dieser Fluoreszenzanstieg wird im Verlauf der PCR kontinuierlich in einem ABI Prisma 7700 aufgezeichnet. Der Schwellenwert, von dem ausgehend ein Anstieg der Fluoreszenz als ein positives Signal gewertet wird, wird im Vergleich mit mehreren Negativkontrollen gemessen.
Die Quantifizierung der Belastung mit dem Mikroorganismus, z.B. Parvo B19 in einer unbekannten Probe erfolgt über eine externe Kalibrationskurve. Ein kloniertes Stück der Parvo B19-DNA in einem Trägerplasmid, das die zu amplifizierende Sequenz einschließt wird zusätzlich in linearisierter Form in Konzentrationen von 10⁶ Kopien/Reaktion bis zu 10 Kopien/Reaktion koamplifiziert. Durch Ermitteln eines Schwellenwertes (entspricht einem PCR-Zyklus, in dem das Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffs zuerst die Grundlinie übersteigt) wird eine Kalibrationslinie in dem Programm ermittelt, mit dem der Gehalt an Parvo B19-DNA einer unbekannten Probe über ihrem Schwellenwert quantifiziert wird.
Wechselnde Verfahren für PCR umfassen die Ligasekettenreaktion (LCR), in Übereinstimmung mit EP 0 320 308 A und EP 0 336 731 A und Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA), selbst-erhaltende Sequenzreplikation (SSR), in Übereinstimmung mit EP 0 310 229 oder das transkriptionsbasierende Amplifikationssystem (TAS) in Übereinstimmung mit EP 0 373 960 A . Eine Anzahl von Enzymen, die gleichzeitig oder schrittweise in der Amplifikation eingesetzt werden können, wie z.B. eine DNA-Polymerase oder eine RNA-Polymerase werden in diesen Verfahren eingesetzt.
Erfindungsgemäß können vorzugsweise interne Standards, mit denen das grundsätzliche Funktionieren der Amplifikation gewährleistet werden kann zu der Nukleinsäureamplifikation zugegeben werden. In Routinetests kann die Interpretation der Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden üblicherweise wie nachstehend nachverfolgt werden:
a) Keine Detektion des internen Standards (d.h. keine sichtbaren Banden): die Bestimmung hat nicht funktioniert, z.B. als ein Ergebnis der Amplifikationsreaktion (z.B. der PCR); auf diese Art und Weise können falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden.
b) Nur der interne Standard ist detektierbar (z.B. nur die Standardbande ist sichtbar): die Bestimmung, einschließlich der Amplifikationsreaktion (z.B. der PCR) hat funktioniert, die Probe ist negativ;
c) Standard und Proben-Nukleinsäure sind nachweisbar (z.B. beide Banden sind sichtbar): positive Probe.
Die biologischen Proben, die Vorrang zum erfindungsgemäßen Testen besitzen werden aus der Gruppe von einzelnen Blutspenden, Plasma, Serum oder Zellkulturchargen ausgewählt. Die erwarteten Verunreinigungen treten insbesondere bei diesen biologischen Proben auf und diese werden auch mit Vorrang in der industriellen Herstellung von Arzneimitteln aus biogenen Quellen verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer automatisierten Version unter Einsatz von Roboterkontrolle mit konventionellen Plattformen, die besonders geeignet dafür sind durchgeführt werden. Der Fachmann kennt viele verschiedene Möglichkeiten zum Herstellen solchen Screening-Pools. Z.B. Mortimer (Vox Sang. 1997, 73: 93 – 96) beschreibt zweidimensionale (2D), dreidimensionale (3D) und sogar vierdimensionale (4D) Pools. Um z.B. einen 3D-Pool, der eben aus 512 (8×8×8) einzelnen Proben hergestellt wurde, aufzulösen, muss man z.B. 24 Subpools verwenden, um in der Lage zu sein, eine verunreinigte Probe eindeutig zu identifizieren.
Erfindungsgemäß wird das zweite Nukleinsäureamplifikationsverfahren vorzugsweise direkt von dem Subpool nach der ersten Nukleinsäureamplifikation aus durchgeführt. Das bedeutet, dass keine zusätzliche Extraktion der Nukleinsäure erfolgt, sondern eher, dass es direkt im Subpool bestimmt wird.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt betrifft diese Offenbarung auch einen qualitätsgesicherten Pool biologischer Proben, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden kann, so wie ein pharmazeutisches Präparat, das auf der Basis einer qualitätsgesicherten Zubereitung hergestellt wird oder hergestellt werden kann. Diese pharmazeutischen Zubereitungen enthalten vorzugsweise mindestens eine Komponente, die aus der Gruppe von Proteinen, insbesondere Plasmaproteinen sowie rekombinant hergestellten Proteinen und Enzymen ausgewählt ist.
Die Erfindung wird nachstehend anhand des folgenden Beispiels noch ausführlicher erläutert.
Beispiel
Poolen
Aliquots von 512 Plasmaspenden werden mit Hilfe von einem dreidimensionalen Schema zu einem Screening-Pool und 24 Subpools gepoolt.
Extraktion
Die Nukleinsäureextraktion aus einem Screening-Pool wird mit Hilfe eines modifizierten Protokolls des QIAmp viral Kits von QIAGEN durchgeführt. Dafür wird 1 mL des Screening-Pools einer Ultrazentrifugation unterworfen, der Überstand wird auf 140 μL reduziert. Nach der Zugabe von 560 μL ABL-Lysepuffer in Übereinstimmung mit dem QIAGEN-Kit wird die Mischung 10 Minuten lang bei 56 °C in einem Thermoschüttler inkubiert. Das Lysat wird auf eine Silikasäule appliziert und indem es bei 8000 rpm zentrifugiert wird durch die Säule gedrückt. Nach Waschen mit jeweils 0,5 mL Waschpuffer AW1 und AW2 wird die an die Säule gebundene Nukleinsäure mit 50 μL H₂O eluiert.
Amplifikation
Ein kleines Fragment der Parvo B19-DNA wird durch Zugabe von 20 μL Extrakt zu 30 μL Mastermix amplifiziert.
(Perkin Elmer, TagMan PCR Core Reagent Kit mit 5 μL 10 × TagMan Puffer, 14 μL 25 mM MgCl₂, 4 μL 2,5 mM dNTPs, 1,5 μL 10 μM PT1.f(5'GACAGTTATCTGACCACCCCCA3') (Seq. ID Nr. 1), 1,5 μL 10 μM PT1.r(5'GCTAACTTGCCCAGGCTTGT3') (Seq. ID Nr. 2), 1 μL 5 μM PT1.p(5'6-FAM-CCAGTAGCAGTCATGCAGAACCTAGAGGAGA-TAMRA3') (Seq. ID Nr. 3), 1 μL Tween 20 (1 %), 1,25 μL Gelatine (2 %), 0,5 μL AmpErase UNG (1 U/μL), 0,25 μL AmpliTaq Gold (5 U/μL).
Die Amplifikation erfolgt unter den folgenden Bedingungen in einem ABI Prisma 7700:
1. AmpErase UNG Reaktion 2 min, 50 °C
2. Anfängliches Denaturieren 10 min, 95 °C
3. Zyklen von 15 sec bei 95 °C und 1 min bei 58 °C.
Die PCR wird anhand der Fluoreszenzzunahme während der PCR ausgewertet. Der Schwellenwert (d.h. der Zyklus bei dem das Signal über das Grundrauschen ansteigt) dient zur Quantifizierung. Die Schwellenwerte einer Standardserie eines linearisierten Plasmids mit einem klonierten Fragment des Parvo B19-Genoms dient in diesem Fall als Grundlinie zum Messen der Parvo B19-Konzentration im Extrakt des Screening-Pools.
Wenn die Anzahl der Genomäquivalente, die in der Probe gemessen wird unter dem Grenzwert von 10⁴ GE/mL im Screening-Pool liegt, werden die Proben dieses Pools zur Verwendung freigegeben. Auf der anderen Seite wird der Screening-Pool, wenn ein Wert über dem Grenzwert erreicht wird, aufgelöst.
Auflösung
Die 24 Subpools eines Screening-Pools werden 1:200 in H₂O (destilliert) in mehreren Schritten mit Hilfe eines Roboters verdünnt und ohne Extraktion in der TagMan PCR eingesetzt.
Amplifikation der Auflösung
Ein kleines Fragment der Parvo B19-DNA wird durch Zugabe von 20 μL Subpool-Verdünnung (entspricht 0,1 μL des Subpools) zu 30 μL Mastermix amplifiziert. (Perkin Elmer, TagMan Gold Kit mit 5 μL 10 × TagMan Puffer, 14 μL 25 mM MgCl₂, 4 μL 2,5 mM ·dNTPs, 1,5 μL 10 mM PT1.f(5'GACAGTTATCTGACCACCCCCA3'), 1,5 μL 10 μM PT1.r(5'GCTAACTTGCCCAGGCTTGT3'), 1 μL 5 μM PT1.p(5'6-FAM-CCAGTAGCAGTCATGCAGAACCTAGAGGAGA-TAMRA3'), 1 μL Tween 20 (1 %), 1,25 μL Gelatine (2 %), 0,5 μL AmpErase UNG (1 U/μL), 0,25 μL AmpliTaq Gold (5 U/μL).
Die Amplifikation erfolgt unter den folgenden Bedingungen in einem ABI Prisma 7700:
1. AmpErase UNG Reaktion 2 min, 50 °C
2. Anfängliches Denaturieren 10 min, 95 °C
3. Zyklen von 15 sec bei 95 °C und 1 min bei 58 °C.
Auswertung
Die PCR wird an Hand der Zunahme der Fluoreszenz während der PCR ausgewertet. Durch Bestimmen des Schwellenwerts (d.h. der Zyklus, bei dem das Signal über das Grundrauschen ansteigt) im Vergleich mit den Werten einer bekannten Standartserie, die zur gleichen Zeit amplifiziert wurde, wird die Anzahl der Genomäquivalente im Extrakt der Screening-Probe bestimmt.
Da nur Proben mit einem Gehalt von mindestens 10⁴ GE/mL ein Signal bewirken können, wenn die Menge 0,1 μL Material beträgt, werden alle einzelnen Spenden, die als positiv erkannt werden in der Auflösung verworfen und die übrig bleibenden werden zur Verwendung freigegeben.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Pools von qualitätsgesicherten biologischen Proben, umfassend: – das Entnehmen von Aliquots aus den biologischen Proben, – das Kombinieren der gesammelten Aliquots in einem Screening-Pool, – das Testen des Screening-Pools auf das Vorhandensein oder den Gehalt von Genomäquivalenten von Mikroorganismen durch ein erstes Nukleinsäureamplifikationsverfahren, welches eine Nachweisgrenze DL-1 für die zu testenden Mikroorganismen aufweist, – das Teilen des Screening-Pools in Screening-Subpools durch das Rekombinieren der gesammelten Aliquots in kleineren Pools, wenn ein Grenzwert, welcher zwischen DL-1 und 10⁵ Genomäquivalenten/ml festgesetzt ist, beim Testen des Screening-Pools überschritten wird, – das nochmalige Testen des Screening-Subpools auf das Vorhandensein oder den Gehalt von Genomäquivalenten der Mikroorganismen, welche zu testen sind, mittels eines zweiten Nukleinsäureamplifikationsverfahrens, welches eine ausgewählte Nachweisgrenze DL-2 für die zu testenden Mikroorganismen aufweist, wobei DL-1 < DL-2, – das Identifizieren und das Verwerfen derjenigen Proben, welche DL-2 überschreiten, und – das Kombinieren der verbleibenden Proben, um den Pool von qualitätsgesicherten biologischen Proben herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäureamplifikationsverfahren PCR ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zu testende Mikroorganismus ein Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zu testende Mikroorganismus aus der Gruppe, bestehend aus einem Hepatitisvirus, einem Retrovirus und einem Parvovirus, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologischen Proben aus der Gruppe, bestehend aus individuellen Blutspenden, Plasma, Serum und Zellkulturchargen, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Screening-Pool aus 512 biologischen Proben gebildet wird und in 24 Subpools eingeteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zusätzliche Nukleinsäureamplifikationsverfahren sofort nach dem ersten Nukleinsäureamplifikationsverfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Hepatitisvirus aus der Gruppe, bestehend aus HAV, HBV, HCV, HDV, HEV und HGV, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Retrovirus aus der Gruppe, bestehend aus HIV-1 und HIV-2, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Parvovirus Parvo B-19 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Grenzwert auf 10⁴ Genomäquivalenten/ml festgesetzt wird.