DE60008353T2

DE60008353T2 - Hemihydrat von 16.alpha.-bromoepiandrosterone

Info

Publication number: DE60008353T2
Application number: DE60008353T
Authority: DE
Inventors: Clarence Nathaniel Ahlem; James Martin Frincke; Luis Daniel Paio Pires DE CARVALHO DOS ANJOS; William Heggie; Patrick T. Prendergast; Christopher L. Reading; Krupakar Paul Thadikonda; Russell Neil Vernon
Original assignee: Hollis Eden Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Harbor Biosciences Inc
Priority date: 1999-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: AU3919000A; HK1046002A1; RU2295534C2; CN1355809A; EP1163256B1; ES2215631T3; JP2002540119A; CZ20013420A3; HK1046002B; NO20014588D0; NO20056167L; EP1163256A1; HUP0203429A3; OA11850A; KR20020003217A; CN1243767C; CA2365081A1; AU781997B2; RU2006133273A; DE60008353D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on-hemihydrat (16α-Bromepiandrosteron oder im folgenden "BrEA") gemäß Anspruchs 1; eine Zusammensetzung, die BrER-Hemihydrat umfaßt, gemäß Anspruch 5; ein Verfahren zur Herstellung von BrEA-Hemihydrat gemäß Anspruch 9; eine Verwendung von BrEA-Hemihydrat gemäß Anspruch 14; und BrEA-Hemihydrat für eine Verwendung als ein Medikament gemäß Anspruch 56. Die Steroide sind brauchbar für eine Anzahl therapeutischer und nichttherapeutischer Anwendungen, einschließlich ihrer Verwendung als Immunmodulatoren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, Zusammensetzungen und Formulierungen.
BrEA und dessen Herstellung aus der Steroidverbindung 3β-Hydroxyandrost-5-en-17-on (Dehydroepiandrosteron oder "DHEA") wurde beschrieben (siehe z.B. J. Org. Chem. 1962, 27:2937–2938). Verfahren zur Herstellung von DHEA und anderer Steroide und deren biologische Eigenschaften sind beschrieben worden, siehe z.B. US-Patente der Nummern
Deutsche Patente der Nummern 2035738 und 2705917; PCT-Veröffentlichungen der Nummern WO 95/21617, WO 97/48367, WO 98/05338, WO 98/50040, WO 98/50041, WO 98/58650; europäische Veröffentlichung der Nummer 0020029; Ben-David, et al., Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 1967, 125:1136–1140, Coleman et al., Diabetes, 1982, 31:830, Oertel, et al., J. Steroid Biochem., 1972, 3:493–496, Pashko, et al., Carcinogenesis, 1981, 2:717–721, Schwartz et al., Nutr. Cancer, 1981, 3:46–53; Dyner et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndromes, 1993, 6:459–465; A.A. Afanasii und Y.A. Titov, Total Steroid Synthesis, Plenum Press, New York, 1970, siehe z.B. S. 1–304.
Die Verwendung von DHEA und anderer Steroide in verschiedenen Anwendungen, z.B. der Modulation von Immunantworten, wurde beschrieben in z.B. den US-Patenten der Nummern 5869090, 5863910, 5856340, 5824668, 5804576, 5753237, 5714481, 5709878, 5407684, 5206008, 5077284, 4978532, 4898694, 4542129, 3711606 und 3710795. Das US-Patent 4956355 und die PCT-Veröffentlichung der Nummer-WO 97/48367 beschrieben die Verwendung von BrEA und bestimmter Steroidverbindungen zur Behandlung bestimmter Virusinfektionen oder bakterieller Infektionen, wie der Human Immunodeficiency Virus ("HIV") Infektion.
Verschiedene biologische Wirkungen und/oder metabolische Umwandlungen von Steroidverbindungen wurden z.B. beschrieben in Batta et al., J. Biol. Chem., 1986, 25:127–133, Belli et al., Liver, 1991, 11:162–169, Bhattacharjee et al., Anal. Biochem., 1992, 201:233–236, Blake et al.,. Int. J. Peptide Protein Res., 1982, 20:97-101, 1986, 25:127–133, Bonaventura, Am. J. Obstet. Gynecol., 1978, 131:403–409, Bucala et al., J. Steroid Biochem., 1986, 25:127–133, Carey et al., Biochem., 1981, 20:3637–3648, Chen et al., Carcinogenesis, 1999, 20:249- 254, Chen et al., Carcinogenesis, 1998, 19:2187–2193, Chow et al., Antisense Res. Dev., 1994, 4:81–86, Citro et al., Dis. Colon Rectum, 1994, 37(2 Suppl):S127–S132, Cleary, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1991, 196:8–16, Cleary, Int. J. Biochem., 1990, 22:205–210, Crawford et al., Lab. Invest,. 1994, 71:42–51, Danenberg et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1992, 36:2275–2279, Dotzlaw et al., Cancer Res., 1999, 59:529–532, Falany et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1994, 48:369–375, Faredin et al., J. Investigative Dermatol., 1969, 52: 357-361, Galigniana et al., Mol. Pharmacol., 1999, 55:317-323, Goto et al., J. Chromatogr., 1983, 276:289–300, Grenot Biochem., 1992, 31:7609–7621, Hofbauer et al., Life Sci., 1999, 64:671–679, Huijghebaert et al., J. Lipid Res., 1986, 27:742–752, Hurd et al., Oncogene, 1999, 18:1067–1072, Iida et al., J. Lipid Res., 1995, 36:628–638, Jellinck et al., Steroids, 1967, 10:329–346, Jonsson et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 1995, 20:394–402, Kalimi et al, Mol. Cell. Biochem., 1994, 131:99–108, Kramer et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:10621–10627, LaRochelle et al., Steroids, 1984, 43-209–217, Liao et al., Carcinogenesis, 1998, 19:2173–2180, Lillienau et al., J. Clin. Invest., 1992, 89:420–431, Loria, Psychoneuroendocrinology, 1997, 22:S103–S108, Luscher et al Mol. Immunol., 1983, 20:1099–1105, Manna et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:5909–5918, Marschall et al., J. Biol. Chem., 1989, 264: 12989–12993, Medh et al., Cancer Res., 1998, 15:3684–3693, Mohan et al., Steroids, 1992, 57:244–247, Munoz de Toro et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, 67:333–339, Padgett et al., J. Neuroimmunol., 1998, 84:61, Padgett et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1995, 774:323, Padgett et al., J. Immunol., 1994, 153:1544–1552, Pashko et al., Carcinogenesis, 1984, 5:463466, Pashko et al., Carcinogenesis, 1981, 2:717, Petrylak et al., J. Clin. Oncology, 1999, 17:958–967, Podesta et al., Steroids, 1996, 61:622–626, Regelson et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1994, 719:564, Schmassmann et al., Gastroenterology, 1993, 104:1171–1181, Schmassmann et al., Hepatology, 1990, 11:989–996, Schreiber et al., Lancet 353:459–461, Schreiber, Neth. J. Med., 1998, 53:524–31, Schwartz et al., Cancer Res., 1988, 48:4817, Shahidi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 254:559–565, Steer et al., Ann. Rheum. Dis., 1998, 57:732–737, Suzuki et al., Steroids, 1998, 63:672–677, Suzuki et al., Steroids, 1996, 61:296–301, Swaan et al., Bioconjugate Chem., 1997, 8:520–525, Tang et al, Anticancer Drug Res., 1998, 13:815–824, Thomas et al., J. Steroid Biochem , 1986, 25:103–108, Utsumi et al., Cancer Res., 1999, 59:377–381, Vanden Heuvel, J. Nutr., 1999, 129(2S Suppl.):5755–5805, Wang et al., Endocrinology, 1998, 139:3903–3912, Wong et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:5443–5453, Xie et al., Endocrinology, 1999, 140:219-227, Yen et al., Lipids, 1977, 12:409413, Zackheim et al., Arch. Dermatology, 1998, 134:949–954, Zhang et al., Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1096:179–186, Zhu et al., Carcinogenesis, 1988, 19:2101–2106.
Zusammensetzungen, die BrEA enthalten, welche verwendet wurden, um die Verbindung Zellen oder Zellextrakten zuzuführen, enthielten gewöhnlich eine signifikante Menge an Wasser. Solche Zusammensetzungen enthielten Lösungsmittel wie Dioxan oder Dimethylsulfoxid ("DMSO"), welche Wasser oder wäßrige Cyclodextrinlösungen enthielten, um die Zuführung der Verbindung zu Zellen zu erleichtern, siehe z.B. J. Pharmacol Exp. Ther. 1998, 285:876–83, Cancer Res. 1986 46:3389–95, Carcinogenesis 1985 6:333-35, Carcinogenesis 1981 2:717–721, Carcinogenesis 2:683-86. Solche Zusammensetzungen werden Tieren typischerweise durch Injektion verabreicht oder werden Zellen in Gewebekulturen durch Zugabe zu dem Zellkulturmedium verabreicht. Die Europäische Veröffentlichung der Nr. EP 429 187 beschreibt Formulierungen, die DHEA oder BrEA und Polyvinylpyrrolidon und vernetztes Polyvinylpyrrolidon enthalten. Einige dieser Zusammensetzungen können unerwünschte oder suboptimale Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel sind Lösungsmittel wie Dioxan, DMSO oder Chloroform im allgemeinen keine bevorzugten oder geeigneten parenteralen Hilfsstoffe, insbesondere für eine Anwendung beim Menschen. Es werden Formulierungen benötigt, die BrEA oder verwandte Steroide enthalten und verbesserte Eigenschaften besitzen, wie z.B. eine geringere Toxizität, eine verbesserte chemische Stabilität oder wünschenswerte Eigenschaften für eine Synthese in großem Maßstab.
Immunantworten bei Säugetieren auf Infektionen oder andere Zustände sind oft charakterisiert durch Antworten, die durch verschiedene Effektorzellpopulationen mediiert werden. In einigen Situationen erleichtern Helfer T-Zellen, die in dem Murinsystem als Th1 bezeichnet werden, Immuneffektorfunktionen, die typischerweise dominiert werden durch zellmediierte Antworten. In anderen Fällen erleichtern Helfer T-Zellen, die als Th2-Zellen bezeichnet werden, Immuneffektorfunktionen, die typischerweise durch Humoralantworten dominiert werden. Eine kräftige Thl-Antwort ist üblicherweise notwendig, um Infektionen zu bereinigen oder den Fortschritt einer Infektion zu verlangsamen. Wenn die Immunantwort eines Lebewesens von einer Antwort vom Th2-Typ beeinflußt oder dominiert wird, neigen die mit der Th2-Antwort assoziierten Zytokine gleichzeitig dazu, die Leistungsfähigkeit des Immunsystems im Hinblick auf den Aufbau einer kräftigen Th1-Antwort zu unterdrücken. Im allgemeinen trifft auch das Umgekehrte zu. Wenn Immunantworten eines Säugetiers dazu führen, daß eine Th2-Antwort verstärkt wird, neigt die Th1-Antwort desselben Zustands dazu, schwächer zu werden. Schwache Th1-Antworten können assoziiert sein mit einem Fortschritt einiger Infektionen oder anderer Zustände, siehe z.B. M. Clerici und G.M. Shearer, Immunol. Today 14:107–111, 1993; M. Clerici und G.M. Shearer, Immunol. Today 15:575–581, 1994. Die Erfindung stellt Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verfügung, die zur Verstärkung von Th1-Immunantworten brauchbar sind Darüber hinaus offenbart WO 98/47516 A1 ein Verfahren zur Verstärkung der Th1-Immunschutzantwort, wenn 17-ketosteroidale Verbindungen als antivirale Mittel, antibakterielle Mittel, Antimycoplasmamittel oder Mittel gegen intrazelluläre Parasiten verwendet werden, wobei 16-α-Bromepiandrosteron eine bevorzugte Verbindung ist.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Zusammensetzungen, Formulierungen, Verwendungen oder Verfahren der Erfindung erfüllen eine oder mehrere der folgenden Aufgaben.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, neue Steroidverbindungen oder Analoge zur Verfügung zu stellen, die geeignet sind für therapeutische und andere Anwendungen, wie Immunmodulatoren. Die Aufgaben der Erfindung umfassen ferner das Zur-Verfügung-Stellen von BrEA-Hemihydrat (BrEA₂·H₂O), Zusammensetzungen, welche BrEA-Hemihydrat umfassen, und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung. Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, flüssige Zusammensetzungen und Formulierungen zur Verfügung zu stellen, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 umfassen und die ungefähr 3 % (v/v) oder weniger an Wasser umfassen. Eine andere Aufgabe ist es, Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die man als Zwischenprodukte bei der Herstellung von humanpharmazeutischen Formulierungen und Formulierungen für Veterinäranwendungen, welche eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 enthalten, verwenden kann. Eine andere Aufgabe ist es, intermittierende Dosierungsverfahren zur Verfügung zu stellen, um eine Verbindung der Formel 1 einem Lebewesen zuzuführen, um Th1-Immunantworten zu verstärken. Weitere Aufgaben sind es, Verfahren zur Modulation einer angeborenen Immunität oder zur Verstärkung von Th1-Immunantworten in einem Lebewesen zur Verfügung zu stellen durch Verabreichung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, wie BrEA, an das Lebewesen. Andere Aufgaben sind es, Verfahren zur Inhibierung einer pathogenen, z.B. viralen, Replikation in einem Lebewesen zur Verfügung zu stellen durch Verabreichung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, wie BrEA, an das Lebewesen. Die Aufgaben der Erfindung umfassen ein Bereitstellen von Verbindungen der Formel 1 oder Formulierungen, die brauchbar sind für eine Verbesserung von einem oder mehrerer Symptome eines pathologischen Zustands, der in Verbindung steht mit einer Immunsuppression oder mit unzureichenden Th1-Immunantworten. Andere Aufgaben sind es, Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Zusammensetzungen und Formulierungen, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 umfassen, zur Verfügung zu stellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein FTIR (Fourier Transform Infrarot)-Spektrum, das erhalten wird durch das USP-Verfahren <197> von BrEA-Hemihydrat, welches hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus Ethanol und Wasser. 2 ist FTIR-Spektrum, das erhalten wurde durch das USP-Verfahren <197> von wasserfreiem BrEA, das hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus wasserfreiem Methanol. 3 zeigt eine DSC-Endotherme von BrEA-Hemihydrat, das hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus Ethanol und Wasser. 4 zeigt eine DSC-Endotherme von wasserfreiem BrEA, das hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus wasserfreiem Methanol. 5 ist ein XRD (Pulverröntgenbeugungs)-Spektrum von BrEA-Hemihydrat, das hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus Ethanol und Wasser. 6 ist ein FTIR-Spektrum, das erhalten wurde durch das USP-Verfahren <197> von BrEA-Hemihydrat, das hergestellt wurde durch Ausfällen von BrEA aus Aceton und Wasser.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß den Aufgaben stellt die Erfindung BrEA-Hemihydrat
zur Verfügung, welches gegebenenfalls charakterisiert ist durch Verweis auf eine oder mehrere physikalische Eigenschaften wie dessen Schmelzpunkt, Infrarotabsorptionsspektrum oder Pulverröntgenbeugungsspektrum.
Verwandte Ausführungsformen umfassen BrEA-Hemihydrat und einen oder mehrere Hilfsstoffe, geeignet für eine humanpharmazeutische Anwendung oder für eine Veterinäranwendung. Eine andere verwandte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung von BrEA-Hemihydrat, umfassend ein Ausfällen von BrEA aus einer Lösung, die Ethanol und Wasser umfaßt.
BrEA ist von einer Verbindung gemäß der Formel 1 umfaßt
und einem oder mehreren nichtwäßrigen flüssigen Hilfsstoffen, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 3 % v/v an Wasser umfaßt und wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R¹⁰ unabhängig -H, -OR^PR, -SR^PR, -N(R^PR)₂, -O-Si-(R¹³)₃, -CN, -NO₂, einen Ester, einen Thioester, einen Phosphoester, einen Phosphothioester, einen Phosphonoester, einen Phosphiniester, einen Sulfitester, einen Sulfatester, ein Amid, eine Aminosäure, ein Peptid, einen Ether, einen Thioether, eine Acylgruppe, eine Thioacylgruppe, ein Carbonat, ein Carbamat, ein Thioacetal, ein Halogen, eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Alkenylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Alkinylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppierung, eine gegebenenfalls substituierte Heteroarylgruppierung, ein gegebenenfalls substituiertes Monosaccharid, ein gegebenenfalls substituiertes Oligosaccharid, ein Nukleosid, ein Nukleotid, ein Oligonukleotid, ein Polymer sind oder einer oder mehrere von R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R¹⁰ R¹⁵, R¹⁷ und R¹⁸ gleich =O oder =S sind und das Was serstoffatom, das an demselben Kohlenstoff gebunden ist, abwesend ist.
Ausführungsformen umfassen flüssige Formulierungen, die BrEA, einen oder mehrere Hilfsstoffe und weniger als ungefähr 3 % an Wasser umfassen, wobei die Formulierung gegebenenfalls in Behältern, die Wasser ausschließen, angeordnet sind.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren, das eine intermittierende Verabreichung von BrEA an ein Lebewesen umfaßt, das einen pathologischen Zustand, wie eine virale oder parasitäre Infektion, aufweist.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Modulation der angeborenen Immunität eines Lebewesens, von Th1-Immunantworten oder Th2-Immunantworten, umfassend eine Verabreichung von BrEA an ein Lebewesen.
Andere Ausführungsformen sind wie in der Beschreibung beschrieben, einschließlich der anhängenden numerierten Ausführungsformen und der Ansprüche.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen
Insofern sie hierin verwendet werden und soweit nicht anderweitig angegeben oder aus dem Zusammenhang nahegelegt, haben die folgenden Begriffe die hier definierten Bedeutungen.
Eine "Formulierung der Erfindung" oder "Formulierung" bedeutet eine Zusammensetzung der Erfindung, die man einem Menschen oder einem Tier ohne weitere Manipulatio nen, die die Bestandteile oder die Verhältnisse der vorhandenen Bestandteile ändern, parenteral verabreichen kann. Formulierungen sind geeignet für Human- oder Veterinäranwendungen.
Eine "Zusammensetzung der Erfindung" ist eine Zusammensetzung, die ein Zwischenprodukt ist, das man zur Herstellung der Formulierungen der Erfindung verwenden kann, d.h. es sind eine oder mehrere Änderungen hinsichtlich eines oder mehrerer Bestandteile oder deren Mengen notwendig, um eine Formulierung herzustellen. Somit umfassen Zusammensetzungen der Erfindung Zusammensetzungen, bei denen eine weitere Verarbeitung erforderlich ist, bevor diese eine Formulierung ist, z.B. ein Mischen oder eine Zugabe einer gewünschten Menge eines Bestandteils.
Ein "Hilfsstoff" ("excipient") bedeutet eine Komponente oder einen Bestandteil, der in dem Sinn akzeptabel ist, daß er mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzungen oder Formulierungen der Erfindung kompatibel ist und für den Patienten oder das Tier, dem die Formulierung zu verabreichen ist, nicht übermäßig nachteilig ist. Wie hierin verwendet, schließen "Hilfsstoffe" Flüssigkeiten ein wie Benzylbenzoat, Baumwollsamenöl, N,N-Dimethylacetamid, einen C_2-12-Alkohol (z.B. Ethanol), Glycerol, Erdnußöl, ein Polyethylenglykol ("PEG"), Vitamin E, Mohnsamenöl, Propylenglykol, Safloröl, Sesamöl, Sojabohnenöl und Pflanzenöl. Hilfsstoffe, wie sie hierin verwendet werden, werden gegebenenfalls Chloroform, Dioxan, Pflanzenöl, DMSO oder eine beliebige Kombination davon ausschließen. Hilfsstoffe umfassen eine oder mehrere Komponenten, die typischerweise auf dem Gebiet der Formulierung von Pharmazeutika verwendet werden, z.B. Füllstoffe, Bindemittel, Trennmittel und Gleitmittel.
Ein "Lebewesen" bedeutet ein Mensch oder Tier. Für gewöhnlich ist das Tier ein Wirbeltier wie ein Primat, Nagetier, Haustier oder Jagdtier. Primaten umfassen Schimpansen, Cynomolgus-Affen, Spinnenaffen und Makaken, z.B. Rhesus. Nagetiere umfassen Mäusen, Ratten, Waldmurmeltiere, Frettchen, Kaninchen und Hamster. Haus- und Jagdtiere umfassen Kühe, Pferde, Schweine, Hirsche, Bisons, Büffel, Katzen, z.B. Hauskatzen, Hunde, Vögel, z.B. Huhn, Emu, Strauß und Fisch, z.B. Forelle, Katzenfisch und Lachs. Lebewesen schließt jegliche Teilmenge des zuvor Erwähnten ein; z.B. das gesamte oben Erwähnte, jedoch unter Ausschluß von einer oder mehreren Gruppen oder Spezies wie Humanoide, Primaten oder Nagetiere.
Soweit nicht anderweitig angegeben, oder aus dem Zusammenhang zu schließen, bedeuten die Angaben eines prozentualen Anteils eines flüssigen Bestandteils, z.B. eines Hilfsstoffs, in einer Zusammensetzung oder Formulierung der Erfindung die Volumenprozente (v/v) des Bestandteils. Somit bedeuten 20 % an Propylenglykol, daß 20 % v/v an Propylenglykol in einer Zusammensetzung oder Formulierung der Erfindung vorhanden sind. Die angegebene Menge an Hilfsstoffen in Zusammensetzungen der Erfindung wird nicht von der verwendeten Form, z.B. ein Lösungsmittel oder Hilfsstoff der Qualität NF oder USP, beeinflußt. Somit kann eine Zusammensetzung der Erfindung, die ungefähr 30 % an Polyethylenglykol 300 NF umfaßt, statt dessen ein USP-Gegenstück umfassen, vorausgesetzt, daß andere Beschränkungen, wie die Menge an vorhandenem Wasser, nicht überschritten werden.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "angeborene Immunität" eine oder mehrere Komponenten, die typischerweise mit nichtspezifischen Immunabwehrmechanismen in einem Lebewesen assoziiert sind. Diese Komponenten umfassen den alternativen Komplementweg, z.B. Faktor B, Faktor D und Properdin; NK-Zellen, Phagozyten (Monozyten, Makrophagen), Neutrophile, Eosinophile, dendritische Zellen, Fibrozyten; antimikrobielle Chemikalien, z.B. Defensine; physikalische Barrieren – Haut, mukosales Epithel; und bestimmte Interleukine, Chemokine und Zytokine. Die angeborene Immunität spielt eine Rolle bei der Widerstandsfähigkeit gegenüber intrazellulären Parasiteninfektionen, z.B. Infektionen der weißen Blutzellen, einer Leberinfektion und anderen Infektionen, z.B. Lymphknoteninfektionen. Eine Verstärkung der angeborenen Immunitätsmechanismen durch Verbindungen der Formel 1 oder dem hierin beschriebenen Verfahren können eine Phagolysosomfusion oder -bewegung verstärken, was einige Pathogene, z.B. intrazelluläre Bakterien wie Mycobacteria oder Listeria, inhibiert.
Wie hierin verwendet, verwenden Verweise auf CD-Moleküle, spezifische Immunzellteilmengen, Immunantworten und dergleichen im allgemeinen eine Nomenklatur, die auf Moleküle, Zellen oder dergleichen, welche beim Menschen gefunden werden, anzuwenden sind. Analoge oder Gegenstücke zu solchen Molekülen, Zellen oder dergleichen in anderen Spezies können eine verschiedene Nomenklatur besitzen, sind jedoch von dieser Erfindung umfaßt. Eine Beschreibung der Nomenklatur und Funktion verschiedener CD-Moleküle und Immunzellteilmengen findet sich in der wissenschaftlichen Literatur. Verweise auf Th0-, Th1- oder Th2-Zellen und Verweise auf Th1- oder Th2-Immunantworten im Zusammenhang mit menschlichen Patienten bezeichnen die menschlichen Gegenstücke zu den Murin-ThO-, -Th1- oder -Th2-Immunzellen oder -Antworten. Für eine Übersicht siehe z.B. A.K. Abbas et al. Herausgeber, Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, dritte Auflage, 1997, ISBN 0–7216–4024–9, Seiten 4–469, und I. Kimber und M.K. Selgrade, Herausgeber, T. Lympho cyte Subpopulations in Immunotoxicology, John Wiley & Sons Ltd., 1998, ISBN 0–471–97194–4, Seiten 1–53.
"Immunosuppressive Moleküle" bedeutet Moleküle wie Cyclosporin, Cyclohexamid, Mitomycin C, Adriamycin, Taxol und Amphotericin B. Diese Moleküle neigen dazu, eine Toxizität gegenüber dem Immunsystem aufzuweisen und sind direkt oder indirekt imunosuppressiv, d.h. toxisch für sich teilende Zellen, oder sie können die Immunität herunterregulieren.
"Steroidrezeptor" bedeutet ein Genprodukt, typischerweise ein Proteinmonomer oder -dimer, das an einen Liganden binden kann, z.B. ein natürliches Steroid oder ein Analoges davon, wie Verbindungen der Formel 1. Steroidrezeptoren umfassen Orphansteroidrezeptoren. Orphansteroidrezeptoren sind Proteine, bei denen der natürliche Ligand oder die biologische Funktion zumindest teilweise unbekannt sind. Wie hierin verwendet, umfassen Steroidrezeptoren Homodimere, z.B. SXR und (CARβ)₂, und Heterodimere, z.B. PXR-CARβ oder RXR-CARβ. Steroidrezeptoren umfassen auch Isoforme, z.B. PXR.1 und PXR.2 für den PXR-Rezeptor, und Homologe der Steroidrezeptoren, z.B. das Homolog von CARβ, das als MB67 bekannt ist. Isoforme werden typischerweise durch verschiedene Spleißwege für eine Kern-RNA aus einem Gen gebildet, während Homologe typischerweise eine eindeutige Kopie eines Steroidrezeptorgens sind, wobei die Genkopie lediglich relativ kleine Unterschiede im Vergleich mit dem Referenzsteroidrezeptorgenprodukt encodiert. Solche Unterschiede werden oft in Bereichen gefunden, die von dem Dimerisierungsbereich und dem Steroidbindungsbereich der Steroidrezeptorstruktur verschieden sind. Typischerweise binden Isoforme und Homologe dieselben oder ähnliche Liganden wie das Referenzgenprodukt oder der Steroidrezeptor. Steroidrezeptoren können von menschlichem oder tierischem Ursprung sein, z.B. erhalten aus Zellen, Geweben oder cDNA-Expressionsbibliotheken, die gewonnen werden aus Zellen oder Geweben beliebiger Primaten-, Nagetier- (einschließlich Mäusen), Vogel-, Schaf-, Rinder-, Pferd-, Hund- oder Katzenspezies oder einer beliebigen der Spezies oder beliebiger Spezies innerhalb einer beliebigen Gruppe (z.B. Familie oder Gattung) von Spezies, die an anderer Stelle hierin oder in einer beliebigen hierin zitierten Referenz erwähnt werden.
In dem Zusammenhang einer Kombination von Molekülen, die einen Steroidrezeptor und eine Verbindung der Formel 1 einschließen, bedeuten "Komplexe der Erfindung" oder "Komplexe" einen Komplex, der eine Steroidrezeptor und eine Verbindung der Formel 1 und gegebenenfalls andere Moleküle umfaßt. Diese anderen Moleküle umfassen (i) eine DNA-Erkennungssequenz (nachfolgend "DNARS"), d.h. eine Sequenz, die der Steroidrezeptor spezifisch erkennt und daran bindet, und (ii) einen Transkriptionsfaktor, der an den Steroidrezeptorkomplex mit der Verbindung der Formel 1 binden kann. Wie hierin verwendet, können diese Komplexe in Zellen in vitro oder in vivo oder in zellfreien System auftreten. Komplexe umfassen zum Beispiel Kombinationen aus Steroidrezeptorheterodimer – Verbindung der Formel 1, Kombinationen aus Steroidrezeptorhomodimer – Verbindung der Formel 1, Kombinationen Steroidrezeptormonomer – Verbindung der Formel 1, Kombinationen aus Steroidrezeptorheterodimer – Verbindung der Formel 1 – DNA (oder DNARS), Kombinationen aus Steroidrezeptorhomodimer – Verbindung der Formel 1 – DNA (oder DNARS), Kombinationen aus Steroidrezeptorheterodimer – Verbindung der Formel 1 – Transkriptionsfaktor, Kombinationen aus Steroidrezeptorhomodimer – Verbindung der Formel 1 – Transkriptionsfaktor, Kombinationen aus Steroidrezeptorheterodimer – Verbindung der Formel 1 – DNA (oder DNARS) – Transkriptionsfaktor und Kombinationen aus Steroidrezeptorhomodimer-Verbindung der Formel 1 – DNA (oder DNARS)-Transkriptionsfaktor.
Ein "Agonist" oder ein "Antagonist" ist eine Verbindung oder eine Zusammensetzung, die entweder die Aktivität eines Rezeptors erhöht bzw. verringert, was zu einer erhöhten bzw. verminderten Transkription eines regulierten Gens führen kann. Rezeptoren (und Transkriptionsfaktoren) können eine Transkription ihres Zielgens oder ihrer Zielgene modulieren durch Erhöhung der Transkription oder durch deren Verringerung.
Allgemeine Verfahren
Es wurden Verfahren beschrieben, zum Beispiel Karl Fischer (KF) und Trocknungsverlust (LOD), um den Gehalt an Wasser oder Lösungsmitteln in verschiedenen Zusammensetzungen zu bestimmen. LOD mißt alle flüchtigen Substanzen in einer Probe, während KF typischerweise zur Bestimmung des gesamten Wassers verwendet wird. Wenn Wasser die einzige vorhandene flüchtige Substanz ist, sind die LOD-Werte gleich oder geringer als die KF-Werte für eine gegebene Zusammensetzung. KF mißt Wasser in Hydraten einer Verbindung und LOD bestimmt sowohl Wasser als auch die Menge anderer flüchtiger Substanzen, die vorhanden sein können. Die Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung werden geeigneterweise durch eine KF-Titration (z.B. unter Verwendung eines Metrohm 684 KF Coulometers oder eines äquivalenten Geräts) gemäß einem veröffentlichten Verfahren (U. S. Pharmacopoeia, Bd. 23, 1995, Kapitel <921>, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD) und den Anweisungen des Herstellers des Coulometers auf den Wassergehalt getestet. Die Menge des im Assay verwendeten Materials, ungefähr 50–100 mg, wird unter Verwendung einer fünfstelligen Analysenwaage (Sartorius, Modell RC210D, oder eines geeigneten äquivalenten Geräts) gemessen. Die in den Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung spezifizierte Menge an Wasser ist die durch eine KF-Analyse erhaltene Menge.
Pulverröntgenbeugungs (XRD)-Verfahren wurden zur Charakterisierung verschiedener kristalliner Verbindungen verwendet (siehe z.B. U. S. Pharmacopoeia, Band 23, 1995 <941>, S. 1843–1845, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD; Stout et al., X-Ray Structure Determination; A Practical Guide, MacMillan Co., New York, N.Y., 1986). Das Beugungsmuster, oder Teile davon, das von einer kristallinen Verbindung erhalten wird, ist üblicherweise symptomatisch für eine gegebene Kristallform, obwohl schwache oder sehr schwache Beugungspeaks nicht immer in sich wiederholenden Beugungsmustern, die von nachfolgenden Batches oder Kristallen erhalten werden, auftauchen. Auch die relativen Intensitäten von XRD-Banden, insbesondere bei geringen Werten des Röntgeneinfallswinkels (geringes Theta), können aufgrund bevorzugter Orientierungseffekte variieren, die aufgrund von Unterschieden in z.B. dem Kristallhabitus, der Teilchengröße oder anderen Meßbedingungen auftreten. Peaks in XRD-Spektren werden typischerweise bei einem gegebenen Theta-Wert +/– ungefähr 0,1 bis 0,2 definiert. Eine XRD-Information von den 1, 2, 3, 4, 5 oder weiteren Hauptintensitäts-XRD-Peaks, gegebenenfalls kombiniert mit ein oder mehreren diagnostischen Daten (Schmelzpunkt, DSC, IR), ist üblicherweise geeignet für eine Charakterisierung oder Beschreibung eines kristallinen Materials wie BrEA-Hemihydrat von einer anderen Kristallform, welche dieselbe Verbindung enthält.
Andere Techniken, die zur Identifikation oder Beschreibung eines kristallinen Materials wie eines BrEA-Hemihydrats verwendet werden, umfassen Daten eines Schmelzpunkts (MP), einer Differentialscanningkalorimetrie (DSC) und einer Infrarotabsorptionsspektroskopie (IR). DSC mißt thermische Übergangstemperaturen, bei denen ein Kristall Wärme absorbiert oder freisetzt, wenn dessen Kristallstruktur sich ändert oder er schmilzt. MP-Daten und DSC-Thermoübergangstemperaturen sind bei aufeinanderfolgenden Analysen innerhalb ungefähr 1 oder 2°C reproduzierbar. IR mißt eine Absorption von infrarotem Licht, die in Zusammenhang steht mit dem Vorhandensein bestimmter chemischer Bindungen, die mit Gruppen assoziiert sind, z.B. Hydroxyl, welche als Antwort auf bestimmte Lichtwellenlängen schwingen.
Ausführungsformen der Erfindung
Die Erfindung stellt BrEA-Hemihydrat zur Verfügung, das typischerweise im wesentlichen frei von anderen Formen von BrEA ist, wie amorphes BrEA oder wasserfreies BrEA. Wie hierin verwendet, bezeichnen BrEA-Hemihydrat oder kristallines BrEA-Hemihydrat festes BrEA und Wasser, die eine geordnete Anordnung von im wesentlichen allen der diese bildenden Moleküle in einem definierten dreidimensionalen Raummuster oder -gitter aufweisen. Kristallines BrEA-Hemihydrat kann einen oder mehrere Kristallhabitus umfassen, z.B. Plättchen, Stangen, Platten oder Nadeln. BrEA-Hemihydrat, das im wesentlichen frei von anderen Formen von BrEA ist, bedeutet eine trockene oder im wesentlichen trockene (wobei eine oder mehrere Flüssigkeiten weniger als ungefähr 10 % w/w des Gesamtgewichts umfassen) feste Zubereitung, wo mehr als ungefähr 55 % w/w des BrEA in der Zubereitung als BrEA-Hemihydrat vorhanden sind. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise mindestens ungefähr 60 % w/w oder mindestens ungefähr 70 % w/w oder mindestens ungefähr 80 % w/w, für gewöhnlich mindestens ungefähr 90 % w/w oder mindestens ungefähr 95 % w/w oder mindestens ungefähr 98 % w/w an BrEA-Hemihydrat, wobei das verbleibende BrEA als andere Formen von BrEA vorhanden ist, wie amorphes oder wasserfreies BrEA. Festes BrEA-Hemihydrat wird typischerweise mindestens ungefähr 90 % w/w, für gewöhnlich mindestens ungefähr 97 % oder ungefähr 98 % w/w der Verbindung und weniger als ungefähr 10 % w/w, für gewöhnlich weniger als ungefähr 3 % oder 2 % w/w an Nebenprodukten, welche das 16β-Isomer von BrEA oder eines oder mehrere Nebenprodukte einer BrEA-Synthese einschließen, umfassen. Oft wird die Menge an festem BrEA, die in einem festen oder einem flüssigen Medium vorhanden ist, keine erfaßbaren Mengen an anderen Formen von BrEA enthalten (wobei analytische Standardverfahren verwendet werden, wie z.B. FTIR, DSC oder XRD), und das Hemihydrat wird somit ungefähr 99-100 % w/w der Gesamtmenge an vorhandenem BrEA umfassen.
Andere Ausführungsformen der Erfindung umfassen Zusammensetzungen, die eine wesentliche Menge an BrEA-Hemihydrat umfassen, die in Zusammensetzungen vorhanden ist, die eine oder mehrere andere Formen von BrEA, z.B. amorphes BrEA oder wasserfreies BrEA und gegebenenfalls eine oder mehrere zusätzliche Komponenten wie beliebige hierin beschriebene Hilfsstoffe, umfassen. Wie hierin verwendet, umfaßt die "wesentliche Menge" an BrEA-Hemihydrat in diesen Zusammensetzungen mindestens ungefähr 15–20 % w/w oder mindestens ungefähr 20 % w/w an BrEA-Hemihydrat von der Gesamtmenge an vorhandenem BrEA, typischerweise mindestens ungefähr 25 % w/w, weiter typischerweise mindestens ungefähr 30 % w/w, oft mindestens ungefähr 35 % w/w und für gewöhnlich mindestens ungefähr 45 % w/w. Diese Zusammensetzungen sind im allgemeinen Feststoffe, z.B. Formulierungen oder Unitdosagen, sie können jedoch auch Suspensionen, Präzipitate, Gele und Kolloide einschließen, die festes BrEA enthalten. Solche Suspensionen oder Präzipitate können entstehen aus z.B. einer Präzipitation von BrEA-Hemihydrat aus einer Lösung, die Wasser enthält, oder aus einer Zugabe von festem BrEA zu einem oder mehreren flüssigen Hilfsstoffen. Es ist offensichtlich, daß Zusammensetzungen, die eine wesentliche Menge an BrEA enthalten, im wesentlichen frei von anderen Formen an festem BrEA sein können, wie oben diskutiert.
BrEA-Hemihydrat kann geeigneterweise identifiziert werden durch Verweis auf BrEA-Hemihydrat, das charakterisiert ist durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften (1) dessen Schmelz- oder Zersetzungspunkt oder -bereich (gegebenenfalls ausgedrückt als +/– 2°C), (2) eine oder mehrere BrEA-Hemihydrat-DSC-Übergangstemperaturen oder -bereiche (von denen jeder gegebenenfalls ausgedrückt sein kann als +/– 2°C), (3) eine oder mehrere BrEA-Hemihydrat-IR-Absorptionsbanden, (4) 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehrere XRD-Peaks mit der höchsten Intensität (von denen jeder einzelne oder mehrere gegebenenfalls ausgedrückt sein können als +/– 0,1° Theta oder +/– 0,2° Theta), erhalten aus einem XRD-Spektrum von BrEA-Hemihydrat unter Verwendung einer Cu-Ka-Strahlung (z.B. im wesentlichen erhalten gemäß dem Verfahren, das beschrieben ist in U. S. Pharmacopoeia, Band 23, 1995, <941>, S. 1843–1845), (5) die Anwesenheit von weniger als ungefähr 3 % oder weniger als ungefähr 2 % w/w an anderen Verbindungen, (6) einen Wassergehalt von trockenem BrEA-Hemihydrat von ungefähr 2,5 % w/w (z.B. 2,3–2,7 % w/w), wobei trockenes BrEA-Hemihydrat eine durch Filtration getrocknete Verbindung bedeutet, die gegebenenfalls einmal mit einem wasserfreien Lösungsmittel wie Hexan gewaschen wird, erneut filtriert und im Vakuum bei ungefähr 60°C getrocknet wird, bis kein weiterer Gewichtsverlust während 24 Stunden bei ungefähr 60°C auftritt (z.B. wobei der Wassergehalt im wesentlichen bestimmt wird durch das Karl-Fisher-Verfahren oder durch andere Verfahren, die beschrieben sind in U.S. Pharmacopoeia, Bd. 23, 1995, S. 1801–1802 oder 1840–1843, Verfahren <731> oder <921>), (7) Zellkonstanten und die Orientierungsmatrix, die erhalten werden aus einer Einkristall-Röntgenkristallographie von BrEA-Hemihydrat (erhalten, wie z.B. im wesentlichen beschrieben in WO 99/04774 in Beispiel 13), (8) eine Beschreibung der Kristallform, wie sie beobachtet wird bei ungefähr 100facher Vergrößerung bis ungefähr 150facher Vergrößerung mittels Mikroskopie mit polarisiertem Licht oder (9) Beschreibungen der mittleren BrEA-Hemihydrat-Kristallgröße und -form.
Somit kann BrEA-Hemihydrat zum Beispiel charakterisiert sein durch eine oder mehrere dessen IR-Absorptionsbanden, z.B. den Carbonylpeaks bei 1741 cm^–1 und 1752 cm^–1, und entweder dessen Schmelz- oder Zersetzungspunkt oder -bereich und/oder 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehrerer der XRD-Peaks (für gewöhnlich die Peaks mit höchster Intensität) bei Theta-Werten (Röntgenbeugungswinkelwerten) von 17,8, 23,8, 24,2, 26,9–27,2, 28,6, 30,1 und 32,2.
BrEA-Hemihydrat ist geeignet für eine Herstellung von Zusammensetzungen, die einen oder mehrere Hilfsstoffe umfassen, die für eine humanpharmazeutische Anwendung oder für eine Veterinäranwendung geeignet sind. Solche Zusammensetzungen werden verwendet zur Herstellung von Formulierungen und Unitdosagen. Unitdosagen umfassen typischerweise Tabletten, Kapseln, Pastillen oder sterile Lösungen, einschließlich steriler Lösungen für eine parenterale Verabreichung. Feste Formen von Unitdosagen umfassen typischerweise ungefähr 5–1000 mg an BrEA-Hemihydrat, typischerweise ungefähr 20–400 mg, z.B. ungefähr 25 mg, ungefähr 50 mg, ungefähr 100 mg, ungefähr 150 mg oder ungefähr 250 mg per Unitdosage.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von BrEA-Hemihydrat zur Verfügung, umfassend das In-Kontakt-Bringen von Wasser 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on und einen C₁-C₆-Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol) und Wasser. Typischerweise ist nur ein C₁-C₆-Alkohol vorhanden, z.B. Ethanol, welcher wasserfrei ist oder welcher bis zu ungefähr 2 % w/w an Wasser umfassen kann. In einigen Ausführungsformen verwendet das Verfahren eine Lösung, die ungefähr 5–25 % w/w an Wasser, ungefähr 30–45 % w/w an Ethanol und ungefähr 30–45 % w/w einer BrEA-Zubereitung umfaßt. Typische BrEA-Zubereitungen sind feste Zubereitungen, die mindestens ungefähr 80 % w/w, für gewöhnlich mindestens ungefähr 90 % w/w oder mindestens ungefähr 95 % w/w an BrEA umfassen. Die Lösungen können ungefähr 18–22 % w/w an Wasser, ungefähr 37–43 % w/w an Ethanol und ungefähr 37–43 % w/w einer BrEA-Zubereitung umfassen. Beim Durchführen des Fällungs- oder Kristallisationsverfahrens wird die Lösung typischerweise eine Temperatur von ungefähr –20°C bis ungefähr 45°C, für gewöhnlich ungefähr 0°C bis ungefähr 20°C aufweisen. Die Lösung wird während ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 12 Stunden in diesem Temperaturbereich gehalten, und die Lösung wird gegebenenfalls unter Verwendung von langsamem bis moderatem Rühren während der Kristallisation gerührt.
Eine verwandte Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von BrEA-Hemihydrat, umfassend ein Ausfällen von BrEA aus einer Lösung, die mindestens ungefähr 15–25 % w/w an Wasser, ungefähr 35–45 % w/w einer BrEA-Zubereitung und mindestens ungefähr 35–45 % w/w von einem oder mehreren wassermischbaren Lösungsmitteln, typischerweise C_1-6-Alkohole (Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol), umfaßt. Die BrEA-Zubereitung kann gegebenenfalls ein oder mehrere Nebenprodukte der BrEA-Synthese umfassen. Typische BrEA-Hemihydrat-Zubereitungen oder -Batches umfassen weniger als ungefähr 5 % w/w, für gewöhnlich weniger als ungefähr 3 % oder ungefähr 2 % w/w an anderen Verbindungen wie Nebenprodukte der BrEA-Synthese. Die Aspekte dieses Verfahrens schließen ein In-Kontakt-Bringen von Wasser mit einer organischen Lösung, die BrEA und ein organisches Lösungsmittel wie einen C₁-C₆-Alkohol (z.B. Ethanol) oder Aceton umfaßt, ein. Eine Zugabe von Wasser zu solchen Lösungen führt zu einem Ausfällen von BrEA-Hemihydrat. Lösungen, die BrEA-Hemihydratkristalle oder -präzipitate enthalten, sind Ausführungsformen der Erfindung, die verwendet werden zur Herstellung von festem BrEA, das später getrocknet und gelagert wird, typischerweise bei Umgebungstemperaturen.
Das Ausfällen von BrEA-Hemihydrat aus wasserhaltigen Lösungen wird erreicht durch bekannte Verfahren, z.B. einer Verringerung der Temperatur der Lösung, unter Verwendung gesättigter oder nahezu gesättigter BrEA-Lösungen, einer Vakuumkonzentration von gesättigten oder nahezu gesättigten BrEA-Lösungen (was typischerweise bei relativ niedrigen Temperaturen, für gewöhnlich ungefähr 15–25°C, durchgeführt wird), Impfen von gesättigten oder nahezu gesättigten BrEA-Lösungen mit BrEA-Hemihydratkristallen (z.B. ungefähr 10–100 mg pro 1–10 l an Lösung), durch Erwärmen einer gesättigten oder nahezu gesättigten BrEA-Lösung (ungefähr 25–35°C während einiger Minuten, wobei man danach die Temperatur abfallen läßt oder die Lösung aktiv kühlt) und gegebenenfalls Impfen der Lösung mit BrEA-Hemihydratkristallen oder durch Zugabe einer Flüssigkeit, z.B. zusätzlichem Wasser oder Ethanol, zu einer gesättigten oder nahezu gesättigten BrEA-Ethanol-Wasser-Lösung, was bewirkt, daß die Lösung übersättigt wird. BrEA kann auch aus anderen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelsystemen, einschließlich Aceton und Aceton-Ethanol, ausgefällt werden. Solche Lösungsmittel sind typischerweise wassermischbar. Eine zweistufige Ausfäl lung von BrEA kann auch verwendet werden, um festes BrEA-Hemihydrat rückzugewinnen, z.B. anfängliches Ausfällen und Rückgewinnen des Feststoffs, gefolgt von entweder einem Kühlen oder einem Impfen der Mutterlauge oder indem man die Mutterlauge stehen läßt, z.B. während ungefähr einem, zwei oder mehreren Tagen bei Umgebungstemperatur, um eine zweite Ernte an Kristallen zu erhalten. BrEA-Hemihydratkristalle können gegebenenfalls auch umkristallisiert werden, im wesentlichen wie hierin beschrieben, um die Reinheit des endgültigen Feststoffs weiter zu erhöhen. Verfahren zum Kristallisieren von organischen Verbindungen wurden z.B. beschrieben bei A.S. Myerson, Handbook of Industrial Crystallization, 1993, Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, S. 1–101.
Andere verwandet Ausführungsformen umfassen ein Produkt, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens einer Lösung, die BrEA und ein organisches Lösungsmittel umfaßt, mit Wasser. Typischerweise sind die Lösungen wie oben beschrieben, z.B. eine Lösung, die ungefähr 3–5 % v/v an Wasser und mindestens ungefähr 40 % v/v an einem oder mehreren wassermischbaren Lösungsmitteln, typischerweise polaren Lösungsmitteln wie C_1-6-Alkoholen oder Ketonen (z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, typischerweise Ethanol oder Aceton) umfaßt. Solche Verfahren werden erreicht mit einer oder mehreren der in dem obigen Absatz beschriebenen Techniken, z.B. Kühlen einer gesättigten oder nahezu gesättigten BrEA-Wasser-Ethanol-Lösung und gegebenenfalls Impfen der gekühlten Lösung mit BrEA-Hemihydrat. Eine dazu verwandte Ausführungsform umfaßt Lösungen oder Feststoffe, die nasse BrEA-Hemihydratkristalle oder naßfiltrierte oder zentrifugierte BrEA-Hemihydratkuchen, welche nach einer Kristallisation erhalten werden können, umfassen. Beispiele dieser Ausführungsformen schließen eine Zugabe von Wasser zu einer BrEA-Alkohollösung, ein, z.B. eine langsame Zugabe von ungefähr 0,5–1,5 Volumen oder ungefähr 0,8–1,2 Volumen an Wasser zu ungefähr 6 Volumen einer BrEA-Ethanollösung, um BrEA-Hemihydrat zu erhalten. Andere Beispiele dieser Ausführungsformen schließen eine Zugabe von Wasser zu einer BrEA-Keton-Lösungsmittel-Lösung ein, z.B. eine langsame Zugabe von ungefähr 0,5-1,5 Volumen oder ungefähr 0,8–1,2 Volumen an Wasser zu ungefähr 10 Volumen einer BrEA-Acetonlösung, um BrEA-Hemihydrat zu erhalten.
Eine andere verwandte Ausführungsform ist BrEA-Hemihydrat, das auf eine mittlere Teilchengröße von ungefähr 0,01–200 μm oder 0,01–10 μm oder ungefähr 0,5–5 μm gemahlen ist. Die mittlere Teilchengröße oder der Durchmesser für gemahlenes BrEA-Hemihydrat kann somit relativ gering sein, z.B. ungefähr 0,03–2,0 μm oder ungefähr 0,1–1,0 μm, oder etwas größer, z.B. ungefähr 0,5–5,0 μm oder ungefähr 1–5,0 μm. Gemahlenes BrEA-Hemihydrat ist geeignet für eine Herstellung von festen Formulierungen und parenteralen Formulierungen für eine Human- oder Veterinäranwendung. Das gemahlene Material erleichtert eine Auflösung von BrEA-Hemihydrat in Lösungsmitteln oder Hilfsstoffen und erleichtert ein Mischen mit Feststoffen oder festen Hilfsstoffen.
Während es möglich ist, BrEA-Hemihydrat als eine reine Verbindung einem Lebewesen zu verabreichen, wird es für gewöhnlich als eine feste Formulierung zur Verfügung gestellt oder verwendet zur Herstellung einer flüssigen Formulierung. Formulierungen werden typischerweise zur Herstellung von Unitdosagen verwendet, z.B. Tabletten, Kapseln oder Pastillen für eine orale, bukkale oder sublinguale Verabreichung, welche ungefähr 10–1000 mg oder typischerweise ungefähr 25–400 mg an BrEA-Hemihydrat umfassen. Alternativ dazu schließen Ausführungsformen ein Produkt für eine parenterale (z.B. subkutane, subdermale, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale) Verabreichung ein, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens von BrEA-Hemihydrat und eines flüssigen Hilfsstoffs, z.B. irgendeinem, zwei, drei oder mehreren von PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, Propylenglykol, Benzylbenzoat, Benzylalkohol oder Ethanol, und gegebenenfalls Sterilisieren der Lösung und gegebenenfalls Verteilen der Lösung in Phiolen oder Ampullen (typischerweise bernsteinfarbenes Glas), die einmal oder mehrfach verwendet werden können, und gegebenenfalls Lagern der Formulierung bei verringerter Temperatur (ungefähr 0–12°C oder ungefähr 2–10°C). Solche Produkte für eine parenterale Verabreichung umfassen typischerweise BrEA bei einer Konzentration von ungefähr 10–170 mg/ml, für gewöhnlich ungefähr 20–110 mg/ml oder ungefähr 30–100 mg/ml, und gegebenenfalls eines oder mehrere von einem Salz, Puffer oder Bakteriostat oder Konservierungsmittel (z.B. NaCl, BHA, BHT oder EDTA).
Andere Ausführungsformen schließen ein Produkt ein, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens von BrEA-Hemihydrat, das im wesentlichen frei von anderen Formen an BrEA sein kann, mit einem Hilfsstoff, der geeignet ist für eine humanpharmazeutische Anwendung oder eine Veterinäranwendung. Das Produkt ist brauchbar zur Herstellung von Formulierungen oder Formen von Unitdosagen, die das Hemihydrat enthalten.
Formulierungen, die aus BrEA-Hemihydrat hergestellt sind oder dieses enthalten, werden für gewöhnlich unter Bedingungen gelagert, die die Menge an Wasser, welches die Formulierung erreicht, limitiert, z.B. Silicagel in einem verschlossenen Behälter, der eine Formulierung beinhaltet. Wasserpermeationscharakteristiken von Behältern wurden beschrieben bei z.B. Containers-Permeation, Kapitel, USP 23, 1995, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD, S. 1787.
Ausführungsformen schließen Zusammensetzungen der Erfindung ein, die vorübergehend auftreten, wenn ein Verfahrensschritt oder ein Arbeitsschritt durchgeführt wird. Wenn zum Beispiel eine Verbindung der Formel wie BrER, welches weniger als ungefähr 3 % an Wasser enthält, mit einem Hilfsstoff, z.B. einem PEG, einem Alkohol, Propylenglykol oder Benzylbenzoat, in Kontakt gebracht wird, ist die Zusammensetzung vor einer Zugabe eines Bestandteils eine nichthomogene Mischung. Wenn die Bestandteile in Kontakt gebracht werden, nimmt die Homogenität der Mischung zu und erreicht der Anteil an Bestandteilen relativ zueinander einen gewünschten Wert. Somit können Zusammensetzungen der Erfindung, welche weniger als ungefähr 3 % an Wasser enthalten, ungefähr 0,0001–99 einer Verbindung der Formel 1 wie BrEA und einen oder mehrere Hilfsstoffe umfassen. Diese vorläufigen Zusammensetzungen sind Zwischenprodukte, die notwendigerweise auftauchen, wenn man eine Zusammensetzung oder Formulierung der Erfindung herstellt, und sie sind in den Ausführungsformen der Erfindung bis zu dem Ausmaß, wie sie patentierbar sind, eingeschlossen.
Im allgemeinen ist die Verbindung der Formel 1, die in Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung vorhanden ist, vollständig in dem nichtwäßrigen Hilfsstoff aufgelöst. In einigen Ausführungsformen, z.B. vorübergehenden Zusammensetzungen und einigen Formulierungen, ist die Verbindung der Formel 1 jedoch teilweise aufgelöst, während der verbleibende Anteil als ein Feststoff vorhanden ist, der eine Suspension oder ein Kolloid sein kann.
Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung, die für eine parentale Zuführung der Verbindungen der Formel 1 an Menschen oder Tiere geeignet sind, umfassen typischerweise zwei, drei oder mehrere Hilfsstoffe. Beispielhafte Ausführungsformen umfassen (1) irgendwelche zwei, drei oder vier von Propylenglykol, PEG200, PEG300, Ethanol und Benzylbenzoat und (2) irgendwelche zwei, drei oder vier von Propylenglykol, PEG100, PEG200, PEG300, PEG400 und Benzylbenzoat.
Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung umfassen im allgemeinen ungefähr 0,01–10 % an BrEA, für gewöhnlich ungefähr 1–5 %, und ungefähr 0,01–3 % an Wasser, typischerweise ungefähr 0,05–3 %, für gewöhnlich ungefähr 0,1–1 %. Die Formulierungen der Erfindung sind für gewöhnlich Unitdosagen oder Multiunitdosagen, die geeignet sind für eine parenterale Verabreichung einmal oder zweimal pro Tag oder einmal pro 2–3 Tagen. Unidosagen umfassen ungefähr 3–1000 mg an BrEA pro Unitdosage, typischerweise ungefähr 5–500 mg, für gewöhnlich ungefähr 10–200 mg. Zur Behandlung von Retroviren wie HIV bei Menschen umfaßt eine Unitdosage für gewöhnlich ungefähr 10–250 mg an BrEA, üblicherweise ungefähr 100–200 mg, in einem Volumen von ungefähr 1–6 ml, für gewöhnlich ungefähr 2–4 ml.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen das Produkt, das hergestellt wird durch ein Verfahren des Kombinierens, Mischens oder anderweitigen In-Kontakt-Bringens von BrEA und einem, zwei oder mehreren Hilfsstoffen. Solche Produkte werden hergestellt durch Routineverfahren des In-Kontakt-Bringens der Bestandteile. Solche Produkte enthalten gegebenenfalls auch ein Verdünnungsmittel, ein Trennmittel und ein Bindemittel oder andere Hilfsstoffe, die hierin oder in den hierin zitierten Referenzen beschrieben werden.
Es zeigte sich, daß BrEA in der Gegenwart von signifikanten Mengen an Wasser am Bromatom epimerisiert, was zu einer Mischung der 16α- und 16β-BrEA-Isomere führt. Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung, welche BrEA oder BrEA-Hemihydrat umfassen, werden für gewöhnlich einen Wassergehalt von weniger als ungefähr 3 %, typischerweise weniger als ungefähr 0,3 %, für gewöhnlich weniger als ungefähr 0,1 % besitzen. Diese Zusammensetzungen und Formulierungen zeigen, daß sie eine gute Stabilität besitzen, wenn sie bei Umgebungstemperatur (ungefähr 5–40°C, wie hierin verwendet) in geschlossenen Behältern gelagert werden, im Vergleich mit Kontrollzusammensetzungen und -formulierungen, die mehr Wasser besitzen. Solche Flüssigkeiten werden auch durch eine unerwartete Verringerung der Präzipitation der Verbindung charakterisiert, was scheinbar durch Wasser induziert wird.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen Zusammensetzungen, die weniger als ungefähr 3 % an Wasser, eine Verbindung der Formel 1 und eine Verbindung, die im allgemeinen nicht als geeignet für eine Humananwendung angesehen wird, aber geeignet ist für eine Herstellung einer Formulierung der Erfindung für eine Veterinäranwendung, umfassen. Veterinärformulierungen sind Zusammensetzungen, die zum Zweck der Verabreichung von Zusammensetzungen der Erfindung an Primaten, Katzen, Hunde, Pferde, Rinder, Kaninchen und andere Lebewesen brauchbar sind und Hilfsstoffe enthalten können, die auf dem Gebiet der Veterinärmedizin als geeignet angesehen werden und kompatibel sind mit Verbindungen der Formel 1 wie BrEA. Diese Veterinärzusammensetzungen können nicht immer geeignet sein für eine Humananwendung, da sie einen Hilfsstoff enthalten, der nicht für eine Humananwendung geeignet ist, z.B. einen Alkohol, der von Ethanol verschieden ist, wie Methanol, Propanol oder Butanol. Typischerweise werden solche Hilfsstoffe mit relativ geringen Niveaus vorhanden sein, z.B. ungefähr 1–30 %, für gewöhnlich ungefähr 1–5 %.
Ausführungsformen der Erfindung schließen Zusammensetzungen und Formulierungen ein, z.B. Formen von Unitdosagen und sterile Lösungen, die folgendes umfassen- (1) ungefähr 1–100 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 57,5 % an Propylenglykol, ungefähr 25 % an PEG300, ungefähr 12,5 % an Ethanol und ungefähr 5 % an Benzylbenzoat; (2) ungefähr 1–60 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 70 % an Propylenglykol, ungefähr 25 % an PEG300 und ungefähr 5 an Benzylbenzoat; (3) ungefähr 1–60 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 25 % an PEG300, ungefähr 35 % an Propylenglykol, ungefähr 35 % an Mannitol und ungefähr 5 % an Benzylbenzoat; (4) ungefähr 1–60 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 57,5 % an Propylenglykol, eine Mischung, umfassend ungefähr 25 % an PEG300 und PEG200 (z.B. PEG300:PEG200 in einem Verhältnis von ungefähr 1:10 bis ungefähr 10:1), ungefähr 12,5 % an Ethanol und ungefähr 5 % an Benzylbenzoat, (5) ungefähr 1–60 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 75 % an Propylenglykol, eine Mischung, umfassend ungefähr 25 % an PEG300 und PEG200 (z.B. PEG300:PEG200 in einem Verhältnis von ungefähr 1:10 bis ungefähr 10:1) und ungefähr 5 % an Benzylbenzoat; (6) ungefähr 1–60 mg/ml einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, ungefähr 25 % an PEG300 und PEG200 (z.B. PEG300:PEG200 in einem Verhältnis von ungefähr 1:10 bis ungefähr 10:1), ungefähr 35 % an Propylenglykol, ungefähr 35 % an Mannitol und ungefähr 5 % an Benzylbenzoat; (7) irgendeine der Formulierungen (1) bis (6), wobei die Verbindung(en) der Formel 1 ungefähr 40-55 mg/ml ausmachen; (8) irgendeine der Formulierungen (1) bis (6), wobei die Verbindung(en) der Formel 1 ungefähr 30–100 mg/ml ausmachen; (9) irgendeine der Formulierungen (1) bis (8), wobei 1, 2, 3 oder 4 Verbindungen der Formel 1 vorhanden sind; (10) irgendeine der Formulierungen (1) bis (8), wobei 1 oder 2 Verbindungen der Formel 1 vorhanden sind; (11) irgendeine der Formulierungen (1) bis (8), wobei 1 Verbindung der Formel 1 vorhanden ist; (12) irgendeine der Formulierungen (1) bis (11), wobei die Verbindung der Formel 1 unabhängig bei 1, 2 oder 3 von irgendeinem von R¹–R⁶, R¹⁰, R¹⁵, R¹⁷ oder R¹⁸ einen unabhängig ausgewählten Ester, Thioester, Carbonat, Carbamat, Aminosäure oder Peptid von 1 oder 2 unabhängig ausgewählten Verbindungen der Formel 1 umfaßt; (13) irgendeine der Formulierungen (1) bis (12), wobei die Verbindung der Formel 1 BrEA oder BrEA-Hemihydrat umfaßt oder ist; (14) irgendeine der Formulierungen (1) bis (13), wobei die Verbindung der Formel 1 einen Ester, einen Sulfatester oder Phosphorester von BrEA umfaßt oder ist.
Andere Ausführungsformen schließen das Produkt ein, das erhalten wird durch Lagern von Zusammensetzungen oder Formulierungen der Erfindung, z.B. Formen von Unitdosagen, irgendeine der obigen Ausführungsformen (1)–(14) oder Zusammensetzungen, die verwendet werden zur Herstellung von Formulierungen, bei ungefähr 10–40°C während mindestens ungefähr 3 Tagen, z.B. Lagern bei Umgebungstemperatur während ungefähr 1–24 Monaten. Formulierungen der Erfindung werden während dieser Zeiträume typischerweise in hermetisch oder induktionsversiegelten Behältern gelagert. Zusammensetzungen der Erfindung werden typischerweise in verschlossenen Behältern aufbewahrt. Die Beschreibung und Ansprüche offenbaren beispielhaft geeignete Formulierungen und Formen von Unitdosagen für diese Ausführungsformen.
Verfahren des intermittierenden Dosierens
Man kann die Verbindung oder die Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA-Hemihydrat, einem Lebewesen intermittierend verabreichen, ohne einige der unerwünschten Aspekte, die normalerweise im Zusammenhang mit einer diskontinuierlichen Dosierung stehen. Solche unerwünschten Aspekte umfassen eine Entwicklung einer Resistenz eines Pathogens (Virus wie HIV oder eines Parasiten wie eines Plasmodium-Parasiten) gegenüber dem therapeutischen Mittel oder einem Versagen des Patienten oder des Lebewesens beim Festhalten an einer Dosierungstherapie. Intermittierende Dosierungsprotokolle schließen die folgenden Verabreichungen einer Verbindung der Formel 1, z.B. oral, topisch oder parenteral, ein: (1) eine Dosierung während ungefähr 3 bis ungefähr 20 Tagen, (2) keine Dosierung der Verbindung der Formel 1 während ungefähr 4 bis ungefähr 20 Tagen, (3) Dosierung während ungefähr 4 bis ungefähr 20 Tagen und (4) gegebenenfalls Wiederholen des Dosierungsprotokolls 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30 oder mehrere Male. Oft werden die Dosierungen der Schritte (1) und (3) während ungefähr 3–15 Tagen, für gewöhnlich ungefähr 3–5 Tagen beibehalten. Im allgemeinen werden die oben angegebenen Schritte (1)–(3) des Dosierungsprotokolls mindestens einmal, typischerweise mindestens 2-, 3-, 4-, 5- oder 6mal wiederholt. Für Infektionen, die dazu neigen, chronisch zu bleiben, z.B. HIV, HCV oder andere chronische Virus- oder Parasiteninfektionen, wird das intermittierende Dosierungsprotokoll typischerweise über einen relativ langen Zeitraum, z.B. während mindestens ungefähr 6 Monaten bis ungefähr 5 Jahren, beibehalten.
In diesen intermittierenden Dosierungsprotokollen kann die Verbindung der Formel 1 oder können die Verbin dungen der Formel 1 über eine beliebige geeignete Route verabreicht werden, z.B. intramuskulär (i.m. oder I.M.), subkutan (s.c. oder S.C.), intravenös (i.v. oder I.V.), intradermal, einer anderer parenteralen Route, ein Aerosol unter Verwendung von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 mg/kg/Tag, für gewöhnlich ungefähr 0,2–4 mg/kg/Tag. Alternativ dazu kann man die Verbindung(en) der Formel 1 oral verabreichen unter Verwendung von ungefähr 4 bis ungefähr 40 mg/kg/Tag, für gewöhnlich ungefähr 6-20 mg/kg/Tag. In einigen Ausführungsformen schließen die intermittierenden Dosierungsverfahren Dosierungsprotokolle aus, die für gewöhnlich verwendet werden, um kontrazeptive Steroide an z.B. humanoide Frauen zu verabreichen, wie bei einer täglichen Dosierung während 21 Tagen, gefolgt von einer ausbleibenden Dosierung während 7 Tagen. Im allgemeinen werden die hierin beschriebenen nichtwäßrigen Formulierungen, welche eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 enthalten, i.m. oder s.c. verabreicht, während wäßrige Formulierungen, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 enthalten, i.v., i.m., s.c. oder über andere parenterale Routen verabreicht werden. Die täglichen Dosierungen können als eine einzelne Dosierung verabreicht werden, insbesondere für parenteral gegebene Dosierungen, oder die Dosierung kann in zwei, drei oder vier Unterdosierungen, für gewöhnlich zwei, unterteilt werden, insbesondere für oral gegebenen Dosierungen.
Beispielhafte Ausführungsformen sind (a) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA-Hemihydrat, jeden zweiten Tag während 20 Tagen, gefolgt von (b) einer ausbleibenden Dosierung während 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oder mehr Tagen und (c) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 mindestens einmal mehr an einem Tag, z.B. Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 jeden zweiten Tag während 20 Tagen, und (d) gegebenenfalls Wiederholen von (a), (b) und (c) 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6mal oder mehr. Eine Teilmenge dieser Ausführungsformen sind (a) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA-Hemihydrat, jeden zweiten Tag während 20 Tagen, gefolgt von (b) einem Ausbleiben der Dosierung während ungefähr 10–40 Tagen und dann (c) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 mindestens einmal mehr an einem Tag, z.B. Verabreichen einer oderer mehrerer Verbindungen der Formel 1 jeden zweiten Tag während 20 Tagen, und (d) gegebenenfalls Wiederholen von (a), (b) und (c) 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6mal oder mehr. In einer beliebigen dieser Ausführungsformen kann man die eine oder mehreren Verbindungen der Formel 1 in 2 oder 3 Unterdosierungen pro Tag verabreichen.
Andere Ausführungsformen sind (a) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA, einmal jeden Tag während ungefähr 8–12 Tagen, gefolgt von (b) einem Ausbleiben der Dosierung während 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oder mehr Tagen und dann (c) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 mindestens einmal mehr an einem Tag, z.B. Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 einmal pro Tag während ungefähr 8–12 Tagen und (d) gegebenenfalls Wiederholen von (a), (b) und (c) 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6mal oder mehr. Eine Teilmenge dieser Ausführungsformen sind (a) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA-Hemihydrat, einmal jeden Tag während ungefähr 10 Tagen, gefolgt von (b) einem Ausbleiben der Dosierung während ungefähr 10–40 Tagen und dann (c) Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 mindestens einmal mehr an einem Tag, z.B. Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 einmal pro Tag während ungefähr 10 Tagen, und (d) gegebenenfalls Wiederholen von (a), (b) und (c) 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6mal oder mehr. In einer beliebigen dieser Ausführungsformen kann man die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 in 2 oder 3 Unterdosierungen pro Tag verabreichen.
Ein Aspekt der intermittierenden Dosierung der Erfindung ist das Überwachen der Antwort des Lebewesens auf die Dosierung. Während der Dosierung eines Lebewesens, das eine Virusinfektion (z.B. HCV, HIV, SIV, SHIV) besitzt, kann man z.B. die Antwort des Lebewesens oder des Pathogens messen, z.B. eine Verbesserung von einem oder mehreren Symptomen oder eine Änderung der infektiösen Teilchen oder viralen RNA im Serum. Sobald eine Antwort beobachtet wird, kann eine Dosierung während einem, zwei oder drei zusätzlichen Tagen fortgeführt werden, gefolgt von einem Unterbrechen der Dosierung während mindestens einem Tag (mindestens 24 Stunden), für gewöhnlich während mindestens 2 oder 3 Tagen. Sobald die Antwort des Lebewesens ein Anzeichen einer Remission aufzeigt (z.B. die virale Serum-RNA beginnt zuzunehmen), kann die Dosierung für einen weiteren Durchlauf wieder aufgenommen werden. Ein Aspekt der Antwort eines Lebewesens auf eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 ist es, daß das Lebewesen eine meßbare Antwort innerhalb einer kurzen Zeit, für gewöhnlich ungefähr 5–10 Tagen, aufzeigen kann, was eine direkte Verfolgung der Antwort des Lebewesens ermöglicht, z.B. durch Überwachung des viralen Titers in peripheren weißen Blutzellen ("PBMC") oder durch Messen der viralen Nukleinsäureniveaus im Blut. Man kann eine oder mehrere Immunzellen-Teilmengen, z.B. NK-, LAK-, dendritische Zellen oder Zellen, die ADCC-Immunantworten mediieren, während und nach einer intermittierenden Dosierung überwachen, um die Antwort des Lebewesens zu überwachen und um zu bestimmen, wann eine weitere Verabreichung der Verbindung der Formel 1 angezeigt ist. Diese Zellteilmen gen werden wie hierin beschrieben überwacht, z.B. mittels Durchflußzytometrie.
Für jegliche der hierin beschriebenen Behandlungen oder Verfahren können langandauernde günstige Effekte oder eine anhaltende Immunantwort durch ein Lebewesen aus einer einzelnen Verabreichung oder einer Verabreichung der Verbindung der Formel 1 während weniger Tage oder von einer intermittierenden Behandlung mit der Verbindung der Formel 1 resultieren. Eine einzelne Verabreichung bedeutet, daß eine Verbindung der Formel 1 dem Lebewesen in einer, zwei, drei oder mehreren Dosen innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden verabreicht wird und keine weitere Verabreichung von irgendeiner Verbindung der Formel 1 an das Lebewesen während mindestens ungefähr 45 Tagen bis ungefähr 2 Monaten, z.B. während 3, 4, 5, 6 oder mehr Monaten, stattfindet. Langanhaltende günstige Effekte oder Immunantworten können auch andauern, nachdem ein kurzer Behandlungsdurchlauf abgeschlossen wurde (z.B. eine tägliche Dosierung während 2, 3, 4, 5 oder 6 Tagen) und das Lebewesen nicht länger irgendeine Verbindung der Formel 1 oder in einigen Fällen irgendeine andere therapeutische Behandlung zur Behandlung der primären Ursache des pathologischen Zustands des Lebewesens erhält. Solche günstigen Effekte können über mehr als ungefähr 5–30 Tage anhalten.
In einigen Fällen wurden günstige Effekt aus einer Behandlung während mehr als 3 Monaten (4 oder 5 oder mehr Monaten) nach einem kurzen Behandlungsdurchlauf eines Lebewesens mit einer Verbindung der Formel 1 beobachtet. Somit stellt die Verabreichung einer Verbindung der Formel 1 ein Verfahren zum wirksamen Schutz eines Lebewesens gegenüber einem Fortschreiten einer Infektion oder gegenüber nachteiligen Konsequenzen von unerwünschten Immunreaktionen (z.B. Entzündung) oder gegenüber einer Immunsuppression (von einer Infektion, Chemotherapie usw.) zur Verfügung, ohne irgendeine Dosierung der Verbindung während mindestens 3 Monaten nach einem anfänglichen Dosierungsprotokoll, welches ein intermittierendes oder ein kontinuierliches Dosierungsprotokoll über z.B. 1 Tag bis ungefähr 4 Monate (1–15 Tage, ungefähr 1 Monat, ungefähr 2 Monate usw.) sein könnte.
Formulierungen und Zusammnsetzungen zur Herstellung von Formulierungen
Während es für den oder die aktiven Bestandteile möglich ist, allein verabreicht zu werden, werden sie gewöhnlich als pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung gestellt. Die Formulierungen der Erfindung, sowohl für eine veterinäre als auch eine Humananwendung, umfassen mindestens einen aktiven Bestandteil, d.h. eine Verbindung der Formel 1, zusammen mit einem oder mehreren dafür akzeptablen Hilfsstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe oder Träger umfassen. Eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 (auch als die "aktiven Bestandteile" bezeichnet) werden durch eine beliebige Route verabreicht, die für den zu behandelnden Zustand geeignet ist. Geeignete Routen für die nichtwäßrigen flüssigen Formulierungen und anderen Formulierungen der Verbindung der Formel 1 schließen orale, rektale, nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), vaginale und parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intrathekale und epidurale) ein. Im allgemeinen werden die nichtwäßrigen flüssigen Zubereitungen durch eine parenterale Route verabreicht.
In anderen Ausführungsformen, wie bei den intermittierenden Dosierungsverfahren der Erfindung, können die Verbindungen der Formel 1 als eine nichtwäßrige, flüssige Formulierung, eine trockene feste Formulierung, welche eine orale, topische, parenterale Formulierung ist, oder als eine wäßrige flüssige Formulierung, welche parenteral, oral oder topisch verwendet wird, vorliegen. Es wird bevorzugt, daß die bevorzugte Route variieren kann im Hinblick auf zum Beispiel den pathologischen Zustand oder das Gewicht des Lebewesens oder die Antwort des Lebewesens auf die Therapie mit einer Verbindung der Formel 1 oder eine anderen Therapie, die für die Gegebenheiten geeignet ist.
Die Formulierungen schließen solche ein, die geeignet sind für die vorher erwähnten Verabreichungsrouten. Die Formulierungen können geeignetermaßen in Formen von Unitdosagen zur Verfügung gestellt werden und können hergestellt werden durch irgendeines der auf dem Gebiet der Pharmakologie gut bekannten Verfahren. Techniken, Hilfsstoffe und Formulierungen sind im allgemeinen zu finden in z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985, 17. Ausgabe, Nema et al., PDA J. Pharm. Sci. Tech., 1997, 51:166–171. Verfahren zur Herstellung von Formulierungen der Erfindung schließen den Schritt des Zusammenbringens eines oder mehrerer aktiver Bestandteile mit dem oder den Hilfsstoffen ein. Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt durch ein gleichförmiges und inniges Zusammenbringen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Hilfsstoffen oder feinverteilten festen Hilfsstoffen oder beiden und dann, falls angebracht, Formen des Produkts.
Formulierungen der Erfindung, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, werden als diskrete Einheiten wie Kapseln, Pillen oder Tabletten hergestellt, welche jeweils eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils als ein Pulver oder Granalien, als eine Lösung oder eine Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit oder einer nichtwäßrigen Flüssigkeit oder als eine flüssige Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine flüssige Wasser-in-Öl-Emulsion enthalten. Der oder die aktiven Bestandteile können auch als ein Bolus, ein Electuarium oder eine Paste vorliegen.
Eine Tablette wird hergestellt durch Pressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen. Gepreßte Tabletten können hergestellt werden durch Pressen des oder der aktiven Bestandteile in einer freifließenden Form wie einem Pulver oder Granalien, gegebenenfalls vermischt mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, oberflächenaktiven oder Dispersionsmittel in einer geeigneten Maschine. Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen einer Mischung der pulvrigen aktiven Bestandteile, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet sind, in einer geeigneten Maschine. Die Tabletten können gegebenenfalls beschichtet oder gekerbt werden und werden gegebenenfalls so formuliert, daß sie eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des oder der aktiven Bestandteile daraus zur Verfügung stellen.
Für Infektionen des Auges oder anderer äußerer Gewebe, z.B. Mund oder Haut, werden die Formulierungen typischerweise als eine topische Salbe oder Creme aufgebracht, die die aktiven Bestandteile in einer Menge von zum Beispiel 0,075 bis 20 % w/w (einschließlich aktiver Bestandteile in einem Bereich von 0,1 % und 20 % in Inkrementen von 0,1 % w/w wie 0,6 % w/w, 0,7 % w/w usw.), oft 0,2 bis 15 % w/w und am meisten 0,5 bis 10 % w/w enthalten. Wenn sie in einer Salbe formuliert sind, können die aktiven Bestandteile mit entweder einer paraf finischen oder einer wassermischbaren Salbengrundlage verwendet werden. Alternativ dazu können die aktiven Bestandteile in einer Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremegrundlage formuliert werden.
Falls gewünscht, kann die wäßrige Phase der Cremegrundlage zum Beispiel mindestens 30 % w/w eines mehrwertigen Alkohols, d.h. eines Alkohol mit zwei oder mehreren Hydroxylgruppen wie Propylenglykol, Butan-1,3-diol, Mannitol, Sorbitol, Glycerol und Polyethylenglykol (einschließlich PEG400) und Mischungen davon, einschließen. Die topischen Formulierungen können wünschenswerterweise eine Verbindung einschließen, welche eine Adsorption oder Penetration der aktiven Bestandteile durch die Haut oder andere betroffene Bereiche erhöht. Beispiele solcher Verstärkersubstanzen für eine dermale Penetration schließen Dimethylsulfoxid und verwandte analoge Verbindungen ein.
Die Ölphase der Emulsionen dieser Erfindung kann aus bekannten Hilfsstoffen auf eine bekannte Weise aufgebaut sein. Während die Phase lediglich einen Emulgator (ansonsten als Emulgierungsmittel bekannt) umfassen kann, kann sie wünschenswerterweise eine Mischung aus mindestens einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder mit sowohl einem Fett als auch einem Öl umfassen. Ein hydrophiler Emulgator kann zusammen mit einem lipophilen Emulgator, welcher als ein Stabilisator wirkt, enthalten sein. Einige Ausführungsformen umfassen sowohl ein Öl als auch ein Fett. Zusammen machen der oder die Emulgatoren mit oder ohne Stabilisatoren das sogenannte Emulgierungswachs aus, und das Wachs zusammen mit dem Öl und Fett machen die sogenannte Emulgierungssalbengrundlage aus, welche die ölige dispergierte Phase der Cremeformulierungen bildet.
Emulgatoren und Emulsionsstabilisatoren, die für eine Verwendung in der Formulierung der Erfindung geeignet sind, schließen Tween60^TM, Span80^TM, Cetostearylalkohol, Benzylalkohol, Myristylalkohol, Glycerylmonostearat und Natriumlaurylsulfat ein.
Die Wahl von geeigneten Ölen oder Fetten für die Formulierung basiert auf dem Erreichen der gewünschten kosmetischen Eigenschaften. Cremes sind im allgemeinen nichtfettende, nichtschmutzende und auswaschbare Produkte mit einer geeigneten Konsistenz, um ein Auslaufen aus Tuben oder anderen Behältern zu vermeiden. Es können geradkettige oder verzweigtkettige mono- oder dibasische Alkylester wie Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglykoldiester von Kokosfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat oder eine Mischung aus verzweigtkettigen Estern, die als Crodamol CAP bekannt ist, verwendet werden. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden, abhängig von den erforderlichen Eigenschaften. Alternativ dazu werden Lipide mit hohem Schmelzpunkt wie weißes Weichparaffin und/oder Flüssigparaffin oder andere Mineralöle verwendet.
Formulierungen, die für eine topische Verabreichung an das Auge geeignet sind, schließen auch Augentropfen ein, wobei der oder die aktiven Bestandteile in einem oder mehreren Hilfsstoffen gelöst oder suspendiert sind, insbesondere einem wäßrigen Lösungsmittel für aktive Bestandteile, das eine oder mehrere Befüllungen bei pH-Werten nahe der Neutralität, z.B. ungefähr pH 6–8, umfaßt. Der oder die aktiven Bestandteile sind in solchen Formulierungen typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 0,5–20 % w/w, typischerweise ungefähr 1–10 w/w, oft ungefähr 2–5 % w/w vorhanden.
Formulierungen, die für eine topische Verabreichung im Mund geeignet sind, schließen Pastillen, welche den aktiven Bestandteil in einer Geschmacksbasis, für gewöhnlich Saccharose und Akazin oder Tragant, umfassen; Pastillen, die den oder die aktiven Bestandteile in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akazin umfassen; und Mundwässer, die den aktiven Bestandteil in einem oder mehreren geeigneten flüssigen Hilfsstoff umfassen, ein.
Formulierungen für eine rektale Verabreichung können als ein Suppositorium mit einer geeigneten Basis, die zum Beispiel Kakaobutter oder ein Salicylat umfaßt, vorliegen.
Formulierungen, die für eine intrapulmonale oder nasale Verabreichung geeignet sind, besitzen eine Teilchengröße, die zum Beispiel im Bereich von 0,01 bis 500 Mikrometer liegt (einschließlich mittlerer Teilchengrößen in einem Bereich zwischen 0,01 und 500 Mikrometer in Schritten von 0,1 Mikrometer oder anderen Schritten, z.B. 0, 05, 0, 1, 0, 5, 1, 1, 5, 2, 0, 2, 5, 3, 0, 3, 5, 4, 0, 4, 5, 5, 0, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100 Mikrometer usw.), die durch eine schnelle Inhalation durch den Nasengang oder durch eine Inhalation durch den Mund verabreicht wird, um so die Sacculi alveolares zu erreichen. Geeignete mikronisierte Formulierungen schließen wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen der aktiven Bestandteile ein. Formulierungen, die für eine Verabreichung mittels eines Aerosols, trockenen Pulvers oder Tabletten geeignet sind, können gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden und können mit anderen therapeutischen Mitteln wie Verbindungen, die bisher bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen oder anderen Infektionen, wie sie hierin beschrieben werden, verwendet werden, zugeführt werden. Solche Formulierungen können z.B. oral, parenteral (i.v., i.m., s.c.) topisch oder über eine bukkale Route verabreicht werden.
Formulierungen, die für eine vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen vorliegen, welche zusätzlich zu dem oder den aktiven Bestandteilen solche Hilfsstoffe enthalten, die im Stand der Technik als geeignet bekannt sind.
Formulierungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen wäßrige und nichtwäßrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Stoffe, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen, enthalten; und wäßrige und nichtwäßrige sterile Suspensionen, welche Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können.
Die Formulierungen werden in Behältern mit einer Einfachdosis oder Mehrfachdosis zur Verfügung gestellt, zum Beispiel versiegelten Ampullen oder Phiolen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der lediglich die Zugabe des sterilen flüssigen Hilfsstoffs, zum Beispiel Waser für die Injektion, unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Extemporierte Injektionslösungen und Suspensionen werden hergestellt aus sterilen Pulvern, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen Art. Unitdosage-Formulierungen sind solche, die eine Tagesdosis oder eine Einheitstagesunterdosis enthalten, wie hierin angegeben, oder einen geeigneten Anteil davon, der aktiven Bestandteile.
Selbstverständlich können die Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben speziell erwähnten Bestandteilen andere Mittel oder Hilfsstoffe enthalten, die auf dem Gebiet üblich sind, das sich auf die jeweilige Formulierung bezieht, zum Beispiel solche, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, können Geschmacksstoffe enthalten.
Die Erfindung stellt ferner Veterinärzusammensetzungen zur Verfügung, die mindestens einen aktiven Bestandteil, wie er oben definiert ist, mit einem oder mehreren Veterinärhilfsstoffen dafür umfassen. Veterinärhilfsstoffe sind Materialien, die brauchbar sind für den Zweck einer Verabreichung der Zusammensetzung, und können feste, flüssige oder gasförmige Materialien sein, die ansonsten inert oder auf dem Gebiet der Veterinärmedizin akzeptabel sind und kompatibel mit dem oder den aktiven Bestandteilen sind. Diese Veterinärzusammensetzungen können oral, parenteral oder durch eine andere gewünschte Route verabreicht werden.
Formulierungen der Erfindung umfassen pharmazeutische Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung, die einen oder mehrere aktive Bestandteile ("Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung") enthalten, in welchen die Freisetzung der aktiven Bestandteile kontrolliert und reguliert ist, um eine Dosierung mit geringerer Frequenz zu ermöglichen oder um das pharmakokinetische oder Toxizitätsprofil eines gegebenen aktiven Bestandteils zu verbessern.
Eine effektive Dosis eines oder mehrerer aktiver Bestandteile ist abhängig von zumindest der Natur des zu behandelnden Zustands, der Toxizität, ob die Verbindungen prophylaktisch (geringere Dosen) oder gegen eine aktive Infektion oder einen aktiven Zustand verwendet werden, dem Verabreichungsverfahren und der pharmazeutischen Formulierung, und werden durch die Kliniken unter Verwendung herkömmlicher Dosissteigerungsstudien bestimmt.
Es ist zu erwarten, daß sie von ungefähr 0,05 bis ungefähr 30 mg/kg Körpergewicht pro Tag reichen. Für eine topische Zuführung wird zum Beispiel die Personentagesdosis für einen erwachsenen Menschen mit ungefähr 70 kg an Körpergewicht von ungefähr 1 mg bis ungefähr 500 mg, im allgemeinen zwischen ungefähr 5 mg und ungefähr 40 mg liegen und kann die Form von Einzeldosen oder Mehrfachdosen oder Verabreichungsstellen einnehmen.
Ausführungsformen schließen Formulierungen ein, die ein Liposom oder einen Lipidkomplex umfassen, der eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 umfaßt, z.B. Carbamat, Carbonat, Aminosäure oder Peptid davon. Solche Formulierungen werden gemäß bekannten Verfahren hergestellt, z.B. US-Patente 4427649, 5043165, 5714163, 5744158, 5783211, 5795589, 5795987, 5798348, 5811118, 5820848, 5834016 und 5882678. Die Liposome enthalten gegebenenfalls ein oder mehrere therapeutische Mittel, z.B. Amphotericin B, cis-Platin, Adriamycin, einen Proteaseinhibitor, ein Nukleosid- oder ein Nukleotidanalog, wie eines der hierin erwähnten. Formulierungen, die Liposome umfassen, können einem Lebewesen über eine beliebige Standardroute verabreicht werden, z.B. oral, Aerosol oder parenteral (z.B. s.c., i.v. oder i.m.).
Therapeutische Anwendungen
Die Verbindung der Formel 1 oder die biologisch aktiven Substanzen, die aus diesen Verbindungen hergestellt werden durch Hydrolyse oder Metabolismus in vivo, besitzen eine Anzahl an klinischen und nichtklinischen Anwendungen. Die Verbindungen sind im allgemeinen brauchbar zur Erhöhung von Th1-Immunantworten oder zur Verringerung von Th2-Immunantworten. Wie hierin verwendet, bedeutet ein Verweis auf Th1- oder Th2- Immunantworten solche Antworten, wie sie bei Säugetieren im allgemeinen beobachtet werden und nicht, wie sie in dem Murinsystem beobachtet werden, von welchem die Th1- und Th2-Terminologie abstammt. Beim Menschen stellen somit Th1-Zellen bevorzugt Chemokinrezeptoren CXCR3 und CCR5 dar, während Th2-Zellen bevorzugt das CCR4-Molekül und eine geringere Menge des CCR3-Moleküls darstellen.
Aspekte der Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, die eine Menge von mindestens einer Verbindung der Formel 1, die wirksam ist zur Verstärkung des relativen Anteils einer gewünschten Immunzellteilmenge, z.B. CD4⁺ T-Zellen, NK-Zellen oder dendritischen Zellen, oder zur Modulation von einer oder mehreren Funktionen von Immunzellteilmengen, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Eine typische Immunmodulation konzentriert sich auf ein Modulieren einer Expression von Genen, die die Th1-Immunantworten verstärken oder die Th2-Immunantworten verringern. Funktionen, welche die Verbindung der Formel 1 beeinflussen, schließen eine Expression von CD-Molekülen oder eine Änderung des Anteils an Zellteilmengen, z.B. CD4⁺ oder CD8⁺ T-Zellen, oder deren relative Zahlen in dem Blut oder den Geweben eines Lebewesens ein. CD-Moleküle sind beteiligt bei der Funktion verschiedener Immunzellteilmengen und können brauchbar sein als Marker für eine Immunfunktion in vivo. In einigen Aspekten aktiviert die Verbindung der Formel 1 Immunzellen, die im allgemeinen eine Änderung (Erhöhung oder Verringerung) einer Expression von oder eine Veränderung der Anzahl der Zellen bewirkt, welche Kombinationen von CD4, CD6, CD8, CD25, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD43, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CD71, CD90 oder HLA-DR-Molekülen exprimieren. Oft ist die Anzahl an Zellen, welche diese Moleküle exprimieren, erhöht, z.B. CD25, CD16 oder CD69. Typischerweise werden solche Erhöhungen als ein erhöhter Anteil an zirkulierenden weißen Blutzellen beobachtet, welche ein oder mehrere dieser Moleküle exprimieren. In einigen Fällen ist die Anzahl solcher Moleküle pro Zelle nachweisbar verändert.
Eine Expression von einem oder mehreren Adhäsionsmolekülen CD2, CD5, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD31, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD54, CD58, CD103 oder CD104 ist ebenfalls nachweisbar beeinflußt nach einer Verabreichung der Verbindungen der Formel 1 an ein Lebewesen. Oft ist die Anzahl an Zellen, welche diese Moleküle exprimieren, erhöht, z.B. CD5 oder CD56. Die Adhäsionsmoleküle fungieren in verschiedenen Aspekten der Immunantworten wie einem Binden an Moleküle der Klasse I MHC, einem Umwandeln von Signalen zwischen Zellen oder einem Binden an Molekülen in der extrazellulären Matrix, die in Zusammenhang steht mit Endothelialzellen oder anderen Zellarten. Eine Verabreichung der Verbindungen der Formel I an ein Lebewesen beeinflußt auch die Anzahl an bestimmten Immunzellteilmengen, z.B. NK-Zellen (z.B. CD8^–, CD56⁺ oder CD8⁺, CD56⁺) oder Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK). Ein verstärktes Zirkulieren von NK- oder LAK-Zellen wird typischerweise beobachtet, was sich widerspiegelt in einer gestiegenen Anzahl an Zellen, die ein oder mehrere von CD16, CD38, CD56, CD57 oder CD94 exprimieren. Es werden auch erhöhte Zahlen an zirkulierenden dendritischen Zell-Precursern beobachtet, was aufgezeigt wird durch eine Erhöhung in Zellen, welche einen oder mehrere von CD11c, CD80, CD83, CD106 oder CD123 exprimieren. Obwohl man einen erhöhten Anteil an zirkulierenden weißen Blutzellen beobachtet, welche eine oder mehrere dieser Moleküle exprimieren, ist in einigen Fällen die Anzahl an solchen Molekülen pro Zelle nachweisbar verändert. Sowohl die Zellanzahl als auch die Dichte der CD-Moleküle pro Zelle können auch nachweisbar moduliert werden. Eine Modulation von Immun zellteilmengen findet typischerweise bei einer intermittierenden Dosierung der Verbindung der Formel 1 statt.
Eine Expression von einem oder mehreren Homing-Rezeptoren wie CD62L kann auch nachweisbar beeinflußt sein nach einer Verabreichung der Verbindungen der Formel 1 an ein Lebewesen. Oft ist die Anzahl an Zellen, welche diese Moleküle exprimieren, erhöht, z.B. CD62L.
Andere CD-Moleküle, die durch die Gegenwart der Verbindungen der Formel 1 in einem Lebewesen moduliert werden, schließen Zytokinrezeptormoleküle ein wie CD115, CDW116, CD117, CD118, CDW119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CDW127, CDW128 oder CDW130. Oft wird die Anzahl an Rezeptormolekülen pro Zelle moduliert. Zum Beispiel werden Rezeptoren für Zytokine, welche die Th1-Immunantworten mediieren (z.B. IL-2, γIFN), typischerweise erhöht sein in oder an Zellen, welche Th1-Immunantworten mediieren. Eine Modulation dieser Moleküle kann stattfinden durch eine direkte Wechselwirkung mit einem oder mehreren Rezeptoren in der Zelle, welche den Zytokinrezeptor exprimiert, oder indirekt durch Modulation einer Zytokinsynthese in den betroffenen Zellen oder in anderen Zellen, typischerweise Immunzellen, die mit den Zellen, deren Rezeptorsynthese moduliert wird, Wechselwirken.
Eine Behandlung eines Lebewesens mit einer Verbindung der Formel 1 kann zu einer Änderung von mindestens 25-50 % über oder unter (z.B. mindestens 30 % oder mindestens 40 % über oder unter) des Kontrollniveaus oder Grundniveaus von einigen Immunzellteilmengen führen. Zum Beispiel findet eine Erhöhung von mehr als ungefähr 30 bei der Gesamtanzahl an aktivierten CD8⁺ T-Zellen, z.B. CD8⁺, CD69⁺, CD25⁺ T-Zellen, CD8⁺, CD69⁺, CD25^– T-Zellen oder CD8⁺, CD69^–, CD25⁺ T-Zellen für gewöhnlich bei 7 Tagen nach einer Einzeldosis einer Verbindung der Formel 1 an ein Lebewesen statt. Solche Erhöhungen können größer sein als 50 %, 60 % oder 100 % der Gesamtanzahl an aktivierten CD8⁺ T-Zellen oder Teilmengen von aktivierten CK8⁺ T-Zellen in einzelnen Lebewesen. Typischerweise finden solche Erhöhungen bei den Gesamtzahlen von aktivierten CD8⁺ T-Zellen oder Teilmengen von aktivierten CD8⁺ T-Zellen im Mittel von ungefähr 30–40 % statt, wobei einzelne Lebewesen Erhöhungen von über 100 % hinsichtlich der Anzahl an aktivierten CD8⁺ T-Zellen pro Einheitsblutvolumen im Vergleich mit dem Grundniveau erfahren.
Eine Verabreichung der Verbindungen der Formel 1 kann andere Immunzellteilmengen beeinflussen. Zum Beispiel nimmt die Konzentration an zirkulierenden CD4⁺, CD69⁺, CD25^– (Th1-Helferzellen) und CD8⁺, CD16⁺, CD38⁺ LAK-Zellen oder CD8–, CD16⁺, CD38⁺ LAK-Zellen typischerweise während oder nach dem Verlauf einer Dosierung eines Lebewesens mit einer Verbindung der Formel 1 zu. Auch CD8^–, CD16⁺, CD38⁺ und CD8⁺, CD16⁺, CD38⁺ (ADCC-Effektorzellen) und Low Side Scatter Lin^–, DR⁺, CD123⁺ (dendritische Precurser) oder Low Side Scatter Lin^–, DR⁺, CD11c⁺ (dendritische Zellen oder Precurser) können moderate bis signifikante Erhöhungen aufzeigen.
In Lebewesen, die immununterdrückt sind, z.B. durch eine Infektion (z.B. viral (HIV, HCV), Bakterieninfektion oder Parasiteninfektion) oder durch eine Chemotherapie (z.B. eine antivirale Therapie, eine Krebs-Chemotherapie oder eine Strahlentherapie), führt eine Verabreichung der Verbindungen der Formel 1 an das Lebewesen zu einer günstigen Verschiebung des Gleichgewichts von Th1- oder Th2-Antworten, die das Lebewesen angesichts der Immunsuppression aufbringen kann. Wenn Th1-Antworten suboptimal oder unzureichend sind, führt eine Behandlung mit einer Verbindung der Formel 1 zu einer Erhöhung der Th1-Antwor ten oder einer Verringerung der Th2-Antworten. Wenn demgegenüber Th2-Antworten suboptimal oder unzureichend sind, führt eine Behandlung mit einer Verbindung der Formel 1 zu einer Erhöhung der Th2-Antworten oder einer Verringerung der Th1-Antworten. Die Verbindungen der Formel 1 können somit verwendet werden zum Verschieben der Natur einer Immunantwort eines Lebewesens, was zu einer ausgeglicheneren Immunantwort von einer Immunosuppression führt. Alternativ dazu können die Verbindungen selektiv ungeeignete oder unerwünschte Immunantworten unterdrücken. Erhöhte Th1-Antworten scheinen zumindest teilweise herzurühren von einem oder mehreren von (i) einer Verringerung einer biologischen Einschränkung, z.B. hohe Niveaus an IL-4 oder IL-10, bei Th1-Funktionen bei vorher existierenden primed Th1-Effektorzellen, (ii) einer erhöhten Differenzierung von Th0-Zellen oder Th1-Zellen oder erhöhten Antworten, die mediiert werden durch Th1-Zellen, (iii) einer erhöhten Funktion einer akzessorischen Zellfunktion, z.B. einer Antigenpräsentation durch dendritische Precursorzellen oder durch Makrophagen, (iv) einer erhöhten Proliferation und Differenzierung von Th1-Precursor- oder -Progenitorzellen, (v) einer erhöhten IL-12-Expression in dendritischen Zellen oder deren Precursorn, was zu einer erhöhten Differenzierung von Th1-Zellen aus Th0-Precursorn führt, (vi) einer erhöhten Expression oder Aktivität von Faktoren, die in Zusammenhang stehen mit Th1-Funktionen, z.B. IL-2, gamma-Interferon (γIFN) oder Lymphotoxin.
Ein Aspekt der Verfahren der Erfindung ist eine Änderung der Expression von IL-4 oder IL-10, die stattfindet nach einer Verabreichung einer Verbindung der Formel 1 an ein Lebewesen. Eine folgerichtige Beobachtung ist es, daß extrazelluläre IL-4- oder IL-10-Niveaus schnell auf Niveaus abnehmen, die durch ELISA nicht erfaßbar sind. Intrazelluläre IL-10-Niveaus sind auf Niveaus verringert, die nahe oder unterhalb der Grenzen einer Erfassung mittels Durchflußzytometrie liegen. Die Verabreichung einer Verbindung der Formel 1 an ein Lebewesen stellt somit ein Mittel zur Verfügung zur Inhibierung von einem oder beiden dieser Interleukine. Eine solche Inhibierung kann assoziiert sein mit einer Verstärkung von Th1-Immunantworten relativ zu Th2- oder Th0-Antworten, z.B. in Lebewesen, bei denen Th1-Antworten unterdrückt (z.B. durch eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion (HIV, HCV usw.) oder eine Chemotherapie) oder anderweitig suboptimal sind. In vielen Lebewesen sind Niveaus von entweder IL-4 oder IL-10, für gewöhnlich IL-10, vor einem Dosieren mit einer Verbindung der Formel 1 gering oder nicht erfaßbar. In diesen Lebewesen führt eine Dosierung mit der Verbindung der Formel 1 zu einem rapiden Abfall des Interleukins, das erfaßbar ist, für gewöhnlich IL-4.
In einigen Ausführungsformen wird die Verbindung der Formel 1 einem Lebewesen verabreicht, das eine pathogene Infektion besitzt, wie eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion. Die Verbindungen der Formel 1 können für eine Verwendung bei einem großen Umfang an Infektionen in Betracht gezogen werden (siehe z.B. J.B. Peter, Herausgeber, Use and Interpretation of Laboratory Tests in Infectious Disease, 5. Auflage, Specialty Laboratories, Santa Monica, CA 90404, 1998, Seiten 1–271), da die Verbindungen im allgemeinen Th1-Immunantworten verstärken und/oder Th2-Immunantworten verringern. Eine Schwierigkeit bei der Behandlung einiger Infektionen, z.B. Enzephalitis toxoplasmatica, Malaria, Tuberkulose, Leishmaniase und Schistosomiasis, scheint oft in Zusammenhang mit unerwünschten Th2-Immunantworten aufzutreten. Typischerweise sind unerwünschte Th2-Immunantworten assoziiert mit oder verursacht durch eine erhöhte Expression von einem oder mehreren Zytokinen oder Interleukinen wie IL-4 und IL-10. Eine Verabreichung einer Verbindung der Formel 1 oder anderer hierin offenbarter Verbindungen wird im allgemeinen die Expression von einem oder mehreren der Th2-assoziierten Zytokinen oder Interleukinen verringern. Gleichzeitig verstärken die Verbindungen die Expression von einem oder mehreren Zytokinen oder Interleukinen, die mit Th1-Immunantworten assoziiert sind. Aufgrund ihrer Kapazität zur Modulierung von Th1- und Th2-Immunantworten sind die Verbindungen brauchbar für eine Vielzahl an klinischen Zuständen, z.B. Infektion, Immunosuppression oder Krebs, wo eine gesteigerte Th1-Immunantwort gewünscht ist. Bei einer disseminierten oder diffusen Tuberkulose würde zum Beispiel eine verringerte Th2-Antwort wünschenswert sein, um einem Patienten zu ermöglichen, den Fortschritt der Erkrankung zu verlangsamen oder infizierte Zellen wirksamer zu bereinigen.
Ein Aspekt der Erfindung stellt Ausführungsformen zur Verfügung, bei denen eine Verbindung der Formel 1 und ein Glutathionreduktaseinhibitor wie Buthathionsulfoximin [CH₃-(CH₂)₃-S(=O)(=NH)-(CH₂)₂-CHNH₂-C(O)-OH] einem Lebewesen verabreicht werden zur Behandlung von Infektionen, z.B. einer parasitären Infektion wie Malaria, Toxoplasma, Cryptosporidium, oder zur Behandlung eines Krebs oder einer Malignität. Die verringerte Zufuhr von reduziertem Glutathion kann eine Phagozytose durch Makrophage verstärken, möglicherweise aufgrund einer verstärkten oxidativen Schädigung in infizierten Zellen oder in replizierenden malignen Zellen. Alternativ dazu kann die Verwendung eines Glutathionreduktaseinhibitors zu einer verbesserten Erkennung von infizierten oder malignen Zellen durch das Immunsystem führen. Eine Verbindung der Formel 1 und Buthathionsulfoximin werden verwendet, um z.B. eine Klärung von Ring-Stage-Malaria von infizierten Zellen zu verstärken oder um eine Immunsystemerkennung von malignen Zellen zu verstärken, im Vergleich mit der Verwendung der Verbindung der Formel 1 allein. Die Infek tionen und Malignitäten, bei denen diese Ausführungsformen angewendet werden, werden hierin beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der Formel 1 und eines Flavonoids, z.B. eines Naragin-Flavonoids, zur Verfügung, um die Bioverfügbarkeit der Verbindung der Formel 1 zu erhöhen. In diesen Ausführungsformen wird eine wirksame Menge eines Flavonoids einem Lebewesen verabreicht, das eine Verbindung der Formel 1 empfangen hat. Typischerweise werden ungefähr 1–10 mg an Flavonoid pro kg an Körpergewicht dem Lebewesen verabreicht, ein Flavonoid wie Bavachinin A, Didymin (Isosakuranetin-7-rutinosid oder Neoponcirin), Flavanomarein (Isookanin-7-glucosid), Flavanonazin, Flavanondiacetylhydrazon, Flavanonhydrazon, Silybin, Silychristin, Isosilybin oder Silandrin. Die Flavonoidverbindung wird typischerweise mit der Verbindung der Formel 1 oder einige Stunden, z.B. ungefähr 1, 2 oder 3 Stunden, vor der Verabreichung der Verbindung der Formel 1 dem Lebewesen gegeben.
Es können Liposomformulierungen verwendet werden, um die Zuführung der Verbindungen der Formel 1 zu bestimmten Zelltypen wie Tumorzellen (siehe z.B. US-Patent 5714163) oder zu Zellen des Retikuloendothelialsystems ("RES") zu erhöhen. Das RES schließt Makrophagen, mononukleare Phagozytenzellen, Zellen, die die Sinusoide der Milz auskleiden, Lymphknoten und Knochenmark und die fibroblastischen Retikularzellen von blutbildenden Geweben ein. Im allgemeinen sind RES-Zellen phagozytisch, und sie sind Ziele für eine gezielte Zufuhr einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 in vitro oder in vivo unter Verwendung von Liposomen oder anderen Zusammensetzungen oder Formulierungen. Somit kann man eine Verbindung der Formel 1 einem Neoplasma zuführen, das von einem Retikuloendothelialgewebe (Retikuloendothelioma) abstammt. Die Liposome können auch gegebenenfalls ein Peptid eines Infekticnsmittels wie eines Malariaparasiten umfassen. Die Peptide können die Bildung einer MHC-Klasse II und B-Zellantwort erleichtern.
Andere Verwendungen der Verbindung der Formel 1 umfassen eine Verabreichung der Verbindung an ein Lebewesen, das unter einem oder mehreren pathologischen Zuständen leidet. Die Behandlung kann die Quelle des oder der Zustände und/oder der Symptome mildern, die in Zusammenhang stehen mit dem oder den pathologischen Zuständen, wie einer Infektion mit einem oder mehreren Pathogenen (Viren, Bakterien, Pilze), einer Malignität, einer unerwünschten Immunantwort, d.h. einer Immunantwort, die eine Pathologie und/oder Symptome bewirkt, z.B. Autoimmunzustände oder Allergie oder Zustände wie Hypoproliferationszustände, z.B. normales oder ungleichmäßiges Gewebewachstum, oder Wundheilung oder Heilung von Verbrennungen, oder in Immunosuppressionszuständen, z.B. Zuständen, die durch eine Abwesenheit einer gewünschten Antwort und/oder einen unangemessenen Grad einer gewünschten Antwort charakterisiert sind.
Viele Krebse oder Malignitäten sind assoziiert mit einer unerwünschten Th2-Immunantwort oder einer unzureichenden Th1-Antwort. Eine unzureichende Th1-Immunantwort kann eine Rolle spielen bei der Kapazität von malignen Zellen im Hinblick auf ein Entkommen aus der Immunüberwachung. Diese Zustände umfassen nichtkleinzelligen Lungenkrebs, Bronchogenkarzinom, Nierenzellenkrebs oder -karzinom, Lymphom, Gliom, Melanom, pankreatisches oder gastrisches Adenokarzinom, mit dem Humanpappilomavirus in Zusammenhang stehende zervikale intraepitheliale Neoplasie, Zervikalkarzinom, Hepatom und kutanes T-Zellenlymphom (Mycosis fungoides, Sezary-Syndrom).
In einigen dieser Ausführungsformen kann die Hyperproliferation oder der maligne Zustand des Lebewesens in Zusammenhang stehen mit einem oder mehreren Pathogenen. Zum Beispiel ist ein Leberzellenkarzinom assoziiert mit HCV oder HBV, ist ein Kaposi-Sarkom assoziiert mit HIV-1 oder HIV-2, ist eine T-Zellenleukämie assoziiert mit HTLV I, ist ein Burkitt-Lymphom assoziiert mit dem Epstein-Barr-Virus oder Papillomas oder ist ein Karzinom assoziiert mit Papillomaviren (HPV6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45) oder ist ein gastrisches Adenokarzinom oder ein gastrisches MALT-Lymphom assoziiert mit einer Helicobacter pylori Infektion. In anderen Ausführungsformen wird die Verbindung der Formel 1 einem Lebewesen verabreicht, das einen Hyperproliferationszustand besitzt, der scheinbar nicht mit einem Pathogen assoziiert ist, z.B. Melanom oder einen Krebs oder eine Präkanzerose, welche im Rachen, in der Speiseröhre, dem Magen, dem Darm, dem Dickdarm, den Eierstöcken, der Lunge, der Brust oder dem zentralen Nervensystem auftauchen.
In einer beispielhaften Ausführungsform werden menschliche Patienten, die unter einem Melanom oder einer Melanompräkanzeroseläsion leiden, mit einer topischen Cremezubereitung behandelt, die 2–20 % an BrEA (w/w) enthält. Die Creme wird aufgebracht auf primäre Naevi (dysplastische Naevi oder üblich erworbene Naevi) primäre kutane Melanome, sekundäre kutane Melanome und die Haut, welche die Naevi oder Melanome umgibt. Die zu behandelnden Bereiche werden mit Seife gewaschen oder mit einem Alkohol (z.B. Ethanol oder Isopropanol) vor einer Verabreichung der Creme abgewischt, wenn dies praktikabel ist. In Abhängigkeit von der Größe der behandelten Fläche werden ungefähr 0,1–0,4 g an Creme einmal oder zweimal pro Tag pro behandelten Bereich oder Läsion während ungefähr 10–20 Tagen aufgebracht. Die Creme läßt man ohne Beeinträchtigung während ungefähr 15–30 Minuten auf der Verabreichungsstelle, bevor der Patient seine normale Aktivität wieder aufnimmt. Ein Fortschritt der Naevi und Melanome wird bei der Hauptzahl an Patienten verzögert, und es wird eine signifikante Rückentwicklung bei einigen Läsionen beobachtet. Infolge der Anfangsbehandlung wird die Formulierung jeden zweiten Tag während mindestens 1 bis 4 Monaten verabreicht, wobei dieselbe Dosierung, wie sie für die Anfangsbehandlung beschrieben wird, verwendet wird. Für diese Patienten wird entsprechend den Empfehlungen des den Patienten behandelnden Arztes und mit der wissentlichen Zustimmung des Patienten optional eine Standardtherapie zur Behandlung der Precursorläsion oder des Melanoms, z.B. Dimethyltriazenoimidazolcarboxamid oder Nitrosourea (z.B. BCNU, CCNU), gestartet oder fortgeführt. In Fällen, bei denen ein Tumor oder eine Precursorläsion. chirurgisch entfernt wurde und die Stelle ausreichend ausgeheilt ist, fährt der Patient gegebenenfalls fort unter Verwendung der topischen Formulierung an der Stelle und der benachbarten umgebenden Fläche jeden Tag während mindestens 1 bis 4 Monaten. In einigen dieser Ausführungsformen wird täglich eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 kontinuierlich als eine orale Zusammensetzung oder Formulierung verabreicht, z.B. für eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1, welche als solches eine neue Verbindung ist. BrEA wird gegebenenfalls auch systemisch verabreicht unter Verwendung von z.B. einer Formulierung, die beschrieben wird in den nachfolgenden Beispielen, um jeden zweiten Tag während ungefähr 1 Woche bis ungefähr 4 Monaten 1–5 mg/kg/Tag zuzuführen, z.B. im Falle eines malignen Melanoms.
Unzureichende TH1-Immunantworten sind oft assoziiert mit einer Virusinfektion. Virusinfektionen können herrühren von DNA- oder RNA-Viren, z.B. Herpesviren, Hepadnaviren, Adenoviren, Retroviren, Togaviren, Alphaviren, Arboviren, Flaviviren, Rhinoviren, Papillomaviren und/oder Pestviren. Beispielhafte Viren wurden beschrieben. Siehe zum Beispiel B.N. Fields et al., Herausgeber, Fundamental Virology, 3. Ausgabe, 1996, Lippencott-Raven Publishers, siehe Kapitel 2 auf Seiten 23–57, einschließlich Tabelle 4 auf Seiten 26–27, Tabelle 5 auf Seiten 28-29, Kapitel 17 auf Seiten 523–539, Kapitel 26–27 auf Seiten 763–916, Kapitel 32 auf Seiten 1043–1108 und Kapitel 35 auf Seiten 1199–1233. Wie hierin verwendet, umfassen Retroviren Human- und Tierviren, z.B. HIV-1, HIV-2, LAV, Human-T-Zell-Leukämievirus I ("HTLV I"), HTLV II, HTLV III, ShV, SHIV, FIV, FeLV. Zusätzliche Viren, einschließlich derer Genogruppen, Klades, Isolate, Stämme usw., die eine Virusinfektion hervorrufen können, umfassen Humanhepatitis-C-Virus ("HCV"), Humanhepatitis-B-Virus ("HBV"), Humanhepatitis-A-Virus ("HAV"), Entenhepatitisvirus, Woodchuckhepatitisvirus, Human- ("HPV", z.B. HPV 6, HVP 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45) oder Tierpapillomaviren, Poliovirus, Herpes-simplex-Virus 1 ("HSV-1"), Herpes-simplex-Virus 2 ("HSV-2"), Humanherpesvirus 6 ("HHV-6"), Humanherpesvirus 8 ("HHV-8"), Denguevirus (Typen 1–4), Western-Equine Enzephalitis-Virus, Japan-Enzephalitis-Virus, Gelbfiebervirus und Bovine Viral Diarrhea-Virus.
Andere Zustände, wo ein Immunungleichgewicht oder eine übermäßige Th2-Immunantwort beteiligt ist, schließen Autoimmunerkrankungen ein wie SLE (systemischer Lupus erythematodes), Osteoporose, Multiple Sklerose, Myastenia gravis, Graves-Krankheit, mit Milben in Verbindung stehende ulceröse Dermatitis, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis. Übermäßige Th2-Immunantworten sind auch assoziiert mit einem unerwünschten Symptom oder einer Pathologie, z.B. Müdigkeit, Schmerz, Fieber, oder einer gesteigerten Infektionshäufigkeit, die assoziiert ist mit dem Altern, einer Allergie und Entzündungszuständen wie einer allergischen bronchopulmonalen Aspergillose bei Patienten mit zystischer Fibrose, atopischem Asthma, allergischer Atemwegserkrankung, allergischer Rhinitis, atopischer Dermatitis, subepithelialer Fibrose bei Luftweg-Überreagibilität, chronischer Sinusitis, perennialer allergischer Rhinitis, Crohn-Krankheit (regionaler Enteritis), Colitis ulcerosa, entzündlicher Darmerkrankung, fibrosierender Alveolitis (Lungenfibrose).
Andere klinische Indikationen, die eine Assoziation damit oder ein oder mehrere Symptome besitzen, die konsistent sind mit einer übermäßigen Th2-Immunantwort, z.B. Müdigkeit, Schmerz, Fieber oder einer gestiegenen Infektionshäufigkeit, sind Schizophrenie, akute Myelitis, Sarkoidose, Verbrennungen, Traumata (z.B. Knochenfraktur, Blutung, chirgischer Eingriff) und Immunantworten auf eine Xenotransplantation. Diese übliche zugrundeliegende Immunkomponente in mindestens einem Teil der Pathologie von all diesen Zuständen erlaubt es, daß ein einzelnes Mittel wirksam verwendet werden kann zur Behandlung des Zustands oder zur Behandlung von einem oder mehreren Symptomen, die mit unzureichenden Th1-Antworten oder mit übermäßigen Th2-Antworten assoziiert sind. In all den Zuständen, bei denen eine unzureichende Th1-Antwort oder eine unerwünschte Th2-Antwort vorhanden ist, wird eine Linderung von einem oder mehreren Symptomen, die mit dem Zustand assoziiert sind, erreicht durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel 1 gemäß den hierin beschriebenen Verfahren. Somit kann man intermittierend eine Verbindung der Formel 1 unter Verwendung einer Formulierung und einer Verabreichungsroute, wie sie hierin beschrieben werden, verabreichen.
In einigen Anwendungen kann die Verbindung der Formel 1 direkt und/oder indirekt mit einer Replikation, Entwicklung oder Transmission eines Pathogens von Zelle zu Zelle, wie eines Virus oder eines Parasiten (Malaria), wechselwirken. Eine Verbesserung bei dem klinischen Zustand eines Lebewesens kann von einer direkten Wirkung auf ein infektiöses Mittel oder auf eine maligne Zelle herrühren. Eine Wechselwirkung mit einer zellulären Replikation kann von einer Inhibierung von einem oder mehreren Enzymen herrühren, die ein Parasit oder eine infizierte Zelle für eine normale Replikation oder den Metabolismus verwendet, z.B. Glucose-6-phosphatdehydrogenase, welche die zelluläre Bildung von NADPH beeinflußt (siehe z.B. Raineri et al., Biochemistry 1970, 9: 2239-2243). Dieser Effekt kann zu zytostatischen Effekten beitragen, die einige Verbindungen der Formel 1 besitzen. Eine Modulation einer zellulären Enzymexpression oder -aktivität kann auch wechselwirken mit einer Replikation oder Entwicklung eines Pathogens, z.B. HIV oder Malariaparasiten, oder mit einer Replikation oder Entwicklung von neoplastischen Zellen, z.B. Inhibierung einer Angiogenese. Eine klinische Verbesserung wird im allgemeinen auch aus einer verstärkten Th1-Immunantwort resultieren.
In anderen Anwendungen sind Ausführungsformen ein Verfahren, das ein In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel 1 mit einer oder mehreren Zellen umfaßt, wobei die Verbindung der Formel 1 mit einem Steroidhormonrezeptor einen Komplex bildet oder zu einer Modulation einer biologischen Aktivität führt. Der Steroidhormonrezeptor kann ein Orphankernhormonrezeptor sein, der eine mäßige oder hohe Bindungsaffinität für die Verwendung der Verbindung der Formel 1 aufzeigt. In einigen Ausführungsformen ist der Steroidrezeptor ein bekannter Steroidrezeptor. Biologische Wirkungen von einer Interaktion einer Verbindung der Formel 1 und eines Rezeptors können zu einer Wechselwirkung mit der Replikation oder Entwicklung eines Pathogens oder der Zellen selbst führen. Zum Beispiel kann die Expression eines HIV-Transkripts in HIV- infizierten Zellen verändert sein. Der Komplex Rezeptor-Verbindung der Formel 1 kann direkt mit einer LTR-abhängigen Transkription von HIV-Genen wechselwirken, was zu einer verringerten viralen Replikation führt.
Die Verbindungen der Formel 1 können verwendet werden zur Identifikation von Rezeptoren, die biologische Antworten modulieren, z.B. Rezeptoren, die teilnehmen bei dem Bewirken einer verstärkten Th1-Zytokinsynthese. Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein Verfahren, "Verfahren 1", das die Bestimmung von einem oder mehreren Wirkungen einer Testverbindung auf einen Steroidrezeptor in verschiedenen biologischen Systemen ermöglicht. Im allgemeinen ist die Testverbindung eine Verbindung der Formel 1. Solche Systeme umfassen Zellen, die ein DNA-Konstrukt enthalten, das konstitutiv oder induzierbar einen oder mehrere interessante Steroidrezeptoren exprimiert, z.B. SXR, CARβ, RXR, PXR, PPARα, oder Mischungen oder Dimere davon, z.B. SXR/RXR. In anderen biologischen Systemen kann der Steroidrezeptor der transkriptionalen Kontrolle eines regulierbaren Promotors unterliegen. Alternativ dazu die Exprimierung eines anderen Gens wie eines Steroid-induzierbaren Gens, z.B. eines Steroidinduzierbaren Zytochroms P-450. Für dieses Verfahren wird im allgemeinen eine Quelle von Steroidrezeptoren mit einem Mittel, diese zu überwachen, kombiniert, z.B. durch Messen der Transkription eines Gens, das durch den Rezeptor reguliert wird. Zellen, die den Steroidrezeptor und optional ein Überwachungsmittel umfassen, werden manchmal hierin als das "biologische System" bezeichnet. Quellen von Steroidrezeptoren umfassen Zellinien und Zellpopulationen, die den interessanten Steroidrezeptor normal exprimieren, und Extrakte, die aus solchen Zellen erhalten werden. Eine andere Quelle für ein brauchbares biologisches System für die Zwecke dieses Verfahrens sind Gewebe aus experimentellen Tieren, die den Rezeptor exprimieren.
In einem Aspekt ermöglicht das Verfahren 1 eine Bestimmung von einem oder mehreren Effekten einer Verbindung der Formel 1 auf einen Steroidrezeptor unter Verwendung eines Verfahrens, das folgendes umfaßt (a) Bereitstellen eines biologischen Systems, z.B. eines Zellextrakts, Zellen oder Gewebe, umfassend Zellen mit einer Vielzahl an Steroidrezeptoren, die Monomere, Homodimere oder Heterodimere umfassen, die einen Steroidrezeptor umfassen, z.B. SXR, ARβ, RXR, PPARα, PXR oder Dimere, die einen oder mehrere von diesen umfassen; (b) Aktivieren oder Inhibieren der Vielzahl an Monomeren, Homodimeren oder Heterodimeren, welche den Steroidrezeptor umfassen, durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem Steroidrezeptor (z.B. SXR, ARβ, RXR, PPARα oder PXR)-Agonisten oder -Antagonisten; (c) Entfernen von im wesentlichen den gesamten Steroidrezeptoragonisten oder -antagonisten aus den Zellen; (d) Bestimmen einer Aktivität der Vielzahl an Monomeren, Homodimeren oder Heterodimeren, welche den Steroidrezeptor umfassen, während des Vorliegens eines aktivierten Zustands in der Abwesenheit eines Agonisten oder Antagonisten; (e) Einwirkenlassen der Testverbindung auf die Zellen; (f) Bestimmen von mindestens einem Effekt der Testverbindung auf die Aktivität der Vielzahl an Monomeren, Homodimeren oder Heterodimeren, welche einen oder mehrere der Steroidrezeptoren umfassen, während diese im wesentlichen frei von einem Agonisten oder Antagonisten bleiben; und (g) gegebenenfalls Klassifizieren der Testverbindung als einen Agonisten oder einen Antagonisten des Steroidrezeptors oder als eine neutrale Verbindung mit einem geringen oder nichterfaßbaren Effekt.
Die Effekte, die das Verfahren 1 messen kann, umfassen ein Bestimmen oder Messen eines Effekts auf ein Gen, dessen Expression durch den Steroidrezeptor beeinflußt wird. Das Gen könnte ein Gen sein, das mit einem pathologischen Zustand assoziiert ist, wie einem infektiösen Mittel, einer Immunerkrankung oder einem Hyperproliferationszustand.
Somit ist ein anderer Aspekt des Verfahrens 1, "Verfahren 1A", eine Bestimmung, ob eine chemische Verbindung, die bis dahin nicht als ein Modulator einer Proteinbiosynthese bekannt ist, die Expression eines Gens transkriptional modulieren kann, das ein Protein encodiert, das in Zusammenhang steht mit der Aufrechterhaltung oder Behandlung von einem oder mehreren Symptomen eines pathologischen Zustands. Dieses Verfahren umfaßt: (a) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die eukaryotische Zellen umfaßt, mit einer Verbindung der Formel 1, wobei die eukaryotischen Zellen eine Vielzahl an Steroidrezeptorproteinen und ein DNA-Konstrukt umfassen, das in einer 5' zu 3'-Reihenfolge folgendes enthält: (i) eine modulierbare transkriptionale Regulatorsequenz des Gens, das das Protein, dem das Interesse gilt, encodiert, (ii) einen Promotor des Gens, das das Protein, dem das Interesse gilt, encodiert, und (iii) ein Reportergen, das ein Polypeptid exprimiert, welches in der Lage ist, ein erfaßbares Signal zu erzeugen, gekoppelt mit und unter der Kontrolle des Promotors, unter Bedingungen, die derart sind, daß die chemische Verbindung, wenn sie in der Lage ist, als ein transkriptionaler Modulator des Gens, welches das Protein, dem das Interesse gilt, encodiert, zu wirken, ein meßbares oder erfaßbares Signal erzeugt durch das Polypeptid, das durch das Reportergen exprimiert wird; (b) quantitatives Bestimmen des Betrags des auf diese Weise erzeugten Signals; und (c) gegebenenfalls Vergleichen des auf diese Weise bestimmten Betrags mit dem Betrag des erzeugten Signals, das in der Abwesenheit jeglicher zu testender chemischer Verbindung oder bei einem In-Kontakt-Bringen der Probe mit anderen chemischen Verbindungen erfaßt wird, um so die chemische Verbindung als eine zu identifizieren, die eine Änderung in dem erfaßbaren Signal bewirkt, das von dem Polypeptid erzeugt wird, und Bestimmen, ob die chemische Verbindung spezifisch transkriptional die Exprimierung des Gens moduliert, das assoziiert ist mit der Aufrechterhaltung oder Behandlung von einem oder mehreren Symptomen des pathologischen Zustands.
Bei der Durchführung des Verfahrens 1A wird typischerweise eine Probe, die eine vordefinierte Anzahl an identischen oder im wesentlichen identischen eukaryotischen Zellen enthält, in Kontakt gebracht mit einer vorbestimmten Konzentration einer Verbindung der Formel 1. Die eukaryotischen Zellen umfassen ein DNA-Konstrukt, das hergestellt wurde unter Verwendung herkömmlicher molekularbiologischer Verfahren und Protokolle. Im allgemeinen enthält das DNA-Konstrukt in einer 5' zu 3'-Reihenfolge folgendes: (i) eine transkriptionale Regulatorsegenz, die bei der Modulierung einer Expression des Gens beteiligt ist, das in Zusammenhang steht mit der Aufrechterhaltung oder Behandlung des pathologischen Zustands, (ii) den Promotor des Gens, und (iii) ein Reportergen, das ein Polypeptid exprimiert, welches in der Lage ist, ein erfaßbares Signal zu erzeugen, gekoppelt mit und unter der Kontrolle des Promotors. Das Konstrukt wird auf eine solche Weise unter Bedingungen gehalten, daß die Verbindung der Formel 1, falls sie in der Lage ist, als ein transkriptionaler Modulator des Gens, welches das Protein, dem das Interesse gilt, encodiert, zu wirken, ein meßbares oder erfaßbares Signal erzeugt durch das Polypeptid, das das Reportergen exprimiert. Sobald eine ausreichende Zeit zur Bildung einer erfaßbaren Antwort oder eines Signals abgelaufen ist, kann man den Betrag des erzeugten Signals bestimmen. Typischerweise wird die Antwort oder das Signal quantitativ gemessen, jedoch kann auch eine qualitative Messung für schnelle Screenigzwecke verwendet werden.
Für das Verfahren 1A kann man auch gegebenenfalls das erfaßbare Signal vergleichen mit dem Betrag des erzeugten Signals, (i) das man in Abwesenheit von jeglicher Verbindung der Formel 1 erfaßt, oder (ii) bei einem Kontakt der Probe mit anderen chemischen Verbindungen, welche die Verbindung der Formel 1 als eine chemische Verbindung identifizieren, die eine Änderung in dem erfaßbaren Signal, welches das Polypeptid erzeugt, bewirkt. Man bestimmt dann üblicherweise, ob die Verbindung der Formel 1 die Expression des Gens, das in Zusammenhang steht mit der Aufrechterhaltung oder Behandlung von einem oder mehreren Symptomen des pathologischen Zustands, spezifisch transkriptional moduliert.
Andere Aspekte des Verfahrens 1 und 1A umfassen ein Screeningverfahren, das ein getrenntes In-Kontakt-Bringen von jeder einer Vielzahl an identischen, im wesentlichen identischen oder verschiedenen Proben umfaßt, wobei jede Probe eine vorbestimmte Anzahl solcher Zellen enthält, mit einer vorbestimmten Konzentration von jeder der verschiedenen zu testenden Verbindungen der Formel 1, z.B. wo die Vielzahl an Proben mehr als ungefähr 1×10³ oder mehr als ungefähr 1×10⁴ Proben oder ungefähr 0,5–5×10⁴ Proben umfaßt. In anderen Aspekten bestimmt man die Menge an RNA durch eine quantitative Polymerasekettenreaktion. In jedem der Verfahren 1 oder 1A kann eine Verbindung der Formel 1, wie irgendeine von denen, die hierin beschrieben oder genannt werden, verwendet werden.
Die Aspekte der Erfindung umfassen ein weiteres Verfahren, "Verfahren 2", welches sich auf eine Idenfikation eines Gens konzentriert, dessen Expression moduliert wird durch einen Kandidatenbindungspartner für therapeutische Mittel für infektiöse Erkrankungen. Typischerweise ist der Bindungspartner ein Steroidrezeptor, z.B. ein Monomer, Homodimer oder Heterodimer, das SXR, CARβ, PXR, PPAR α oder RXR oder ein Homolog oder Isoform davon umfaßt. Der Steroidrezeptor ist typischerweise als ein Komplex vorhanden, der z.B. die Verbindung der Formel 1 und die DNARS des Regulatorgens umfaßt, welche der Steroidrezeptor oder ein Komplex, der den Steroidrezeptor umfaßt, erkennt und spezifisch daran bindet. Solche Komplexe können auch einen Transkriptionsfaktor umfassen, der an den Steroidrezeptor oder an Nukleinsäuresequenzen, die benachbart zu oder nahe der DNARS liegen, bindet. Beispielhafte Transkriptionsfaktoren, die vorhanden sein können, umfassen einen oder mehrere von ARA54, ARA55, ARA70, SRC-1, NF-kB, NFAT, AP1, Ets, p300, CBP, p300/CBP, p300/CPB-assoziierter Faktor, SWI/SNF und Humanhomologe von SWI/SNF, CBP, SF-1, RIP140, GRIP1 und Vpr. Im allgemeinen stellt man eine erste und eine zweite Gruppe an Zellen in vitro oder in vivo zur Verfügung und bringt die erste Gruppe an Zellen in Kontakt mit dem therapeutischen Mittel für eine infektiöse Erkrankung, bringt jedoch die zweite Gruppe an Zellen in vitro oder in vivo nicht in Kontakt mit dem therapeutischen Mittel für die infektiöse Erkrankung. Eine Rückgewinnung von RNA aus den Zellen oder eine Erzeugung von cDNA, die von der RNA abstammt, wird durch übliche Protokolle bewerkstelligt. Eine Analyse der RNA oder cDNA, die von der RNA stammt, aus der ersten und der zweiten Gruppe an Zellen identifiziert Unterschiede zwischen diesen, welche man verwenden kann zum Identifizieren eines Gens, dessen Regulation moduliert wird durch den Kandidatenbindungspartner für das therapeutische Mittel für eine infektiöse Erkrankung oder irgendeine DNARS, die mit dem Gen assoziiert ist.
Ein Aspekt des Verfahrens 2 ist eine Bestimmung der Kapazität eine Verbindung der Formel 1 für eine Modulation oder eine Beteiligung an der Modulation der Transkription eines Gens, das mit der Aufrechterhaltung oder Behandlung von einem oder mehreren Symptomen eines pathologischen Zustands assoziiert ist. Es wird erwartet, daß die Verbindungen der Formel 1 im allgemeinen eine Erhöhung der Transkription solcher Gene bewirken. Der pathologische Zustand ist typischerweise einer, der assoziiert ist mit einem infektiösen Mittel, z.B. Virus, Parasit oder Bacterium, kann jedoch auch einen Immunzustand einschließen, z.B. einen Autoimmunzustand oder eine Immunschwäche. Der pathologische Zustand kann auch eine unzureichende Immunantwort auf eine Infektion oder eine unzureichende Antwort auf einen Hyperproliferationszustand oder eine Malignität sein. Andere pathologische Zustände, auf die man das Verfahren anwenden kann, sind Entzündungszustände.
In einigen Aspekten werden die Verbindungen der Formel 1, die in dem Verfahren 2 verwendet werden, markiert. Solche Verbindungen werden hergestellt durch übliche Verfahren unter Verwendung von standardmäßigen Markierungen, wie Radiomarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen oder anderen Markierungen, wie sie hierin und in den angegebenen Referenzen beschrieben werden.
Eine Ausführungsform des Verfahrens 2 beinhaltet ein Analysieren der RNA oder der davon abstammenden cDNA durch Subtraktionshybridisierung. In dieser Ausführungsform wird die RNA oder cDNA, die erhalten werden von der ersten und zweiten Gruppe an Zellen, hybridisiert, und die resultierenden Doppelstränge werden entfernt. Dies erlaubt eine Rückgewinnung von Nukleinsäuren, welche Gene encodieren, deren Transkription durch den Kandidatenbindungspartner moduliert wird, welcher für gewöhnlich ein Steroidrezeptor ist. Man kann herkömmliche Verfahren verwenden zum Verstärken und Erhalten von Nukleinsäure- und Proteinsequenzinformationen aus den durch dieses Verfahren rückgewonnenen Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuresequenzen, die transkriptional induziert oder reprimiert werden durch die Verbindung der Formel 1, sind Kandidatenbindungspartner.
Ein transkriptional induziertes Gen wird in den Zellen der Gruppe 1, die mit der Verbindung der Formel 1 behandelt wurden, angereichert werden, während irgendein reprimiertes Gen abgereichert wird oder abwesend ist. In diesen Ausführungsformen wird die nach der Entfernung der Doppelstränge rückgewonnene RNA durch Standard-RT-PCR- oder -PCR-Protokolle amplifiziert. Diese Protokolle verwenden typischerweise spezifische Sets an zufälligen Primerpaaren, gefolgt von einer Analyse der amplifizierten Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese. Nukleinsäuren, die durch die Verbindung der Formel 1 induziert werden, werden als Banden erscheinen, üblicherweise Doppelstrang-DNA, die nicht in der Kontrolle oder dem zweiten Set an Zellen enthalten sind. Nukleinsäuren, die transkriptional reprimiert werden durch die Bindungspartner der Verbindung der Formel 1, werden abgereichert oder abwesend sein in der ersten Gruppe der Zellen. Sobald solche Genkandidaten identifiziert sind, können sie geklont und exprimiert werden, und die Kapazität der mit den Genen assoziierten DNARS zur Ausbildung eines Komplexes, der einen Kandidatenbindungspartner und eine gegebenenfalls markierte Verbindung der Formel 1 umfaßt, wird analysiert durch herkömmliche Verfahren, z.B. Gleichgewichtsdialyse, Affinitätschromatographie, unter Verwendung von z.B. der auf einer Säule immobilisierten DNARS, oder Copräzipita tion von Komplexen, welche eine gegebenenfalls markierte DNARS und Kandidatenbindungspartner umfassen, unter Verwendung von Antibindungspartner-Antikörpern. Für gewöhnlich wird eine Nukleinsäuresequenzanalyse verwendet, um Bereiche zu identifizieren, die benachbart zu den codierenden Bereichen des regulierenden Gens liegen, um beliebige mit dem Gen assoziierte DNARS zu identifizieren. Die Identität einer DNARS kann begründet sein durch die Bindung der DNARS an Komplexe, die einen Kandidatenbindungspartner umfassen, z.B. einen Steroidrezeptor, und gegebenenfalls auch eine Verbindung der Formel 1 umfassen. Die Lokalisierung und Identität der DNARS kann bewerkstelligt werden durch ein DNA-Footprinting oder andere Verfahren zur Erfassung von Bindungswechselwirkungen. Die DNARS, der Rezeptor der Verbindung der Formel 1, kann in diesen Variationen des Verfahrens 2 markiert sein.
Im allgemeinen wird die zweite Gruppe an Zellen identisch oder im wesentlichen identisch sein mit der ersten Gruppe an Zellen. In Ausführungsformen (für beide Verfahren 1 und 2), wo die Zellen "im wesentlichen identisch" sind, können oder die erste oder die zweite Gruppe an Zellen sich voneinander unterscheiden durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder mehrerer DNA-Konstrukte, welche folgendes exprimieren: (i) einen Steroidrezeptor und/oder (ii) ein einfach zu erfassendes Protein, z.B. eine β-Galactosidase, eine Peroxidase, eine Phosphatase oder eine Chloramphenicolacetyltransferase, deren transkriptionale Regulation üblicherweise durch einen Steroidrezeptor moduliert wird. In diesen Ausführungsformen wird der Unterschied zwischen der ersten und der zweiten Gruppe an Zellen verwendet, um die Analyse der biologischen Wirkungen der Verbindung der Formel 1 und des Steroidrezeptorbindungspartners zu erleichtern. Gruppen an Zellen werden als "identisch" betrachtet, wenn sie keine bekannten oder offensichtlichen morphologischen oder genetischen Unterschiede aufzeigen.
Für gewöhnlich wird die zweite Gruppe an Zellen als eine Kontrolle fungieren, und sie werden somit vor einem Erhalt der RNA oder cDNA keiner der Verbindungen der Formel 1 ausgesetzt. Für einige Ausführungsformen kann man jedoch die zweite Gruppe an Zellen einem bekannten Agonisten oder Antagonisten des Steroidrezeptorbindungspartners aussetzen. Dies ermöglicht einem einen Vergleich der Potenz der Verbindung der Formel 1 mit der Potenz des Agonisten oder Antagonisten.
In anderen Ausführungsformen kann man das Verfahren 2 modifizieren, indem man eine dritte Gruppe an Zellen zur Verfügung stellt, welche gegebenenfalls als eine unbehandelte Kontrolle verwendet wird, wenn die zweite Gruppe an Zellen mit einem Steroidrezeptoragonisten oder -antagonisten behandelt wird. In diesen Ausführungsformen wird man typischerweise den Effekt der Verbindung der Formel 1 und des Agonisten oder des Antagonisten hinsichtlich der Exprimierung eines Gens oder eines DNA-Konstrukts vergleichen. Das DNA-Konstrukt würde einen Promotor oder andere Regulatorsequenzen umfassen, welche einer transkriptionalen Modulation unterliegen, für gewöhnlich einer gesteigerten Transkription, durch die Verbindung der Formel 1 im Zusammenspiel mit dessen Bindungspartner.
Beispielhafte Säugetier- und andere Steroidrezeptoren, einschließlich Orphansteroidrezeptoren, deren Homologe, Isoforme und Cofaktoren (z.B. Corepressoren, Transkriptionsfaktoren, Genpromotorbereiche oder -sequenzen), welche diese Komplexe umfassen können, sind steroidogener Faktor-1 (SF-1), Chicken-Ovalbumin-Upstream-Promotor-Transkriptionsfaktor (COUP-TFI) und deren Säugetierhomo loge, Silencing Mediator für Retinoid- und Thyroidhormonrezeptor (SMRT) und dessen Säugetierhomologe, NF-E3, COUP-TFII und deren Säugetierhomologe, testikulärer Orphanrezeptor TR2, Thyroidhormon α1 (TR α1), Retinoid-X-Rezeptor α, TR α1/RXR α-Heterodimer, Direkt Repeat-4 Thyroidhormonantwortelement (DR4-TRE), Östrogenrezeptor (ER) Östrogenrezeptor-related α (ERRα), Östrogenrezeptorrelated β (ERRβ), Steroid-xenobiotischer Rezeptor (SXR), Hepatozytnuklearfaktor 4 (HNF-4), Hepatozytnuklearfaktor 3 (HNF-3), Leber-X-Rezeptoren (LXRs), LXRα, Östrogenrezeptor α (ERα), konstitutiver Androstanrezeptor-β (CAR-β), RXR/CAR-β-Heterodimer, Short-Heterodimer-Partner (SHP), SHP/ERα-Heterodimer, Östrogenrezeptor β, SHP/ERβ-Heterodimer, testikulärer Orphanrezeptor TR4, TR2/TR4-Heterodimer, Pregnan-X-Rezeptor (PXR) und Isoforme, Cytochrom P-450 Monooxygenase 3A4-Genpromotorbereich und Isoforme, HNF-4/Zytochrom P-450 Monooxygenase 3A4-Genpromotorbereich und Isoforme-Komplexe, HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR), HIV-2 LTR, TR2/HIV-1 LTR-Komplex, TR3/HIV-1 LTR-Komplex, TR4/HIV-1 LTR-Komplex, TR α1/TR4/HIV-1 LTR-Komplex, TR2-Isoforme (TR2-5, TR7, TR9, TR11), DAX-1, DAX-1/steroidogener akuter Regulatorproteingenpromotorbereich, RevErb, Rev-erbA α, Rev-erb β, Steroidrezeptor-Coaktivator, amplifiziert in Brustkrebs (AIB 1), p300/CREB Bindungsprotein-interagierendes Protein (p/CIP), Thyroidhormonrezeptor (TR, T3R), Thyroidhormonantwortelemente (T3REs), konstitutiver Androstanrezeptor (CAR), Xenopus xSRC-3 und Säugetier-(Human)-Homologe, TAK1, TAK1/Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor α (PPARα)-Komplex, PPARα/RXRα-Komplex, TAK-1/RIP-140-Komplex, Retinoinsäurerezeptor (RAR), RARβ, TR4/RXRE-Komplex, SF-1/Steroidhydroxylasegenpromotorbereich, SF-1/Oxytocingenpromotorbereich, SF-1/ACTH-Rezeptorgenpromotorbereich, Ratten-Ear-2- und Säugetierhomologe, Human-TR3-Orphanrezeptor (TR3), RLD-1, OR-1, Androgenrezeptor, Glucocorticoidrezeptor, Östrogenrezeptor, Proge steronrezeptor, Mineralcorticoidrezeptor, OR1, OR1/RXRα-Komplex, TIF-1, CBP/P300-Komplex, TRIP1/SUG-1-Komplex, RP-140, SRC1α/P160-Komplex und TIF-2/GRIP-1-Komplex, RAR/N-CoR/RIP13-Komplex, RAR/SMRT/TRAC-2-Komplex, und die DNARS 5' AGGTCANAGGTCA 3' oder 5' TGCACGTCA 3'. Einer dieser Komplexe kann in den Verfahren der Erfindung eingeschlossen sein, wenn z.B. diese in zellfreien Assays durchgeführt werden. Eine Bildung dieser Komplexe in Zellen wird erleichtert, indem in die Zellen ein DNA-Konstrukt eingebracht wird, das eines oder mehrere dieser Proteine exprimiert, z.B. Säugetier- oder Hefezellen, welche ein stabiles DNA-Konstrukt oder ein Konstrukt, das für transiente Transfektionsassays verwendet wird, enthalten. Verfahren zur Durchführung von Assays oder zum Induzieren von biologischen Antworten in vitro oder in vivo unter Verwendung der Verbindungen der Formel 1 als Agonisten, Antagonisten oder als Referenzstandards sind im wesentlichen wie beschrieben, siehe z.B. US-Patente der Nummern 5080139, 5696133, 5932431, 5932555, 59355968, 5945279, 5945404, 5945410, 5945412, 5945448, 5952319, 5952371, 5955632, 5958710, 5958892, 5962443; Internationale Veröffentlichungen der Nummern WO 96/19458, WO 99/41257, WO 99/45930. Die Komplexe oder Assaysysteme, welche eine Verbindung der Formel 1 umfassen und welche bei der praktischen Durchführung dieser Verfahren verwendet werden, sind als Aspekte der Erfindung umfaßt.
Die Verbindung der Formel 1 wechselwirkt typischerweise mit einem oder mehreren biologischen Liganden, um eine biologische Antwort zu bewirken. Zur Erleichterung der Identifikation von Kandidatenbindungspartnern für die Verbindung der Formel 1 kann man eine radiomarkierte Verbindung der Formel 1 verwenden, die mit einem Träger verknüpft ist, für gewöhnlich einem festen Träger, als ein Mittel zum Rückgewinnen der Kandidatenbindungspartner. Die Verbindung der Formel 1 kann über z.B. die 3-, 7-, 16- oder 17-Position des Steroidkerns mit dem Träger verknüpft sein. Verknüpfungsmittel sind für solche Anwendungen bekannt und umfassen homobifunktionale und heterobifunktionale Mittel, von denen viele im Handel erhältlich sind. Der Linker, den man verwendet, wird typischerweise ungefähr 2–20 verknüpfte Atome umfassen. Die verknüpften Atome umfassen für gewöhnlich meistens Kohlenstoff mit einem, zwei oder drei Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatomen, welche ein oder mehrere Kohlenstoffatome ersetzen. Man kann eine cDNA-Expressionsbibliothek verwenden, die man für geeignete Zellen oder Gewebe als eine Quelle für Kandidatenbindungspartner erstellt hat. Die Zellen oder Gewebe können erhalten werden von einem Säugetier- oder einem Wirbeltierwirt, z.B. Mensch, Maus, Vogel, Affe, oder von anderen Quellen, z.B. Insekten (z.B. Drosophila), anderen wirbellosen Tieren (z.B. Hefe, Bakterien, Mycoplasma sp., Plasmodium sp., Tetrahymena sp., C. elegans) oder anderen Organismengruppen oder -spezies, die hierin oder in den angegebenen Referenzen aufgelistet sind. Geeignete Gewebe umfassen Haut, Lebergewebe oder -zellen, einschließlich Hepatozyten und Kupferzellen, Fibrozyten, Monozyten, dendritische Zellen, Nierenzellen und -gewebe, Hirnzellen oder -gewebe oder andere Zellen oder Gewebe des zentralen Nervensystems, einschließlich Neuronen, Astrozyten und Glialzellen, Periphernervensystemgewebe, Lunge, Darm, Plazenta, Brust, Eierstöcke, Testes, Muskel, einschließlich Herz oder Myozytgewebe oder -zellen, weiße Blutzellen, einschließlich T-Zellen, B-Zellen, Knochenmarkzellen und -gewebe, Lymphgewebe oder -fluide und Chondrozyten.
Typischerweise wird ein Kandidatenbindungspartner, den man von einer nichtmenschlichen Quelle isoliert, ein Humanhomolog besitzen, das ähnliche Bindungseigenschaften für die Verbindung der Formel 1 besitzt. Nichthumane Kandidatenbindungspartner können somit verwendet werden, um die Rückgewinnung der Humanhomologen zu erleichtern, z.B. durch Herstellen eines Antiserums zum Ausfällen des Humanhomologen aus einer Lösung, welche das Humanhomologe umfaßt, oder durch Vergleich der Sequenz des Nichthuman-Kandidatenbindungspartners mit bekannten Humangensequenzen. Sobald eine Quelle des Kandidatenbindungspartners erhalten wird, kann sie in Kontakt gebracht werden mit einer markierten Verbindung der Formel 1, für gewöhnlich radiomarkiert mit z.B. ¹⁴C oder ³H, und Komplexe, welche die markierte Verbindung der Formel und die Kandidatenbindungspartner umfassen, werden rückgewonnen unter Verwendung von z.B. Affinitätschromatographie oder Antikörperpräzipitationsverfahren. Die Rückgewinnung des Komplexes stellt eine Quelle von zumindest teilweise gereinigten Kandidatenbindungspartnern zur Verfügung, d.h. der Kandidatenbindungspartner ist angereichert, z.B. mindestens 10fach angereichert oder mindestens 100fach angereichert oder mindestens 500fach angereichert, im Vergleich mit dessen Menge in dem ursprünglichen Kandidatenbindungspartnerquellenmaterial.
Andere Aspekte umfassen ein Verfahren zur Bestimmung einer biologischen Aktivität der Verbindung der Formel 1, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung(en) der Formel 1 mit einer Zelle oder Zellpopulation; (b) Messen von einem oder mehreren von (i) einem Komplex zwischen einem Bindungspartner und der Verbindung der Formel 1, (ii) einer Proliferation der Zelle oder Zellpopulation, (iii) einer Differenzierung der Zelle oder Zellpopulation, (iv) einer Aktivität einer Proteinkinase C, (v) einem Niveau einer Phosphorylierung eines Proteinkinase C-Substrats, (vi) einer Transkription von einem oder mehreren Zielgenen, (vii) einer Inhibierung der Zellantwort auf Steroide, z.B. Glucocorticoide, (viii) einer Inhibierung einer Steroid-induzierten Transkription, z.B. Glucocorticoide, Geschlechtssteroide oder (ix) einer Inhibierung einer HIV LTR-angetriebenen Transkription; und (c) gegebenenfalls Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Ergebnisses mit einer geeigneten Kontrolle. Aspekte dieser Ausführungsform umfassen (i) das Verfahren, wobei der Bindungspartner ein Steroidrezeptor, ein Transkriptionsfaktor oder eine DNARS ist, (ii) das Verfahren, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität der Verbindung der Formel 1 auf eine Replikation oder zytopathische Effekte in Zusammenhang mit einem Retrovirus, einem Hepatitisvirus oder einem Protozoenparasiten ist, (iii) das Verfahren, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität der Verbindung der Formel 1 auf eine Replikation, zytopathische Effekte im Zusammenhang mit dem Retrovirus, dem Hepatititsvirus oder dem Protozoenparasiten ist, oder die bestimmte biologische Aktivität ein Metabolismus (Assay durch ³H-Thymidin-Aufnahme oder andere Assays, wie sie hierin angegeben sind oder auf welche hierin verwiesen wird) einer Zelle oder Zellpopulation ist, umfassend NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Basophile, Eosinophile, dendritische Zellen, Synoviozyten, Mikroglialzellen, Fibrozyten, transformierte (neoplastische) Zellen, virusinfizierte Zellen, bakterieninfizierte Zellen oder parasiteninfizierte Zellen, und (iv) das Verfahren, wobei das Zielgen ein Virusgen, ein Bakteriengen, ein Parasitengen, ein mit Krebs assoziiertes Gen, z.B. wobei das Virusgen ein DNA- oder ein RNA-Polymerasegen ist, ein Reverse Transcriptase-Gen, ein Envelope-Gen, ein Proteasegen oder ein mit einer viralen Nukleinsäurereplikation assoziiertes Gen oder ein virales Strukturgen ist.
Eine Ausführungsform ist ein Verfahren, das ein In-Kontakt-Bringen eines Komplexes, der einen Steroidrezeptor und eine Verbindung der Formel 1 umfaßt, mit einem Transaktivatorprotein umfaßt, wobei ein Komplex, der ein Steroidrezeptorprotein, die Verbindung der Formel 1 und das Transaktivatorprotein umfaßt, gebildet wird, wobei das Transaktivatorprotein (1) ein Zell- oder Gewebeextrakt ist (z.B. Kerne, ein Kerne enthaltendes Lysat oder ein Lysat ohne Kerne von einer oder mehreren Zellen oder Geweben), (2) ein teilweise gereinigter oder ein gereinigter Zell- oder Gewebeextrakt ist, (3) eine oder mehrere Zellen in Gewebekultur ist, oder (4) eine oder mehrere Zellen in einem Lebewesen ist, wobei jede von (1)–(4) gegebenenfalls ein Zielgen (natives Gen oder eingebracht durch standardmäßige Genmanipulationstechniken) umfaßt, dessen Niveau der Expression gegebenenfalls assayed wird, nachdem der Komplex gebildet ist. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Transaktivatorprotein teilweise gereinigt oder gereinigt und ist in dem Zell- oder Gewebeextrakt oder dem teilweise gereinigten oder gereinigten Zell- oder Gewebeextrakt. Das Transaktivatorprotein kann TIF-1, CBP/P300, TRIP1/SUG-1, RIP-140, SCR1α/P160 oder TIF-2/GRIP-1 sein. In jeder dieser Ausführungsformen kann der Komplex, der das Steroidrezeptorprotein, die Verbindung der Formel 1 und das Transaktivatorprotein umfaßt, eine Transkription des Zielgens verstärken oder verringern, im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle (z.B. einer Kontrolle unter denselben Bedingungen, jedoch ohne irgendeine zugegegeben Verbindung, die der Verbindung der Formel 1 entspricht, oder wobei eine andere Verbindung (z.B. ein Steroid, das dafür bekannt ist, daß es an den Steroidrezeptor bindet) als eine Benchmark oder ein Referenzstandard verwendet wird, demgegenüber eine veränderte Zielgenexpression gemessen wird). In diesen Verfahren kann das Zielgen ein pathogenes Gen (z.B. Virus, Bacterium, Parasit, Pilz, Hefe) oder ein Gen, das mit einem pathologischen Zustand (Autoimmunität, Entzündung, Hyperproliferation) assoziiert ist, sein.
Die Verbindungen der Formel 1 sind geeignet für eine Verwendung in einigen beschriebenen Verfahren, die Steroide verwenden, um biologische Aktivitäten in Zellen oder Geweben zu modulieren. Zum Beispiel kann eine Verbindung der Formel 1 verwendet werden zur selektiven Interaktion mit spezifischen Steroidrezeptoren oder einem Steroidorphanrezeptor oder deren Untertypen, die assoziiert sind mit einem oder mehreren pathologischen Zuständen in einem Lebewesen, im wesentlichen wie in dem US-Patent 5668175 beschrieben. In diesen Anwendungen kann die Verbindung der Formel 1 als ein Ligand für den Rezeptor fungieren, um eine abnormale Expression eines Genprodukts zu modulieren, das mit dem pathologischen Zustand korreliert (ein auf ein Steroidhormon reagierender Krankheitszustand). Solche Gene werden normalerweise durch Steroidhormone reguliert. In anderen Anwendungen kann man die Verbindungen der Formel 1 für ein Screenen von Liganden, welche an einen Steroidrezeptor oder Steroidorphanrezeptor binden, und einem oder mehreren Transkriptionsfaktoren (oder Cofaktoren) wie AP-1 und/oder mit einer DNA- oder mehreren DNA-Sequenzen, verwenden, wie im wesentlichen im US-Patent 5643720 beschrieben. Gleichermaßen können die Verbindungen der Formel 1 im wesentlichen wie in den US-Patenten 5597693, 5639598, 5780220, 5863733 und 5869337 beschrieben verwendet werden. In einigen dieser Ausführungsformen ist die Verbindung der Formel 1 markiert, um deren Verwendung zu vereinfachen. Geeignete Markierungen sind auf diesem Gebiet bekannt und umfassen Radiomarkierungen (z.B. ³H, ¹⁴C ³²P ³⁵S ¹³¹I, ⁹⁹Tc und andere Halogenisotope), fluoreszierende Gruppierungen (z.b. Fluorescein, Resorufin, Texasrot, Rhodamin, BODIPY, Arylsulfonatcyanine), chemilumineszierende Gruppierungen (z.B. Acridiniumester), Metallchelatoren, Biotin, Avadin, Peptid-Tags (z.B. Histidinhexamer, ein durch monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erkennendes Peptid), kovalent vernetzende Gruppierungen. Man stellt die markierten Verbindungen gemäß bekannten Verfahren her.
Verfahren, die geeignet sind für ein Messen der biologischen Wirkungen verschiedener Verbindungen, z.B. Aktivierung, auf Immunsystemzellen (z.B. NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophage, Neutrophile, Eosinophile, dendritische Zellen, Synoviocyten, Mikroglialzellen, Fibrozyten) wurden beschrieben in z.B. Jakob et al., J. Immunol., 1998, 161:3042–3049, Pierson et al., Blood, 1996, 87:180–189, Cash et al., Clin. Exp. Immunol., 1994, 98:313–318, Monick et al., J. Immunol., 1999, 162:3005-3012, Rosen et al., Infect. Immun., 1999, 67:1180–1186, Grunfeld et al., J. Lipid Res., 1999, 40:245–252, Singh et al., Immunol. Cell Biol., 1998, 76:513–519, Chesney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:6307–6312, Verhasselt et al., J. Immunol., 1999, 162:2569–2574, Avice et al., J. Immunol., 1999, 162:2748–2753, Cella et al., J. Exp. Med., 1999, 189:821–829, Rutalt et al., Free Radical Biol. Med., 1999, 26:232–238, Akbari et al., J. Exp. Med., 1999, 189:169–178, Hryhorenko et al., Immunopharmacology, 1998, 40:231–240, Fernvik et al., Inflamm. Res., 1999, 48 : 28–35, Cooper et al., J. Infect. Dis., 1999, 179:738–742, Betsuyaku et al., J. Clin. Invest., 1999, 103:825–832, Brown et al., Toxicol. Sci., 1998, 46:308–316, Sibelius et al., Infect. Immunol., 1999, 67:1125–1130. Die Verwendung der Verbindungen der Formel 1 in solchen Verfahren sind Aspekte der Erfindung und sie ermöglichen z.B, eine Messung der biologischen Wirkungen der Verbindungen der Formel 1 auf Gene, deren Expression reguliert wird durch die Verbindung der Formel 1 und den Steroidrezeptor.
Ausführungsformen umfassen irgendeines der oben beschriebenen Verfahren, z.B. Verfahren 1, wobei die Zellen oder das biologische System NK-Zellen, Phagozyten, Mono zyten, Makrophage, Neutrophile, Eosinophile, dendritische Zellen, Synoviozyten, Mikroglialzellen, Glialzellen, Fibrozyten oder Hepatozyten, die gegebenenfalls ein DNA-Konstrukt umfassen, das einen oder zwei geklone Steroidrezeptoren exprimiert, umfassen. Das Verfahren analysiert optional den Effekt einer Verbindung der Formel 1 auf die Zellen im Vergleich mit den Kontrollen. Die Kontrollen umfassen die Verwendung eines bekannten Agonisten oder Antagonisten für den Steroidrezeptor oder den Vergleich von Zellen, die einer Verbindung der Formel 1 ausgesetzt werden, mit Kontrollzellen (für gewöhnlich derselbe Zelltypus wie die behandelten Zellen), die nicht der Verbindung der Formel 1 ausgesetzt wurden. Eine Antwort, z.B. Aktivierung des Steroidrezeptors, kann durch bekannte Assays im Vergleich zu den Kontrollen gemessen werden.
Die Verbindung der Formel 1 wird in einigen Fällen eine Transkription von einem oder mehreren Genen in der Zelle modulieren (erhöhen oder verringern). In anderen Fällen wird die Verbindung der Formel 1 eine Lysosombewegung in einer oder mehreren der folgenden Zellen des Lebewesens verstärken: NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, dendritischen Zellen, Synoviozyten, Mikroglialzellen oder Fibrozyten. Solche Effekte werden typischerweise direkt oder indirekt durch Steroidrezeptoren, welche unter Modulation einer Gentranskription agieren, mediiert, z.B. bewirken eine verstärkte Proteinkinase-C (PKC)-Aktivität in den Zellen, die im Assay verwendet werden, z.B. PKCα, PKCβ, PKCγ oder PKCζ.
Andere verwandte Ausführungsformen sind Zusammensetzungen, umfassend einen teilweise gereinigten oder einen gereinigten Komplex, umfassend eine Verbindung der Formel 1 und einen Steroidrezeptor, ein Serumsteroidbindungsprotein (z.B. Humanserumalbumin, α1-Säureglykopro tein, Geschlechtshormon-bindendes Globulin, Testosteronbindendes Globulin, Corticosteroid-bindendes Globulin, Androgen-bindendes Protein (Ratte) oder einen anderen Bindungspartner, z.B. Transkriptionsfaktor oder DNARS. Ein Aspekt dieser Zusammensetzungen umfaßt ein Produkt, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens der teilweise gereinigten oder der gereinigten Zusammensetzung mit einer oder mehreren Zellen, einem oder mehreren Geweben, Plasma oder Blut.
Eine andere Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung einer biologischen Aktivität einer Verbindung der Formel 1, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung(en) der Formel 1 mit einer Zelle oder einer Zellpopulation; (b) Messen von einem oder mehreren von (i) einem Komplex zwischen einem Bindungspartner und der Verbindung der Formel 1, (ii) einer Proliferation der Zelle oder Zellpopulation, (iii) einer Differenzierung der Zelle oder Zellpopulation, (iv) einer Aktivität einer Proteinkinase (C), (v) einem Niveau der Phosphorylierung eines Proteinkinase-(C)-Substrats, (vi) einer Transkription von einem oder mehreren Zielgenen, (vii) einer Inhibierung der zellulären Antwort auf Steroide, z.B. Glucocorticoide, (viii) einer Inhibierung einer Steroidinduzierten Transkription, z.B. Glucocorticoide, Geschlechtssteroide, oder (ix) einer Inhibierung von HIV-LTR-getriebener Transkription; und (c) gegebenenfalls Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Ergebnisses mit einer geeigneten Kontrolle. Aspekte dieser Ausführungsform umfassen (i) das Verfahren, wobei der Bindungspartner ein Steroidrezeptor, ein Transkriptionsfaktor oder eine DNARS ist, (ii) das Verfahren, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität der Verbindung der Formel 1 für eine Replikation oder zytopathische Effekte im Zusammenhang mit einem Retrovirus, einem Hepatitisvirus oder einem Protozoenparasiten ist, (iii) das Verfahren, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität der Verbindung der Formel 1 für eine Replikation, zytopathische Effekte im Zusammenhang mit dem Retrovirus, dem Hepatitisvirus oder dem Protozoenparasiten ist oder die bestimmte biologische Aktivität ein Metabolismus (Assay durch ³H-Thymidin-Aufnahme oder ein anderer Assay, auf den wie hierin verwiesen wird oder der wie hierin beschrieben ist) einer Zelle oder Zellpopulation ist, umfassend NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Basophile, Eosinophile, dendritische Zellen, Synoviozyten, Mikroglialzellen, Fibrozyten, transformierte (neoplastische) Zellen, virusinfizierte Zellen, bakterieninfizierte Zellen oder parasiteninfizierte Zellen, und (iv) das Verfahren, wobei das Zielgen ein Virusgen, ein bakterielles Gen, ein Parasitengen, ein mit Krebs assoziiertes Gen ist, z.B. wobei das Virusgen ein DNA- oder ein RNA-Polymerasegen, ein reverses Transkriptasegen, ein Envelope-Gen, ein Proteasegen oder ein Gen, das assoziiert ist mit einer viralen Nukleinsäurereplikation, oder ein virales Strukturgen ist.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren, umfassend ein In-Kontakt-Bringen eines Komplexes, der einen Steroidrezeptor und eine Verbindung der Formel 1 umfaßt, mit einem Transaktivatorprotein, wobei sich ein Komplex bildet, der das Steroidrezeptorprotein, die Verbindung der Formel 1 und das Transaktivatorprotein umfaßt, wobei das Transaktivatorprotein (1) ein Zell- oder Gewebeextrakt ist (z.B. Kerne, Lysat, das Kerne enthält, oder Lysat ohne Kerne aus einer oder mehreren Zellen oder Geweben), (2) ein teilweise gereinigter oder gereinigter Zell- oder Gewebeextrakt ist, (3) eine oder mehrere Zellen in Gewebekultur ist, oder (4) eine oder mehrere Zellen in einem Lebewesen ist, wobei jede von (1)-(4) gegebenenfalls ein Zielgen (natives Gen oder eingeführt durch standardmäßige Genmanipulationstechniken) ist, dessen Expressionsniveau gegebenenfalls assayed wird, nachdem der Komplex gebildet ist. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Transaktivatorprotein teilweise gereinigt oder gereinigt und ist in dem Zell- oder Gewebeextrakt oder dem teilweise gereinigten oder gereinigten Zell- oder Gewebeextrakt enthalten. Das Transaktivatorprotein kann TIF-1, CBP/P300, TRIP1/SUG-1, RIP-140, SRC1α /P160 oder TIF-2/GRIP-1 sein. In jeder dieser Ausführungsformen kann der Komplex, der das Steroidrezeptorprotein, die Verbindung der Formel 1 und das Transaktivatorprotein umfaßt, eine Transkription des Zielgens erhöhen oder verringern, im Vergleich mit einer geeigneten Kontrolle (z.B. einer Kontrolle unter denselben Bedingungen, jedoch ohne irgendeine zugegebene Verbindung, die der Verbindung der Formel 1 entspricht, oder wo eine andere Verbindung (z.B. ein Steroid, von dem bekannt ist, das es an den Steroidrezeptor bindet) als eine Benchmark verwendet wird, gegenüber der eine veränderte Zielgenexpression gemessen wird). In diesen Verfahren kann das Zielgen ein pathogenes Gen sein (z.B. Virus, Bacterium, Parasit, Pilz, Hefe) oder ein Gen, das mit einem pathologischen Zustand (Autoimmunität, Entzündung, Hyperproliferation) assoziiert ist.
Es wird erwartet, daß die biologischen Effekte, die während der Durchführung der hierin beschriebenen Verfahren beobachtet werden, üblicherweise die Bildung von Komplexen einschließen, die zwei oder mehrere Komponenten enthalten. Diese Komponenten können einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren oder Coregulatoren oder Corepressoren einer Transkription und deren Homologe und Isoforme einschließen. Diese Faktoren und Komplexe, welche diese einschließen, umfassen Mitglieder der Steroidrezeptorcoaktivator-1-Familie (SRC-1, SRC-1/Serumresponsefaktor), NF-κB, NFAT, p300, CBP, p300/CBP, p300/CPB-assoziierter Faktor, SWI/SNF und humane oder andere Homologe, BRG-1, OCT-1/OAF, AP, Ets, Androgenrezeptor-assoziiertes Protein 54 (ARA54), Androgenrezeptor-assoziiertes Protein 55 (ARA55), Androgenrezeptor-assoziiertes Protein 70 (ARA70), RAC3/ACTR, CREB-Bindungsprotein (CPB), SRC-1α, Rezeptor-interacting Protein-140 (RIP-140), Transkriptionsfaktoraktivatorprotein-1, Aktivierungsfunktion-2, Glucocorticoidrezeptor-interacting Protein-1 (GRIP-1), Rezeptor-interacting Protein-160 (RIP-160), Suppressor von gal4D-Läsionen (SUG-1), Transcription intermediary Faktor-1 (TIF-1), Transcription intermediary Faktor-2 (TIF-2), SMRT, N-CoR, N-CoA-1, p/CIP, stroidogenischer Faktor-1 (SF-1), p65 (RelA) und Vpr, das durch das Human Immunodeficiency-Virus encodiert ist, und deren Isoforme und Homologe. Einer oder mehrere dieser Faktoren kann in Komplexen vorhanden sein, welche eine Verbindung der Formel 1 und einen Steroidrezeptor umfassen, wie SXR, PPARα, CAR-β, RXR und/oder PXR.
In einer verwandten Ausführungsform wird eine Verbindung der Formel 1 verwendet, um einen zytostatischen Effekt auf Säugetierzellen in vitro auszuüben. Typischerweise sind solche Zellen Lymphoidzellen, z.B. T-Zellpopulationen aus z.B. Blut oder Organen, die reich an Lymphoidzellen sind (z.B. Milz, Lymphgewebe oder -knoten), oder transformierte T-Zellinien. Eine derartige Aktivität stellt eine Abschätzung der Potenz der Verbindungen der Formel 1 im Hinblick auf die Mediation immunologischer Effekte wie eine Erhöhung der Th1-Immunantworten oder eine Unterdrückung einer Expression von einem oder mehreren Th2-assoziierten Zytokinen zur Verfügung. Somit umfaßt ein Verfahren der Erfindung (a) In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel 1 und Lymphoidzellen in vitro, (b) Bestimmen des Grads der Zytostase, den die Verbindung ausübt, um eine zytostatische Verbindung zu identifizieren, und (c) gegebenenfalls Verabreichen der zytostatischen Verbindung an ein Lebewesen mit Immunsuppression, um die Wirkung der Verbindung auf eine oder mehrere Immunantworten des Lebewesens, wie hierin beschrieben, zu bestimmen, z.B. eine verstärkte Th1-Zytokin- oder Zellantwort oder eine verringerte Th2-assoziierte Zytokinexpression. Typischerweise werden solche Verfahren durchgeführt unter Verwendung eines Bereichs der Konzentrationen der Verbindung der Formel 1 und geeigneter Kontrollen, wie eines bekannten zytostatischen Mittels oder einer Blindprobe, welche ein Lösungsmittel enthält, das frei von der Verbindung der Formel 1 ist. Die Inhibierung einer Zellproliferation wird mittels Standardverfahren gemessen. Verfahren zur Messung der zytostatischen Wirkungen der Verbindungen umfassen ein Messen von Zahlen von lebensfähigen Zellen in behandelten und unbehandelten Kulturen oder durch Messen einer DNA-Synthese unter Verwendung von z.B. einem Einbringen von ³H-Thymidin in DNA in behandelten und nichtbehandelten Kulturen. Typische Bereiche der Konzentrationen der Verbindung der Formel 1 in dem Zellwachstumsmedium liegen bei ungefähr 0,1 μM bis ungefähr 100 μM, wobei ungefähr 4–6 verschiedene Konzentrationen an Verbindungen mit einer festen Anzahl an Zellen (z.B. ungefähr 0,4 × 10⁵ bis ungefähr 5 × 10⁵) verwendet werden. Die Verbindung der Formel 1 wird in Kontakt belassen mit den Zellen in der Gewebekultur während einer ausreichenden Zeit, um einen Zytostase zu beobachten, z.B. ungefähr 16 Stunden bis ungefähr 6 Tage, typischerweise ungefähr 24–72 Stunden. In diesen Ausführungsformen kann man gegebenenfalls eine Modulation einer biologischen Aktivität eines Steroidrezeptors screenen, z.B. eine Aktivierung von PPAR α, welche assoziiert sein kann mit der Zytostase der induzierten Verbindung.
In einigen Anwendungen scheint es, daß die Verbindungen) der Formel 1 eine Verbesserung von einer oder mehreren der Symptome, die assoziiert sind mit einer Infektion oder einem Zustand, mit sich bringen. Zum Beispiel zeigt eine Behandlung eines Lebewesens, das eine Immunsuppression aufweist, z.B. von einer Retrovirusinfektion, Krebs-Chemotherapie oder einem anderen Grund, im allgemeinen eine Verbesserung von einem oder mehreren damit zusammenhängenden Symptomen wie Gewichtsverlust, Fieber, Anämie, Müdigkeit oder verringerten Infektionssymptomen, die in Zusammenhang stehen mit einer zweiten Infektion, z.B. HSV-1, HSV-2, Papilloma, Humanzytomegalovirus ("CMV"), Pneumocystis (z.B. P. carinii) oder Candida (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis)-Infektionen. Die Verbindungen der Formel 1 sind auch brauchbar, um eine Erholung des Immunsystems zu erleichtern bei autologen Knochenmarktransplantations- oder Stammzellentransplantationssituationen. In einigen Ausführungsformen werden die Verbindungen der Formel 1 als eine nichtwäßrige, flüssige Formulierung, wie sie hierin beschrieben wird, verabreicht, oder werden die Verbindungen der Formel 1 gemäß irgendeinem der intermittierenden Dosierungsprotokolle, wie sie hierin beschrieben werden, unter Verwendung einer festen oder flüssigen Formulierung verabreicht. In dem Fall eines Lebewesens, das eine retrovirale Infektion besitzt, die Symptome aufweist, welche eines oder mehrere der folgenden einschließen, einen relativ geringen CD4-Count (z.B. ungefähr 10–200, üblicherweise ungefähr 20–100), eine oder mehrere zusätzliche pathogene Infektionen (HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-8, CMV, HCV, a HPV, P. carinii- oder Candida-Infektion) und eine oder mehrere von einer Anämie, Müdigkeit, einem Kaposi-Sarkom, Fieber oder unfreiwilligem Gewichtsverlust (mindestens ungefähr 5 % an Körpergewicht), resultiert eine Verabreichung von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 mg/kg/Tag (für gewöhnlich ungefähr 0,4 bis ungefähr 5 mg/kg/Tag) einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 1 an das Lebewesen typischerweise in einer merklichen Verbesserung von einem oder mehreren der Symptome innerhalb von ungefähr 1–4 Wochen. In anderen Ausführungsformen wird die Verbindung der Formel 1 einem Lebewesen verabreicht, das einen Zustand aufweist, der scheinbar mit einer viralen Infektion assoziiert ist, z.B. Pneumonia oder Retinitis, in Assoziation mit CMV, Nasopharynxkarzinom oder oraler Haarleukoplakie mit Epstein-Barr-Virus, progressiver Panenzephalitis oder Diabetes, im Zusammenhang mit einem Rötelvirus, oder aplastischer Crisis bei hämolytischer Anämie, im Zusammenhang mit Parvovirus 19.
In einer beispielhaften Ausführungsform werden menschliche Patienten, die mit HCV infiziert sind, mit einer wäßrigen isotonischen α-Cyclodextrin- oder β-Cyclodextrin-Formulierung, die ungefähr 20 mg/ml an brEA-Hemihydrat enthält, dosiert. Die Formulierung wird intravenös in einer einzelnen Tagesdosis oder zwei Unterdosen pro Tag verabreicht. Die Patienten werden dosiert mit 1 bis 10 mg/kg/Tag während 4 bis 10 Tagen, gefolgt von 5 bis 30 Tagen ohne Dosierung, gefolgt von einer erneuten Dosierung mit der Cyclodextrinformulierung während 4 bis 10 Tagen. Die Dosierungstherapie wird einmal, zweimal oder mehrmals wiederholt. Während der Behandlung werden klinische Marker für eine HCV-Infektion verfolgt, z.B. virale Nukleinsäure im Blut oder Plasma, Leberenzymniveaus im Blut oder Plasma (z.B. AST/SGOT, ALT/SGPT, Alkaliphosphatase). Für diese Patienten wird gegebenenfalls eine Standard-anti-HCV-Behandlung, z.B. Interferon und/oder Ribavirin, entsprechend den Empfehlungen des Arztes des Patienten und mit der wissentlichen Zustimmung des Patienten gestartet oder fortgeführt. In einigen dieser Ausführungsformen wird eine oder werden mehrere Verbindungen der Formel 1 kontinuierlich täglich als eine Komponente in einer oralen oder parenteralen Zusammensetzung oder Formulierung verabreicht, z.B. für eine Verbin dung der Formel 1, welche als solches eine neue Verbindung ist. Gegebenenfalls wird auch BrEA-Hemihydrat systemisch verabreicht unter Verwendung von z.B. der Formulierung aus Beispiel 1, um 1–5 mg/kg/Tag jeden zweiten Tag während ungefähr 1 bis 4 Monaten zuzuführen, oder einer oralen Formulierung, um ungefähr 5–40 mg/kg/Tag jeden zweiten Tag während ungefähr 1 bis 4 Monaten zuzuführen.
In irgendeiner der hierin offenbarten Ausführungsformen kann man gegebenenfalls eine zusätzliche therapeutische Behandlung zusammen mit, d.h. vor, während oder nach, einer Verabreichung von einer oder mehreren Verbindungen der Formel 1 an ein oder mehrere Lebewesen verabreichen. Zum Beispiel können bei Lebewesen, welche eine virale oder parasitäre Infektion besitzen und einer Verabreichung einer Verbindung der Formel 1 unterliegen, auch andere Behandlungen verabreicht werden, z.B. Nukleosidanaloge für virale Infektionen oder Chlorochin für Malaria. Solche zusätzlichen Behandlungen werden typischerweise Standardtherapien für den pathologischen Zustand des Lebewesens einschließen, jedoch können sie auch experimentelle oder andere Behandlungen einschließen. Zum Beispiel kann man gleichzeitig Vitamine (Multivitamine, individuelle Vitamine), Antioxidationsmittel oder andere Mittel (Vitamin E, Allopurinol), Nahrungsergänzungsstoffe (flüssiges Protein oder Kohlenhydratzubereitungen) oder andere Therapien verabreichen, wenn dies der medizinische Zustand des Patienten rechtfertigt und der Arzt des Patienten empfiehlt. Jegliche dieser zusätzlichen Behandlungen kann gekoppelt sein mit der Verabreichung von irgendeiner der Verbindungen der Formel 1, z.B. BrEA-Hemihydrat, einem Ester, Carbamat, Carbonat oder einer Aminosäure oder eines Peptidkonjugats davon, in irgendeiner der hierin beschriebenen Ausführungsformen.
Solche zusätzlichen Behandlungen sind dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet offensichtlich. Solche Behandlungen werden ausgewählt auf Basis des zu behandelnden Zustands, von Kreuzreaktivitäten von Bestandteilen und pharmakologischen Eigenschaften der Kombination. Bei einer Behandlung einer retroviralen Infektion in einem Menschen oder einem anderen Lebewesen werden zum Beispiel Verbindungen der Formel 1 mit einem oder mehreren reversen Transkriptaseinhibitoren, Proteaseinhibitoren, Antibiotika oder Schmerzmitteln kombiniert. Geeignete Verbindungen der Formel 1 umfassen solche, die z.B. beschrieben werden in den Verbindungsgruppen 1 bis 42-25-20-6 und an anderen Orten hierin. Beispielhafte Inhibitoren der reversen Transkriptase sind AZT, 3TC, D4T, ddl, ddC, Adefovirdipivoxil, 9-[2-(R)-[[bis[[Isopropoxycarbonyl)oxy]methoxy]phosphinoyl]methoxy ]propyl]adenin, (R)-9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl]adenin und Adefovir. Beispielhafte Proteaseinhibitoren sind Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir, Crixivan und Sequanavir. Fusionsinhibitoren können ebenfalls verwendet werden, z.B. HIV-Fusionsinhibitoren. Bei einer Behandlung von viralen Infektionen des Atemsystems oder anderer Systeme, z.B. Hepatitis-C-Virus ("HCV") oder einer Influenzavirusinfektion (z.B. Influenza A oder B), werden die Zusammensetzungen der Erfindung gegebenenfalls zusammen mit antiviralen Mitteln (wie γ-Interferon, Amantidin, Rimantadin, Ribavirin oder den Verbindungen, die offenbart sind in den US-Patenten 5763483 (insbesondere die in den Ansprüchen 1 und 2 aufgeführten Verbindungen) und 5866601), Mucolytica, Expektoranzien, Bronchodilatoren, Antibiotika, Fiebermittel oder Schmerzmittel verwendet.
In einigen Ausführungsformen wird die Verbindugn der Formel 1 einem Lebewesen verabreicht, das eine parasitäre oder bakterielle Infektion besitzt, um den Fortschritt der Infektion zu verlangsamen, mit einer Replikation oder Entwicklung des infektiösen Mittels wechselzuwirken oder eines oder mehrere der damit zusammenhängenden Symptome zu lindern, z.B. Gewichtsverlust, Anämie oder sekundäre Infektionen. Parasiten sind Malariaparasiten, Schlafkrankheitsparasiten und Parasiten, die mit gastrointestinalen Infektionen in Verbindung stehen. Parasiten und Bakterien schließen Spezies, Gruppen, Genotypen, Stämme oder Isolate von gastroentestinalen Helminthen, Microsporidia, Isospora, Cryptosporidia (Cryptosporidium parvum), Mycobacterium (M. avium, M. bovis, M. leprae, M. tuberculosis, M. pneumoniae. M. penetrans), Mycoplasma (M. fermentans, M. penetrans, M. pneumoniae), Trypanosoma (T. brucei, T. gambiense, T. cruzi, T. evansi), Leishmania (L. donovani, L. major, L. braziliensis), Plasmodium (P. falciparum, P. knowlesi, P. vivax, P. berghei), Ehrlichia (E. canis, E. chaffeensis, E. phagocytophila, E. equi, E. sennetsu), Babesia microti, Haemophilus (H. somnus, H. influenzae) , Brucella (B. militensis, B. abortus), Bartonella (B. henselae), Bordetella (B. bronchiseptica, B. pertussis) , Escherichia (E. coli), Salmonella (S. typhimurium), Shigella (S. flexneri), Pseudomonas (P. aeruginosa), Neisseria (N. gonorrhoeae, N. meningitidis), Streptococcus, Staphylococcus (S. aureus), Rickettsia (R. rickettsii), Yersinia (Y. enterocolitica), Legionella pneumonia und Listeria (L. monocytogenes) ein.
Eines oder mehrere der intermittierenden Dosierungsprotokolle der Erfindung oder eine oder mehrere der flüssigen nichtwäßrigen Formulierungen, die hierin beschrieben werden, können durch routinemäßiges Experimentieren für irgendeine der hierin beschriebenen Verwendungen oder Anwendungen angewendet werden. Für eine Verbindung der Formel 1, welche als solches eine neue Verbindung ist, kann die Verbindung einem Lebewesen gemäß einem intermittierenden Dosierungsprotokoll der Erfindung oder durch andere Protokolle verabreicht werden, z.B. kontinuierliche tägliche Dosierung einer Einzeldosis oder zwei oder mehrere Unterdosen pro Tag. Zusätzlich kann irgendeine der Verbindungen der Formel 1, z.B. eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1, die als solches neu sind, in irgendeiner hierin beschriebenen festen oder flüssigen Formulierung vorhanden sein. Diese Formulierungen und Dosierungsprotokolle können über routinemäßiges Experimentieren auf jegliche hierin beschriebene Verwendung oder Anwendung angewendet werden.
Numerierte Ausführungsformen
Die folgenden numerierten Ausführungsformen umfassen mehrere Aspekte der Erfindung und verwandter Gegenstände.
In einigen Aspekten betrifft die Erfindung nichtwäßrige, flüssige Formulierungen, die eine Verbindung der Formel 1 umfassen. Beispielhafte Ausführungsformen sind wie folgt.

1. Eine Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 und einen oder mehrere nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe umfaßt, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 3 % v/v an Wasser umfaßt.
5. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 1, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 0,3 % v/v an Wasser umfaßt.
6. Die Zusammensetzung der Ausführungsformen 1 oder 5, wobei der eine oder die mehreren nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoffe eines, zwei oder mehrere von einem Alkohol, einem Polyethylenglykol, Propylenglykol oder Benzylbenzoat sind.
9. Die Zusammensetzung nach einer der Ausführungsformen 1, 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung zwei, drei, vier oder fünf nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe umfaßt.
10. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 9, wobei die Zusammensetzung drei oder mehrere nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe umfaßt.
11. Die Zusammensetzung nach einer der Ausführungsformen 1, 5, 6, 9 oder 10, wobei die Verbindung der Formel 1 ungefähr 0,0001–99 % w/v der Zusammensetzung umfaßt.
12. Die Zusammensetzung nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die Zusammensetzung eine Einheitsdosis umfaßt.
13. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 12, wobei die Einheitsdosis ungefähr 0,5–100 mg/ml der Verbindung der Formel 1 umfaßt.
14. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 10, wobei die Zusammensetzung ungefähr 1,0–60 mg/ml der Verbindung der Formel 1 umfaßt.
16. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 1, wobei der eine oder die mehreren nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoffe ein Polyethylenglykol, Propylenglykol und Benzylbenzoat umfassen.
17. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 16, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 0,3 % v/v an Wasser umfaßt.
20. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 16, welche ferner einen Alkohol umfaßt.
22. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 1, wobei der eine oder die mehreren nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoffe Benzylbenzoat, ein Polyethylenglykol, einen Alkohol und gegebenenfalls einen zusätzlichen nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoff umfassen.
23. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 22, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 0,3 % v/v an Wasser umfaßt.
26. Die Zusammensetzung der Ausführungsformen 22 oder 23, wobei das Polyethylenglykol Polyethylenglykol 300 und/oder Polyethylenglykol 200 ist.
27. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 26, wobei der Alkohol Polyethylenglykol, Polyethylenglykol 300 ist.
28. Die Zusammensetzung der Ausführungsformen 22 oder 23, welche ungefähr 2,5–25 % v/v an Ethanol, ungefähr 1–10 % v/v an Benzylbenzoat, ungefähr 10–35 v/v an Polyethylenglykol 300, ungefähr 40–65 % v/v an Propylenglykol und ungefähr 2–60 mg/ml an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on umfaßt.
28A. Die Zusammensetzung der Ausführungsformen 22, 23 oder 26, welche ungefähr 0, 1–10 % v/v an Benzylbenzoat, ungefähr 0,1–10 % v/v an Benzylalkohol, ungefähr 1–95 % v/v an Polyethylenglykol 200, ungefähr 1–95 % v/v an Propylenglykol und ungefähr 2–60 mg/ml an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on umfaßt. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 28A kann ungefähr 2 % v/v an Benzylbenzoat, ungefähr 2 % v/v an Benzylalkohol, ungefähr 40 % v/v an Polyethylenglykol 200, ungefähr 51 % v/v an Propylenglykol (qs) und ungefähr 50 mg/ml an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on unfassen
29. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 28, welche ungefähr 12,5 % v/v an Ethanol, ungefähr 5 % v/v an Benzylbenzoat, ungefähr 25 % v/v an Polyethylenglykol 300, ungefähr 57,5 % v/v an Propylenglykol und ungefähr 50 mg/ml an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on umfaßt.
30. Die Zusammensetzung von einer der vorhergehenden Ausführungsformen, welche ferner ein Lokalanästhetikum umfaßt.
31. Die Zusammensetzung der Ausführungsform 30, wobei das Lokalanästhetikum Procain, Benzocain oder Lidocain ist.
32. Die Zusammensetzung nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Zusammensetzung ein Solvat, eine Suspension, ein Kolloid, ein Gel oder eine Kombination von beliebigen der vorher genannten umfaßt.
33. Ein Produkt, das hergestellt wurde durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 und einen ersten nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoff umfaßt, mit einem zweiten nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoff, wobei das Produkt weniger als ungefähr 3 % an Wasser und die Salze, analogen Verbindungen, Konfigurationsisomere und Tautomere davon umfaßt.
34. Das Produkt der Ausführungsform 33, wobei das Produkt weniger als ungefähr 0,3 % an Wasser umfaßt.
35. Das Produkt der Ausführungsformen 33 oder 34, wobei der erste nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoff ein Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200) oder Propylenglykol ist.
36. Das Produkt der Ausführungsformen 33, 34 oder 35, wobei der zweite nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoff ein Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200) oder Propylenglykol ist.
38. Ein Produkt, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 und zwei nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe umfaßt, mit einem dritten nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoff, wobei das Produkt weniger als ungefähr 3 % an Wasser und die Salze, analogen Verbindungen, Konfigurationsisomere und Tautomere davon umfaßt.
39. Das Produkt der Ausführungsform 38, wobei das Produkt weniger als ungefähr 0,3 % an Wasser umfaßt.
40. Das Produkt der Ausführungsformen 38 oder 39, wobei die beiden nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoffe ausgewählt werden aus einem Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200), Propylenglykol, Benzylbenzoat und einem Alkohol (z.B. Ethanol).
41. Das Produkt der Ausführungsformen 38, 39 oder 40, wobei der dritte nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoff ein Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200), Propylenglykol, Benzylbenzoat oder Alkohol (z.B. Ethanol) ist.
42. Ein Produkt, das hergestellt wird durch das Verfahren des In-Kontakt-Bringens einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel 1 und drei nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe umfaßt, mit einem vierten nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoff, wobei das Produkt weniger als ungefähr 3 % an Wasser und die Salze, analogen Verbindungen, Konfigurationsisomere und Tautomere davon umfaßt.
43. Das Produkt der Ausführungsform 42, wobei das Produkt weniger als 0,3 % an Wasser umfaßt.
44. Das Produkt der Ausführungsformen 42 oder 43, wobei die drei nichtwäßrigen, flüssigen Hilfsstoffe ausgewählt werden aus einem Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200), Propylenglykol, Benzylbenzoat und einem Alkohol (z.B. Ethanol).
45. Das Produkt der Ausführungsformen 42, 43 oder 44, wobei der vierte nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoff ein Polyethylenglykol (z.B. PEG 300 oder PEG 200), Propylenglykol, Benzylbenzoat oder ein Alkohol (z.B. Ethanol) ist.
46. Das Produkt von einer der Ausführungsformen 33–45, wobei das Produkt bei einer verringerten Temperatur (ungefähr 4°C bis ungefähr 8°C) oder bei Umgebungstemperatur während ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Jahre gelagert wurde.
65. Ein Verfahren, umfassend das Verabreichen der Zusammensetzung oder des Produkts von einer der vorheri gen Ausführungsformen an ein Lebewesen, das unter einer pathogenen Infektion oder einer Malignität oder einer Immunsuppression oder einem Zustand der Regulationsstörung leidet, z.B. einer unterdrückten Th1-Immunantwort oder einer unerwünschten Th2-Immunantwort.
66. Das Verfahren der Ausführungsform 65, wobei die pathogene Infektion eine DNA-Virusinfektion oder eine RNA-Virusinfektion ist.
67. Das Verfahren der Ausführungsform 66, wobei die RNA-Virusinfektion eine Retrovirusinfektion oder eine Hepatitisvirusinfektion ist.
68. Das Verfahren der Ausführungsform 67, wobei die Retrovirusinfektion oder Hepatitisvirusinfektion eine HIV-, FIV-, SIV-, SHIV- oder Hepatitis-C-Virus-infektion ist.
69. Das Verfahren der Ausführungsform 65, wobei die pathogene Infektion eine intrazelluläre Parasiteninfektion ist.
70. Das Verfahren der Ausführungsform 69, wobei die intrazelluläre Parasiteninfektion eine Malariainfektion ist.

In anderen Aspekten stellt die Erfindung Dosierungsverfahren zur Verfügung, die geeignet sind für eine Behandlung der hierin beschriebenen Zustände. Die folgenden Ausführungsformen beschreiben einige dieser Verfahren.

1B. Ein Verfahren, umfassend die intermittierende Verabreichung von BrEA-Hemihydrat (oder einer Zusammen setzung, die BrEA-Hemihydrat umfaßt) an ein Lebewesen oder eine Zuführung zu den Geweben des Lebewesens von BrEA-Hemihydrat (oder einer Zusammensetzung, die BrEA-Hemihydrat umfaßt).
2B. Das Verfahren der Ausführungsform 1B, wobei das Lebewesen eine Infektion, eine Hyperproliferationsstörung, einen Hypoproliferationszustand, einen Immunosuppressionszustand, eine unerwünschte Immunantwort besitzt oder wobei das Lebewesen vor kurzem ein Trauma, einen operativen Eingriff oder eine therapeutische Behandlung erfahren hat oder in Kürze erfahren wird, wobei die therapeutische Behandlung eine von dem Verfahren der Ausführungsform 1B verschiedene ist.
3B. Das Verfahren der Ausführungsform 2B, wobei der Immunosuppressionszustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer viralen Infektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenparasiten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
4B. Das Verfahren der Ausführungsform 3B, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens verbessert wird oder die unerwünschte Immunantwort (z.B. eine Th2-Antwort) verringert wird oder wobei die Th1-Immunantwort des Lebewesens verstärkt wird.
5B. Das Verfahren der Ausführungsform 3B, wobei die angeborene Immunität, spezifische Immunität oder beide des Lebewesens verstärkt werden.
6B. Das Verfahren der Ausführungsform 5B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
7B. Das Verfahren der Ausführungsform 6B, wobei die spezifische Immunität des Lebewesens verstärkt wird, z.B. wobei die Th2-Immunantwort des Lebewesens verringert wird oder wobei die Th1-Immunantwort des Lebewesens verstärkt wird.
8B. Das Verfahren der Ausführungsform 2B, wobei das BrEA-Hemihydrat gemäß einer Dosierungstherapie verabreicht wird, die die folgenden Schritte umfaßt: (a) Verabreichen von BrEA-Hemihydrat an das Lebewesen mindestens einmal pro Tag während mindestens 2 Tagen; (b) Nichtverabreichen des BrEA-Hemihydrats an das Lebewesen während mindestens 1 Tag; (c) Verabreichen von BrEA-Hemihydrat an das Lebewesen mindestens einmal pro Tag während mindestens 2 Tagen; und (d) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) mindestens einmal oder Variationen der Schritte (a), (b) und (c) mindestens einmal.
9B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei der Schritt (c) dieselbe Dosierungstherapie wie der Schritt (a) umfaßt.
10B. Das Verfahren der Ausführungsform 9B, wobei der Schritt (a) der Dosierungstherapie eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat einmal am Tag, zweimal am Tag, dreimal am Tag oder viermal am Tag umfaßt.
11B. Das Verfahren der Ausführungsform 10B, wobei der Schritt (a) der Dosierungstherapie eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat-Verbindungen einmal pro Tag oder zweimal pro Tag umfaßt.
12B. Das Verfahren der Ausführungsform 10B, wobei der Schritt (a) eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 3 bis ungefähr 24 Tagen umfaßt.
13B. Das Verfahren der Ausführungsform 12B, wobei der Schritt (a) eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 4 bis ungefähr 12 Tagen umfaßt.
14B. Das Verfahren der Ausführungsform 13B, wobei der Schritt (a) eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat-Verbindungen während ungefähr 4 bis ungefähr 8 Tagen umfaßt.
15B. Das Verfahren der Ausführungsform 14B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 3 bis ungefähr 120 Tagen umfaßt.
16B. Das Verfahren der Ausführungsform 15B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 4 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
17B. Das Verfahren der Ausführungsform 16B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemi hydrat während ungefähr 5 bis ungefähr 30 Tagen umfaßt.
18B. Das Verfahren der Ausführungsform 16B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 8 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
19B. Das Verfahren der Ausführungsform 15B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) mindestens ungefähr 4mal wiederholt werden.
20B. Das Verfahren der Ausführungsform 15B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) ungefähr 5mal bis ungefähr 25mal wiederholt werden.
21B. Das Verfahren der Ausführungsform 15B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 2 Monaten stattfinden.
22B. Das Verfahren der Ausführungsform 15B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c ). über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 12 Monaten stattfinden.
23B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen des BrEA-Hemihydrats während ungefähr 3 bis ungefähr 120 Tagen umfaßt.
24B. Das Verfahren der Ausführungsform 23B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 4 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
25B. Das Verfahren der Ausführungsform 24B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 5 bis ungefähr 30 Tagen umfaßt.
26B. Das Verfahren der Ausführungsform 23B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 8 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
27B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) mindestens einmal umfaßt.
28B. Das Verfahren der Ausführungsform 27B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) ungefähr 3mal bis ungefähr 25mal umfaßt.
29B. Das Verfahren der Ausführungsform 1B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 2 Monaten stattfinden.
30B. Das Verfahren der Ausführungsform 29B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 12 Monaten stattfinden.
31B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 8B–30B, wobei der Immunosuppressionszustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenpara siten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
32B. Das Verfahren der Ausführungsform 31B, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens verbessert wird oder die unerwünschte Immunantwort verringert wird.
33B. Das Verfahren der Ausführungsform 32B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens, die spezifische Immunität des Lebewesens oder beide verstärkt werden.
34B. Das Verfahren der Ausführungsform 33B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
35B. Das Verfahren der Ausführungsform 34B, wobei die spezifische Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
36B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei der Schritt (c) eine kürzere Dosierungstherapie als im Schritt (a) umfaßt.
37B. Das Verfahren der Ausführungsform 36B, wobei der Schritt (a) ein Verabreichen von BrEA-Hemihydrat während 7 bis ungefähr 24 Tagen umfaßt.
38B. Das Verfahren der Ausführungsform 37B, wobei der Schritt (c) ein Verabreichen von BrEA-Hemihydrat während 4 bis ungefähr 12 Tagen umfaßt.
39B. Das Verfahren der Ausführungsform 38B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 3 bis ungefähr 120 Tagen umfaßt.
40B. Das Verfahren der Ausführungsform 39B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 4 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
41B. Das Verfahren der Ausführungsform 40B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 5 bis ungefähr 30 Tagen umfaßt.
42B. Das Verfahren der Ausführungsform 36B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) mindestens einmal umfaßt.
43B. Das Verfahren der Ausführungsform 42B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) ungefähr 3mal bis ungefähr 25mal umfaßt.
44B. Das Verfahren der Ausführungsform 36B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 2 Monaten stattfinden.
45B. Das Verfahren der Ausführungsform 44B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 12 Monaten stattfinden.
46B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 36B–45B, wobei der Immunosuppressionszustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenparasiten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
47B. Das Verfahren der Ausführungsform 46B, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens verbessert wird oder die unerwünschte Immunantwort verringert wird.
48B. Das Verfahren der Ausführungsform 47B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens, die spezifische Immunität des Lebewesens oder beide verstärkt werden.
49B. Das Verfahren der Ausführungsform 48B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
50B. Das Verfahren der Ausführungsform 48B, wobei die spezifische Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
51B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei der Schritt (c) eine längere Dosierungsperiode als im Schritt (a) umfaßt.
52B. Das Verfahren der Ausführungsform 51B, wobei der Schritt (a) ein Verabreichen von BrEA-Hemihydrat während 7 bis ungefähr 24 Tagen umfaßt.
53B. Das Verfahren der Ausführungsform 52B, wobei der Schritt (c) ein Verabreichen von BrEA-Hemihydrat während 4 bis ungefähr 12 Tagen umfaßt.
54B. Das Verfahren der Ausführungsform 53B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 3 bis ungefähr 120 Tagen umfaßt.
55B. Das Verfahren der Ausführungsform 54B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 4 bis ungefähr 60 Tagen umfaßt.
56B. Das Verfahren der Ausführungsform 55B, wobei der Schritt (b) ein Nichtverabreichen von BrEA-Hemihydrat während ungefähr 5 bis ungefähr 30 Tagen umfaßt.
57B. Das Verfahren der Ausführungsform 51B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) mindestens einmal umfaßt.
58B. Das Verfahren der Ausführungsform 57B, wobei der Schritt (d) ein Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) ungefähr 3mal bis ungefähr 25mal umfaßt.
59B. Das Verfahren der Ausführungsform 51B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 2 Monaten stattfinden.
60B. Das Verfahren der Ausführungsform 59B, wobei die Schritte (a), (b) und (c) und die Wiederholungen der Schritte (a), (b) und (c) über einen Zeitraum von mindestens ungefähr 12 Monaten stattfinden.
61B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 51B–60B, wobei der Immunosuppressionszustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenparasiten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
62B. Das Verfahren der Ausführungsform 61B, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens verbessert wird oder die unerwünschte Immunantwort verringert wird.
63B. Das Verfahren der Ausführungsform 62B, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens, die spezifische Immunität des Lebewesens oder beide verstärkt werden oder wobei die Th1-Immunantwort des Lebewesens verstärkt wird oder die Th2-Immunantwort des Lebewesens verringert wird.
64B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei die Variationen der Schritte (a), (b) und (c) ein Durch führen einer ersten Dosierungstherapie der Schritte (a), (b) und (c) einmal, zweimal oder dreimal umfassen, gefolgt von einer oder mehreren zweiten Dosierungstherapien der Schritte (a'), (b') und (c'), wobei einer oder mehrere der Schritte (a'), (b') und (c') in der zweiten Dosierungstherapie länger ist als der entsprechende Schritt in der ersten Dosierungstherapie.
65B. Das Verfahren der Ausführungsform 8B, wobei die Variationen der Schritte (a), (b) und (c) ein Durchführen einer ersten Dosierungstherapie der Schritte (a), (b) und (c) einmal, zweimal oder dreimal umfassen, gefolgt von einer oder mehreren zweiten Dosierungstherapien der Schritte (a'), (b') und (c'), wobei einer oder mehrere der Schritte (a'), (b') und (c') in der zweiten Dosierungstherapie kürzer ist als der entsprechende Schritt in der ersten Dosierungstherapie.
66B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 1B–67B, wobei BrEA-Hemihydrat oral, intramuskulär, intravenös, subkutan, topisch, vaginal, rektal, intrakranial, intrathekal, intradermal als ein Aerosol oder über eine bukkale Route verabreicht wird.
67B. Das Verfahren der Ausführungsform 66B, wobei BrEA-Hemihydrat in einer festen Formulierung vorhanden ist, hauptsächlich als ein Feststoff, oder BrEA-Hemihydrat in einer flüssigen Formulierung vorhanden ist, hauptsächlich als ein Solvat, Kolloid oder eine Suspension, oder BrEA-Hemihydrat in einem Gel, einer Creme oder einer Paste vorhanden ist. 68B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 2B–67B, wobei die Virusinfektion, intrazelluläre Bakterieninfektion, extrazelluläre Bakterieninfektion, Pilzinfektion, Hefeinfektion, extrazelluläre Parasiteninfektion, intrazelluläre Parasiteninfektion, der Protozoenparasit, multizelluläre Parasit, die Autoimmunerkrankung, der Krebs, die Präkanzerose, Chemotherapie, Radiotherapie, Immunosuppressionstherapie, Antiinfektivatherapie, eine Verwundung, eine Verbrennung oder die Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, eine gastrointestinale Irritation oder irgendeine Kombination der vorherigen des Lebewesens folgendes ist: (a) eine DNA-Virusinfektion oder eine RNA-Virusinfektion (HSV, CMV, HBV, HCV, HIV, SHIV, SIV); (b) eine Mycoplasmainfektion, eine Listeria-Infektion oder eine Mycobacterium-Infektion; (c) eine extrazelluläre Bakterieninfektion; (d) eine Pilzinfektion; (e) eine Hefeinfektion (Candida, Cryptococcus); (d) Protozoen (Malaria, Leishmania, Cryptosporidium, Toxoplasmose, Pneumocystosis); (e) ein multizellulärer Parasit; (f) Autoimmunerkrankungen (SLE, RA, Diabetes); (g) Krebsarten (solide Krebsarten, ausgewählt aus z.B. Eierstock, Brust, Prostata, Gliom; disseminierte Krebse, ausgewählt aus Lymphoma, Leukämie, Darmkrebs, Sarcoma); (h) Präkanzerosen; (i) Chemotherapien (Adriamycin, Cisplatin, Mitomycin C); (j) Strahlentherapien; (k) Immunosuppressionstherapien; (1) Therapien mit Antiinfektionsmitteln; (m) Verwundungen (chirurgische oder andersartige); (n) Verbrennungen 1. Grades, 2. Grades oder 3. Grades; (o) immunosuppressive Moleküle; (p) gastrointestinale Irritation (Reizdarm, Crohn-Krankheit, chronische Diarrhöe); oder (q) jegliche Kombination von (a) bis (p)
69B. Das Verfahren der Ausführungsform 68B, wobei die RNA-Virusinfektion eine Retrovirusinfektion oder eine Hepatitisvirusinfektion ist.
71B. Das Verfahren, bei dem BrEA-Hemihydrat in einer Zusammensetzung vorliegt, welche folgendes umfaßt: (a) einen oder mehrere nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe, wobei die Zusammensetzung weniger als ungefähr 3 % v/v an Wasser umfaßt, (b) einen Feststoff, der einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff umfaßt, oder (c) einen oder mehrere flüssige Hilfsstoffe, wobei die Zusammensetzung mehr als ungefähr 3 % v/v an Wasser umfaßt.
75B. Ein Verfahren zur Behandlung von unfreiwilligem Gewichtsverlust, oralen Läsionen, Hautläsionen, opportunistischen Infektionen, Diarrhöe oder Ermüdung in einem Lebewesen, umfassend ein intermittierendes Verabreichen von BrEA-Hemihydrat an das Lebewesen (z.B. unfreiwilliger Gewichtsverlust aufgrund einer Virusinfektion, gastrointestinalen Infektion, Chemotherapie, Anorexie).
76B. Das Verfahren der Ausführungsform 75B, wobei das Lebewesen einen Immunosuppressionszustand besitzt.
77B. Das Verfahren der Ausführungsform 76B, wobei das Lebewesen ein Mensch ist.
78B. Das Verfahren der Ausführungsform 77B, wobei das Lebewesen ein Mensch im Alter von 1 Tag bis 18 Jahren ist (z.B. mit einem Alter von 1 Monat bis 6 Jahren).
79B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 75B–78B, wobei die spezifische Immunität des Lebewe sens verschlechtert bleibt im Vergleich zu einem typischen vergleichbaren Kontrollebewesen, das nicht den pathologischen Zustand des Lebewesens besitzt.
80B. Das Verfahren der Ausführungsform 79B, wobei die CD4-Zellzählung des Lebewesens während einem oder mehrerer Dosierungsdurchläufen (z.B. eine Dosierung während 1 Woche bis ungefähr 2 Wochen oder mehr) nicht signifikant zunimmt.
81B. Das Verfahren der Ausführungsform 80B, wobei die CD4-Zellzählung des Lebewesens ungefähr 20 bis ungefähr 100 CD4⁺ Zellen/mm³ oder ungefähr 20 bis ungefähr 75 CD4⁺ Zellen/mm³ beträgt.
82B. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 1B–81B, wobei das Lebewesen eine Infektion mit einem oder mehreren Pathogenen oder eine Malignität besitzt und die Pathogene oder die Malignität nicht gegenüber BrEA-Hemihydrat resistent werden über einen Zeitraum, der normalerweise in Zusammenhang steht mit der Entwicklung einer meßbaren Resistenz bei mindestens ungefähr 50 % der Lebewesen, die mit einer therapeutischen Behandlung behandelt werden, die von BrEA-Hemihydrat verschieden ist.
83B. Das Verfahren der Ausführungsform 82B, wobei die pathogene Infektion eine HIV-, SIV-, SHIV- oder HCV-Infektion ist.

In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Verfahren zur Modulation von Immunzellen oder Immunantworten in einem Lebewesen zur Verfügung. Die folgenden numerierten Ausführungsformen beschreiben einige dieser Verfahren.

1C. Ein Verfahren zur Modulierung einer angeborenen Immunität eines Lebewesens oder zur Erhöhung einer Th1-Immunantwort eines Lebewesens oder zur Verringerung von Th2-Immunantworten eines Lebewesens, umfassend ein Verabreichen eines BrEA-Hemihydrats an das Lebewesen.
2C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, wobei die angeborene Immunität des Lebewesens verstärkt wird.
3C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C oder 2C, wobei das Lebewesen an einem angeborenen Immunsuppressionszustand, einer unterdrückten Th1-Immunantwort oder einer unerwünschten Th2-Immunantwort leidet.
4C. Das Verfahren der Ausführungsform 3C, wobei der angeborene Immunsuppressionszustand, die unterdrückte Th1-Immunantwort oder die unerwünschte Th2-Anwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenparasiten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
5C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1C–3C, wobei die Th1-Immunantwort des Lebewesens verstärkt ist.
6C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, wobei die Th2-Immunantwort des Lebewesens verringert ist.
7C. Das Verfahren der Ausführungsform 6C, wobei das Lebewesen einen Zustand aufweist, der eine unerwünschte Immunantwort (z.B. Autoimmunerkrankung, SLE, Diabetes) umfaßt.
9C. Das Verfahren der Ausführungsform 6C oder 7C, wobei das Lebewesen ein Wirbeltier, ein Säugetier, ein Primat oder ein Mensch ist.
10C. Das Verfahren der Ausführungsform 9, wobei die spezifische Immunmodulation des Wirbeltiers, des Säugetiers, des Primaten oder des Menschen (i) eine verstärkte CTL- oder Th1-Antwort auf eine Virusinfektion oder auf eine maligne Zelle in vitro oder in vivo ist, (ii) eine verstärkte Antigenpräsentation oder biologische Aktivität durch dendritische Zellen oder dendritische Zellprecursor ist oder (iii) ein verstärktes Abtöten von virusinfizierten oder malignen Zellen ist.
11C. Das Verfahren nach 10C, wobei das Wirbeltier ein Mensch ist, die Virusinfektion eine HIV-Infektion ist und die CTL- oder Th1-Antwort eine verstärkte Antwort auf eines oder mehrere der HIV-gag-Proteine oder auf das HIV-gp-120 umfaßt.
12C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, 4C, 10C oder 11C, wobei die Th1-Zellen, tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL-Zellen), NK-Zellen, peripheren Blutlymphozyten, Phagozyten, Monozyten, Makrophage, Neutrophile, Eosinophile, dendritischen Zellen oder Fibrozyten des Lebewesens aktiviert sind, was gemessen wird durch z.B. eine verstärkte ³H-Thymidin-Auf nahme im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen oder durch eine Zunahme der Anzahl des Zelltyps im Kreislauf oder eine nachweisliche Bewegung des Zelltyps von einem Gewebe oder Bereich (z.B. Haut) zu einem anderen Gewebe oder Bereich (z.B. Blut, Lymphknoten, Milz oder Thymus).
13C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, 4C, 10C, 11C oder 12C, wobei BrEA-Hemihydrat die Transkription von einem oder mehreren Genen moduliert in den Lebewesen-NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, dendritische Zellen oder Fibrozyten aktiviert sind (z.B. was gemessen wird durch eine erhöhte Proteinkinase-C-Aktivität oder durch eine Modulation einer biologischen Aktivität eines Steroidrezeptors oder eines Orphannuklearhormonrezeptors).
14C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, wobei das BrEA-Hemihydrat eine Lysosombewegung in einem oder mehreren der Lebewesen-NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, dendritischen Zellen oder Fibrozyten verstärkt. 15C. Das Verfahren der Ausführungsform 1C, wobei BrEA-Hemihydrat eine Proteinkinase-C-Aktivität in einem oder mehreren der NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, dendritischen Zellen oder Fibrozyten (z.B. PKCα, PKCβ, PKCγ und PKCζ) des Lebewesens verstärkt.
18C. Das Verfahren von einer der Ausführungsformen 1C–17C, wobei das Lebewesen eine Infektion, eine Hyperproliferationsstörung, einen Hypoproliferationszustand, einen Immunosuppressionszustand, eine unerwünschte Immunantwort besitzt oder wobei das Lebewe sen vor kurzem ein Trauma, einen chirurgischen Eingriff oder eine therapeutische Behandlung erfahren hat oder in Kürze erfahren wird, wobei die therapeutische Behandlung eine andere ist wie bei dem Verfahren der Ausführungsform 1C
19C. Das Verfahren der Ausführungsform 18C, wobei der Immunosuppressionszustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einem Protozoenparasiten, einem multizellulären Parasiten, einer Autoimmunerkrankung, einem Krebs, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Radiotherapie, einer Immunosuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Verwundung, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder irgendeiner Kombination der vorherigen.
20C. Das Verfahren der Ausführungsform 19C, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens verbessert wird oder die unerwünschte Immunantwort verringert wird.
21C. Das Verfahren der Ausführungsform 19C, wobei der Immunosuppressionszustand des Lebewesens in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion.
22C. Das Verfahren der Ausführungsform 21C, wobei die Virusinfektion eine DNA-Virus- oder eine RNA-Virusinfektion umfaßt.
23C. Das Verfahren der Ausführungsform 22C, wobei die RNA-Virusinfektion eine Retrovirusinfektion oder eine Hepatitisvirusinfektion umfaßt.
24C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 18C–23C, wobei das Lebewesen an einem oder mehreren der folgenden Zustände leidet: chronischer Diarrhöe, unfreiwilligem Gewichtsverlust (üblicherweise mindestens ungefähr 5 % oder mehr), Kachexie (üblicherweise mindestens ungefähr 5 % oder mehr), Muskelschwund, einer oder mehrerer oraler Läsionen (üblicherweise mindestens ungefähr 1 cm²), einer oder mehrerer genitaler Läsionen (üblicherweise mindestens ungefähr 1 cm²), Hautläsionen (üblicherweise mindestens ungefähr 1 cm²) oder einer opportunistischen Infektion im Zusammenhang mit AIDS.
25C. Ein Verfahren (z.B. zur Bestimmung einer biologischen Aktivität von BrEA-Hemihydrat oder zur Modulation einer Transkription eines Gens in einem Zellsystem oder einem zellfreien Transkriptionssystem), umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen des BrEA-Hemihydrats mit einer Zelle oder Zellpopulation in vitro oder in vivo; (b) Messen von einem oder mehreren von (i) einem Komplex zwischen einem Bindungspartner und BrEA-Hemihydrat, (ii) einer Proliferation der Zelle oder Zellpopulation, (iii) einer Differentierung der Zelle oder Zellpopulation, (iv) einer Aktivität einer Proteinkinase C, (v) einem Niveau der Phosphorylierung eines Substrats der Proteinkinase C, (vi) einer Transkription von einem oder mehreren Zielgenen, (vii) einer Verstärkung oder Inhibierung der zellulären Antwort auf Steroide, z.B. Glucocorticoide, (viii) einer Inhibierung einer Steroidinduzierten Transkription, z.B. Glucocorticoide, Geschlechtssteroide, (ix) einer Inhibierung einer Retrovirus-(z.B. HIV, SIV, FIV oder SHIV)-LTR-getriebenen Transkription, oder (x) einer Modulation der Anzahl einer Immunzellpopulation im Kreislauf in vivo (z.B. zirkulierende periphere Blutlymphozyten in einem Säugetier wie einem Primaten oder einem Menschen); und (c) gegebenenfalls Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Ergebnisses mit einer geeigneten Kontrolle.
26C. Das Verfahren der Ausführungsform 25C, wobei der Bindungspartner ein Steroidrezeptor, ein Transkriptionsfaktor oder ein Steroidhormon-Superfamilien-Orphanrezeptor ist.
27C. Das Verfahren der Ausführungsform 25C, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität von BrEA-Hemihydrat ist für eine Replikation oder zytopathische Effekte im Zusammenhang mit einem Retrovirus, einem Hepatitisvirus oder einem Protozoenparasiten.
28C. Das Verfahren der Ausführungsform 25C, wobei die bestimmte biologische Aktivität eine modulierende Aktivität von BrEA-Hemihydrat ist für eine Replikation, zytopathische Effekte im Zusammenhang mit dem Retrovirus, dem Hepatitisvirus oder dem Protozoenparasiten, oder die bestimmte biologische Aktivität ein Metabolismus (Assay durch ³H-Thymidin-Aufnahme) einer Zelle oder Zellpopulation ist, die NK-Zellen, Phagozyten, Monozyten, Makrophagen, Basophile, Eosinophile, Fibrozyten, transformierte Zellen, virusinfizierte Zellen, bakterieninfizierte Zellen oder parasiteninfizierte Zellen umfaßt.
29C. Das Verfahren der Ausführungsform 25C, wobei das Zielgen ein Virusgen, ein bakterielles Gen, ein Parasitengen, ein mit Krebs assoziiertes Gen ist.
30C. Das Verfahren der Ausführungsform 29C, wobei das Virusgen ein Polymerasegen, ein Gen der reversen Transkriptase, ein Envelope-Gen, ein Proteasegen oder ein mit einer viralen Nukleinsäurereplikation in Zusammenhang stehendes Gen oder ein virales Strukturgen ist.
31C. Das Verfahren der Ausführungsform 30C, wobei das Polymerasegen eine DNA-Polymerase encodiert oder eine RNA-Polymerase encodiert.
32C. Das Verfahren der Ausführungsform 30C, wobei das Gen der reversen Transkriptase eine reverse Transkriptase eines Retrovirus eines Menschen, Primaten, Vogels oder einer Katze encodiert.
33C. Ein Verfahren, umfassend eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat an einen Menschen oder Primaten, der eine retrovirale Infektion und eine CD4-Zählung von 550 oder weniger besitzt.
34C. Das Verfahren der Ausführungsform 33C, wobei der Mensch eine CD4-Zählung von ungefähr 20 bis ungefähr 100 oder ungefähr 20 bis ungefähr 80 besitzt.
35C. Das Verfahren der Ausführungsform 33C, wobei der Mensch eine CD4-Zählung von ungefähr 30 bis ungefähr 150 besitzt.
36C. Das Verfahren der Ausführungsform 33C, wobei der Mensch eine CD4-Zählung von ungefähr 500 oder weniger, ungefähr 450 oder weniger, ungefähr 400 oder weniger, ungefähr 350 oder weniger, ungefähr 300 oder weniger, ungefähr 250 oder weniger, ungefähr 200 oder weniger, ungefähr 150 oder weniger, ungefähr 100 oder weniger, ungefähr 50 oder weniger oder ungefähr 25 oder weniger oder ungefähr 20 oder weniger besitzt.
37C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 33C–36C, wobei BrEA-Hemihydrat in einer Zusammensetzung, die einen oder mehrere nichtwäßrige, flüssige Hilfsstoffe und weniger als ungefähr 3 % v/v an Wasser umfaßt, oder einer der Formulierungen, wie sie in der Beschreibung oder irgendeiner der oben aufgezählten Ausführungsformen offenbart ist, vorhanden ist.
38C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 33C–37C, wobei das BrEA-Hemihydrat gemäß einem intermittierenden Dosierungsprotokoll verabreicht wird, wie dies in der Beschreibung oder irgendeiner der oben aufgezählten Ausführungsformen offenbart ist.
39C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 30C–45C, wobei der Mensch mit Hepatitis-C-Virus, Hepatitis-B-Virus, HSV-1, HSV-2, einem Malariaparasiten, einem Pneumocystis-Parasiten oder einem Cryptosporidium-Parasiten coinfiziert ist.
40C. Das Verfahren der Ausführungsform 46C, wobei das Niveau des HCV im Menschen reduziert ist.
41C. Ein Verfahren, umfassend eine Verabreichung von BrEA-Hemihydrat an ein Lebewesen oder an Nervensystemzellen in Gewebekultur, wobei BrEA-Hemihydrat an einen Rezeptor bindet, der mit Zellen im Nerven system assoziiert ist und (1) eine biologische Antwort in den Zellen im Nervensystem oder in den Zellen in Gewebekultur hervorruft und/oder (2) eine neurale Antwort hervorruft, die zu einer entfernten Stelle oder zu entfernten Zellen übertragen wird, wobei das Verfahren gegebenenfalls verwendet wird, um Verbindungen der Formel 1 zu screenen, insbesondere BrEA-Hemihydrat, auf dessen biologische Aktivität, um einen pathologischen Zustand (z.B. eine pathogene Infektion wie einen Virus (HIV), eine Malignität oder eine neurologische Störung, z.B. AIDS-assoziierte Demenz, Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Multiple Sklerose) im Lebewesen zu behandeln oder die Bioverfügbarkeit oder den Metabolismus von BrEA-Hemihydrat für das Lebewesen oder die Zellen im Nervensystem oder in Gewebekultur zu bestimmen, wobei ein Metabolismus gegebenenfalls bestimmt wird durch Vergleich der biologischen Wirkung der Verbindung der Formel 1 mit einer Kontrollverbindung, welche eine verschiedene Verbindung der Formel 1 sein kann.
42C. Das Verfahren der Ausführungsform 41, wobei der mit der Zelle im Nervensystem assoziierte Rezeptor ein Neurotransmitterrezeptor (z.B. ein γ-Aminobuttersäure-Rezeptor wie vom Typ A, ein NMDA-Rezeptor) und/oder ein Steroidrezeptor (z.B. Androgenrezeptor, Östrogenrezeptor) ist.
43C. Das Verfahren der Ausführungsform 41C oder 42C, wobei die Zelle(n) in dem Nervensystem eine oder mehrere Neuronen und Astrozyten und/oder Glialzellen sind.
44C. Das Verfahren der Ausführungsform 41C, 42C oder 43C, wobei die biologische Antwort in der oder den Zellen im Nervensystem oder in der oder den Zellen in Gewebekultur eine erhöhte oder verringerte Transkription eines oder mehrere Gene (z.B. ein Neurotransmitter, Vasopressin, ein Heat-Shock-Protein), eine erhöhte oder verringerte Sekretion eines oder mehrerer Proteine (z.B. Vasopressin), eine verringerte Schädigung gegenüber oxidativem Streß, eine verstärkte Stickstoffoxidfreisetzung und/oder ein verstärktes Neuritenwachstum ist.
45C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1C–44C, wobei die Verbindung der Formel 1 BrEA-Hemihydrat ist.
46C. Ein Verfahren zum (a) Modulieren der Expression von mindestens einem Immunzellenantigen durch eine Immunzelle in einem Lebewesen, wobei das Immunzellenantigen ausgewählt ist aus CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD25, CD38, CD56, CD62L, CD69, CD45RA, CD45R0, CD123, HLA-DR, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα, IGF₁ und γIFN, oder (b) Aktivieren von CD8⁺ T-Zellen oder CD8^– T-Zellen in einem Lebewesen, wobei die Aktivierung mindestens eine transient verstärkte Expression von CD25 oder CD69 durch die T-Zellen umfaßt, oder (c) Erhöhen des Anteils an CD8⁺ oder CD8^– Lymphokin-aktivierten Killerzellen in CD16⁺ Zellen eines Lebewesens (z.B. CD8⁺, CD16⁺, CD38⁺ oder Zellen CD8^–, CD16⁺, CD38⁺), oder (d) Erhöhen des Anteils an (i) CD8^–, CD16⁺ natürlichen Killerzellen, (ii) CD8⁺, CD16⁺ natürlichen Killerzellen oder (iii) CD8^–, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige zellmediierte Zytotoxizität mediieren, oder (iv) CD8⁺, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige zellmediierte Zytotoxizität mediieren, oder (e) Erhöhen des Anteils an dendritischen Zellprecursorn in zirkulierenden weißen Blutzellen eines Lebewesens (z.B. Lin^–, HLA-DR⁺, CD123⁺ oder Lin^–HLA-DR⁺, CD11c⁺ Zellen), oder (f) Erhöhen des Anteils an CD45RA⁺ T-Zellen oder CD45⁺, RO⁺ T-Zellen in zirkulierenden weißen Blutzellen eines Lebewesens, oder (g) Ändern (Erhöhen oder Verringern) des Anteils oder der relativen Anzahl an CD62L⁺ T-Zellen in zirkulierenden weißen Blutzellen eines Lebewesens, oder (h) Erhöhen des Anteils an CD8⁺ oder CD4⁺ T-Zellen, die CD62L in zirkulierenden CD8⁺ oder CD4⁺ T-Zellen exprimieren, oder (i) Verringern des Anteils an CD8⁺ oder CD4⁺ T-Zellen, die CD62L in zirkulierenden CD8⁺ oder CD4⁺ T-Zellen eines Lebewesens exprimieren, oder (j) Erhöhen des Anteils an HLA-DR⁺-, CD8⁺-, CD38⁺-Zellen in zirkulierenden weißen Blutzellen eines Lebewesens, oder (k) Verringern des Niveaus an IL-4 oder IL-10, das exprimiert wird durch oder vorhanden ist in weißen Blutzellen eines Lebewesens oder in dem Plasma eines Lebewesens (oder das exprimiert wird, nachdem die weißen Zellen des Lebewesens in vitro stimuliert werden), (1) zumindest transienten Erhöhen der Anzahl an dendritischen Zellprecursorn oder dendritischen Zellen, die in den weißen Blutzellen eines Lebewesens oder in einem Plasma des Lebewesens vorhanden sind, oder (m) Verstärken der Kapazität der CD4⁺ T-Zellen zur Exprimierung von IL-2, IL-12 oder γIFN, wobei das Verfahren ein Verabreichen von BrEA-Hemihydrat und eines pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffs an das Lebewesen umfaßt.
48C. Das Verfahren der Ausführungsform 46C oder 47C, wobei BrEA-Hemihydrat einem Lebewesen täglich über einen Zeitraum von 1 bis ungefähr 15 Tage verabreicht wird, z.B. während 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr Tagen.
49C. Das Verfahren der Ausführungsform 48C, wobei die Expression des Immunzellenantigens erfaßbar moduliert wird während mindestens ungefähr 4–7 Tagen nach der letzten Verabreichung von BrEA-Hemihydrat an ein Lebewesen, z.B. während mindestens 4, 5, 6, 7 oder mehr Tagen.
50C. Das Verfahren der Ausführungsform 48C oder 49C, wobei die Expression des Immunzellenantigens erfaßbar ist mindestens ungefähr 8–90 Tage nach der letzten Verabreichung von BrEA-Hemihydrat, z.B. während mindestens ungefähr 8, 10, 12, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 42, 45, 49, 50, 55, 56, 60, 63, 65, 70, 75, 77, 80, 84, 85, 90, 91, 95, 98, 100 oder mehr Tagen.
51C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 46C–51C, wobei das Lebewesen einen Immunosuppressionszustand, eine Pathogeninfektion oder einen Zustand besitzt, der assoziiert ist mit einer unzureichenden Th1-Immunantwort oder einer übermäßigen Th2-Immunantwort.
52C. Der Verfahren der Ausführungsform 51C, wobei die Pathogeninfektion eine Virusinfektion, eine Bakterieninfektion, eine Hefeinfektion, eine Pilzinfektion oder eine Viroidinfektion ist, z.B. wobei die Pathogeninfektion eine Virusinfektion ist, wie eine DNA-Virusinfektion oder eine RNA-Virusinfektion (z.B. eine Infektion, die verursacht wird durch einen Hepadnavirus, einen Parvovirus, einen Papovavirus, einen Adenovirus, einen Herpesvirus, einen Retrovirus, einen Flavivirus, einen Togavirus, einen Rhabdovirus, einen Picomavirus, einen Bunyavirus, einen Reovirus, einen Orthomyxovirus oder einen Paramyxovirus, wie HIV1, HIV2, SIV, SHIV oder einen anderen Virus, der hierin oder in den angegebenen Referenzen beschrieben wird.
53C. Das Verfahren der Ausführungsform 52C, wobei das Lebewesen einen Immunosuppressionszustand besitzt, der assoziiert ist mit oder verursacht wird durch eine Pathogeninfektion.
54C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 46C–53C, wobei das Lebewesen ein Säugetier, ein Mensch, ein Primat oder ein Nagetier ist.
55C. Das Verfahren nach einem der Ausführungsformen 46C–54C, wobei ungefähr 0,05 mg/kg/Tag bis ungefähr 20 mg/kg/Tag parenteral (z.B. durch eine intravenöse, subkutane, intramuskuläre oder intramedulläre Injektion), topisch, oral, sublingual oder bukkal an das Lebewesen verabreicht werden, z.B. ungefähr 0,1 mg/kg/Tag, ungefähr 0,2 mg/kg/Tag, ungefähr 0,5 mg/kg/Tag, ungefähr 1,0 mg/kg/Tag, ungefähr 1,5 mg/kg/Tag, ungefähr 2 mg/kg/Tag, ungefähr 2,5 mg/kg/Tag, ungefähr 3,0 mg/kg/Tag, ungefähr 4 mg/kg/Tag oder ungefähr 6 mg/kg/Tag, d.h. ungefähr 0,1–10 mg/kg/Tag, typischerweise ungefähr 0,2–7 mg/kg/Tag.
56C. Das Verfahren der Ausführungsform 55C, wobei das Lebewesen gleichzeitig ein oder mehrere zweite therapeutische Mittel zur Behandlung einer pathogenen Infektion nimmt, z.B. einer Virusinfektion wie einer HIV-1-Infektion, einer HIV-2-Infektion, einer HAV-Infektion, einer HBV-Infektion, einer HCV-Infektion, einer Epstein-Barr-Virusinfektion, einer HSV-1-Infektion, einer HSV-2-Infektion, einer Infektion mit dem Humanherpesvirus 6, einer Infektion mit dem Humanherpesvirus 7, einer Infektion mit dem Humanher pesvirus 8, oder einer Bakterieninfektion oder einer Parasiteninfektion wie einer Malariainfektion, Leishmaniase, Kryptosporidiose, Toxoplasmose, einer Mycoplasmainfektion, einer Trichomonas-Infektion, einer Chlamidya-Infektion, einer Pneumocystis-Infektion, einer Salmonella-Infektion, einer Listeria-Infektion, einer Escherichia coli-Infektion, einer Yersinia-Infektion, einer Vibrio-Infektion, einer Pseudomonas-Infektion, einer Mycobacterium-Infektion, einer Haemophilus-Infektion, einer Neisseria-Infektion, einer Staphylococcus-Infektion oder einer Streptococcus-Infektion.
57C. Das Verfahren der Ausführungsform 56C, wobei das eine oder die mehreren zweiten therapeutischen Mittel ein Proteaseinhibitor, ein Inhibitor der reversen Transkriptase, ein Inhibitor einer Virus-, Bakterien- oder Parasiten-DNA- oder -RNA-Polymerase, ein antibakterielles Antibiotikum oder ein Antipilzmittel, wie AZT, ddl, ddC, D4T, 3TC, ein Virus (z.B. HIV)-Fusionsinhibitor, Hydroxyharnstoff, Nelfinavir, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Chloroquin, ein Chloroquinanalog, Amphotericin B, Fluconazol, Clotrimazol, Isoniazid, Dapson, Rifampin, Cycloserin, Erythromycin, ein Tetracyclinantibiotikum, Vancomycin, Ethambutol, Pyrazinamid, ein Fluorchinolon (z.B. Ciprofloxacin, Norfloxacin), ein Cephalosporinantibiotikum, ein β-Lactam-Antibiotikum oder ein Aminoglykosidantibiotikum (z.B. Streptomycin, Kanamycin, Tobramycin) ist.
58C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 46C–57C, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Primat, ein Hund, eine Katze oder ein Nagetier ist.
59C. Eine Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge einer Immunzellenteilmengen-Modulatorverbindung der Formel 1, insbesondere BrEA-Hemihydrat, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
60C. Zusammensetzung der Ausführungsform 59C, wobei die Immunzellenteilmenge (1) CD8⁺ T-Zellen, (2) CD4⁺ T-Zellen, (3) CD8⁺ Lymphokin-aktivierte Killerzellen, (4) CD8^– Lymphokin-aktivierte Killerzellen, (5) CD8^–, CD16⁺ natürliche Killerzellen, (6) CD8⁺, CD16⁺ natürliche Killerzellen, (7) CD8^–, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige, zellmediierte Zytotoxizität mediieren, (8) CD8⁺, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige, zellmediierte Zytotoxizität mediieren, (9) dendritische Zellen oder dendritische Zellprecursors, (10) CD45RA⁺ T-Zellen, (11) CD45RO⁺ T-Zellen, (12) CD45RA⁺, CD45RO⁺ T-Zellen, (13) CD8⁺, CD62L T-Zellen, (11) CD4⁺, CD62L⁺ T-Zellen oder (14) HLA-DR⁺, CD8⁺, CD38⁺ T-Zellen ist.
61C. Ein Verfahren zum Erfassen einer biologischen Antwort im Zusammenhang mit der Verabreichung von BrEA-Hemihydrat an ein Lebewesen, umfassend (1) Erhalten einer Probe des Lebewesens, (2) Verabreichen des BrEA-Hemihydrats an das Lebewesen, um ein behandeltes Lebewesen zu erhalten, (3) Erhalten einer zweiten Probe des behandelten Lebewesens, (4) innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe Analysieren der Probe, um eine Kontrollinformation zur Erfassung der biololgischen Antwort zu erhalten, (5) innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der zweiten Probe Analysieren der zweiten Probe auf Vorhandensein oder Abwesenheit einer biologischen Antwort, um eine experimentelle Information zu erhalten, und (6) gegebenenfalls Vergleichen der Kontrollinformation mit der experimentellen Information, um die Anwesenheit, Abwesenheit, relative Größe oder absolute Größe der biologischen Antwort zu erfassen.
62C. Das Verfahren der Ausführungsform 61C, wobei das BrEA-Hemihydrat ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
63C. Das Verfahren der Ausführungsform 61C oder 62C, wobei die biologische Antwort im Zusammenhang mit der Verabreichung von BrEA-Hemihydrat an das Lebewesen eine Modulation der Expression eines Zelloberflächenantigens, eine gesteigerte absolute oder relative Zahl an Zellen in einer Immunzellenteilmenge, eine verringerte absolute oder relative Zahl an Zellen in einer Immunzellenteilmenge oder eine unveränderte absolute oder relative Zahl an Zellen in einer Immunzellenteilmenge ist.
64C. Das Verfahren der Ausführungsform 63C, wobei die Immunzellenteilmenge CD8⁺ T-Zellen, CD4⁺ T-Zellen, CD8⁺ Lymphokin-aktivierte Killerzellen, CD8^–, CD16⁺ natürliche Killerzellen, zirkulierende dendritische Zellprecursor, zirkulierende dendritische Zellen, gewebedendritische Zellprecursor, gewebedendritische Zellen, CD8⁺ Lymphokin-aktivierte Killerzellen, CD8^– Lymphokin-aktivierte Killerzellen, CD8^–, CD16⁺ natürliche Killerzellen, CD8⁺, CD16⁺ natürliche Killerzellen, CD8^–, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige zellmediierte Zytotoxizität mediieren, CD8⁺, CD16⁺ Zellen, die eine antikörperabhängige zellmediierte Zytotoxizität mediieren, CD45RA⁺ T-Zellen, CD45RA⁺, CD45RO⁺ T-Zellen, CD45RO⁺ T-Zellen, CD8⁺, CD62L T-Zellen, CD4⁺, CD62L⁺ T-Zellen oder HLA-DR⁺, CD8⁺, CD38⁺ T-Zellen, Monozyten oder Makrophagen ist.
65C. Das Verfahren der Ausführungsform 64C, wobei die biologische Antwort mindestens eine transiente Modulation eines Immunzellenantigens oder eines Immunhilfszellenantigens (z.B. eines Adhäsionsmoleküls an der Oberfläche von Endothelialzellen oder eines Zytokinrezeptors an der Oberfläche von T-Zellen oder B-Zellen) ist.
66C. Das Verfahren der Ausführungsform 65C, wobei das Immunzellenantigen ein Protein, Glykoprotein oder Zelloberflächenantigen ist, das normalerweise oder ausschließlich exprimiert wird von Lymphoidzellen (Lymphozyten oder weißen Blutzellen oder deren Precursorn, z.B. T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Makrophage, LAK-Zellen, NK-Zellen, dendritischen Zellen).
67C. Das Verfahren der Ausführungsform 65C, wobei das Immunzellenantigen ein CD-Molekül, ein Interleukin oder ein Zytokin ist, gegebenenfalls ausgewählt aus CD16, CD25, CD38, CD62L, CD69, CD45RA, CD45R0, IL-1, IL-2, IL-4, Il-6, IL-8, IL-10, TNFα, IGF₁ und γIFN.
68C. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 61C–67C, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Primat, ein Hund, eine Katze oder ein Nagetier ist.
69C. Ein Verfahren zur Änderung des Th1-Th2-Gleichgewichts in einem Lebewesen, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge an BrEA-Hemihydrat an ein Lebewesen, wodurch die Expression oder Sekretion des Lebewesens von IL-4 oder IL-10 erfaßbar moduliert wird.
70C. Das Verfahren der Ausführungsform 30, wobei die Expression oder Sekretion des Lebewesens von IL-4 oder IL-10 verringert wird und das Th1-Th2-Gleichgewicht bei den Th1-Immunantworten des Lebewesens auf einen Infektionszustand oder einen Immunosuppressionszustand erfaßbar verstärkt wird.

Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weitergehender und besitzen nicht die Absicht, sie in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1. BrEA-Formulierung.
Es wurden zwei Chargen einer nichtwäßrigen BrEA-Formulierung mit einer BrEA-Konzentration von 50 mg/ml in 25 % Polyethylenglykol 300, 12,5 % dehydratisiertem Ethylalkohol, 5 % Benzybenzoat und 57,5 % Propylenglykol auf die folgende Weise hergestellt. BrEA wurde erhalten von Procyte, Inc. Die restlichen Hilfsstoffe sind unten aufgezeigt.
Die Formulierung wurde hergestellt durch Suspendieren von BrEA in Polyethylenglykol 300 und schrittweises Zugeben von Propylenglykol, Benzylbenzoat und dehydratisiertem Ethylalkohol, um eine Lösung zu bilden, die mit zusätzlich Propylenglykol auf das gewünschte Endvolumen verdünnt wurde. Dsa Verfahren wird unten beschrieben.
Die berechnete Menge an Polyethylenglykol 300 wurde einem Mischgefäß zugegeben. Dann wurde dem Gefäß unter Mischen die berechnete Menge an BrEA zugegeben und während mindestens 5 Minuten gemischt, um eine glatte, cremige Flüssigkeit zu bilden; es wurde dem Gefäß Propylenglykol zugegeben und während mindestens 5 Minuten gemischt, um eine gleichförmige Suspension zu bilden. Dem Gefäß wurde die berechnete Menge an Benzylbenzoat zugegeben und während ungefähr 5 Minuten gemischt, um eine durchscheinende flüssige Suspension zu bilden. Es wurde dem Gefäß dehydratisierter Alkohol zugegeben und während ungefähr 5 Minuten gemischt, um eine klare farblose Lösung zu bilden. Dann wurde Propylenglykol zugegeben, um die gewünschte Endformulierung zu erzielen, und es wurde während ungefähr 5 Minuten gemischt. Die Arzneimittellösung wurde in einen Volumendispenser übertragen, der auf eine Abgabe von 1,2 ml pro Phiole eingestellt war. Die Lösung wurde unter Stickstoffdruck durch zwei in Reihe geschaltete 0,2 μm Polyvinylidenfluoridfilter in bernsteinfarbene Glasphiolen von 2 cm³ filtriert. Die Phiolen wurden mit teflonbeschichteten Butylgummistopfen abgedeckt und mit einer Klammer versiegelt. Die für die Produktphiolen verwendeten Materialien sind unten aufgelistet.
Die Produktspezifizierungen wurden mittels einem oder mehreren der folgenden Assays untersucht.
Chargenanalys
Beispiel 2. BrEA-Arzneimittelsubstanz und BrEA-Formulierungsstabilität
Eine beschleunigte Stabilitätsstudie über eine Dauer von 6 Monaten wurde durchgeführt unter Verwendung von BrEA und den Formulierungen aus Beispiel 1. Es wurden Proben bei den Zeitpunkten 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Monaten genommen und mit den in Beispiel 1 aufgelisteten Spezifikationen verglichen. Real Time-Stabilität (25°C, 60 relative Feuchtigkeit) wird durchgeführt unter Verwendung der BrEA-Formulierung der Chargen 1 und 2 bei Probenzeitpunkten von 3, 6, 9, 12, 18, 24 und 36 Monaten. Nach einer Lagerung von 3 Monaten bei 40°C und einer relativen Feuchtigkeit von 75 % beträgt die Assaywirksamkeit von BrEA mindestens 95 % des angegebenen Werts. Das Ergebnis des Stabilitätstests zeigt an, daß BrEA während mindestens 3 Monaten bei erhöhter Temperatur und Feuchtigkeit in den Chargen 1 und 2 der Formulierungen stabil ist.
Beispiel 3. Intermittierendes Dosierungsprotokoll bei Primaten
Schweinsaffen (Macaca nemestrina), die mit einem SHIV₂₂₉-Retrovirus infiziert sind, wurden mit einer BrEA-Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. SHIV₂₂₉ ist ein rekombinanter Retrovirus, der HIV- und SIV-Sequenzen enthält. J. Thompson et al., Abstract #75, 16^th Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, 7.–10. Oktober, 1998, Atlanta, GA; M. Agy et al., Abstract #67, 16^th Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, 7.–10. Oktober, 1998, Atlanta, GA. In Affen begründet er eine aggressive Infektion, die bei unbehandelten Tieren bei ungefähr 180–210 Tagen nach einer Infektion zu ernsten Symptomen des Endstadiums der Krankheit führt. Vier Schweinsaffen (2/Gruppe) erhielten subkutane Injektionen der Formulierung bei 1 oder 2 mg/kg Körpergewicht während 10 aufeinanderfolgenden Tagen (Protokoll 1). In Woche 8 wurden 3 der 4 Affen erneut behandelt, und 2 bisher unbehandelte Affen wurden mit 5 mg/kg der Formulierung jeden zweiten Tag während eines Zeitraums von 20 Tagen behandelt (Protokoll 2). In Woche 19 begannen alle Primaten, die eine Behandlung erhielten, eine Behandlungstherapie mit 3 Perioden mit 3 mg/kg der BrEA-Formulierung einmal täglich während 10 aufeinanderfolgenden Tagen, welche alle vier Wochen wiederholt wurde für insgesamt 3 Behandlungsperioden (Protokoll 3).
Die Tiere wurden mit 1–100 TCID₅₀-Einheiten infiziert, die intravenös oder intrarektal verabreicht wurden. Virale Titer in der ersten Gruppe der Tiere reichten von 10⁶ bis 10⁸, bevor eine Dosierung begann. Alle Tiere zeigten einen anfänglichen Anstieg der plasmaviralen SHIV RNA. Nach einem Zeitraum von 2 bis 3 Wochen begannen die Titer abzufallen und 3 der 4 Tiere zeigten eine Antwort auf die Therapie mit mittleren viralen Titern von 0,76 log unterhalb der Basislinie in den Wochen 4 bis 5 nach dem Beginn der Behandlung. In der Woche 8 waren die Titer bei allen Tieren zu den Basislinienwerten zurückgekehrt. Blutglucoseniveaus fielen signifikant ab, die Niveaus der alkalischen Phosphatase waren erhöht und SGOT/GGT-Werte tendierten in Richtung des oberen Endes des normalen Bereichs. Es wurden keine anderen signifikanten Änderungen in irgendeinem der überwachten Parameter beobachtet. Die CD4-Niveaus in allen Affen blieben unterhalb von 100 Zellen/mm³ am Ende des ersten Protokolls.
Drei der fünf Affen der zweiten Therapie (Protokoll 2) zeigten eine Antwort auf die BrEA-Therapie mit einer größeren Tiefe und Dauer der Antwort als beobachtet wurde bei geringeren Dosierungsniveaus. Bei den Tieren, die eine Antwort zeigten, war der mittlere Abfall unterhalb der Basislinie 1,47 log. Die Tiere des Protokolls 1, die keine Antwort zeigten, zeigten eine Antwort, wenn die BrEA-Formulierung in Protokoll 2 verabreicht wurde. Zwei Tiere zeigten keine Antwort, eines jeweils aus der Gruppe, die eine Behandlung erfuhr, und der Gruppe, die bisher nicht behandelt wurde. Die dritte Therapie (Protokoll 3) dauert an, und die Tiere werden überwacht.
Die Affen dieser Studie wurden aus einer Infektionsstudie gerettet und es war zu erwarten, daß die erste Gruppe von vier Affen der Studie (Protokoll 1) nach Beginn dieser Experimente lediglich einige wenige Wochen leben werden, da sich ihr Zustand aufgrund krankheitsbedingter Ursachen begann zu verschlechtern. Ein Tier starb am Tag 356 an einer toxischen Reaktion des Betäubungsmittels, das während der Entnahme einer Blutprobe für eine Analyse verwendet wurde. Zum Zeitpunkt dieser Anwendung schienen die Affen, die mehrfache Therapiedurchläufe erhielten, in einem guten klinischen Gesundheitszustand zu sein. Ihr Überleben war größer als 380 Tage ab dem Zeitpunkt der Infektion. Es wurde eine Behandlung durch intermittierende Dosierung der BrEA-Formulierung verwendet. Drei Kontrollaffen wurden mit 1–10 000 SHIV₂₂₉ TCID₅₀ Einheiten infiziert und erhielten keine Behandlung. Diese Tiere werden als der Zweig der Überlebensstudie betrachtet, der keine Behandlung erfährt. Die mittlere Zeit bis zum Tod für Schweinsaffen, die mit SHIV₂₂₉ infiziert wurden, betrug 193 Tage. Affen, die eine Therapie erhielten, verblieben während über 350 Tage in einem guten klinischen Zustand, mit CD4-Niveaus von weniger als 20 Zellen/mm³ und ohne opportunistische Infektionen oder krankheitsbedingte Symtome, mit Ausnahme einer leichten Anämie bei einem Tier.
Diese Ergebnisse zeigten vollständig unerwartete therapeutische Antworten durch die Primaten, die mit dem SHIV-Retrovirus, der ziemlich virulent ist, infiziert wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß die Mehrzahl der Lebewesen bei diesen Behandlungsprotokollen nicht nur ein signifikant verlängertes Überleben aufwiesen im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen, sondern daß auch die klinischen Symptome im Zusammenhang mit einer retroviralen Infektion dramatisch verbessert waren, trotz der Tatsache, daß CD4-Zählungen niedrig blieben, d.h. geringer als ungefähr 100 CD4-Zellen/mm³ zu Anfang und weniger als ungefähr 20 CD4-Zellen/mm³ später im Behandlungsprotokoll. Bis heute sind solche Ergebnisse, d.h. (1) gute klinische Gesundheit bei einer Mehrzahl an Lebewesen mit geringen CD4-Niveaus (weniger als ungefähr 150 Zellen/mm³, insbesondere weniger als ungefähr 75 Zellen/mm³) und (2) keine klinischen Anzeichen einer viralen Resistenz auf die Behandlung, trotz intermittierender Dosierung über einen verlängerten Zeitraum, bei Primaten, Menschen oder irgendeinem anderen Tier beispiellos. Das SHIV₂₂₉-Modell ist extrem pathogen bei Schweinsaffen. Die Ereignisse, die bei diesem Modell im Verlauf mehrerer Wochen auftreten, würden typischerweise mehrere Jahre bei einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, benötigen. Eine Behandlung von Affen, die mit diesem Virus infiziert sind und mit üblicherweise verwendeten Antiretrovirusmitteln behandelt werden, z.B. AZT, 3TC oder einem Proteaseinhibitor, werden den Erwartungen nach den Verlauf des Krankheitsfortschritts nicht signifikant beeinflussen. Der klinische Zustand der Tiere verbessert sich fortlaufend, z.B. der Gewichtsverlust pro Tier beträgt ungefähr 8–15 %. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung unter Verwendung des intermittierenden Dosierungsprotokolls in hohem Maße wirksam ist, trotz der offensichtlichen Verschlechterung der spezifischen Immunität des Lebewesens, wie dies durch die geringen CD4-Zählungen aufgezeigt wird. Erhöhte CD4-Zählungen können erreicht werden unter Verwendung von Immunstimulatoren wie IL2 oder sie können bei einigen Lebewesen wie beim Menschen spontan ansteigen, in Abhängigkeit von dem Behandlungsprotokoll, der Dauer der Dosierung oder dem anfänglichen medizinischen Zustand des Lebewesens. Die hier aufgezeigten antiviralen Effekte scheinen zumindest teilweise durch eine Erhöhung der Immunantworten des Lebewesens zu funktionieren, z.B. eine verstärkte Immunantwort durch phagozytische Zellen (NK-Zellen, Monozyten und/oder Makrophagen), und/oder eine Verstärkung beliebiger restlicher spezifischer Immunantworten, wenn überhaupt, die das Lebewesen in der Lage ist aufzubringen.
Beispiel 4. Humanbehandlungsprotokoll
Es wurde ein klinischer Dosissteigerungsversuch durchgeführt unter Verwendung einer nichtwäßrigen Formulierung, die BrEA oder eine andere Verbindung der Formel 1 enthält, die im wesentlichen wie in Beispiel 1 be schrieben hergestellt wurde. Die Patienten wurden bisher nicht behandelt oder erhielten bereits eine Behandlung, und es wurden ungefähr 3–10 Patienten für jedes Dosisniveau untersucht. Die Anfangsdosis beträgt 25 mg an BrEA oder einer anderen Verbindung der Formel 1, welche parenteral, z.B. s.c. oder i.m., verabreicht wird. Die Dosis wird einmal täglich oder ein- oder zweimal täglich während 1–12 Tagen verabreicht, gefolgt von einer Nichtdosierung während mindestens 7 Tagen (z.B. 7 bis 90 Tagen). Nachfolgende Dosen werden einmal oder einmal pro Tag während 1–12 Tagen verabreicht, gefolgt von einer Nichtdosierung während mindestens 7 Tagen (z.B. 7 bis 90 Tagen). Andere getestete Dosierungsniveaus sind 20 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg und 300 mg, wobei jede verabreichte Dosis einmal täglich als eine Einzeldosis oder als zwei, drei oder mehrere Teildosen verabreicht wird. Es wird ein Wirksamkeitsdosierungsversuch durchgeführt unter Verwendung desselben Dosierungsprotokolls wie bei dem Dosissteigerungsversuch, oder er kann alternativ eine Dosierung einmal oder zweimal jeden zweiten Tag während 3–17 Tagen umfassen, gefolgt von einer Nichtdosierung während 7–90 Tagen und dann einem Wiederholen der Dosierung einmal oder zweimal jeden zweiten Tag während 3–17 Tagen. Dieses Protokoll wird auf unbegrenzte Zeit wiederholt (z.B. mindestens ungefähr 3-18 Monate) unter Verwendung der optimalen Dosen, die erhalten werden aus dem Dosissteigerungsversuch, z.B. 10-200 mg/Tag einer Verbindung der Formel 1.
Beispiel 5. Pharmakologische Tierstudien
Es wurden nichtklinische Studien durchgeführt unter Verwendung einer oralen und einer subkutanen Formulierung von BrEA. Ratten wurde oral ¹⁴C BrEA verabreicht, das in verschiedenen Hilfsstoffen solubilisiert war, um die Niveaus an Arzneimitteln im Blut und in verschiedenen Geweben zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser vorläufigen pharmakokinetischen Studien zeigten auf, daß die Absorption von BrEA durch eine orale Verabreichung ungefähr 0,1 bis 15 % beträgt, mit mindestens ungefähr 80 % Ausscheidung im Kot.
Die nichtwäßrige BrEA-Formulierung aus Beispiel 1 wurde als eine einzelne subkutane Dosis an Kaninchen verabreicht. Mehr als 90 % des Arzneimittels verließen die Injektionsstelle innerhalb von 24 Stunden nach einer Verabreichung und erreichten eine maximale Konzentration im Plasma von ungefähr 1,2 % der injizierten Dosis bei acht bis zwölf Stunden nach einer Verabreichung. Die zirkulierende Halbwertszeit des Arzneimittels im Plasma betrug ungefähr zwölf Stunden. Das Arzneimittel sammelte sich nicht bis zu einem signifikanten Ausmaß in irgendeinem der Hauptorgane an und wurde hauptsächlich im Urin ausgeschieden.
BrEA wurde Ratten subkutan verabreicht unter Verwendung der Formulierung des Beispiels 1. Ungefähr 90 % des Arzneimittels verließen die Injektionsstelle innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung und erreichten eine maximale Konzentration im Plasma von ungefähr 0,2 % der injizierten Dosis bei einer Stunde nach der Verabreichung. Eine Eliminierung aus dem Plasma war zweiphasig mit Halbwertszeiten von ungefähr 12 bzw. 72 Stunden. BrEA sammelte sich nicht in signifikantem Ausmaß in irgendeinem Hauptorgan an und wurde hauptsächlich im Kot ausgeschieden. Es wurde auch eine Studie in Rhesusaffen mit der Formulierung des Beispiels 1 durchgeführt, um die Plasmapharmakokinetiken zu bestimmen.
Eine pharmakokinetische Analyse von ¹⁴C BrEA im Plasma wurde in zwei weiblichen Rhesusaffen durchgeführt. Es wurde eine spurenmarkierte Verbindung (16α-Brom-3β-hydroxy-5α-[4-¹⁴C]-androstan-17-on [50 mCi/mmol]) bei einer Dosis von 1 mg/kg als eine subkutane Injektion in der Skapularregion verwendet, wobei ein Injektionsvolumen von 1 ml/kg verwendet wurde. Das BrEA wurde formuliert in 25 % an Polyethylenglykol 300, 12,5 an absolutem Ethanol, 5 % an Benzylbenzoat und qs mit Propylenglykol. Pro Tier wurden 40 μCi injiziert. Blutproben wurden bei 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden genommen, um die ¹⁴C-Aktivität zu bestimmen. Die Radioaktivität in dem Plasma stieg in 8 Stunden auf nahezu die Peakkonzentration und verblieb bei ungefähr demselben Niveau bis zum Ende der Studie bei 24 Stunden.
Es wurde eine pharmakokinetische Analyse von ¹⁴C BrEA in New Zealand White Rabbits durchgeführt. Jedem der drei New Zealand White Rabbits wurden 20 μCi an ¹⁴C 16α-Brom-3 β-hydroxy-5α-[4-¹⁴C]-androstan-17-on (50 mCi/mmol) plus 1 mg/kg an nichtmarkiertem BrEA als eine subkutane Injektion in die Skapularregion verabreicht, wobei ein Injektionsvolumen von 1 ml/kg verwendet wurde. Das Arzneimittel wurde formuliert in 25 % an Polyethylenglykol 300, 12,5 % an absolutem Ethanol, 5 % an Benzylbenzoat und qs mit Propylenglykol. Bei allen drei Tieren wurden Blutproben genommen bei 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 Stunden, und für zwei Tiere bei 48 Stunden. 24 und 48 Stunden nach der Verabreichung wurde ein bzw. wurden zwei Tiere getötet und die folgenden Organe/Gewebe wurden gesammelt: Hirn, Herz, Nieren, Leber, Lungen, Skelettmuskulatur, Milz und Muskel und Haut der Injektionsstelle. Zusätzlich zu den Organen und Geweben wurden Urin und Kot ebenso wie die Käfigwaschungen gesammelt. BrEA sammelte sich nicht in signifikantem Ausmaß in irgendeinem der oben aufgeführten Organe an. Die größte Masse an Arzneimittel in den Organen wurde in der Leber beobachtet, welche ungefähr 0,8 und 0,12 % der injizierten Dosis bei 24 bzw. 48 Stunden enthielt (Mittelwert 0,13 %).
Prozentualer Anteil an Arzneimittel in den Organen (Kaninchen)
Der mittlere Prozentsatz der verabreichten Dosis im gesamten Blut wurde berechnet durch Multiplizieren der Konzentration an Arzneimittel im gesamten Blut mit dem angenommenen Volumen an Blut im Tier, 200 ml. Die Menge an Arzneimittel im Blut erreicht ein Maximum bei ungefähr 8 Stunden, und nach 48 Stunden war immer noch eine geringe Menge erkennbar. Die Menge an BrEA im gesamten Blut war durchgehend geringer als im Plasma, was den Schluß nahelegt, daß das Arzneimittel nicht in einem nennenswerten Ausmaß durch die roten Blutzellen aufgenommen wird.
Es wurden in vivo-Experimente durchgeführt, um die Bioverfügbarkeit von BrEA über eine orale Verabreichung unter Verwendung verschiedener Formulierungen zu bestimmen. BrEA wurde (1) solubilisiert in Sojaöl, Vitamin E- Öl, einer Mischung aus Vitamin E und Cremophor, oder (2) BrEA wurde mikrovisiert und mit oder ohne ein Tensid kombiniert. Diese Formulierungen werden unten beschrieben. Die Formulierungen wurden oral an Ratten verabreicht, und es wurden BrEA-Niveaus im Blut, in der Leber, der Milz, der Niere und in den Lymphknoten bestimmt. In den Studien, bei denen mikrovisiertes BrEA verwendet wurde, wurde das Gehirn auf eine Arzneimittelaufnahme ausgewertet. Es wurden über 24 Stunden Urin und Kot gesammelt, wenn BrEA in Vitamin E und Sojaöl und mit Cremophor vermischtem Vitamin E solubilisiert war. Die Daten aus diesen Studien zeigen auf, daß BrEA in das lymphatische System eintritt, aber schnell aus den anderen Geweben eliminiert wird. Die Menge der ¹⁴C-Radioaktivität, die im Kot 24 Stunden nach einer Verabreichung rückgewonnen wurde, betrug 78 bis 83 %. Eine kurze Zusammenfassung eines jeden Experiments wird nachfolgend zur Verfügung gestellt, und die Ergebnisse werden in Tabelle 6 zur Verfügung gestellt.
BrEA (5 mg in 1,0 ml an Sojaöl oder Vitamin E Öl), ergänzt mit ¹⁴C-markiertem BrEA, wurde Ratten intragastrisch verabreicht. Eine Solubilisierung von BrEA in Vitamin E oder Sojaöl wurde mit 50 μl an Ethanol erleichtert. Die Tiere (3/Zeitpunkt) wurden bei 1,5, 3, 5,5 und 24 Stunden nach einer Verabreichung assayed, und es wurde die ¹⁴C-Radioaktivität im Blut, in der Leber, der Milz, der Niere, in den Lymphknoten und bei 24 Stunden im Kot und Urin gemessen. Die Ergebnisse zeigen auf, daß auf Basis der ¹⁴C-Radioaktivität einiges des BrEA im lymphatischen System aufgenommen wird. Die Aufnahme ist größer mit Sojaöl als mit Vitamin E Öl im Blut, in der Leber und in den Lymphknoten.
Ratten wurde intragastrisch BrEA (5 mg in 1,0 ml an Vitamin E und Cremophor), ergänzt mit ¹⁴C-markiertem BrEA, verabreicht. Eine Solubilisierung von BrEA in der Mischung aus Vitamin E und Cremophor wurde erleichtert durch die Zugabe von 60 μl an Ethanol. Die Tiere (4/Zeitpunkt) wurden bei 2, 3, 5,5 und 24 Stunden getötet, und es wurde die ¹⁴C-Radioaktivität im Blut, in der Leber, der Milz, der Niere, in den Lymphknoten und bei 24 Stunden im Kot und Urin gemessen. Die Ergebnisse zeigen an, daß ein kleiner Anteil des Arzneimittels von dem lymphatischen System aufgenommen wurde. Bei einer Beurteilung der Werte im Plasma, in der Leber und in den Lymphknoten scheint es, daß eine Arzneimittelaufnahme geringer ist als im Vergleich mit Sojaöl oder Vitamin E und deren Gegenwart im Gewebe persistenter ist.
Ratten, in Gruppen von drei männlichen Tieren, wurden oral 1,0 ml an 0,9 % NaCl, das 10 oder 32 mg an mit einem Tensid, Synperonic PE/F 127 (2,5 Gew.-%), mikronisiertem BrEA enthielt, verabreicht. Die Ratten wurden bei 1,5, 5 und 24 Stunden nach der Verabreichung untersucht. Das Blut, die Leber, die Milz, die Niere, die Lymphknoten und das Gehirn wurden auf die ¹⁴C-Radioaktivität untersucht. Die Niveaus an BrEA im Blut waren im Vergleich mit den Experimenten mit BrEA im Vitamin E-Öl und Soja höher, 0,3 % bei 1,5 Stunden, und nahmen nach 5 Stunden auf 0,8 % und 0,9 % der 10 bzw. 32 mg-Dosen zu. Darüber hinaus waren die Werte in den Lymphknoten ähnlich zu denen, die bei 1,5 Stunden gemessen wurden, und die Niveaus wurden beibehalten bei 5 Stunden (5,3 und 5,0 %) und 24 Stunden (3,7 und 3,1 %) für die 10 bzw. 32 mg-Dosen (Verweis auf Tabelle 6).
In einem wiederholten Dosierungsexperiment wurde Ratten intragastrisch 1,0 ml an 0,9 % NaCl, das 2 mg an BrEA, mikronisiert mit Synperonic PE/F 127 (2,5 Gew.-%) enthielt, alle 6 bis 16 Stunden verabreicht. Die Ratten (3/Zeitpunkt) wurden bei 40, 72, 84, 90 und 96 Stunden nach der ersten Verabreichung getötet. Das Blut, die Leber, die Milz, die Niere und die Lymphknoten wurden auf die ¹⁴C-Radioaktivität untersucht. Gegenüber früheren Studien wurden bei diesem Experiment höhere Niveaus im Blut, in der Leber, den Nieren und den Lymphknoten festgestellt.
Ratten, in Gruppen von drei männlichen Tieren, wurde oral 1,0 ml an 0,9 NaCl, das 2, 4 oder 10 mg an BrEA, ohne ein Tensid mikronisiert, enthielt, verabreicht. Die Ratten wurden bei 1,5, 5 und 24 Stunden nach einer Verabreichung getötet, und das Blut, die Leber, die Milz, die Niere, die Lymphknoten und das Gehirn wurden auf ¹⁴C-Radioaktivität untersucht. Die Konzentration an ohne ein Tensid mikronisiertem BrEA in den beobachteten Geweben war geringer als BrEA plus ein Tensid.
Beispiel 6. Inhibierung von Parasiten in vitro
Für einen in vitro Antimalariatest wurden Mikrotiterplatten verwendet. Die Konzentrationen an Arzneimitteln wurden hergestellt als pmol/Kavität gemäß den WHO-Standardverfahren (WHO, 1990). Die Testverbindung wurde in 15 % DMSO in sterilem RPMI-1640 gelöst. Es wurden sowohl Chloroquin-sensitive (z.B. WS/97) als auch -resistente (z.B. MN/97) Isolate von Plasmodium-Spezies verwendet.
Ein Schizont-Inhibierungsassay wurde wie folgt durchgeführt. Die Mikrotiterplatten wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung vordosiert. Es wurden 50 μl an parasitierter Erythrozytensuspension in RPMI-1640 (0,2 ml Erythrozyt + 0,3 ml Serum + 4–5 ml RPMI-1640) in Mikrotiterkavitäten verteilt, welche verschiedene Konzentrationen an Arzneimittel enthielten. Für jede Konzentration wurde ein dreifacher Ansatz durchgeführt.
Es wurde ein ³H-Hypoxanthin-Inkorporationsassay wie folgt durchgeführt. Der Test wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von Desjardins et al., 1979. Nach einer Kultur während 30 Stunden bei 37°C wurde dieselben Mikrotiterplatten aus dem Schizont-Inhibierungsassay mit weiteren Dreifachkavitäten mit ³H-Hypoxanthin über Nacht gepulst. Die Zellsuspensionen wurden zweimal mit einer Millipore-Filtervorrichtung auf Millipore-Glasfaserfiltern gewaschen. Die Filterscheiben wurden mittels eines Beckman LS6000 β-Szintillationszählers auf DPM gezählt. Die Aktivität des Arzneimittels wurde gemessen, indem DPM gegenüber der Konzentration an Arzneimittel aufgetragen wurde.
Aktivität der Verbindungen gegenüber Chloroquine-sensitive T996/86 P. falciparum in vitro
Die Aktivität von 16α-Chlorepiandrosteron und 16 α-Bromdehydroepiandrosteron gegenüber Chloroquin-sensitivem T996.86 und Chloroquin-resistentem KI P. falciparum in vitro ist nachfolgend aufgezeigt.
Andere Verbindungen der Formel 1, z.B. irgendeine Verbindung in der Verbindungsgruppe 1 bis 25–6, werden auf eine ähnliche Weise verwendet, um Plasmodium-Parasiten zu inhibieren.
Beispiel 7. In vivo Vier-Tage-Protokoll zur Inhibierung von Plasmodium berghei
Der 4-Tage-Suppressionstest wurde in großem Umfang verwendet und kann innerhalb eines Zeitraums von 1 Woche durchgeführt werden. Der Test besteht aus der Inokulation von parasitierten Erythrozyten am ersten Tag des Experiments (D₀), gefolgt von einer Injektion der Testverbindung, welche auch am 2., 3. und 4. Tag des Protokolls verabreicht wird. Am 5. Tag werden Blutausstriche genom men und die Antimalaria-Aktivität wird abgeschätzt durch entweder Berechnen der Parasitämie oder durch Bewerten der Parasitenzahlen auf einer vorbestimmten Skala (d.h. 1–5). Peters (Ann. Trop. Med. Parasitol. 64: 25–40, 1970) beschreibt ein grundlegendes Verfahren unter Verwendung dieses 4-Tage-Tests.
Das Protokoll wird wie folgt zusammengefaßt: Fünf weibliche TO-Mäuse wurden pro Testgruppe verwendet. Es wurden P. berghei HP15 ANKA-Parasiten durch eine Herzpunktur unter Verwendung einer heparinisierten Nadel von einer Spendermaus mit einer 30+ % Parasitämie gesammelt. Das Blut wurde mit einem Verdünnungsmittel (50 % HIFCS + 50 % steriles PBS) auf eine Endkonzentration von 1 Parasitämie oder 1 × 10⁷ infizierten Erythrozyten pro 0,2 ml der infizierenden Suspension verdünnt. Jede Maus wurde intravenös geimpft, was eine gleichförmigere Infektionsrate als bei einer intraperitonealen Verabreichung von 0,2 ml der infizierenden Suspension erzeugte. Die Testverbindungen wurden hergestellt mit Dosen von 100 mg/kg in (16,7 % DMSO + 83,3 % Celacol). Die Steroidformulierungen wurden intraperitoneal 2 Stunden nach einer Parasitenimpfung verabreicht. Die Verbindungen wurden einmal am Tag ausgehend von D₀ verabreicht und an den folgenden drei Tagen fortgeführt. Die Blutausstriche wurden hergestellt aus Schwanzblut an dem Tag nach der letzten Dosierung der Verbindung, und das Blut wurde mit 100 % Methanol fixiert und mit 10 % Giemsa angefärbt. Die Parasitämie wurde auf einer Skala von 0–5 bewertet, wobei 5 gleich der Kontrolle ist.
Durch intravenöse Injektion wurde ein Inokulum von 1 % Parasitämie 1 × 10⁷ Erythrozyten/ml, 0,2 ml pro Maus (weibliche Maus vom Stamm TO) zugeführt. Die Arzneimittelverabreichung begann 2 Stunden nach der Impfung am Tag 1 und wurde während 3 Tagen fortgeführt. Die Ergebnisse aus den Blutausstrichen von allen 20 Tagen am Tag 5, wo eine Parasitämie untersucht wurde, sind unten aufgezeigt.
Bei einem ähnlichen Protokoll werden Mäuse durch eine I.V.-Injektion mit einer Lösung geimpft, die 1 × 10⁷ Erythrozyten/ml enthielt. Zwei Stunden später wird Arzneimittel durch eine I.V.-Injektion zugeführt. Es wird BrEA oder eine andere Verbindung der Formel 1 gegeben (0,2 ml I.V. oder S.C.) einmal am Tag während 4 Tagen. Schnitte in den Schwanz werden verwendet, um Blut nach der Studie zu erhalten. Mit P. berghei infizierte Mäuse wurden verwendet, um infizierte Zellen zu erhalten. Die Parasiten werden geerntet aus dem Herzblut der Maus, und es werden nichtinfizierte Mäuse unter Verwendung von 0,2 ml an Blut mit 14 % Parasitämie pro Maus I.V. infiziert. Zwei Stunden später wird den infizierten Tieren die erste Dosis an BrEA (100 mg/kg I.V. oder S.C.) zugeführt. Die BrEA-Formulierung war eine sterile Lösung, die 15 mg/ml BrEA in 45 % Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und 0,9 % Salzlösung enthielt. Bei 1, 2, 3 und 4 Tagen nach der Infektion der Tiere wird den infizierten Tieren BrEA (100 mg/kg I.V. oder S.C.) zugeführt. Am Tag 30 trat kein Todesfall auf in der Gruppe, die BrEA I.V. erhielt, jedoch waren alle Kontrolltiere am Tag 10 tot. Alle durch S.C.-Zuführung mit BrEA behandelten Tiere waren am Tag 11 tot.
Beispiel 8. Rattenstudie in vitro und in vivo
In dem in vitro-Protokoll wird das Niveau des Parasiten (Plasmodium falciparum, Chloroquin-sensitiver Stamm WT und Chloroquin-resistenter Dd2) mit dem Medium auf 1 und der Hämatokrit auf 7 % eingestellt. Unter Verwendung einer Platte mit 96 Kavitäten werden 50 μl an Parasit und 100 μl an Arzneimittel in einer Mischung mit dem Medium zu jeder Kavität gegeben, und das Verfahren wird als Dreifachtest durchgeführt. Die Platte wird in eine Kammer gegeben, die eine physiologische Gasmischung enthält, und bei 37°C inkubiert. Die Medium/Arzneimittel-Mischung wird bei 24, 48 und 72 Stunden gewechselt. Am Tag 5 (96 Stunden) werden von jeder Kavität Objektträger hergestellt, mit Gemsia angefärbt und 500 rote Blutzellen für jeden Objektträger gezählt. Die Dreifachproben werden gemittelt und die Daten als prozentuale Inhibierung angegeben.
In dem in vivo-Protokoll wurde Lewis-Ratten, die ein Gewicht von 80–85 g besaßen, eine standardisierte IP-Injektion des Parasiten (Plasmodium berghei) gegeben. Den Ratten wurde dann intravenös 2 Stunden später eine Injektion gegeben mit einer der in der nachfolgenden Tabelle beschriebenen Behandlungen, diese wurden dann in ihren Käfig zurückgegeben, mit standardisiertem Laborfutter gefüttert, und es wurde ihnen ein freier Zugang zu Wasser ermöglicht. Die Tiere wurden 24, 48 und 72 Stunden nach der ersten Behandlung gewogen und erneut behandelt und erneut in ihren Käfig zurückgegeben, und es wurde ihnen ein freier Zugang zu Nahrung und Wasser ermöglicht. Die Tiere wurden am Tag 5, 11 und 28 nach der Impfung erneut gewogen, und dann wurde ihnen unter Verwendung einer 26 gauge Nadel Blut abgenommen. Der Hämatokrit wurde gemessen und für jede Ratte wurden Blutausstriche hergestellt. Die Blutausstriche wurden unter Verwendung von Gemsia angefärbt, und das Niveau der Parasitämie (definiert als der Prozentsatz an roten Zellen mit Parasiten) wurde bestimmt. Die Tiere wurden erneut in ihren Käfig zurückgegeben und zweimal täglich auf ein Auftreten einer fortschreitenden Erkrankung untersucht, die definiert ist als eine Teilnahmslosigkeit und/oder eine nachteilige Arzneimittelreaktion, welche definiert ist als ein Verlust von 20 % an ursprünglichem Körpergewicht, über eine Gesamtheit von 28 Tagen. Wenn entweder eine fortschreitende Erkrankung oder eine Arzneimittelreaktion festgestellt wird, werden die Tiere eingeschläfert.
Die BrEA-Formulierung war eine sterile Lösung, die 15 mg/ml an BrEA in 45 % an Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und 0,9 % an Salzlösung enthielt.
Die intravenösen Injektionen wurden an den Tagen 0, 1, 2 und 3 gegeben, und die Ergebnisse sind unten aufgezeigt. Die Ergebnisse zeigten, daß eine Behandlung in vivo mit einer Formulierung, die BrEA umfaßt, eine Parasitämie bis auf ein Niveau verringert, das vergleichbar ist mit dem, das bei der Chloroquin-Kontrolle ("Clq") zu sehen ist. Die Ergebnisse sind unten zusammengefaßt.
Beispiel 9. Klinische Humanstudie – Parasiteninfektion
Die Antwort auf eine Arzneimittelbehandlung wurde gemäß den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (WHO 1973) bei infizierten Patienten bewertet. Eine Wertung der therapeutischen Antwort wurde bestimmt unter Verwendung der parasitären und Fieber-Clearance-Zeiten. Die parasitäre Clearance wurde ausgedrückt als drei Indizes; die Zeit für einen Abfall der Parasitenzählung um 50 des Vorbehandlungswerts (Basislinie) (PC₅₀), (ii) die Zeit für einen Abfall der Parasitenzählung von 90 % des Basislinienwerts (PC₉₀) und (iii) die Zeit für einen Abfall der Parasitenzählung unterhalb des Niveaus der mikroskopischen Erfassung (Parasiten-Clearance-Zeit PCT) (N.J. White und S. Krishna Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 83: 767–777, 1989; White et al., J. Infect. Dis. 165: 599–600, 1992; White et al., J. Infect. Dis. 166: 1195-1196; 1192). Die Fieber-Clearance-Zeit wurde definiert als die Zeit ab der Arzneimittelverabreichung bis zu dem Zeitpunkt, bei dem die orale oder rektale Temperatur auf oder unterhalb 37,2°C fällt und dort mindestens 48 h bleibt.
Von zwei Patienten wurde vor einer Behandlung und bei 4, 6, 8, 12, 18, 20, 24, 30 und 36 h nach einer Behandlung oder bei 4- oder 6-stündigen Intervallen nach einer Behandlung venöses Blut (5 ml) erhalten, bis eine vollständige Clearance der peripheren Parasitämie erreicht war. Das Blut wurde aseptisch gesammelt und auf 10 ml Spritzen übertragen, welche 2 ml an Acid-Citrat-Dextrose (ACD) für eine in vitro-Kultur enthielten. Vor einer Inkubation wurde das Plasma von den roten Blutzellen abgetrennt, und die roten Blutzellen wurden zweimal gewaschen. Die Parasiten wurden durch eine Modifikation von standardmäßigen in vitro-Kulturtechniken kultiviert (W. Trager und J.B. Jensen, Science 193: 673–675, 1976; A.M. Oduola et al., J. Protozool. 39:605–608, 1992). Die Proben wurden in sterilen Zentrifugationswürfeln innerhalb von 10 min ab der Sammlung verteilt und zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde gelagert, während die kompaktierten Zellen zweimal mit Kulturmedium (Waschmedium, RPMI-1640-Medium, das 25 mM HEPES-Puffer und 25 mmol/l NaOH enthält) gewaschen wurden. Die Buffy-Coat (Leukozytenmanschette) wurde durch Vakuumabsaugung entfernt. Es wurde für jede der Blutproben eine 1:10-fache Verdünnung mit vollständigem Waschmedium [CMP (Waschmedium, das mit 10 % an Humanplasma ergänzt ist)] durchgeführt. 1 ml einer jeder der Proben wurde in 2 Kavitäten einer Mikrokulturplatte mit 24 Kavitäten übertragen. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre aus vorvermischtem Gas mit 5 % an CO₂, 5 % an O₂ und 90 an N₂ inkubiert. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt, und es wurden dünne Blutausstriche für eine Mikroskopie bei 24 und 48 Stunden nach dem Start der Kultur hergestellt. Die Kulturproben wurden mit nichtparasitierten gewaschenen roten Blutzellen vom Typ A Rh-positiv verdünnt, wenn der Anteil an parasitierten roten Blutzellen größer als 2 % war.
Mikroskopie
Während der in vivo-Studie wurden dünne und dicke Blutausstriche mit dehydratisiertem Methanol (100 %) fixiert und erwärmt, wurden entsprechend mit 10 % Giemsa während 20 min angefärbt. Die Parasitämie wurde in dünnen Filmen quantifiziert durch Auszählen von 2000 roten Blutzellen in klaren benachbarten Feldern und Finden des Anteils, der parasitiert war. In dicken Filmen wurde die Parasitämie quantifiziert durch Zählen von Parasiten gegenüber Leukozyten. Ein Film wurde als negativ deklariert, wenn keine Parasiten nach einer Begutachtung von 200 Mikroskopfeldern bei einem dicken Ausstrich gefunden wurden. Während der in vitro- und ex vivo-Untersuchung wurde eine Vorbehandlung von dünnen und dicken Ausstrichen auf Ringstadien bewertet durch das Verfahren von Jiang, das modifiziert wurde durch Li et al. (J.B. Jiang et al., Lancet 2(8293): 285–288, 1982; K. Silamut und N.J. White, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87: 436–443, 1993; X.L. Li et al., Chi. J. Parasitol. Dis. 12: 296, 1994). Ungefähr 5000 Erythrozyten wurden in klaren benachbarten Feldern 24 und 48 h nach einer Inkubation von Blut gezählt, das erhalten wurde zu jedem Zeitpunkt, und bewertet hinsichtlich der Reife in winzige Ringe, kleine Ringe, große Ringe, pigmentierte Trophozoiten und Schizonten. Eine funktionale Lebensfähigkeit wurde abgeschätzt als der Prozentsatz an asexuellen Ringformen, die in der Lage sind, zu pigmentierten Trophozoiten oder Schizonten nach 24–48 h einer in vitro-Kultur zu reifen (W.M. Watkins et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87:75–78, 1993).
Berechnung von Parametern
Die Patienten zeigten eine akut symptomatische ernste nichtzerebrale reine P. falciparum Malaria. Sie besaßen eine orale Fluidintoleranz, Körpertemperaturen von mehr als 39°C, mehr als 5000 Parasiten pro Mikroliter an Blut, eine asexuelle Parasitämie, und sie besaßen einen negati ven Urintest auf Antimalaria-Arzneimittel. Ihnen wurden alle vier Stunden intravenös 25 ml an BrEA, das in sterilem 45 % β-Cyclodextrin in Salzlösung bei einer Konzentration von 25 mg/ml suspendiert war, verabreicht. Diese Therapie wurde während vier Tagen fortgeführt. Die Quantifizierung der Parasitämie und die klinische Begutachtung wurden während der ersten 72 Stunden alle 6 Stunden durchgeführt, gefolgt von einer täglichen Bewertung der Parameter bis zum Tag 7 (168 h) und danach am Tag 14.
Blutausstriche wurden mit Giemsa angefärbt, und die Quantifiziertung der Parasitämie wurde in dicken Filmen durchgeführt durch Zählen von 2000 Parasiten gegenüber Leukozyten und in dünnen Filmen durch Finden des Anteils an infizierten roten Blutzellen. Eine Antwort auf eine Arzneimittelbehandlung wurde bewertet gemäß den WHO-Kriterien. Eine Bewertung der therapeutischen Antwort wurde durchgeführt unter Verwendung der parasitären und Fieber-Clearance-Zeiten. Die parasitäre Clearance wurde ausgedrückt als drei Indizes: die Zeit für einen Abfall der Parasitenzählung um 50 % des Vorbehandlungswerts (Basislinienwert) (PC₆₀); für einen Abfall um 90 % des Basislinienwerts (PC₉₀); und für einen Abfall unterhalb des Niveaus der mikroskopischen Erfassung (parasitäre Clearance-Zeit) PCT.
Die Fieber-Clearance-Zeit wurde definiert als die Zeit ab einer Arzneimittelverabreichung bis zu dem Zeitpunkt, bei dem die orale/rektale Temperatur auf unterhalb 37,2°C fiel und über mehr als 48 Stunden so blieb. Die parasitäre Clearance-Rate am Tag 14 betrug 100 %. Die klinische Antwort umfaßte somit bei beiden Patienten eine Wirkung auf die Parasitämie und verbesserte ein oder mehrere Symptome der Infektion.
Beispiel 10. Zellstudien in vitro
Die Wirkung von BrEA auf die Aktivität des Pentosephosphatwegs (PPS) in normalen menschlichen RBC wurde unter Verwendung ganzer Zellen untersucht. Da Glucose-6-phosphatdehydrogenase ("G6PD") das limitierende Enzym des PPS ist, wird eine Messung des PPS-Flusses als eine Maßnahme erachtet, die besser eine G6PD-Aktivität in der gesamten Zelle widerspiegelt als vergleichsweise eine G6PD-Aktivitätsmessung in einem Zelllysat. Die in einem Zelllysat gemessene G6PD-Aktivität ist typischerweise ungefähr 1100-fach höher als der PPS-Fluß in der gesamten ruhenden nichtstimulierten RBC (G6PD-Aktivität im Zelllysat: 165; PPS-Fluß 0,142 Mikromol/Stunde/ml RBC). Der PPS-Fluß und die G6PD-Aktivität in der gesamten RBC ist abhängig von einer Anzahl an Faktoren (der Konzentration an NADPH, NAD und ATP und dem intrazellulären pH), welche konstant gehalten werden, wenn die Messung im Lysat durchgeführt wird, und variieren können in der gesamten RBC. Die Niveaus der G6PD-Aktivität in Zellen liegt beträchtlich oberhalb des normalen Grundbedarfs, und eine Inhibierung der gesamten G6PD-Aktivität könnte keine oder eine geringe Folge auf den PPS-Fluß in der gesamten Zelle haben. Eine RBC mit dem mediterranen G6PD-Mutanten mit ungefähr 1–3 % an restlicher Aktivität besitzt zum Beispiel im Vergleich mit normalen Individuen keine Beein trächtigung des grundlegenden PPS-Flusses, zeigt jedoch einen beeinträchtigten Fluß, wenn der Fluß durch den PPS durch Zugabe von Methylenblau stimuliert wird. Es wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt unter Verwendung variierender Mengen an BrEA, und der PPS-Fluß wurde gemessen in nichtstimulierten Basal-RBD und in mit Methylenblau (MB) stimulierten RBC.
Die nachfolgenden Daten zeigen einen PPS-Fluß (Mikromol/Stunde/ml RBC) in basalen nichtstimulierten und MB-stimulierten normalen RBC. Es wurden verschiedene Konzentration an BrEA (0,3, 3,5 und 7 Mikromolar, am Ende) zu Suspensionen von gewaschenen RBD, die in RPMI, pH 7,4, bei 10 % Hämatokrit suspendiert sind, gegeben, wobei der PPS-Fluß ohne eine weitere Inkubation und ohne weitere Waschungen sofort gemessen wurde. Mit BrEA von 7 μM wurde eine geringfügige Inhibierung des MB-stimulierten PPS-Flusses beobachtet.
Die nachfolgenden Daten zeigen mittlere Werte von 3 Experimenten, wobei ein basaler, nichtstimulierter und MB-stimulierter PPS-Fluß (Mikromol/Stunde/ml RBC) in normalen RBC gemessen wurde. Bei diesen Experimenten wurden verschiedene Konzentrationen an BrEA (~0,8, 8 und 80 Mikromolar, am Ende) zu Suspensionen von gewaschenen RBC, die in RPMI, pH7,4, bei 10 % Hämatokrit suspendiert sind, gegeben. Nach einer Inkubation von 90 min bei 37°C mit und ohne BrEA wurde der PPS-Fluß gemessen. Die Resultate zeigten eine dosisabhängige Inhibierung des MBstimulierten PPS-Flusses. Die Inhibierung betrug 10 % bei 8 Mikromolar (p = 0,006 gegenüber Konrolle + DMSO) und 25 % bei 80 Mikromolar (p = 0,002 gegenüber Kontrolle + DMSO).
Beispiel 11. Inhibierung des Parasitenwachstums
Es wurde der Effekt von Epi (16α-Bromepiandrosteron) auf ein Parasitenwachstum (Plasmodium falciparum) aufgezeigt. EPI war bei einer Konzentration von 1 μM aktiv.
Die Parasitämie wurde bestimmt mittels Standardverfahren (mikroskopische Begutachtung von mindestens 500 Zellen, angefärbt mit Diff-Quick^TM (Baxter)). Die Parasiten wurden unter Standardbedingungen in RPMI-1640, versetzt mit Hepes/Glucose (10 mM), Glutamin (0,3 g/l) und 10 % Humanplasma, kultiviert. Der Hämatokrit betrug 1 %.
Beispiel 12. Stimulation der Phagozytose
Die Kapazität von BrEA betreffend einen Einfluß auf die Phagozytose von mit Plasmodium-Parasiten infizierten RBC wird untersucht unter Verwendung von adhärenten Human-Monozyten. Das Parasitämieniveau beträgt ungefähr 8–10 %, und die Human-Monozyten werden aus dem Blut wie folgt aus den Buffy-Coats erhalten. Mononukleare Zellen aus peripherem Blut werden von frisch gesammelten Thrombozyten-armen Buffy-Coats getrennt, die verworfen wurden aus Blutproben von gesunden erwachsenen Spendern beiderlei Geschlechts. Die abgetrennten Zellen werden einmal mit lauwarmem PBS, ergänzt mit 10 mM an Glucose (PBS-G), gewaschen und wieder suspendiert mit 5 × 10⁶ Zellen/ml in eiskaltem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 23 mM NaHCO₃ und 25 mM Hepes, pH 7,4 (RMBH). Zu den Zellen werden während 20 min bei 4°C Dynabeads M450 Pan B und Pan T (Dynal) in einem Verhältnis von 4:1 gegeben. Wie durch den Hersteller spezifiziert, werden die B-Lymphozyten und T-Lymphozyten entfernt. Die verbleibenden Monozyten werden zweimal in RMBH gewaschen, in AIM V-Zellkulturmedium (Gibco) mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Monozytenschicht wird gesammelt, mit PBS-G bei 37°C gewaschen und in AIM V-Medium mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die gereinigten Zellen sind >90 % an Monozyten, bestimmt durch eine CD14-Expression.
Die Phagozytose von opsonisierten parasitisierten RBC (PE) wird wie folgt bestimmt. Eine Phagozytose von mit frischem Serum opsonisierten PE wird initialisiert durch Mischen von 10 PE/Monozyt. Die Suspensionen werden kurz zentrifugiert (150 × g während 5 s bei Raumtemperatur), um den Kontakt zwischen PE und Monozyten zu verbessern. Um ein Festhaften der Monozyten nach der Zentrifugation und während der gesamten Inkubationsperiode zu vermeiden, werden die Zellen in Suspension gehalten bei 5 × 10⁶ Zellen/5 ml AIM V-Medium in Schalen mit Teflonboden und einem Durchmesser von 6 cm (Heraeus) in einem befeuchteten Inkubator (95 % Luft, 5 % CO₂) bei 37°C. Im Mittel mindestens 90 % der Monozyten phagozytieren PE, bestimmt durch eine mikroskopische Begutachtung. Die Kontrollzellen werden unter ähnlichen Bedingungen ohne eine Phagozytose gehalten. Eine quantitative Auswertung der Phagozytose wird durch ein kürzlich beschriebenes Biolumineszenzverfahren durchgeführt (E. Schwarzer et al., Br. J. Xaematol. 1994, 88: 740–745).
Die Erythrozytenbehandlungen und Parasitenkulturen sind wie folgt. Es wird frisches Blut (Rh+) verwendet, um Erythrozyten (RBC) zu isolieren. Die gewaschenen RBC werden mit Schizont/Trophozoit-Parasitenstadien (Palo Alto-Stamm, Mycoplasma-frei) infiziert. Durch das Percoll-Mannitol-Verfahren werden Parasiten eines spezifischen Stadiums isoliert. Kurz zusammengefaßt werden normale parasitisierte RBC (SPE) im Schizont-Stadium, die auf einem Percoll-Mannitol-Gradienten getrennt wurden (Parasitämie >95 % SPE), mit RBC gemischt, die suspendiert sind in einem Wachstumsmedium (RPMI 1640-Medium, enthaltend 25 mmol/l an Hepes, 20 mmol/l an Glucose, 2 mmol/l an Glutamin, 24 mmol/l an NaHCO₃, 32 mg/l an Gentamicin und 10 % an AB– oder A-Humanserum, pH 7,30), um synchrone Kulturen bei ausgewählten Hämatokritwerten zu starten. Die Impfparasitämie ist eingestellt auf 20 Normal-SPE für eine Isolation von ringparasitisierten RBC (RPE) und auf 5 % Normal-SPE für eine Isolation von parasitisieten RBC im Trophozoit-Stadium (TPE). 14–18 Stunden nach einem Impfen sind die Parasiten im Ringstadium im ersten Zyklus; bei 34–33 Stunden sind die Parasiten im Trophozoit-Stadium im ersten Zyklus; und bei 40–44 Stunden nach dem Impfen sind die Parasiten im Schizont-Stadium im ersten Zyklus. RPE, TPE und SPE werden auf Percoll-Mannitol-Gradienten getrennt. Die Parasitämie beträgt für gewöhnlich 8–10 % RPE und >95 % TPE. Nichtparasitisierte und parasitisierte RBC werden elektronisch gezählt. Zur Bestimmung der Gesamtparasitämie und der relativen Verteilung auf RPE, TPE und SPE werden aus den Kulturen bei angegebenen Zeiten Objektträger hergestellt, mit Diff-Quik^TM Parasitenfärbemittel angefärbt, und es werden mikroskopisch ungefähr 400–1000 Zellen begutachtet.
Die Wirkung der Verbindung der Formel 1 wie BrEA in parasitisierten RBC wird untersucht unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Verbindung, z.B. BrEA, z.B. 0,5 μM, 1 μM, 10 μM, 25 μM und 50 μM. Die Trophozoiten-parasitisierten RBC, Schizont-parasitisierten RBC oder ringparasitisierten RBC werden wie beschrieben untersucht.
Beispiel 13. Klinischer Humanmalaria-Versuch
Es wird ein klinisches Versuchsprotokoll, das ungefähr 15–20 Patienten beinhaltet, festgelegt. Für einen Versuch der Phase I, I/II oder II sind die Patienten mit einem oder mehreren Plasmodium-Parasiten schwach infiziert, und sie zeigen schwache Symptome (weniger als 8-10 % Parasitämie bei RBC). Vor einer Behandlung werden die Patienten gegebenenfalls auf eine Infektion mit HIV, HCV, TB und Cryptosporidium getestet. Den Patienten mit einer oder mehreren Coinfektionen wird eine Standardbehandlung für die Coinfektion gegeben. Die Patienten werden für die Behandlung während einer Woche hospitalisiert. Zwei oder mehrere Dosierungsgruppen, z.B. 25, 50 oder 100 mg/Tag an BrEA, werden parenteral verabreicht, z.B. durch intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion an 3, 4 oder 5 Tagen der Woche, wenn die Patienten dosiert werden. Eine Dosierung findet an aufeinanderfolgenden Tagen oder nach einem intermittierenden Zeitplan statt, z.B. 2, 3 oder 4 Dosen, wobei eine Dosis jeden zweiten Tag gegeben wird.
Die BrEA-enthaltende Formulierung ist wie hierin beschrieben, z.B. die Formulierung des Beispiels 1 oder eine Formulierung, die 100 mg/ml an BrEA, PEG 300 ~30 v/v, Propylenglykol 30 % v/v, Benzylbenzoat 30 % v/v und Benzylalkohol 2 % v/v umfaßt. Am Tag 5–7, wenn eine Verringerung der Parasitämie um weniger als ungefähr 50 beobachtet wird, wird den Patienten eine Standardbehand lung für Malaria (Mefloquin) gegeben. Während der Woche der Behandlung und während 1, 2, 3 oder mehreren Wochen danach werden periodisch Blutproben genommen für eine Bewertung der Parasitämie, der Pharmakokinetiken, der Plasmazytokine (z.B. IL-2, IL-4, IL-10, IGF1, γIFN, GM-CSF) und der intrazellulären Zytokine (z.B. IL-2, IL-4, IL-10, IGF1, γIFN, GM-CSF). Die Patienten werden gegebenenfalls erneut bei ungefähr 2 bis 12 Wochen nach der Anfangsdosierung behandelt unter Verwendung desselben oder eines ähnlichen Protokolls wie dem, das beim Anfangsdosierungsprotokoll verwendet wurde.
Es wird eine beispielhafte Open-Label-Studie einer BrEA-Formulierung durchgeführt, die halbimmunen Patienten mit nichtkomplizierter Malaria intramuskulär verabreicht wird. Die Formulierung umfaßt 100 mg/ml BrEA, PEg300 ~30 % v/v, Propylenglykol 30 % v/v, Benzylbenzoat 30s v/v und Benzylalkohol 2 %. Für die ersten 7 Tage der Studie bleiben die Patienten im Krankenhaus. Die Patienten werden eine tägliche intramuskuläre Verabreichung von 50 mg oder 100 mg an BrEA während 5 aufeinanderfolgenden Tagen erhalten. Eine tägliche Bewertung für die ersten 7 Tage und bis zum Tag 14 der Studie kann eine Parasitämiebewertung (zweimal täglich), eine chemische, hämatologische und Arzneimittelniveaubewertung (pharmakokinetische Bewertung) einschließen. Wenn nach dem Tag 7 der Studie die Parasitämieniveaus von dem Screeningwert abnehmen und der Patient klinisch stabil ist, kann der Patient weiterbehandelt werden auf einer täglichen Basis im Hinblick auf die Parasitämie (zweimal täglich) für bis zu zusätzlichen 7 Tage als hospitalisierter Patient. Wenn ein Patient bei irgendeinem Zeitpunkt während der Studie klinisch instabil wird, wird der Patient nicht weiter in der Studie belassen, und es kann ihm eine Standardbehandlung für Malaria angeboten werden. Patienten mit einem Defizit hinsichtlich des Glucose-6-phosphatdehydrogenase enzyms können ausgeschlossen werden, da BrEA das Enzym hemmt. Andere Betrachtungen, die zu einem Ausschluß von Patienten aus dem Versuch führen können, umfassen Patienten, bei denen einer der folgenden Zustände diagnostiziert wird: schwere Anämie (Hämatokrit < 21 % oder Hämoglobin < 7 g/dl); Nieren- oder Leberversagen aufgrund der Vorgeschichte und/oder von Laborergebnissen, einem Respiratory-Distress-Syndrom, das belegt wird durch Atemnot oder eine Atemfrequenz ≥ 30 pro Minute; eine Hypotension (systolischer Blutdruck < 90 mm Hg); eine Tachykardie (Herzfrequenz > 130 Schläge/Minute); eine Schwangerschaft oder stillende Frauen; eine signifikante, aktive comorbide Erkrankung (akute medizinische Diagnosen erfordern eine spezifische Therapie); Patienten mit einer Parasitämie > 10 % bei einem peripheren Ausstrich.
Es können Blutproben gesammelt werden von jedem Patienten für zukünftige klinische Bewertungen wie die Bestimmung von Aktivierungsmarkern oder immunologischen Analysen (z.B. Assay für intrazelluläre oder extrazelluläre Interleukine IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-12, γIFN und TNFα).
Beispiel 14. Liposomformulierung
Liposome, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, werden wie folgt hergestellt. Es werden 400 mg an Phosphatidylcholin und 8 mg an BrEA in Chloroform und Methanol (2:1 v/v) gelöst, und die Lösung wird durch Rotationsverdampfen unter reduziertem Druck getrocknet. Der resultierende Film wird durch Zugabe von 8,0 ml einer 0,9 %igen w/v NaCl-Lösung rehydratisiert und die Lösung gerührt. Die Größen der Liposome werden gegebenenfalls gemessen, z.B. durch Photonenkorrelationsspektroskopie (Malvem Zetasizer 3000 oder eine äquivalente Vorrich tung). Die Liposome werden gegebenenfalls hinsichtlich der Größe angepaßt durch z.B. eine Ultraschallbehandlung, um die mittlere Größe unterhalb 400 mit zu reduzieren, oder durch Filtration unter Verwendung geeigneter Filter. Ähnliche Verfahren werden verwendet zur Herstellung von Liposomzubereitungen, die eine Verbindung der Formel 1 mit ungefähr 15–100 mg/ml enthalten. Die Formulierung wird für eine Zuführung der Verbindung auf oralem oder parenteralem Weg (I.M., S.C., I.V.) verwendet.
Beispiel 15. Cyclodextrinformulierung
Eine Cyclodextrinformulierung, die BrEA enthält, wird wie folgt hergestellt. Es werden 45 g an Hydroxypropyl-β-cyclodextrin zu 1 1 einer sterilen physiologischen Salzlösung gegeben, und die Mischung wird während ungefähr 4-24 Stunden gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wird. Es wird nichtmikronisiertes BrEA zugegeben, um eine Konzentration von 20 mg/ml zu erhalten, und die Mischung wird gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die Lösung wird durch Filtration unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,2 μm sterilisiert und in sterile Behälter aufgeteilt. Es werden ähnliche Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinformulierungen verwendet, die eine Verbindung der Formel 1 mit ungefähr 15–100 mg/ml enthalten. Die Formulierung wird verwendet zur Zuführung der Verbindung auf oralem, parenteralem (I.M., S.C., I.V.) Weg oder über eine bukkale oder sublinguale Route.
Beispiel 16. Suppositorische Formulierung
Eine suppositorische Formulierung, die eine Verbindung der Formel 1 enthält, wie BrEA, wird wie folgt hergestellt. Es wird ausreichend nichtmikronisiertes BrEA abgemessen, um eine gewünschte Anzahl an Einheiten zu erhalten, die jeweils 500 mg an BrEA umfassen. Das BrEA wird mit einer Suppositoriumbase, z.B. Triglycerid aus Pflanzenspeiseöl, vermischt, um gewünschte Charakteristiken zur Verfügung zu stellen, z.B. einen Gehalt an freien Fettsäuren von ungefähr 0,1 % w/w, einen Verseifungswert von ungefähr 242, eine Iodzahl von ungefähr 3, eine Feuchtigkeit bei ungefähr 0,1 % w/w und einen Schmelzpunkt in einer geschlossenen Kapillare von ungefähr 35°C.
Beispiel 17. Klinischer Human-HCV-Versuch
Ein weiblicher Patient, der mit HIV und HCV infiziert war, wurde I.V. mit BrEA an 3 aufeinanderfolgenden Tagen dosiert, wobei eine Formulierung verwendet wurde, die 20 mg/ml an BrEA in 45 % w/v an Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und Salzlösung enthielt. Dem Patienten wurden alle 4 Stunden während der 3-tägigen Behandlungsperiode 4 ml der Formulierung (80 mg BrEA) verabreicht. Das HCV-Niveau des Patienten vor der Dosierung betrug 6,5 Log₁₀, was gemessen wurde mittels PCR, und das HCV-Niveau betrug 6,2 Log₁₀ am ersten Tag der Dosierung, 5,5 Log₁₀ am dritten Tag der Dosierung und 4,9 Log₁₀ drei Tage nach der letzten verabreichten Dosis. Die HIV RNA-Niveaus, gemessen mittels PCR, betrugen 5,2 Log₁₀ (vor der Dosierung), 5,8 Log₁₀ (erster Tag), 5,9 Log₁₀ (dritter Tag) und 5,4 Log₁₀ (Tag 6). Die NK-Zellenzählung (Zellen/mm³) betrug 28, 41 und 38 zum Zeitpunkt vor der Dosierung, am Tag 0 und am Tag 3.
Beispiel 18. Formulierung
Es wurde eine Formulierung hergestellt, umfassend 100 mg/ml an BrEA, ~30 % v/v an PEG 300, 30 % v/v an Propylenglykol, 30 % v/v an Benzylbenzoat und 2 % v/v an Benzylalkohol, indem BrEA in Polyethylenglykol 300 suspendiert wurde und anschließend Propylenglykol und Benzylbenzoat zugegeben wurden, um eine Lösung zu bilden, die auf das gewünschte Endvolumen mit zusätzlichem Propylenglykol verdünnt wurde. Das Verfahren wird unten beschrieben.
Die berechnete Menge an Polyethylenglykol 300 wurde einem Mischgefäß zugegeben. Dann wurde unter Mischen die berechnete Menge an BrEA dem Gefäß zugegeben und während mindestens 5 Minuten vermischt, um eine glatte, cremige Flüssigkeit zu bilden; es wurde Propylenglykol dem Gefäß zugegeben und während mindestens 5 Minuten gemischt, um eine gleichförmige Suspension zu bilden. Die berechnete Menge an Benzylbenzoat wird dem Gefäß zugegeben und während ungefähr 5 Minuten gemischt, um eine durchscheinende flüssige Suspension zu bilden. Dann wurde das Propylenglykol zugegeben, um die gewünschte Endformulierung zu erreichen, und es wurde während ungefähr 5 Minuten gemischt. Die Arzneimittellösung wurde auf eine Volumenspendervorrichtung übertragen, die eingestellt wurde, um 1,2 ml pro Phiole abzugeben. Die Lösung wurde unter Stickstoffdruck durch zwei in Reihe angeordnete 0,2 μm-Polyvinylidenfluoridfilter in bernsteinfarbene Glasphiolen mit 2 cm³ filtriert. Die Phiolen wurden mit teflonbeschichteten Butylgummistopfen abgedeckt und mittels Klammern versiegelt.
Beispiel 19. Klinisches Protokoll bei opportunistischer Infektion
Eine randomisierte, Placebo-kontrollierte Doppelblindstudie mit 100 mg an BrEA, das intramuskulär verabreicht wird an Patienten in einem späten Stadium einer HIV-Infektion mit einem Risiko für opportunistische Infektionen (OIs). HIV-1-serumpositive Patienten mit einer CD4-Zellzählung ≤ 100 Zellen/mm³, HIV RNA bei 1 × 10⁶ Kopien/ml und einer Kamofsky-Bewertung von mindestens 60 werden für eine potentielle Miteinbeziehung in das Protokoll identifiziert. Die Patienten in allen klinischen Protokollen müssen vor Screeningbewertungen eine schriftliche Einwilligungserklärung verstehen und unterschreiben.
Es wird BrEA in der Formulierung des Beispiels 16 verwendet. Eine Verabreichung des Arzneimittels oder Vehikels wird während 3 bis 5 aufeinanderfolgenden Tagen stattfinden, gefolgt von ungefähr 35–90 Tagen der Beobachtung, z.B. 37 Tagen der Beobachtung. Eine beispielhafte Behandlungstherapie umfaßt 5 Tage der Behandlung, gefolgt von 37 Tagen der Beobachtung, was wiederholt wird während insgesamt 7 Durchläufen über 42 Wochen. Die Häufigkeitsrate der OIs ebenso wie die Zeit zur Lösung oder Kontrolle der OIs wird überwacht und mit einer Placebokontrollgruppe verglichen. Die Patienten können monatlich während 2 oder 3 Monaten nach der Vollendung der Studie für eine Nachverfolgung beobachtet werden. Das Auftreten von OIs oder Zuständen im Zusammenhang mit AIDS wird überwacht, z.B. wie Tuberkulose (TB), Candadiasis, Pneumocystis pneumonia (PCP), Diarrhöe oder Kaposi-Sarkom, können als Protokollendpunkte bewertet werden. Wenn ein Patient mit einer oder mehreren der für das Protokoll spezifizierten opportunistischen Infektionen diagostiziert wird, wird die Protokolltherapie, eine Behandlung der OI initiiert, z.B. Fluconazol für Candidiasis oder für PCP, Trimethoprim und Sulfamethoxazol oder Dapson. Ein ähnliches Protokoll wird mit anderen Verbindungen der Formel 1 verwendet.
Beispiel 20. Klinisches Human-HIV-Protokoll
Patienten mit einer HIV-Infektion werden dosiert mit einer i.m.-Injektion von 25–200 mg an BrEA unter Verwendung einer Formulierung, die 100 mg/ml an BrEA, PEG 300 30 % v/v, Propylenglykol 30 % v/v, Benzylbenzoat 30 % v/v und Benzylalkohol 2 % v/v enthält. Die Patienten werden einmal pro Tag während 5 aufeinanderfolgenden Tagen dosiert, gefolgt von einer Periode von ungefähr 28 Tagen oder länger ohne eine BrEA-Behandlung. Den Patienten wurden dann ein oder mehrere Durchläufe von 5 aufeinanderfolgenden Tagen der Dosierung mit BrEA zur Verfügung gestellt, gefolgt von einer Nichtdosierungsperiode von mindestens ungefähr 28 Tagen. Es wurden bis zu 5 Runden einer 5-tägigen Behandlung, gefolgt von mindestens 28 Tagen des Nichtdosierens, zur Verfügung gestellt. Immunologische Antworten wurden dann unter Verwendung von Blutoder Plasmaproben der Patienten mittels Durchflußzytometrie und anderer bekannter analytischer Methoden assayed. Immunzellenteilmengen oder andere gemessen Marker wurden innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe eines jeden Patienten assayed. Markierte Antikörper, z.B, anti-CD-Antigen-Antikörper, in Konjugation mit Fluoreszenzfarbstoffen (FITC, Phycoerythrin, Allophycocyanin oder PerCP) wurden hergestellt und im wesentlichen gemäß Standardprotokollen verwendet, wobei im Handel erhältliche Reagenzien verwendet wurden, siehe z.B. PharMingen, 1998, Research Products Catalog, technische Protokolle auf Seiten 732–774, Humanzelloberflächenmoleküle auf Seiten 182–295 und Maus-, Ratten- und Hamsterzelloberflä chenmoleküle auf Seiten 2–173, und Zytokin- und Chemokinreagenzien auf Seiten 344–489.
Das klinische Protokoll ist eine randomisierte Open-Label-Studie der Phase I/II mit 3 Dosierungsniveaus an BrEA, das intramuskulär an HIV-infizierte Patienten verabreicht wird, die bisher nicht behandelt wurden. Es gibt drei Behandlungsgruppen, und jede Gruppe wird aus 2 Teilen bestehen (Teil A und B). Die Patienten werden dieselben Dosierungen an BrEA über die Teile A und B der Studie erhalten. Wenn ein Patient eine antivirale Antwort (einen HIV-RNA-Titer von mindestens 0,5 log unterhalb des Mittelwerts der Screening- und Basislinienwerte) oder Verbesserungen (jegliche Abnahme der HIV-RNA-Titer unterhalb des Mittelwerts der Screening- und Basislinienwerte) von der empfangenen Behandlung während der Teile A und B der Studie erfährt, kann der Patient weiterführende 5-tägige Behandlungsdurchläufe der BrEA-Formulierung des Beispiels 2 mit den anfänglich erhaltenen Dosen erhalten. Dieser Behandlungsverlauf kann bis zu sechsmal wiederholt werden.
Alle Patienten können im Verlauf der Studie überwacht werden hinsichtlich der Niveaus an HIV-RNA (Chiron Quantiplex^TM Branched-Chain-DNA-Assay), T-Zellen-Teilmengen [CD4/CD8], provirale HIV-DNA (PBMC), Interleukinen [IL-2, 4, 6, 8, 10 und 12] (Serum), γIFN (Serum), Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor [IGF-1] (Serum) und Tumornekrosefaktor [TNF] (Serum). Bei einer Teilmenge der Patientenproben kann eine PBMC-quantitative Cokultur (Zellen) durchgeführt werden. Assays auf zusätzliche Aktivierungsmarker können durchgeführt werden. Analysen hinsichtlich chemischer und hämatologischer Bilder und Urinanalysen sind geplant. Zusätzlich können Patienten, die mit Hepatitis-B- und/oder -C-Viren, Malaria oder Tuberkulose coinfiziert sind, regelmäßig auf virale Titer oder mikrobiolo gische Kulturen überwacht werden. Von einer Teilmenge der Patienten werden seriell Blut- und Urinproben gesammelt für eine pharmakokinetische Bestimmung nach der ersten Dosis bei Teil A und der letzten Dosis bei Teil B.
Die Behandlung kann aus mehr als einer intramuskulären Injektion bestehen. Intramuskuläre Injektionen können an verschiedenen Stellen verabreicht werden (d.h. linker oder rechter Oberarm oder Oberschenkel oder Gesäß), und es kann eine einzelne 100 mg oder 200 mg Dosis an BrEA an Patienten in zwei oder mehreren Unterdosen von weniger als 100 mg (z.B. 50 mg) verabreicht werden.
Es gibt zwei Abschnitte dieser Studie, Abschnitt 1 und 2. Beide Abschnitte bestehen aus zwei Teilen, Teil A und Teil B. Die ersten 12 Patienten, die der Studie angehören, werden dem in Abschnitt 1 beschriebenen Entwurf zugeordnet. Die verbleibenden 24 Patienten werden dem Abschnitt 2 der Studie zugeordnet. Der Entwurf eines jeden Abschnitts wird unten bereitgestellt.
Der Teil A wird aus einer einzelnen intramuskulären Injektion einer BrEA-Formulierung bestehen. Der Tag, an dem der Patient die Injektion erhalten wird, wird der Tag 1 der Studie sein. Von Patienten, die an der pharmakokinetischen Untergruppe teilnehmen, werden seriell Blut- und Urinproben gesammelt, beginnend am Tag 1 der Studie. Der Teil B der Studie beginnt am Tag 8 der Studie (Abschnitt 1) oder am Tag 15 der Studie (Abschnitt 2).
Der Teil B des Abschnitts 1 besteht aus 5 aufeinanderfolgenden täglichen intramuskulären Injektionen der Formulierung des Beispiels 1 bei derselben Dosis, wie sie in Teil A der Studien erhalten wurden. Der Tag, an dem der Patient die erste Dosis empfängt, wird ungefähr am Tag 8–12 der Studie sein. Der 5-tägige Behandlungsverlauf wird gefolgt von einem ungefähr 28-tägigen Beobachtungszeitraum (oder ungefähr 32 Tagen ab einer ersten Dosis am Tag 8 zur Initiierung eines zweiten Behandlungsverlaufs am Tag 40). Während des Beobachtungszeitraums werden die Patienten befragt hinsichtlich einer Rückkehr zur Klinik auf wöchentlicher Basis für verschiedene Tests. Von Patienten, die der pharmakokinetischen Untergruppe zugehören, werden serielle Blut- und Urinproben gesammelt, beginnend ungefähr am Tag 12–17 der Studie.
Der Teil B des Abschnitts 2 besteht aus 5 aufeinanderfolgenden täglichen intramuskulären Injektionen der Formulierung des Beispiels 2 mit derselben Dosis, wie sie der Patient während des Teils A der Studie erhielt. Der Tag, an dem der Patient die erste Dosis erhält, wird ungefähr am Tag 15 der Studie sein. Dem 5-tägigen Behandlungsdurchlauf folgt ein ungefähr 45-tägiger Beobachtungszeitraum (oder ungefähr 49 Tage ab der ersten Dosis am Tag 15 der Studie zur Initiierung des nächsten Behandlungsverlaufs am Tag 64 der Studie). Während des Beobachtungszeitraums werden die Patienten befragt hinsichtlich einer Rückkehr zu der Klinik auf einer wöchentlichen Basis für verschiedene Tests. Von Patienten, die der pharmakokinetischen Untergruppe angehören, werden seriell Blut- und Urinproben gesammelt, beginnend ungefähr am Tag 19 der Studie.
Eine Randomisierung bei dieser Dosissteigerungsstudie geschieht wie folgt. Wenn 4 der 12 Patienten pro Behandlungsgruppe 5 Tage der täglichen Dosierung im Teil B vollendet haben und kein ernstes arzneimittelbedingtes negatives Ereignis erfahren haben, wird nach einer Rücksprache zwischen dem Sponsor und den Forschern eine Einschreibung in das nächsthöhere Dosisniveau stattfinden.
Die ersten vier eingeschriebenen Patienten werden der 50 mg Dosisgruppe zugeordnet. Wenn keine ernsten arzneimittelbedingten nachteiligen Ereignisse erfahren werden, werden die nächsten 8 Lebewesen in einem 1:1-Modus zufällig entweder dem 50 mg- oder 100 mg-Dosisniveau zugeordnet. Wenn keine ernsten arzneimittelbedingten negativen Ereignisse bei Patienten auftreten, die 100 mg erhalten, dann werden in einem 1:2:3-Modus die nächsten 24 Patienten zufällig entweder der 50, 100 oder 200 mg-Dosisgruppe zugeordnet.
Wenn 4 der 12 Patienten in einer Dosisgruppe ein ernstes arzneimittelbedingtes Ereignis erfahren (Grad III oder IV), werden 2 zusätzliche Patienten bei dem selben Dosisniveau eingeschrieben. Ein Einschreiben zusätzlicher Patienten auf das nächste Dosisniveau wird zeitweilig anhalten, bis die Sicherheit beurteilt ist. Wenn einer der zwei zusätzlichen Patienten ein ernstes arzneimittelbedingtes Ereignis erfährt, wird eine Dosierung in diesem Dosisniveau abgebrochen. Nach einer Rücksprache mit dem Sponsor und den Forschern können zusätzliche Patienten bei einer Dosis zwischen der dosislimitierten Gruppe und der nächstniedrigeren Dosisgruppe eingeschrieben werden, um die maximal tolerierte Dosis (MTD) zu bestimmmen. Ein Einschreiben zusätzlicher Patienten zu einem spezifischen Dosisniveau wird bestimmt in einer Protokolländerung.
Die Ergebnisse zeigten auf, daß eine einzelne 50 mg oder 100 mg Dosis von BrEA die Anzahl an aktivierten CD8⁺ und CD4⁺ T-Zellen (CD8⁺, CD69⁺, CD25^– Zellen), welche in dem Blut des Patienten zirkulierten, erhöhten. Auch die zirkulierende Anzahl an dendritischen Precursorzellen, NK-Zellen, LAK-Zellen und Zellen, welche ADCC-(Antikörper-abhängige, zellmediierte Zytotoxizität, mediiert durch die CD8⁺, CD16^– Immunzellteilmengen)-Funktionen mediieren, waren erhöht. Weitere Erhöhungen wurden für gewöhnlich beobachtet bei einer Dosierung während 5 aufeinanderfolgenden Tagen.
Einige der Ergebnisse sind unten zusammengefaßt. Durchlauf 1, 2 und 3 bezeichnen jeweils Behandlungstherapien von 5 aufeinanderfolgenden Tagen von einmal täglich einer Injektion mit BrEA (50 oder 100 mg BrEA pro Injektion). In den unten aufgezeigten Diagrammen bezeichnet HE2000 die Formulierung, die 100 mg/ml an BrEA, PEG 300 30 % v/v, Propylenglykol 30 % v/v, Benzylbenzoat 30 % v/v und Benzylalkohol 2 % enthält. Die unten aufgezeigten Daten wurden erhalten aus Patientenblutproben bei der Basislinie (an dem Tag, bei dem die Dosierung initiiert wurde) und bei verschiedenen Zeiten, nachdem die Patienten mindestens eine Dosis an BrEA erhielten. Die Ergebnisse zeigten signifikante Erhöhungen bei Immunzellpopulationen und Zytokinexpressionsprofilen im Zusammenhang mit Th1-Antworten. Die Patienten in diesem Protokoll besaßen anfänglich CD4-Zählungen von mindestens 200 pro mm³ und eine Serum-HIV-RNA-Beladung von 5000 bis 1 × 10⁶ RNA-Kopien/ml. Nach einer Dosierung mit einem Durchlauf an BrEA (5 aufeinanderfolgende tägliche i.m.-Injektionen) zeigten alle Patienten Erhöhungen bei den Niveaus der Immunzellen, einschließlich aktivierter CD8 T-Zellen (z.B. CD8⁺, CD69⁺, CD25^–), LAK-Zellen (z.B. CD8⁺, CD16⁺, CD38⁺), NK-Zellen (z.B. CD8^–, CD16⁺), ADCC-Zellen (z.B. CD8^–, CD16⁺) und dendritischer Zellen (Lin^–, HLA-DR⁺, CD11c⁺ oder Lin^–, HLA-DR⁺, CD123⁺). Die mittlere CD4 IL-10-Produktion fiel von einem Mittel von 66 % auf 4 der Zellen, während CD4 IFNγ sich von einem Mittel von 8 % auf 63 % bewegte, was zu einer Verschiebung der Zytokinproduktion von Th2 zu Th1 führt.
In den nachfolgenden Diagrammen sind die Basisliniendaten durch "BL" oder durch "pre" bezeichnet.
Beispiel 21. Behandlung von Symptomen einer HIV-Infektion
Zwei HIV-infizierte Patienten mit einer chronischen Diarrhöe wurden wie folgt mit BrEA dosiert. Eine BrEA-Formulierung (40 mg/ml an BrEA in 25 % v/v an PEG 300, 12,5 v/v an Ethanol, 5 % v/v an Benzylbenzoat, 57,5 v/v an Propylenglykol) wurde subkutan zugeführt. Die Patienten erhielten 60 mg an BrEA in 1,5 ml täglich während 10 Tagen. Während der Dosierungsperiode verschwand die Diarrhöe. Nach dem Ende der 10-tägigen Dosierungsperiode trat die Diarrhöe wieder auf. Bei anderen Patienten, die oral BrEA erhielten, ging die Diarrhöe ebenfalls in eine Remission über.
Beispiel 22. Subkutane Formulierung
Es wurde eine BrEA-Formulierung im wesentlichen wie hierin beschrieben hergestellt. Die Formulierung enthielt 50 mg/ml an BrEA, 40 % v/v an PEG 200, 2 % v/v an Benzylalkohol, 2 % v/v an Benzylbenzoat und ~66 % v/v an Propylenglykol (qs). Die Formulierung ist besonders geeignet für eine subkutane Verabreichung der Verbindung.
Beispiel 23. Herstellung von BrEA-Hemihydrat – Verfahren 1
Rohres BrEA wurde hergestellt durch Bromieren von Epiandrosteron, gefolgt von einer Kristallisation aus Methanol. Das Hemihydrat wurde hergestellt durch Auflösen von 25 g an rohem BrEA in 75 ml an Ethanol unter Rückfluß und mit moderatem Rühren. Zu der BrEA-Lösung wurden langsam 12,5 ml an Wasser gegeben, während die Lösung unter Rühren unter Rückfluß gehalten wurde. Ein Rühren der Lösung wurde fortgeführt, und man ließ die Lösung dann auf ungefähr 20–25°C abkühlen und hielt sie während ungefähr 15 Minuten bei ungefähr 20–25°C, um eine Suspension von BrEA-Hemihydratkristallen zu erhalten. Die Kristalle wurden durch Filtration rückgewonnen, mit einer Lösung von 25 ml an Wasser:Ethanol (5:1 v/v) bei ungefähr 20–25°C gewaschen und dann während ungefähr 13 Stunden bei 50–60°C vakuumgetrocknet, bis das Produktgewicht konstant blieb. Die Kristalle waren hauptsächlich stangen- und nadelförmig mit geringeren Mengen an anderen Formen wie Tabletten.
Das Verfahren ergab 22,5 g an BrEA-Hemihydrat (Ausbeute 90 %) mit einem Wassergehalt von 2,6 % w/w mittels KF-Analyse, einer Reinheit von 100 % mittels einer HPLC-Flächenanalyse, einem FTIR-Spektrum mit Carbo nylpeaks bei 1741 cm^–1 und 1752 cm^–1. Der FTIR-Scan von wasserfreiem BrEA zeigt einen einzelnen Carbonylpeak bei 1749 cm^–1. Der DSC-Scan zeigte drei Endotherme. Eine besaß einen breiten flachen Peak mit einem Anfang bei ungefähr 109–110°C und einem Ende bei ungefähr 150°C. Dieser breite DSC-Peak ist in Übereinstimmung mit dem Verlust an Wasser aus den Hemihydratkristallen, wenn die Temperatur der Probe ansteigt. Die zweite Endotherme bei ungefähr 83–100°C ist in Übereinstimmung mit dem Verlust der geringen Menge an restlichem Ethanol aus der Probe. Ein DSC-Scan von wasserfreiem BrEA besitzt nicht die breite Endotherme, die bei dem Hemihydrat beobachtet wird. Auch in Übereinstimmung mit dem Verlust an Wasser aus dem Hemihydrat über den Bereich von 100–150°C ist ein scharfer dritter Endothermpeak in dem Hemihydrat-DSC-Scan bei ungefähr 163–164°C, welches der Schmelzpunkt des wasserfreien BrEA ist. Das FTIR wurde erhalten unter Verwendung des USP-Verfahrens <197>, wobei die BrEA-Hemihydratprobe in KBr präpariert wurde. Das DSC-Thermogramm wurde erhalten durch Scannen von 25°C bis 250°C mit einer Erwärmungsrate von 10°C/Minute.
Beispiel 24. Herstellung von BrEA-Hemihydrat – Verfahren 2
Das Hemihydrat wurde hergestellt durch Auflösen von 10 g an rohem BrEA in 40 ml an Aceton unter Rückfluß mit moderatem Rühren. Zu der BrEA-Lösung wurden langsam 4,0 ml an Wasser gegeben, während die Lösung unter Rühren weiter unter Rückfluß gehalten wurde. Das Rühren der Lösung wurde aufrechterhalten, und man ließ die Lösung dann auf ungefähr 20–25°C abkühlen und hielt sie während ungefähr 15 Minuten bei ungefähr 20–25°C, um eine Suspension von BrEA-Hemihydratkristallen zu erhalten. Die Kristalle wurden durch Filtration rückgewonnen, mit einer Lösung von 6,0 ml an Wasser:Aceton (10:1 v/v) bei ungefähr 20–25°C gewaschen und dann über Nacht (ungefähr 13-15 Stunden) bei 50–60°C vakuumgetrocknet, bis das Produktgewicht konstant blieb. Das Verfahren ergab 7,0 g an BrEA-Hemihydrat (Ausbeute 70 %) mit einem Wassergehalt von 2,6 % w/w, mittels KF-Analyse, und einem FTIR-Spektrum mit Carbonylpeaks bei 1741 cm^–1 und 1752 cm^–1.
Beispiel 25. Analyse der Teilchengröße von BrEA-Hemihydrat
BrEA-Hemihydratkristalle wurden im wesentlichen wie hierin beschrieben hergestellt und unter Verwendung einer Teilchenklassierungsvorrichtung (Malvem Instruments) klassiert. Das verwendete Analysemodell war für eine polydisperse Probe und einen Volumenverteilungstyp. Die Analyse zeigte einen Bereich der Kristalldurchmessergrößen von ungefähr 0,5 μm bis ungefähr 880 μm. Ungefähr 90 % der Kristalle hatten einen Durchmesser von ungefähr 20 μm bis ungefähr 220 μm, und der Großteil der Kristalle besaß einen Durchmesser von ungefähr 30–200 μm. Der mittlere Kristalldurchmesser betrug ungefähr 93 μm. Die spezifische Oberfläche der Kristalle betrug ungefähr 0,25 m²/g.

Claims

16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat.

16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine oder mehrere der folgenden Bedingungen (1) einen mittels Differentialscanningcalorimetrieanalyse gemessenen Absorptionsendothermenbeginn von ungefähr 100 °C +/– 2 °C, (2) zwei Carbonyl-Absorptionsbanden bei ungefähr 1741 cm^–1 und 1750 cm^–1, gemessen mittels Fouriertransform-Infrarotabsorptionsspektroskopie, (3) einen Wassergehalt von ungefähr 2,4 % w/w bis ungefähr 2,6 % w/w, gemessen mittels Karl-Fisher-Titration und (4) 1, 2, 3 oder mehr der XRD-Peaks bei Theta-Werten von ungefähr 17,8° +/– 0,2°, 23,8° +/– 0,2°, 24,2° +/– 0,2°, 26,9° – 27,2° +/– 0,2°, 28,6° +/– 0,2°, 30,1° +/– 0,2° und 32,2° +/– 0,2° Theta, wobei die XRD-Peaks unter Verwendung einer Cu-Kα-Strahlung bestimmt wurden.

16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf eine mittlere Teilchengröße von 0,01–200 μm gemahlen ist.

16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf eine mittlere Teilchengröße von 0,1–10 μm gemahlen ist.

Zusammensetzung, umfassend 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat und einen Hilfsstoff, der für eine humanpharmazeutische Anwendung oder für eine Veterinäranwendung geeignet ist.

Zusammensetzung nach Anspruch 5 in der Form einer Unit Dosage, die 3 bis 1000 mg an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat umfaßt.

Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6 in der Form einer Tablette, einer Kapsel, einer Pastille, einer Lösung, einer Suspension, eines Gels oder eines Kolloids.

Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6 in der Form einer Tablette, einer Kapsel, einer Pastille, einer Lösung, einer Suspension, eines Gels oder eines Kolloids, wobei die Unit Dosage geeigent ist für eine orale, parenterale, topische, bukkale oder sublinguale Verabreichung an einen Patienten.

Verfahren zur Herstellung von 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat, umfassend ein In-Kontakt-Bringen von Wasser mit einer Lösung, die 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on und einen C₁-C₆-Alkohol umfaßt.

Verfahren nach Anspruch 9, wobei der C₁-C₆-Alkohol Ethanol ist.

Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Lösung 5-25 % w/w an Wasser, 30–45 % w/w an Ethanol und 30-45 % w/w an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on umfaßt.

Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Lösung 18-22 % w/w an Wasser, 37–43 % w/w an Ethanol und 37-43 % w/w an 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-on umfaßt.

Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Lösung eine Temperatur von ungefähr –20 °C bis ungefähr 45 °C besitzt.

Verwendung von 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der einen Immunosuppressions-Zustand oder eine unerwünschte Immunantwort aufweist oder dafür anfällig ist, wovon einer oder beide in Verbindung stehen mit (1) einer pathogenen Infektion, die ausgewählt ist aus einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einer Protozoenparasiteninfektion und einer multizellulären Parasiteninfektion, (2) einer Autoimmunerkrankung, (3) einer Malignität oder einer Präkanzerose, (4) einer Chemotherapie, einer Strahlentherapie, einer Immunsuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Wunde, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder Entzündung oder (5) irgendeiner Kombination des vorher erwähnten.

Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang stehen mit einer Malignität oder einer Präkanzerose.

Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Malignität oder Präkanzerose Ovarialkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, gutartige Prostatahyperplasie, ein Gliom, ein Lymphom, eine Leukämie, Dickdarmkrebs, ein Sarkom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Bronchialkarzi nom, Nierenzellenkrebs, Nierenzellenkarzinom, Melanom, Pankreas- oder Magenadenokarzinom, mit dem Human-Papilloma-Virus in Zusammenhang stehende zervikale intraepitheliale Neoplasie, Zervixkarzinom, Hepatom, kutanes T-Zell-Lymphom oder ein Krebs oder eine Präkanzerose ist, die im Rachen, Esophagus, Magen, Darm, Dickdarm, Ovarium, Lunge, Brust oder Zentralnervensystem entsteht.

Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einer Protozoenparasiteninfektion und einer multizellulären Parasiteninfektion.

Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Virusinfektion, intrazelluläre Bakterieninfektion, extrazelluläre Bakterieninfektion, Pilzinfektion, Hefeinfektion, eine extrazelluläre Parasiteninfektion, intrazelluläre Parasiteninfektion, Protozoenparasiteninfektion oder multizelluläre Parasiteninfektion eine Infektion ist, die verursacht wird durch eine Gruppe, Spezies oder Gattung, ausgewählt aus einem Retrovirus, einem Togavirus, einem Flavivirus, einem Hepadnavirus, einem Herpesvirus, einem Papillomavirus, HIV-1, HIV-2, HHV-6, HHV-8, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, HSV-1, HSV-2, CMV, Escherichia, Haemophilus, Legionella pneumonia, Listeria, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Yersinia, Pneumocystis, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Cryptosporidium, Toxoplasma, Trichomonas, Chlamidya, Pneumocystis, Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium, einem gastrointestinalen Helminthen, einem Microsporidiumparasiten oder einem Isosporumparasiten.

Verwendung nach Anspruch 18, wobei gegebenenfalls in Kombination mit dem Medikament gemäß Anspruch 14 ein Medikament verabreicht wird, das ein antivirales Mittel, ein antibakterielles Mittel, ein antifungales Mittel oder ein antiparasitäres Mittel umfaßt.

Verwendung nach Anspruch 19, wobei das antivirale Mittel, antibakterielle Mittel oder antifungale Mittel ein Inhibitor der reversen Transcriptase, ein Proteasinhibitor, ein Antibiotikum, ein Fusionsinhibitor, γ-Interferon, Amantadin, Rimantadin, Ribavirin, Chloroquin oder ein Chloroquinanalog ist.

Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das antivirale Mittel ausgewählt ist aus AZT, 3TC, D4T, ddI, ddC, Adefovir Dipivoxil, 9-[2-(R)-[[Bis[[(isopropoxycarbonyl)oxy]methoxy]phosphinoyl]methoxy]propyl]adenin, (R)-9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl]adenin, Adefovir, Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir, Crixivan, Sequanavir und Hydroxyharnstoff.

Verwendung nach Anspruch 21, wobei das antibakterielle Mittel oder antifungale Mittel ausgewählt ist aus Amphotericin B, Fluconazol, Clotrimazol, Isoniazid, Dapson, Rifampin, Cycloserin, Erythromycin, einem Tetracyclin-Antibiotikum, Vancomycin, Ethambutol, Pyrazinamid, einem Fluorchinolon, das gegebenenfalls ausgewählt ist aus Ciprofloxacin und Norfloxacin, einem Cephalosporin-Antibiotikum, einem β-Lactam-Antibiotikum oder einem Aminoglycosid-Antibiotikum, das gegebenenfalls ausgewählt ist aus Streptomycin, Kanamycin und Tobramycin.

Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang stehen mit einer Entzündung.

Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Entzündung eine allergische bronchopulmonale Aspergillose bei Patienten mit zystischer Fibrose, atopisches Asthma allergische Atemwegserkrankung, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, subepitheliale Fibrose bei Luftweg-Überreagibilität, chronischer Sinusitis, perenniale allergische Rhinitis, Crohn-Krankheit, Colitis ulcerosa, entzündliche Darmerkrankung oder fibrosierende Alveolitis ist.

Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang mit einer Autoimmunerkrankung stehen.

Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Autoimmunerkrankung eine systemische Lupus erythematodes, Osteoporose, Multiple Sclerose, Myasthenia gravis, Graves-Krankheit, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.

Verwendung nach Anspruch 14–26, wobei das Medikament dem Patienten unter Verwendung eines intermittierenden Dosierungsprotokolls verabreichte wird.

Verwendung nach Anspruch 27, wobei der Patient ein Säugetier ist.

Verwendung von 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation eines Zytokins oder Interleukins, das Th1- Immun- oder Th2-Immunantworten in einem Patienten fördert.

Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Zytokins oder Interleukin IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, γIFN oder TNFα ist.

Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Zytokins oder Interleukin IL-12 ist.

Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Zytokins oder Interleukin IL-1 ist.

Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Zytokins oder Interleukin IL-6 ist.

Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Zytokins oder Interleukin IL-10 ist.

Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Zytokins oder Interleukin TNFα ist.

Verwendung nach Anspruch 29–35, wobei das Medikament dem Patienten unter Verwendung eines intermittierenden Dosierungsprotokolls verabreichte wird und der Patient ein Säugetier ist.

Verwendung of 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung von Lin^–HLA-DR⁺CD123⁺ dendritischen Zellen, Lin^–HLA-DR+CD11c⁺ dendritischen Zellen, CD8⁺CD16⁺CD38⁺ Lymphokin-aktivierten Killerzellen, CD8^–CD16⁺CD38⁺ Lymphokin-aktivierten Killerzellen, CD8^–CD16⁺ natürlichen Killerzellen, CD8⁺CD16⁺ natürlichen Killerzellen, CD8^–CD16⁺ Zellen, die eine Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität ver mitteln, CD8⁺CD16⁺ Zellen, die eine Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität in einem Patienten vermitteln, CD45RA⁺ T-Zellen oder CD45⁺RO⁺ T-Zellen in einem Patienten.

Verwendung nach Anspruch 37, wobei der Patient einen Immunosuppressions-Zustand oder eine unerwünschte Immunantwort aufweist oder dafür anfällig ist, wovon einer oder beide in Verbindung stehen mit (1) einer pathogenen Infektion, die ausgewählt ist aus einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einer Protozoenparasiteninfektion und einer multizellulären Parasiteninfektion, (2) einer Autoimmunerkrankung, (3) einer Malignität oder einer Präkanzerose, (4) einer Chemotherapie, einer Strahlentherapie, einer Immunsuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Wunde, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls, einer gastrointestinalen Irritation oder Entzündung oder (5) irgendeiner Kombination des vorher erwähnten.

Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei das Medikament dem Patienten unter Verwendung eines intermittierenden Dosierungsprotokolls verabreichte wird und der Patient ein Säugetier ist.

Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang stehen mit einer Malignität oder einer Präkanzerose.

Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Malignität oder Präkanzerose Ovarialkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, gutartige Prostatahyperplasie, ein Gliom, ein Lymphom, eine Leukämie, Dickdarmkrebs, ein Sarkom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom, Nierenzellenkrebs, Nierenzellenkarzinom, Melanom, Pankreas- oder Magenadenokarzinom, mit dem Human-Papilloma-Virus in Zusammenhang stehende zervikale intraepitheliale Neoplasie, Zervixkarzinom, Hepatom, kutanes T-Zell-Lymphom oder ein Krebs oder eine Präkanzerose ist, die im Rachen, Esophagus, Magen, Darm, Dickdarm, Ovarium, Lunge, Brust oder Zentralnervensystem entsteht.

Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang steht mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion oder einer Hefeinfektion.

Verwendung nach Anspruch 42, wobei die Virusinfektion, intrazelluläre Bakterieninfektion, extrazelluläre Bakterieninfektion, Pilzinfektion oder Hefeinfektion eine Infektion ist, die verursacht wird durch eine Gruppe, Spezies oder Gattung, ausgewählt aus einem Retrovirus, einem Flavivirus, einem Papillomavirus, HIV-1, HIV-2, HHV-6, HHV-8, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, HSV-1, HSV-2, CMV, Escherichia, Legionella pneumonia, Listeria, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shige11a, Streptococcus, Staphylococcus, Yersinia, Trichomonas, Chlamidya, Pneumocystis, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Cryptosporidium, Toxoplasma und Pneumocystis.

Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang mit einer Entzündung stehen.

Verwendung nach Anspruch 44, wobei die Entzündung eine allergische bronchopulmonale Aspergillose bei Patienten mit zystischer Fibrose, atopisches Asthma allergische Atemwegserkrankung, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, subepitheliale Fibrose bei Luftweg-Überreagibilität, chronischer Sinusitis, perenniale allergische Rhinitis, Crohn-Krankheit, Colitis ulcerosa, entzündliche Darmerkrankung oder fibrosierende Alveolitis ist.

Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Immunosuppressions-Zustand oder die unerwünschte Immunantwort in Zusammenhang mit einer Autoimmunerkrankung stehen.

Verwendung nach Anspruch 46, wobei die Autoimmunerkrankung eine systemische Lupus erythematodes, Osteoporose, Multiple Sclerose, Myasthenia gravis, Graves-Krankheit, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.

Verwendung of 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der angeborenen Immunität eines Patienten oder zur Steigerung der Th1-Immunantworten eines Patienten.

Verwendung nach Anspruch 48, wobei der Patient einen Suppressionszustand der angeborenen Immunität oder eine unterdrückte Th1-Immunantwort besitzt.

Verwendung von 16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Anzahl der Neutrophilen, dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen oder NK-Zellen im Patientenblut.

Verwendung nach Anspruch 50, wobei der Patient einen Suppressionszustand der angeborenen Immunität oder eine unterdrückte Th1-Immunantwort besitzt.

Verwendung nach Anspruch 51, wobei der Suppressionszustand der angeborenen Immunität oder die unterdrückte Th1-Immunantwort in Verbindung stehen mit einer Virusinfektion, einer intrazellulären Bakterieninfektion, einer extrazellulären Bakterieninfektion, einer Pilzinfektion, einer Hefeinfektion, einer extrazellulären Parasiteninfektion, einer intrazellulären Parasiteninfektion, einer Protozoenparasiteninfektion und einer multizellulären Parasiteninfektion, einer Autoimmunerkrankung, eines Karzinoms, einer Präkanzerose, einer Chemotherapie, einer Strahlentherapie, einer Immunsuppressionstherapie, einer Antiinfektivatherapie, einer Wunde, einer Verbrennung, der Gegenwart eines immunosuppressiven Moleküls oder irgendeiner Kombination des vorher erwähnten.

Verwendung nach Anspruch 52, wobei der Patient einen Suppressionszustand der angeborenen Immunität oder eine unterdrückte Th1-Immunantwort besitzt oder deren Entstehung unterliegt, welche in Zusammenhang stehen mit einer Chemotherapie, einer Strahlentherapie, einer Immunsuppressionstherapie oder einer Antiinfektivatherapie.

Verwendung nach Anspruch 53, wobei der Suppressionszustand der angeborenen Immunität oder die unter drückte Th1-Immunantwort in Verbindung stehen mit einer Chemotherapie, einer Strahlentherapie oder einer Immunsuppressionstherapie, wobei die Therapie gegebenenfalls ausgewählt ist aus einer Adriamycin-Behandlung, Cisplatin-Behandlung, Mitomycin C Behandlung, Amphotericin B Behandlung, γ-Strahlentherapie, Nucleosidanaloga-Behandlung für Virusinfektion oder Krebs, Cyclosporin-Behandlung und Corticosteroid-Behandlung.

Verwendung nach Anspruch 50, 51 oder 52, wobei die dendritischen Zellen Lin^–HLA-DR⁺CD123⁺ dendritische Zellen oder Lin^–HLA-DR⁺CD11c⁺ dendritische Zellen sind.

16α-Brom-3β-hydroxy-5α-androstan-17-onhemihydrat zur Verwendung als ein Medikament.