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DE4318186C2 - Retrovirus from the HIV group and its use - Google Patents

Retrovirus from the HIV group and its use

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Publication number
DE4318186C2
DE4318186C2 DE4318186A DE4318186A DE4318186C2 DE 4318186 C2 DE4318186 C2 DE 4318186C2 DE 4318186 A DE4318186 A DE 4318186A DE 4318186 A DE4318186 A DE 4318186A DE 4318186 C2 DE4318186 C2 DE 4318186C2
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DE
Germany
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hiv
sequence
immunodeficiency virus
dna
antigen
Prior art date
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DE4318186A
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German (de)
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DE4318186A1 (en
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Lutz G Guertler
Josef Eberle
Stefan Knapp
Hans-Peter Hauser
Albrecht V Brunn
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Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Original Assignee
Dade Behring Marburg GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Retrovirus aus der HIV-Gruppe sowie Varianten oder Teile davon, welche die wesentlichen Eigenschaften des Virus enthalten. Beschrieben wird ein Verfahren zur Züchtung des Retrovirus. Die Erfindung betrifft weiterhin die Gewinnung dieses Retrovirus sowie die Verwendung des Virus, seiner Teile oder Extrakte für medizinische Zwecke, für die Diagnostik und bei der Herstellung von Impfstoffen.The present invention relates to a new retrovirus the HIV group as well as variants or parts thereof which the essential properties of the virus included. described becomes a method of growing the retrovirus. The The invention further relates to the extraction of this retrovirus and the use of the virus, its parts or extracts for medical purposes, for diagnostics and for Vaccine production.

Retroviren, die zur sogenannten HIV-Gruppe gehören, führen bei damit infizierten Menschen zu Krankheitserscheinungen, die unter dem Sammelbegriff Immunschwäche bzw. AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) zusammengefaßt werden.Retroviruses, which belong to the so-called HIV group, lead in people infected with it to symptoms of illness, those under the collective term immunodeficiency or AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome).

Epidemiologische Studien belegen, daß das Humane Immunschwäche Virus (HIV) das aetiologische Agens für die überwiegende Mehrheit der AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Fälle darstellt. Ein 1983 aus einem Patienten isoliertes und charakterisiertes Retrovirus erhielt die Bezeichnung HIV-1 (Barré-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871 [1983]). Eine Variante von HIV-1 wird in WO 86/02383 beschrieben. Epidemiological studies show that the human Immunodeficiency Virus (HIV) the aetiological agent for the vast majority of AIDS (Acquired Immune Deficiency Represents syndrome) cases. A 1983 from a patient isolated and characterized retrovirus received the Name HIV-1 (Barré-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871 [1983]). A variant of HIV-1 is described in WO 86/02383 described.  

Eine zweite Gruppe von Humanen Immunschwäche Viren wurde 1985 in Westafrika identifiziert (Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 [1986]) und als Humanes Immunschwäche Virus Typ 2 (HIV-2) bezeichnet (EP-A-0 239 425). HIV-2 Retroviren unterscheiden sich deutlich von HIV-1, weisen jedoch auch eine Verwandtschaft zu Affen Immunschwäche Viren (SIV-2) auf. Wie HIV-1 führt auch HIV-2 zu einer AIDS-Symptomatik.A second group of human immunodeficiency viruses was developed 1985 identified in West Africa (Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 [1986]) and as a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) denotes (EP-A-0 239 425). HIV-2 retroviruses differ significantly from HIV-1, but also show a relationship to monkeys immunodeficiency virus (SIV-2) on. Like HIV-1, HIV-2 leads to symptoms of AIDS.

Eine weitere Variante eines Immunschwäche Retrovirus wird in der EP-A-0 345 375 beschrieben und dort als HIV-3 Retrovirus bezeichnet (ANT 70).Another variant of an immune deficiency retrovirus is in EP-A-0 345 375 and there as HIV-3 retrovirus designated (ANT 70).

Auch in Lancet Vol. 340, Sept. 1992, S. 681-682 wird die Isolierung eines weiteren, varianten Immunschwächevirus beschrieben.Also in Lancet Vol. 340, Sept. 1992, pp. 681-682 the Isolation of another variant immunodeficiency virus described.

Es ist ein Charakteristikum der Humanen Immunschwäche Viren, daß sie eine hohe Variabilität aufweisen, die die Vergleichbarkeit der verschiedenen Isolate deutlich kompliziert. Beim Vergleich diverser HIV-1-Isolate treten z. B. in einigen Regionen des Genoms hohe Variabilitäten auf, während andere Genombereiche vergleichsweise konserviert vorliegen (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). Ein wesentlich größerer Polymorphismus konnte auch für HIV-2 beobachtet werden (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). Die größte genetische Stabilität besitzen Bereiche in den gag und pol Genen, die für strukturell und enzymatisch essentielle Proteine codieren; einige Regionen im env-Gen sowie die Gene (vif, vpr, tat, rev, nef), die für regulatorische Proteine codieren, zeigen einen hohen Grad an Variabilität. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß Antisera gegen HIV-1 auch mit gag und pol Genprodukten von HIV-2 kreuzreagieren, obwohl nur geringe Sequenzhomologie vorlag. Ebenfalls war die Hybridisierung zwischen diesen beiden Viren wenig signifikant, wenn nicht sehr wenig stringente Konditionen verwandt wurden (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). It is a characteristic of the human immunodeficiency virus, that they have a high variability that the Comparability of the different isolates clearly complicated. When comparing various HIV-1 isolates occur z. B. high variability in some regions of the genome, while other genome areas are comparatively conserved are available (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). On HIV-2 could also have a much larger polymorphism can be observed (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). Areas have the greatest genetic stability in the gag and pol genes that are structural and encode enzymatically essential proteins; some regions in the env gene as well as the genes (vif, vpr, tat, rev, nef) that are for encoding regulatory proteins indicate a high level Variability. It could also be shown that Antisera against HIV-1 also with gag and pol gene products from HIV-2 cross-reacts, although only little sequence homology Template. The hybridization between these was also of the two viruses little significant, if not very little stringent conditions were used (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]).  

Aufgrund der weiten Verbreitung der Retroviren aus der HIV- Gruppe und der Tatsache, daß zwischen dem Zeitpunkt der Infektion und dem Zeitpunkt, zu dem eindeutige Symptome für pathologische Veränderungen erkennbar sind, ein Zeitraum von einigen bis vielen Jahren (2-20) liegt, ist es epidemiologisch von großer Bedeutung, die Infektion mit Retroviren der HIV-Gruppe möglichst frühzeitig und vor allem zuverlässig zu bestimmen. Dies spielt nicht nur eine Rolle bei der Diagnose von Patienten, die Zeichen von Immunschwäche aufweisen, sondern auch bei der Überprüfung von Blutspendern. Es hat sich herausgestellt, daß bei der Verwendung von Retroviren oder Bestandteilen davon des Types HIV-1 oder HIV-2 in Nachweissystemen bei manchen Seren kein oder nur ein schwacher Nachweis von Antikörpern geführt werden kann, obwohl bei den Patienten, von denen die Seren stammen, Zeichen von Immunschwäche auftreten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Retrovirus aus der HIV-Gruppe ist in bestimmten Fällen ein derartiger Nachweis möglich.Due to the wide spread of retroviruses from HIV Group and the fact that between the time of the Infection and the time when clear symptoms of pathological changes are recognizable, a period of a few to many years (2-20), it is epidemiologically of great importance, the infection with Retroviruses from the HIV group as early as possible and above all to determine reliably. This doesn't just matter in diagnosing patients who show signs of Have immunodeficiency, but also when checking from blood donors. It has been found that the Use of retroviruses or components thereof of the type HIV-1 or HIV-2 in detection systems none for some sera or only weak detection of antibodies can be, although in the patients of whom the sera originate, signs of immune deficiency occur. With the help of retrovirus according to the invention from the HIV group is in Such evidence is possible in certain cases.

Beschrieben wird die Isolation und Charakterisierung eines neuen Humanen Immunschwäche Virus, im folgenden als MVP- 5180/91 bezeichnet, das aus peripheren Lymphozyten einer 1991 34-jährigen Patientin aus Kamerun isoliert wurde, die Zeichen von Immunschwäche aufwies. Geographisch stammt dieses Retrovirus aus einer Region in Afrika, die zwischen Westafrika mit endemischer HIV-2 und HIV-1 Virusinfektion und Ostzentralafrika mit fast ausschließlicher HIV-1- Verbreitung lokalisiert ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein neues Retrovirus der HIV-Gruppe, welches als MVP-5180/91 bezeichnet wird und dessen Varianten sowie davon abgeleitete DNS-Sequenzen und Aminosäuresequenzen bzw. Teilsequenzen und diese enthaltende Test-Kits. Das Retrovirus MVP-5180/91 wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nummer V 920 92 318 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt. The isolation and characterization of a new human immunodeficiency virus, hereinafter referred to as MVP 5180/91, that of peripheral lymphocytes one In 1991, 34-year-old female patient from Cameroon was isolated Showed signs of immune deficiency. Geographically this retrovirus from a region in Africa that between West Africa with endemic HIV-2 and HIV-1 virus infection and East Central Africa with almost exclusive HIV-1 Spread is localized. Subject of the present So invention is a new HIV group retrovirus, which is called MVP-5180/91 and its variants and DNA sequences derived therefrom and Amino acid sequences or partial sequences and those containing them Test kits. The retrovirus MVP-5180/91 was developed by the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) under number V 920 92 318 according to the terms of the Budapest Treaty deposited.  

Ebenso wie HIV-1 und HIV-2 wächst das erfindungsgemäße MVP- 5180/91 in folgenden Zellinien HUT 78, Jurkat-Zellen, C8166- Zellen und MT-2-Zellen. Die Isolierung und Vermehrung von Viren wird in dem Buch "Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991" ausführlich beschrieben. Die dort beschriebenen Arbeitsmethoden werden durch Bezugnahme zum Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gemacht.Like HIV-1 and HIV-2, the MVP- according to the invention grows 5180/91 in the following cell lines HUT 78, Jurkat cells, C8166- Cells and MT-2 cells. Isolation and propagation of Viruses are described in the book "Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991 " described in detail. The ones described there Working methods become the subject of reference by reference Disclosure of the present application made.

Weiterhin besitzt das erfindungsgemäße Virus eine magnesiumabhängige Reverse Transkriptase, die aber nicht manganabhängig ist. Dies stellt eine weitere Gemeinsamkeit zu den Viren HIV-1 und HIV-2 dar.Furthermore, the virus according to the invention has one magnesium-dependent reverse transcriptase, but not is dependent on manganese. This represents another commonality to the viruses HIV-1 and HIV-2.

Zum besseren Verständnis der Unterschiede des erfindungsgemäßen MVP-5180/91 Virus zu den Retroviren HIV-1 und HIV-2 soll zunächst kurz der Aufbau der Immunschwäche verursachenden Retroviren erläutert werden. Im Inneren des Virus befindet sich die RNA in einem kegelförmigen Core, das aus Proteinuntereinheiten zusammengesetzt ist, die die Bezeichnung p 24 (p für Protein) tragen. Dieses innere Core wird von einer Proteinhülle umgeben, die aus dem Protein p 17 aufgebaut ist (äußeres Core) und von einer Glykoproteinhülle umgeben ist, die neben Lipiden, die aus der Wirtszelle stammen, das Transmembranprotein gp 41, und das Hüllprotein 120 (gp 120) enthält. Dieses gp 120 kann dann mit den CD-4-Rezeptoren der Wirtszellen eine Bindung eingehen.To better understand the differences of the MVP-5180/91 virus according to the invention for the retroviruses HIV-1 and HIV-2 should initially briefly build the immune deficiency causing retroviruses. Inside the The RNA is located in a cone-shaped core, the virus is composed of protein subunits that the Name p 24 (p for protein). This inner core is surrounded by a protein shell that consists of the protein p 17 is built (outer core) and one Glycoprotein envelope is surrounded by lipids that are made up of of the host cell, the transmembrane protein gp 41, and contains the coat protein 120 (gp 120). This gp 120 can then binding to the CD-4 receptors of the host cells received.

Soweit bekannt, weist die RNA der HIV-Viren - vereinfacht dargestellt - folgende Genbereiche auf: An den beiden Enden sogenannte long terminal repeats (LTR), und die folgenden Genbereiche gag, pol, env und nef. Das Gen gag codiert unter anderem für die Kern(Core)-Proteine, p 24 und p 17, das Gen pol codiert u. a. für die Reverse Transkriptase, die RNAse H und die Integrase und das Gen env codiert für die Glykoproteine gp 41 und gp 120 der Virushülle. Das Gen nef codiert für ein Protein mit Regulatorfunktion. Eine schematische Anordnung des Genomes von Retroviren des HIV- Typs ist in Fig. 1 gezeigt.As far as is known, the RNA of the HIV virus has the following gene regions - to put it simply - at what is termed long terminal repeats (LTR), and the following gene regions gag, pol, env and nef. The gene gag codes, inter alia, for the core (core) proteins, p 24 and p 17, the gene pol codes, inter alia, for reverse transcriptase, RNAse H and integrase, and the gene env codes for glycoproteins gp 41 and gp 120 the virus envelope. The gene nef codes for a protein with a regulatory function. A schematic arrangement of the genome of retroviruses of the HIV type is shown in FIG. 1.

Eine Unterscheidung zwischen den Retroviren HIV-1 und HIV-2 ist u. a. dadurch möglich, daß virales Antigen ausgetestet wird mit einem monoklonalen Antikörper, der kommerziell als Testkit von Abbott (HIVAG-1 Monoclonal) erhältlich ist, und gegen das (HIV-1) p 24 gerichtet ist. Es ist bekannt, daß der Gehalt an Reverser Transkriptase in den Virustypen HIV-1 und HIV-2 etwa gleich ist. Wenn man deshalb in Verdünnungen der aufgeschlossenen Viren die Extinktion (E 490 nm), erhalten durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, aufträgt gegen die Aktivität der Reversen Transkriptase, dann erhält man eine Graphik, die etwa der Fig. 2 entspricht. Hierbei stellt man fest, daß im Verhältnis zu dem Gehalt an Reverser Transkriptase bei HIV-1 eine sehr hohe Bindungsaffinität für p 24 mit dem eingesetzten monoklonalen Antikörper vorhanden ist. Für HIV-2 tritt dagegen nur eine sehr geringe Bindungsaffinität für p 24 bei Einsatz des monoklonalen Antikörpers wiederum bezogen auf den Gehalt an Reverser Transkriptase auf. Werden diese Messungen durchgeführt für MVP-5180/91, dann befindet sich die Kurve ziemlich genau in der Mitte zwischen der Kurve von HIV-1 und HIV-2, d. h. die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers gegen MVP- 5180/91 p 24 ist gegenüber HIV-1 reduziert. Fig. 2 zeigt schematisch diesen Sachverhalt, wobei RT Reverse Transkriptase bedeutet und als Antigen (Ag) das Protein p 24 eingesetzt wird, gegen das der monoklonale Antikörper, der in dem von Abbott käuflich erwerblichen Testkit vorhanden ist, gerichtet ist.A distinction between the retroviruses HIV-1 and HIV-2 is possible, inter alia, by testing viral antigen with a monoclonal antibody, which is commercially available as a test kit from Abbott (HIVAG-1 monoclonal), and against (HIV-1) p 24 is directed. It is known that the reverse transcriptase content is approximately the same in the HIV-1 and HIV-2 virus types. Therefore, if the absorbance (E 490 nm), obtained by the antigen-antibody reaction, is plotted against the activity of the reverse transcriptase in dilutions of the digested viruses, a graphic is obtained which corresponds approximately to FIG. 2. It is found that, in relation to the reverse transcriptase content in HIV-1, there is a very high binding affinity for p 24 with the monoclonal antibody used. For HIV-2, on the other hand, there is only a very low binding affinity for p 24 when using the monoclonal antibody, again based on the content of reverse transcriptase. If these measurements are carried out for MVP-5180/91, the curve is pretty much midway between the curve of HIV-1 and HIV-2, ie the binding affinity of the monoclonal antibody against MVP-5180/91 p 24 is against HIV -1 reduced. FIG. 2 shows this situation schematically, where RT means reverse transcriptase and the protein p 24 is used as antigen (Ag) against which the monoclonal antibody which is present in the test kit commercially available from Abbott is directed.

Ein sehr vielseitig verwendbares System der Gentechnologie ist die sogenannte PCR (polymerase chain reaction) geworden, wobei die zur Durchführung des Verfahrens benötigten Komponenten käuflich erworben werden können. Mit diesem Verfahren ist es möglich, DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wenn DNA-Bereiche der zu amplifizierenden Sequenz bekannt sind. Es müssen dann kurze komplementäre DNA-Fragmente (Oligonucleotide = Primer) synthetisiert werden, die sich an einen kurzen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz anlagern. Für die Testdurchführung werden HIV-Nukleinsäuren mit den Primern zusammengebracht in einer Reaktionsmischung, die zusätzlich eine Polymerase und Nukleotidtriphosphate enthält. Die Polymerisation (DNA- Synthese) wird für eine bestimmte Zeit durchgeführt und dann werden die Nukleinsäurestränge durch Erwärmen getrennt. Nach Abkühlen läuft dann die Polymerisation erneut an. Wenn es sich also bei dem erfindungsgemäßen Retrovirus um ein HIV-1 oder HIV-2 Virus handelt, dann müßte die Nukleinsäure amplifiziert werden können, indem Primer verwendet werden, die konserviert sind innerhalb der bekannten Sequenzen der Viren HIV-1 und HIV-2. Derartige Primer sind zum Teil vorbeschrieben (Lauré, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 für pol 3 und pol 4 bzw. Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 für sk 38/39, sk 68/69).A very versatile system of genetic engineering has become the so-called PCR (polymerase chain reaction), the ones required to carry out the method Components can be purchased. With this Method it is possible to amplify DNA sequences if DNA regions of the sequence to be amplified are known  are. Short complementary DNA fragments are then required (Oligonucleotides = primer) can be synthesized a short range of the ones to be amplified Attach nucleic acid sequence. For carrying out the test HIV nucleic acids are brought together with the primers in a reaction mixture which additionally contains a polymerase and Contains nucleotide triphosphates. The polymerization (DNA Synthesis) is carried out for a certain time and then the nucleic acid strands are separated by heating. To Cooling then starts the polymerization again. If it So the retrovirus according to the invention is an HIV-1 or HIV-2 virus, then the nucleic acid would have to can be amplified using primers which are conserved within the known sequences of the Viruses HIV-1 and HIV-2. Such primers are in part (Lauré, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 for pol 3 and pol 4 or Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 for sk 38/39, sk 68/69).

Es wurde nun herausgefunden, daß bei Verwendung von bestimmten Primerpaaren, die folgende Sequenz aufweisen:
It has now been found that when using certain primer pairs, they have the following sequence:

oder eine Kombination von pol 3 und pol 4 mit
or a combination of pol 3 and pol 4 with

(Donehower L. A. et al. (1990) J. Virol. Methods 28, 33-46)
und mit der PCR mit nested primer schwache Amplifikate der MVP-5180/91-DNA erhalten wurden.(Donehower LA et al. (1990) J. Virol. Methods 28, 33-46)
and weak amplicons of the MVP-5180/91 DNA were obtained by PCR with nested primer.

Keine oder nur schwache Amplifikate im Vergleich zum HIV-1, die evtl. auf Verunreinigungen zurückzuführen sind, wurden erhalten mit folgenden Primer-Sequenzen:
No or only weak amplicons compared to HIV-1, which may be due to contamination, were obtained with the following primer sequences:

Im Vergleich zum HIV-1 schwache Amplifikate, die jedoch die gleiche Intensität wie das verwendete HIV-2 Isolat (MVP-11971/87) aufwiesen, wurden erhalten mit
Weak amplicons compared to HIV-1, but with the same intensity as the HIV-2 isolate used (MVP-11971/87), were obtained with

Eine weitverbreitete Methode zum Nachweis von HIV- Antikörpern ist der sogenannte Western Blot (Immunoblot). Dabei werden die viralen Proteine gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann auf eine Membran überführt. Die mit den überführten Proteinen versehenen Membranen werden dann mit Seren der zu untersuchenden Patienten in Verbindung gebracht. Sofern Antikörper gegen die viralen Proteine vorhanden sind, binden diese an die Proteine. Nach Waschen verbleiben lediglich spezifische Antikörper gegen virale Proteine. Die Antikörper werden dann mit Antiantikörpern sichtbar gemacht, die regelmäßig mit einem Enzym gekoppelt sind, das eine Farbreaktion katalysiert. Auf diese Weise können die Banden der viralen Proteine sichtbar gemacht werden.A widespread method of detecting HIV Antibodies are the so-called Western blot (immunoblot). The viral proteins become gel electrophoretic separated and then transferred to a membrane. The one with the Proteins are then transferred to proteins Sera related to the patient to be examined brought. Provided antibodies against the viral proteins are present, they bind to the proteins. After washing only specific antibodies against viral remain Proteins. The antibodies are then combined with anti-antibodies visualized that are regularly coupled with an enzyme that catalyzes a color reaction. In this way can visualize the bands of viral proteins become.

Das erfindungsgemäße Virus MVP-5180/91 weist gegenüber den Viren HIV-1 und HIV-2 im Western Blot zwei signifikante wesentliche Unterschiede auf. Das HIV-1 zeigt regelmäßig eine starke Bande, die dem Protein p 24 zuzuordnen ist und eine sehr schwache, oft kaum sichtbare Bande, die dem Protein p 23 zuzuordnen ist. HIV-2 weist eine kräftige Bande auf, die dem Protein p 25 zuzuordnen ist und manchmal eine schwache Bande, die dem Protein p 23 zuzuordnen ist. Im Unterschied dazu weist das erfindungsgemäße MVP-5180/91 Virus zwei etwa gleich starke Banden auf, die den Proteinen p 24 und p 25 entsprechen. The virus MVP-5180/91 according to the invention shows the Viruses HIV-1 and HIV-2 two significant in Western blot significant differences. The HIV-1 shows regularly a strong band which can be assigned to the protein p 24 and a very weak, often barely visible gang, that the Protein p 23 is assigned. HIV-2 has a strong band that is assigned to the protein p 25 and sometimes one weak band attributable to protein p 23. in the The MVP-5180/91 according to the invention differs from this Virus two approximately equally strong bands on the proteins correspond to p 24 and p 25.  

Ein weiterer signifikanter Unterschied besteht bei den Banden, die der Reversen Transkriptase zuzuordnen sind. HIV- 1 zeigt eine Bande (p 53), die der Reversen Transkriptase entspricht und eine Bande (p 66), die der Reversen Transkriptase verbunden mit der RNAse H entspricht. Bei HIV- 2 entspricht die Reverse Transkriptase dem Protein p 55 und, wenn sie mit der RNAse H verbunden ist, dem Protein p 68. Das erfindungsgemäße MPV-5180/91 weist dagegen eine Bande auf bei dem Protein p 48, die der Reversen Transkriptase entspricht, und eine Bande, bei dem Protein p 60, die der Reversen Transkriptase in Verbindung mit RNAse H entspricht.Another significant difference is in the Bands that are assigned to the reverse transcriptase. HIV 1 shows a band (p 53) that of the reverse transcriptase corresponds and a band (p 66) that of the reverse Transcriptase associated with the RNAse H corresponds. With HIV 2 the reverse transcriptase corresponds to the protein p 55 and, when linked to RNAse H, protein p 68. In contrast, the MPV-5180/91 according to the invention has a band on the protein p 48, that of the reverse transcriptase and a band at the protein p 60, which is the Reverse transcriptase in conjunction with RNAse H corresponds.

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die Reverse Transkriptase des MVP-5180/91 ein Molekulargewicht hat, das zwischen etwa 3 und etwa 7 Kilodalton kleiner ist als das der Reversen Transkriptase von HIV-1 bzw. HIV-2. Die Reverse Transkriptase von MPV-5180 weist also ein Molekulargewicht auf, das zwischen etwa 4500 Dalton und etwa 5500 Dalton kleiner ist als die Reverse Transkriptase von HIV-1 bzw. HIV-2.From these results it can be concluded that the Reverse transcriptase of the MVP-5180/91 a molecular weight that is between about 3 and about 7 kilodaltons smaller than that of reverse transcriptase from HIV-1 or HIV-2. The Reverse transcriptase from MPV-5180 thus shows Molecular weight that is between about 4500 daltons and is about 5500 daltons smaller than reverse transcriptase of HIV-1 or HIV-2.

Es wurde herausgefunden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Virus MVP-5180/91 anti-env-Antikörper in Seren von deutschen Patienten, die Zeichen von Immunschwäche zeigen, nur schwach nachgewiesen werden können, wobei die Seren aber stark reagieren, wenn anstelle des erfindungsgemäßen Virus ein HIV-1 Virus verwendet wird. Diese stärkere Nachweisreaktion wurde vor allem lokalisiert in dem gp 41 Protein. Bei den Versuchen wurden Serumpanels gegenübergestellt, die einmal von deutschen Patienten stammen und zum anderen von afrikanischen Patienten mit Zeichen von Immunschwäche stammen.It was found that with the help of the invention Virus MVP-5180/91 anti-env antibodies in sera from German Patients who show signs of immunodeficiency are weak can be detected, but the sera are strong react if instead of the virus of the invention HIV-1 virus is used. This stronger detection reaction was mainly localized in the gp 41 protein. Both Trials were juxtaposed with serum panels once come from German patients and from African patient with signs of immunodeficiency come.

Die oben angegebenen Charakteristika kennzeichnen solche Virus-Varianten, die dem erfindungsgemäßen MVP-5180/91 entsprechen. Wenn also aus heparinisiertem Spenderblut, das von Personen stammt, die Immunschwächeanzeichen aufweisen und vorzugsweise aus Afrika stammen, Immunschwächeviren isoliert werden, dann kann auf diese Weise das erfindungsgemäße Virus oder Varianten davon erhalten werden.The characteristics indicated above characterize such Virus variants, the MVP-5180/91 according to the invention correspond. So if from heparinized donor blood, that comes from people who show signs of immunodeficiency  and preferably come from Africa, immunodeficiency viruses can be isolated, then this way virus according to the invention or variants thereof are obtained.

Da das Virus isoliert wurde, welches die oben erwähnten Eigenschaften aufweist, kann die Klonierung einer cDNA auf folgendem Weg durchgeführt werden: Das Virus wird aus einer entsprechend großen Kulturmenge (etwa 1 l) präzipitiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgenommen. Dann erfolgt eine Pelletierung durch ein (20%iges) Saccharose- Kissen. Das Viruspellet kann in 6 M Guanidiniumchlorid in 20 mM Dithiothreitol und 0,5% Nonidet P 40 suspendiert werden. CsCl wird bis auf eine Konzentration von 2 molar zugegeben und die das aufgebrochene Virus enthaltende Lösung wird auf ein Cäsiumchlorid-Kissen aufgebracht. Dann wird die virale RNA durch Zentrifugation pelletiert, gelöst, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol und Lithiumchlorid präzipitiert. Mit Hilfe eines Oligo(dT)-Primers wird die Synthese des ersten cDNA-Stranges an der viralen RNA oder Teilen davon durchgeführt. Die Synthese unter Zugabe von Reverser Transkriptase kann durchgeführt werden unter Verwendung eines käuflich erhältlichen Kits. Für die Synthese des zweiten Stranges wird der RNA-Strang des RNA/DNA-Hybrids mit RNase H verdaut und der zweite Strang unter Einsatz von E.coli DNA Polymerase I synthetisiert. Mit Hilfe von T4 DNA Polymerase können dann stumpfe Enden erzeugt werden und diese mit geeigneten Linkem für Restriktionsschnittstellen verbunden werden. Nach Restriktionsverdau mit der geeigneten Restriktionsendonuklease wird das cDNA-Fragment aus einem Agarosegel isoliert und mit einem vorher in geeigneter Weise geschnittenen Vektor ligiert. Der Vektor mit dem cDNA-Insert kann dann zur Transformation von kompetenten E.coli-Zellen verwendet werden. Die erhaltenen Kolonien werden dann auf Membranen übertragen, lysiert und denaturiert und schließlich durch Hybridisierung mit Digoxigenin oder Biotin markierter Nukleinsäure aufgefunden. Nach gentechnologischer Herstellung der entsprechenden cDNA ist eine Isolierung der gewünschten DNA-Fragmente, die aus dem Retrovirus stammen, möglich. Durch Einbau dieser Fragmente in geeignete Expressionsvektoren kann dann das gewünschte Protein bzw. Proteinfragment exprimiert werden und für die diagnostischen Tests eingesetzt werden.Since the virus was isolated, which mentioned the above Has properties, the cloning of a cDNA the following way: The virus is made from a correspondingly large amount of culture (about 1 l) precipitated and taken up in phosphate buffered saline. Then pelleting is carried out using a (20%) sucrose Pillow. The virus pellet can be in 6 M guanidinium chloride 20 mM dithiothreitol and 0.5% Nonidet P 40 suspended become. CsCl becomes up to a concentration of 2 molar added and the solution containing the broken virus is applied to a cesium chloride cushion. Then the viral RNA pelleted by centrifugation, dissolved, with Phenol extracted and with ethanol and lithium chloride precipitated. With the help of an oligo (dT) primer, the Synthesis of the first strand of cDNA on the viral RNA or Parts of it done. The synthesis with the addition of Reverse transcriptase can be done at Using a commercially available kit. For the Synthesis of the second strand becomes the RNA strand of the RNA / DNA hybrids digested with RNase H and the second strand synthesized using E. coli DNA polymerase I. With Using T4 DNA polymerase can then blunt ends generated and these with suitable links for Restriction interfaces are connected. To Restriction digestion with the appropriate Restriction endonuclease is the cDNA fragment from a Agarose gel isolated and with a previously appropriate cut vector ligated. The vector with the cDNA insert can then be used to transform competent E. coli cells be used. The colonies obtained are then expanded Membranes transferred, lysed and denatured and finally by hybridization with digoxigenin or biotin labeled nucleic acid found. After genetic engineering Preparation of the corresponding cDNA is an isolation of the  desired DNA fragments that originate from the retrovirus, possible. By incorporating these fragments into suitable ones Expression vectors can then be the desired protein or Protein fragment can be expressed and used for diagnostic Tests are used.

Alternativ zu der angegebenen Methode kann das Immunschwächevirus mit Hilfe der PCR-Technologie kloniert werden, wobei die oben angegebenen Primer Verwendung finden können.As an alternative to the specified method, this can Immunodeficiency virus cloned using PCR technology using the primers given above can.

Zwischen verschiedenen Virusisolaten kann die Ähnlichkeit ausgedrückt werden durch den Grad der Homologie der Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen. Eine 50%ige Homologie bedeutet beispielsweise, daß 50 von 100 Nucleotid- oder Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Die Homologie von Proteinen wird durch Sequenzanalyse bestimmt. Homologe DNA-Sequenzen lassen sich auch durch die Hybridisierungs-Technik ermitteln.The similarity can exist between different virus isolates are expressed by the degree of homology of the Nucleic acid or protein sequences. A 50% homology means, for example, that 50 out of 100 nucleotide or Amino acid positions in the sequences match. The Homology of proteins is determined by sequence analysis. Homologous DNA sequences can also be identified by the Determine hybridization technique.

Erfindungsgemäß wurde zunächst ein Teil aus dem Hüllprotein sequenziert und festgestellt, daß diese Sequenz nur eine verhältnismäßig geringe Homologie zu den entsprechenden Sequenzen von Viren vom HIV-Typ aufweist. Insbesondere bezogen auf den gp 41-Bereich wurde durch einen Vergleich mit HIV-Sequenzen, der mit Hilfe von Datenbanken durchgeführt wurde, eine Homologie von höchstens 66% (Nucleotidsequenz) ermittelt.According to the invention, part of the coat protein first became sequenced and found that this sequence is only one relatively low homology to the corresponding Has sequences of HIV-type viruses. In particular based on the gp 41 range was by comparison with HIV sequences using databases homology of at most 66% (Nucleotide sequence) determined.

Es wurde weiterhin der Bereich sequenziert, der für gp 41 kodiert. Diese Sequenz ist in Tabellen 1 bzw. 3 dargestellt.The area was further sequenced for gp 41 coded. This sequence is shown in Tables 1 and 3, respectively.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche Viren, die eine Homologie von mehr als 66%, bevorzugt 75% und besonders bevorzugt 85% aufweisen zu dem erfindungsgemäßen HIV-Virus, MVP 5180/91, bezogen auf die Nucleotidsequenz der Tabelle 1 und/oder der Tabelle 3. The present invention therefore relates to such Viruses that have a homology of more than 66%, preferably 75% and particularly preferably have 85% of that HIV virus according to the invention, MVP 5180/91, based on the Nucleotide sequence of Table 1 and / or Table 3.  

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung solche Viren, die eine Homologie von mehr als 66%, bevorzugt 75% und besonders bevorzugt 85% aufweisen zu Partialsequenzen der in Tabelle 3 dargestellten Nucleotidsequenz, die wenigstens 50, bevorzugt 100 Nucleotide lang sind.The present invention furthermore relates to such Viruses that have a homology of more than 66%, preferably 75% and particularly preferably have 85% partial sequences the nucleotide sequence shown in Table 3, which are at least 50, preferably 100 nucleotides long.

Das erfindungsgemäße Virus unterscheidet sich durch seine Sequenz von vorbekannten Viren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche Viren sowie entsprechende DNS- bzw. Aminosäuresequenzen, die der Sequenz des erfindungsgemäßen Virus weitgehend entsprechen, wobei der Grad der Abweichung durch den Grad der Homologie festgelegt wird. Eine Homologie von beispielsweise mehr als 85% bedeutet daher, daß solche Sequenzen umfaßt werden, die in wenigstens 85 von 100 Nucleotiden bzw. Aminosäuren dieselben Nucleotide bzw. Aminosäuren aufweisen, während der Rest unterschiedlich sein kann. Hei der Feststellung der Homologie werden die beiden Sequenzen derart gegenübergestellt, daß möglichst viele einander entsprechende Nucleotide bzw. Aminosäuren miteinander zur Deckung kommen.The virus according to the invention differs in its Sequence of known viruses. Subject of the present Such viruses and corresponding DNS or amino acid sequences which correspond to the sequence of the Virus largely correspond to the invention, the Degree of deviation is determined by the degree of homology becomes. Homology of, for example, more than 85% therefore means that those sequences are included which are in at least 85 of 100 nucleotides or amino acids are the same Have nucleotides or amino acids, while the rest can be different. Hei the determination of The two sequences become homology in this way juxtaposed that as many as possible corresponding nucleotides or amino acids with each other Come cover.

Die (nahezu) vollständige Sequenz, angegeben als DNS-Sequenz des erfindungsgemäßen Virus ist in Fig. 4 wiedergegeben. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind dabei Viren, die die Sequenz gemäß Fig. 4 aufweisen sowie Varianten davon, die eine hohe Homologie zu der Sequenz von Fig. 4 aufweisen sowie davon abgeleitete Proteine, Polypeptide und Oligopeptide, die diagnostisch verwendbar oder als Impfstoff einsetzbar sind.The (almost) complete sequence, given as the DNA sequence of the virus according to the invention, is shown in FIG. 4. The present invention relates to viruses which have the sequence according to FIG. 4 and variants thereof which have a high homology to the sequence of FIG. 4 and proteins, polypeptides and oligopeptides derived therefrom which can be used diagnostically or used as a vaccine.

Anhand der isolierten Sequenz können immundominante Epitope (Peptide) konfektioniert und synthetisiert werden.Using the isolated sequence, immunodominant epitopes (Peptides) are assembled and synthesized.

Bei den diagnostischen Tests wird eine Serumprobe der zu untersuchenden Person zusammengebracht mit den Proteinketten von einem oder mehreren Proteinen oder Glykoproteinen (die in eukaryontischen Zellinien exprimiert werden können) oder Teilen davon, die von MVP-5180/91 stammen. Bevorzugte Testverfahren schließen die Immunfluoreszenz oder immunenzymatische Testverfahren (z. B. Elisa, Immunoblot) ein.In the diagnostic tests, a serum sample is taken of the investigator brought together with the protein chains of one or more proteins or glycoproteins (the can be expressed in eukaryotic cell lines) or  Parts of it that come from MVP-5180/91. preferred Test procedures include immunofluorescence or immuno-enzymatic test methods (e.g. Elisa, immunoblot) on.

Bei den immunenzymatischen Tests (ELISA) kann beispielsweise Antigen, das von MVP-5180/91 oder einer Variante davon stammt, an den Wänden von Mikrotiterplatten gebunden werden. Die dabei verwendete Dosierung hängt von dem Testsystem und der Behandlung der Mikrotiterplatten wesentlich ab. Dann wird Serum bzw. Serumverdünnungen, die von der zu untersuchenden Person stammen, in die Löcher der Mikrotiterplatten gegeben. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Platte gewaschen und spezifische Immunkomplexe werden nachgewiesen durch Antikörper, die spezifisch an menschliche Immunglobuline binden und die vorher mit einem Enzym, beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase usw. verbunden wurden oder mit enzymmarkiertem Antigen. Diese Enzyme können ein farbloses Substrat in ein stark gefärbtes Produkt umwandeln und an der Stärke der Färbung kann dann das Vorhandensein von spezifischen Anti-HIV-Antikörpern abgelesen werden. Eine weitere Möglichkeit der Verwendung des erfindungsgemäßen Virus in Testsystemen ist die Verwendung in Western Blots.In the case of immunoenzymatic tests (ELISA), for example Antigen from MVP-5180/91 or a variant thereof is bound to the walls of microtiter plates. The dosage used depends on the test system and the treatment of the microtiter plates. Then will be serum or serum dilutions that depend on the investigating person come into the holes of the Given microtiter plates. After a certain Incubation period, the plate is washed and specific Immune complexes are detected by antibodies that bind specifically to human immunoglobulins and the beforehand with an enzyme, for example Horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc. linked or with enzyme labeled antigen. This Enzymes can turn a colorless substrate into a highly colored one The product can then transform and change in color strength the presence of specific anti-HIV antibodies be read. Another way of using of the virus according to the invention in test systems is the Use in Western blots.

Auch wenn die Herstellung von Impfstoffen gegen Immunschwächeerkrankungen sich als äußerst schwierig erweist, kann doch auch dieses Virus bzw. Teile davon, d. h. immundominante Epitope und Induktoren der zellulären Immunität, oder gentechnologisch hergestellte Antigene zur Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen verwendet werden.Even if the production of vaccines against Immunodeficiency disorders prove to be extremely difficult proves, this virus or parts of it, d. H. immunodominant epitopes and inducers of cellular Immunity, or genetically engineered antigens to Development and manufacture of vaccines used become.

Beispiel 1example 1

Das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 wurde aus dem Blut einer Patientin mit Zeichen von Immunschwäche isoliert. Hierzu wurden periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood lymphocytes, PBL) und periphere Lymphozyten aus dem Blut (PBL) eines nicht HIV-infizierten Spenders mit Phytohämagglutinin stimuliert und in Kultur gehalten. Verwendet wurde hierzu das übliche Medium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum. Die Kulturbedingungen sind beschrieben in Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) S. 706-710. Beobachtet wurde dann die Bildung von Riesenzellen unter dem Mikroskop. Die Produktion von HIV- Viren wurde über die Bestimmung des p 24-Antigens mit Hilfe des käuflich erwerbbaren Tests von Abbott bestimmt. Ein weiterer Test zur Bestimmung des Wachstums der Viren war der Test unter Verwendung von partikelgebundener Reverser Transkriptase (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, S. 347-356). Das Wachstum der Viren wurde also anhand der enzymatischen Aktivitäten im Kulturüberstand ein- bis zweimal pro Woche bestimmt, um die Virusproduktion zu überwachen. Wöchentlich einmal wurden neue Spenderlymphozyten zugegeben.The immunodeficiency virus MVP-5180/91 according to the invention was from the blood of a patient with signs of immunodeficiency isolated. Peripheral mononuclear cells were used for this purpose (peripheral blood lymphocytes, PBL) and peripheral Lymphocytes from the blood (PBL) of a non-HIV-infected Donors stimulated with phytohemagglutinin and in culture held. The usual medium RPMI was used for this 1640 with 10% fetal calf serum. The cultural conditions are described in Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) pp. 706-710. The formation of Giant cells under the microscope. The production of HIV Viruses were detected using the p 24 antigen of Abbott's commercially available test. On another test to determine the growth of the virus was the Test using particle-bound reverser Transcriptase (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp. 347-356). The growth of the viruses was therefore based on of the enzymatic activities in the culture supernatant determined twice a week to increase virus production monitor. Once a week there were new ones Donor lymphocytes added.

Nachdem eine HIV-Virenvermehrung festgestellt werden konnte, wurden frische periphere Lymphozyten aus dem Blut (PBL) nicht HIV-infizierter, gesunder Spender mit dem Überstand der ersten Kultur infiziert. Dieser Schritt wurde wiederholt und dann wurden mit dem Überstand H 9 bzw. HUT 78 Zellen infiziert. Auf diese Weise war eine permanente Produktion des Immunschwäche-Virus möglich. Das Virus wurde bei der ECACC unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegt. After HIV virus replication was found, fresh peripheral blood lymphocytes (PBL) healthy donor not infected with HIV with the supernatant the first culture infected. This step was repeated and then with the supernatant H 9 and HUT became 78 cells infected. In this way it was a permanent production of the immunodeficiency virus possible. The virus was found in the ECACC deposited under number V 920 92 318.  

Beispiel 2Example 2

Zum Nachweis von HIV-Infektionen ist derzeit der sogenannte Western Blot oder Immunoblot ein Standardverfahren. Gemäß der in J. Virol. Meth. 15 (1987) S. 11-23 von Gürtler et al. beschriebenen Vorgehensweise wurden verschiedene Seren untersucht. Hierbei wurden Seren von deutschen Patienten solchen Seren gegenübergestellt, die von afrikanischen Patienten erhalten wurden. Es wurden hierbei folgende Ergebnisse erhalten:
Western blot or immunoblot is currently a standard method for detecting HIV infections. According to the in J. Virol. Meth. 15 (1987) pp. 11-23 by Gürtler et al. Different sera were examined. Sera from German patients were compared to sera obtained from African patients. The following results were obtained:

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, daß ein aus deutschen Patienten isoliertes Virus vom HIV-1 Typ, wenn es zum Nachweis von HIV-Infektionen verwendt wird, möglicherweise keine eindeutigen Ergebnisse liefert, wenn der Patient infiziert wurde mit einem Virus, das dem erfindungsgemäßen MVP-5180/91 entspricht. Es wird dabei davon ausgegangen, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Virus solche Viren nachgewiesen werden können, die wenigstens etwa 85% Homologie, bezogen auf das Gesamtgenom, zu dem erfindungsgemäßen Virus aufweisen.The results presented above show that an out German patients isolated HIV-1 type virus if it is used to detect HIV infections, may not produce clear results if the patient has been infected with a virus that MVP-5180/91 according to the invention corresponds. It will be there assumed that with the help of the virus according to the invention such viruses can be detected that at least approximately 85% homology, based on the total genome, to the exhibit virus according to the invention.

Beispiel 3Example 3

Gemäß der in Beispiel 2 angegebenen Vorgehensweise wurden weitere Western Blots durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der anliegenden Fig. 3 dargestellt. Bei diesem Test wurde einmal das virale Protein des erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 und einmal das virale Protein eines HIV-1-Typ Virus (MVP-899) gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann auf Zellulosefilter transferiert. Diese Filterstreifen wurden mit den Seren von verschiedenen Patienten inkubiert und dann wurden die spezifischen Antikörper durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Die linke Hälfte der Figur mit der Überschrift MVP-5180 zeigt das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus. Die rechte Hälfte der Figur zeigt ein aus deutschem Spender isoliertes Virus (MVP-899), bei dem es sich um ein HIV-1-Virus handelt.Further Western blots were carried out in accordance with the procedure given in Example 2. The results are shown in the attached FIG. 3. In this test, the viral protein of the immunodeficiency virus MVP-5180/91 according to the invention and once the viral protein of an HIV-1 type virus (MVP-899) were separated by gel electrophoresis and then transferred to cellulose filters. These filter strips were incubated with the sera from different patients and then the specific antibodies were visualized by a color reaction. The left half of the figure with the heading MVP-5180 shows the immunodeficiency virus according to the invention. The right half of the figure shows a virus isolated from a German donor (MVP-899), which is an HIV-1 virus.

Die einzelnen Filterstreifen wurden nun mit den Seren von verschiedenen Patienten inkubiert. Betrachtet man die Fig. 3, so wurden jeweils dieselben Seren (von deutschen Patienten) umgesetzt mit je zwei Filterstreifen, wobei die Nummern 8 und 26; 9 und 27; 10 und 28; 11 und 29; 12 und 30; 13 und 31; 14 und 32; 15 und 33 sowie 16 und 34 die gleichen Seren bezeichnen. Bei den Western Blots mit den Nummern 17 und 18 wurden Seren von afrikanischen Patienten eingesetzt. Die Zahlen an den rechten Seitenrändern geben die annähernden Molekulargewichte in Tausend (KD) an.The individual filter strips were then incubated with the sera from different patients. Looking at FIG. 3, the same sera (from German patients) were implemented with two filter strips, the numbers 8 and 26; 9 and 27; 10 and 28; 11 and 29; 12 and 30; 13 and 31; 14 and 32; 15 and 33 and 16 and 34 denote the same sera. Sera from African patients were used in the Western blots with the numbers 17 and 18. The numbers on the right hand side indicate the approximate molecular weights in thousands (KD).

Die Fig. 3 zeigt deutlich, daß Seren von deutschen Patienten mit dem erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus im Western Blot mit dem gp 41 nur sehr schwach reagieren. Seren von afrikanischen Patienten dagegen reagieren mit dem erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus sehr stark. Fig. 3 macht daher deutlich, daß unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus solche Immunschwäche- Infektionen nachgewiesen werden können, die bei Verwendung eines HIV-1 oder HIV-2-Virus nur fragliche, also nicht eindeutig positive Ergebnisse liefern. Diese Nachweismöglichkeit kann weitreichende diagnostische Bedeutung haben, da in den Fällen, in denen nur fragliche Ergebnisse im Western Blot erzielt werden, nicht mit eindeutiger Sicherheit festgestellt werden kann, ob es sich um eine Infektion mit einem Immunschwäche-Virus handelt. Wenn aber mit Hilfe des erfindungsgemäßen Immunschwäche- Virus derartige fragliche Ergebnisse einer Infektion mit einem Virus des erfindungsgemäßen Typs zugeordnet werden können, dann stellt dies einen erheblichen diagnostischen Fortschritt dar. FIG. 3 clearly shows that sera from German patients with the immunodeficiency virus according to the invention react in the Western blot with the gp 41 only very weakly. In contrast, sera from African patients react very strongly with the immunodeficiency virus according to the invention. Fig. 3 therefore makes clear that such immunodeficiency infections can be detected using the immunodeficiency virus according to the invention, which provide for use of an HIV-1 or HIV-2 virus only in question, that is not clearly positive results. This possibility of detection can have far-reaching diagnostic significance, since in cases in which only questionable results are obtained in the Western blot, it cannot be determined with certainty whether it is an infection with an immunodeficiency virus. However, if such questionable results of an infection with a virus of the type according to the invention can be assigned with the help of the immunodeficiency virus according to the invention, then this represents a significant diagnostic advance.

Beispiel 4Example 4 DNA-Isolierung, Amplifizierung und strukturelle Charakterisierung von Genomabschnitten des HIV-Isolates MVP-5180/91DNA isolation, amplification and structural Characterization of genome sections of the HIV isolate MVP-5180/91

Genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zellen wurden nach Standardmethoden isoliert.Genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT 78 cells were isolated using standard methods.

Zur Charakterisierung von Genombereichen des Isolates MVP-5180/91 wurden PCR (Polymerase Chain Reaction)- Experimente mit einem Primerpaar aus dem Hüllproteinbereich gp 41 durchgeführt. Die Durchführung der PCR-Experimente erfolgte nach der Methode von Saiki et al. (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) mit folgenden Modifikationen: Für die Amplifikation HIV-spezifischer DNA-Bereiche wurden 5 µl genomische DNA aus MVP-5180/91 infizierten HUT 78- Zellen in einem 100 µl Reaktionsansatz (0,25 mM dNTP, je 1 µM Primer 1 und Primer 2, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 2,5 units Taq Polymerase (Perkin Elmer) pipettiert und nach folgendem Temperatur-Programm amplifiziert: 1. Initiale Denaturierung: 3' 95°C, 2. Amplifikation: 90" 94°C, 60" 56°C, 90" 72°C (30 Cyclen).To characterize genome areas of the isolate MVP-5180/91, PCR (polymerase chain reaction) experiments were carried out with a primer pair from the coat protein area gp 41. The PCR experiments were carried out according to the method of Saiki et al. (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) with the following modifications: For the amplification of HIV-specific DNA regions, 5 μl genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT 78 cells in a 100 μl reaction mixture ( Pipette 0.25 mM dNTP, 1 µM each of Primer 1 and Primer 2, 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% gelatin, 2.5 units Taq polymerase (Perkin Elmer) and amplified according to the following temperature program: 1st initial denaturation: 3 '95 ° C, 2nd amplification: 90 "94 ° C, 60" 56 ° C, 90 "72 ° C (30 cycles).

Die für die PCR und die Nucleotidsequenzierung verwendeten Primer wurden auf dem Oligonucletidsynthesizer 8750 der Firma Biosearch synthetisiert. Those used for PCR and nucleotide sequencing Primers were made on the 8750 oligonucleotide synthesizer Biosearch synthesized.  

Primer 1: AGC AGC AGG AAG CAC TAT GG (Koordinaten aus HIV 1 Isolat HXB2: Base 7795-7814, entspricht Primer sk 68)Primer 1: AGC AGC AGG AAG CAC TAT GG (coordinates from HIV 1 Isolate HXB2: Base 7795-7814, corresponds to primer sk 68)

Primer 2: GAG TTT TCC AGA GCA ACC CC (Koordinaten aus HIV 1 Isolat HXB2: Base 8003-8022, entspricht Primer env b).Primer 2: GAG TTT TCC AGA GCA ACC CC (coordinates from HIV 1 Isolate HXB2: Base 8003-8022, corresponds to primer env b).

Die amplifizierte DNA wurde über ein 3% "Nusieve"- Agarosegel (Fa. Biozyme) aufgetrennt, das amplifizierte Fragment ausgeschnitten und mit dem gleichen Volumen an Puffer (1 × TBE (0,09 M TrisBorat, 0,002 M EDTA pH 8,0) versetzt. Nach Inkubation des DNA-Agarosegemisches für 10 Minuten bei 70°C und nachfolgender Phenolextraktion wurde die DNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 1/10 Vol 3 M NaAc pH 5,5 und 2 Vol Ethanol bei -20°C 15' gefällt und anschließend in einer Zentrifuge (Eppendorf) pelletiert (13000 rpm, 10', 4°C). Die pelletierte DNA wurde getrocknet, in Wasser aufgenommen und nach der photometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration bei 260 nm im Spektralphotometer (Beckman) nach der Methode von Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Adac. Sci., 74: 5463, 1977) sequenziert. Anstelle der Sequenzierung mit Klenow DNA Polymerase, wurde die Sequenzierungsreaktion mit einem Kit von Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing", Best.-Nr.: 401150) durchgeführt. Als Primer wurden in getrennten Sequenzierungsreaktionen Primer 1 oder Primer 2 (jeweils 1 µM) eingesetzt. Die Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte auf dem DNA-Sequenziergerät 373A (Applied Biosystems) nach den Vorgaben des Geräteherstellers.The amplified DNA was over a 3% "Nusieve" - Agarose gel (Biozyme) separated, the amplified Cut out fragment and apply the same volume Buffer (1 × TBE (0.09 M TrisBorat, 0.002 M EDTA pH 8.0) added. After incubation of the DNA agarose mixture for 10 minutes at 70 ° C and subsequent phenol extraction the DNA from the aqueous phase by adding 1/10 vol 3 M NaAc pH 5.5 and 2 vol ethanol at -20 ° C 15 'and then pelleted in a centrifuge (Eppendorf) (13000 rpm, 10 ', 4 ° C). The pelleted DNA was dried taken up in water and after the photometric Determination of the DNA concentration at 260 nm in Spectrophotometer (Beckman) using the Sanger method (F. Sanger, Proc. Natl. Adac. Sci., 74: 5463, 1977) sequenced. Instead of sequencing with Klenow DNA Polymerase, the sequencing reaction was performed using a kit by Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing ", order no .: 401150). As a primer were in separate sequencing reactions primer 1 or Primer 2 (1 µM each) used. The analysis of the Sequencing reaction was done on the DNA sequencer 373A (Applied Biosystems) according to the specifications of Equipment manufacturer.

Die Nucleotidsequenz des amplifizierten DNA-Bereichs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der Tabelle 1 dargestellt. The nucleotide sequence of the amplified DNA region and the the amino acid sequence derived therefrom is in Table 1 shown.  

Tabelle 1 Table 1

Beispiel 5Example 5

Die gefundene Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 wurde auf homologe Sequenzen in der GENEBANK-Datenbank (Release 72, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms (Genetic Computer Group, Inc., Wisconsin USA, Version 7.1, März 1992) untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juli 1992 bekannten Nucleotidsequenzen von Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The nucleotide sequence found from Table 1 was found on homologous sequences in the GENEBANK database (release 72, June 1992) with the help of the GCG computer program (Genetic Computer Group, Inc., Wisconsin USA, version 7.1, March 1992) examined. In this database most of the are up July 1992 known nucleotide sequences from Immunodeficiency viruses of human origin and isolates Primates included.

Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 weist im besten Fall eine 66%ige Homologie zu einem Schimpansen-Isolat auf. Zu HIV 1- Isolaten ist MVP 5180/91 in der untersuchten DNA-Sequenz im besten Fall zu 64% homolog. Zu HIV 2-Isolaten ist die DNA aus Tabelle 1 zu 56% homolog. Außer der Sequenz des Schimpansenisolates besteht die beste Homologie zwischen der Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 und DNA-Abschnitten aus Primatenisolaten (SIV: Simian Immunodeficiency Virus) in einer DNA-Sequenz, die für einen Teilbereich des Hüllproteins des Isolates SIV (Afrikanische Meerkatze) TYO-1 kodiert. Die Homologie beträgt 61,5%.At best, the nucleotide sequence from Table 1 has one 66% homology to a chimpanzee isolate. To HIV 1- MVP 5180/91 is in the investigated DNA sequence in isolates at best 64% homologous. DNA is about HIV 2 isolates from Table 1 to 56% homolog. Except for the sequence of the  Chimpanzee isolates have the best homology between them Nucleotide sequence from Table 1 and DNA sections Primate isolates (SIV: Simian Immunodeficiency Virus) in a DNA sequence that is for a portion of the Isolate SIV (African Vervet Monkey) coat protein TYO-1 coded. The homology is 61.5%.

Beispiel 6Example 6

Die gefundene Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 wurde auf homologe Sequenzen in der SWISSPROT Protein-Datenbank (Release 22, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juni 1992 bekannten Proteinsequenzen von Immundefizienz- Viren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The amino acid sequence found from Table 1 was found on homologous sequences in the SWISSPROT protein database (Release 22, June 1992) using the GCG computer program examined. In this database most of the are up June 1992 known protein sequences of immunodeficiency Viruses of human origin and isolates from primates contain.

Die Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 ist im besten Fall mit 62,5% zu einem Hüllproteinabschnitt des oben genannten Schimpansenisolates homolog. Unter HIV 1-Hüllproteinen findet man die beste Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Tabelle 1, in dem Isolat HIV 1 Mal. Die Homologie beträgt 59%. Zu HIV 2-Hüllproteinen beträgt die Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 im besten Fall 52% (Isolat HIV 2 Rod). Da auch HIV 1 und HIV 2-Isolate im besten Fall im korrespondierenden Proteinabschnitt nur zu 64% identisch sind, scheint es sich bei dem Isolat MVP-5180/91 um eine HIV-Variante zu handeln, die sich deutlich von HIV 1 und von HIV 2 strukturell abgrenzt und somit einen Vertreter einer davon unabhängigen Gruppe von HIV-Viren repräsentiert.The amino acid sequence from Table 1 is in the best case with 62.5% to a coat protein portion of the above Chimpanzee isolates homolog. Among HIV 1 coat proteins one finds the best homology with the amino acid sequence Table 1, in which isolate HIV 1 time. The homology is 59%. The homology to HIV 2 coat proteins is Amino acid sequence from Table 1 in the best case 52% (isolate HIV 2 Rod). Because HIV 1 and HIV 2 isolates in the best case only 64% identical in the corresponding protein segment Isolat MVP-5180/91 seems to be one HIV variant to act that is significantly different from HIV 1 and from Structurally delimits HIV 2 and thus a representative of one independent group of HIV viruses.

Die Aminosäuresequenz des amplifizierten DNA-Bereiches (Tabelle 1) des HIV-Isolates MVP 5180/91 überlappt mit einem immundiagnostisch wichtigen Bereich aus dem Hüllprotein gp 41 von HIV 1 (Aminosäure 584-618*) (Tabelle 2) (Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987).The amino acid sequence of the amplified DNA region (Table 1) of the HIV isolate MVP 5180/91 overlaps with one immunodiagnostically important area from the coat protein  gp 41 of HIV 1 (amino acid 584-618 *) (Table 2) (Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987).

Korrespondierende Aminosäurebereiche aus den Hüllproteinen von HIV 2 und SIV sind ebenfalls immundiagnostisch konserviert (Gnann et al., Science, S. 1346-1349, 1987). So werden Peptide aus diesem Hüllproteinbereich von HIV 1 und HIV 2 in vielen kommerziell erhältlichen HIV 1/2 Antikörper- Screeningtests als Festphasenantigene eingesetzt. Ungefähr 99% der anti HIV 1 und anti HIV 2 positiven Seren können damit erfaßt werden.Corresponding amino acid regions from the coat proteins HIV 2 and SIV are also immunodiagnostic conserved (Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987). So are peptides from this coat protein region of HIV 1 and HIV 2 in many commercially available HIV 1/2 antibodies Screening tests used as solid phase antigens. Approximately 99% of anti HIV 1 and anti HIV 2 positive sera can thus be grasped.

Der Aminosäurebereich des MVP-5180/91-Hüllproteins (Tabelle 1) könnte aufgrund der Überlappung mit dem immundiagnostisch wichtigen Bereich aus gp 41 serodiagnostisch von Bedeutung sein. Dies wäre insbesondere dann der Fall, wenn Antiseren von HIV-infizierten Patienten mit keinem der kommerziell erhältlichen Antikörper- Screeningtests positiv reagieren würden. In diesen Fällen könnte eine Infektion mit einem MVP-5180/91 eng verwandten Virus vorliegen.The amino acid region of the MVP-5180/91 coat protein (Table 1) could be due to the overlap with the immunodiagnostically important area from gp 41 be of serodiagnostic importance. This would be particular then the case when antisera from HIV-infected patients with none of the commercially available antibody Screening tests would respond positively. In these cases could be an infection with an MVP-5180/91 closely related Virus present.

Tabelle 2 Table 2

Beispiel 7Example 7 DNA Isolierung, Amplifizierung und strukturelle Charakterisierung von Genomabschnitten des HIV Isolates MVP- 5180/91 (kodierend für gp 41)DNA isolation, amplification and structural Characterization of genome sections of the HIV isolate MVP- 5180/91 (coding for gp 41)

Genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT78-Zellen wurden wie beschrieben isoliert.Genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT78 cells were isolated as described.

Zur Charakterisierung von Genombereichen des Isolates MVP- 5180/91 wurden PCR (Polymerase Chain Reaction)-Experimente mit Primerpaaren aus dem Hüllproteinbereich gp 41 durchgeführt. Die PCR (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) und inverse PCR (Triglia et al., Nucl. Asids, Res. 16: 8186, 1988) wurden mit folgenden Modifikationen durchgeführt:For the characterization of genome areas of the isolate MVP- 5180/91 were PCR (polymerase chain reaction) experiments with primer pairs from the gp 41 coat protein region carried out. PCR (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) and inverse PCR (Triglia et al., Nucl. Asids, Res. 16: 8186, 1988) with the following modifications carried out:

1. PCR1. PCR

Für die Amplifikation HIV-spezifischer DNA Bereiche wurden 5 µl (218 µg/ml) genomische DNA aus MVP-5180/91 infizierten HUT 78 Zellen in einem 100 µl Reaktionsansatz (0,25 mM dNTP, je 1 µM Primer 163env und Primer envend, 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 2,5 units Taq Polymerase (Perkin Elmer)) pipettiert und nach folgendem Temperaturprogramm amplifiziert: 1. Initiale Denaturierung: 3 min. 95°C, 2. Amplifikation: 90 sec. 94°C, 60 sec. 56°C, 90 sec. 72°C (30 Cyclen).For the amplification of HIV-specific DNA areas, 5 µl (218 µg / ml) genomic DNA from MVP-5180/91 infected HUT 78 cells in a 100 µl reaction mixture (0.25 mM dNTP, 1 µM primer 163env and primer envend, Pipette 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% gelatin, 2.5 units Taq polymerase (Perkin Elmer)) and amplify according to the following temperature program: 1. Initial denaturation: 3 min. 95 ° C, 2nd amplification: 90 sec. 94 ° C, 60 sec. 56 ° C, 90 sec. 72 ° C (30 cycles).

2. Inverse PCR2. Inverse PCR

Der 5' Bereich von gp 41 (N-Terminus) und die 3' Sequenz von gp 120 wurden mittels "inverser PCR" amplifiziert. Hierzu wurden 100 µl einer genomischen DNA Präparation (218 µg/ml) aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zellen in einem Endvolumen von 200 µl mit 10 units der Restriktionsendonuklease Sau3a 1 Stunde bei 37°C verdaut. Die DNA wurde anschließend phenolisiert und mit Natriumazetat (Endkonzentration 300 mM) und 2.5 Volumen Ethanol 10 min bei -70°C gefällt, in der Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert und das Pellet getrocknet und in 890 µl Aqua dest. resuspendiert. Nach Zugabe von 100 µl Ligasepuffer (50 mM Tris HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml Rinder­ serumalbumin) und 10 µl T4 DNA-Ligase (Fa. Boehringer, Mannheim) wurden die DNA-Fragmente 3 Stunden bei Raumtemperatur ligiert, erneut phenolisiert und mit Natriumazetat und Ethanol wie oben gefällt. Nach dem Abzentrifugieren und Trocknen wurde die DNA in 40 µl Aqua dest. resuspendiert und mit 10 units der Restriktionsendonuklease SacI (Fa. Boehringer, Mannheim) für 1 Stunde verdaut. Anschließend wurden 5 µl dieses Ansatzes in einem PCR-Experiment wie unter "1. PCR" dargestellt, eingesetzt. Anstelle der Primer 163env und envend wurden für die inverse PCR die Primer 168i und 169i verwendet.The 5 'region of gp 41 (N-terminus) and the 3' sequence of gp 120 were amplified by means of "inverse PCR". For this purpose, 100 μl of a genomic DNA preparation (218 μg / ml) from MVP-5180/91-infected HUT 78 cells in a final volume of 200 μl was digested with 10 units of the restriction endonuclease Sau3a at 37 ° C. for 1 hour. The DNA was then phenolized and precipitated with sodium acetate (final concentration 300 mM) and 2.5 volumes of ethanol for 10 min at -70 ° C., centrifuged in the Eppendorf centrifuge and the pellet dried and in 890 μl distilled water. resuspended. After adding 100 μl ligase buffer (50 mM Tris HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg / ml bovine serum albumin) and 10 μl T4 DNA ligase (from Boehringer, Mannheim ) the DNA fragments were ligated for 3 hours at room temperature, phenolized again and precipitated with sodium acetate and ethanol as above. After centrifugation and drying, the DNA was in 40 ul aqua dest. resuspended and digested with 10 units of the restriction endonuclease SacI (from Boehringer, Mannheim) for 1 hour. Then 5 ul of this approach were used in a PCR experiment as shown under "1st PCR". Instead of the primers 163env and envend, the primers 168i and 169i were used for the inverse PCR.

Die Primer 163env, 168i und 169i wurden aus der bereits ermittelten Teilsequenz des HIV-Isolates MVP-5180 ausgewählt (Beispiel 4).The primers 163env, 168i and 169i have been removed from the determined partial sequence of the HIV isolate MVP-5180 selected (Example 4).

Die für die PCR/inverse PCR und die Nucleotidsequenzierung verwendeten Primer wurden auf dem Oligonucleotidsynthesizer 8750 der Firma Biosearch synthetisiert, wobei die Primer folgende Sequenzen aufwiesen:
The primers used for the PCR / inverse PCR and the nucleotide sequencing were synthesized on the 8750 oligonucleotide synthesizer from Biosearch, the primers having the following sequences:

Die amplifizierte DNA wurde über ein 3% "Nusieve"-Agarose­ gel (Fa. Biozyme) aufgetrennt, das amplifizierte Fragment ausgeschnitten und mit dem gleichen Volumen an Puffer (1 × TBE (0.09 M TrisBorat, 0.002 M EDTA, pH 8.0)) versetzt. Nach Inkubation des DNA-Agarosegemisches für 10 Minuten bei 70°C und nachfolgender Phenolextraktion wurde die DNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 1/10 Vol 3 M NaAc, pH 5,5 und 2 Vol Ethanol bei -20°C 15' gefällt und anschließend in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert (13 000 rpm, 10', 4°C). Die pelletierte DNA wurde getrocknet, in Wasser aufgenommen und nach der photometrischen Bestimmung der DNA- Konzentration bei 260 nm im Spektralphotometer (Fa. Beckman) nach der Methode von Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463, 1977) sequenziert. Anstelle der Sequenzierung mit Klenow DNA Polymerase wurde die Sequenzierungsreaktion mit einem Kit der Fa. Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing", Best. Nr.: 401150) durchgeführt. Als Primer wurden in getrennten Sequenzierungsreaktionen Primer 163env oder Primer envend (jeweils 1 µM) eingesetzt. Die amplifizierte DNA aus dem inversen PCR-Experiment wurde mit den Primern 168i und 169i sequenziert. Die Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte auf dem DNA-Sequenziergerät 373A (Applied Biosystems) nach den Vorgaben des Geräteherstellers.The amplified DNA was over a 3% "Nusieve" agarose gel (Biozyme), the amplified fragment cut out and with the same volume of buffer (1 × TBE (0.09 M TrisBorat, 0.002 M EDTA, pH 8.0)) was added. To Incubate the DNA agarose mixture for 10 minutes at 70 ° C and subsequent phenol extraction, the DNA was extracted from the aqueous phase by adding 1/10 vol 3 M NaAc, pH 5.5 and 2 vol ethanol at -20 ° C 15 'and then in pelleted in an Eppendorf centrifuge (13,000 rpm, 10 ', 4 ° C). The pelleted DNA was dried, taken up in water and after the photometric determination of the DNA Concentration at 260 nm in the spectrophotometer (Beckman) according to the Sanger method (F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463, 1977). Instead of sequencing with Klenow DNA polymerase the sequencing reaction with a kit from Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing ", Order No .: 401150) carried out. As primers were in separate Sequencing reactions Primer 163env or Primer envend (1 µM each) used. The amplified DNA from the Inverse PCR experiment was performed with primers 168i and 169i sequenced. The sequencing reaction was analyzed on the DNA sequencer 373A (Applied Biosystems) the specifications of the device manufacturer.

Die Nucleotidsequenz des amplifizierten DNA-Bereichs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der Tabelle 3 dargestellt. The nucleotide sequence of the amplified DNA region and the amino acid sequences derived therefrom are in Table 3 shown.  

Tabelle 3 Table 3

Beispiel 8Example 8

Die gefundene Nucleotidsequenz aus Tabelle 3 wurde auf homologe Sequenzen in der GENEBANK-Datenbank (Release 72, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms (Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin USA, Version 7.1, März 1992) untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juli 1992 bekannten Nucleotidsequenzen von Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The nucleotide sequence found from Table 3 was found on homologous sequences in the GENEBANK database (release 72, June 1992) with the help of the GCG computer program (Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin USA, version 7.1, March 1992) examined. In this database most of the are up July 1992 known nucleotide sequences from Immunodeficiency viruses of human origin and isolates Primates included.

Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 3 weist im besten Fall eine 62%ige Homologie zu einem HIV 1-Isolat auf. Zu HIV 2 Isolaten ist die DNA aus Tabelle 5 zu 50% homolog.The nucleotide sequence from Table 3 has at best one 62% homology to an HIV 1 isolate. To HIV 2 Isolates, the DNA from Table 5 is 50% homologous.

Die aus der Nucleotidsequenz aus Tabelle 3 abgeleitete Aminosäuresequenz wurde auf homologe Sequenzen in der SWISSPROT Protein-Datenbank (Release 22, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis Juni 1992 bekannten Proteinsequenzen von Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten enthalten.The one derived from the nucleotide sequence of Table 3 Amino acid sequence was based on homologous sequences in the SWISSPROT protein database (Release 22, June 1992) with Examined with the help of the GCG computer program. In this Database are most of those known until June 1992 Protein sequences from immunodeficiency viruses of human origin and contain isolates from primates.

Die Aminosäuresequenz aus Tabelle 3 ist im besten Fall mit 54% zu dem korrespondierenden Hüllproteinabschnitt eines Schimpansen-Isolates CIV (SIVcpz) homolog und zu 54,5% zu dem HIV 1-Isolat Mal. Zu HIV 2-Hüllproteinen beträgt die Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Tabelle 3 im besten Fall 34% (Isolat HIV 2 D194). The amino acid sequence from Table 3 is in the best case with 54% to the corresponding coat protein section Chimpanzee isolates CIV (SIVcpz) homologous and 54.5% too the HIV 1 isolate time. For HIV 2 coat proteins this is Homology with the amino acid sequence from Table 3 in the best Case 34% (isolate HIV 2 D194).  

Vergleicht man demgegenüber die gp 41-Aminosäuresequenz von HIV 1 mit den in der SWISSPROT-Datenbank vorhandenen HIV 1 gp 41-Sequenz, ergeben sich wie erwartet im besten Fall eine fast 100%ige Homologie und im schlechtesten Fall eine 78%ige Homologie.In comparison, the gp 41 amino acid sequence of HIV 1 with the HIV 1 available in the SWISSPROT database gp 41 sequence, as expected, the result is one almost 100% homology and in the worst case one 78% homology.

Aufgrund dieser deutlichen strukturellen Unterschiede zwischen dem Sequenzbereich aus Tabelle 3 und dem korrespondierenden Abschnitt aus HIV 1 und HIV 2 scheint es sich bei dem Isolat MVP-5180/91 um eine HIV-Variante zu handeln, die sich von HIV 1 und HIV 2 deutlich strukturell abgrenzt. Möglicherweise ist MVP-5180/91 einer eigenen, von HIV 1 und HIV 2 sich abgrenzenden Gruppe von HIV-Viren zuzuordnen.Because of these clear structural differences between the sequence area from Table 3 and the corresponding section from HIV 1 and HIV 2 it seems isolate MVP-5180/91 is an HIV variant act that are structurally distinct from HIV 1 and HIV 2 demarcates. MVP-5180/91 may be your own, from HIV 1 and HIV 2 delimiting group of HIV viruses assigned.

Das Peptid von Aminosäure 584-618 des HIV 1- Hüllproteinbereichs ist von besonderem serodiagnostischem Interesse (Numerierung nach Wain Hobson et al., Cell 40: 9-17, 1985; Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987). Korrespondierende Aminosäurebereiche aus den Hüllproteinen von HIV 2 und SIV sind ebenfalls immundiagnostisch konserviert (Gnann et al., Science, S. 1346-1349, 1987). So werden Peptide aus diesem Hüllproteinbereich von HIV 1 und HIV 2 in vielen kommerziell erhältlichen HIV 1/2 Antikörper- Screeningtests als Festphasenantigene eingesetzt. Ungefähr 99% der Anti-HIV 1 und Anti-HIV 2 positiven Seren können damit erfaßt werden.The HIV 1- amino acid 584-618 peptide Coat protein area is particularly serodiagnostic Interest (numbering according to Wain Hobson et al., Cell 40: 9-17, 1985; Gnann et al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, , 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987). Corresponding amino acid regions from the coat proteins HIV 2 and SIV are also immunodiagnostic conserved (Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987). So are peptides from this coat protein region of HIV 1 and HIV 2 in many commercially available HIV 1/2 antibodies Screening tests used as solid phase antigens. Approximately 99% of anti-HIV 1 and anti-HIV 2 positive sera can thus be grasped.

Der korrespondierende Aminosäurebereich des MVP-5180/91- Hüllproteins (Tabelle 4) als auch das gesamte gp 41 dieses Isolates könnten serodiagnostisch insbesondere dann von Bedeutung sein, wenn Antiseren von HIV-infizierten Patienten in kommerziell erhältlichen Antikörper-Screening-Tests nur schwach oder überhaupt nicht reagieren würden. In diesen Fällen könnte eine Infektion mit einem MVP-5180/91 eng verwandten Virus vorliegen.The corresponding amino acid region of the MVP-5180 / 91- Coat protein (Table 4) as well as the entire gp 41 of this Isolates could be serodiagnostically especially from Be important when antisera from HIV-infected patients in commercially available antibody screening tests only  would react weakly or not at all. In these Cases of infection with an MVP-5180/91 could be narrow related virus.

Tab. 4 Tab. 4

Beispiel 9Example 9 Klonierung des Gesamtgenoms des HIV-Isolates MvP5180Cloning of the entire genome of the HIV isolate MvP5180 a) Herstellung einer genomischen Bibliotheka) Generation of a genomic library

Genomische DNA aus MvP5180-infizierten HUT 78-Zellen wurde wie beschrieben isoliert.Genomic DNA from MvP5180-infected HUT 78 cells was isolated as described.

300 µg dieser DNA wurde in einem Volumen von 770 µl mit 0,24 U des Restriktionsenzyms Sau3A für 45 min inkubiert. Die dadurch nur partiell geschnittene DNA wurde anschließend über ein 0,7%iges Agarosegel (low melting agarose, Nusieve) größenfraktioniert und Fragmente zwischen 10 und 21 kb ausgeschnitten. Die Agarose wurde für 10 min bei 70°C geschmolzen und mit demselben Volumen Puffer (1 × TBE, 0,2 M NaCl) versetzt. Anschließend folgte nach zweimaliger Phenol- und einmaliger Chloroformextraktion die Fällung der DNA durch Zugabe von 1/10 Vol 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,9) und 2,5 Vol Ethanol bei -70°C für 10 min. Die gefällte DNA wurde abzentrifugiert, getrocknet und in einer Konzentration von 1 µg/µl in Wasser gelöst.300 µg of this DNA was in a volume of 770 µl 0.24 U of the restriction enzyme Sau3A incubated for 45 min. The DNA that was only partially cut was subsequently over a 0.7% agarose gel (low melting agarose, Nusieve) size fractionated and fragments between 10 and 21 kb cut out. The agarose was kept at 70 ° C for 10 min melted and with the same volume of buffer (1 × TBE, 0.2 M NaCl) added. This was followed by two phenol and one-time chloroform extraction the precipitation of the DNA by adding 1/10 vol 3 M sodium acetate solution (pH 5.9) and 2.5 vol ethanol at -70 ° C for 10 min. The felled DNA was centrifuged, dried and at a concentration of 1 µg / µl dissolved in water.

Die Ausbeute an größenfraktionierter DNA betrug etwa 60 µg. The yield of size-fractionated DNA was approximately 60 µg.  

5 µg dieser DNA wurden mit 1 U Alkalische Phosphatase im entsprechenden Puffer für 20 min bei 37°C inkubiert. Durch Abspaltung des 5'-terminalen Phosphatrestes wurden so multiple Insertionen von größenfraktionierter DNA vermindert. Die Phosphatasebehandlung wurde durch Phenolisierung gestoppt, die DNA wie oben gefällt und zusammen mit 1 µg des Vektors (λ DASH, BamHI geschnitten, Stratagene Nr.: 247611) in 6 µl Gesamtvolumen mit 2 Weiss- Units Lambda T4 Ligase für 12 Stunden bei 15°C ligiert.5 µg of this DNA were mixed with 1 U alkaline phosphatase appropriate buffer for 20 min at 37 ° C incubated. By The 5'-terminal phosphate residue was removed in this way multiple insertions of size fractionated DNA reduced. The phosphatase treatment was through Phenolization stopped, the DNA fell like above and together with 1 µg of the vector (λ DASH, BamHI cut, Stratagene No .: 247611) in 6 µl total volume with 2 white Units Lambda T4 ligase ligated for 12 hours at 15 ° C.

Nach erfolgter Ligation wurde die DNA mit Hilfe eines Verpackungskits (Gigapack II Gold, Stratagene Nr.: 247611) genau nach Angaben des Herstellers in Phagenhüllen verpackt.After the ligation, the DNA was analyzed using a Packaging kits (Gigapack II Gold, Stratagene No .: 247611) packed in phage sleeves exactly according to the manufacturer's instructions.

b) Radioaktive Markierung der DNA-Probeb) Radioactive labeling of the DNA sample

Für die Markierung wurde der "Random Primed DNA Labeling Kit" von Boehringer Mannheim (Nr.: 713 023) eingesetzt. Markiert wurde das PCR-Produkt, welches wie in Beispiel 3 beschrieben mit den Primern sk68 und envb erhalten wurde. 1 µg dieser DNA wurde durch 2 × 5 min Kochen und anschließender Abkühlung in Eiswasser denaturiert. Zur Markierung wurden 50 mCi [α-32P]-dCTP (NEN, Nr.: NEX-053H) zugegeben. Sonstige Zusätze wurden nach Herstellerangaben pipettiert. Nach einer Inkubation von 30 min bei 37°C erfolgte eine Fällung der nun radioaktiv markierten DNA.The "Random Primed DNA Labeling Kit" from Boehringer Mannheim (No. 713 023) was used for the labeling. The PCR product which was obtained as described in Example 3 with the primers sk68 and envb was labeled. 1 µg of this DNA was denatured by boiling for 2 × 5 min and then cooling in ice water. 50 mCi [α- 32 P] -dCTP (NEN, no .: NEX-053H) were added for labeling. Other additives were pipetted according to the manufacturer's instructions. After an incubation of 30 minutes at 37 ° C., the now radioactively labeled DNA was precipitated.

c) Screening der Phagen-Bibliothekc) Screening the phage library

Zu 200 µl einer bei 30°C über Nacht angezogenen Kultur (Stamm SRB(P2) [Stratagene, Nr.: 247611] in LB-Medium, welches 10 mM MgSO4, sowie 0,2% Maltose enthielt) wurden 20000 pfu (Plaque forming units) der Bibliothek in 100 µl SM-Puffer (5,8 g NaCl, 2 g MgSO4 50 ml 1 M Tris. pH 7,5 und 5 ml einer 2% Gelatinelösung in 1 l H2O gelöst) gegeben, die Phagen 20 min bei 37°C an die Bakterien adsorbiert, mit 7,5 ml auf 55°C abgekühlter Top-Agarose gemischt und auf einer vorgewärmten Lb-Agarplatte von 14 cm Durchmesser verteilt. Nach etwa 8 Stunden erreichten die Plaques Konfluenz. Daraufhin wurden Nitrocellulosefilter für wenige Minuten auf die Platten gelegt und asymmetrische Markierungen angebracht. Nach vorsichtigem Abheben wurden die Filter für 2 min denaturiert (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) und dann 5 min neutralisiert (0,5 M Tris, pH 8, 1,5 M NaCl). Nach anschließendem Backen der Filter bei 80°C für 60 min. konnten die Filter mit der Probe hybridisiert werden.20000 pfu (plaque.) Were added to 200 ul of a culture grown overnight at 30 ° C. (strain SRB (P2) [Stratagene, no .: 247611] in LB medium which contained 10 mM MgSO 4 and 0.2% maltose) forming units) of the library in 100 ul SM buffer (5.8 g NaCl, 2 g MgSO 4 50 ml 1 M Tris. pH 7.5 and 5 ml of a 2% gelatin solution dissolved in 1 l H 2 O), the Phages adsorbed to the bacteria for 20 min at 37 ° C, mixed with 7.5 ml of top agarose cooled to 55 ° C and distributed on a preheated Lb agar plate with a diameter of 14 cm. After about 8 hours, the plaques reached confluence. Nitrocellulose filters were then placed on the plates for a few minutes and asymmetrical markings were made. After careful lifting, the filters were denatured for 2 min (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) and then neutralized for 5 min (0.5 M Tris, pH 8, 1.5 M NaCl). After baking the filters at 80 ° C for 60 min. the filters could be hybridized with the sample.

Zur Vorhybridisierung wurden die Filter in 15 ml Hybridisierungslösung (50% Formamid, 0,5% SDS, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA) pro Filter bei 42°C unter Schütteln 2-3 h inkubiert. Die [32P]- markierten DNA-Proben wurden 2-5 min bei 100°C denaturiert, auf Eis abgekühlt, der Vorhybridisierungslösung zugesetzt und 12 Stunden bei 42°C hybridisiert. Anschließend wurden die Filter bei 60°C zunächst mit 2 × SSC/0,1% SDS, dann mit 0,2 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Nach Trocknen der Filter wurden Hybridisierungssignale mit Hilfe des Röntgenfilms X- OMAT™AR (Kodak) detektiert.For pre-hybridization, the filters were placed in 15 ml hybridization solution (50% formamide, 0.5% SDS, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's solution and 0.1 mg / ml salmon sperm DNA) per filter at 42 ° C with shaking 2-3 h incubated. The [ 32 P] - labeled DNA samples were denatured for 2-5 min at 100 ° C, cooled on ice, added to the prehybridization solution and hybridized at 42 ° C for 12 hours. The filters were then washed at 60 ° C. first with 2 × SSC / 0.1% SDS, then with 0.2 × SSC / 0.1% SDS. After the filters had dried, hybridization signals were detected using the X-OMAT ™ AR X-ray film (Kodak).

Die Plaques, denen ein Signal zugeordnet werden konnte, wurden nach Elution in SM-Puffer in weiteren Verdünnungsschritten vereinzelt.The plaques to which a signal could be assigned were further eluted in SM buffer Dilution steps isolated.

Der unten beschriebene Klon konnte nach dem Screening von 2 × 106 Plaques identifiziert werden.The clone described below could be identified after screening 2 × 10 6 plaques.

d) Isolierung der Phagen-DNA und Subklonierungd) isolation of phage DNA and subcloning

Mit 10 µl eines Phageneluats in SM-Puffer, wurde eine Übernachtkultur des Wirtsstammes SRB (P2) so infiziert, daß nach zunächst dichtem Wachstum der Kultur nach etwa 6-8 h Lyse erfolgte. Von der lysierten Kultur wurden Zellreste durch zweimalige Zentrifugation bei 9000 g für 10 min abgetrennt. Anschließend wurden die Phagen durch Zentrifugation pelletiert (35000 g, 1 h), in 700 µl 10 mM MgSO4 aufgenommen und solange phenolisiert, bis keine Proteininterphase mehr zu sehen war. Daraufhin wurde die Phagen-DNA gefällt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und die daraus erhaltenen EcoRI-Fragmente in den Vektor Bluescript KS- (Strategene, Nr.: 212208) subkloniert. Insgesamt wurden 4 Klone erhalten:
An overnight culture of the host strain SRB (P2) was infected with 10 μl of a phage eluate in SM buffer in such a way that, after the culture had initially grown densely, lysis took place after about 6-8 h. Cell residues were separated from the lysed culture by centrifugation twice at 9000 g for 10 min. The phages were then pelleted by centrifugation (35000 g, 1 h), taken up in 700 μl of 10 mM MgSO 4 and phenolized until no more protein interphase was visible. The phage DNA was then precipitated, cut with the restriction enzyme EcoRI and the EcoRI fragments obtained therefrom were subcloned into the vector Bluescript KS - (Strategene, no .: 212208). A total of 4 clones were obtained:

Das fehlende Stück zwischen Base 7416 und 7659 wurde durch PCR mit den Primern 157 (CCA TAA TAT TCA GCA GAA CTA G) und 226 (GCT GAT TCT GTA TAA GGG) erhalten. Als DNA-Template wurde die Phagen-DNA des Klons verwendet. Die Bedingungen für die PCR waren: 1.) Initiale Denaturierung: 94°C, 3 min. 2.) Amplifikation: 1,5 min 94°C, 1 min 56°C und 1 min 72°C für 30 Zyklen.The missing piece between base 7416 and 7659 was made by PCR with primers 157 (CCA TAA TAT TCA GCA GAA CTA G) and 226 (GCT GAT TCT GTA TAA GGG) obtained. As a DNA template the clone's phage DNA was used. The conditions for the PCR were: 1.) Initial denaturation: 94 ° C, 3 min. 2.) Amplification: 1.5 min 94 ° C, 1 min 56 ° C and 1 min 72 ° C for 30 cycles.

Die Sequenzierung der DNA erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. Vom gesamten Genom wurde sowohl der Strang- als auch der Gegenstrang sequenziert. Bei allen EcoRI Schnittstellen wurde durch PCR mit Phagen-DNA des Klons als DNA-Template verifiziert, daß es sich an den Subklonübergängen jeweils um singuläre EcoRI-Schnittstellen handelt. The DNA was sequenced as in Example 4 described. From the entire genome, both the strand and the opposite strand is also sequenced. With all EcoRI Interfaces were identified by PCR with the clone's phage DNA DNA template verified that it is the Subclone transitions around unique EcoRI interfaces is.  

Tab. 5 Tab. 5

Die Lage der Gene der Virusproteine GAG, POL und ENV in der Gesamtsequenz von MvP5180 The location of the genes of the virus proteins GAG, POL and ENV in the overall sequence of MvP5180

Beispiel 10Example 10 Abgrenzung der Gesamtsequenz von MvP5180/91 von anderen HIV1-IsolatenDistinguishing the overall sequence of MvP5180 / 91 from others HIV-1 isolates

Grundlage für die folgenden Sequenzvergleiche war die Datenbanken Genbank Release 75 von 2.93, EMBL 33 von 12.92 und Swissprot 24 von 1.93. Homologievergleiche erfolgten mit der GCG-Software (Version 7.2, 10.92. der Genetics-Computer- Group, Wisconsin).The basis for the following sequence comparisons was the Databases Genbank Release 75 from 2.93, EMBL 33 from 12.92 and Swissprot 24 from 1.93. Homology comparisons were made with the GCG software (version 7.2, 10.92. of the Genetics computer Group, Wisconsin).

Zunächst wurden auf Aminosäureebene die Sequenzen von GAG, POL und ENV mit dem Programm "Wordsearch" mit der Datenbank verglichen. Die 50 besten Homologen wurden mit dem Programm "Pileup" jeweils untereinander verglichen. Daraus geht deutlich hervor, daß MvP5180/91 in den HIV1-Stammbaum fällt, dort aber sehr früh, sogar noch vor dem Schimpansenvirus SIVcpz abzweigt, also eine neue Subfamilie von HIV1 repräsentiert. Um Zahlenwerte für die Homologien zu erhalten, wurde mit dem Programm "Gap" MvP5180 mit den jeweils am besten passenden HIV1, HIV2 und SIV-Sequenzen und zusätzlich mit der SIVcpz-Sequenz verglichen. First, at the amino acid level, the sequences of GAG, POL and ENV with the program "Wordsearch" with the database compared. The 50 best homologues were included in the program "Pileup" compared to each other. From this goes clearly shows that MvP5180 / 91 falls within the HIV1 family tree, but there very early, even before the chimpanzee virus SIVcpz branches off, i.e. a new subfamily of HIV1 represents. To get numerical values for the homologies was obtained with the program "Gap" MvP5180 with the best fitting HIV1, HIV2 and SIV sequences and additionally compared with the SIVcpz sequence.  

Tab. 6 Tab. 6

Homologiewerte der Aminosäuresequenz von GAG, POL und ENV des MvP5180/91-Isolates Homology values of the amino acid sequence of GAG, POL and ENV of the MvP5180 / 91 isolate

Der obere Zahlenwert drückt die Identität, der untere die Ähnlichkeit beider Sequenzen aus.The upper numerical value expresses the identity, the lower the Similarity of both sequences.

Weiter wurde die Datenbank mit "Wordsearch" und "Gap" auf Nukleotidebene durchsucht. Die Homologiewerte für die jeweils besten "matches" sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.Furthermore, the database was opened with "Wordsearch" and "Gap" Nucleotide level searched. The homology values for the The best matches are summarized in Table 7.

Tab. 7 Tab. 7

Homologiewerte der Nukleotidsequenz von MvP5180/91 Homology values of the nucleotide sequence of MvP5180 / 91

Beispiel 11Example 11 Beschreibung der PCR Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung des gag Gens des HIV 5180 IsolatesDescription of PCR amplification, cloning and Sequencing of the gag gene of the HIV 5180 isolate

Um die im Laufe der Virusvermehrung auftretenden Spontanmutationen darzustellen, wurde ein Teil des Virusgenoms mit der PCR-Technik kloniert und die so erhaltene DNS-Sequenz verglichen mit der Sequenz gemäß Fig. 4. In order to depict the spontaneous mutations occurring in the course of virus multiplication, part of the virus genome was cloned using the PCR technique and the DNA sequence thus obtained was compared with the sequence according to FIG. 4.

Die gag Sequenz wurde vom LTR ("long terminal repeat", LTR1 primer) des linken Endes des MvP 5180 Genomes bis in das pol (Polymerase Gen, pol 3.5i primer) hinein überlappend kloniert. Die Klonierungsstrategie ist in Fig. 5 schematisch dargestellt.The gag sequence was cloned from the LTR ("long terminal repeat", LTR1 primer) of the left end of the MvP 5180 genome overlapping into the pol (polymerase gene, pol 3.5i primer). The cloning strategy is shown schematically in FIG. 5.

Die PCR Reaktionen wurden mit den u. g. DNA Primern, deren Sequenzen von der HIV-1 Konsensus-Sequenz abgeleitet wurden, durchgeführt. Die Sequenzierungen erfolgten mit Hilfe der Dideoxykettenabbruchmethode.The PCR reactions were carried out with the u. G. DNA primers whose Sequences derived from the HIV-1 consensus sequence carried out. The sequencing was done using the Dideoxy chain termination method.

Die für das MvP 5180 gag Gen kodierende Sequenz erstreckt sich von Nukleotid 817 (A des ATG Startkodons) bis Nukleotid 2300 (A des letzten Kodons).
The sequence coding for the MvP 5180 gag gene extends from nucleotide 817 (A of the ATG start codon) to nucleotide 2300 (A of the last codon).

Die bei der PCR-Technik erhaltene DNS-Sequenz wurde der in Fig. 4 dargestellten DNS-Sequenz gegenübergestellt. Ein Vergleich der beiden DNS-Sequenzen ist in Fig. 6 dargestellt. Hierbei wurde festgestellt, daß sich die Nukleotide in ca. 2% voneinander unterscheiden, obwohl es sich um dasselbe Virus handelt. In Fig. 6 stellt jeweils die obere Zeile die DNS-Sequenz dar, die in Fig. 4 dargestellt ist und die untere Zeile stellt die mit PCR-Technik erhaltene DNS-Sequenz dar.The DNA sequence obtained in the PCR technique was compared with the DNA sequence shown in FIG. 4. A comparison of the two DNA sequences is shown in FIG. 6. It was found that the nucleotides differ from one another in about 2%, even though the virus is the same. In FIG. 6 the top line represents the DNA sequence shown in FIG. 4 and the bottom line shows the DNA sequence obtained with the PCR technique.

Weiterhin wurde die Aminosäuresequenz des mit PCR-Technik ermittelten Proteins gag der Aminosäuresequenz des aus Fig. 4 abgeleiteten entsprechenden Proteins gegenübergestellt. Dabei wurde ein Unterschied der Aminosäure von ca. 2,2% ermittelt. Der Vergleich ist in Fig. 7 dargestellt, wobei die untere Zeile jeweils die Aminosäuresequenz darstellt, die von der mit PCR-Technik erhaltenen Sequenz abgeleitet wurde.Furthermore, the amino acid sequence of the protein gag determined using the PCR technique was compared with the amino acid sequence of the corresponding protein derived from FIG. 4. A difference of approximately 2.2% in the amino acid was determined. The comparison is shown in FIG. 7, the lower line in each case representing the amino acid sequence which was derived from the sequence obtained using the PCR technique.

Beispiel 12Example 12

Es wurde die Sequenz des erfindungsgemäßen Virus MvP 5180 verglichen mit den Konsensus-Sequenzen von HIV1 und HIV2 und soweit bekannt mit der Sequenz von ANT-70 (WO 89/12094).It became the sequence of the virus MvP 5180 according to the invention compared to the consensus sequences of HIV1 and HIV2 and as far as known with the sequence of ANT-70 (WO 89/12094).

Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:The following results were obtained:

Tab. 8 Tab. 8

In der obigen Tabelle bedeuten "HIV-1" Konsensus-Sequenzen von HIV-1 Viren; "HIV-2" Konsensus-Sequenzen von HIV-2 Viren; ANT-70 aus der WO 89/12094 bekannte Teilsequenz eines als HIV-3 bezeichneten Virus. In the table above, "HIV-1" means consensus sequences of HIV-1 viruses; "HIV-2" consensus sequences of HIV-2 viruses; ANT-70 partial sequence known from WO 89/12094 known as HIV-3 virus.  

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Viren, DNS- Sequenzen, Aminosäuresequenzen sowie Teilsequenzen davon, die eine solche Homologie mit der in Fig. 4 dargestellten Sequenz aufweisen, bezogen auf die Genorte, daß höchstens die in Tabelle 9 angegebenen Anteile, ausgedrückt in %- Werten, unterschiedlich sind.The present invention therefore relates to viruses, DNA sequences, amino acid sequences and partial sequences thereof which have such homology with the sequence shown in FIG. 4, based on the gene loci, that at most the proportions given in Table 9, expressed in% values , are different.

Tab. 9 Tab. 9

Homologie bezogen auf Genorte, ausgedrückt als maximale Unterschiede Homology based on gene locations, expressed as maximum differences

Die in Tabelle 9 angegebenen Homologiewerte in % bedeuten, daß bei einer Gegenüberstellung der Sequenz gemäß Fig. 4 mit einer Sequenz eines anderen Virus höchstens ein den oben angegebenen Prozentwerten entsprechender Anteil der Sequenz unterschiedlich sein darf.The homology values in% given in Table 9 mean that when the sequence according to FIG. 4 is compared with a sequence of another virus, at most a portion of the sequence corresponding to the percentages given above may differ.

Beispiel 13Example 13 V3-loop/V3-SchlaufeV3 loop / V3 loop

Diese Schlaufe ist die hauptneutralisierende Region im HIV und die Dokumentation der immunologischen Spezifitäten der Region sind in der Fig. 8 zusammengefaßt. Dies ist eine Kopie aus AIDS aus einer Arbeit von Peter Nara (1990).This loop is the main neutralizing region in HIV and the documentation of the immunological specificities of the region are summarized in FIG. 8. This is a copy of AIDS from a work by Peter Nara (1990).

Die V3-Schlaufe ist dann in Aminosäuren-Ebene aufgezeichnet und mit dem IIIB Virus jetzt LAI und dem ersten HIV-2 Isolat (ROD) verglichen. Einzelne Aminosäuren an der Cystin-Brücke sind konserviert. Während die Krone von HIV-1 GPGR oder GPGQ ist und die von HIV-2 GHVF ist die Krone des MvP5180/91 gebildet aus den Aminosäuren GPMR. Das Motiv mit dem Methionin ist bisher nicht beschrieben worden und unterstreicht die Individualität des MvP 5180/91.The V3 loop is then recorded at the amino acid level and with the IIIB virus now LAI and the first HIV-2 isolate (ROD) compared. Individual amino acids on the cystine bridge are preserved. While the crown of HIV-1 GPGR or GPGQ  and that of HIV-2 GHVF is the crown of the MvP5180 / 91 formed from the amino acids GPMR. The motif with the Methionine has not been previously described and underlines the individuality of the MvP 5180/91.

Claims (21)

1. Immunschwäche-Virus der HIV-Gruppe oder Varianten dieses Virus, das die wesentlichen morphologischen und immunologischen Eigenschaften des bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegten Retrovirus mit der Bezeichnung MVP-5180/91 aufweist.1. Immunodeficiency virus of the HIV group or variants of this Virus that is the essential morphological and immunological properties of the at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) under the No. V 920 92 318 deposited retrovirus with the Designation MVP-5180/91. 2. Immunschwäche-Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine der Reversen Transkriptase entsprechende Proteinbande im Western Blot aufweist, die 3-7 Kilodalton kleiner ist als die entsprechende Bande der Viren HIV-1 und/oder HIV-2.2. immunodeficiency virus according to claim 1, characterized characterized as being one of the reverse transcriptase has a corresponding protein band in the Western blot, the 3-7 Kilodalton is smaller than the corresponding band of viruses HIV-1 and / or HIV-2. 3. Immunschwäche-Virus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Retrovirus mit einem gegen das Protein p 24 gerichteten monoklonalen Antikörper weniger Reaktivität aufweist, bezogen auf die Reverse Transkriptase-Aktivität, als das Virus HIV-1 und mehr Aktivität, bezogen auf die Aktivität der Reversen Transkriptase, als HIV-2.3. immunodeficiency virus according to one of claims 1 or 2, characterized in that this retrovirus with a monoclonal antibodies directed against the protein p 24 has less reactivity, based on the reverse Transcriptase activity than the HIV-1 virus and more Activity, based on the activity of the reverse Transcriptase, as HIV-2. 4. Immunschwäche-Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit seinem Transmembranprotein gp 41 Antigen-Antikörperreaktionen gut nachweisbar sind mit Seren von aus Afrika stammenden Patienten und, daß mit dem gp 41 nur eine geringere oder keine Antigen-Antikörperreaktion mit Seren von aus Deutschland stammenden Patienten nachgewiesen werden kann.4. Immunodeficiency virus according to one of the previous ones Claims, characterized in that with his Transmembrane protein gp 41 antigen-antibody reactions good are detectable with sera from Africa Patients and that with the gp 41 only a minor or no antigen-antibody reaction with sera from Germany-born patients can be proven. 5. Immunschwäche-Virus nach einem der obengenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine RNA-Sequenz aufweist, die mit der RNA des hinterlegten Virus zu etwa 75% oder mehr, bezogen auf das Gesamtgenom, homolog ist. 5. Immunodeficiency virus according to one of the above Claims, characterized in that there is an RNA sequence has about that with the RNA of the deposited virus 75% or more, based on the entire genome, is homologous.   6. Immunschwäche-Virus nach einem der oben genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine RNA-Sequenz aufweist, die zu der RNA-Sequenz von Tabelle 1 zu wenigstens 75% homolog ist.6. Immunodeficiency virus according to one of the above Claims, characterized in that there is an RNA sequence which corresponds to the RNA sequence of Table 1 at least Is 75% homologous. 7. Immunschwäche-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die zu der Sequenz von Tabelle 3 oder Teilen davon zu wenigstens 75% homolog ist.7. immunodeficiency virus according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is a nucleotide sequence to the sequence of Table 3 or parts thereof is at least 75% homologous. 8. Immunschwäche-Virus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil der Sequenz wenigstens 50 Nucleotide lang ist.8. immunodeficiency virus according to claim 7, characterized characterized in that the part of the sequence is at least 50 Is nucleotides long. 9. Immunschwäche-Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz oder Teilsequenz aufweist, die der Fig. 4 entspricht oder zu dieser Sequenz homolog ist, wobei die Unterschiede zu der in Fig. 4 angegebenen Sequenz bezogen auf die Genorte höchstens betragen: LTR: 17%, GAG: 29%; POL: 25%; VIF: 31%; ENV: 46%; NEF: 16%.9. immunodeficiency virus according to one of the preceding claims, characterized in that it has a sequence or partial sequence which corresponds to FIG. 4 or is homologous to this sequence, the differences from the sequence given in FIG. 4 based on the gene loci maximum: LTR: 17%, GAG: 29%; POL: 25%; VIF: 31%; EPS: 46%; NEF: 16%. 10. Immunschwäche-Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz oder Teilsequenz aufweist, die der Fig. 4 entspricht oder zu dieser Sequenz homolog ist, wobei die Unterschiede zu der in Fig. 4 angegebenen Sequenz bezogen auf die Genorte höchstens betragen: LTR: 10%; GAG: 14%; POL: 12%; VIF: 15%; ENV: 22%; NEF: 10%.10. Immunodeficiency virus according to one of the preceding claims, characterized in that it has a sequence or partial sequence which corresponds to FIG. 4 or is homologous to this sequence, the differences from the sequence indicated in FIG. 4 based on the gene loci maximum: LTR: 10%; GAG: 14%; POL: 12%; VIF: 15%; EPS: 22%; NEF: 10%. 11. cDNA, die komplementär ist zu der RNA oder Teilen davon, des bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegten Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 oder eines Virus gemäß einem der Ansprüche 1-10.11. cDNA that is complementary to the RNA or parts of which, at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) under the number V 920 92 318 Immunodeficiency virus MVP-5180/91 or a virus according to one of claims 1-10. 12. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie cDNA gemäß Anspruch 11 enthält. 12. Recombinant DNA, characterized in that it is cDNA according to claim 11.   13. Antigen, das unter Verwendung der cDNA gemäß Anspruch 11 oder der rekombinanten DNA gemäß Anspruch 12 hergestellt wurde oder unter Verwendung der Aminosäurenstruktur, die aus seiner cDNA abgeleitet werden kann.13. Antigen using the cDNA according to claim 11 or the recombinant DNA according to claim 12 was or using the amino acid structure derived from its cDNA can be derived. 14. Antigen, das aus einem Immunschwäche-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt wurde.14. Antigen derived from an immunodeficiency virus according to a of claims 1 to 10 was produced. 15. Antigen nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Protein oder Peptid ist.15. Antigen according to claim 13 or 14, characterized characterized as being a protein or peptide. 16. Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es rekombinant hergestellt wurde.16. Antigen according to one of claims 13 to 15, characterized characterized in that it was produced recombinantly. 17. Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Immunschwäche verursachende Viren, dadurch gekennzeichnet, daß Antigen gemäß den Ansprüchen 13 bis 16 eingesetzt wird.17. Test kit for the detection of antibodies against Viruses causing immune deficiency, characterized in that that antigen is used according to claims 13 to 16. 18. Testkit gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Western Blot ist.18. Test kit according to claim 17, characterized in that it's a western blot. 19. Testkit gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Elisa-Test ist oder ein Fluoreszenz-Antikörper Nachweistest ist.19. Test kit according to claim 17, characterized in that it is an Elisa test or a fluorescent antibody Proof test is. 20. Verwendung des Immunschwäche-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder der cDNA gemäß Anspruch 11 oder 12 und/oder eines Antigens gemäß den Ansprüchen 13 bis 16 zum Nachweis von Retroviren, die Immunschwäche verursachen.20. Use of the immunodeficiency virus according to one of the Claims 1 to 10 and / or the cDNA according to claim 11 or 12 and / or an antigen according to claims 13 to 16 for the detection of retroviruses that cause immunodeficiency. 21. Verwendung eines Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, einer cDNA gemäß Anspruch 11 oder 12 und/oder eines Antigens gemäß den Ansprüchen 13 bis 16 zur Herstellung von Impfstoffen.21. Use of a retrovirus according to one of claims 1 to 10, a cDNA according to claim 11 or 12 and / or one Antigen according to claims 13 to 16 for the production of Vaccines.
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