DE4139083A1 - Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven herstellung optisch aktiver cyanhydrine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine aus einem Aldehyd oder unsymmetrischen Keton und einem Cyanidgrup­ pendonor unter Einwirkung einer Hydroxynitrillyase.

Cyanhydrine haben etwa für die Synthese von alpha-Hydroxysäu­ ren, die zur Gewinnung biologisch wirksamer Stoffe, z. B. pharmazeutischer Wirkstoffe, Vitamine oder auch pyrethroider Verbindungen Verwendung finden, Bedeutung.

Die Herstellung eines Cyanhydrins kann beispielsweise durch Anlagerung einer Cyanidgruppe an den Carbonylkohlenstoff eines Aldehyds oder Ketons erfolgen, wobei bei Einsatz eines Aldehyds oder eines unsymmetrischen Ketons Enantiomerengemische optisch aktiver Cyanhydrine entstehen. Da in einem biologisch wirksamen Enantiomerengemisch im allgemeinen nur eines der beiden Enan­ tiomere biologisch wirksam ist, hat es nicht an Versuchen ge­ fehlt, ein Verfahren zu finden, durch das ein gewünschtes Enantiomeres eines optisch aktiven Cyanhydrins in möglichst ho­ her optischer Reinheit herstellbar ist.

So ist in Chemistry Letters, The Chemical Society of Japan (1986), 931-934 ein Verfahren zur Cyanhydrinierung eines Alde­ hyds unter Verwendung eines Cyanidgruppendonors und eines synthetischen Dipeptides als Katalysator geoffenbart. Diese Re­ aktion verläuft aber nur in geringem Ausmaß enantioselektiv und die optische Reinheit der Produkte ist unbefriedigend.

Aus EP-A-03 26 063 ist bekannt, aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Aldehyde oder Ketone mit Blausäure in Gegen­ wart einer Oxynitrilase umzusetzen, wobei entsprechende R- bzw. S-Cyanhydrine enantioselektiv gebildet werden. Die Handhabung von Blausäure bereitet aber wegen ihres niedrigen Siedepunktes Schwierigkeiten. Außerdem ist Blausäure hochgiftig und wird da­ her nur sehr ungern in einem technischen Verfahren eingesetzt.

In J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6992-6996 ist ein Verfahren zur Herstellung von R-cyanhydrinen durch Umsetzung von aromatischen oder aliphatischen Aldehyden mit Acetoncyanhydrin in Gegenwart einer D-Oxynitrilase beschrieben. Um enantiomerenangereicherte Produkte zu erhalten, muß das Verfahren dabei in Gegenwart eines organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels durchgeführt werden, da es in wäßriger Lösung allein zu einer Racemisierung des Produktes kommt.

Es wurde nun unerwarteterweise ein enantioselektives Verfahren zur Herstellung des S-Enantiomeren eines optisch aktiven Cyan­ hydrins gefunden, bei dem die Produkte in hoher optischer Rein­ heit anfallen und bei dem keine Blausäure und kein organisches Lösungsmittel verwendet werden müssen. S-Cyanhydrine, die von aliphatischen Aldehyden abgeleitet sind, können auf diese Weise erstmals mit Hilfe einer S-Hydroxynitrillyase hergestellt wer­ den.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein enantioselektives Verfahren zur Herstellung des S-Enantiomeren eines optisch ak­ tiven Cyanhydrins durch Umsetzung eines Aldehydes oder eines unsymmetrischen Ketons mit einem Cyanidgruppendonor, das da­ durch gekennzeichnet ist, daß der Aldeyhd oder das Keton in ei­ nem Verdünnungsmittel in Gegenwart einer S-Hydroxynitrillyase mit dem Cyanidgruppendonor umgesetzt wird, worauf das gebildete Cyanhydrin aus der Reaktionsmischung isoliert wird.

Als Ausgangsmaterialien im erfindungegemäßen Verfahren werden ein Aldehyd oder ein unsymmetrisches Keton, ein Cyanidgruppen­ donor, eine Hydroxynitrillyase und ein Verdünnungsmittel einge­ setzt.

Unter Aldehyde sind dabei aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Aldehyde zu verstehen. Unsymmetrische Ketone sind aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Ketone, bei denen das Carbonylkohlenstoffatom ungleich substituiert ist. Bevorzugt werden Aldehyde, ganz bevorzugt aliphatische oder aromatische Aldehyde umgesetzt. Solche Aldehyde und Ketone sind bekannt oder wie üblich herstellbar.

Als Cyanidgruppendonor kommt ein Cyanhydrin der allgemeinen Formel R₁R₂C(OH)(CN), in der R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine unsubstituierte oder mit unter den Reak­ tionsbedingungen inerten Gruppen substituierte Kohlenwasser­ stoffgruppe, oder R₁ und R₂ gemeinsam eine Alkylengruppe mit 4 oder 5 C-Atomen bedeuten, wobei R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten, in Betracht. Die Kohlenwasserstoffgruppen sind aliphatische oder aromatische, bevorzugt aliphatische Gruppen. Bevorzugt bedeuten R₁ und R₂ Alkylgruppen mit 1 bis 6 C-Atomen, ganz bevorzugt ist der Cyanidgruppendonor Acetoncyan­ hydrin.

Die Herstellung des Cyanidgruppendonors kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Cyanhydrine, insbesonders Acetoncyanhydrin, sind auch käuflich zu erwerben.

Als Hydroxynitrillyase kommen S-Hydroxynitrillyasen, z. B. aus Sorghum bicolor und Hevea brasiliensis in Frage. Als besonders geeignet hat sich die Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis herausgestellt. Die Hydroxynitrillyase kann dabei gereinigt oder ungereinigt, als solche oder immobilisiert eingesetzt wer­ den. Die Bereitstellung und Reinigung der Hydroxynitrillyase kann beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat und an­ schließender Gelfiltration, etwa gemäß D. Selmar et al., Phy­ siologia Plantarum 75 (1989), 97-101 erfolgen.

Die Umsetzung erfolgt in einem Verdünnungsmittel. Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, daß die Umsetzung in einem wäßrigen Verdünnungsmittel ohne Zusatz organischer Lösungsmit­ tel, die die Aktivität des Enzyms rasch hemmen, erfolgen kann, wobei es unerwarteterweise zu keiner Racemisierung des Pro­ duktes kommt. Die erfindungsgemäße Umsetzung kann aber auch in einem organischen Verdünnungsmittel oder in Gegenwart eines or­ ganischen Lösungsmittels ausgeführt werden. Das organische Lö­ sungsmittel kann dabei als Colösungsmittel in einem wäßrigen System oder als Lösungsmittel in einem Zweiphasensystem, bei­ spielsweise in einem Membranreaktor, dienen. Als organische Verdünnungsmittel können aliphatische oder aromatische Kohlen­ wasserstoffe, die gegebenenfalls halogeniert sind, Alkohole, Ether, Ester verwendet werden. Als organisches Colösungsmittel können mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, etwa Al­ kohole, als Lösungsmittel in einem Zweiphasensystem mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel wie z. B. aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, die gegebenenfalls halogeniert sind, Ether, Ester eingesetzt werden. Bevorzugt erfolgt die Umsetzung nicht in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel sondern in einem wäßrigen Verdünnungsmittel. Als wäßriges Verdünnungsmittel wird Wasser, eine wäßrige Salz- oder eine wäßrige Pufferlösung eingesetzt. Bevorzugt wird eine wäß­ rige Pufferlösung, ganz bevorzugt eine solche, die Natriumci­ trat enthält, verwendet. Der pH-Wert soll dabei unter 7, bevor­ zugt etwa 3 bis 5 betragen.

Pro g Aldehyd oder unsymmetrisches Keton werden etwa 150 bis 300 g Verdünnungsmittel und 500 bis 2000 IU Aktivität Hydroxynitrillyase, bevorzugt etwa 800 bis 1500 IU, zugesetzt. Ein IU (International Unit) drückt dabei die Bildung von einem Mikromol Produkt pro Minute und pro Gramm Enzymrohisolierung aus. Die benötigte Menge der jeweiligen Hydroxynitrillyase ermittelt man am besten in einem Aktivitätstest, etwa gemäß Selmar et al., Analytical Biochemistry 166 (1987), 208-211.

Pro Mol eingesetzte Aldehyd- oder Ketogruppe werden mindestens ein Mol, bevorzugt 1 bis 2 Mole Cyanidgruppendonor zugegeben.

Die Reaktionsmischung wird bei Temperaturen von etwa 0°C bis zur Desaktivierungstemperatur der Hydroxynitrillyase, bevorzugt von 20 bis 30°C geschüttelt oder gerührt.

Dabei wird die Cyanidgruppe vom Cyanidgruppendonor auf das Carbonylkohlenstoffatom des eingesetzten Aldehyds oder Ketons übertragen und es entsteht überwiegend das S-Enantiomere des, dem eingesetzten Aldehyd oder Keton entsprechenden, optisch aktiven Cyanhydrins. Der Fortschritt der Reaktion wird dabei gaschromatographisch verfolgt.

Nach erfolgter Umsetzung kann das gebildete Cyanhydrin aus der Reaktionsmischung mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, das mit Wasser nicht mischbar ist, etwa aliphatische oder aro­ matische gegebenenfalls halogenierte Kohlenwasserstoffe, z . B. Pentan, Hexan, Benzol, Toluol, Methylenchlorid, Chloroform, Chlorbenzole, Ether wie etwa Diethylether, Diisopropylether oder Ester, beispielsweise Essigsäureethylester oder Mischungen solcher Lösungsmittel extrahiert werden. Sollte die Reinheit des extrahierten Produktes nicht ausreichend sein, kann eine Reinigungsoperation angeschlossen werden. Die Reinigung kann durch eine bekannte Methode erfolgen und gelingt am besten chromatographisch.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden etwa 100 mg Aldehyd in 15 bis 30 g einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 4, die Natriumcitrat enthält, mit 2 Mol Acetoncyanhy­ drin pro Mol eingesetzter Aldehyd- oder Ketogruppe und 200 IU Aktivität Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Fortschritt der Reaktion wird gaschromatographisch verfolgt. Nach beendeter Reaktion wird die Reaktionsmischung mit Methylenchlorid extrahiert, die organi­ sche Phase getrocknet und abgedampft. Eine weitere Reinigung des Rückstandes kann säulenchromatographisch erfolgen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden auf einfache Weise optisch aktive, S-angereicherte Cyanhydrine ohne Blausäure und ohne ein organisches Lösungsmittel verwenden zu müssen, her­ gestellt. Das Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.

Beispiel 1

100 mg Capronaldehyd (1 mMol) wurden in 20 ml 0,1 molarem Ci­ tratpuffer mit einem pH-Wert von 4 gelöst, mit 1 g Enzymrohiso­ lierung mit einer Aktivität von 100 IU pro Gramm als ge­ friergetrocknetes Pulver, erhalten gemäß D. Selmar et al., Phy­ siologica Plantarum 75 (1989), 97 bis 101, und 168 mg Aceton­ cyanhydrin (2 mMol) versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur am Schüttler geschüttelt. Die Reaktion wurde gaschromatogra­ phisch verfolgt. Nach beendeter Reaktion wurde dreimal mit je 25 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotavapor abgedampft.

Dabei wurden 114 mg, das sind 90 % der Theorie, S- Capronaldehydcyanhydrin mit einer Enantiomerenreinheit ee von 84% erhalten.

Beispiel 2

80 mg Benzaldehyd (0,75 mMol) und 128 mg Acetoncyanhydrin (1,5 mMol) wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, in 15 ml 0,1 mo­ larem Citratpuffer (pH-Wert = 4) mit 1 g der im Beispiel 1 be­ schriebenen Enzymrohisolierung umgesetzt.

Dabei wurden 45 mg, das sind 45% der Theorie S-Benzaldehyd­ cyanhydrin mit einer Enantiomerenreinheit ee von 94% erhalten.

Die Bestimmung der optischen Reinheit der gebildeten Aldehyd­ cyanhydrine erfolgte gaschromatographisch auf einer Kapillar­ säule als Menthylcarbonat gemäß J.W. Westley et al., J. Org. Chem. 33 (1968), 3978-3980.

Die Bestimmung der optischen Reinheit der Ketoncyanhydrine er­ folgte gaschromatographisch auf einer chiralen Trennphase gemäß V. Schurig et al., Ang. Chemie 102 (1990), 969-986.

Claims (10)

1. Enantioselektives Verfahren zur Herstellung des S-Enantiome­ ren eines optisch aktiven Cyanhydrins durch Umsetzung eines Aldehyds oder eines unsymmetrischen Ketons mit einem Cyanidgruppendonor, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd oder das Keton in einem Verdünnungsmittel in Gegenwart einer S-Hydroxynitrillyase mit dem Cyanidgruppendonor umge­ setzt wird, worauf das gebildete Cyanhydrin aus der Re­ aktionsmischung isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Aldehyd umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein aliphatischer oder aromatischer Aldehyd umgesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Cyanidgruppendonor ein Cyanhydrin der Formel (R₁)(R₂)C(OH) (CN), in der R₁ und R₂ Alkylgruppen bedeuten, eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Cyanidgruppendonor Acetoncyanhydrin eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Verdünnungsmittel ein wäßriges Verdün­ nungsmittel eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einer wäßrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert von 3 bis 5 durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Hydroxynitrillyase eine S-Hydroxyni­ trillyase aus Hevea brasiliensis oder aus Sorghum bicolor eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das gebildete Cyanhydrin aus der Reak­ tionsmischung extrahiert und chromatographisch gereinigt wird.

10. Verwendung einer S-Hydroxynitrillyase aus Hevea brasilien­ sis oder Sorghum bicolor zur Herstellung von S-Cyanhydri­ nen.