DE4115401A1

DE4115401A1 - Fluoreszenz-messvorrichtung

Info

Publication number: DE4115401A1
Application number: DE19914115401
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Uhl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-05-10
Filing date: 1991-05-10
Publication date: 1992-11-19
Anticipated expiration: 2011-05-11
Also published as: DE4115401C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung, mit der sich Ionen konzentrationen beispielsweise in Zellen, biologischen Schnitten oder einer Küvette be stimmen lassen.

Zelluläre Eigenschaften und inter- sowie intrazelluläre Vorgänge können in zunehmen dem Maße mit Hilfe optischer Methoden charakterisiert werden. Vor allem in der Bio medizin, u. a. beim Studium von komplexen Nerven- und Gehirnstrukturen, gewinnen optische Methoden an Bedeutung. Angesichts der emotional geführten Debatte über Sinn und Notwendigkeit von Tierversuchen gilt dies besonders für Methoden zur Cha rakterisierung intakter Zellkulturen, welche in zunehmendem Maße Tierversuche er setzen werden. Es stehen spezielle Fluoreszenzindikatoren zur Verfügung, mit denen sich die lebende Zelle anfärben und die räumliche Verteilung von für den Zellmetabo lismus wichtigen Ionen (Magnesium, Kalium und Chlorid, vor allem aber Kalzium), re gistrieren läßt. Diese die Zellfunktion nicht beeinträchtigenden Farbstoffe ändern ihr Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit von den intrazellulären Ionenkonzentrationen. Ein optisches Meßverfahren, das bereits besonders intensive Anwendung erfahren hat, ist die Fluoreszenzbestinimung von intrazellulärem Kalzium.

Um aus einer einzigen Fluoreszenzmessung absolute Konzentrationen bestimmen zu können, müßte man die genaue Konzentration des Farbstoffes in der Zelle und die Zelldicke kennen. Beides läßt sich nur mit großem experimentellem Aufwand bestim men. Einen Ausweg bietet eine Verhältnismessung, bei welcher die Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen ermittelt wird. Der Quotient der Meßwerte ist von Zelldicke und Indikatorkonzentration unabhängig und ein direktes Maß für die Ionenkonzentration.

Zum Bestimmen der Ionenkonzentration muß dementsprechend die Fluoreszenz eines Indikatorfarbstoffs bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt und das Verhältnis der resultierenden Fluoreszenzintensitäten ermittelt werden. Bei den für diesen Zweck bisher verwendeten Geräten werden die erforderlichen unterschiedlichen Wellenlängen nacheinander mit

i) einem rotierenden Filterrad oder
ii) zwei Monochromatoren mit nachgeschaltetem Chopper

erhalten. Die Nachteile dieser Konzepte liegen in der begrenzten Zeitauflösung bei (i) bzw. dem großen Aufwand bei (ii). Hinzu kommt die erhöhte Störanfälligkeit von Gerä ten, die auf mechanisch bewegte Teile zurückgreifen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung zu schaf fen, die eine verbesserte Zeitauflösung erlaubt und die sich mit verhältnismäßig gerin gem Aufwand realisieren läßt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung zum Bestimmen von Ionenkonzentrationen mit zwei Beleuchtungseinheiten, von denen mindestens eine gepulst ist, und einem Beugungsgitter, das von den beiden Beleuch tungseinheiten so beleuchtet wird, daß es in einer Austrittsspaltebene die beiden von den Beleuchtungseinheiten ausgehenden Strahlengänge vereinigt und dort unter Bil dung eines bichromatischen Intensitätszeitprofils unterschiedliche Wellenlängen auftre ten läßt, je nach dem welche der beiden Beleuchtungseinheiten gerade Licht abgibt, so wie mit einem abbildenden System, welches das Intensitätszeitprofil auf ein Untersu chungsobjekt auftreffen läßt, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt ist, dessen Anregungsmaximum sich in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Ionenkonzentration ändert, und einer Detektoreinheit, welche das resultierende Fluoreszenzlicht in ein Meßsignal umwandelt.

Zum Beleuchten des Beugungsgitters können zwei gepulste Beleuchtungseinheiten vor gesehen sein, die zweckmäßig beide in Form von Blitzlampen ausgebildet sind. Die bei den gepulsten Beleuchtungseinheiten können dabei aber auch jeweils eine kontinuierli che Lichtquelle und einen im Strahlengang zwischen dieser Lichtquelle und dem Beu gungsgitter angeordneten ansteuerbaren Verschluß aufweisen. Gemäß einer weiter ab gewandelten Ausführungsform können die beiden gepulsten Beleuchtungseinheiten mit einer gemeinsamen kontinuierlichen Lichtquelle und zwei im Strahlengang zwischen dieser Lichtquelle und dem Beugungsgitter angeordneten, getrennt ansteuerbaren Ver schlüssen ausgestattet sein. Der Verschluß bzw. die Verschlüsse sind vorteilhaft elektro nisch ausgebildet.

In vorteilhafter weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist eine elektrische, vorzugsweise rechnergesteuerte Auslösevorrichtung zum Triggern der beiden Blitzlampen bzw. der beiden Verschlüsse mit vorgegebenem zeitlichen Abstand vorgesehen.

Entsprechend einer weiter abgewandelten Ausführungsform der Erfindung können zum Beleuchten des Beugungsgitters aber auch eine gepulste Beleuchtungseinheit und eine kontinuierlich Licht abgebende Beleuchtungseinheit vorgesehen sein.

Die Beleuchtungseinheiten können zweckmäßig eine Lichtquelle, ein abbildendes Sy stem (z. B. mit Linse, Spiegel und/oder Prisma) und einen Lichtleiter aufweisen, dessen Austrittsöffnung in der Eintrittsspaltebene des Beugungsgitters liegt.

Bei der Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach der Erfindung kann ohne großen Aufwand si chergestellt werden, daß das durch die gepulste Lichtquelle oder gepulsten Lichtquellen angeregte Fluoreszenzlicht innerhalb eines so kurzen Zeitfensters anfällt, daß bei einer vorgegebenen Photonenzahl eine außerordentlich hohe Fluoreszenzintensität auftritt. Dabei ist zu berücksichtigen, daß die während eines Meßvorgangs applizierbare Photo nenzahl begrenzt ist, weil andernfalls die Indikatorfarbstoffe ausbleichen. In Meßsi tuationen, wo das Signal/Rauschverhältnis durch Dunkelrauschen limitiert ist, führen die erfindungsgemäß realisierbaren kurzen Zeitfenster zu einer deutlichen Steigerung des Signal/Rauschverhältnisses. Dies erlaubt in der Detektoreinheit den Einsatz von preiswerten und robusten Halbleiterdetektoren (Photodioden) an Stelle von teuren und empfindlichen Sekundärelektronenvervielfachern. Solche Photodioden haben eine deutlich bessere Quantenausbeute, die ebenfalls dem Signal/Rauschverhältnis zugute kommt.

Weil vorliegend die Fluoreszenzwerte bei den verschiedenen Anregungswellenlängen so kurz hintereinander ermittelt werden können, kann von einer quasi-gleichzeitigen Mes sung gesprochen werden. Beispielsweise entspricht der Zeitabstand zwischen einem Doppelblitz, und damit die eigentliche Zeitauflösung, der maximalen Blitzfrequenz der einzelnen Lichtblitze, beispielsweise Stroboskopblitze. Diese maximale Blitzfrequenz kann beispielsweise ohne weiteres einen Wert von etwa 1 kHz haben.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung sind die Beleuchtungseinheiten oder minde stens deren Austrittsöffnungen relativ zueinander und zu dem Beugungsgitter ver schiebbar ausgebildet. Eine solche Verschiebung gestattet es, die beiden Anregungs wellenlängen in einem weiten Bereich zu verändern und damit unterschiedlichen Indi katoren anzupassen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.

Die schematisch dargestellte Fluoreszenz-Meßvorrichtung weist zwei Beleuchtungsein heiten mit gepulsten Lichtquellen 1 und 2, beispielsweise in Form von Stroboskop-Blitz lampen auf, deren Licht über ein zweckentsprechendes nicht veranschaulichtes abbildendes System (Optik) in jeweils eine Lichtleitfaser 3 bzw. 4 eingekoppelt wird. Die Austrittsenden der beiden Lichtleiter 3 und 4 befinden sich in der Eintrittsspalt ebene 5 eines Beugungsgitters 6. Im gezeigten Ausführungsbeispiel handelt es sich bei dem Beugungsgitter 6 um ein konkaves Gitter, das ohne Zuhilfenahme weiterer opti scher Elemente die in der Eintrittsspaltebene 5 liegenden Austrittsöffnungen der Licht leiter 3 und 4 in der in einer Austrittsspaltebene 7 des Beugungsgitters befindlichen Ein trittsöffnung eines Lichtleiters 8 abbildet. Je nach dem, welche der beiden Lichtquellen 1 oder 2 gerade blitzt, resultiert in dem Lichtleiter 8 ein Lichtblitz unterschiedlicher Farbe. Die genaue Wellenlänge der Lichtblitze in dem Lichtleiter 8 läßt sich durch Ver schieben der Austrittsöffnungen der Lichtleiter 3 und 4 in der Eintrittsspaltebene 5 nach Wunsch unabhängig voneinander einstellen und somit unterschiedlichen Meßanforde rungen, insbesondere unterschiedlichen Indikatorfarbstoffen, anpassen.

Die beschriebene Anordnung ermöglicht die Realisierung eines bichromatischen Inten sitätszeitprofils, beispielsweise in Form einer bichromatischen Blitzfolge mit hoher Fol gefrequenz und ohne die Notwendigkeit bewegter Teile. Im Normalfall wird man einen bichromatischen Doppelblitz wählen, wobei der zeitliche Abstand der beiden Blitze nur durch die Dauer der einzelnen Blitze (in der Regel wenige Millisekunden) und durch die Zeitauflösung der Detektor-Verstärkerkombination limitiert ist, die in einer nachge schalteten Detektoreinheit zur Messung des angeregten Fluoreszenzlichtes vorgesehen ist.

Es ist beispielsweise aber auch möglich, eine kontinuierliche Lichtquelle der Wellen länge λ₁, mit einer gepulsten Lichtquelle der Wellenlange λ₂ über das Beugungsgitter 6 zu kombinieren und die Fluoreszenzintensität bei Anregung mit der Wellenlänge λ₂ durch Differenzbildung zu ermitteln. Die gepulste Lichtquelle kann dabei entweder mit einem zusätzlichen Stroboskopblitz oder mit der bereits vorhandenen kontinuierlichen Lichtquelle sowie einem zusätzlichen, vorzugsweise elektronischen, Verschluß und ei nem Lichtleiter realisiert werden.

Die weiteren Bestandteile der Meßvorrichtung können in konventioneller Weise aus gelegt sein und seien daher vorliegend nur der Vollständigkeit halber kurz beschrieben.

Das aus dem Lichtleiter 8 austretende bichromatische Licht wird mittels eines abbilden den Systems, zu dem beispielsweise eine Linse 15 gehört, in den Auflichtstrahlengang eines Mikroskops 9 eingekoppelt und mit einem dichroitischen Spiegel 10 in den Mikroskoptubus eingespiegelt. Dieser dichroitische Spiegel 10 reflektiert die beiden An regungswellenlängen, welche danach von einem Objektiv 11 in einer Objektebene 12 fokussiert werden. Dort regen sie Indikatormoleküle zur Fluoreszenz an. Teile des ab gestrahlten Fluoreszenzlichtes werden von dem Objektiv 11 wieder aufgefangen und passieren den dichroitischen Spiegel 10, der so ausgelegt ist, daß die beiden Anregungs wellenlängen reflektiert, das von der Probe ausgesandte Fluoreszenzlicht dagegen transmittiert wird. Abgestrahltes Fluoreszenzlicht wird danach von einer Projektions linse 13 in einer Beobachtungsebene 14 fokussiert, wobei ein vergrößertes Bild des Ob jekts in der Objektebene 12 erhalten wird. Für Spotmessungen ist in der Beobachtungs ebene 14 ein einzelner Detektor, vorzugsweise ein Halbleiterdetektor, für zweidimen sionale Messungen beispielsweise eine CCD-Kamera angebracht.

Claims

1. Fluoreszenz-Meßvorrichtung zum Bestimmen von Ionenkonzentrationen mit zwei Beleuchtungseinheiten (1, 3; 2, 4), von denen mindestens eine gepulst ist, und ei nem Beugungsgitter (6), das von den beiden Beleuchtungseinheiten so beleuchtet wird, daß es in einer Austrittsspaltebene (7) die beiden von den Beleuchtungsein heiten ausgehenden Strahlengänge vereinigt und dort unter Bildung eines bichro matischen Intensitätszeitprofils unterschiedliche Wellenlängen auftreten läßt, je nach dem welche der beiden Beleuchtungseinheiten gerade Licht abgibt, sowie mit einem abbildenden System (8,10, 11), welches das Intensitätszeitprofil auf ein Un tersuchungsobjekt (bei 12) auftreffen läßt, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff ange färbt ist, dessen Anregungsmaximum sich in Abhängigkeit von der zu bestimmen den Ionenkonzentration ändert, und mit einer Detektoreinheit (bei 14), welche das resultierende Fluoreszenzlicht in ein Meßsignal umwandelt.

2. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Beleuchten des Beugungsgitters (6) zwei gepulste Beleuchtungseinheiten (1, 3; 2, 4) vorgesehen sind.

3. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden gepulsten Beleuchtungseinheiten mit Blitzlampen (1, 2) versehen sind.

4. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden gepulsten Beleuchtungseinheiten jeweils eine kontinuierliche Lichtquelle und einen im Strahlengang zwischen dieser Lichtquelle und dem Beugungsgitter (6) angeordneten ansteuerbaren Verschluß aufweisen.

5. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden gepulsten Beleuchtungseinheiten eine gemeinsame kontinuierliche Licht quelle und zwei im Strahlengang zwischen dieser Lichtquelle und dem Beugungsgit ter (6) angeordnete, getrennt ansteuerbare Verschlüsse aufweisen.

6. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß bzw. die Verschlüsse elektronisch ausgebildet ist bzw. sind.

7. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch eine elektrische, vorzugsweise rechnergesteuerte Auslösevorrichtung zum Triggern der beiden Blitzlampen (1, 2) bzw. der beiden Verschlüsse mit vorgegebenem zeitli chem Abstand.

8. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Beleuchten des Beugungsgitters (6) eine gepulste Beleuchtungseinheit und eine kontinuierlich Licht abgebende Beleuchtungseinheit vorgesehen sind.

9. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinheiten eine Lichtquelle (1, 2), ein abbil dendes System und einen Lichtleiter (3,4) aufweisen, dessen Austrittsöffnung in der Eintrittsspaltebene (5) des Beugungsgitters (6) liegt.

10. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinheiten (1, 3; 2, 4) oder mindestens deren Austrittsöffnungen relativ zueinander und zu dem Beugungsgitter (6) verschiebbar ausgebildet sind.