DE4039002A1

DE4039002A1 - Biologische strahlungsdetektion

Info

Publication number: DE4039002A1
Application number: DE4039002A
Authority: DE
Inventors: Lothar Dipl Biol Quintern
Original assignee: Deutsches Zentrum fuer Luft und Raumfahrt eV
Current assignee: Deutsches Zentrum fuer Luft und Raumfahrt eV
Priority date: 1990-12-06
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1992-06-11
Anticipated expiration: 2010-12-07
Also published as: DE4039002C2; US5371004A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur biologischen Detektion von Strahlung durch Mikroorganismen, ins besondere um die schädliche Wirkung auf den Menschen und die Biosphäre zu untersuchen.

Diese Anforderungen bedürfen eines Detektors, dessen Empfind lichkeitskurve insbesondere mit der Erytheminduktionskurve des Menschen weitgehend übereinstimmt, der einen variablen Einsatz ermöglicht, beispielsweise bei globalen Feldmessungen, und auch von wenig geschultem Personal fehlerfrei bedient werden kann.

Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Meßkonzepte, insbe sondere zur UV-B-Dosimetrie des terrestrischen UV-Lichtes mit biologischer Wichtung bekannt.

So beschreibt D.S. Berger in Photochemistry and Photobiology, 1976, Band. 24, S. 587-593 eine Meßvorrichtung zur Bestimmung von UV-Strahlung mit dem Ziel, die Empfindlichkeit des Detektors dem Wirkungsspektrum für die Erytheminduktion beim Menschen an zugleichen. Unter Einsatz einer Kombination geeigneter Filter wird die Fluoreszenz einer Magnesiumwolframatschicht quantifi ziert. Nachteilig bei dem beschriebenen Verfahren ist die Wichtung bei der Anwendung als UV-Detektorfolie. Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren wird der kurzwellige Bereich des UV-B- Spektrums zu schwach und der langwellige Bereich zu stark ge wichtet. Eine Detektion der Ozonkonzentrations-abhängigen UV- B-Variation ist daher mit diesem System schwer erfaßbar.

C.F. Wong, R. Fleming und S.J. Carter, Photochemistry and Photo biology, 1989, Band 50, S. 611-615 beschreiben die Exposition von Kunststoffolien, deren UV-Sensitivität dem oben genannten Wirkungsspektrum ähnlich ist und die anschließende Ätzung sowie photometrische Detektion des veränderten optischen Verhaltens der Folie, beispielsweise aus Polycarbonat. Auch dieses Ver fahren wichtet den kurzwelligen Bereich des UV-B-Spektrums zu schwach und den langwelligen Bereich zu stark. In gleicher Weise ist eine Detektion der Ozonkonzentrations-abhängigen UV-B- Variation daher auch mit diesem System schwer erfaßbar.

K. Henriksen, K. Stamnes und P. Ostensen, Atmospheric Environ ment, 1989, Band 23, S. 1573-1579 beschreiben die wellenlängen auflösende Strahlungsleistungs-Messung des terrestrischen UV-A- und UV-B-Strahlenbereiches. Die erhaltenen Werte könnten mit geeigneten Wichtungsfaktoren noch verrechnet werden. Die sehr kostenintensiven Messungen erfordern den Einsatz einer umfang reichen Gerätekombination, insbesondere eine quarzkuppelabge deckte Ulbricht-Kugel, einen automatischen motorgetriebenen Doppelmonochromator, einen Photodetektor, einen Photomultiplyer mit Hochspannungsquelle sowie entsprechende Rechner und Soft ware.

R. M. Tyrrell, Photochemistry and Photobiology, 1978, S. 571-579, N. Munakata, Mutation Research, 82 (1981), S. 263-268 und G. Horneck et al., Science, 1984, Band 225, S. 226-228 be schreiben biologische UV-Dosimetrie mit Mikroorganismen.

Bei diesem Verfahren werden Mikroorganismen in Suspension oder als getrocknete Monolayer dem UV-Licht exponiert und anschlie ßend die Überlebensrate bestimmt, bzw. die Mutationshäufigkeit ermittelt. Hierbei stellt die Erbsubstanz der Organismen (Des oxyribonukleinsäure-Polymer) das Haupt-Target für die UV- Strahlung dar und ergibt somit eine direkte biologische Wichtung der erhaltenen Strahlungsdosis. Allerdings sind die beschrie benen Meßserien sehr arbeitsintensiv in der Auswertung, so daß die beschriebenen Verfahren bisher keinen Eingang in die routinemäßige Anwendungstechnik gefunden haben.

Demgegenüber besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, die Vorteile der biologischen UV-Dosimetrie mit Mikro organismen mit denen der genannten kostengünstigen und einfachen Verfahren zu kombinieren.

Die Lösung der vorgenannten Aufgabe besteht in einem Verfahren zur biologischen Detektion von Strahlung durch Mikroorganismen, wobei man

a) Mikroorganismen in Form einer Beschichtung auf ein flächi ges Substrat aufbringt,
b) gegebenenfalls erste ausgewählte Bereiche der Mikroorganis men-Beschichtung einer definierten Strahlungsdosis aus setzt,
c) die gegebenenfalls der Strahlung ausgesetzten Bereiche vor der Einwirkung weiterer Strahlungsexposition schützt,
d) anschließend weitere zweite ausgewählte Bereiche der Mikro organismen-Beschichtung der zu detektierenden Strahlung aussetzt,
e) nach Beendigung der Strahlungsexposition in den gegebenen falls ersten und zweiten Bereichen der Mikroorganismen- Beschichtung die Biosynthese der Mikroorganismen initiiert und
f) die Bildung von Biosyntheseprodukten, insbesondere die Zellinaktivierung und/oder die Wachstumshemmung der Mikro organismen in den gegebenenfalls ersten und zweiten Be reichen der Mikroorganismen-Beschichtung photometrisch be stimmt.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen insbeson dere in der direkten biologischen Wichtung der absorbierten Strahlung, da hauptsächlich die Erbsubstanz der Mikroorganismen als Target dient und bei einer Schädigung zur Zellinaktivierung oder Wachstumshemmung führt. Dies bedingt bekanntermaßen eine geringere Proteinbildung gegenüber einem nicht exponierten Mikroorganismus.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerordentlich preiswert und einfach in der Handhabung sowie in der Auswertung.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich dergestalt realisieren, daß man zunächst von einer handelsüblichen Kunststoffträgerfolie mit einer hydrophilen Oberfläche ausgeht, auf die die biologi sche Körnung, beispielsweise Bacillus subtilis-Sporen, aufge tragen werden. Hierzu kann der Mikroorganismus bei erhöhter Tem peratur in einer wäßrigen Trägermittellösung auf die Folie appliziert werden und anschließend nach Erstarren der Träger lösung das gebildete Gel getrocknet werden. Die so erhaltene Folie ist im Dunkeln über mehrere Monate gut lagerungsfähig.

Zur biologischen Quantifizierung, insbesondere zur gewichteten Detektion beispielsweise der UV-Strahlung des Sonnenlichtes, werden die auf das Substrat aufgebrachten Mikroorganismen im Freiland in geeigneten Expositionsbehältern, vorzugsweise in horizontaler Lage, exponiert. Hierbei werden - sofern vorhanden - Kalibrierungszonen abgedunkelt und nur ausgewählte Bereiche des Substrates und des darauf befindlichen Mikroorganismus dem Sonnenlicht exponiert. Bei dieser Exposition können metallbe dampfte Neutralfilter und/oder Kantenfilter eingesetzt werden, um beispielsweise bestimmte ausgewählte Wellenlängenbereiche zu vermessen oder die gewünschten Meßzeiten einzustellen. Üblicher weise werden die Bestrahlungsbedingungen so gewählt, daß der Effekt innerhalb des Bereiches liegt, der von einer Kalibrie rungskurve erfaßt wurde.

In Abhängigkeit von den Inkubationsbedingungen können sich un terschiedliche Dosis-Effektkurven ergeben, so daß bevorzugter weise die Substrate mit Kalibrierungsreihen versehen werden. Hierzu werden ausgewählte Bereiche des Substrates und der Mikro organismus-Beschichtung einer definierten Strahlungsdosis, vor zugsweise mit einer künstlichen Strahlungsquelle, exponiert, die eine bekannte, konstante Beleuchtungsstärke und spektrale Zu sammensetzung besitzt (Sonnensimulationsanlage). Der so belich tete Bereich wird von einer Reihe verschiedener Neutralfilter abgedeckt, deren Transmissionswert beispielsweise von etwa 100% bis 0,4% reicht.

In der Figur wird eine Kalibrierungsreihe eines UV-Detektorfilms dargestellt, dessen einzelne Segmente unterschiedlich lange einer Strahlenquelle (simuliertes Sonnenlicht) exponiert wurden.

Nach Beendigung der Strahlungsexposition in den Kalibrierungs bereichen und den der zu detektierenden Strahlung ausgesetzen Bereichen wird die Biosynthese der Mikroorganismen-Beschichtung initiiert. Der Film wurde anschließend inkubiert, gefärbt und die optische Dichte des Farbstoffes bestimmt. Die genannten Ex positionszeiten in Minuten ergeben sich aus der Umrechnung der Transmissionswerte der eingesetzten Neutralfilter.

Das Grundprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also in der Immobilisierung der Mikroorganismen, gegebenenfalls in einem Träger auf einem Substrat. So ist es möglich, die Mikro organismen auch durch geeignete chemische oder auch adsorptive Bindung an das Substrat zu binden, beispielsweise als Mono schicht.

Das Auswertungsprinzip besteht darin, die Strahlungsdosis-ab hängige Abnahme von Biosyntheseprodukten zu quantifizieren. Hierzu wird das Substrat und die darauf aufgebrachte Mikroorga nismen-Beschichtung bei geeigneter Temperatur in ein steriles Bakterien-Nährmedium eine festgelegte Zeit inkubiert. Dabei keimen überlebende Sporen aus und wachsen zu Mikrokolonien von beispielsweise 10 bis 100 Einzellern heran. Das dabei gebildete Protein kann mit bekannten Färbungsverfahren und Entfärbungs verfahren selektiv angefärbt werden. Nach dem Waschen, bei spielsweise mit reinem Methanol, wird die Mikroorganismen-Be schichtung erneut getrocknet und die Extinktion beim längs welligen Absorptions-Maximum des verwendeten Farbstoffes be stimmt. Bereiche mit hohen Extinktionswerten (viel Protein) ent sprechen dabei niedrigen UV-Dosen, während Areale mit niedrigen Extinktionswerten (wenig Protein) Bereichen entsprechen, die hohen UV-Dosen ausgesetzt waren. Die jeweiligen Extinktionswerte der Expositionsbereiche können nun mit den Werten der Kalibrierungsreihe verglichen werden. Als relative biologisch wirksame UV-Dosis-Einheit kann beispielsweise die Zeit der Wir kung definiert werden, die nach einminütiger Exposition mit der Kalibrierungslichtquelle erzielt wird. Bei Anwendung des erfin dungsgemäßen Verfahrens zur biologischen Detektion von Strahlung durch Mikroorganismen im Rahmen von standardisierten Verfahren kann selbstverständlich im Einzelfall auf die entsprechende Kalibrierung verzichtet werden, so daß die notwendige Auswertung lediglich darin besteht, die Mikroorganismen-Beschichtung nach der Strahlungsexposition unter standardisierten Inkubationsbe dingungen zu behandeln und ebenso die Anfärbung und Extinktions messung unter definierten Bedingungen durchzuführen. Im Gegen satz zu den bisher im Stand der Technik bekannten Auswertungs verfahren der biologischen Detektion von Strahlung durch Mikro organismen stellt somit das erfindungsgemäße Verfahren eine außerordentlich große Vereinfachung dar.

Vorteilhafterweise wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Aufbringen des Mikroorganismus in Form eines Gels eine gleich mäßige Sporendichte pro Flächeneinheit des Substrats erhalten. Insbesondere Agarosegel haftet sehr gut auf Kunststoffolien und insbesondere Polyesterfolien mit hydrophiler Oberfläche. Die Beschichtung bleibt bei allen weiteren Arbeitsschritten (Inku bation, Färbung, Entfärbung, Trocknung und Auswertung) an der Substratfolie haften. Das Einbetten der Mikroorganismen in das Agarosegel gewährleistet eine gute Fixierung auf der Trägerfolie und eine hohe Überlebensrate der unbestrahlten Sporen, so daß die Folie über Monate lagerungsfähig ist. Für den Fall der De tektion von UV-Strahlung gewährleistet die UV-transparente Aga rosematrix ein gutes Keimen der Sporen und das Heranwachsen zu geeigneten Mikrokolonien. Das Anfärben der Biosyntheseprodukte auf der Folie ist komplikationslos. Die Strahleneffektmessung (Dosisbestimmung) ist durch einfache photometrische Bestimmung der Remission bei einem ausgewählten Maximum des verwendeten Farbstoffs, üblicherweise des längswelligen Maximums des ver wendeten Farbstoffs, direkt auf der Folie möglich. Durch kom binierte Messung mit verschiedenen Kantenfiltern ist eine ge zielte Sensibilität im UV-A, UV-A- und UV-B- und UV-A- bis UV- C-Bereich möglich. Eine Dosisraten-Abhängigkeit im Bereich der terrestrischen UV-Intensitäts-Variationsbereiche konnte nicht festgestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dahingehend ausgelegt, daß ein additiver Effekt der Strahlungsdosen beobachtet wird. Auch nach unterschiedlicher Lagerungsdauer konnte festgestellt wer den, daß die UV-Sensibilität der Folie gleichgeblieben ist. Die Strahlungsempfindlichkeit ist nur in äußerst geringem Maße vom Einstrahlwinkel abhängig, so daß dieser Faktor üblicherweise vernachlässigt werden kann. Auch die Temperatur hat praktisch keinen Einfluß auf die UV-Sensibilität. Die Luftfeuchtigkeit sollte bei den Bestrahlungen möglichst konstant gehalten werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfin dungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man durch die Verwendung von Kantenfiltern den zu detektierenden Wellenlängen bereich der Strahlung auswählt. Insbesondere kann somit das er findungsgemäße Verfahren zur Detektion von ultravioletter Strahlung, insbesondere im UV-A-, -B- und C-Bereich, eingesetzt werden. In gleicher Weise ist die Dosimetrie im Bereich der Röntgenstrahlung möglich.

Die Art und Weise der Aufbringung der Mikroorganismen-Beschich tung auf das flächige Substrat ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung unkritisch. Insbesondere bevorzugt wird die Mikro organismen-Beschichtung daher als Suspension des Mikroorganismus mit anschließender Trocknung auf das Substrat aufgebracht.

Die direkte biologische Wichtung und Dosimetrie der absorbierten Strahlung kann vorzugsweise durch die Messung von gebildeten Biosyntheseprodukten der der Strahlung exponierten Bereiche be stimmt werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Er findung besteht darin, daß man

a) Bacillus subtilis-Sporen in einer Trägerlösung suspendiert, auf eine Kunststoffolie oder Glasoberfläche, insbesondere eine Polyesterfolie unter Erhalt eines Gels aufträgt und trocknet,
b) gegebenenfalls erste ausgewählte Bereiche der Mikroorganis men-Beschichtung, gegebenenfalls unter Verwendung einer Reihe von Neutralfiltern, einer definierten Strahlungsdosis aussetzt,
c) die gegebenenfalls der Strahlung ausgesetzten Bereiche der Mikroorganismen-Beschichtung abdeckt,
d) anschließend weitere zweite ausgewählte Bereiche der Mikro organismen-Beschichtung der zu detektierenden Strahlung aussetzt,
e) das flächige Substrat und die Mikroorganismen-Beschichtung in einem sterilen Bakterienmedium inkubiert und dabei Proteine bildet und
f) das gebildete Protein mit einem Farbstoff selektiv anfärbt und die Extinktion der der Strahlung exponierten Bereiche photometrisch bestimmt.

Die oben genannte Ausführungsform ist keinesfalls auf den ange gebenen Mikroorganismus beschränkt. Vielmehr kann auch nach dieser Ausführungsform jeder strahlungssensitive Mikroorganismus eingesetzt werden.

Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vor richtung zur Detektion von Strahlung durch Mikroorganismen. Die so bezeichnete Vorrichtung besteht aus einem flächigen Substrat und einer darauf befindlichen Mikroorganismen-Beschichtung, wo bei der Mikroorganismus eine gewisse Sensitivität gegenüber der zu detektierenden Strahlung aufweist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher als flächiges Substrat eine Kunststoffolie, insbesondere eine Polyesterfolie mit hydrophiler Oberfläche, ausgewählt.

Notwendiges Kriterium der Mikroorganismen-Beschichtung ist die Sensibilität gegenüber der zu detektierenden Strahlung. Die Art und Weise des Aufbaus dieser Mikroorganismen-Beschichtung ist daher von geringerer Bedeutung. Besonders vorteilhafte Ergeb nisse werden jedoch erhalten, wenn die Mikroorganismen-Beschich tung eine Monoschicht des Mikroorganismus selbst ist. Als in gleicher Weise vorteilhaft hat sich eine Mikroorganismen-Be schichtung in Form eines Gels mit darin suspendiertem Mikroor ganismus herausgestellt. Aufgrund der außerordentlich guten Trocknungseigenschaften von Agarosegel wird dieses Gel besonders bei der Verwendung von Bacillus subtilis-Sporen bevorzugt ein gesetzt.

Ausführungsbeispiel

Auf eine handelsübliche, 250 µm dicke Polyesterträgerfolie mit einer hydrophilen Oberfläche und einer Größe von 12·26 cm wurde die biologische Körnung (Mikroorganismen-Beschichtung) aufgebracht. Hierzu wurden Bacillus subtilis-Sporen in 70°C warmer, 0,5%iger Agaroselösung suspendiert und auf die Folie appliziert (pro 100 cm² Folienoberfläche 20 ml Lösung mit 5·10⁷ Sporen). Nach dem Erstarren der Agarose-Lösung wird das Gel bei 65°C über Nacht getrocknet.

Zur Kalibrierung aufgrund unterschiedlicher Dosis-Effekt-Kurven, bedingt durch die Abhängigkeit von den Inkubationsbedingungen wurde daher die Folie mit Kalibrierungsreihen versehen. Hierzu wurden in 2 cm Abstand von den Folienlängskanten 20·1,6 cm große Bereiche 20 min einer künstlichen Strahlungsquelle ausge setzt, die eine konstante Beleuchtungsstärke und spektrale Zu sammensetzung besaß (Sonnensimulationsanlage). Der so belichtete Bereich wurde von 10 verschiedenen Neutralfiltern abgedeckt, deren Transmissionswert von ca. 100 bis 0,4% reicht.

Zur biologisch gewichteten Quantifizierung der UV-Dosis wurden dann die oben exponierten Bereiche der Folie abgedeckt und die Folien im Freiland in geeigneten Expositionsbehältern in hori zontaler Lage exponiert. Lediglich ausgewählte Bereiche in der Folienmitte wurden dem Sonnenlicht exponiert.

Nach Beendigung der Strahlungsexposition wurde die Folie bei 34,5°C in 500 ml sterilem Bakteriennährmedium bei leichter Be wegung 4 h inkubiert. Dabei keimten überlebende Sporen aus und wuchsen zu Mikrokolonien von 10 bis 100 Einzellern heran. Das dabei gebildete Protein wurde mit einer 60 minütigen Färbung und 60 minütiger Entfärbung selektiv angefärbt. Als Farbstoff diente Coomassie-Farbstoff. Nach dem Trocknen der Folie wurde diese mit 100%igem Methanol gereinigt, erneut getrocknet und die Extink tion der exponierten Bereiche bei λ = 590 nm vermessen.

Die folgende Tabelle gibt die erhaltenen Anteile biologisch ge wichteten UV-Lichts in verschiedenen Strahlungsquellen wieder.

Neben der Quantifizierung des Sonnenlichts wurde auch eine Philips-Heimsonne und eine 1000 Watt Xenon-Lampe mit Spezial filter zur Sonnenlichtsimulation in den jeweiligen Abständen vermessen.

Tabelle

Anteil biologisch gewichteten UV-Lichts*) in verschiedenen Strahlungsquellen

Claims

1. Verfahren zur biologischen Detektion von Strahlung durch Mikroorganismen, wobei man

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch die Verwendung von Kantenfiltern die zu detektierenden Wellenlängenbereiche der Strahlung auswählt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Detektion von Röntgen strahlung oder ultravioletter Strahlung, insbesondere im UV-A-, -B- und -C-Bereich.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, da durch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen-Beschichtung als Suspension auf das Substrat aufbringt und das sich bildende Gel anschließend mit den Sporen trocknet.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, da durch gekennzeichnet, daß man die Überlebensrate und/oder die Mutationshäufigkeit der der Strahlung exponierten Bereiche be stimmt.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-5, da durch gekennzeichnet, daß man

a) Bacillus subtilis-Sporen in einer Trägerlösung suspendiert, auf eine Polyesterfolie unter Erhalt eines Gels aufträgt und trocknet,
b) gegebenenfalls erste ausgewählte Bereiche der Mikroorganis men-Beschichtung, gegebenenfalls unter Verwendung einer Reihe von Neutralfiltern, einer definierten Strahlungsdosis aussetzt,
c) die gegebenenfalls der Strahlung ausgesetzten Bereiche der Mirkoorganismen-Beschichtung abdeckt,
d) anschließend weitere zweite ausgewählte Bereiche der Mikro organismen-Beschichtung der zu detektierenden Strahlung aussetzt,
e) das flächige Substrat und die Mikroorganismen-Beschichtung in einem sterilen Bakterienmedium inkubiert und dabei Pro teine bildet und
f) das gebildete Protein mit einem Farbstoff selektiv anfärbt und die Extinktion der der Strahlung exponierten Bereiche photometrisch bestimmt.

7. Vorrichtung zur Detektion von Strahlung durch Mikroorganis men bestehend aus einem flächigen Substrat und einer darauf be findlichen Mikroorganismen-Beschichtung.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das flächige Substrat eine Kunststoffolie ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen-Beschichtung eine Monoschicht des Mikro organismus ist.

10. Vorrichtung nach Ansprüchen 7 oder 8, gekennzeichnet, durch ein getrocknetes Gel mit dem darin befindlichen Mikroorganismus.