DE4013180C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen chemi­ schen Analysieren und eine Mikrotestplatte für die Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von Hämolyse in Testflüssigkeiten sowie zur Auswertung von Agglutinationsmu­ stern, die in der Testflüssigkeit infolge einer immunologi­ schen Agglutinations-Reaktion entstanden sind.

Es gibt zwei Arten von Verfahren zum Nachweis von Agglutina­ tionsmustern, die infolge einer immunologischen Agglutinati­ ons-Reaktion entstehen. Das eine ist das Sedimentations-Ver­ fahren, bei dem eine Probe und ein Reagens in ein Reaktions­ gefäß mit einer kegeligen Bodenfläche aufgegeben und dann zentrifugiert werden. Danach läßt man das Reaktionsgefäß ste­ hen, damit sich auf seinem kegeligen Boden ein auszuwertendes Partikelmuster ausbilden kann. Das andere Verfahren ist das Schüttelverfahren, bei dem die Probe und das Reagens in ein Reaktionsgefäß mit ungefähr halbkugeliger Bodenfläche aufge­ geben und dann zentrifugiert werden. Danach wird das Reakti­ onsgefäß geschüttelt, um festzustellen, ob in der Testflüs­ sigkeit die Agglutinations-Reaktion ausgelöst wird.

Wenn beim Sedimentations-Verfahren die immunologische Agglu­ tinations-Reaktion in der Testflüssigkeit ausgelöst wird, werden die Blutkörperchenpartikel über die kegelige Bodenflä­ che des Reaktionsgefäßes verteilt und bilden darauf ein Ag­ glutinationsmuster; kommt es in der Testflüssigkeit nicht zur immunologischen Agglutinations-Reaktion, gleiten die Blutkör­ perchenpartikel an der Innenfläche des Reaktionsgefäßes nach unten und sammeln sich in der Mitte der Bodenfläche, wo sie ein Nicht-Agglutinations-Muster bilden. Diese auf der Boden­ fläche des Reaktionsgefäßes entstehenden Muster sind in Fig. 1A und 1B dargestellt.

Wenn dagegen beim Schüttelverfahren in der Testflüssigkeit eine immunologische Agglutinations-Reaktion stattfindet, sam­ meln sich die Blutkörperchenpartikel in der Mitte der unge­ fähr halbkugeligen Bodenfläche des Reaktionsgefäßes. Hat in der Testflüssigkeit eine immunologische Agglutinations-Reak­ tion nicht stattgefunden, sind die Blutkörperchenpartikel über die ganze Testflüssigkeit verteilt. Diese durch das Schüttelverfahren im Reaktionsgefäß entstehenden Partikelmu­ ster sind in den Seitenansichten der Fig. 2A und 2B darge­ stellt.

Liegt in einer Testflüssigkeit Hämolyse vor, dann ist die Durchsichtigkeit der Testflüssigkeit umso höher, je höher der Grad der Hämolyse. Bei Vorliegen einer starken Hämolyse wird die Testflüssigkeit wie rote Tinte und ändert ihre Transpa­ renz auch nach Schütteln des Reaktionsgefäßes nicht. Anderer­ seits nimmt die Transparenz der Testflüssigkeit mit sinkendem Grad der Hämolyse ab, so daß ein jenseits des Reaktionsgefä­ ßes angeordneter Gegenstand durch die Testflüssigkeit hin­ durch nicht sichtbar ist.

Ist es daher in der Testflüssigkeit durch Zerstören der in der Probe oder dem Reagens enthaltenen Blutkörperchen zu ei­ ner Hämolyse gekommen, können die Agglutinations- oder Nicht- Agglutinations-Muster nicht einwandfrei ausgewertet werden. Mit anderen Worten, bei Vorliegen von Hämolyse in einer Test­ flüssigkeit besteht die Gefahr, daß beim Sedimentations-Ver­ fahren das Nicht-Agglutinations-Muster als Agglutinations-Mu­ ster und beim Schüttelverfahren das Agglutinations-Muster als Nicht-Agglutinations-Muster beurteilt wird. Um ein einwand­ freies Analyseergebnis zu erhalten, muß daher vor dem Auswer­ ten des in der Testflüssigkeit entstandenen Partikelmusters auf das Vorhandensein von Hämolyse in der Testflüssigkeit ge­ prüft werden.

Bisher wurde der Nachweis von Hämolyse vom Laboranten visuell vorgenommen, bevor das in der Testflüssigkeit entstandene Partikelmuster im Analysiergerät automatisch ausgewertet wur­ de. Weil jedoch die Hämolyse-Reaktion sehr empfindlich ist, erfordert ihr Nachweis geübtes Personal und großen Zeitauf­ wand. Durch den visuellen Hämolyse-Nachweis wird der Analyse- Wirkungsgrad des automatischen Analysiergerätes niedrig ge­ halten. Der viele Stunden dauernde visuelle Nachweis kann zu Fehlern führen, was die endgültige Beurteilung der Agglutina­ tions-Reaktion in der Testflüssigkeit beeinflußt.

Es ist ferner bisher kein spezielles Reaktionsgerät für den Nachweis von Hämolyse in Testflüssigkeiten vorgeschlagen wor­ den, und somit war ein automatischer Nachweis von Hämolyse in Testflüssigkeiten mittels des herkömmlichen Analysiergerätes unmöglich.

Aus der EP 03 72 755 A1, die nicht vorveröffentlicht ist, ist eine Vorrichtung für die automatische immunologische Analyse bekannt, bei der Markierungen im Bereich der Bodenflächen von Mulden vorgesehen sind, die in einer Platte ausgeformt sind. Die Markierungen dienen jedoch nicht dem Nachweis des Vorhandenseins einer Hämolyse in der Testflüssigkeit, sondern dazu, eine kodierte Identifizierung zu ermöglichen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum automatischen chemischen Analysieren zu schaffen, das es er­ möglicht, eine Testflüssigkeit auf Vorliegen von Hämolyse au­ tomatisch objektiv und genau zu überprüfen und die Genauig­ keit der Schlußanalyse, z.B. der immunologischen Agglutinati­ ons-Reaktion, durch Rückkoppeln des Ergebnisses des Hämolyse- Nachweises mit dem Analyseergebnis der immunologischen Agglu­ tinations-Reaktion zu erhöhen. Ferner soll die Erfindung eine Mikrotestplatte für die Durchführung des Verfahrens angeben.

Ein diese Aufgabe lösendes Verfahren ist im Patentanspruch 1 angegeben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden sowohl ein Bild der Markierung als auch ein Bild eines im Reaktionsgefäß entstandenen Partikelmusters durch die Testflüssigkeit hindurch von einer Bildaufnahmevorrichtung aufgenommen. Die Schärfe der Markierung wird mit einem vorgegebenen Schwellenwert verglichen, derart, daß das Vorhandensein von Hämolyse in der Testflüssigkeit nachweisbar ist. Es ist daher möglich, die Hämolyse in der Testflüssigkeit maschinell bei hohem Wirkungsgrad und fehlerfrei objektiv nachzuweisen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Mikrotestplatte gemäß Anspruch 3 verwendet.

Bei Benutzung der Mikrotestplatte können daher sowohl die Bilder der Markierungen als auch die Bilder der Partikelmuster aufgenommen werden, und somit kann die in der Testflüssigkeit vorliegende Hämolyse bequem nachgewiesen werden.

Mehrere Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 3 ein Blockschaltbild zur Erläuterung des Verfahrens zum Nachweis von Hämolyse,

Fig. 4 eine Schrägansicht einer Grundplatte mit einer Vielzahl von Markierungen für den Hämolyse-Nachweis,

Fig. 5A eine Draufsicht auf ein Reaktionsgefäß, in dem eine Hämolyse stattgefunden hat,

Fig. 5B eine Draufsicht auf ein Reaktionsgefäß, in dem keine Hämolyse vorliegt,

Fig. 6 eine Draufsicht auf eine Ausführungsform eines Reaktionsgerätes,

Fig. 7 eine Seitenansicht des in Fig. 6 dargestellten Reaktionsgerätes, und

Fig. 8 eine Seitenansicht einer anderen Ausführungsform des Reaktiongerätes.

Das Blockschaltbild in Fig. 3 zeigt eine Grundplatte 1 und eine aus durchsichtigem Werkstoff hergestellte Mikroplatte 2, in deren Oberseite eine Vielzahl von Mulden 2a entsprechend einer Matrix eingearbeitet sind. Gemäß Fig. 4 sind auf der Oberseite der Grundplatte 1 dreieckförmige Markierungen 1a entsprechend einer Matrix so ausgebildet, daß sich nach Auf­ legen der Mikroplatte 2 auf die Grundplatte 1 unter jeder Mulde 2a der Mikroplatte 2 eine Markierung 1a befindet und gegenüber der Mitte der Mulde 2a versetzt ist. Nach Aufgeben von Reagentien und Proben in die Mulden 2a wird die Mikro­ platte 2 auf die Grundplatte 1 aufgesetzt. Die Bilder der in­ folge einer immunologischen Agglutinations-Reaktion in jeder Mulde 2a entstandenen Partikelmuster ebenso wie die Bilder der Markierungen 1a werden von einer über der Mikroplatte 2 angeordneten Videokamera 3 aufgenommen. Mit 3a ist eine Lichtquelle bezeichnet. Weil die Markierungen 1a unter den Bodenflächen der Mulden 2a angeordnet sind, wird ihr Bild bei Vorliegen von Hämolyse in der Testflüssigkeit von der Video­ kamera 3 entsprechend Fig. 5A deutlich aufgenommen, weil die Testflüssigkeit infolge der Hämolyse durchsichtig und rot wie rote Tinte wird. Wenn jedoch in der Testflüssigkeit keine Hä­ molyse stattgefunden hat, wird das Bild der Markierung 1a von der Videokamera 3 weniger deutlich oder überhaupt nicht auf­ genommen (Fig. 5B), weil die Testflüssigkeit undurchsich­ tig wird.

Nach dem Aufnehmen der Bilder der in den Mulden 2a entstande­ nen Partikelmuster und der Markierungen 1a durch die Videoka­ mera 3, wird deren Ausgang einem Analog-Digital-Umsetzer 4 zugeleitet, der daraus digitale Bilddaten erzeugt, die in ei­ nem Bildspeicher 5 gespeichert werden. Danach werden die di­ gitalen Bilddaten eines Datenbereiches der Markierung 1a von einem Bilddatenprozessor 6 verarbeitet.

Die Datenverarbeitung im Bilddatenprozessor 6 geschieht fol­ gendermaßen:

• 1) Erkennen des Bildes eines Rands der Markierung 1a durch Verarbeiten der Daten des Datenbereiches, in dem sich die Markierung 1a befindet;
• 2) Berechnen des numerischen Grades der im Arbeitsschritt (1) erfaßten Schärfe des Randes;
• 3) Vergleichen des numerischen Wertes der Randschärfe der Markierung 1a mit einem vorgegebenen Schwellenwert und Nachweisen des Vorhandenseins von Hämolyse in der Weise, daß, wenn die Randschärfe größer ist als der Schwellen­ wert, Hämolyse in der Testflüssigkeit vorliegt, und wenn die Randschärfe geringer ist als der Schwellenwert, in der Testflüssigkeit keine Hämolyse stattgefunden hat.

Das Ergebnis der Datenverarbeitung wird auf einer Anzeigevor­ richtung 7 dargestellt. Nachdem das Vorliegen von Hämolyse nachgewiesen wurde, werden die Testflüssigkeiten mit Hämolyse aus der Analyselinie entfernt, und nur die hämolysefreien Testflüssigkeiten werden überprüft, ob sich ein Agglutinati­ ons-Partikelmuster gebildet hat oder nicht.

Gemäß der Erfindung läßt sich also der Nachweis von Hämolyse in der Testflüssigkeit mittels eines Analysegerätes automa­ tisch durchführen. Der Hämolyse-Nachweis läßt sich daher rasch und genau führen. Insbesondere bei einem großen Analy­ siergerät, in dem eine große Anzahl Proben untersucht wird, ist eine Reduzierung des Arbeitsaufwandes des Personals mög­ lich. Ferner ist durch Rückkoppelung des Ergebnisses des Hä­ molyse-Nachweises mit der Auswertung der immunologischen Ag­ glutinations-Reaktion eine Verbesserung der Genauigkeit der Agglutinations-Analyse zu erwarten.

Bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform sind die Markierungen 1a auf der Oberseite der Grundplatte 1 ausgebil­ det. Die Mikroplatte 2 muß daher genau auf die Grundplatte 1 aufgelegt werden.

Bei der in Fig. 6 und 7 dargestellten Ausführungsform ist in die Mikroplatte 2 eine Vielzahl von Mulden 2a entsprechend einer Matrix eingearbeitet, und in den Mulden 2a sind drei­ eckförmige Markierungen 1a so aufgemalt oder aufgedruckt, daß sie gegenüber der Mitte der Bodenfläche der Mulde 2a versetzt sind. Die Mikroplatte 2 gemäß Fig. 6 und 7 muß also nicht ge­ nau auf die Grundplatte 1 aufgesetzt werden.

Bei der in Fig. 8 dargestellten abgewandelten Ausführungsform der Mikroplatte 2 gemäß Fig. 6 und 7 ist jede Markierung 1a auf der Rückseite der Mikroplatte 2 so angebracht, daß sie bei Betrachtung in der optischen Achse der Videokamera 3 ge­ genüber der Mitte jeder Mulde 2a versetzt ist. Wenn bei die­ ser Mikroplatte 2 die Mulden 2a nach jeder Analyse gespült werden, um die in ihnen enthaltene Testflüssigkeit zu entfer­ nen, verwischen die Markierungen 1a nicht rasch.

Für die Wirkung der Erfindung ist die Gestalt der Markierun­ gen 1a unwichtig. Der Werkstoff für die Mikroplatte 2 sollte durchsichtig oder halbdurchsichtig sein. Bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform wird die Analyse unter Benut­ zung eines Analysiergerätes automatisch durchgeführt.

Claims (6)

1. Verfahren zum automatischen chemischen Analysieren bei dem das Vorhandensein von Hämolyse in einer Testflüssigkeit nachgewiesen und ein Partikelmuster ausgewertet wird, das sich in der Testflüssigkeit infolge einer immunologischen Agglutinations- Reaktion gebildet hat,
umfassend die folgenden Arbeitsschritte:

• - Aufnahme des Bildes einer Markierung (1a) zusammen mit dem Bild eines in einer Testflüssigkeit entstandenen Partikelmusters durch die Testflüssigkeit hindurch mittels einer Bildaufnahmevorrichtung (3), wobei sich die Testflüssigkeit in einem Reaktionsgefäß (2a) und die Markierung (1a) sich im Bereich der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes (2a) befindet,
• - Verarbeitung des von der Aufnahmevorrichtung (3) aufgenommenen Bildes der Markierung (1a) durch eine Bildverarbeitungseinrichtung (4, 5, 6), wobei ein numerischer Wert für die Schärfe der Markierung (1a) berechnet und mit einem im voraus festgelegten Schwellenwert verglichen wird,
• - Nachweis des Vorliegens von Hämolyse in der Testflüssigkeit, wobei Hämolyse vorliegt, wenn die Schärfe der Markierung (1a) größer ist als der Schwellenwert, und keine Hämolyse vorliegt, wenn die Schärfe der Markierung (1a) kleiner ist als der Schwellenwert, und Ableitung eines Hämolysennachweissignals,
• - Ausführung des Agglutinations- oder Nicht-Agglutinations- Nachweises aufgrund des Hämolysennachweissignals, wenn keine Hämolyse vorliegt oder Verwerfung der Testflüssigkeit beim Vorliegen von Hämolyse.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Markierung (1a) unter der in einem Reaktionsgefäß (2a) enthaltenen Testflüssigkeit so angebracht ist, daß sie gegenüber dem tiefsten Abschnitt der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes (2a) versetzt ist, und
• - die Bilder des Partikelmusters und der Markierung (1a) von der über dem Reaktionsgefäß (2a) angeordneten Bildaufnahmevorrichtung (3) aufgenommen werden.

3. Mikrotestplatte für die automatische chemische Analyse, mit der das Vorliegen einer Hämolyse in einer Testflüssigkeit ermittelt und ein Teilchenmuster, das sich bei einer immunologischen Agglutinations-Reaktion in der Testflüssigkeit gebildet hat, untersucht wird, mit

• - einer Platte (2) aus transparentem oder halbtransparentem Material, in der eine Mehrzahl von Mulden (2a) ausgeformt und matrixartig angeordnet sind, um die Testflüssigkeiten aufzunehmen,
• - einer Mehrzahl von Markierungen (1a), die den Mulden (2a) jeweils zugeordnet sind, und so angeordnet sind, daß sie gegenüber den Mitten der Bodenflächen der Mulden (2a) versetzt sind, wobei die Markierungen (1a) durch die Testflüssigkeit hindurch von einem optischen System lesbar sind, das in den Mulden (2a) entstandene Partikelmuster zu erkennen vermag.

4. Mikrotestplatte nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen (1a) auf einer unterhalb der Platte (2) angeordneten Grundplatte (1) angebracht sind.

5. Mikrotestplatte nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen (1a) auf der Rückseite der Platte (2) - bezogen auf die Seite der Mulden - angebracht sind.

6. Mikrotestplatte nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen (1a) auf die Bodenflächen (2a) aufgemalt oder aufgedruckt sind.