DE3931399A1 - N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse - Google Patents
N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyseInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue
N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase (nachfolgend bezeichnet als
N-AHDH), die auf N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin
einwirkt, um diese N-Acetylglucosaminolacton oder
N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen und gleichzeitig
die oxidierte Form von Nikotinamidadenindinucleotid (NAD⁺)
zur reduzierten Form von Nikotinamidadenindinucleotid
(NADH) zu reduzieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein
Verfahren zur Erzeugung der genannten N-AHDH, ein enzymatisches
Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin
oder N-Acetylgalactosamin durch die Verwendung von N-AHDH
sowie einen Kit für die quantitative Analyse.
Seit der Entdeckung des Sachverhaltes, daß komplexe Zucker
oder Glycokonjugate, die in der Oberflächenschicht von
Zellen und Körperflüssigkeiten in Kombination mit Protein
oder dergleichen vorliegen, die Informationen zur Steuerung
lebender Organismen tragen, haben die Untersuchungen von
komplexen Zuckern oder Glycokonjugaten schnelle Fortschritte
gemacht. Als Ergebnis wurde die Beziehung zwischen abnormer
Steuerung eines lebenden Organismus und struktureller
Abnormität komplexer Zucker oder Glycokonjugate schrittweise
aufgeklärt.
Andererseits werden Mucopolysaccharide wegen der metabolischen
Abnormität von Mucopolysacchariden oder komplexen Zuckern
manchmal in den Urin in starkem Maße abgesondert oder in
Geweben angereichert, so daß es wichtig ist, die Struktur
dieser Zucker zu untersuchen, um die Ursachen zu spezifizieren.
In klinischen Tests wird die enzymatische Aktivität des
metabolischen Systems von N-Acetylglucosamin, d. h. die
Aktivitäten von β-N-Actylglucosaminidase und Lysozym,
ermittelt, um Ausmaß und Ort von Nierenstörungen zu
spezifizieren.
Bei diesen Untersuchungen und Messungen von Enzymaktivitäten
spielt die quantitative Analyse von N-Acetylglucosamin
eine wichtige Rolle. Somit ist ein ausgezeichnetes
Bestimmungsverfahren von den Fachleuten angestrebt worden.
Im allgemeinen wird die quantitative Analyse von
N-Acetylglucosamin durch chemische Verfahren, wie die
Morgan-Elson-Methode usw., durchgeführt. Verfahren unter
Einsatz eines Enzyms sind jedoch hinsichtlich Genauigkeit
und Einfachheit überlegen. Als ein Beispiel kann auf das
Verfahren gemäß JP-OS 59-1 56 299 verwiesen werden. Gemäß
diesem Verfahren wird N-Acetylhexosamin quantitativ
analysiert, indem man N-Acetylhexosamin mit
N-Acetylhexosamin-Oxidase zur Reaktion bringt und das
entstehende Produkt, wie Wasserstoffperoxid und dergleichen,
oder die mit fortlaufender Reaktion absorbierte
Sauerstoffmenge ermittelt.
Da jedoch N-Acetylhexosamin-Oxidase eine relativ breite
Substratspezifität aufweist, übt sie auch eine Wirkung
auf N,N′-Diacetylchitobiose und dergleichen aus. Da dieser
Zucker zwei Moleküle von N-Acetylglucosamin auf eine
Reaktion mit β-N-Acetylglucosaminidase bildet, ist er als
ausgezeichnetes Substrat zur hochempfindlichen Messung
von Enzymaktivitäten geeignet. Er war jedoch aus oben
genanntem Grund nicht einsetzbar als ein Substrat für die
Messung von β-N-Acetylglucosaminidase in Urin.
Es ist auch bekannt, daß die in Urin vorhandenen reduzierenden
Substanzen einen Einfluß auf das quantitative
Analysesystem von Wasserstoffperoxid ausüben, und die
Genauigkeit der Messung wird dadurch etwas eingeschränkt.
Bekannt ist jedoch, daß diese Substanzen im Falle des
quantitativen Analysensystems von NADH einen solchen
Einfluß kaum ausüben. Demzufolge kann die Vorbehandlung
von Probe und Vorrichtung im Meßsystem minimiert und
eine Messung höherer Genauigkeit durchgeführt werden.
Angesichts dieses Sachverhaltes haben die hier auftretenden
Erfinder ein Enzym aufgesucht, das in der quantitativen
Analyse von N-Acetylglucosamin einsetzbar ist, und zwar
mit dem Ziel, eine verbesserte enzymatische Messung von
N-Acetylhexosamin zu entwickeln. Als Ergebnis ist
herausgefunden worden, daß ein zum Genus Pseudomonas
gehörendes Bakterium, das aus dem Boden isoliert wird,
ein neues Enzym N-AHDH enthält, das auf
N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin einwirkt, um
diese in N-Acetylglucosaminolacton oder
N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und gleichzeitig
das im System vorliegende NAD⁺ zu NADH reduziert. Es wurde
festgestellt, daß dieses Enzym nicht auf Acetylchitobiose
einwirkt und in einem neuen Verfahren zur enzymatischen
quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin und
N-Acetylgalactosamin verwendet werden kann. Auf der
Grundlage dieser Erkenntnis ist die vorliegende
Erfindung vollbracht worden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Enzym
N-AHDH, das auf N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin
einwirkt, um diese in N-Acetylglucosaminolacton bzw.
N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und gleichzeitig
NAD⁺ zu NADH reduziert. Die Erfindung betrifft ebenso
ein Verfahren zur Erzeugung von N-AHDH, wobei man einen
Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und die Fähigkeit
zur Erzeugung von N-AHDH besitzt, in einem Medium züchtet
und N-AHDH aus dem gezüchteten Produkt gewinnt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein
Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin
oder N-Acetylgalactosamin, wobei man NADH auf eine
N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin enthaltende
Probe einwirken läßt und das entstehende NADH mißt.
Schließlich betrifft die Erfindung auch einen quantitativen
Analysekit, enthaltend mindestens N-AHDH, NAD⁺ und
Pufferlösung.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die den
optimalen pH des Enzyms der vorliegenden
Erfindung aufzeigt;
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die seinen
stabilen pH aufzeigt;
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung, die den optimalen
Temperaturbereich der Einwirkung des Enzyms
aufzeigt;
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung, die die
Wärmestabilität des Enzyms aufzeigt;
Fig. 5 ist ein Diagramm, das seine Elektrophoresebande
zeigt; und
Fig. 6 ist eine Kalibrationskurve in Beispiel 3.
Es gilt die Voraussetzung, daß die in Fig. 1 und 2
verwendeten Pufferlösungen Kaliumphosphatpuffer (○-○),
Tris-Salzsäure-Puffer (∆-∆) und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer
(⚫-⚫) sind.
Als nächstes wird die Erfindung konkreter dargelegt.
Die physiko-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms
N-AHDH der vorliegenden Erfindung werden nachstehend
aufgeführt.
Wie im folgenden Reaktionsschema gezeigt, oxidiert das
Enzym N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin zu
N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton
in Gegenwart von NAD⁺ und reduziert gleichzeitig das
NAD⁺ zu NADH.
Es ist überhaupt nicht oder kaum irgendeine Wirkung auf
N,N-Diacetylchitobiose, Hexosamin und neutrale Zucker
aus, ausgenommen, daß es nur eine leichte Wirkung auf
N-Acetylmannosamin ausübt.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Messung der Enzymaktivität
unter Verwendung von Phosphatpuffer, Tris-Salzsäure-Puffer
und Glycin-Natriumhydroxid-Puffern. Wie in Fig. 1 gezeigt,
beträgt der optimale pH 8,0 bis 10,5.
Wie in Fig. 2 gezeigt, beträgt der stabile pH-Bereich 8,0
bis 11,5.
Die in Fig. 2 verwendeten Puffer waren Kaliumphosphatpuffer,
Tris-Salzsäure-Puffer und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer.
Wie in Fig. 3 gezeigt, beträgt sie 30 bis 60°C.
Wenn über einen Zeitraum von 10 Minuten in 0,1 M
Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,5) erwärmt wird, bleibt
das Enzym bis zu einer Temperatur von 55°C stabil, während
es seine Aktivität bei 65°C rasch verliert. Wenn über eine
Zeitdauer von 10 Minuten bei 45°C erwärmt wird, ist es bei
einem pH-Wert von 8,0 bis 11,5 stabil, während es
insbesondere instabil bei einem pH-Wert von 6,0 oder darunter
ist (Fig. 4).
| Inhibitor | |
| Restaktivität | |
| keiner|100% | |
| HgCl₂ | 35 |
| CdSO₄ | 92 |
| ZnSO₄ | 95 |
| CaCl₂ | 95 |
| CuSO₄ | 94 |
| MnSO₄ | 96 |
| NaN₃ | 89 |
| SDS | 62 |
| KCN | 103 |
| EDTA | 101 |
| PCMB | 97 |
| Jodacetamid | 104 |
| alpha,alpha′-Dipyridyl | 107 |
| o-Phenanthrolin | 104 |
| 8-Hydroxychinolin | 110 |
In der obigen Tabelle wurde die Enzymaktivität in einer
Lösung, enthaltend 2 mM Metallion oder Inhibitor, gemessen.
Es ist keine Substanz bekannt, die zu Aktivierung und
Stabilisation besonders beiträgt.
Das Enzym kann gemäß üblichen Verfahren isoliert und
gereinigt werden. Beispielsweise werden Reinigungsverfahren,
wie Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Zellulose,
Fällung mit Ammoniumsulfat, Säulenchromatografie unter
Verwendung von DEAE-Sephadex, Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex-G-200 usw., entweder allein oder in
entsprechender Kombination angewandt.
Das durch Gelfiltration unter Verwendung von 0,05 M
Tris-Salzsäure-Puffer (enthaltend 0,1 M Natriumchlorid)
gemessene Molekulargewicht beträgt ca. 120 000 bis 130 000.
Wie in Fig. 5 dargelegt, zeigt die Substanz nahezu nur
eine Bande bei üblicher Acrylamid-Elektrophorese unter
Verwendung von 7,5%igem Polyacrylamidgel. Mit Bromphenolblau
als Standard beträgt seine relative Beweglichkeit in
7,5%igem Acrylamidgel 0,41.
Gemessen durch Polyacrylamidgel-Isoelektrofokusieren beträgt
sein isoelektrischer Punkt 4,7.
Zu 1,8 ml 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,5)
werden 0,1 ml 60 mM NDA⁺-Lösung gegeben. Nach 10minütigem
Halten der Mischung bei 37°C werden 10 ml Enzymlösung
zugefügt und anschließend 0,1 ml 0,3 M N-Acetylglucosamin-
Lösung zugemischt, um die Reaktion zu starten. Die
Reaktionsmischung wird sofort in eine bei 37°C gehaltene
Absorptionsmeßzelle (1 cm Lichtweg) gegeben, und es
wird die Absorption in Intervallen von 1 Minute bei einer
Wellenlänge von 340 nm über eine Zeitdauer von 5 Minuten
oder, falls erwünscht, über einen längeren Zeitraum gemessen.
Die Enzymmenge, die 1 µMol NADH pro 1 Minute bildet, wird
als "eine Einheit" genommen.
Wie oben erwähnt, ist das Enzym der vorliegenden Erfindung
ein neues Enzym, von dem Wirkung und Substratspezifität
bisher vollkommen unbekannt waren.
Als nächstes wird das Verfahren zur Erzeugung des neuen
Enzyms N-AHDH der vorliegenden Erfindung dargelegt. Der
verwendete Mikroorganismus ist ein Stamm, der zum Genus
Pseudomonas gehört und die Fähigkeit zur Erzeugung von
N-AHDH besitzt. Als sein konkretes Beispiel kann auf
Pseudomonas sp. Nr. 53 verwiesen werden. Varianten und
Mutanten dieses Stammes sind ebenfalls verwendbar.
Pseudomonas sp. Nr. 53 ist ein Stamm, den die hier auftretenden
Erfinder aus dem Boden isoliert haben, und seine
bakteriologischen Eigenschaften sind wie folgt.
Mikroskopische Betrachtungen (nach Züchtung bei 30°C über
18 Stunden in einer Glucose-Mediumbrühe, enthaltend 0,4%
Hefeextrakt):
- (1) Zellengröße: Stäbe mit einer Größe von 1,0 bis 1,1×1,4 bis 2,6 µm.
- (2) Polymorphismus der Zelle: Die Zellenform schwankt von einer nahezu sphärischen zu relativ langen Stäben. Es sind zweigliedrige Ketten beobachtbar, die an den Enden verbunden sind, obwohl längere Ketten nicht beobachtet werden.
- (3) Beweglichkeit: Schnelle lineare Bewegung (polare Flagellen).
- (4) Sporen: nicht gebildet
- (5) Gram-Färbung: negativ
- (6) Acid-Fast: negativ
- (1) Agar-Plattenkulturbrühe (3 Tage bei 30°C): Es werden weiß-braun gefärbte, vollständige, konvexe, halbdurchsichtigte Kolonien (1,5 mm Durchmeser) gebildet, und zwar ohne Pigmentbildung.
- (2) Glucosebrühe-Agar-Plattenkultur mit 0,4% Hefeextrakt (3 Tage bei 30°C): Es werden weiß- braun gefärbte, vollständige, konvexe, halbdurchsichtige Kolonien (2,1 mm Durchmesser) gebildet.
- (3) Glucosebrühe-Agar-Schrägkultur mit 0,4% Hefeextrakt (24 Stunden bei 30°C): Gutes Wachstum, glatte Oberfläche, fettiger Glanz, halbdurchsichtig.
- (4) Kultur in Glucosebrühe-Flüssigmedium mit 0,4% Hefeextrakt: In stehender Kultur (2 Tage bei 30°C) ist das Wachstum sehr schlecht. Eine membranähnliche Substanz wird an der Oberfläche leicht gebildet und fällt mit der Zeit aus. In Schüttelkultur (24 Stunden bei 30°C) wird einheitliches gutes Wachstum beobachtet.
- (5) Gelatinebrühe-Stichkultur (3 Tage bei 24°C): Es wird ein leichtes Wachstum ohne Verflüssigung von Gelatine beobachtet.
- (6) Lackmus-Milch (5 Tage bei 30°C): Leicht saure Reaktion mit einer schwachen Koagulation und Abtrennung einer transparenten Flüssigkeit an der Oberfläche.
- (1) Reduktion von Nitraten: negativ
- (2) Denitrifikation: negativ
- (3) MR-Test: negativ
- (4) VP-Test: negativ
- (5) Bildung von Indol: negativ
- (6) Bildung von Hydrogensulfid: positiv (Bleiacetat- Testpapier)
- (7) Hydrolyse von Stärke: negativ
- (8) Verwendung von Zitronensäure: negativ
- (9) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: negativ
- (10) Pigmentbildung: negativ
- (11) Urease: negativ
- (12) Oxidase: positiv
- (13) Katalase: positiv
- (14) Bereich der Wachstumsbedingungen: 13 bis 36°C (optimale Temperatur 29°C); pH 4,6 bis 8,5 (optimaler pH: nahe Neutralität)
- (15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: sehr aerob
- (16) O-F-Test: oxidativ
- (17) Bildung von Säure und Gas aus Zucker:
- (1) Keine Anreicherung von Poly-β-hydroxybuttersäureester.
- (2) Keine Bildung fluoreszierenden Pigmentes.
- (3) Kein Wachstum bei 40°C.
- (4) Keine Verwendung von H₂ als Energiequelle.
- (5) Keine Erzeugung von Alginin-Dihydrolase.
Bei Vergleich der obigen taxonomischen Eigenschaften dieses
neuen Stammes mit der Fähigkeit zur Erzeugung von N-AHDH
mit der Klassifikation gemäß "Bergey's Mannual of
Systematic Bacteriology (1984), Bd. 1" wird dieser Stamm
als zum Genus Pseudomonas gehörend betrachtet, weil er
ein gram-negativer, aerober, Katalase-positiver Bacillus
mit polarem Flagellum ist und keine Sporen bildet. Er wird
als eine verwandte Spezies von Pseudomonas stutzeri
betrachtet, weil er kein Poly-β-hydroxybutyrat im Zellkörper
anreichert, weder gelbes noch fluoreszierendes Pigment
erzeugt, Glucose für sein Wachstum verwendet und bei 40°C
nicht wächst. Er unterscheidet sich jedoch von Pseudomonas
stutzeri hinsichtlich Denitrifikation, Stärkeabbau und
Verwendung von Trehalose. Demzufolge wird er als neuer
Stamm betrachtet, der bisher unbekannt war.
Aus obigen Gründen nannten die Erfinder diesen Stamm
"Pseudomonas sp. Nr. 53". Pseudomonas sp. Nr. 53 ist im
Fermentation Research Insititute, Agency of Industrial
Science and Technology, Ministry of International Trade
and Industry, Japan, unter dem Budapester Vertrag als
FERM BP-2057 hinterlegt worden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium
kann jedes synthetische und natürliche Medium sein, solange
sie in geeigneter Weise eine Kohlenstoffquelle,
Stickstoffquelle, anorganische und andere Nährstoffe
enthalten. Als Kohlenstoffquelle kann Glucose, Galactose,
Fructose und dergleichen verwendet werden. Als
Stickstoffquelle können stickstoffhaltige organische
Substanzen, wie Pepton, abgebautes Casein, Glutaminsäure,
Hefeextrakte und dergleichen, erfolgreich eingesetzt
werden. Als Anorganika können Salze von Natrium, Kalium,
Magnesium, Mangan, Kalzium, Eisen und dergleichen verwendet
werden.
In der vorliegenden Erfindung kann N-AHDH in hoher Ausbeute
erhalten werden, wenn ein Stamm mit der Fähigkeit zur
Erzeugung von N-AHDH in einem Medium, enthaltend
N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, gezüchtet
wird. Als ein bevorzugtes Beispiel des Kulturmediums kann
auf ein Medium verwiesen werden, das 0,5%
N-Acetylglucosamin, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Pepton, 0,2%
primäres Kaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,01%
Kalziumchlorid und 0,01% Eisensulfat (pH 7,0) enthält.
Wenn eine Züchtung unter Bewegung und Belüftung in
genanntem Medium bei 30°C 20 Stunden durchgeführt wird,
liegt der erreichte Produktionstiter 10- bis 100mal so hoch
wie derjenige, der erreichbar ist, wenn man das
N-Acetylglucosamin durch andere Zucker als N-Acetylglucosamin
ersetzt.
Die Temperatur der Kultur liegt üblicherweise im Bereich
von 20 bis 35°C, und vorzugsweise bei ca. 30°C. Bei Beginn
der Züchtung liegt der pH üblicherweise im Bereich von 6
bis 8, und vorzugsweise bei ca. 7. Wenn eine
Schüttelkultur oder eine bewegte Tauchkultur unter den
obigen Bedingungen 20 bis 30 Stunden lang durchgeführt
werden, wird N-AHDH gebildet und in dem gezüchteten
Produkt angereichert.
Da N-AHDH üblicherweise in der Bakterienzelle vorkommt,
ist es bevorzugt, die Bakterienzelle nur durch
Zentrifugation oder Filtration zu isolieren. Dann wird
die isolierte Bakterienzelle gebrochen und in einer geeigneten
Pufferlösung solubilisiert, um das Enzym in die Lösung
freizusetzen.
Zum Brechen der Bakterienzellen können physikalische
Verfahren, wie Dynomill, French Press, Ultraschall und
dergleichen, chemische Verfahren, wie Triton-X-100,
Natriumlaurylsulfat, EDTA und dergleichen, sowie enzymatische
Verfahren, wie Lysozym und dergleichen, entweder allein
oder in Kombination angewandt werden. Nach Brechen der
Bakterienzellen werden Nucleinsäure aus der Flüssigkeit
auf übliche Weise und unlösliches Material durch Filtration
oder Zentrifugation entfernt. Auf diese Weise wird N-AHDH
erhalten.
Falls gewünscht, kann das N-AHDH durch übliche Verfahren
zur Isolation und Reinigung von Enzym gereinigt werden,
wie (1) Säulenchromatografie unter Einsatz einer
DEAE-Zellulose-Säule, (2) fraktionierte Fällung unter
Verwendung von Ammoniumsulfat, (3) Säulenchromatografie
unter Einsatz einer DEAE-Sephadex-Säule, (4) Gelfiltration
unter Verwendung von Sephadex oder andere Verfahren, welche
gegebenenfalls kombiniert werden können.
Als nächstes werden das Verfahren zur quantitativen
Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin
gemäß der vorliegenden Erfindung sowie der Kit zur
quantitativen Analyse konkret erklärt.
Der erfindungsgemäßen Messung liegt das folgende Prinzip
zugrunde:
Das heißt, N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin
werden in der Probe mit N-AHDH zur Reaktion gebracht und
das gebildete NADH gemäß bekannter Verfahren bestimmt,
wie der Messung der UV-Absorption bei 340 nm usw.
Alternativ dazu werden die Probe mit N-AHDH, die auf einem
Feststoff gehalten wird, in Kontakt gebracht und das
entstehende NADH auf ähnliche Weise bestimmt.
Gewünschtenfalls kann eine geeignete Menge an Inhibitor,
wie Oxaminsäure, Oxalsäure und dergleichen, zugefügt werden,
um den Einfluß der ebenfalls vorhandenen Lactat-Dehydrogenase
(LDH) zu verhindern.
Als die in der Erfindung verwendete N-AHDH kann N-AHDH
eines jeden Ursprungs verwendet werden. Es ist jedoch
bevorzugt, eine N-AHDH zu verwenden, die durch Züchtung
eines Stammes erhalten wird, der aus Bakterien ausgewählt
ist, die zum Genus Pseudomonas gehören.
Als Beispiele der Enzym erzeugenden Bakterien, die zum
Genus Pseudomonas gehören, kann auf Pseudomonas sp. Nr. 53
(FERM BP-2057) und dergleichen verwiesen werden.
Bei Einwirkung der N-AHDH auf N-Acetylglucosamin oder
N-Acetylgalactosamin in der Probe wird die Reaktion bei
einer Temperatur von 60°C oder darunter bei einem pH-Wert
von 7 bis 11 und vorzugsweise bei einer Temperatur von 30
bis 55°C bei einem pH-Wert von 8 bis 10,5 durchgeführt,
und zwar üblicherweise über einen Zeitraum von ca. 10 bis
20 Minuten. Zur Einstellung des pH-Wertes wird eine
beliebig ausgewählte Pufferlösung verwendet, die den obigen
pH-Bereich einhalten kann und die Enzymreaktion nicht stört.
Zum Beispiel werden Kaliumphosphatpuffer,
Tris-Salzsäure-Puffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer und
dergleichen, vorzugsweise verwendet.
Das durch die Einwirkung von N-AHDH gebildete NADH kann
durch jedes Verfahren bestimmt werden. Am meisten
gebräuchlich wird es jedoch durch die Absorptionsmessung
bei einer UV-Wellenlänge von 340 nm ermittelt. Als Verfahren
zur Bestimmung von NADH nach Überführung in ein Pigment
mit einer Absorption im sichtbaren Bereich kann auf ein
Verfahren, wobei man NADH mit Phenazin-Methosulfat und
Nitroblau-Tetrazolium zur Reaktion bringt und die Absorption
des entstehenden Diformazan bei 570 nm mißt, sowie auf
ein Verfahren verwiesen werden, wobei man NADH mit
NADH-Oxidase (J. Biochem. 98, 1433 (1985)) oder
Phenazin-Methosulfat oder einem wirkungsgleichen
Elektronträger oder einem Metallion zur Reaktion bringt,
um Wasserstoffperoxid zu bilden, eine Farbe aus dem
Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase und
verschiedenen Chromogenen entwickelt und die Absorption
bei den jeweiligen optimalen Wellenlängen mißt. Wenn NADH
zu Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, kann es auch durch
Emissionsspektrometrie nach Behandlung mit Luminol
nachgewiesen werden. Es ist auch möglich, es halbquantitativ
nachzuweisen, indem man eine Reihe von entsprechend
ausgewählten Redoxindikatoren und Elektronträgern zufügt
und den Farbton des Systems beobachtet. Alle diese
Verfahren können entsprechend ihrer charakteristischen
Merkmale ausgewählt und angewandt werden.
Der Kit der vorliegenden Erfindung zur quantitativen Analyse
von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin ist
zusammengesetzt aus N-AHDH, NAD⁺, Enzymen und Reagenzien
zur Bestimmung des entstehenden NADH, sowie Pufferreagenzien
für den glatten Ablauf der Reaktionen. Die Reagenzien und
Enzyme liegen flüssig, fest oder gefriergetrocknet vor und
werden kurz vor Gebrauch aufgelöst und eingemischt in eine
Pufferlösung, um ein Reagens für die Messung herzustellen,
und zwar in Übereinstimmung mit dem jeweiligen Bedarf.
Zur Ausführung der Messung läßt man den Kit direkt auf
eine Probe, die N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin
enthält, einwirken, um NADH zu bilden. Dann wird NADH in
der Reaktionsmischung entweder direkt oder nach Zugabe eines
NADH Bestimmungsreagens gemessen. Die Messung kann entweder
durch Ein- oder Zwei- oder Multi-Reagenssysteme erfolgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können N-Acetylglucosamin
oder N-Acetylgalactosamin durch die Verwendung einer neuen
N-AHDH in hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt und auf
deren Grundlage die Aktivität von β-N-Acetylglucosaminidase
usw. gemessen werden. Somit können Struktur komplexer
Zucker analysiert und Nierenstörungen effektiv diagnostiziert
werden. Demzufolge ist die vorliegende Erfindung für Fachleute
sehr wertvoll.
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung anhand der
folgenden Beispiele verdeutlicht.
Pseudomonas sp. Nr. 53 (FERM BP-2057) wurde in einen 150 ml
Erlenmeyer-Kolben mit 20 ml eines Keimmediums (pH 7,2)
gespritzt, enthaltend 0,5% N-Acetylglucosamin, 0,5%
Hefeextrakt, 0,3% Pepton, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat,
0,05% Magnesiumsulfat, 0,01% Kalziumchlorid und 0,01%
Eisensulfat. Nach Züchtung unter Schütteln über 24 Stunden
bei 30°C wurde die Mischung in einen Kolbenfermenter
(hergestellt von Iwashiya Seibutsukagaku K. K.) gegeben,
enthaltend 2 l desselben Mediums wie oben, und unter
Belüftung (2 l/Min.) sowie Rühren (500 Upm) 18 Stunden lang
bei 30°C gezüchtet. Das so erzeugte N-AHDH wurde in der
Bakteriumzelle angereichert.
5 l 0,02 M Tris-Salzsäure-Puffer (pH 8,0) (nachfolgend als
"Standardpuffer" bezeichnet) wurden zu 0,96 kg lebenden
Bakterienzellen gegeben, welche in derselben Weise wie in
Beispiel 1 erhalten wurden. Dann wurden Triton-X-100 und
EDTA zugefügt, so daß ihre Konzentrationen 0,5% bzw.
10 mM betrugen. Unter Rühren der Mischung bei niedriger
Temperatur (5°C) über Nacht wurde eine einheitliche
Suspension erhalten. Danach wurde sie bei 3000 Upm mittels
einer Dynomill (hergestellt von Willey A. Beckohen Co.,
Schweiz) gebrochen. Durch Zentrifugieren bei 8000 Upm über
20 Minuten wurden 5,1 l eines Überstandes erhalten.
Danach wurden 3,5 kg nasse DEAE-Zellulose zugefügt und
der pH der Mischung auf 8,0 eingestellt, worauf die Mischung
30 Minuten lang gerührt wurde, um das Enzym auf der
DEAE-Zellulose adsorbieren zu lassen. Die DEAE-Zellulose
wurde durch Filtration mit einem Buchner-Trichter gesammelt
und mit 10 l Standardpuffer gewaschen, worauf sie mit 7 l
Standardpuffer gewaschen wurde, enthaltend 0,3 M Natriumchlorid,
und die Waschflüssigkeit wurde als eine beabsichtigte
Fraktion herausgenommen. Die Fraktion wurde auf ein
Volumen von 1,4 l mittels eines Hohlfaser-Ultrafilters
(hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K. K.) aufkonzentriert.
Dann wurden 112 g pulveriges Ammoniumsulfat im Konzentrat
aufgelöst und gründlich gerührt.
Nach 2stündigem Stehen der Mischung wurde sie bei 9000 Upm
20 Minuten lang zentrifugiert, um 1,4 l Überstand zu
erhalten. Dann wurden zusätzliche 364 g Ammoniumsulfat
zugegeben und vollständig darin aufgelöst, und die
entstehende Lösung wurde über Nacht bei niedriger Temperatur
stehen gelassen.
Die entstehende Fällung wurde durch 20minütiges Zentrifugieren
der Mischung bei 12 000 Upm gesammelt, und sie wurde in
1,4 l Standardpuffer aufgelöst, enthaltend 4% Ammoniumsulfat.
Dann wurde sie auf eine Phenyl-Sepharose-CL-4B-Säule
(9 cm Durchmesser, 40 cm hoch, hergestellt von Pharmacia,
Schweden) gegeben, die vorher mit einem Standardpuffer
equilibriert wurde, enthaltend 6% Ammoniumsulfat, um das
Enzym an die Säule zu adsorbieren, und dann wurde sie mit
20 l Standardpuffer mit einem Konzentrationsgradienten von
0 bis 30% bezüglich Ethylenglykol und einem umgekehrten
Konzentrationsgradienten von 4 bis 0% bezüglich
Ammoniumsulfat eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und
auf 5 l mittels Ultrafiltration aufkonzentriert, worauf die
Enzymlösung einer Filrationsdialyse gegen 3 l Standardpuffer,
enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, unterworfen wurde. Die
dialysierte Lösung wurde auf eine DEAE-Sephadex-A-50-Säule
(9 cm Durchmesser, 30 cm hoch) gegeben, die vorher mit
Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid equilibriert
wurde, um das Enzym an der Säule zu adsorbieren, und dann
wurde sie mit 20 l Standardpuffer mit einem Natriumchlorid-
Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,3 M eluiert.
Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration auf 50 ml
aufkonzentriert, und ein 5 ml-Anteil wurde einer
präparativen Elektrophorose unter Einsatz einer Vorrichtung,
hergestellt von Fuji Riken K. K., unterworfen, um Protein
durch Polyacrylamid-Elektrophorese abzutrennen und zu
gewinnen.
Das in diesem Verfahrensschritt verwendete Polyacrylamidgel
war ein 7,5%iges Gel. Der Strom betrug 10 mA und der für
die Gewinnung verwendete Puffer war 0,012 M
Tris-0,1M Glycin-Puffer (pH 8,3).
Die auf diese Weise gewonnene aktive Fraktion wurde durch
Ultrafiltration aufkonzentriert und mittels einer
Collodion-Konzentrationsvorrichtung auf 1 ml zusätzlich
aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration
durch Verwendung einer Sephadex-G-200-Säule (2,5 cm Durchmesser,
95 cm hoch) unterworfen, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid.
Alle rohen Enzymlösungen wurden durch ähnliche Behandlung
gereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und
aufkonzentriert, um 1,980 Einheiten gereinigten Enzyms zu
erhalten. Wie in Fig. 5 gezeigt, handelte es sich um eine
Enzymprobe, die nahezu eine Bande bei
Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufwies.
Die Konzentration von N-Acetylglucosamin in Lösung wurde
durch das folgende Verfahren durch die Verwendung der
folgenden Reagenzien bestimmt.
| 1. Reagenzien | |
| 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4)|1,7 ml | |
| NAD⁺ (60 mM) | 0,1 ml |
| N-AHDH (250 Einheiten/ml) | 0,1 ml |
| Probenlösung | 0,1 ml |
Vorbestimmte Mengen der Reagenzien wurden in ein Teströhrchen
gegeben und bei 37°C 10 Minuten lang zur Reaktion gebracht,
worauf die Absorption bei 340 nm gemessen wurde. Die
Nettoabsorption der Probenlösung wurde berechnet, indem
man die Absorption eines Durchlaufs unter Verwendung derselben
Menge an Wasser anstatt der Probenlösung abzog.
Andererseits wurde eine Kalibrationskurve aufgestellt,
indem man N-Acetylglucosaminlösungen bekannter Konzentrationen
in derselben Weise wie oben behandelte. Unter Bezug auf
die Kalibrationskurve wurde die Konzentration von
N-Acetylglucosamin in der Probenlösung bestimmt. Fig. 6
zeigt die Kalibrationskurve.
Die Konzentration von N-Acetylgalactosamin in Lösung wurde
durch das folgende Verfahren durch die Verwendung der
folgenden Reagenzien bestimmt.
| 1. Reagenzien | |
| 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (enthaltend 0,3% Triton-X-100)|115 µl | |
| Phenazin-Methosulfat (1 mg/ml) | 5 µl |
| Nitroblau-Tetrazolium (10 mg/ml) | 5 µl |
| NAD⁺ (60 mM) | 10 µl |
| N-AHDH (155 Einheiten/ml) | 15 µl |
| Probenlösung | 50 µl |
Vorbestimmte Mengen an Reagenzien wurden in ein Teströhrchen
gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang zur Reaktion gebracht.
Dann wurden 2,0 ml 0,3 N Salzsäure zugegeben und gründlich
gerührt. Die Absorption der entstehenden Farbe wurde bei
570 nm gemessen. Parallel dazu wurde dieselbe Menge wie
oben an Wasser anstatt der Probenlösung ähnlich behandelt
und diese Absorption wurde als Nullprobe genommen. Durch
Abziehen der Nullprobe von der obigen Absorption der
Probenlösung wurde die Nettoabsorption der Probenlösung
berechnet. Andererseits wurde eine Kalibrationskurve
aufgestellt, indem man N-Acetylgalactosaminlösungen bekannter
Konzentrationen ähnlich behandelte. Unter Bezug auf die
Kalibrationskurve wurde die Konzentration von
N-Acetylgalactosamin in der Probenlösung bestimmt.
Die Aktivität von β-N-Acetylglucosaminidase, extrahiert aus
Rindernieren, wurde durch das folgende Verfahren durch die
Verwendung der folgenden Reagenzien bestimmt.
| 1. Reagenzien | |
| (A) 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 4,4)|0,3 ml | |
| N,N′-Diacetylchitobiose (50 mM) | 0,1 ml |
| Probenlösung | 0,1 ml |
| (B) 0,2 M Glycin-Natriumhydroxidpuffer (pH 10,0) | 1,3 ml |
| NAD⁺ (60 mM) | 0,1 ml |
| N-AHDH (250 Einheiten/ml) | 0,1 ml |
Vorbestimmte Mengen der Reagenzien (A) wurden in ein
Teströhrchen gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang zur
Reaktion gebracht. Dann wurden vorbestimmte Mengen der
Reagenzien (B) vermischt, und die entstehende Mischung
wurde dem Teströhrchen zugefügt und wiederum bei 37°C
10 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die Absorption
wurde bei 340 nm gemessen, von der die Absorption eines
Durchlaufs unter Verwendung von Wasser anstatt der
Probenlösung abgezogen wurde, um die Nettoabsorption der
Probenlösung zu ergeben. Die Enzymaktivität der Probenlösung
wurde aus der folgenden Gleichung berechnet:
Claims (6)
1. N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase, welche Wasserstoff
von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin
wegnimmt, um diese in N-Acetylglucosaminolacton oder
N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und
gleichzeitig Coenzym NAD⁺ zu NADH reduziert.
2. N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase mit den folgenden
physiko-chemischen Eigenschaften (1) bis (3):
- (1) Wirkung und Substratspezifität:
Sie nimmt Wasserstoff von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin weg, um diese in N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und reduziert gleichzeitig Coenzym NAD⁺ zu NADH; - (2) Optimaler pH: 8,0 bis 10,5;
- (3) Stabiler pH: 8,0 bis 11,0.
3. Verfahren zur Erzeugung einer N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase,
wobei man einen Stamm, der zum Genus Pseudomonas
gehört und eine Fähigkeit zur Erzeugung von
N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase besitzt, in einem
Medium züchtet und N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase aus
dem gezüchteten Produkt gewinnt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der zum Genus
Pseudomonas gehörende Stamm Pseudomonas sp. Nr. 53
(FERM BP-2057) ist.
5. Verfahren zur quantitativen Analyse von
N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, wobei man
N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase auf eine Probe,
enthaltend N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin,
einwirken läßt und die Menge des entstehenden NADH
mißt.
6. Kit zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin
oder N-Acetylgalactosamin, welcher
N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase, NAD⁺ und eine
Pufferlösung enthält.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234746A JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3931399A1 true DE3931399A1 (de) | 1990-03-29 |
Family
ID=16975708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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