DE3855523T2

DE3855523T2 - Proteine mit Faktor-VIII-Aktivität, Verfahren zu deren Herstellung unter Verwendung von genetisch modifizierten Zellen und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3855523T2
Application number: DE3855523T
Authority: DE
Inventors: Hans C O Centraal La Pannekoek; Leen Robert Willem Van; Ooyen Albert Johannes Jose Van; Martinus Philippus Cen Verbeet
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2008-06-14
Also published as: GR3021545T3; ZA884216B; IL86693A; ATE142691T1; ATE209679T1; CN1033760C; FI890643L; DK58789A; ES2094111T3; DE3856505T2; FI890643A0; US6316226B1; PT87721B; KR890701739A; CA1341208C; PT87721A; FI103731B; FI103731B1; NO301121B1; NO890587D0

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft neue Proteine mit Faktor VIII-Ativität und Verfahren zu ihrer Herstellung unter Verwendung gentechnisch veränderter Zellinien und Mikroorganismen.

Hintergrund

Hämophilie A ist eine geschlechtsgebundene Bluterkrankung, die durch einen Mangel an Faktor VIII, einem wesentlichen Element in der Blutgerinnungskaskade, gekennzeichnet ist. Die Erkrankung tritt bei ca. 0,01 % der männlichen Bevölkerung auf. Hämophilie A kann durch Verabreichung von Faktor VIII-haltigem Blutplasma, das von gesunden Spendern gewonnen wird, behandelt werden. Diese Behandlung hat jedoch mehrere Nachteile. Die Versorgung mit Faktor VIII ist begrenzt und sehr teuer; die Konzentration von Faktor VIII im Blut ist nur ca. 100 ng/ml, und die Ausbeuten unter Anwendung gegenwärtiger Plasma-Fraktionierungsverfahren sind niedrig. Da die Faktor VIII-Quelle gepooltes Spenderblut ist, ist der Empfänger einem hohen Risiko der Erkrankung mit verschiedenen Infektionserkrankungen ausgesetzt, einschließlich solcher, die durch Hepatitis non-A-, non-B-, Hepatitis B- oder AIDS-Viren, die im Spenderblut vorhanden sein können, verursacht werden. Zusätzlich können die Empfänger Antikörper gegen den exogenen Faktor VIII entwickeln, was in hohem Maße seine Wirksamkeit verrringern kann.
Faktor VIII enthält drei Regionen, eine N-terminale Region, die sogenannte "A1A2-Domäne"; eine zentrale Region, die sogenannte "B-Domäne"; und eine C-terminale Region, umfassend die A3-, C1- und C2-Domänen. Man vermutet, daß die A1A2-Domäne und die C-terminale Region wesentlich für die Gerinnungsaktivität sind. Faktor VIII zirkuliert im Blut zusammen mit einem Protein, dem von Willebrand-Faktor (vWf), von dem man vermutet, daß er den empfindlichen Faktor VIII gegen einen frühen Abbau schützt.
Faktor VIII wird in ungenügend niedrigen Ausbeuten bei Produktion durch bekannte rekombinante DNA-Verfahren erhalten. Darüber hinaus scheinen die Proteine nicht als intakte Kette vorzuliegen, daher sind die Produkte schwierig zu isolieren und zu reinigen, und folglich sind die Kosten hoch. Es ist daher erwünscht, einen wirksamen Weg zur Herstellung großer Mengen an Verbindungen mit Faktor VIII-Aktivität zu entwickeln, wobei die Verbindungen vorzugsweise eine verringerte immunogene Aktivität aufweisen.

Relevanter Stand der Technik

Über die molekulare Clonierung von Faktor VIII cDNA, erhalten aus humaner mRNA, und die anschließende Herstellung von Proteinen mit Faktor VIII-Aktivität in Säugern, Hefe- und Bakterienzellen wurde berichtet. Siehe WO 85/01961, EP 0160457, EP 0150735, EP 0253455. Ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Faktor VIII-Aktivität unter Verwendung transformierter Mikroorganismen ist in EP 025455 offenbart. Die europäischen Patentanmeldungen EP 0150735 und EP 0123945 und Brinkhous et al (1985) offenbaren Faktor VIII-Aktivität in proteolytischen Spaltungsprodukten von Faktor VIII. Ein Komplex aus zwei proteolytischen Spaltungsprodukten von Faktor VIII, ein 92 kDA und ein 80 kDA Polypeptid zeigt verbesserte Faktor VIII-Aktivität (Fay et al, Biochem. Biophys. Acta (1986) 871:268-278; Faton et al Biochemistry (1986) 25: 505-512).
Eaton et al, Biochemistry (1986) 25: 8343-8347, offenbaren, daß ein Polypeptid, bei dem 766 Aminosäuren (797-1562) aus der zentralen Region deletiert wurden, Faktor VIII-Aktivität beibehält. Ferner hatten Säugerzellen, die mit einem dieses Deletionspolypeptid kodierende DNA enthaltenden Vektor transformiert wurden, eine höhere Produktivität als Zellen, die mit einem Vektor transformiert wurden, welcher die gesamte Länge des Polypeptids kodierende DNA umfaßt.
Die PCT-Anmeldung WO 86/06101 offenbart, daß rekombinante Faktor VIII- Proteine mit Deletionen von bis zu 880 Aminosäuren in der zentralen Region Faktor VIII-Aktivität zeigen. Die größte Deletion erstreckt sich von Thr- 760 bis Asn-1693 (Zählung nach Figur 1). Die Wirtszellen für die Herstellung des rekombinanten Faktors VIII schlossen Säugerzellen ein, einschließlich CHO-Zellen (Eizellen des chinesichen Hamsters)

Zusammenfassung der Erfindung

Neue Zusammensetzungen, zusammen mit Expressionsvektoren, und Verfahren zu ihrer Herstellung werden zur Verfügung gestellt, welche Derivate und Fragmente vom Faktor VIII umfassen. Die Zusammensetzungen werden durch Transformieren einer Wirtszelle, vorzugsweise einer Säugerzelle, mit einem Expressionsvektor hergestellt, der eine einen Faktor VIII-Congener kodierende DNA-Sequenz umfaßt, Wachsenlassen der transformierten Wirtszelle unter Expression der exogenen DNA-Sequenz und Gewinnen des erhaltenen Faktor VIII-Derivats oder Fragments aus einem Zelllysat oder einem konditionierten Wachstumsmedium. Die Zusammensetzungen können verstärkte Faktor VIII-Aktivität und/oder verringerte Immunogenizität haben. Verwendungen der Zusammensetzungen umfassen Behandlung von Hämophilie A.

Kurze Beschreibung der zeichnungen

Figur 1 zeigt das Faktor VIII cDNA-Insert von pCLB89, einschließlich der Aminosäuresequenz Ala-1 bis Tyr-2332 des Faktor VIII und seine Signalsequenz M(-19) bis S(-1) mit der entsprechenden Sequenz der Nukleotide. F-973 wird durch das Codon TTC kodiert.
Figur 2 zeigt die Struktur des Expressionsvektors pCLB201, der die gesamte Länge des Faktor VIII-Proteins kodiert.
Das zirkuläre Plasmid pCLB201 wird dargestellt mit dem Beginn an der EcoRI-Position innerhalb des 4217 bp HindIII-BglII-Fagments, abgeleitet aus Plasmid pSV2 (Gorman, 1985 DNA Cloning (Ed.Glover) IRL Press, Seiten 143- 169; Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:2072). Die frühe SV40-Promotorregion wird als SVep angegeben. Der Vektor enhält ebenfalls ein NdeI-HindIII-Fragment, abgeleitet aus Plasmid pRSV-neo (Gorman, 1985, supra), welches das Rous Sarcoma Virus-Long Terminal Repeat (LTR), eingefügt in eine SalI-Schnittstelle, trägt. Die gesamte Länge des Faktors VIII wird durch ein SalI-HpaI-Fragment mit 7440 bp kodiert und wird als Faktor VIII cDNA (H = HindIII, Sal = SalI) bezeichnet. Die Restriktionsendonuklease-Schnittstellen, die während der Konstruktion des pCLB201 verlorengegangen sind, sind in Klammern angegeben. Die Plasmidgröße ist in Kilobasen-Paaren (kb) angegeben.
Figur 3 zeigt Vektoren für die transiente Expression von deletionsmutierten Faktor VIII-Proteinen:
a. Die besonderen Kennzeichen des pSV2-abgeleiteten Vektors sind: zwei tandemartig angeordnete Promotoren: der frühe SV40 Transkriptionspromotor (SVep) und das Rous Sarcoma Virus-Long Terminal Repeat (RSV-LTR); die Cap-Stelle (Capsite) und 5'-Ende der Messenger RNA (mRNA); das cDNA-Insert, welches die gesamte Länge der Faktor VIII kodierenden Region mit dem Startcodon (ATG), dem offenen Leserahmen und das Stop-Codon (TGA) trägt; die 3'-nichtkodierende Region der mRNA mit einem kurzen Intron und das Polyadenylierungs-Signal (polyA), abgeleitet aus der SV40 DNA (vergleiche mit Figur 2).
b. Das 7440 bp (Basenpaare)-Fraktment SalI-HpaI, welches die gesamte Länge der Faktor VII-kodierenden cDNA trägt, ist angegeben. Die Start- und Stop-Codons des Leserahmens sind angegeben. Restriktionsendonuklease- Stellen innerhalb der gesamten Länge der cDNA, die bei der Mutagenese für die Konstruktion von pCLB202 und pCLB203 beteiligt sind, sind angegeben.
c. Karte des Faktor VIII-Proteins. Das 19 Aminosäure lange Signalpeptid und die Domäne oder Repeatstruktur von Plasma Faktor VIII sind angegeben. A1, A2 und A3 sind homologe Aminosäuresequenzen. B ist eine einzelne Region, wogegen C1 und C2 wieder homolog sind (Vehar et al, 1984). Die Aminosäure-Positionen, welche die A- und C-Repeats begrenzen, sind angegeben. Darunter ist das zirkuläre Plasmid pCLB201 gezeigt, welches mit der EcoRI-Position innerhalb des 4217 bp HindIII-BglII-Fragments, abgeleitet aus Plasmid pSV2 beginnt (Gorman, 1985 DNA Cloning (Ed. Glover) IRL Press, Seiten 143-169; Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:2072). Die frühe SV40-Promotorregion ist mit SVep bezeichnet. Der Vektor enthält ebenfalls ein NdeI-HindIII-Fragment, abgeleitet aus Plasmid pRSV-neo (Gorman, 1985), welche das Rous Sarcoma Virus-Long Terminal Repeat (LTR), eingefügt in eine SalI-Schnittstelle trägt. Die gesamte Länge des Faktors VIII wird durch ein SalI-HpaI-Fragment von 7440 bp kodiert und bezeichnet als Faktor VIII cDNA (H = HindIII, Sal = SalI). Die Restriktionsendonuklease-Schnittstellen, die während der Konstruktion des pCLB201 verlorengegangen sind, sind in Klammern angegeben. Die Größe des Plasmids wird in Kilobasen-Paaren (kb) angegeben.
Figur 3 zeigt Vektoren für die transiente Expresseion von deletionsmutierten Faktor VIII-Proteinen:
a. Die wesentlichen Merkmale des pSV2-abgeleiteten Vektors sind: zwei tandemartig angeordnete Promotoren: der frühe SV40- Transkriptionspromotor (SVep) und das Rous Sarcoma Virus-Long Terminal Repeat (RSV-LTR); die Cap-Stelle (Capsite) und das 5'-Ende der Messenger- RNA (mRNA); das cDNA-Insert, welches die gesamte Länge der Faktor VIII- kodierenden Region mit dem Start-Codon (ATG), den offenen Leserahmen und das Stop-Codon (TGA) trägt; die 3'-nichtkodierende Region der mRNA mit einem kurzen Intron und dem Polyadenylierungssignal (polyA), abgeleitet aus der SV40 DNA (vergleiche mit Figur 1).
b. Das 7440 bp (Basenpaare)-Fragment SalI-HpaI, das die gesamte Länge der Faktor VIII-kodierenden DNA trägt, ist angegeben. Die Start- und Stop-Codons des Leserahmens sind angegeben. Die Restriktionsendonuklease- Stellen innerhalb der gesamten Länge der cDNA, die an der Mutagenese zur Konstruktion von pCLB202 und pCLB203 beteiligt sind, sind gezeigt.
c. Karte des Faktor VIII-Proteins. Das 19-Aminosäure lange Signalpeptid und die Domänen oder Repeatstruktur des Plasma-Faktor VIII sind angegeben. A1, A2 und A3 sind homologe Aminosäuresequenzen. B ist eine einzelne Region, wogegen C1 und C2 wiederum homolog sind (Vehar et al, 1984). Die Aminosäure-Positionen an den Grenzen der A- und C-Repeats sind angegeben. Unterhalb der Karte sind die Schnittstellen der proteolytischen Enzyme, die Faktor VIII schneiden, d.h. aktiviertes Protein C (APC), Thrombin (IIa), aktivierter Gerinnungsfaktor X (Xa) und eine Trypsinähnliche Protease (gekennzeichnet durch "?") durch Pfeile angegeben. Man vermutet, daß Faktor Xa die IIa- und APC-Schnittstellen schneidet, die ebenfalls angegeben sind (Eaton et al, Biochemistry (1986) 25: 8343-8347; Fay et al, Biochem. Biophys. Acta (1986) 871: 268-278). Ihre Schnittstellen sind angegeben. Die B-Region enthält multiple Schnittstellen.
d. Die Untereinheiten-Struktur von aktiviertem Faktor VIII. Faktor VIIIa-Untereinheiten zu 92 kDA und 80 kDa sind als 92k und 80k angegeben. Ihre Amino-terminalen und Carboxy-terminalen Aminosäurepositionen innerhalb der gesamten Länge der Sequenz sind angegeben.
e. Die Struktur der cDNA und des Proteins von pCLB202, die eine direkte Fusion zwischen der PstI- und BamHI-Schnittstelle enthalten, sind in b angegeben. Das erhaltene Protein ist als eine Peptidbindung zwischen Ala-867 und Asp-1563 enthaltend gekennzeichnet. Die gesamte Länge des Proteins ist 1637 Aminosäuren. (Die speziellen Eigenschaften der Repeat- Randpositionen und der spezifischen proteolytischen Spaltstellen sind gekennzeichnet; siehe oben)
f. Die Struktur der cDNA und des Proteins pCLB203, enthaltend eine MluI-Linker-Sequenz, die für vier zusätzliche Aminosäuren kodiert, welche die MaeIII-Schnittstelle und HgiAT-Schnittstelle verbinden, wie unter b angegeben. Die gesamte Länge des Proteins ist 1411 Aminosäuren. (Die speziellen Kennzeichen der Repeat-Randpositionen und der spezifischen proteolytischen Spaltstellen sind gekennzeichnet; siehe oben).
Figur 4 zeigt die Ergebnisse der Molekulargewichts(größen) Bestimmung von mehreren Deletions-mutierten Faktor VIII-Proteinen unter Verwendung von Immunpräzipitation und Elektrophorese.
Die Autoradiographie zeigt die Bahnen für die mit den Vektoren pCLB202 (Bahn 2) und pCLB203 (Bahn 1) hergestellten Proteine. Die Molekulargewichtsmarker sind wie gekennzeichnet.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Erfindungsgemäß werden neue DNA-Konstrukte und neue Zusammensetzungen, die Wirtszellen-produzierte Polypeptide mit Faktor VIII-Aktivität enthalten, zur Verfügung gestellt. Die Polypeptide mit Faktor VIII- Aktivität umfassen Deletions-mutierte Proteine von Faktor VIII, bei denen im wesentlichen die gesamte zentrale Region oder "B-Domäne", wie auch ein Teil der 92 Kilo-Dalton (kDa)-Region deletiert wurde. Plasmidkonstrukte, die eine Deletionspolypeptide mit Faktor VIII-Aktivität kodierende DNA- Sequenz enthalten, werden zur Transformation einer Wirtszelle verwendet. Dann läßt man die Wirtszelle unter Expression des Gens wachsen. Die Wirtszelle kann entweder eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle sein.
Humaner Faktor VIII hat die in Figur 1 gezeigte Sequenz. Es werden Einzelbuchstaben-Abkürzungen für die Aminosäuren verwendet, welche die folgende Bedeutung haben: A = Alanin; R = Arginin; N = Asparagin; D = Asparaginsäure; C = Cystein; Q = Glutamin; E = Glutaminsäure; G = Glycin; H = Histidin; I = Isoleucin; L = Leucin; K = Lysin; M = Methionin; F = Phenylalanin; P = Prolin; S = Serin; T = Threonin; W = Tryptophan; Y = Tyrosin und V = Valin. Die Zählung der Aminosäuresequenz beginnt mit A-1, der ersten Aminosäure nach der 19-Aminosäure langen-Signalsequenz. Die letzte Aminosäure von Faktor VIII ist Y-2332. Diese Zählweise wird in der gesamten Beschreibung verwendet. Faktor VIII-ähnliche Materialien, einschließlich Faktor VIII-Fragmente, Mutanten der Polypeptide als auch Fusionspeptide, die funktionelle Anteile des Faktors VIII mit der biologischen Aktivität des intakten Faktors VIII enthalten, einschließlich der Blutgerinnungsaktivität, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen Congeners von Faktor VIII, nämlich Verbindungen mit mindestens einer biologischen Aktivität von Faktor VIII und mit mindestens einer Aminosäuresequenz mit der im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz wie Faktor VIII. Die Congener können eine größere oder kleinere Aminosäuresequenz als Faktor VIII haben. Die biologische Aktivität umfaßt die Fähigkeit, bei Verabreichung an Patienten mit Hämophilie A den Gerinnungseffekt und/oder die immunologische Kreuzaktivität mit natürlich vorkommendem Faktor VIII auszugleichen. Der Ausgleich kann daher bewerkstelligt werden entweder durch direkte Wirkung in der Gerinnungskaskade oder durch Bindung an Antikörper gegen Faktor VIII, so daß die biologische Aktivität von anschließend verabreichtem Faktor VIII weniger beeinträchtigt ist. Der Begriff "immunologische Kreuzreaktivität" soll bedeuten, daß ein durch ein neues Polypeptid gemäß der Erfindung induzierter Antikörper mit intaktem Faktor VIII kreuzreagiert. Das Polypeptid hat mindestens eine biologisch aktive Sequenz, z.B. eine immunologische oder epitope, und kann mehr als eine biologisch aktive Sequenz aufweisen, wobei eine solche Sequenz mit einem natürlich vorkommenden Produkt in seinen biologischen Eigenschaften vergleichbar sein kann.
Neue Polypeptide von Interesse haben zum großen Teil eine Formel, die eine n-terminale Region, NR, eine Rückenregion LR und eine C-terminale Region, CR, umfassen. NR ist gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen einer fortlaufenden Sequenz entspricht, die in der Aminosäuresequenz A-1 bis R-740 der gesamten Länge von Faktor VIII (der "A1A2-Domäne" oder 92kDa Polypeptid) entspricht, worin nicht mehr als 45 %, im allgemeinen nicht mehr als 20 %, vorzugsweise nicht mehr als 10 %, besonders bevorzugt nicht mehr als 5 % der Aminosäuren in der A1A2-Domäne deletiert wurden. Bevorzugte Sequenzen entsprechend im wesentlichen der Sequenz A-1 bis D712 oder A-1 bis R-740.
LR kann eine kurze Verbindungsgruppe von 1 bis 20 Aminosäuren, eine Bindung oder irgendeine Aminosäuresequenz sein, die im allgemeinen unwesentlich ähnlich der Sequenz der "B-Domäne" der gesamten Länge des Faktor VIII-Proteins ist. Sie kann auch Sequenzen, die den im wesentliche nahe aufeinanderfolgenden Sequenzen in der B-Domäne entsprechen, umfassen oder irgendeinen Teil davon.
CR ist gekennzeichnet als Aminosäuresequenz, die im wesentlichen ähnlich einer aufeinanderfolgenden Sequenz ist, die in der Sequenz von Faktor VIII gefunden wird, welche die Aminosäuren Ser-1669 bis Tyr-2332 umfaßt, worin nicht mehr als 25 %, im allgemeinen nicht mehr als 20 %, vorzugsweise nicht mehr als 10 %, der Aminosäuren S-1669 bis Y-2332 deletiert worden sind. Die Sequenz umfaßt vorzugsweise Sequenzen entsprechend im wesentlichen den Faktor VIII-Sequenzen S-1669 bis Y-2332 und S-1690 bis Y-2332.
Die fraglichen Polypeptide können Fragmente von Faktor VIII sein, worin bis zu 75 % der Aminosäuren aus der gesamten Länge des Fakors VIII deletiert wurden, oder Fusionsproteine, worin das 92 kDa-Protein oder ein Fragment davon an das 80 kDa-Polypeptid oder ein Fragment davon fusioniert ist. Es sind im allgemeinen nicht mehr als ca. 75 % der Aminosäuren deletiert, normalerweise nicht mehr als 45 % der Aminosäuren, insbesondere nicht mehr als ca. 40 % der Aminosäuren.
Zur Vermittlung der Immunogenizität können die Faktor VIII-Congeners covalent an eine große immunogene Polypeptideinheit verknüpft werden. Beispiele solcher immunogenen Einheiten sind Rinderserumalbumin, "Keyhole- Limpet"-Hämocyanin (KLH) und ähnliche. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich zur Induzierung von Antikörper in einem geeigneten Wirtsorganismus. Die Antikörper können zur Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit und/oder der Konzentration von Faktor VIII in einer Körperflüssigkeit verwendet werden, wobei das Fehlen des Faktors auf Hämophilie A hindeutet.

Herstellung der Congener von Faktor VIII

Faktor VIII-Congener können auf eine Vielzahl von Arten erhalten werden. Sie können durch proteolytische Spaltung der gesamten Länge des Faktors VIII in drei Regionen, vorzugsweise durch Spaltung vor Arg-740 und Ser-1669 und anschließender Verkürzung des Aminosäure- oder Carboxylterminus der Ala-1- bis Pro-729-Sequenz um mindestens eine Aminosäure und/oder Verkürzung des Amino- oder Carboxylterminus der Sequenz Ser-1669 bis Tyr-2332 um mindestens eine Aminosäure gleichzeitig erhalten werden. Die erhaltenen Polypeptidfragmente können dann direkt oder über eine zentrale Verknüpfungsgruppe fusioniert werden, oder Fragmente können in einer Zusammensetzung vereinigt werden, um Faktor VIII-Aktivität bereitzustellen.
Die Faktor VIII-Congener, einschließlich Fusionsproteine, bei denen die NR und CR fusioniert sind, können ebenfalls durch rekombinante DNA- Techniken hergestellt werden. Techniken, die zur Isolierung des Faktor VIII-Gens benutzt werden, sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich Synthese, Isolierung aus genomischer DNA, Herstellung von cDNA oder Kombinationen davon. Die verschiedenen Techniken zur Manipulation der Gene sind bekannt und umfassen Restriktion, Verdau, Resektion, Ligation, in vitro-Mutagenese, Primer-Reparatur und Polylinker und Adapter und ähnliche. Siehe Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Im allgemeinen umfaßt das Verfahren die Herstellung einer genomischen Bank aus Zellen, die Faktor VIII synthetisieren. Zur Verbesserung der Wahrscheinlichkeit für die Identizierung der korrekten Sequenz kann eine cDNA-Bank aus Zellen, die keinen Faktor VIII produzieren, zur Kreuz- Hybridisierung verwendet werden. Ein Test für die Expression von Faktor VIII unter Verwendung von Restriktionsfragmenten, die in einen prokaryontischen Epxressionsvektor, wie pTZ 18 oder 19, eingefügt sind, und Screenen mit Antikörper auf Faktor VIII unter Nachweis eine kreuzreaktiven Peptidfragmentes oder ähnlichem kann verwendet werden.
Nachdem ein komplettes Gen identifiziert wurde, entweder als cDNA oder als chromosomale DNA, können die erwünschten Deletionen im Strukturgen auf verschiedene Weise erfolgen. Deletionen können erzeugt werden durch enzymatisches Schneiden der gesamten Länge der Faktor VIII cDNA, worauf sich Modifikation und Ligation der gereinigten Fragmente oder ortsgerichtete Mutagenese, insbesondere Loop-out-Mutagenese, wie bei Kramer et al, Nucl. Acids Res. (1984) 12: 9441-9456 beschrieben, anschließt. Das so erhaltene Gen kann dann auf verschiedene Arten, die im Stand der Technik bekannt sind, zur Bewirkung der Expression manipuliert werden.
Es können sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirte eingesetzt werden, die Bakterien, Hefe, Säugerzellen, z.B. CHO-Zellen C127- Zellen, humane "293"-Zellen, Myelom-Zellen oder spezialisierte Zellen, wie Leberzellen und COS-Zellen, umfassen. Daher wird, wo das Gen in einen Wirt expremiert werden soll, der die Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulationsregionen von Faktor VIII erkennt, das gesamte Gen mit seinen Wildtyp-5'- und 3'-Regulationsregionen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt. Es gibt verschiedene Expressionsvektoren, welche Replikationssysteme aus Säugerviren, wie dem SV40-Virus, Epstein- Barr-Virus, Rinder-Papilloma-Virus, Vaccinia-Virus usw., bereitstellen.
Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert werden soll, welcher die natürlich vorkommenden Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulationseinheiten nicht erkennt, sind weitere Maßnahmen erforderlich. Man kennt eine Vielzahl von 3'-transkriptionalen Regulationsregionen, die stromabwärts der Stop-Codons eingefügt werden können. Die nichtkodierende 5'-Region stromaufwärts des Strukturgens kann durch Endonuklease- Restriktion, Bal31-Resektion, oder ähnlichen entfernt werden. Alternativ kann dort, wo eine bequeme Restriktionsstelle in der Nähe des 5'-Terminus des Strukturgens vorliegt, das Strukturgen eingeschränkt werden und ein Adapter zum Verknüpfen des Strukturgens an die Promotorregion eingesetzt werden, wobei der Adapter anstelle der verlorengegangenen Nukleotide des Strukturgens steht.
Verschiedene Strategien können zum Bereitstellen einer Fremdexpressions-Kassette eingesetzt werden, welche in der 5'-3'-Richtung der Transkription umfaßt: eine transkriptionale Regulationsregion und eine translationale Initiationsregion, die ebenfalls Regulationssequenzen einschließt, welche die Induktion der Regulation erlauben, einen offenen Leserahmen, der für die gesamte Länge des Faktors VIII oder ein Congener von Faktor VIII kodiert, einschließlich der Deletionsmutanten-Proteine, vorzugsweise einschließlich einer Sekretions-Leadersequenz, die von der vorgeschlagenen Wirtszelle erkannt wird, und translationale und transkriptionale Terminationsregionen. Die Expressionskassette kann zusätzlich mindestens ein Markergen umfassen. Die Initiations- und Terminationsregionen sind in den Wirtszellen funktional und können entweder homolog (abgeleitet vom ursprünglichen Wirt) oder heterolog (abgeleitet von einer Fremdquelle) oder synthetische DNA-Sequenzen sein. Die Expressionskassette kann daher insgesamt oder teilweise von natürlichen Quellen abgeleitet sein, und entweder ganz oder teilweise von Quellen abgeleitet sein, die homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind. Die verschiedenen DNA-Konstrukte (DNA-Sequenzen, Vektoren, Plasmide, Expressionskassetten) gemäß der Erfindung werden isoliert und/oger gereinigt, oder synthetisiert und sind daher nicht "natürlich vorkommend".
Für eine optimale Genexpression wurde gefunden, daß die Nukleotid- Sequenzen, welche das transiationale Initiations-Codon ATG umgeben, in tierischen Zellen wichtig sind. Zum Beispiel haben Kozak, Microbiol. Reviews (1983) 47: 1-45, intensiv die Wirkung dieser Regionen auf die Expression von Polypeptiden, wie Insulin in COS-Zellen, untersucht. Daher kann es notwendig sein, die Nukleotid-Sequenzen, welche das Initiations- Codon umgeben, zu modifizieren. Dies kann durch ortsspezifische Mutagenese oder durch Fusion des exogenen Gens an die Initiationsregion eines hochexprimierten Gens erfolgen.
Illustrative transkriptionale Regulationsregionen oder Promotoren umfassen für Bakterien den beta-gal-Promotor, den Amylase-Promotor, die lambda-Left und Right-Promotoren, trp- und lac-Promotoren, trp-lac- Fusionspromotor; für Hefe die glykolytischen Enzynpromotoren, wie ADH-1 -2- Promotoren, PGK-Promotor und Lactase-Promotor und ähnliche; für Säugerzellen die frühen und späten SV40-Promotoren, den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, beta-Aktin-Promotor, späte Hauptadenovirus-Promotoren und ähnliche.
In eukaryontischen Zellen können die regulatorischen Sequenzen, z.B. die Cytometalovirus-Verstärker-Sequenz umfassen, welche an eine Promotor- Sequenz fusioniert sein kann, wie z.B. den SV40-Promotor, unter Bildung eines chimerischen Promotors, oder anderswo in der Expressionskassette eingefügt sein, vorzugsweise in großer Nähe zur Promotorsequenz.
Die Expression des Strukturgens kann ebenfalls z.B. durch Tandem- Ligation eines Gens für einen dominanten amplifizierbaren genetischen Marker 5' oder 3' zum Strukturgen und Wachsenlassen der Wirtszelle unter selektiven Bedingungen verstärkt werden. Ein Beispiel für ein amplifizierbares Gen ist das Gen für Dihydrofolat-Reduktase (dhfr), wobei dessen Expression in Zellen erhöht werden kann, die resistent gegen Methotrexat (mtx), einem Folatantagonisten, gemacht wurden. Von Interesse für die Expression in Säugerzellen, wie COS-Zellen, sind Expressionskassetten, die zur Expression von Faktor VIII oder Cogeners davon in der Lage sind, welche einen Metallothionein-Promotor oder den frühen SV40-Transkriptions (Einheitstranskriptions)-Promotor (SVep), insbesondere den Rous Sarcoma Virus-Long Terminal Repeat (RSV-LTR)-Promotor in Tandem mit dem SVep-Promotor verwenden. Beispiele von Promotoren und Promotor/Enhancer-Kombinationen, die in C127-Zellen in Kombination mit Expressionsvektoren gemäß Beispiel 7 verwendet werden können, wurden z.B. von Hurwitz et al, Nucl. Acids Res. (1987) 15: 7137-7153, beschrieben. Für die optimale Expression kann die Einführung eines Introns in die Expressionskassette vorteilhaft sein. Ein Intron im 5'-Teil der mRNA ist bevorzugt.
Zusätzlich kann ein fusioniertes Gen durch Bereitstellung einer 5'- Sequenz zum Strukturgen hergestellt werden, welches einen Sekretionsleader und ein Prozessierungssignal kodiert. Für die Sekretion der Faktor VIII- Polypeptide wird die natürlich vorkommende Faktor VIII-Leadersequenz vorzugsweise verwendet, jedoch können ebenfalls andere Signalsequenzen, einschließlich der Sekretions-Leadersequenzen der Penicillinase, alfa- Faktor, Immunglobulin, T-Zellrezeptoren, äußere Membranproteine, Serumalbumin, Gewebeplasminogen-Aktivator, Insulin, Enzyme des Verdauungstraktes und ähnliche verwendet werden. Zur Fusion eines Sekretionsleaders im richtigen Leserahmen mit einem Strukturgen für Faktor VIII oder einen Congener davon kann der reife Faktor VIII in das Kulturmedium ausgeschieden werden.
Die Terminationsregion kann von der 3'-Region des Gens stammen, von dem die Initiationregion erhalten wurde, oder von einem verschiedenen Gen. Man kennt eine große Anzahl von Terminationsregionen, von denen gefunden wurde, daß sie zufriedenstellend in einer Vielzahl von Wirten aus demselben und verschiedenen Gattungen und Arten funktionieren. Die Terminationsregion kann Sequenzen für die richtige Prozessierung der mRNA in einer Säugerzelle enthalten, z.B. ein kleines Intron und ein Polyadenylierungssignal.
Während der Konstruktion der Expressionskassette werden die verschiedenen DNA-Fragmente im allgemeinen in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert, welcher eine Expansion der DNA, Modifikation der DNA oder Manipulation durch Verknüpfen und Entfernen der Sequenzen, Linker oder ähnlicher erlaubt. Normalerweise sind die Vektoren in der Lage zur Replikation in einer relativ hohen Kopienanzahl zumindestens in E. coli. Es ist eine Anzahl von Vektoren ohne weiteres zur Klonierung erhältlich, einschließlich solcher Vektoren, wie pBR322, pML2, pUC7-pUC7- pUC19, pSP64, pSP65, pSP18, pSP19, pTZ18 und pTZ18R, pTZ19 und pTZ19R und ähnliche.
Die Klonierungsvektoren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen effizienten Replikationsursprung aufweisen, der zumindestens in E.coli funktional ist. Ebenfalls hat der Klonierungsvektor mindestens eine einzelne Restriktionsschnittstelle, im allgemeinen eine Vielzahl von einzelnen Restriktionsschnittstellen, und kann ebenfalls multiple Restriktionsschnittstellen umfassen, insbesondere zwei von den gleichen Restriktionsschnittstellen für die Substitution. Zusätzlich hat der Klonierungsvektor einen oder mehrere Marker, die die Selektion für die Transformation erlauben. Diese Marker stellen normalerweise eine Resistenz gegen cytotoxische Mittel, wie z.B. Antibiotika, Schwermetalle, Toxine oder ähnliche, Komplementation eines auxotrophen Wirts oder Immunität gegen einen Phagen bereit. Durch geeignete Restriktion des Vektors und der Kassette und durch geeignete Modifikation der Enden durch Verkürzen oder Auffüllen der Überhänge, unter Bereitstellung glatter Enden durch Zugabe von Linker und durch Taillieren können komplementäre Enden für die Ligation bereitgestellt werden, und Verknüpfen des Vektors an die Expressionskassette oder eine Komponente davon.
In einigen Fällen wird ein Shuttle-Vektor eingesetzt, wo der Vektor zur Replikation in verschiedenen Wirten, welches verschiedene Replikationssysteme erfordern, in der Lage ist. Vorzugsweise wird ein Simianvirus 40 (SV40)-Replikationsursprung eingesetzt, welcher erlaubt, daß das Plasmid in COS-1 vermehrt wird, wogegen der Rinder-Papilloma-Virus (BPV-1)-Genom zur episomalen Aufrechterhaltung der Expressionsvektoren in C127-Zellen verwendet wird (siehe z.B. Howley et al, Meth. Enzymol. 101: 387-402, 1983).
Die Expressionskassette kann in einem Replikationssystem für episomale Aufrechterhaltung in einem geeigneten zellulären Wirt umfaßt sein, oder kann ohne ein Replikationssystem bereitgestellt werden, wo es in einem Wirtsgenom integriert werden kann. Die Art der Transformation des Wirtsorganismus mit den verschiedenen DNA-Konstrukten ist für diese Erfindung nicht kritisch. Die DNA kann in dem Wirt nach bekannten Verfahren, wie Transformation, unter Verwendung von mit Calciumphosphat präzipitierter DNA, Elektroporation, Transfektion durch In-Kontaktbringen der Zellen mit einem Virus, Mikroinjektion der DNA in Zellen oder ähnlichen eingeführt werden.
Als Wirtsorganismus können normale Primärzellen oder Zellinien, die aus kultiviertem Primärgewebe abgeleitet sind, wie auch mikrobielle Zellen verwendet werden. Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine Säugerzellinie, vorzugsweise Hamster-CHO-Zellen, Maus-C127-Zellen oder humane "293"-Zellen, es können jedoch mikrobielle Zellen, z.B. Hefe, vorzugsweise eine Kluyveromyces-Spezies, oder Bakterien, vorzugsweise eine Bacillus-Spezies, ebenfalls verwendet werden.
Für eine stabile Transformation einer Säugerzellinie mit dem Expressionsvektor, welche den Faktor VIII-Congener kodierende Sequenz enthält, und anschließende Amplifikation des in das Wirtschromosom eingefügten Vektors, sind Chinesische Hamster-Eizellen (CHO) besonders geeignet. Die Transformation umfaßt die Transfektion der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor zusammen mit einem selektierbaren Markergen, wie dhfr oder einem G418(neo-)-Resistenzgen oder ähnlichem, und anschließende Integration in das Chromosom und Selektion nach einer stabilen Transformation.
Ein weiteres Verfahren zur stabilen Transformation für Wirtszelllinien verwendet die Expressionsvektoren, die BPV-1-Sequenzen enthalten. C127-Zellen sind für diesen Zweck gut geeignet. Die Transformation umfaßt die Transfektion der Wirtszellinie mit dem Expressionsvektor, der BPV-1- Sequenzen enthält. Die Transformanten werden durch Bildung von Foci erkannt. Stabile Transformanten werden erzeugt und nach Faktor VIII- Aktivität gescreent unter Verwendung von Kabi-Coatest nach Beispielen 6 und 7. Wird im Gegensatz hierzu die Expression in einem transienten Transformationssystem, wie z.B. COS-1-Zellen mit pSV2-abgeleiteten Expressionsvektoren durchgeführt, gibt es keinen Selektionsschritt. Nachdem das Strukturgen in den geeigneten Wirt eingeführt wurde, kann der Wirt unter Expression des Strukturgens kultiviert werden. Die Wirtszelle kann bis zu einer hohen Dichte in einem geeigneten Medium wachsengelassen werden. Wo der Promotor induzierbar ist, wie z.B. in einem prokaryontischen System, werden dann zulässige Bedingungen eingestellt, z.B. Temperaturveränderung, Erschöpfung oder Überschuß eines metabolischen Produkts oder Nährstoffes oder ähnliches. In einem Säugersystem, wo ein amplifizierbares Gen im Tandem mit dem Strukturgen verwendet wird, werden die geeigneten Maßnahmen für die Amplifikation eingesetzt.
Wenn eine Sekretion bereitgestellt wird, kann das Expressionsprodukt, entweder fusioniert oder nichtfusioniert, aus dem Wachstumsmedium mit üblichen Mitteln isoliert werden. Wenn keine Sekretion vorgesehen ist, können die Wirtszellen geerntet und nach üblichen Verfahren lysiert werden. Dann wird das erwünschte Produkt nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt, z.B. mit Affinitäts-Chromatographie mit immobilisierten Antikörpern, Chromatographie auf Aminohexyl-Sepharose oder ein vermischtes Polyelektrolyt-Verfahren.
Die rekombinanten Produkte können glykosyliert oder nicht-glykosyliert mit der Wildtyp- oder anderer Glykosylierung sein. Die Menge an Glycosylierung hängt teilweise von der Sequenz des bestimmten Peptids, wie auch dem Organismus ab, in dem es produziert wird. Daher führt die Expression des Produktes in E coli-Zellen zu einem unglykosylierten Produkt, während die Expression des Produkts in Säugerzellen zu einem Produkt mit einer Glykosylierung ähnlich dem Wildtyp-Peptid führt.

Verwendungen von Faktor VIII-Congener

Die betreffenden Verbindungen können auf eine Vielzahl von Arten sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt werden. Die betreffenden Verbindungen können als Wirkstoffkomponente in pharmazeutischen Präparationen zur Behandlung von Patienten mit Symptomen von Hämophilie A eingesetzt werden. Mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist jede Zusammensetzung, die an Säugern verabreicht wird, gemeint. Daher ist eine pharmazeutische Präparation mit Faktor VIII-Aktivität eine Präparation, die an einen Säuger unter Linderung der Symptome, die mit Hämophilie A, der Unfähigkeit zur angemessenen Blutgerinnung, einhergehen, verabreicht wird. Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden im allgemeinen die betreffenden Polypeptide mit parenteral verträglichen Vehikeln oder anderen geeigneten Exzipienten nach im Stand der Technik bekannten Verfahren vermischt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können üblicherweise eine sterile, lyophilisierte Präparation des betreffenden Polypeptids sein, welche durch Zugabe einer sterilen Lösung, die für die Herstellung von Lösungen geeignet ist, vorzugsweise isoton mit dem Blut des Empfängers, rekonstituiert wird. Die pharmazeutische Präparation kann als in Einzeleinheit oder Multidosisbehältern angeboten werden, z.B. in versiegelten Ampullen oder Gefäßen.
Die betreffenden Verbindungen können zusätzlich zur Herstellung von Antikörper gegen die betreffenden Verbindungen, die in vivo oder in vitro Anwendung finden, eingesetzt werden. Die Antikörper können auf übliche Arten hergestellt werden, entweder unter Verwendung des betreffenden Polypeptids als Immunogen und Injektion des Polypeptids in einen Säugerwirt, z.B. Maus, Kuh, Ziege, Schaf, Kanninchen usw., insbesondere mit einem Adjuvans, z.B. Freund'schen Adjuvans, Aluminiumhydroxidgel, oder ähnlichen. Der Wirt kann dann ausgeblutet werden, und das Blut für die Isolierung der polyklonalen Antikörper verwendet werden, oder bei der Maus können periphere Blutlymphocyten oder Milzlymphocyten (B-Zellen) zur Fusion mit einer geeigneten Myelomazelle unter Immortalisierung der Chromosomen für die Expression von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die betreffenden Verbindungen sind, eingesetzt werden.
Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper hergestellt werden, die dann für die Diagnose oder den Nachweis des Vorliegens des betreffenden Polypeptids in einer Probe, wie Zellen, oder eine physiologischen Flüssigkeit, z.B. Blut, eingesetzt werden. Fehlender Nachweis des betreffenden Polypeptids kann auf eine Hämophilie A hindeuten.
Sonden, die Sequenzen komplementär zur Faktor VIII-mRNA umfassen, können ebenfalls hergestellt und als diagnostische Hilfsmittel eingesetzt werden, z.B. kann das Vorliegen und/oder die Menge von Faktor VIII-mRNA in einer Zelle zum Nachweis benutzt werden, ob der Patient Faktor VIII produziert, jedoch Antikörper entwickelt, welche seine Aktivität verhindern. Eine Testprobe, die eine Zelle, Gewebeprobe oder Körperflüssigkeit enthält, von der man annimmt, daß sie hybridisierende Sequenzen enthält, kann unter Lysierung aller Zellen behandelt werden, dann mit einem denaturierenden Mittel, wie Guanidinhydrochlond unter Freisetzung einzelstämmiger mRNA behandelt werden. Die mit z.B. 32p oder biotinylierten Nukleotiden markierte Sonde kann dann an die zelluläre mRNA unter Bildung eines doppelsträngiges Komplexes hybridisiert werden, der mittels der Markierung nachgewiesen werden kann. Für einige Zwecke kann es erwünscht sein, die Menge der Faktor VIII-mRNA zu quantifizieren. Dies erfolgt durch Vergleich der Menge der Referenzproben, enthaltend bekannte Mengen an einzelsträngiger Faktor VIII-mRNA nachgewiesener Markierung, mit der Menge der in der Testprobe nachgewiesenen Markierung.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung.

EXPERIMENTELLER TEIL

Es wurden allgemeine Klonierungstechniken verwendet, wie bei Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY, 1982. Alle DNA-modifizierenden Enzyme wurden von üblichen Herstellern bezogen. Sie wurden nach den Herstellerangaben eingesetzt. Materialien und die Apparatur zur DNA-Reinigung und Auftrennung wurden nach Herstellerangaben betrieben.

Beispiel 1

Konstruktion des Expressionsvektors pCLB201

pCLB201 ist ein Expressionsvektor, der den RSV-LTR-Promotor in der richtigen Orientierung für die transkriptionale Initiation und die gesamte Länge der Faktor VIII-cDNA (siehe Figur 2) enthält. Er ist vom pSV2-Vektor von Mulligan und Ber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 2072, abgeleitet.
Die einzelne HindIII-Schnittstelle des Plasmids pSV2.tPA (Van Zonneveld et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 4670-4674) wurde in eine SalI-Schnittstelle unter Glätten der HindIII überhängenden Enden und Ligation der SalI-Linker (5'-CGTCGACG-3') in glatte Enden modifiziert. Ein Plasmid, das eine SalI-Schnittstelle enthielt wurde selektiert und als pCLB91 identifiziert. Dieses Plasmid ist das gleiche wie pSV2.tPA mit Ausnahme, daß es einen SalI-Linker, eingefügt in die HindIII-Schnittstelle, enthält.
Die Isolierung der Faktor VIII-mRNA aus humaner Leber und Herstellung und Reinigung und Identifikation ihrer cDNA und Einbau in das Plasmid pEP121, was zum Plasmid pCLB89 führt, wurde in der Patentanmeldung EP 0253455 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme voll eingeschlossen sein soll. Ein 7440 bp langes SalI-HpaI-Fragment aus pCLB89, enthaltend die Faktor VIII-cDNA (siehe Figur 1), wurde gereinigt und in mit SalI und BglII verdautes pCLB91 eingefügt. Der erhaltene Expressionsvektor pCLB200 enthielt eine intakte SalI-Schnittstelle, wobei die HpaI- Schnittstelle in die BglII-Schnittstelle, die aufgefüllt worden war, ligatisiert wurde.
Das mit pRSVneo (Gorman, DNA Cloning, 1985, ed., D. Glover, IRL-press, Washington, Oxford, Seiten 143-169) wurde mit NdeI und HindIII verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase unter Erzeugung glatter Enden und dem 0,6 kb Fragment, enthaltend eine Rous Sarsoma Virus-Long Terminal Repeat (RSV-LTR)-Sequenz isoliert und in die SalI-Schnittstelle von pCLB200 eingefügt, die in ähnlicher Weise unter Bildung des Expressionsvektors pCLB201 (siehe Figur 2) glatt gemacht worden war.

Beispiel 2

Konstruktion von pCLB202

Eine Deletionsmutante von Faktor VIII mit einer Deletion aus der PstI- Schnittstelle bei der Nukleotid-Sequenzposition 2660 (siehe Figur 3b) in die BamHI-Schnittstelle an Position 4749 (siehe Figur 3b) wurde im Plasmid pGB860 wie in der Patentanmeldung EP 0253455 beschrieben, konstruiert. Die Faktor VIII DNA in pGB85660 hatte eine Deletion der DNA, welche für die 695 Aminosäuren in der Zentralregion kodierte.
Expressionsvektor pCLB202 wurde von pGB860 und pCLB201 abgeleitet. Beide Plasmide wurde mit KpnI und XbaI-Restriktionsenzymen verdaut. Das 3,1 jb KpnI-XbaI-Fragment in pCGB60 wurde in das 7 kb KpnI-XbaI-Fragment von pCLB201 ligatisiert. Das erhaltene Plasmid pCLB202 hatte intakte KpnI- und XbaI-Schnittstellen. Seine Struktur ist in Figur 3e wiedergegeben.

Beispiel 3

Konstruktion von pCLB203

(A) pCLB100:

Das SalI-HpaI 7440 bp-Fragment (siehe Figur 2) aus pCLB89 wurde in das Plasmid pSP64 eingefügt (Melton et al, Nucleic Acids Res. (1984) 12: 7035- 7056) welches mit SalI und SmaI gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid pCLB100 enthielt eine intakte SalI-Schnittstelle und das HpaI-Ende verknüpft an das SmaI-Ende.
(B) pCLB101: (Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf Figur 1)
(1) Plasmid pCLB100 wurde mit KpnI und Tth111I verdaut, was zu einem 631 bp-Fragment führte: KpnI (1817) bis Tth111I (2447). Das 631 bp-Fragment wurde gereinigt, dann mit MaeIII (2199) geschnitten. Die MaeIII überhängenden Enden wurden aufgefüllt, was zu einem 383 bp-Fragment führte.
(2) Plasmid pCLB100 wurde mit ApaI und BanI verdaut. Das 669 bp ApaI (6200)-BanI (5532)-Fragment wurde isoliert.
(3) Plasmid pCLB100 wurde mit HgiAI unter Bereitstellung eines HGiAI-Fragments mit 634 bp verdaut. Das Fragment wurde mit T4-DNA- Polymerase unter Herstellung glatter Enden inkubiert, dann mit BanI unter Bereitstellung eines 565 bp-Fragments verdaut.
(4) Plasmid pCLB100 wurde mit ApaI und KpnI verdaut, welches ein 5,9 kb langes Fragment (ApaI (6200) bis KpnI (1817)) erzeugte, das die Vektorsequenzen für die Aufrechterhaltung und Vermehrung in E. coli enthielt.
(5) Die in den Schritten (1) bis (4) erhaltenen Fragmente wurde gereinigt, und äquimolare Menge der Fragmente und ein zehnfacher Überschuß an MluI-Linker (CCACGCGTGG) wurde ligatisiert, wodurch Plasmid pCLB101 erzeugt wurde. Das Plasmid pCLB101 enthielt einen MluI-Linker zwischen den MaeIII- und HgiAI-Schnittstellen (siehe Figur 3b) zusätzlich zu den KpnI-, BanI- und ApaI-Schnittstellen. Vier zusätzliche Aminosäuren (P-R-V-A) zwischen den Aminosäuren D-712 und Q-1638 (Figur 1) sind in Figur 3f gezeigt.

(C) pCLB203:

pCLB101 und pCLB201 wurden mit den Enzymen KpnI und XbaI verdaut. Das 2,4 kg KpnI-XbaI-Fragment aus pCLB101 wurde an das 7,0 kb KpnI-XbaI- Fragment, abgeleitet aus pCLB200, ligatisiert. Das erhaltene Plasmid pCLB203 besaß intakte KpnI- und XbaI-Schnittstellen. Seine Struktur ist in Figur 3f wiedergegeben.

Beispiel 4

Konstruktion von pCLB212

pCLB212 wurde unter Verwendung der Loop-out-Mutagenese-Technik, wie bei Kramer et al, (1984) Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456, beschrieben, konstruiert. Die Deletionsmutagenese der zentralen Region von Faktor VIII- cDNA erfolgte unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:

Primer IV

3' TTC.CAA.AGA.TCA.ACA.CTG.GTT.TTG.GGT.GGT.CAG.AAC 5' zur Herstellung in Faktor VIII-cDNA interner Deletion der Sequenzen kodierend für die Aminosäuren Lys 713 bis Ser-1637.
Das entsprechende Protein enthält eine interne Deletion von 925 Aminosäureresten im Vergleich zur gesamten Länge des Faktor VIII-Proteins.
Um ein Zielfragment für die Loop-out-Mutagenese zu gewinnen, wurde ein HindIII-PstI-Fragment von 1,4 kb, abgeleitet aus pCLB203 (Beispiel 3) selektiert. Die Nukleotidposition (Figur 1) der HindIII-Schnittstelle liegt an 1025 in der gesamten Länge der Faktor VIII-Sequenz stromaufwärts der zu modifizierenden Region, die PstI-Schnittstelle liegt an Position 5165 stromabwärts der Region. Diese Stellen sind in Figur 2 angegeben. Das 1,4 kb Fragment wurde in M13mp9 subkloniert, worauf die Loop-out-Mutagenese folgte.
Nach Selektion des Fragments mit der genauen Deletion erfolgte die Insertion des KpnI-PstI-Teils des HindIII-PstI-Fragments, enthaltend die erwünschte Deletion, in einen geeigneten Expressionsvektor unter Herstellung von Fragmenten mit überhängenden einzelnen Restriktions- Enzymenden (die Ziffern beziehen sich auf Figur 1) nach den folgenden Schritten:
Schritt 1. Zur Herstellung der Mutant-Faktor VIII-Moleküle wurde ein neues Plasmid pCLB211 konstruiert. Das SalI-HpaI-Fragment von 7440 bp (Figur 1), abgeleitet aus pCLB89, wurde in den Expressionsvektor pSVL (Pharmacia, Nr. 27-4509-01, Uppsala, Schweden) eingefügt, was die Transkription von einem späten SV40-Promotor in Säugerzellen ermöglichte. Das Plasmid pSVL wurde mit XhoI und SmaI gespalten. Das erhaltene Plasmid pCLB211 enthält ein XhoI-Ende, das in ein SalI-Ende verknüpft ist, da beide 5'-überstehenden Enden dieser Enzyme identisch sind, und das an das HpaI- Ende verknüpfte SmaI-Ende.
Schritt 2. Plasmid pCLB211 wurde mit ApaI und SalI verdaut. Das 1,4 kg ApaI(6200)-SalI(einzeln im pSVL-Teil von pCLB211)-Fragment wurde isoliert.
Schritt 3. Plasmid pCLB100 wurde mit NdeI, PstI und ApaI verdaut. Es wurden zwei Fragment isoliert: ein PstI(5165)-NdeI(5527)- Fragment mit 363 bp und ein zweites Fragment, NdeI(5527)-ApaI(6200) mit 674 bp.
Schritt 4. Plasmid pCLB100 wurde mit KnpI und SacI verdaut. Es wurde ein KpnI(1817)-SacI(19) mit 1799 bp isoliert.
Schritt 5. Plasmid pCLB211 wurde mit SalI und SacI verdaut. Es wurde ein 4,5 kb SalI(einzeln im pSVL-Vektor)-SacI(19)-Fragment erhalten.
Schritt 6. Ein M13-Bakteriophage, der ein HindIII(1025)- PstI(5165)-Fragment mit der erwünschten Deletion enthielt, bestätigt durch Sequenzanalyse, wurde mit KpnI und PstI verdaut. Es wurde ein 584 bp PstI(5165) -KpnI(1819)-Fragment isoliert.
Schritt 7. Die sechs isolierten Fragmente aus den Schritten 2 bis 6 wurden in äquimolaren Mengen vermischt und ligatisiert. Ein Plasmid, das alle sechs Fragmente enthielt, wurde selektiert. Das Plasmid pCLB212 exprimierte die Beispielsverbindung 3b (Tabelle II). Die Verbindung 3b unterscheidet sich von Verbindung 3 (erläutert in Figur 3f), da ihr der MluI-Linker und die entsprechenden vier Aminosäuren fehlt.

Beispiel 5

Konstruktion von pCLB208, pCLB209 und pCLB210

pCLB208, pCLB209 und pCLB210 wurden unter Verwendung der in Kramer et al, Nucleic Acids Res. (1984) 12: 9441-9456 beschriebenen Loop-out- Mutagenese-Technik konstruiert.

(a) Loop-out-Mutagenese

Deletionsmutagenese der zentralen Region der Faktor VIII-cDNA erfolgte unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:

Primer 1:

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.CTT.TAT.TGA.GCA.TGA.TGA 5'

Primer II.

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.AGT.CAA.CTT.TAC.TTC.TTC 5'

Primer III:

3' TTA.CGG.TAA.CTT.GGT.TCT.TCG.AAA.GTT.TTC.TTT.TGT 5'
unter Herstellung interner Deletionen in der Faktor VIII-cDNA der für die Aminosäuren S-741 bis R-1648 (Primer 1), S-741 bis I-1668 (Primer II) und S-741 bis R-1689 (Primer III) kodierenden Sequenzen. Die entsprechenden Proteine enthalten interne Deletionen von 908 (I), 928 (II) und 949 (III) Aminosäureresten.

(b) Herstellung der Zielfragmente

Unter Erhalt eines Zielfragments für die Loop-out-Mutagenese wurde ein Fragment mit 0,8 kb, abgeleitet von pCLB101 wie folgt konstruiert.
Plasmid pCLB101 wurde mit EcoRI verdaut, die EcoRI-Schnittstellen wurden aufgefüllt, und es folgte ein weiterer Verdau mit KpnI. Ein 479 bp KpnI (1819) -EcoRI (2297)-Fragment (die Zahlen der Nukleotid-Positionen sind wie in Figur 1 beschrieben) wurde isoliert. Plasmid pCLB101 wurde mit BamHI verdaut; die überlappenden Enden wurden aufgefüllt, und ein weiterer Verdau mit PstI folgte. Ein 416 bp BamHI(4749)-PstI(5165)-Fragment wurde isoliert. Diese Fragmente wurden in äquimolaren Mengen ligatisiert und in M13mp19- Amber subkloniert. Der M13-Bakteriophage, der ein KpnI-PstI-Fragment von 895 bp von 1819 stromaufwärts von der zu modifizierenden Region bis 5165 stromabwärts von der Region enthielt und mit einer großen Deletion in der Faktor VIII kodierenden Sequenz, wurde für die Loop-out-Mutagenese selektiert. Nach Selektieren des Fragments mit der präzisen, mit Primer I, II oder III im Bakteriophage M13 erhaltenen Deletion wurde das KpnI-PstI- Fragment, das die erwünschte Deletion enthielt, in einen geeigneten Expressionsvektor, abgeleitet aus pCLB211 (siehe Beispiel 4) unter Verwendung der folgenden Schritte und Herstellung von Fragmenten mit überlappenden, einzelnen Restriktionsenzymenden (die Zahlen beziehen sich auf Figur 1) eingefügt:
(1). Plasmid pCLB211 wurde mit ApaI und SalI verdaut. Das 1,4 kb ApaI(6200)-SalI (einzeln im pSVL-Teil von pCLB211)-Fragment wurde isoliert.
(2). Aus Plasmid pCLB100, verdaut mit NdeI, PstI und ApaI, wurde ein 363 bp PstI(5165)-NdeI(5527)-Fragment und ein 674 bp NdeI(5527)- ApaI (6200)-Fragment isoliert.
(3). Plasmid pCLB100 wurde mit KpnI und SacI verdaut, und es wurde ein 1799 bp KpnI(1817)-SacI(19)-Fragment isoliert.
(4). Plasmid pCLB211 wurde mit SalI und SacI verdaut. Das 4,5 kb SalI (einzeln im pSVL-Vektor)-SacI(19)-Fragment wurde isoliert.
(5). Der M13-Bakteriophage, der das Fragment mit der gewünschten Mutation enthielt, wurde mit KpnI und PstI verdaut. Die Kpn-I- PstI-Fragmente, die die erwünschte Mutation enthielt, wurden für alle drei Mutagenesen isoliert.
(6). Die sechs Fragmente von (1) bis (5) (siehe oben) wurden isoliert, in äquimolaren Mengen vermischt und ligatisiert. Plasmide, die alle erwünschten Fragmente enthielten, wurden durch Hybridisierung und Restriktionsenzym-Verdau selektiert. Unter Verwendung der oben gezeigten Primer I, II oder III wurden drei neue Expressionsvektoren zur Expression der in Tabelle I beschriebenen Beispielverbindung konstruiert:
1. pCLB208 für Verbindung 7 mit Primer I;
2. pCLB209 für Verbindung 8 mit Primer II; und
3. pCLB210 für Verbindung 9 mit Primer III.

Beispiel 6

A. Transiente Expression rekombinanter Faktor VIII-DNA und Test auf produzierte Proteine

A. Transfektion von COS-1-Zellen und metabolische Markierung

Die nach den vorhergehenden Beispielen erhaltenen Expressionsvektoren wurden in COS-1-Zellen unter Verwendung einer DEAE-Transfektions-Technik eingeführt. Vektor DNA wurde durch Inkubation mit DEAE-Dextran für 2 Stunden präzipitiert, worauf Behandlung mit Chlorochin-Schock für 2 Stunden, wie bei Lopata et al, Nucleic Acids Res. 12, 5707, (1984) und Luthman und Magnusson, Nucleic Acids Res. (1983) 11:1295, beschrieben, folgte. Das für das Wachstum der COS-1-Zellen und auch für das konditionierte Medium verwendete Medium war Iscove's DMEM (Flow), ergänzt mit 10 % (v/v) Hitze inaktiviertem fötalen Kalbsserum (Flow). Das Medium wurde nach 48 Stunden nach Transfektion ausgetauscht. Das konditionierte Medium wurde 48 Stunden später gesammelt.
Metabolische Markierung der Proteine in den transfektierten Zellen erfolgte unter Verwendung von serumfreien RPMI-Medium (Gibco). Zwei Tage nach Transfektion wurden die Transfektanten 4 Stunden mit 50 µCi/ml L-³&sup5;S- Methionin (Amersham, 1985; 370 MBeQ/330 µl; spezifische Aktivität: über 100 Ci/mMol) inkubiert, worauf sich Inkubation über Nacht mit 1 mM L-Methionin vor Ernten des konditionierten Mediums anschloß. Um den Proteinabbau zu unterdrücken, wurden Protease-Inhibitoren, wie Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zum konditionierten Medium nach der Ernte zugegeben. Zur Inhibierung der Protein-Glykosylierung kann Tunicamycin zum konditionierten Medium zugegeben werden (Endkonzentration 0,001 mg/ml). Die konditionierten Medien wurden 4 Tage nach Transfektion geerntet; die produzierten Proteine wurden getestet.

B. Biologische Aktivität von rekombinantem Faktor VIII

Das konditionierte Medium wurde auf Faktor VIII-Aktivität unter Verwendung (1) des Standard-Koagulation- oder Gerinnungs-Tests und (2) des chromogenen Aktivitätstests (Kabi Coatest) getestet.
Der Standard-Koagulations- oder Gerinnungs-Test (sogenannte partielle aktivierte Thromboplastinzeit) erfolgte unter Verwendung von Hämophilie- Plasma, wie von Veldkamp et al, Thromb. Diath. Haemorrh. (1968) 19:279, beschrieben. Das konditionierte Medium wurde vor der Überprüfung citratisiert.
Der chromogene Aktivitäts- oder Kabi Coatest erfolgte nach den Verfahren gemäß Hersteller Kabi-Vitrum, mit der Ausnahme, daß alle vorgeschriebenen Volumeneinheiten durch vier geteilt wurden, und 25 pl konditioniertes Medium getestet wurde. Die Faktor VIII-ähnlichen Proteine wurden 15 min aktiviert, worauf das chromogene Substrat (S2222) zugegeben wurde.
Inhibierung von Faktor VIII-Aktivität wurde nach dem Standard- Bethesda-Protokoll gemessen (Kaspar et al, Thromb. Diath. Haemorrh. (1975) 34: 869-871, gemessen. Die verwendeten Immunglobuline wurden durch Ionenaustausch und Protein-A-Sepharose-Chromatographie vor der Verwendung gereinigt.
Der Standard für die biologischen Aktivitätstests für Faktor VIII war ein Pool von citriertem Plasma (0,5 mM Endkonzentration), von dem man annahm, daß er eine Einheit Faktor VIII-Aktivität oder Antigen pro ml enthielt.
Die biologische Aktivität für verschiedene der Deletionsproteine ist in Tabelle II gezeigt.
Mutationsproteine mit Deletionen zeigten Faktor VIII- Gerinnungsaktivität.
Zusätzlich schien die gemessene Aktivität der rekombinanten Proteinlösung nach Zugabe von Antikörpern, die als Inhibitoren der Plasma- abgeleiteten Faktor VIII-Aktivität bekannt sind, und/oder von sogenannten Inhibitorseren, erhalten aus Patienten mit Inhibitoren, z.B. Antikörper gegen Faktor VIII, in ihrem Blut, inhibiert zu sein.

C. Immunologische Kreuz-Reaktivität mit Faktor VIII

(1) Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem humanem Faktor VIII - von Willebrand-Faktor-Komplex, erhalten durch Agarose-Gelfitration von Cryopräzipitat eines Faktor-VIII-Konzentrats, das für therapeutische Zwecke verwendet wurde (Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands), Van Mourik und Mochtar, Biochim. Biophys. Acta 221: 677-679 (1970) immunisiert. Die Lymphocyten- Hybridizierung erfolgte wie bei Galfre et al, Nature (1977) 266: 550-552, beschrieben. Die Beschreibung der für die Selektion von monoklonalen Antikörpern gegen Faktor VIII produzierenden Klone verwendeten Techniken finden sich an anderer Stelle (Stel, 1984, Ph. D. Thesis, University of Amsterdam, The Netherlands) . Die monoklonalen Antikörper gegen Faktor VIII wurden aufgrund ihrer Reaktivität mit Faktor VIII-Polypeptiden, wie in der europäischen Patentanmeldung EP 0253455 beschrieben, identifiziert.

(2) Polyklonale Antikörper gegen Faktor VIII-Polypetide

Kanninchen wurden nach Standardverfahren mit einer Faktor VIII- Präparation immunisiert, die mit Chromatographie gereinigt wurde (Stel, supra). Die so erhaltenen Antikörper wurden durch Immunblotten, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung EP 0253455, unter Verwendung von gereinigtem Faktor VIII-von Willebrand-Faktor oder gereinigten Polypeptiden identifiziert. Die Antikörper wurden mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert, dann auf Nitrocellulosefolien als Zielproteine übertragen. Drei unterschiedliche polyklonale Antiseren wurden erhalten: RH 63271, RH 63272 und RH 63275. Die Antiseren reagierten mit dem 80 kDa-Doublett, 92 kDa Polypeptid und größeren Polypeptiden. Diese Antiseren reagierten auch mit kleineren Fragmenten von Factor VIII.

(3) ELISA

Ein neuentwickelter ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) wurde zum Nachweis von Faktor VIII-Antigen in dem konditionierten Medium verwendet. Das Verfahren ist wie folgt. Die ELISA-Platten wurden durch Zugabe von 200 µl/Well von einer geeigneten Verdünnung des spezifischen Faktor VIII-monoklonalen Antikörpers CLB.CAgA (5 mg/l) in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,8, beschichtet. Die Platten wurden versiegelt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Zwischen allen Inkubationen wurden die Platten dreimal mit PBS, enthaltend 0,05 % Tween-20, gewaschen, was auf den Platten mindestens für eine Minute stehengelassen wurde.
Eine Verdünnungsreihe der Testproben oder von normalem Plasma wurden in die Wells (200 µl/Well) in Doppelbestimmungen pipettiert. Die Platten wurden versiegelt und bei 37ºC 2 Stunden ohne Rühren inkubiert, anschließend wie oben beschrieben, gewaschen. Für die Verdünnung des Antigens wurde ein Puffer verwendet, der 50 mM Tris-HCl-Puffer, 2 % Rinder- Serumalbumin und 1,0 M Natriumchlorid, pH 7,4, enthielt.
CLB-CAg117-Meerettich-Peroxidasekonjugate wurden ca. 10.000-fach (je nach der erforderlichen Empfindlichkeit) in einem Puffer, der 50 mM Tris- HCL-Puffer, 0,2 µl Tween-20 und 1,0 M Natriumchlorid, pH 7,4, enthielt, verdünnt. Von dieser Lösung wurden 200 µl zu jedem Weh gegeben, die Platten wurde versiegelt und 2 Stunden bei 37ºC im Dunklen inkubiert.
Nach Waschen der Platten, wie oben beschrieben, wurden 150 µl einer frischbereiteten Lösung von Tetramethylbenzidin (TMB) (0,1 g/l) und Wasserstoffperoxid (0,006 %) in 0,1 M Acetat/Zitronensäurepuffer, pH 5,5, in jedes Well zugegeben. Die Platten wurden 30 min im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 150 µl 2N Schwefelsäure abgebrochen. Die Adsorption wurde nachgewiesen bei 450 nm mit einem ELISA-Microreader. Wie in Tabelle II gezeigt, erfolgte ein Anstieg der Faktor VIII-Aktivität von aufeinanderfolgendem konditioniertem Medium, was ca. proportional zum Anstieg der Menge an Faktor VIII-Proteinen im Medium war.

D. Größenbestimmung

Die Größe der produzierten Faktor VIII-Proteine wurde unter Verwendung von Gelelektrophorese wie folgt bestimmt.
Die monoklonalen und polyklonalen gegen Plasma abgeleiteten Faktor VIII erzeugten Seren wurden für die Immunpräzipitation verwendet. Die Antikörper wurden auf Protein-A-Sepharose (15 µl Serum pro 10 mg Protein-A- Sepharose) immobilisiert, dann mit den metabolisch markierten rekombinanten Faktor VIII-ähnlichen Verbindungen inkubiert. Die immobilisierten rekombinanten Proteine wurden unter Verwendung von 10 % beta- Mercaptoethanol reduziert, dann auf einem 5 % Polyacrylamid SDS- Gelelektrophorese-System (Laemmli, Nature (1972) 227: 680-685) aufgetrennt. Wie in Figur 4 und Tabelle III gezeigt, haben die rekombinanten Faktor VIII-ähnlichen Proteine die Größe, die für glykosylierte Proteine erwartet wurde. Die kleineren Banden waren ebenfalls in der Kontrollbahn vorhanden.
Auf Grundlage der in Tabelle III vorgestellten Ergebnisse kann ebenfalls der Schluß gezogen werden, daß die rekombinanten Faktor VIII- ähnlichen Proteine der Erfindung glykosyliert sind, da ein bedeutender Unterschied zwischen der Größe der in einem Medium mit und ohne Tunicamycin, einem bekannten Inhibitor der Asparagin-verknüpften Glykosylierung, gebildeten Proteine auftritt.

Beispiel 7

Konstruktion von stabilen Zellinien, die Proteine mit Faktor VIII-Aktivität produzieren

A. Expression in CHO-Zellen

Die Plasmide pCLB203 (10 µg) und pAdD26SV(A)-3 (1 µg, Kaufman und Sharp, Mol. Cell Biol. (1982) 2: 1304-1319) wurden in dhfr-defekte CHO- Zellen (Chasin und Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:4216-4220) unter Anwendung der Calciumphosphat-Präzipitationstechnik (Graham und Van der Eb, Virology (1973) 52: 456-467) eingeschleust. Die Amplifikation von Faktor VIII und dhfr-codierenden Sequenzen erfolgte durch schrittweise Verabreichung von steigenden Konzentrationen von Methotrexat (mtx), wie von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. (1982) 159: 601-621, beschrieben. Unabhängige, gegen 200 nM mtx resistente Transformanten wurden aufgenommen und als stabile Zellinien etabliert. Mehrere dieser Zellinien produzierten ca. 75 meinheiten Faktor VIII-Aktivität/ml Kulturmedium. Die Menge an Faktor VIII-Aktivität, die in das Kulturmedium ausgeschieden wurde, konnte ferner durch weitere Amplifikation der Faktor VIII-kodierenden Sequenzen unter Verwendung von mtx in ansteigenden Konzentrationen amplifiziert werden.

B. Expression in C127-Zellen

Wie oben beschrieben, können Expressionsvektoren in eukaryontische Zellen eingefügt werden, wo sie sich in das Genom der Wirtszelle integrieren. Anschließend können die Expressionskassetten amplifiziert werden. Eine Alternative zur Integration des Expressionsvektors ist seine stabile Aufrechterhaltung als Episom. Ein Beispiel für das Letzere ist die Expression von einem "mutierten" Faktor VIII-Protein unter Verwendung des episomalen BPV-Systems (Howley et al, Meth. Enzymol. (1983) 101: 387-402). Das BPV-1-Genom (BamHI-gespalten) wurde zunächst in ein BamHI-gespaltenes Derivat von pTZ18R (Pharmacia), welches XhoI-Schnittstellen auf beiden Seiten der BamHI-Schnittstelle enthält, eingeführt. Anschließend wurde das erhaltene pTZX-BPV-Plasmid unter Verwendung von XhoI gespalten, was ein 2,9 kb pTZ-Fragment und ein 8 kb BPV-Fragment mit XhoI-überstehenden Enden ergab. Das letztere Fragment wurde in Plasmid pCLB212 ligatisiert, welches an seiner einzelnen SalI-Schnittstelle (bei Position 2040 im ursprünglichen pSVL-Vektor) gespalten worden war. Der erhaltene Expressionsvektor pG881 enthält den späten SV40-Promotor, Faktor VIII-cDNA-kodierende Sequenz, der 2775 bp fehlen (hauptsächlich von der B-Domäne) und das späte SV40- Polyadenylierungssignal. Aufgrund der Anwesenheit des BPV-Genoms kann dieser Vektor als Episom in geeigneten Wirtszellen, wie Maus-C127-Zellen, aufrechterhalten werden.
Plasmid pCB831 (10 µg) wurde in C127-Zellen unter Anwendung der Calciumphosphat-Präzipitationstechnik transfektiert. (Graham und Van der Eb, supra). Foci wurden 14 Tage nach Transfektion isoliert, und es wurden anschließend stabile Zellinien etabliert. Mehrere Zellinien produzierten 40 meinheiten Faktor VIII-Aktivität/ml Kulturmedium.

Beispiel 8

Konstruktion von pCLB204

pCLB204 wurde unter Anwendung der Loop-out-Mutagenese-Technik, wie bei Kramer et al (1984) (siehe Allgemeine Methoden, 2) beschrieben, konstruiert. Die Deletions-Mutagenese der zentralen Region der Faktor VIII- cDNA erfolgte unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:

Primer V:

3' TAG.GTT.TAA.GCG.AGT.CAA.GTT.TTG.GGT.GGT.CAG.AAC 5'
unter Herstellung von internen Faktor VIII-cDNA-Deletionen von Sequenzen, die für die Aminosäuren Ala-375 bis Ser-1637 kodieren (Primer V).
Das entsprechende Protein enthält interne Deletionen von 1263 Aminosäuren.
Für den Erhalt eines Zielfragments für die Loop-out-Mutagenese wurde ein HindIII-PstI-Fragment zu 1,4 kb, abgeleitet aus pCLB203 (Beispiel 3) selektiert. Die Nukleotid-Position (Figur 1) der HindIII-Schnittstelle ist bei 1025 in der gesamten Länge der Faktor VIII-Sequenz stromaufwärts der zu modifizierenden Region; die PstI-Schnittstelle liegt an der Position 5165 stromabwärts der Region. Diese Stellen sind in Figur 2 angegeben. Das 1,4 kb-Fragment wurde im M13mp9 subkloniert, worauf Loop-out-Mutagenese folgte. Nach Selektion des Fragments mit der präzisen Deletion, erhalten mit Primer V in Bakteriophage M13, wurde das die erwünschte Deletion enthaltende HindIII-PstI-Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor, abgeleitet von pCLB201, unter Anwendung der folgenden Schritte und Herstellung von Fragmenten mit überhängenden einzelnen Restriktionsenzymenden (die Zahlen beziehen sich auf Figur 1) eingefügt:
Schritt 1. Plasmid pCLB201 wurde mit AvaI und XbaI verdaut, was zur Erzeugung eines Vektor-Fragments - AvaI (737) bis XbaI (6951) - von ca. 6 kb führte.
Schritt 2. Plasmid pCLB201 wurde mit AvaI und HindIII unter Erhalt eines 289 bp langen Fragments: AvaI (737) bis HindIII (1025) verdaut.
Schritt 3. Plasmid pCLB201, verdaut mit PstI und NdeI ergab das Fragment - PstI (5165) bis NdeI (5527) - mit 363 bp.
Schritt 4. Plasmid pCLB201, verdaut mit NdeI und XbaI ergab das Fragment - NdeI (5527) bis XbaI (6951) - mit 1425 bp.
Schritt 5. Der M13 Bakteriophage, der das Fragment mit der erwünschten Mutation enthielt, wurde mit HindIII und PstI verdaut.
Schritt 6. Die fünf Fragmente wurden isoliert, in äquimolaren Mengen vermischt und ligatisiert. Plasmide, die alle Fragmente enthielten, wurden selektiert. Unter Verwendung von Primer V, wie oben gezeigt, wurde ein neuer Expressionsvektor für die Expression der Beispielverbindung, beschrieben in Tabelle 1, konstruiert:
pCLB204 für Verbindung 4 mit Primer V.
Die DNA-Konstrukte und Verfahren gemäß der Erfindung stellen Mittel zur Herstellung von Polypeptiden mit Faktor VIII-Aktivität durch Einführung eines Deletions-Mutantengens, das für einen Faktor VIII-Congener kodiert, in einer Wirtszelle zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden Anwendung für die Behandlung der Symptome von Hämophilie A.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, geben das Wissen des für diese Erfindung zuständigen Fachmanns wieder. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hiermit unter Bezugnahme in einem solchen Ausmaß mitaufgenommen, als ob jede individuelle Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell durch Bezugnahme mitaufgenommen sein soll.
Durch die vollständige Beschreibung der Erfindung ist es dem Fachmann offensichtlich, daß Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der anliegenden Ansprüche abzuweichen.

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T bedeutet ununterbrochene Sequenz von Faktor VIII-Aminosäuren
* Die Anzahl der deleterten Aminosäuren in jeder Region ist im Vergleich zur gesamten Länge von Faktor VIII in den entsprechenden Spalten mit der Überschrift Del wiedergegeben. Die Numerierung der Aminosäuren ist wie in Figur 1 verwendet. Tabelle II Faktor VIII-Aktivität und Proteinmengen
1) siehe Tabelle I; 2) gemäß dem chromogenen Test (Kabi Coatest)
3) Standard-Gerinnungstest; 4) CLB.CAgA, monoklonale Antikörper gegen Faktor VIII (Stel, Ph.D. Thesis, University of Amsterdam, The Netherlands, 1984)
5) aus Serum vom Patienten isolierter Inhibitor
6) Ausgangsaktivität sehr niedrig, um mögliche Inaktiverung zu unterschieden.
7) Konditionierte Medien nach 48stündiger Inkubation. Eine Einheit Faktor VIII entspricht 100 ng Faktor VIII-Protein
8) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); 9) NB = nicht bestimmt Tabelle III Größe der sekretierten Faktor VIII-Proteine
1) Siehe Tabelle I
2) Die Länge ist die Gesamtanzahl an Aminosäuren in der Faktor VIII- kodierenden Sequenz des Expressionsvektors.
3) Deletion bedeutet die Anzahl von Aminosäuren, die aus der kodierenden Sequenz der gesamten Länge des Faktors VIII im entsprechenden Expressionsvektor deletiert wurde.
4) Die Größe in Kilodalton, bestimmt auf Grundlage der bekannten Aminosäurezusammensetzung.
5) Die Größe in Kilodalton, bestimmt durch Immunpräzipitation des markierten Proteins nach Elektrophorese.
6) Die Größe der Proteine in Kilodalton aus Zellen, die in einem Tunicamycin-haltigem Medium wachsengelassen wurden (0,001 mg/ml).

Claims

1. Protein mit biologischer Faktor VIII-Aktivität und mit einer Aminosäuresequenz, entsprechend der Aminosäuresequenz von Faktor VIII mit Ausnahme einer Deletion der Aminosäuresequenz Ser-741 bis Ile-1668.

2. Protein nach Anspruch 1 mit einer Deletion von mindestens einem Teil der Aminosäuresequenz Lys-713 bis Arg-740 und einer Insertion der Aminosäuresequenz Pro-Arg-Val-Ala als Linkersequenz an der Deletionsstelle.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.

4. Expressionsvektor, umfassend, in Transkriptionsrichtung eine transkriptionale regulatorische Region und eine translationale Initiationsregion, die in einer Wirtszelle funktional sind, eine DNA- Sequenz, die für ein Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert, und translationale und transkriptionale Terminationsregionen, die in Wirtszelle funktional sind, worin die Expression der DNA-Sequenz durch die Initiations- und Terminationsregionen reguliert wird.

5. Transformierte Zelle und Progen davon, wobei die Zelle einen Expressionsvektor enthält, der, in Transkriptionsrichtung, eine transkriptionale regulatorische Region und eine translationale Initiationsregion, die in einer Wirtszelle funktional sind, eine DNA- Sequenz, die für ein Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 und translationale und transkriptionale Terminationsregionen, die in der Wirtszelle funktional sind, umfaßt, worin die Expression der DNA-Sequenz durch die Initiationsund Terminationsregionen reguliert wird.

6. Tranformierte Zelle und Progen davon nach Anspruch 5, worin die Zelle eine Säugerzelle ist.

7. Transformierte Zelle und Progen davon nach Anspruch 6, worin die Zelle eine COS-Zelle, eine CEO-Zelle oder eine C127-Zelle ist.

8. Transformierte Zelle und Progen davon gemäß Anspruch 5, worin die Zelle eine prokaryontische oder eine Hefezelle ist.

9. Transformierte Zelle und Progen davon gemäß Anspruch 1, worin die Zelle zur Spezies Bacillus oder Kluyveromyces gehört.

10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches eine Deletionsmutante des Faktors VIII mit biologischen Aktivität des Faktors VIII ist, wobei das Verfahren das Wachsenlassen in einem Nährmedium von einer Wirtszelle, welche einen Expressionsvektor enthält, der in Transkriptionsrichtung, eine transkriptionale regulatorische Region und eine translationale Initiationsregion, die in der Wirtszelle funktional sind, eine DNA-Sequenz, kodierend für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2, und translationale und transkriptionale Terminationsregionen, die in der Wirtszelle funktional sind, umfaßt, worin die Expression der DNA-Sequenz durch die Initiations- und Terminationsregionen reguliert wird, und Isolieren des Proteins umfaßt.

11. Faktor VIII -Mangelsymptom-lindernde Zusammensetzung, umfassend eine symptomlindernde Menge des Proteins, welches eine Deletionsmutante des Faktors VIII mit der biologischen Aktivität des Faktors VIII gemäß Anspruch 1 oder 2 ist, und einen physiologisch verträglichen Träger.