DE3850634T2

DE3850634T2 - Alpha 2-3-Verbindungen erkennender monoklonaler Antikörper.

Info

Publication number: DE3850634T2
Application number: DE3850634T
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Ito; Yoshitaka Nagai; Yoshiyasu Shitori; Kinji Takada; Hideki Yamamoto
Original assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Current assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2008-11-16
Also published as: NO885113D0; NZ226974A; US5141864A; HUT48679A; KR960014441B1; NO173556B; NO173556C; FI885279A0; AU2518688A; JPH01132374A; IL88400A0; AU624583B2; FI95043B; FI95043C; KR890008320A; EP0316882A3; EP0316882B1; DE3850634D1; NO885113L; CA1337800C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Hybridom und einen von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper gegen Sialinsäure enthaltendes Glycolipid.

Beschreibung des Stands der Technik

Bisher werden Antiseren hergestellt durch Adsorbieren des Serums von einem immunisierten Tier auf eine Vielzahl von Antigenen. Antiseren enthalten jedoch eine große Anzahl von Antikörpermolekülen, die aus verschiedenen B-Zellen hervorgingen (Polyclonal), und verursachen oft Kreuzvernetzungsreaktionen mit anderen Antikörpern. Daher ist es schwierig, Antiseren mit hervorragender Spezifität zu erhalten.
Unter solchen Umständen entwickelte Köhler 1975 ein Hybridom, das Antikörper gegen rote Blutzellen von Schafen erzeugt, und das durch Verschmelzen von Milzzellen, die von einem immunisierten Tier stammten, und von Maus-Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomen erzeugt wird. Ein Klon, der ein von einer einzigen Zelle hervorgebrachtes Hybridom ist, kann wegen seiner hohen Proliferations- Leistungsfähigkeit aus solchen Hybridomzellen isoliert werden (sogenanntes "Klonen"). Alle von einem solchen geclonten Hybridom erzeugten Antikörper sind identisch, haben gleichartige Spezifität zu einem Antigen, und so erkennen sie die gleiche Stelle eines spezifischen Antigens. Zusätzlich können die Hybridome im gefrorenen Zustand gelagert werden, zum Beispiel in flüssigem Stickstoff. Daher kann der stabile Vorrat an den einzelnen Antikörpern sichergestellt werden. Auf diese Weise wird es entsprechend der Zellverschmelzungstechnik möglich, einen zu einem spezifischen Antigen hochgradig spezifischen, monoklonalen Antikörper zu erhalten.
Antikörper sind Proteine die ein Molekül oder eine Substanz erkennen können, das (die) als dazu inhärentes "Antigen" bezeichnet wird, und können an selbiges gebunden werden. Der monoklonale Antikörper bedeutet einen Antikörper mit einer Stelle, die spezifisch ein spezifisches Antigen erkennt, in anderen Worten, er erkennt nur eine antigene Determinante. Heutzutage sind in der Technik verschiedenartige Techniken zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern und zum Schaffen von Hybridomen, die zur Erzeugung derselben in der Lage sind, gut bekannt. In dieser Hinsicht kann auf eine kürzliche Veröffentlichung verwiesen werden "Monoklonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", herausgegeben von John G. Hurrell, 1983.
Das Glycolipid von Säugetierzellen gehört zur Kategorie des sogenannten Sphingoglycolipids und weist auf (a) eine als Ceramid bezeichnete Lipidstruktur, die aus einem Sphingosin genannten, langkettigen Aminoalkohol, an den eine Fettsäure säureamidgebunden ist, zusammengesetzt ist, und (b) verschiedene Kombinationen von Zuckern, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Glucose, Galactose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin, Fucose und Sialinsäure, die über Glycosid-Verknüpfungen an die Struktur gebunden sind. Unter diesen werden die einen Sialinsäure-Rest tragenden Glycolipide Ganglioside genannt.
Die meisten dieser Verbindungen sind im wesentlichen in der äußeren zellulären Membran angeordnet und man dachte aufgrund jüngerer Untersuchungen, daß Ganglioside eine wichtige Rolle spielen in den Funktionen als eine Annahme und Antwort von Erkennen und Information, Rezeptorfunktionen, Differenzierung, Proliferation, bösartige Veränderung oder Verhalten von Zellen.
Unter diesen Gangliosiden sind GD&sub3;-Ganglioside bekannt als das unterscheidende Antigen von Nervenzellen und außerdem erkannt als das mit Krebs in Verbindung stehende Antigen menschlicher Melanomzellen.
Da der monoklonale Antikörper hohe Spezifität zu einem spezifischen Antigen hat und auf diese Weise selbiges in hoher Empfindlichkeit nachweisen kann, wie oben offenbart, würde man erwarten, daß, wenn ein zu den GD&sub3;-Gangliosiden spezifischer monomonaler Antikörper erhalten wird, ein derartiger monoklonaler Antikörper für die Diagnose von Krebs (als ein Krebs-Marker) und immunologische Behandlung sowie für die Erhellung der Rolle der Zuckerkette in zellulären Funktionen angewendet wird.
Aus "The J. of Biol. Chem. 262(14), pp 6803-6807" ist ein monoklonaler Maus-Antikörper bekannt, der den Sialyl α2 → 3 Gal- Rest in Monosialogangliosiden erkennt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridom-Zellinie zur Verfügung gestellt mit der ATCC-Eingangsnr. HB 9475, die einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der Ganglioside immunologisch bindet, wobei der Antikörper das Epitop N-Acetylneuraminsäure mit einer α2 → 3-Verknüpfung erkennt.
Gemäß der Erfindung wird außerdem ein von einer Hybridom-Zellinie mit der ATCC Eingangsnr. 9475 erzeugter monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der Ganglioside immunologisch bindet und ein Epitop von N-Acetylneuraminsäure mit einer α2 → 3-Verknüpfung erkennt.
Das Hybridom der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die zu einer spezifischen antigenen Determinante an dem GD&sub3;-Gangliosid spezifisch sind, das als das Krebs beigesellte Antigen menschlicher Melanomzellen erkannt ist.
Der monoklonale Antikörper der Erfindung zeigt Spezifität für die spezifische antigene Determinante an dem GD&sub3;-Gangliosid.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt und haben herausgefunden, daß bei der Zellverschmelzungstechnik das gereinigte GD&sub3;-Gangliosid als ein Antigen verwendet wird zur Erzeugung eines Hybridoms, das in der Lage ist, einen gewünschten monoklonalen Antikörper zu erzeugen, und auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Das Hybridom der vorliegenden Erfindung kann einen monoklonalen Antikörper erzeugen, der spezifisch ist zu Sialinsäure enthaltenden Glycolipiden, die einen N-Acetylneuraminsäure-Rest mit einer alpha 2 → 3-Verknüpfung tragen.
Das Hybridom wurde bei ATCC unter der Eingangs Nr. -HB 9475 hinterlegt.
Der monoklonale Antikörper der Erfindung ist spezifisch zu Sialinsäure enthaltenden Glycolipiden, die einen N-Acetylneuraminsäure-Rest mit einer α → 3-Bindung als ein Epitop tragen, wobei der monoklonale Antikörper von den vorgenannten Hybridom mit der ATCC-Eingangs- Nr. HB 9475 erzeugt wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ANGEFÜGTEN ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Spezifität des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung zu den Antigenen GD&sub3; und GM&sub3;, bestimmt nach einer Antikörper-Technik mit Enzymmarkierung;
Fig. 2 und 3 zeigen Antigen-Spezifität von verschiedenen Arten von Gangliosiden gegen den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 4 zeigt ein zur Klassifizierung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung verwendetes Diagramm.

GENAUE ERLÄUTERUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird hierunter detallierter erläutert werden.
Hybridome wie das Hybridom der vorliegenden Erfindung können erzeugt werden durch Verschmelzen von B-Zellen (B-Lymphozyten), die von einem mit einem Antigen immunisierten Tier, gemäß dem Verfahren von Köhler & Millstein (siehe Nature 1975) erhalten wurden. Die hierin verwendeten "Antigene" sind, zum Beispiel, N-Acetylneuraminsäure- Rest mit alpha 2 → 3-Verknüpfung enthaltende Ganglioside, bevorzugt Gangliosid-Glycolipide, die N-Acetylneuraminsäure-Rest mit alpha 2 → 3-Verknüpfung enthalten. Spezifische Beispiele dafür sind wie folgt:
Zur Erhaltung des Hybridoms der vorliegenden Erfindung wurde Gangliosid GD&sub3; verwendet.
Der von dem Hybridom der vorliegenden Erfindung erzeugte, monoklonale Antikörper erkennt N-Acetylneuraminsäure mit alpha 2 → 3 als das Epitop oder die antigene Determinante und reagiert spezifisch damit. Daher zeigt der von dem Hybridom erzeugte, monoklonale Antikörper besonders hohe Reaktivität mit Sialinsäure enthaltenden Glycolipiden, die einen N-Acetylnetiraminyl-Rest mit alpha 2 → 3- Verknüpfung tragen, insbesondere GD&sub3;- und GM&sub3;-Gangliosiden. Außerdem zeigt der monoklonale Antikörper eine derartige Spezifität in gleicher Weise für jegliche dieser Sialinsäure enthaltenden Glycolipide, unabhängig von den Arten von Ursprungstieren.
Mit dem Antigen, dem vorgenannten Sialinsäure enthaltenden Glycolipid, zu immunisierende "Tiere" können irgendwelche Arten von Tieren sein. Die spezifischen Beispiele dafür sind Kaninchen, Mensch, Maus und Ratte, bevorzugt Matis und mehr bevorzugt Balb/c-Maus.
Die B-Zellen (B-Lymphozyten), die den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugen, stammen bevorzugt von Milz-Zellen. Andererseits können bei der vorliegenden Erfindung verwendete "Myelomzellen" auch die von irgendwelchen Tieren wie Mensch, Maus, Ratte und Kaninchen stammenden, bevorzugt die von Maus stammenden und mehr bevorzugt von Balb/c-Maus stammenden Myelomzellen (X63- Ag8,653) sein. Diese Myelomzellen zeigen eine extrem hohe Proliferations-Leistungsfähigkeit, so daß das durch ihre Verschmelzung mit den B-Zellen erzeugte Hybridom kontinuierlich den monoklonalen Antikörper der Erfindung erzeugen kann.
Das Hybridom der vorliegenden Erfindung kann nach dem unten genau beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Zuerst wird GD&sub3;-Gangliosid intraperitoneal, subcutan oder intravenös, bevorzugt intravenös, in Mäuse injiziert, um sie zu immunisieren. Bei dieser Immunisierung können entweder unvollständige Adjuvantien oder vollständige Adjuvantien als ein Adjuvans, d. h. ein Mittel zur immunologischen Verstärkung, verwendet werden, und spezifische Beispiele dafür sind Öle, Emmulsionsmittel, getöteter Tubercel-Bazillus, getöteter Salmonella und Mischungen davon, bevorzugt getöteter Salmonella Minesota für intraperitoneale oder subcutane Injektion und für intravenöse Injektion. Dieses Antigen und Adjuvans werden bevorzugt in der Form einer Lösung mit etwa physiologisch annehmbarer Zusammensetzung wie einer Lösung in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, angewendet.
Bei dieser Immunisierung sollte erwähnt werden, daß es schwierig ist, ein zu immunisierendes Tier mit den Eigenbestandteilen zu immunisieren und daher ist es bevorzugt, prinzipiell das Tier phänogenetisch entfernt von dem auszuwählen, von dem die antigene Substanz erhalten wird. Die Immunisierung kann jedoch auch in vitro durchgeführt werden, um solche Schwierigkeiten zu vermeiden.
Dann werden die B-Zellen und die Myelomzellen miteinander verschmolzen. Als ein Mittel zur Zellverschmelzung können Polyethylenglycol und HVJ, bevorzugt Polyethylenglycol 6000, verwendet Weiden. Zusätzlich ist es bevorzugt, HAT-Medium als das Kulturmedium zu verwenden, um leicht Hybridomzellen von Myelomzellen, die unverschmolzen bleiben, zu isolieren.
Danach werden die sich ergebenden Hybridomzellen der Klonierungsbehandlung unterzogen wie der Methylcellulose-Technik, Softagarose-Technik oder begrenzenden Verdünnungstechnik, um ein gewünschtes, einziges, geclontes Hybridom zu isolieren.
Der Antikörper-Titer des so erzeugten, den monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridoms kann in üblicher Weise untersucht werden, um ein Hybridom, das einen hohen Antikörper-Titer aufweist, auszuwählen. Das so ausgewählte Hybridom wird dann gelagert.
Der von dem Hybridom der vorliegenden Erfindung erzeugte, monoklonale Antikörper kann verwendet werden beim Auffinden des Glycolipid-Antigens, das natürlich in Krebsgeweben von Menschen oder Tieren auftritt. Daher kann der monoklonale Antikörper bei, zum Beispiel, ELISA- und RIA-Tests verwendet werden, die üblicherweise zur Auffindung von mit Krebs in Verbindung stehenden Gangliosiden verwendet werden. Darüber hinaus kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung bei der Affinitäts-Chromatographie verwendet werden zum Reinigen von Antigenen, die in der Lage sind, daran zu binden. Wenn der monoklonale Antikörper mit einem Radioisotop markiert wird, kann er dazu verwendet werden, einen Tumor aufzufinden oder seine korrekte Lage festzustellen, so wie er auch in einer hohen Dosierung verwendet werden kann, um unter einem Tumor leidende Patienten zu behandeln. Er kann auch an irgendein chemotherapeutisches Mittel gebunden werden, um seine Toxizität für Krebszellen zu steigern. Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden zur Behandlung oder Diagnose von Spezies, die das Antigen besitzen, wie Menschen und Tiere wie Mäuse. Es wird erwartet, daß der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann für grundlegende Studien an Nervenzellen und für verschiedene klinische Zwecke verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Arbeitsbeispiele genauer erklärt.

Beispiel

(a) Herstellung von Antigen

(1) Extraktion und Reinigung von GD&sub3;- und GM&sub3;-Gangliosiden

Nachdem Schweinenebennieren in kaltem Aceton homogenisiert und getrocknet waren, wurde das getrocknete Produkt mit Chloroform- Methanol in einer üblichen Weise extrahiert.
Die sich ergebende Probe wurde mit Alkali behandelt, und dann wurde GD&sub3;-Gangliosid unter Verwendung eines DEAE-Sephadex A- 25 Anionenaustauscherharzes und einer Iatrobeads-Säule gereinigt.
GM&sub3;-Gangliosid wurde hergestellt durch Zentrifugieren von mit Heparin behandeltem Hundeserum, dreimaliges Waschen des sich ergebenden Sediments mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS(-)), sein Lyophilisieren, und dann Unterziehen des Produkts der Extraktion mit Chloroform-Methanol. Seine Reinigung wurde in der gleichen Weise wie oben durchgeführt.
Ganglioside GD1a, GD1b UND GQ1b waren erhältlich von DIATRON CO., LTD; Ganglioside Gal-Cr und Glc-Cer von Sigma Company und GT1b und GM&sub2; voll FUNAKOSHI Company, und diese wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Diese Gangiiosid-Glycolipide wurden in Chloroform-Met!ianol (1 : 1 (v/v)) oder Ethanol gelöst und bei -20ºC gelagert.

(2) Tier

Sechs weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6 Wochen wurden nach Zucht unter üblichen Bedingungen für Experimente verwendet.

(3) Herstellung von Antigen-Lösung

Aus der Schweinenebenniere extrahiertes und dann gereinigtes Gangliosid GD&sub3; und mit Essigsäure (Gewichtsverhältnis = 1 : 4) und mit Diethylether behandelte Salmonella minesota R 595 wurden in PBS(-) gemischt, so daß die Konzentration an GD&sub3;-Gangliosid 100 Mikrogramm/ml war, und die sich ergebende Lösung wurde als die Antigen-Lösung verwendet.

(4) Kulturmedium

Kulturmedium: Nissui RPMl 1640 (erhältlich von Nissui Seiyaku, Tokyo, Japan) wurde als ein Kulturmedium verwendet. Zu dem Medium wurden Kanamycinsulfat und fötales Kälberserum (FBS) hinzugefügt, so daß ihre Konzentrationen gleich 50 Mikrogramm/ml bzw. 10% waren, vor der Verwendung.
HAT-Medium: 0,9388 g Thymidin und 0,1361 g Hypoxanthin wurden in 100 m) destilliertem Wasser unter Erwärmen gelöst, und die sich ergebende Lösung (a) wurde bei 20ºC als eine Vorratslösung mit einer 100 mal höheren Konzentration als die gewünschte gelagert. In gleicher Weise wurden 0,0176 g Aminopterin in 100 ml destilliertem Wasser gelöst durch Hinzufügen einer kleinen Menge wäßriger in Natriumhydroxid- Lösung, dann wurde dieses zehnfach mit RPMI 1640-Kulturmedium verdünnt, und die sich ergebende Lösung (b) wurde bei -20ºC als eine Vorratslösung mit einer hundertfach höheren Konzentration als der gewünschten unter Abschirmung des Lichts gelagert. HAT- Medium wurde hergestellt durch Hinzufügen von 1/100 Volumen einer jeden dieser zwei Lösungen zu 10% FBS RPMI 1640 Medium direkt vor der Verwendung.
Darüber hinaus wurde HAT-Medium hergestellt durch einfaches Hinzufügen voll 1/100 Volumen der Hypoxanthin und Thymidin enthaltenden Vorratslösung (a) zu dem gleichen 10% FBS RPMI 1640 Medium.

(5) Elternzellen

Als die Elternzellen für die Zellverschmelzung wurden Myelonlzellen (C63-Ag8-6. 5.5-Zellen), die von Balb/c-Mäusen stammten, verwendet. Diese Zellen wurden der Subkultur in RPMI 1640 Medium, zu dem 10% FBS hinzugefügt war, unterzogen, während die Erzeugung von Mutanten gehemmt wurde durch Hinzufügen von 6-Thioguanin zu dem Medium, so daß seine Konzentration gleich 3 Mikrogramm/ml war.

(B) Herstellung des Hybridoms

(1) Immunisierungs-Verfahren

6 Wochen alte, weibliche Balb/c-Mäuse wurden immunisiert durch intravenöse Injektion der folgenden immunisierenden Lösung gemäß dem folgenden Immunisierungsplan (injizierte Menge wurde ausgedrückt in Menge an Gangliosid): Anfangs 5 Mikrogramm, 10 Mikrogramm am vierten Tag, 15 Mikrogramm am siebten Tag, 20 Mikrogramm am zwölften Tag und 20 Mikrogramm am neunundsiebzigsten Tag nach Beginn. Am dritten Tag nach der endgültigen Immunisierung wurden die Mäuse geopfert, um ihre Milz herauszusezieren, und es wurde eine Suspension einzelner Milzzellen hergestellt, und dieselbe nachfolgend bei der Zellverschmelzung zu verwenden.
Immunisierende Lösung: 100 Mikrogramm aus der Schweinenebenniere extraliiertes und gereinigtes GD&sub3;-Gangliosid und 400 Mikrogramm Salmonella minesota R 595 als ein Adjuvans wurden in 1 ml PBS(-) (frei voll Ca&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus;) eingemischt und die sich ergebende Lösung wurde dann geeignet verdünnt zur Verwendung als die immuniserende Lösung.

(2) Zellverschmelzung

Die Verschmelzung der oben erhaltenen Milzzellen und der Maus- Myelomzellen wurde gemäß dem Verfahren von Köhler und Millstein durchgeführt. Genauer wurden 1 · 10&sup8; Milz-Lymphozyten mit 2 · 10&sup7; Myelomzellen in Gegenwart voll 50% Polyethylenglycol (PEG 6000) in einem Kulturmedium verschmolzen.

(3) Auswahl und Zucht des Hybridoms

Nach der Zellverschmelzung wurden die sich ergebenden Zellen bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) kultiviert.
Das so erzeugte Hybridom wurde unter der Eingangs-Nr. ATCC HB 9475 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt.

(C) Beurteilung der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit Gangliosiden

Eine flachbödige Platte mit 96 Vertiefungen (erhältlich von Falcon Co., Ltd.) wurde vor der Verwendung in Experimenten mit Ethanol vorbehandelt. Jeweils 50 Mikroliter der Antigenlösung (immunisierende Lösung), die mit Ethanol verdünnt worden war, um die Konzentration an GD&sub3;-Gangliosid auf 20 Mikrogramm/ml (optimale Konzentration) einzustellen, wurden in Vertiefungen der Platte pipettiert, dann wurde das Lösungsmittel daraus verdampft, jeweils 200 Mikroliter 1% Eialbumin PBS(-)-Lösung wurden in die Vertiefungen eingebracht, sind dann ließ man sie 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die Platte wurde mit der Unterseite nach oben geschüttelt, um die Lösung zu entfernen, dann wurden jeweils 50 Mikroliter des Überstands des Hybridom-Kulturmediums als der primäre Antikörper hinzugefügt, und man ließ die Platte 1,5 Stunden bei Raumtemperatur stehen. In gleicher Weise wurde der primäre Antikörper von den Vertiefungen entfernt, dann wurden die Vertiefungen drei mal gewaschen durch Hinzufügen von 150 Mikrolitern PBS(-)-Lösung und, nach Hinzufügen von jeweils 100 Mikrolitern 1% Eialbumin PBS(-)-Lösung, 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach der Entfernung dieser Lösung wurden jeweils 50 Mikroliter des mit 1% Eialbumin PBS(-) -Lösung auf seine optimale Konzentration verdünnten sekundären Antikörpers hinzugefügt und 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Wie im Fall des primären Antikörpers wurden die Vertiefungen drei mal mit PBS(-)-Lösung gewaschen, und es wurden jeweils 100 Mikroliter einer Reaktionslösung hinzugefügt, um eine Reaktion in der Dunkelheit zu verursachen. Die Reaktionslösung wurde hergestellt durch Auflösen von o- Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid in Citrat-Phosphat-Puffer (pH = 5), so daß ihre Konzentrationen 0,4 mg/ml bzw. 0,01% waren. Die Reaktion wurde gestoppt durch Hinzufügung von jeweils 30 Mikrolitern 8n Schwefelsäure-Lösung, und dann wurde das Produkt durch Kolorimetrie bei 500 nm untersucht. Als der sekundäre Antikörper wurden mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierte Ziegen-Antimaus IgG-, IgM und IgA-Antikörper verwendet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgetragen, bei der die gefüllten Kreise Gangliosid GM&sub3; darstellen und die offenen Kreise Gangliosid GD&sub3; darstellen.
Wie aus den in Fig. 1 aufgezeichneten Ergebnissen ersichtlich ist, erzeugen die Ganglioside GD&sub3; und GM&sub3; Antigen-Antikörper- Reaktionen mit dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung mit hoher Empfindlichkeit. So tragen beide Ganglioside GD&sub3; und GM&sub3; die antigene Determinante gegen den monoklonalen Antiköper der Erfindung. In diesem Zusammenhang zeigt das Gangliosid GD&sub3; eine höhere Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper als das Gangliosid GM&sub3;. Daher findet man, daß das Gangliosid GD ein Epitop oder eine antigene Determinante mit höherer Spezifität zu dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung hat.

(2) TLC Immunfarbe-Technik

Eine Silicagel-Dünnschichtchromatographie (TLC(Polygram SIL G))-Platte wurde in Stücke geeigneter Größe geschnitten und mit einem kleinen Tropfen der Lösung eines Glycolipids in Chloroform- Methanol (1 : 1 (v/v)) befleckt. Abhängig von den Zwecken wurde die Platte mit einer Entwicklerlösung entwickelt, wie Chloroform- Methanol-Wasser (60/401/10; v/v), Chloroform-Methanol 0,5% CaCl&sub2;-Lösung (55/451/10; v/v) oder Chloroform-Methanol-2,5n NH&sub4;OH-Lösung (60/40/9; v/v) und wurde dann in 1% Eialbumin- 1 % Polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-Lösung bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Dann wurde sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt, während sie in die Lösung des primären Antikörpers eintauchte. Nach ausreichendem Waschen mit PBS(-) wurde sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1% Eialbumin-1% Polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-Lösung eingetaucht. Die Platte wurde daraus herausgezogen, wurde unter Schütteln 2 Stunden lang in den sekundären Antikörper eingetaucht, der mit 3% Polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-Lösung auf seine optimale Konzentration verdünnt war, und eine Reaktionslösung wurde dazu hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde hergestellt durch Auflösen von 4 mg 4-Chlor-1-Naphtol in 1 ml Methanol, Hinzufügen von 50 mMol Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 200 mMol NaCl und 5 ml eines Puffers (pH = 7,4) und dann Hinzufügen voll Wasserstoffperoxid, so daß seine Konzentration 0,01% war. Die Reaktion wurde gestoppt durch Waschen der Platte mit Wasser und dann Trocknen mit Luft.

(3) Identifizierung von zu dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifischen Epitopen

Die Ergebnisse qualitativer Tests und Immunreaktionen verschiedener Arten von Glycolipiden, die durch TLC-Färbetechnik (Orcinol-Färbung) (A) und TLC-Immunfärbetechnik (B) erhalten wurden, sind in Fig. 2 gezeigt. Es wird aus den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen herausgefunden, daß das Gangliosid GD&sub3; von Spur 5 eine zu dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifische antigene Determinante hat.
Darüber hinaus wird CDH (Gal-Glc-Cer), das durch Einwirken von Vibrio Cholera Sialidase auf das Gangliosid GD&sub3; von Spur 3 erzeugt wurde, nicht nachgewiesen, wenn es der TLC-Immunfärbung unterzogen wurde. Das zeigt klar an, daß die Gal-Glc-Cer (CDH)- Struktur keine antigene Determinante für den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem zeigt die auf Spur 3 der TLC-Immunfärbung auftretende Bande Gangliosid GD&sub3; an, das nicht durch die vorgenannte Sialidase beeinflußt wird. In Fig. 2 zeigt CMH von Spur 1 Gal-Cer und Glc-Cer und CTH von Spur 4 zeigt Gal-Gal-Glc-Cer.
So wurde gefunden, daß diese Strukturen nicht antigene Determinanten für den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind, da sie nicht durch TLC-Immunfärbetechnik gefärbt wurden.
Wie aus dem obigen ersichtlich ist, wird gefunden, daß die antigene Determinante für den monoklonalen Antikörper der Erfindung N- Acetylneuranlinsäure-Reste sind.
Jede Spur in Fig. 2 ist wie folgt:
(1) Spur 1: CMH (Gal-Cer voll menschlichem Gehirn) 1 Mikrogramm
(2) Spur 2 : 1 Mikrogramm
(3) Spur 3: CDH (Einwirkung voll Vibrio Cholera Sialidase auf GD&sub3;) 1 Mikrogramm
(4) Spur 4: CTH (chemisch synthetisiertes Produkt) 1 Mikrogramm
(5) Spur 5: GD&sub3; 1 Mikrogramm
In gleicher Weise sind die durch Färben einer Vielzahl von Gangliosiden mit N-Acetylneuraminsäure-Resten durch TLC- Immunfärbung erhaltenen Ergebnisse in Tabelle I unten zusammengefaßt.

TABELLE I: Ergebnisse des TLC-Immunfärbetests

Antigen (100 pMol) ATCC HB 9475
GM&sub3; ++++++
GD&sub3; ++++++
GD1a ++
GD1b +
GT1b ++
GQ1b +++
:nicht nachgewiesen.
Proben 578 nm
Kontrolle 710 nm Antikörper Titer

(4) Identifizierung des Epitops oder der antigenen Determinante für den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung.

Wie in Fig. 2 zeigt Fig. 3 die Ergebnisse qualitativer Tests und Immunreaktionen verschiedener Arten von Glycolipiden, die durch TLC-Färbetechnik (A) und TLC-Immunfärbetechnik (B) erhalten wurden. In Fig. 3 zeigen die Spuren 2 und 3 die Ergebnisse natürlich vorkommender Ganglioside, mit anderen Worten N- Acetylneuraminsätire mit alpha 2 → 3-Verknüpfung. Diese Spuren zeigen deutlich, daß die N-Acetylneuraminsäure mit alpha 2 → 3- Verknüpfung eine starke Spezifität zu dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung hat.
Zusätzlich zeigen die Spuren 4 und 5 die Ergebnisse chemisch synthetisierter N-Acetylneuraminsäure-Derivate. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das synthetisierte Gangliosid keine Spezifität zu dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung hat.
Wenn man gemeinsam sowohl die jetzigen Beobachtungen als auch die in Abschnitt (3) erhaltenen in Betracht zieht, kann gefolgert werden, daß der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung die alpha 2 → 3-Verknüpfung von N- Acetylneuraminsäure als sein Eptiop oder antigene Determinante erkennt.
Die Spuren in Fig. 3 werden unten genau erläutert. (1) Spur 1: GM&sub3; 1 Mikrogramm N-Acetylneuraminsäure (NANA)

(5) Qualitative Immundiffusions-Technik (Ouchteriony Technik)

Fig. 4 zeigt die durch Immundiffusionstechnik erhaltenen Ergebnisse. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, ist der von dem Hybridom dieser Erfindung erzeugte monoklonale Antikörper IgM. Bei diesem Verfahren wurden die Antiseren Anti-MIgM, Anti-MIgG&sub1;, Anti- MIgG2a, Anti-MIgG2b und Anti-MIgG&sub3; von Miles Company erhalten.
(1) Anti-MIgM
(2) Anti-MIgG&sub1;
(3) Anti-MIgG2a
(4) Anti-MIgG2b
(5) Anti-MIgG&sub3;
(6) Die Tatsache, daß der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung IgM ist, wird auch gezeigt durch die gemäß der Antikörper-Technik mit Enzymmarkierung erhaltenen Ergebnisse, wobei die nach dem Verfahren erhaltenen Ergebnisse in Tabelle II unten zusammengefaßt sind. TABELLE II Sekundärer Antikörper Aus dem Hybridom erhaltener Anti-Maus IgM OD (Optische Dichte) bei 500 nm Antigen: GD&sub3; 500 ng/Vertiefung Dritter Antikörper: Ziegen-Anti-Kaninchen Ig-HRP

Claims

1. Hybridom-Zellinie mit der ATCC-Eingangsnummer HB 9475, die einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der Ganglioside immunologisch bindet, wobei der Antikörper das Epitop N- Acetylneuraminsäure mit einer α 2 → 3 - Verknüpfung erkennt.

2. Von einer Hybridom-Zellinie mit der ATCC-Eingangsnummer HB 9475 erzeugter monoklonaler Antikörper, der Ganglioside immunologisch bindet und ein Epitop von N-Acetylneuraminsäure mit einer α 2 → 3 - Verknüpfung erkennt.