DE3843534A1 - NEW TNF POLYPEPTIDES - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Polypeptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.The invention relates to new tumor necrosis factor (TNF) derived Polypeptides, their production and their use as medicines.
Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).By Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) has been reported that the serum from endotoxin-treated animals previously treated with the Mycobacteria strain Calmette-Guerin (BCG) had been infected, one caused hemorrhagic necrosis in various tumors in the mouse. This activity was attributed to the tumor necrosis factor. TNF shows also a cytostatic or cytotoxic effect on a variety of transformed cell lines in vitro, while normal human and animal cell lines are not affected (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Recently the biochemical characterization and the gene described for human TNF (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:The following protein structure for the mature human can be derived from these data Derive TNF:
Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).Furthermore, the TNF gene from cattle, rabbits and mice has been described (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.In addition to its cytotoxic properties, TNF is one of the main participants inflammatory reactions (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). In the animal model TNF's involvement in septic shock (Science 229, 869, 1985) and graft versus host disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987).
Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Polypeptide, die sich vom TNF ableiten, günstigere Eigenschaften besitzen.It has now been found that certain polypeptides derived from TNF derive, possess more favorable properties.
Gegenstand der Erfindung sind TNF-Polypeptide der FormelThe invention relates to TNF polypeptides of the formula
worin jedoch mindestens eine Aminosäure in den Positionen 9, 10, 11, 15, 26, 35, 46, 52, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 78, 87, 95, 98, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 150, 156 und/oder 157 durch eine andere natürliche α-Aminosäure ersetzt und/oder deletiert ist und N-terminal 1 bis 7 Aminosäuren fehlen können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.where, however, at least one amino acid in positions 9, 10, 11, 15, 26, 35, 46, 52, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 78, 87, 95, 98, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 150, 156 and / or 157 is replaced and / or deleted by another natural α -amino acid and N-terminal 1 to 7 amino acids may be missing, and their salts with physiologically acceptable acids.
Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung die TNF-Polypeptide, in denen mindestens eine der folgenden Veränderungen vorliegt:In particular, the invention relates to the TNF polypeptides in which there is at least one of the following changes:
Position 9: Ser ersetzt durch A
Position 10: Asp ersetzt durch A
Position 11: Lys ersetzt durch A
Position 15: His ersetzt durch B oder C
Position 26: Leu ersetzt durch C
Position 35: Ala ersetzt durch C
Position 46: Asn ersetzt durch A
Position 52: Ser ersetzt durch A
Position 54: Gly ersetzt durch C
Position 56: Tyr ersetzt durch C
Position 57: Leu ersetzt durch C
Position 59: Tyr ersetzt durch C
Position 60: Ser ersetzt durch C
Position 61: Gln ersetzt durch C
Position 62: Val ersetzt durch C
Position 78: His ersetzt durch C oder B
Position 87: Tyr ersetzt durch C
Position 95: Ser ersetzt durch C
Position 98: Lys ersetzt durch B
Position 119: Tyr ersetzt durch C oder A
Position 121: Gly ersetzt durch C
Position 133: Ser ersetzt durch C
Position 136: Ile ersetzt durch C
Position 137: Asn ersetzt durch A
Position 138: Arg ersetzt durch A oder B
Position 139: Pro ersetzt durch A, C oder B
Position 140: Asp ersetzt durch A, C oder deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch A oder deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch C
Position 144: Phe ersetzt durch C oder A
Position 150: Val ersetzt durch C
Position 156: Ala ersetzt durch C
Position 157: Leu ersetzt durch B,Position 9: Ser replaced by A
Position 10: Asp replaced by A
Position 11: Lys replaced by A
Position 15: His replaced by B or C
Position 26: Leu replaced by C
Position 35: Ala replaced by C
Position 46: Asn replaced by A
Position 52: Ser replaced by A
Position 54: Gly replaced by C
Position 56: Tyr replaced by C
Position 57: Leu replaced by C
Position 59: Tyr replaced by C
Position 60: Ser replaced by C
Position 61: Gln replaced by C
Position 62: Val replaced by C
Position 78: His replaced by C or B
Position 87: Tyr replaced by C
Position 95: Ser replaced by C
Position 98: Lys replaced by B
Position 119: Tyr replaced by C or A
Position 121: Gly replaced by C
Position 133: Ser replaced by C
Position 136: Ile replaced by C
Position 137: Asn replaced by A
Position 138: Arg replaced by A or B
Position 139: Pro replaced by A, C or B
Position 140: Asp replaced by A, C or deleted
Position 141: Tyr replaced by A or deleted
Position 142: Leu replaced by C
Position 144: Phe replaced by C or A
Position 150: Val replaced by C
Position 156: Ala replaced by C
Position 157: Leu replaced by B,
worin A eine Aminosäure mit geladener Seitenkette, B eine Aminosäure mit polarer ungeladener Seitenkette und C eine Aminosäure mit hydrophober Seitenkette bedeuten. A ist also Arg, His, Lys, Glu oder Asp; B Gln, Asn, Gly, Met, Cys, Ser oder Thr und C Phe, Leu, Ile, Trp, Tyr, Pro, Val oder Ala.where A is an amino acid with a charged side chain, B is an amino acid with polar uncharged side chain and C an amino acid with hydrophobic Mean side chain. So A is Arg, His, Lys, Glu or Asp; B Gln, Asn, Gly, Met, Cys, Ser or Thr and C Phe, Leu, Ile, Trp, Tyr, Pro, Val or Ala.
Vorzugsweise sind in dem TNF-Molekül nicht mehr als 10 Aminosäuren ab Position 9 deletiert oder verändert.Preferably, no more than 10 amino acids are ab in the TNF molecule Position 9 deleted or changed.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.The following are particularly worth mentioning as physiologically acceptable acids: Hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, Methanesulfonic acid, acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, Malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-glutamic acid, L-aspartic acid, pyruvic acid, mucic acid, benzoic acid, Glucuronic acid, oxalic acid, ascorbic acid, acetylglycine.
Zur Herstellung der neuen Polypeptide geht man von der cDNA des humanen TNFs aus, die man gemäß Nature 312, 724, 1984 erhält und in ein Plasmid einbaut. Dieses rekombinante Plasmid, das die genetische Information für humanes TNF trägt, dient als Ausgangspunkt für die Herstellung der neuen TNF-Muteine.The cDNA of the human is used to produce the new polypeptides TNFs obtained from Nature 312, 724, 1984 and into a plasmid built in. This recombinant plasmid, which contains the genetic information for human TNF, serves as the starting point for the production of the new TNF muteins.
Um die beabsichtigten Veränderungen in das Gen für den humanen TNF gezielt einzuführen, wird das TNF-cDNA-Fragment durch aufeinanderfolgende Spaltung mit Restriktionsenzymen und anschließende Elektrophorese durch ein Agarosegel rein hergestellt. Dieses TNF-Gen enthaltende Fragment wird in einen Polylinker eines Bakteriophagenvektors eingebaut (Gene 19, 269-276).To target the intended changes in the gene for human TNF introduce the TNF cDNA fragment by successive cleavage with restriction enzymes and subsequent electrophoresis by Pure agarose gel. This fragment containing TNF gene is shown in incorporated a polylinker of a bacteriophage vector (Gene 19, 269-276).
Durch Transformation von E.coli mit diesem rekombinanten Vektor werden schließlich Phagen erhalten, die den codierenden Strang des humanen TNF-Gens tragen.By transforming E.coli with this recombinant vector finally get phages that encode the coding strand of the human Wear TNF gene.
Zur gezielten Mutagenese des TNF-Gens werden Oligodesoxynukleotide chemisch synthetisiert, die partiell komplementär zur TNF-Sequenz sind. Diese Oligonukleotide besitzen eine durchschnittliche Länge von 23 Nukleotiden. Am 5′-Ende ist ein Bereich von etwa 10 Nukleotiden, der perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang ist. Anschließend folgt ein Abschnitt von 3 Nukleotiden, der nicht komplementär ist und die gewünschte Veränderung des TNF-Gens trägt. An diesen Abschnitt schließt sich ein etwa 10 Nukleotide langer Teil an, der wiederum perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang ist.For targeted mutagenesis of the TNF gene, oligodeoxynucleotides are used chemically synthesized, which are partially complementary to the TNF sequence. These oligonucleotides have an average length of 23 nucleotides. At the 5'-end is a region of about 10 nucleotides, the is perfectly complementary to the TNF-coding strand. Then follows a section of 3 nucleotides that is not complementary and that desired change in the TNF gene. This section concludes a part about 10 nucleotides long, which in turn is perfect is complementary to the TNF-coding strand.
Deletionen werden erzeugt, indem man Oligodesoxynukleotide verwendet, die genau vor und hinter der zu deletierenden Gensequenz Komplementarität besitzen; dadurch wird ein Heteroduplex gebildet, in dem die zu deletierende Gensequenz einzelsträngig vorliegt.Deletions are created using oligodeoxynucleotides that exactly before and after the complementarity to be deleted have; a heteroduplex is formed in which the to deleting gene sequence is single-stranded.
Die so konstruierten Oligonukleotide werden mit der rekombinanten TNF-DNA hybridisiert. Anschließend wird mit einer Polymerase und Desoxynukleosidtriphosphaten der Heteroduplex zum vollständigen doppelsträngigen DNA-Molekül aufgefüllt und mit dem Enzym T4 DNA-Ligase kovalent verknüpft.The oligonucleotides so constructed are used with the recombinant TNF-DNA hybridizes. Then using a polymerase and deoxynucleoside triphosphates the heteroduplex for complete double-stranded Filled DNA molecule and covalently linked with the enzyme T4 DNA ligase.
Mit diesem DNA-Molekül werden kompetente E.coli Zellen transformiert und die so erhaltenen Phagen werden durch in situ Plaque-Testung untersucht (Science 196, 180, 1977).With this DNA molecule, competent E.coli cells are transformed and the phages thus obtained are examined by in situ plaque testing (Science 196, 180, 1977).
Dazu wird die auf Nitrocellulose überführte Phagen-DNA mit Hilfe des zur Mutagenese verwendeten Oligonukleotids, das radioaktiv markiert ist, durchgetestet.For this purpose, the phage DNA transferred to nitrocellulose is converted using the Mutagenesis used oligonucleotide that is radiolabelled thoroughly tested.
Unter hochstringenten Bedingungen werden diejenigen Phagen durch Hybridisierung identifiziert, die die gewünschte Veränderung im TNF-Gen tragen. Die Bestätigung der Mutation erfolgt durch DNA-Sequenzierung. Under highly stringent conditions, those phages are cut through Hybridization identified the desired change in the TNF gene wear. The mutation is confirmed by DNA sequencing.
Anschließend kann das mutierte TNF-Gen mittels Spaltung mit Restriktionsenzymen aus dem rekombinierten TNF-Vektor herausgelöst und mittels Gelelektrophorese in reiner Form isoliert werden. Zur Expression dieses veränderten TNF-Gens in E.coli muß das TNF-Genfragment mit prokaryontischen Signalen wie Promotoren, Terminatoren, ribosomalen Bindungsstellen versehen werden (Winnacker, Gene und Clone, Verlag Chemie 1984, Seite 192ff). Anschließend wird mit diesem TNF-Expressionsvektor ein E.coli-Stamm transformiert. Der so erhaltene rekombinante E.coli-Stamm wird zur Produktion eines TNF-Muteins verwendet, indem man ihn in einem geeigneten Nährmedium züchtet. Danach werden die Bakterien geerntet und lysiert. So erhält man ein lösliches Gemisch aus E.coli-Proteinen, aus dem das gewünschte TNF-Mutein durch bekannte Methoden der Proteinreinigung wie Ammoniumsulfatpräzipitation, Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasenchromatographie in reiner Form isoliert werden kann.The mutated TNF gene can then be cleaved with restriction enzymes detached from the recombined TNF vector and by means of Gel electrophoresis can be isolated in pure form. To express this modified TNF gene in E.coli must be the TNF gene fragment with prokaryotic Signals such as promoters, terminators, ribosomal binding sites provided (Winnacker, Gene and Clone, Verlag Chemie 1984, page 192ff). An E. coli strain is then used with this TNF expression vector transformed. The recombinant E. coli strain thus obtained becomes Production of a TNF mutein used by placing it in an appropriate Culture medium breeds. The bacteria are then harvested and lysed. So a soluble mixture of E. coli proteins is obtained, from which the desired TNF mutein by known methods of protein purification such as Ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography and reverse phase chromatography can be isolated in pure form.
Die neuen Muteine zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Muteine besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine zytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Muteine erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Muteine besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die Zytotoxizität des Muteins durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Muteins bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die Zellinie mit dem entsprechenden Mutein in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Bindungsexperiment die Affinität des Muteins zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.Some of the new muteins show good cytotoxic properties. A other part of the muteins has a high affinity for the cellular TNF receptor, but without having cytotoxic activity. they thus represent TNF antagonists. They bind to the natural in competition TNF to the cellular TNF receptor and thus suppress the TNF effect. The new muteins prove to be valuable medicines that are used for treatment of neoplastic diseases and autoimmune diseases as well for the control and prophylaxis of infections, inflammation and Rejection reactions can be used in transplants. By simple experiments can be clarified which mode of action the individual muteins. With a TNF-sensitive cell Cytotoxicity of the mutein by incubation of the cell line in the presence of the Muteins determined. In a second experiment you incubate the Cell line with the corresponding mutein in the presence of a lethal TNF amount. This can demonstrate the TNF-antagonizing effect will. In addition, the affinity is determined by an in vitro binding experiment of the mutein to the cellular TNF receptor.
Die biologische Charakterisierung der neuen Muteine auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:The biological characterization of the new muteins on their agonistic or antagonistic effect took place in the following test systems:
- I. Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,I. cytotoxicity test on TNF-sensitive indicator cells,
- II. Kompetition-Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,II. Competition cytotoxicity test on TNF-sensitive Indicator cells,
- III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden Indikatorzellen.III. Competition receptor binding test expressing TNF receptor Indicator cells.
Die agonistische Bewertung der neuen Muteine basiert auf deren zytotoxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt:The agonistic evaluation of the new muteins is based on their cytotoxic effect on TNF-sensitive cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937). The L929 and MCF-7 test was performed as follows:
-
1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich
im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw.
MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer
96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über
Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf
gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol-% CO₂.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) foetales Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.1. 100 .mu.l culture medium with 3 to 5 × 10³ freshly trypsinized, exponential growth L929 cells (mouse) or MCF-7 cells (human) were pipetted into the wells of a 96-well flat-bottom culture plate. The plate was incubated overnight at 37 ° C in the incubator. The air saturated with water vapor in the incubator contained 5 vol% CO₂.
The L929 culture medium contained 500 ml MEM Earle 1 × (Boehringer, Mannheim), 50 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) fetal calf serum (FCS), 50 ml L-glutamine (200 mM), 5 ml 100 × non-essential amino acids , 3 ml 1M Hepes buffer pH 7.2 and 50 ml gentamycin (50 mg / ml).
The MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco 1 × (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) FCS, 5 ml L-glutamine and 5 ml 100 × non-essential amino acids. - 2. Am folgenden Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Mutein-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Mutein-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d. h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.-% CO₂ inkubiert.2. The following day, 100 µl of the mutein solution to be tested were added given to the cell cultures and titrated serially twice. In addition some cell controls (i.e. not with mutein dilution treated cell cultures) and some rhu-TNF controls (i.e. with recombinant human TNF-treated cell cultures). The culture plate was exposed for 48 hours at 37 ° C in one atmosphere Steam-saturated air incubated with 5 vol .-% CO₂.
-
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Mutein-Verdünnung
behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung
bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen
durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung
wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung: 3,75 g Kristallviolett
1,75 g NaCl
161,5 ml Ethanol
43,2 ml 37% Formaldehyd
ad 500 ml WasserDie Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.3. The percentage of surviving cells in the cultures treated with mutein dilution was determined by crystal violet staining. The liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 µl crystal violet solutions were pipetted into each well.
The crystal violet solution had the following composition: 3.75 g crystal violet
1.75 g NaCl
161.5 ml of ethanol
43.2 ml 37% formaldehyde
ad 500 ml of water The crystal violet solution remained in the wells for 20 min and was then also knocked off. The plates were then washed 5 times each by immersion in water to remove the non-cell-bound dye. The cell-bound dye was extracted from the cells by adding 100 ul reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) to each well. - 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.4. By shaking the plates for 5 min each was obtained Deepen an evenly colored solution. To determine the The extinction of the staining solution in the surviving cells individual wells measured at 540 nm.
- 5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50% Zytotoxizitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50% Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. Then, based on the cell control, the 50% cytotoxicity value defined and the reciprocal of the sample dilution that leads to 50% cytotoxicity as the cytotoxic activity of the investigated sample determined.
Die antagonistische Bewertung der Muteine basiert auf deren Eigenschaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der Kompetition-Zytotoxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:The antagonistic evaluation of the muteins is based on their Property, the cytotoxic effect of rhu-TNF on TNF-sensitive Compete cells (e.g. L929, MCF-7, A204, U937). The Competition cytotoxicity test with L929 and MCF-7 cells was as follows carried out:
-
1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich
im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw.
MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer
96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über
Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf
gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol-% CO₂.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 µl Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren. 1. 100 .mu.l culture medium with 3 to 5 × 10³ freshly trypsinized, exponential growth L929 cells (mouse) or MCF-7 cells (human) were pipetted into the wells of a 96-well flat-bottom culture plate. The plate was incubated overnight at 37 ° C in the incubator. The air saturated with water vapor in the incubator contained 5 vol% CO₂.
The L929 culture medium contained 500 ml of MEM Earle 1 × (Boehringer, Mannheim), 50 ml of FCS heat-inactivated at 56 ° C. for 30 min, 5 ml of L-glutamine (200 mM), 5 ml of 100 × nonessential amino acids, 3 ml of 1M Hepes -Buffer pH 7.2 and 500 µl gentamycin (50 mg / ml).
The MCF-7 culture medium contained 500 ml MEM Dulbecco 1 × (Boehringer, Mannheim), 100 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C.) FCS, 5 ml L-glutamine (200 mM) and 5 ml 100 × non-essential amino acids. - 2. Am nächsten Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Mutein-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 µl einer rhu-TNF-Verdünnung in Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100% zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Mutein-Lösung und nicht mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.-% CO₂ inkubiert.2. The next day, 100 ul of the mutein solution to be tested were added added to the cell cultures and titrated serially twice. To this Cell cultures were then 100 ul of a rhu-TNF dilution in Culture medium in the final concentration in the cell culture Has 80-100% cytotoxic effect. In addition, some Cell controls (i.e. not with mutein solution and not with rhu-TNF solution treated cell cultures) and some rhu-TNF controls (= only treated with rhu-TNF solution Cell cultures). The culture plate was at 48 h 37 ° C in an atmosphere of water vapor-saturated air 5 vol .-% CO₂ incubated.
-
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung
behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung
bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen
durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung
wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte die in II.3 angegebene Zusammensetzung:
Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.3. The percentage of surviving cells in the solution-treated cultures was determined by means of crystal violet staining. The liquids were removed from the wells by knocking off the test plate. 50 µl crystal violet solutions were pipetted into each well.
The crystal violet solution had the composition given in II.3:
The crystal violet solution remained in the wells for 20 minutes and was then also knocked off. The plates were then washed 5 times each by immersion in water to remove the non-cell-bound dye. The cell-bound dye was extracted from the cells by adding 100 ul reagent solution (50% ethanol, 0.1% glacial acetic acid, 49.9% water) to each well. - 4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.4. By shaking the plates for 5 min each was obtained Deepen an evenly colored solution. To determine the The extinction of the staining solution in the surviving cells individual wells measured at 540 nm.
- 5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die rhu-TNF-Kontrolle der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. Then, based on the cell control and the rhu-TNF control defined the 50% competition value and the Sample concentration at the submitted rhu-TNF concentration leads to 50% competition of rhu-TNF cytotoxicity, as antagonistic activity of the examined sample was determined.
Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Muteinen setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Muteine mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven Indikatorzellen (z. B. U937) konkurrieren. Der Kompetition-Rezeptorbindungstest wurde wie folgt durchgeführt:Both the agonistic and the antagonistic effects of Muteinen requires that the latter bind to the TNF receptor. The means that muteins with agonistic or antagonistic activity and rhu-TNF to bind to the TNF receptor on TNF-sensitive Indicator cells (e.g. U937) compete. The competition receptor binding test was carried out as follows:
- 1. 100 µl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Muteins sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktionsgefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriumazid.1. 100 µl medium with different concentrations of the test sample Muteins and the rhu-TNF (= control) were placed in the reaction vessels pipetted. The medium contained 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml heat-inactivated (30 min, 56 ° C) FCS and 100 mg Sodium azide.
- 2. Anschließend wurden 100 µl Medium mit 1 ng ¹²⁵Jod-markiertem rhu-TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das ¹²⁵Jod-markierte rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 µl Medium) mit dem 200fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 µl Medium) gemischt.2. 100 µl medium was then labeled with 1 ng ¹²⁵iodine rhu-TNF (lactoperoxidase method according to Bolton) into the reaction vessels given and mixed. To determine the non-specific Binding (NSB) became the ¹²⁵iodine-labeled in the reaction vessels rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 µl medium) with 200 times Excess of non-radioactively labeled rhu-TNF (200 ng rhu-TNF mixed in 100 ul medium).
- 3. Dann wurden 100 µl Medium mit 2×10⁶ U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 µl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt.3. Then 100 ul medium with 2 × 10⁶ U937 cells (human) were in the Pipette and mix reaction tubes. The reaction vessels (Test volume 300 µl) were incubated at 0 ° C for 90 min. After 45 min the reaction batches were mixed again.
- 4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt.4. After the incubation period, the cells were 5 min at 1800 rpm and Centrifuged at 4 ° C, washed 3 times with medium, quantitatively in Transferred tubes and the cell-bound radioactivity in a Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac).
- 5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten ¹²⁵J-rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der ¹²⁵J-rhu-TNF-Bindung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.5. After correcting the measured values for the non-specific binding, based on the total binding, the 50% competition value defined and the sample concentration that is presented at the ¹²⁵J-rhu-TNF concentration to 50% competition of ¹²⁵J-rhu-TNF binding results as a competitive activity of investigated sample determined.
Ausgangsmaterial war das 578 bp lange TNF-cDNA-Fragment, das für die Aminosäuren 8 bis 157 codiert (Aval-Hind3-Fragment). The starting material was the 578 bp TNF cDNA fragment which was used for the Amino acids 8 to 157 encoded (Aval-Hind3 fragment).
Dieses TNF-cDNA-Teilfragment wurde mit einem chemisch synthetisierten Adaptor, der für die Aminosäuren 1 bis 7 codiert, verknüpft und in einen geeigneten Vektor eingebaut.This partial TNF cDNA fragment was chemically synthesized Adapter that codes for amino acids 1 to 7, linked and in built in a suitable vector.
Als Adaptor diente ein doppelsträngiges DNA-Molekül folgender Sequenz:A double-stranded DNA molecule of the following sequence served as the adapter:
CGATACTACTATG(N) x
TATGATGATAC(M) x GGCT,CGATACTACTATG (N) x
TATGATGATAC (M) x GGCT,
worin
x 0 oder eine durch 3 teilbare Zahl von 3 bis 21,
N A, G, C oder T und
M das jeweils komplementäre Nukleotid zu N sind.wherein
x 0 or a number divisible by 3 from 3 to 21,
NA, G, C or T and
M are the complementary nucleotides to N.
Durch Variation der Adaptoren konnte die Sequenz am 5′-Ende der TNF-cDNA beeinflußt und somit nach erfolgter Genexpression der Aminoterminus des TNF-Proteins verändert werden.By varying the adapters, the sequence at the 5 'end of the TNF cDNA influenced and thus the amino terminus after gene expression of the TNF protein can be changed.
Wurde für N₂₁ GTCAGATCATCTTCTCGAACC eingesetzt, so erhielt man die cDNA für die gesamte reife Form des humanen TNF (1-157), wobei vor der Aminosäure 1 ein Methionin eingebaut ist.Was used for N₂₁ GTCAGATCATCTTCTCGAACC, so you got the cDNA for the entire mature form of human TNF (1-157), where before Amino acid 1 a methionine is incorporated.
Für x gleich 0 erhielt man einen Adaptor, der nach Verknüpfung mit der TNF-cDNA für ein TNF-Protein codierte, bei dem die ersten 7 Aminosäuren am Aminoterminus deletiert sind. Weiterhin konnten durch Variation von N alle Deletionen zwischen 1 und 7 Aminosäuren am Aminoterminus des TNF erzeugt werden.For x equal to 0, an adapter was obtained which, after being linked to the TNF cDNA, coded for a TNF protein in which the first 7 amino acids at the amino terminus were deleted. Furthermore, by variation of N, all deletions between 1 and 7 amino acids at the amino terminus of the TNF could be generated.
Die Adaptoren wurden durch vollautomatische chemische Synthese (Applied Biosystems 380A) hergestellt und durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.The adapters were made through fully automated chemical synthesis (Applied Biosystems 380A) and by preparative polyacrylamide gel electrophoresis cleaned.
Als Vektor diente ein 4,3 kb langes DNA-Molekül, das aus pBR322 durch Spaltung mit Cla1 und Hind3 erhalten wurde.A 4.3 kb long DNA molecule, which was derived from pBR322, was used as the vector Cleavage with Cla1 and Hind3 was obtained.
0,2 pMol des 587 bp langen TNF-Fragmentes wurden mit 0,5 pMol des entsprechenden Adapters und 0,1 pMol des Vektors mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Ligase verknüpft. Mit dieser DNA wurden der E.coli-Stamm W3110 (ATCC 27 325) transformiert und ein Klon mit der entsprechenden DNA-Sequenz isoliert. 0.2 pmole of the 587 bp TNF fragment was mixed with 0.5 pmole of appropriate adapter and 0.1 pmol of the vector using the enzyme T4 DNA ligase linked. With this DNA the E. coli strain W3110 (ATCC 27 325) and a clone with the corresponding DNA sequence isolated.
Der oben beschriebene TNF-cDNA-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und Hind3 gespalten. Man erhielt das 0,6 kb große TNF-cDNA-Fragment durch Gelelektrophorese und anschließende Extraktion aus dem Gel in reiner Form. 100 ng dieses Fragments wurden mit 1 µg des M13mp8-EcoR1-Hind3-Vektorfragments in 20 µl 50 mM TrisHCl (pH=7,4), 10 mM MgCl₂ 25 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP in Gegenwart von 5 Einheiten T4-DNA-Ligase gemischt und über Nacht bei 14°C inkubiert.The TNF cDNA vector described above was used with the restriction enzymes EcoR1 and Hind3 split. The 0.6 kb TNF cDNA fragment was obtained by gel electrophoresis and subsequent extraction from the Pure gel. 100 ng of this fragment were mixed with 1 µg of M13mp8-EcoR1-Hind3 vector fragments in 20 µl 50 mM TrisHCl (pH = 7.4), 10 mM MgCl₂ 25 mM dithiothreitol and 1 mM ATP in the presence of 5 units T4 DNA ligase mixed and incubated overnight at 14 ° C.
Mit diesem Gemisch wurde E.coli JM103 (erhältlich von der Firma Pharmacia) transformiert. Man isolierte durch Ausstanzen aus den Kulturplatten mehrere Plaques, die durch DNA-Sequenzierung auf TNF-cDNA-Insertion untersucht wurden. Der rekombinierte Phage mit dem codierenden Strang der TNF-cDNA wird M13-TNF genannt.With this mixture, E.coli JM103 (available from the company Pharmacia) transformed. One isolated by punching out the Culture plates contain multiple plaques by DNA sequencing TNF cDNA insertion were examined. The recombined phage with the coding strand of the TNF cDNA is called M13-TNF.
Der oben beschriebene M13-TNF war das Ausgangsmolekül für die gezielte Mutagenese des TNF-Gens. Um die beabsichtigten Veränderungen einzuführen, benötigte man Oligodesoxynukleotide, die partiell komplementär zum TNF-codierenden Strang sind ("antisense Oligonukleotide"). Diese Oligonukleotide besitzen eine Länge zwischen 15 und 30 Nukleotiden; bevorzugt verwendet wurden Oligonukleotide mit einer Länge von 23 Nukleotiden. Dabei waren die ersten 10 Nukleotide perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang, dann folgte ein nicht-komplementärer Bereich, der die beabsichtigte Veränderung im TNF-Gen trug, und anschließend folgte wieder ein perfekt komplementärer Bereich von 10 Nukleotiden. Das antisense Oligonukleotid für den Austausch der Aminosäure Nr. 9 Serin gegen Asparaginsäure warThe M13-TNF described above was the starting molecule for the targeted Mutagenesis of the TNF gene. To introduce the intended changes you needed oligodeoxynucleotides that are partially complementary to the TNF-coding strand ("antisense oligonucleotides"). These Oligonucleotides are between 15 and 30 nucleotides in length; oligonucleotides with a length of 23 nucleotides. The first 10 nucleotides were perfectly complementary to the TNF-coding strand, followed by a non-complementary one Area that bore the intended change in the TNF gene and this was followed by a perfectly complementary range of 10 nucleotides. The antisense oligonucleotide for the exchange of Amino acid No. 9 was serine against aspartic acid
pCAGGCTTGTCGTCCGGGGTTCGA.pCAGGCTTGTCGTCCGGGGTTCGA.
Das antisense Oligonukleotid für die Deletion der Aminosäure Nr. 140 Asparaginsäure warThe antisense oligonucleotide for the deletion of amino acid No. 140 Was aspartic acid
pAGTCGAGATAGGGCCGATTG:pAGTCGAGATAGGGCCGATTG:
Die für die Mutagenese verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 1 aufgeführt. The oligonucleotides used for the mutagenesis are shown in Table 1 listed.
Diese Oligonukleotide wurden mittels konventioneller Methoden synthetisiert. Zum Gebrauch bei der Mutagenese wurden 10 pMol des Oligonukleotids 30 min bei 37°C in 10 µl 50 mM TrisHCl (pH=7,5), 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ 10 mM Dithiothreitol, 0,1 mM ATP in Gegenwart von 5 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase phosphoryliert.These oligonucleotides were made using conventional methods synthesized. For use in mutagenesis, 10 pmoles of Oligonucleotides 30 min at 37 ° C in 10 µl 50 mM TrisHCl (pH = 7.5), 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ 10 mM dithiothreitol, 0.1 mM ATP in the presence phosphorylated from 5 units of T4 polynucleotide kinase.
Zum Gebrauch als Probe (s. unten) wurden 2 pMol des synthetischen Oligonukleotids wie oben angegeben phosphoryliert, nur daß anstatt 0,1 mM ATP 1 µm q-³² P-ATP verwendet wurde.For use as a sample (see below), 2 pmoles of the synthetic oligonucleotide were phosphorylated as indicated above, except that 1 µm q- 32 P-ATP was used instead of 0.1 mM ATP.
Die spezifische Aktivität lag im Bereich von 5 · 10⁶ cpm pro pMol Oligonukleotid.The specific activity was in the range of 5 · 10⁶ cpm per pmole Oligonucleotide.
Die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der einzelsträngigen DNA von M13-TNF ergab nach Kettenverlängerung eine Heteroduplex-DNA, bei der ein Strang die mutierte DNA beinhaltete.Hybridization of the oligonucleotides with the single-stranded DNA of M13-TNF resulted in heteroduplex DNA after chain extension which contained a strand of the mutated DNA.
Zur partiellen Heteroduplexbildung wurden 300 ng M13-TNF DNA mit 1 pMol des phosphorylierten Oligonukleotids in 20 µl 10 mM TrisHCl (pH=7,5), 0,1 mM EDTA, 50 mMol NaCl auf 80°C (2 min), 50°C (5 min) und Raumtemperatur (5 min) erwärmt. Die Kettenverlängerung wurde durch Zugabe von 30 µl 50 mM TrisHCl (pH=8,0), 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 mM dATP, 0,2 mM an dGTP, dTTP, dCTP, 2 Einheiten E.coli Polymerase I (großes Fragment) und 20 Einheiten T4 DNA-Ligase gestartet. For partial heteroduplex formation, 300 ng of M13-TNF DNA were used 1 pmole of the phosphorylated oligonucleotide in 20 ul 10 mM TrisHCl (pH = 7.5), 0.1 mM EDTA, 50 mmol NaCl at 80 ° C (2 min), 50 ° C (5 min) and warmed to room temperature (5 min). The chain extension was through Add 30 µl 50 mM TrisHCl (pH = 8.0), 0.1 mM EDTA, 12 mM MgCl₂, 10mM dithiothreitol, 0.7mM ATP, 0.07mM dATP, 0.2mM dGTP, dTTP, dCTP, 2 units of E. coli polymerase I (large fragment) and 20 units T4 DNA ligase started.
Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch 4 h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C über Nacht inkubiert. Aliquots wurden mit Phenol extrahiert, die DNA mit Ethanol ausgefällt und in 15 µl Wasser gelöst. Die DNA dieser Aliquots wurde zur Transformation von E.coli JM 103 benutzt.After 30 min at room temperature the reaction mixture was at 37 ° C for 4 h incubated and then incubated at 4 ° C overnight. Aliquots were extracted with phenol, the DNA precipitated with ethanol and in 15 µl water dissolved. The DNA of these aliquots became the transformation used by E.coli JM 103.
Bakterienkulturschalen (15 cm Durchmesser), die einige Hundert rekombinante Phagen-Plaques enthalten, wurden durch in situ Plaque-Hybridisierung (Science 196, 180, 1977) auf den mutierten Genotyp hin untersucht, indem man das entsprechende radioaktiv markierte Oligonukleotid (die Probe) und Nitrocellulosefilterabzüge der Phagen-Plaques hybridisierte (etwa 10⁶ cpm pro Filter). Die Hybridisierung geschah über Nacht bei 50°C, 40% Formamid und 5 · SSC (1 · SSC=0,1 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH=7,2).Bacterial culture dishes (15 cm in diameter) that are several hundred containing recombinant phage plaques were by in situ plaque hybridization (Science 196, 180, 1977) for the mutated genotype examined by using the appropriate radiolabelled oligonucleotide (the sample) and nitrocellulose filter prints of the phage plaques hybridized (about 10⁶ cpm per filter). The hybridization happened overnight at 50 ° C, 40% formamide and 5 * SSC (1 * SSC = 0.1 M NaCl, 15 mM sodium citrate pH = 7.2).
Die Filter wurden bei 45°C in 2 · SSC, 0,02% Natriumdodecylsulfat gewaschen, an der Luft getrocknet, auf einen Röntgenfilm aufgebracht und bei -70°C exponiert.The filters were at 45 ° C in 2X SSC, 0.02% sodium dodecyl sulfate washed, air-dried, applied to an X-ray film and exposed at -70 ° C.
Es war notwendig, die Stringenz der Hybridisierung (durch Veränderung der SSC-Konzentration beim Waschen der Filter) für das entsprechende Oligonukleotid individuell einzustellen; jede Mutante variierte je nach Anzahl und Art der ausgetauschten oder deletierten Nukleotide in ihrer Fähigkeit, mit dem Oligonukleotid zu hybridisieren.It was necessary to change the stringency of hybridization (by changing the SSC concentration when washing the filter) for the corresponding one Adjust the oligonucleotide individually; every mutant varied according to the number and type of nucleotides exchanged or deleted in their ability to hybridize with the oligonucleotide.
Ein mit der radioaktiv markierten Probe hybridisierender Phage wurde aus der Bakterienkulturplatte ausgestanzt und als Inokulum zur Infektion von E.coli JM 103 verwendet.A phage hybridizing with the radiolabelled sample was created punched out of the bacterial culture plate and used as an inoculum Infection from E.coli JM 103 used.
Aus dem Kulturüberstand wurde die einzelsträngige DNA, aus dem Zellniederschlag die doppelsträngige DNA präpariert.The single-stranded DNA from which the The double-stranded DNA is prepared for cell precipitation.
Die einzelsträngige DNA wurde nach der Didesoxymethode (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, 1977) sequenziert, um die Mutation zu bestätigen. Dann konnte aus der doppelsträngigen DNA durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Cla1 und Hind3 und anschließende Gelelektrophorese das Gen für das TNF-Mutein isoliert werden.The single-stranded DNA was made according to the dideoxy method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, 1977) sequenced the mutation to confirm. Then the double-stranded DNA could be cleaved with the restriction enzymes Cla1 and Hind3 and subsequent Gel electrophoresis the gene for the TNF mutein can be isolated.
Das in den obigen Beispielen hergestellte Gen für ein TNF-Mutein wurde an seinem 5′-Ende (Cla1) mit Promotorsequenzen, wie z. B. lac-Promotor oder trp-Promotor und ribosomalen Bindungsstellen verknüpft. An seinem 3′-Ende (Hind3) enthielt das Gen einen Transkriptionsterminator, wie den trpA-Terminator. Diese DNA-Sequenzen sind alle kommerziell erhältlich (Pharmacia-LKB, Freiburg).The gene for a TNF mutein produced in the above examples was at its 5'-end (Cla1) with promoter sequences, such as. B. lac promoter or trp promoter and ribosomal binding sites linked. On his 3'-end (Hind3) the gene contained a transcription terminator, such as the trpA terminator. These DNA sequences are all commercial available (Pharmacia-LKB, Freiburg).
Das so mit den nötigen Expressionssignalen versehene Gen für das TNF-Mutein wurde in einen Vektor wie z. B. pBR322 eingebaut. Mit diesem Vektor wurde der E.coli Stamm W3110 transformiert und die erhaltenen Klone auf TNF-Mutein-Produktion getestet. Dazu wurde der Bakterienüberstand nach Verdünnung in einem biologischen Test untersucht. Positive Bakterienklone werden bei 37°C in 10 l LB-Nährmedium gezüchtet.The gene for the TNF mutein thus provided with the necessary expression signals was converted into a vector such as B. pBR322 installed. With this E.coli strain W3110 was transformed in vector and the resulting ones Clones tested for TNF mutein production. The bacterial supernatant was added to this after dilution examined in a biological test. Positive bacterial clones are grown at 37 ° C in 10 l LB culture medium bred.
1 l Fermentationsbrühe eines eine neue Substanz produzierenden E.coli-Stamms wurden 30 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 200 ml 0,4 M Argininhydrochlorid, 20 mM Natriumphosphat pH 8,5 aufgenommen und 30 min mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wurde mit 6 ml 2M MnCl₂ versetzt und 45 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,9 gebracht und mit festem Ammoniumsulfat auf 60% Sättigung eingestellt.1 l fermentation broth of a E. coli strain producing a new substance were centrifuged at 3000 g for 30 min. The backlog was in 200 ml of 0.4 M arginine hydrochloride, 20 mM sodium phosphate pH 8.5 was added and treated with ultrasound for 30 min. The suspension was with 6 ml of 2M MnCl₂ are added and centrifuged at 3000 g for 45 min. The Supernatant was brought to pH 8.9 with dilute NH₃ solution and with solid ammonium sulfate adjusted to 60% saturation.
Das Proteinpräzipitat wurde in 0,2 M Argininhydrochlorid pH 7,5 suspendiert und gegen 0,4 M Argininhydrochlorid pH 7,5 dialysiert. Nach 16 h wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und auf das 5fache Volumen mit Wasser verdünnt.The protein precipitate was dissolved in 0.2 M arginine hydrochloride pH 7.5 suspended and dialyzed against 0.4 M arginine hydrochloride pH 7.5. After 16 h was adjusted to pH 8.5 with dilute NH₃ solution and diluted to 5 times the volume with water.
Diese Lösung wurde über eine mit 0,01 M Argininpuffer pH 8,5 äquilibrierte ®R-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit 0,02 M Na-Phosphat, 0,06 M NaCl. Das Eluat wurde nach dem Verdünnen auf das 2,5fache über eine mit 0,02 M Na-Phosphat pH 8,0 äquilibrierte ®S-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer erhielt man durch Elution mit 0,05 M Na-Phosphat, 0,1 M NaCl, 0,1 M Arginin pH 8,6 SDS-Polyacrylamidgel-elektrophoretisch reines Protein.This solution was over a pH 8.5 with 0.01 M arginine buffer Equilibrated ®R-Sepharose column (Pharmacia) chromatographed. The Elution was carried out with 0.02 M Na phosphate, 0.06 M NaCl. The eluate was after dilution to 2.5-fold over one with 0.02 M Na phosphate Chromatographed pH 8.0 equilibrated ®S-Sepharose column (Pharmacia). After washing the column with equilibration buffer, was obtained from Elution with 0.05 M Na phosphate, 0.1 M NaCl, 0.1 M arginine pH 8.6 SDS polyacrylamide gel electrophoretically pure protein.
So wurden durch Mutagenese mit den in Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotiden in der angegebenen Reihenfolge folgende TNF-Proteine hergestellt (Die Positionen geben die Stellung im TNF an, die verändert ist):So were by mutagenesis with those listed in Table 1 Oligonucleotides following TNF proteins in the order given (The positions indicate the position in the TNF, the is changed):
Position 9: Ser ersetzt durch Asp
Position 10: Asp ersetzt durch Lys
Position 10: Asp ersetzt durch Arg
Position 11: Lys ersetzt durch Glu
Position 15: His ersetzt durch Phe
Position 15: His ersetzt durch Asn
Position 26: Leu ersetzt durch Phe
Position 35: Ala ersetzt durch Leu
Position 46: Asn ersetzt durch Asp
Position 52: Ser ersetzt durch Asp
Position 54: Gly ersetzt durch Ala
Position 54: Gly ersetzt durch Val
Position 56: Tyr ersetzt durch Phe
Position 57: Leu ersetzt durch Ala
Position 59: Tyr ersetzt durch Phe
Position 60: Ser ersetzt durch Ala
Position 61: Gln ersetzt durch Ile
Position 62: Val ersetzt durch Ile
Position 62: Val ersetzt durch Leu
Position 78: His ersetzt durch Phe
Position 78: His ersetzt durch Asn
Position 87: Tyr ersetzt durch Phe
Position 87: Tyr ersetzt durch His
Position 95: Ser ersetzt durch Val
Position 98: Lys ersetzt durch Gln
Position 119: Tyr ersetzt durch Phe
Position 119: Tyr ersetzt durch Arg
Position 121: Gly ersetzt durch Ala
Position 121: Gly ersetzt durch Val
Position 133: Ser ersetzt durch Val
Position 136: Ile ersetzt durch Val
Position 137: Asn ersetzt durch Asp
Position 138: Arg ersetzt durch Asp
Position 138: Arg ersetzt durch Gly
Position 139: Pro ersetzt durch Asp
Position 139: Pro ersetzt durch Ile
Position 139: Pro ersetzt durch Gly
Position 140: Asp ersetzt durch Pro
Position 140: Asp deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch His
Position 141: Tyr deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch Phe
Position 144: Phe ersetzt durch Ala
Position 144: Phe ersetzt durch Glu
Position 144: Phe ersetzt durch His
Position 144: Phe ersetzt durch Arg
Position 150: Val ersetzt durch Leu
Position 150: Val ersetzt durch Ile
Position 156: Ala ersetzt durch Val
Position 157: Leu ersetzt durch Gly.Position 9: Ser replaced by Asp
Position 10: Asp replaced by Lys
Position 10: Asp replaced by Arg
Position 11: Lys replaced by Glu
Position 15: His replaced by Phe
Position 15: His replaced by Asn
Position 26: Leu replaced by Phe
Position 35: Ala replaced by Leu
Position 46: Asn replaced by Asp
Position 52: Ser replaced by Asp
Position 54: Gly replaced by Ala
Position 54: Gly replaced by Val
Position 56: Tyr replaced by Phe
Position 57: Leu replaced by Ala
Position 59: Tyr replaced by Phe
Position 60: Ser replaced by Ala
Position 61: Gln replaced by Ile
Position 62: Val replaced by Ile
Position 62: Val replaced by Leu
Position 78: His replaced by Phe
Position 78: His replaced by Asn
Position 87: Tyr replaced by Phe
Position 87: Tyr replaced by His
Position 95: Ser replaced by Val
Position 98: Lys replaced by Gln
Position 119: Tyr replaced by Phe
Position 119: Tyr replaced by Arg
Position 121: Gly replaced by Ala
Position 121: Gly replaced by Val
Position 133: Ser replaced by Val
Position 136: Ile replaced by Val
Position 137: Asn replaced by Asp
Position 138: Arg replaced by Asp
Position 138: Arg replaced by Gly
Position 139: Pro replaced by Asp
Position 139: Pro replaced by Ile
Position 139: Pro replaced by Gly
Position 140: Asp replaced by Pro
Position 140: Asp deleted
Position 141: Tyr replaced by His
Position 141: Tyr deleted
Position 142: Leu replaced by Phe
Position 144: Phe replaced by Ala
Position 144: Phe replaced by Glu
Position 144: Phe replaced by His
Position 144: Phe replaced by Arg
Position 150: Val replaced by Leu
Position 150: Val replaced by Ile
Position 156: Ala replaced by Val
Position 157: Leu replaced by Gly.
Claims (8)
Position 10: Asp ersetzt durch A
Position 11: Lys ersetzt durch A
Position 15: His ersetzt durch B oder C
Position 26: Leu ersetzt durch C
Position 35: Ala ersetzt durch C
Position 46: Asn ersetzt durch A
Position 52: Ser ersetzt durch A
Position 54: Gly ersetzt durch C
Position 56: Tyr ersetzt durch C
Position 57: Leu ersetzt durch C
Position 59: Tyr ersetzt durch C
Position 60: Ser ersetzt durch C
Position 61: Gln ersetzt durch C
Position 62: Val ersetzt durch C
Position 78: His ersetzt durch C oder B
Position 87: Tyr ersetzt durch C
Position 95: Ser ersetzt durch C
Position 98: Lys ersetzt durch B
Position 119: Tyr ersetzt durch C oder A
Position 121: Gly ersetzt durch C
Position 133: Ser ersetzt durch C
Position 136: Ile ersetzt durch C
Position 137: Asn ersetzt durch A
Position 138: Arg ersetzt durch A oder B
Position 139: Pro ersetzt durch A, C oder B
Position 140: Asp ersetzt durch A, C oder deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch A oder deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch C
Position 144: Phe ersetzt durch C oder A
Position 150: Val ersetzt durch C
Position 156: Ala ersetzt durch C
Position 157: Leu ersetzt durch B,worin A eine Aminosäure mit geladener Seitenkette, B eine Aminosäure mit polarer ungeladener Seitenkette und C eine Aminosäure mit hydrophober Seitenkette bedeuten.2. TNF polypeptides according to claim 1, in which at least one of the following changes is present: Position 9: Ser replaced by A
Position 10: Asp replaced by A
Position 11: Lys replaced by A
Position 15: His replaced by B or C
Position 26: Leu replaced by C
Position 35: Ala replaced by C
Position 46: Asn replaced by A
Position 52: Ser replaced by A
Position 54: Gly replaced by C
Position 56: Tyr replaced by C
Position 57: Leu replaced by C
Position 59: Tyr replaced by C
Position 60: Ser replaced by C
Position 61: Gln replaced by C
Position 62: Val replaced by C
Position 78: His replaced by C or B
Position 87: Tyr replaced by C
Position 95: Ser replaced by C
Position 98: Lys replaced by B
Position 119: Tyr replaced by C or A
Position 121: Gly replaced by C
Position 133: Ser replaced by C
Position 136: Ile replaced by C
Position 137: Asn replaced by A
Position 138: Arg replaced by A or B
Position 139: Pro replaced by A, C or B
Position 140: Asp replaced by A, C or deleted
Position 141: Tyr replaced by A or deleted
Position 142: Leu replaced by C
Position 144: Phe replaced by C or A
Position 150: Val replaced by C
Position 156: Ala replaced by C
Position 157: Leu replaced by B, where A is an amino acid with a charged side chain, B is an amino acid with a polar uncharged side chain and C is an amino acid with a hydrophobic side chain.
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