DE3737367A1 - Vascular-antikoagulierende proteine, dna die diese kodieren, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind biologisch aktive Proteine, die für diese kodierenden DNA-Moleküle, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung.

In den meisten Säugetieren existieren Proteine, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen. Diese Proteine können in drei Gruppen eingeteilt werden, wobei die Einteilung auf den unterschiedlichen Wirkmechanismen beruht.

• 1. Proteine, die mit dem Gerinnungsfaktor einen Komplex bilden und dadurch den Gerinnungsfaktor unwirksam machen. Dazu gehören die Proteine:
  • a) Antithrombin-III (Thromb. Res. 5, 439-452 [1974])
  • b) α₁-Protease Inhibitor (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 [1983])
  • c) α₂-Makroglobulin (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 [1983])
  • d) C₁-Inhibitor (Biochemistry 20, 2738-2743 [1981])
  • e) Protease Nexin (J. Biol. Chem. 258, 10 439-10 444, [1983]).
• 2. Proteine, die einen Gerinnungsfaktor proteolytisch zerschneiden und dadurch den Gerinnungsfaktor desaktivieren. Als einziges Protein dieser Art ist bisher Protein C beschrieben (J. Biol. Chem. 251, 355-363, [1976]).
• 3. Proteine, die die negativ geladenen Phospholipide abschirmen und/oder hydrolisieren, so daß die Phospholipid-abhängigen Reaktionen des Blutgerinnungsmechanismus gehemmt werden. Bisher sind nur Phospholipasen, die aus verschiedenen Schlangengiftsorten isoliert wurden, beschrieben worden (Eu. J. Biochem. 112, 25-32 [1980]).

Das stufenweise ablaufende Gerinnungssystem ist in den letzten Jahren intensiv untersucht worden. Es wird als ein sich verstärkendes Mehrstufensystem verschiedener miteinander verbundener, proteolytischer Reaktionen verstanden, bei dem ein Enzym ein Zymogen in die aktive Form umsetzt (vgl. Jackson C. M., Nemerson Y., Ann. Rev. Biochem. 49, 765-811, [1980]). Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird in entscheidender Weise durch die Anwesenheit von Phospholipiden und anderen Kofaktoren wie Faktor V_a und Faktor VIII_a vergrößert. In vivo werden die Prokoagulationsreaktionen durch verschiedene Inhibitationsmechanismen geregelt, die einem explosiv thrombotischen Trauma nach einer geringen Aktivierung der Gerinnungskaskade vorbeugen.

Die Antigerinnungsmechanismen können wie folgt eingeteilt werden (Rosenberg, R. D., Rosenberg, J. S., J. Clin. Invest. 74, 1-6 [1984]):

• 1. Der Serin-Protease-Faktor X_a und Thrombin werden infolge ihrer Bindung an Antithrombin III bzw. an den Antithrombin/Heparin-Komplex inaktiviert. Sowohl die Prothrombin-Aktivierung als auch die Bildung von Fibrin kann auch diese Weise gehemmt werden. Neben Anti-thrombin III gibt es noch verschiedene andere Plasma-Protease-Inhibitoren wie beispielsweise α₂-Maktroglobulin und Antitrypsin, deren Wirkung zeitabhängig ist.
• 2. Die Entdeckung des Protein C′s führte zur Aufdeckung eines weiteren Antigerinnungsmechanismus. Ist das Protein C einmal aktiviert worden, wirkt es durch die selektive Proteolyse der Proteinkofaktoren Faktor V_a und VIII_a, durch die die Prothrombinase und das Enzym, das den Faktor X umsetzt, inaktiviert werden, als Antikoagulanz. Einwirkung von Thrombin aus Fibrinogen, wodurch der Bildung eines unlöslichen Fibrins vorgebeugt wird (Nossel, H. L., Nature, 291, 165-167 [1981]).

Von den oben genannten, in den Gerinnungsprozeß eingreifenden körpereigenen Proteinen ist z. Zt. nur das Anthribombin III in klinischem Einsatz. Als erheblicher Nachteil hat sich jedoch die bei der Anwendung dieses Proteins auftretende Erhöhung der Blutungsneigung herausgestellt.

Alle bisher als Antikoagulantien eingesetzten Mittel, ob körpereigener oder synthetischer Natur machen irgendeiner Weise die Gerinnungsfaktoren unwirksam und führen dadurch zu Nebenwirkungen, die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozeß auswirken können.

Überraschenderweise konnten nun neben diesen Proteinen weitere körpereigene Stoffe isoliert werden, die zwar die gewünschten blutgerinnungshemmenden Eigenschaften unter besonderen Bedingungen zeigen, hierbei aber die Blutungsgefahr nicht erhöhen. Bei größeren Blutungen verlieren diese Proteine ihre blutgerinnungshemmenden Eigenschaften und stören dadurch bei deren Verwendung nicht die in solchen Fällen überlebensnotwendigen Gerinnungsprozesse. Da sie erstmals isoliert wurden aus stark vaskularisiertem Gewebe, wurden sie "vascular anticoagulating proteins", VAC genannt.

Die aus stark vaskularisierten Geweben wie Nabelschnurgefäßen und Placenta isolierten Proteine weisen Molekulargewichte von ca. 70×10³, ca. 60×10³, ca. 34×10³ und ca. 32×10³ auf, von denen die Substanzen mit den Molekulargewichten 34 respektive 32×10³ aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen. Die genaue biochemische Charakterisierung dieser Proteine, sowie deren Isolierung und Reinigung findet sich in der EP-A-0 1 81 465 vom 21. Mai 1986.

Proteine mit VAC Aktivitität stellen natürliche Blutgerinnungshemmstoffe dar, die bei der Blutgerinnungskaskade an zwei Stellen eingreifen.

Das erste Mal inhibieren sie bei der durch die Faktoren IXa und VIIIa katalysierten Aktivierung des Faktors X und Xa, das zweite Mal unterbinden sie die Spaltung von Prothrombin zu Thrombin, die durch die Faktoren Xa und Va vermittelt wird. Beiden Aktivierungschritten ist gemeinsam, daß sie Kalzium-Ionen und Phospholipide benötigen. Offenbar können VAC-Proteine ebenfalls mit Phospholipiden in Wechselwirkung treten, und durch diese Bindung die Aktivierungsschritte der Gerinnungsfaktoren blockieren.

Ihre Eigenschaften machen die Proteine zu interessanten, pharmakologisch äußerst wertvollen Wirkstoffen. Um sie jedoch in ausreichenden Mengen in hochreiner Form zur Verfügung zu haben ist deren Herstellung auf anderen als proteinreinigendem Weg aus natürlichen Gewebe erforderlich. Hierzu bietet sich die gentechnische Methode an.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, Proteine mit VAC-Aktivität gentechnisch herzustellen.

Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß die Aminosäuresequenz von Teilen der aus stark vaskularisiertem Gewebe isolierten und hochgereinigten Proteine mit VAC-Aktivität (EPA 0 1 81 465) aufgeklärt wurde, anhand dieser Sequenzen synthetische DNA-Sonden hergestellt wurden und hiermit geeignete cDNA-Bibliotheken durchsucht wurden. Nach Isolierung von den Sonden hybridisierender cDNA, deren Sequenzbestimmung sowie entsprechender Manipulation wurden diese cDNA in geeigneten Wirtssystemen beispielsweise in Bakterien, Hefen oder Säugetierzellen zur Expression gebracht.

Eines von den gereinigten Proteinen wurde enzymatisch mit Trypsin gespalten. Die entstandenen Peptide wurden aufgetrennt und ausgewählte Fragmente sequenziert. Die Sequenz des N-Terminus widersetzte sich jedoch einer direkten Analyse, da die erste Aminosäure offensichtlich blockiert ist.

Die Sequenzinformationen sind in Fig. 1a aufgeführt.

Zur Herstellung einer geeigneten DNA-Sonde sind prinzipiell drei Wege möglich. Ist ein längerer Abschnitt des Proteins, etwa 30 oder mehr Aminosäuren lang, bekannt, besteht die Möglichkeit, unter Beachtung der bevorzugt verwendeten Codons bei Säugern eine wahrscheinlichste Sequenz für den korrespondierenden mRNA-Abschnitt zu erstellen. Eine solche Sonde ist im schlechtesten Fall etwa 66% homolog zur tatsächlichen Sequenz. Dies ist auch der Grund, weshalb die Sonde relativ lang sein müßte, um unter nicht stringenten Bedingungen hybridisieren zu können.

Die zweite Möglichkeit besteht darin, für einen kurzen Peptidabschnitt, ca. sechs bis sieben Aminosäuren lang, alle erdenklichen Variationen an Oligonukleotiden zu synthetisieren. Werden solch komplexe Mischungen beim Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken verwendet, können relativ viel "falsch" positiv reagierende Klone isoliert werden. Außerdem kann das Hybridisierungssignal sehr schwach ausfallen, da das perfekt passende Einzeloligonukleotid nur einen geringen Anteil an der Gesamtmischung ausmacht.

Der dritte Weg umgeht zwar nicht die Variabilität einer Oligonukleotidsonde, sorgt aber durch die Wahl eines speziellen Nukleosidtriphosphats (ITP) dafür, daß an die gesuchte (oder auch "falsche") cDNA alle Moleküle der Sonde binden können. So wurden zu dem Tryptischen Peptid [P30/I] passende 23 Basen lange Oligonukleotide unter Verwendung von Inosintriphosphat synthetisiert.

Wie bereits erwähnt, können VAC-Proteine aus stark vaskularisiertem Gewebe isoliert werden. Gewebe der Wahl sind Nabelschnurgefäße oder Placenta. Daher und da bekannt ist, daß in der Placenta im Gegensatz zu anderen Spezial-Geweben fast alle Gene exprimiert werden, wurden die oben erwähnten DNA-Sonden verwendet, um eine placentale cDNA-Bibliothek die aus placentalen Gewebe in an sich bekannter Weise hergestellt worden war nach cDNA-Molekülen, die für VAC-Proteine kodieren, zu durchsuchen.

Zum Durchsuchen der cDNA-Bibliothek nach für VAC-protein kodierender cDNA wurden entsprechend der Sequenz des tryptischen Peptides P16/II zwei und des Staph A Peptides P20/I/6 ein Oligonukleotid synthetisiert (Fig. 1). Diese Oligonukleotide stellen jeweils eine Mischung aller Varianten dar, die jede Kodierungsmöglichkeit der entsprechenden mRNA berücksichtigen. EBI-386 weist bei einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden 512 Variationen auf und paßt zu dem Staph-A Peptid P20/I/6. Um die Variation bei dem Oligonukleotid für das tryptische Peptid P16/II niedriger zu halten, wurden zwei Oligonukleotide (20-mere) synthetisiert: EBI-387: 128 Variationen, EBI-388: 64 Variationen.

Weiter wurden zu dem tryptischen VAC-Peptid P30/I passend zwei Oligonukleotide unter Verwendung von Desoxyinosin als Base bei "Wobble" Positionen synthetisiert (Fig. 2): EBI-118 und EBI-119. Diese Substitution wurde von E. Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260/5 (1985), pp. 2605-2608, sowie Y. Takahashi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1985) pp. 1931-1935, beschrieben. Inosin basenpaart gut mit Cytosin, stört jedoch kaum die Ausbildung der Doppel-helix, wenn andere Nukleotide als Partner angeboten werden.

Nachdem jedes dieser Oligonukleotide in bekannter Weise radioaktiv markiert worden war, wurden Abzüge von Phagen-Platten hiermit nach bekannten Verfahren hybridisiert.

Aus der Hybridisierung mit EBI-386, -387 und -388 resultierten die Phagen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5, Lambda-P6/6. Die Hybridisierung mit EBI-118 und -119 resultierte in den Phagen Lambda-Nr. 15, Lambda-Nr. 19 und Lambda-Nr. 22.

Die aus den Phagen isolierten DNAs wurden mit EcoRI geschnitten und die entstehenden Fragmente isoliert.

Die cDNA-Inserts der Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 hatten Größen von etwa 1300 bis 1400 bp. Die Sequenzanalyse zeigte, daß alle drei Klone von ein und derselben mRNA abgeleitet waren. Das 5′-Ende der mRNA fehlte jedoch in der cDNAs. Die Inserts der Phagen Lambda-Nr. 15, Lambda-Nr. 19 und Lambda-Nr. 22 hatten Längen von ca. 1600, 1100, 1000 bp. Die Sequenzanalyse ließ eine annähernd vollständige cDNA vermuten.

Die cDNAs der beiden Phagengruppen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 sowie Lambda-Nr. 15, Lambda-Nr. 19 und Lambda-Nr. 22 sind von zwei verschiedenen mRNAs abgeleitet, wie die Sequenzanalyse ergab. die EcoRI-Inserts der drei Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺-Vektor ligiert (Vektor Cloning System, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Die resultierenden Klone wurden pP6/5, pP6/6 und pP11/3 genannt.

Die EcoRI-Inserts der drei Klone Lambda-Nr. 15, Lambda-Nr. 19 und Lambda-Nr. 22 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺-Vektor ligiert. Die resuliertenden Klone wurden pRH201, pRH202 und pRH203 genannt.

Um weitere cDNA-Klone zu erhalten, wurden die humane, plazentale Lambda-gt10 Bibliothek nochmals durchsucht, diesmal mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Insert des pP11/3 als Sonde.

Insgesamt wurden 69 positiv reagierende Klone erhalten (Lambda-VAC1 bis Lambda-VAC69).

12 dieser Klone wurden im kleinen Maßstab wie oben beschrieben präpariert, die cDNA-Inserts mit EcoRI freigesetzt und isoliert. Dabei zeigte sich, daß das Insert des Klons Lambda-VAC10 den gesamten für VAC- Protein kodierenden Leserahmen enthält. Zur Charakterisierung der für VAC-alfa und VAC-beta kodierenden cDNAs wurden ein Northernblot-Experiment, Sequenzanalysen und eine genomische Southernblot- Analyse durchgeführt.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 abgebildet. Die cDNA des Klons pP11/3 hybridisiert an eine mRNA der Größe von etwa 1700 Basen ("VAC-alfa"), die cDNA des Klons pRH 203 an eine mRNA der Größe von etwa 2200 Basen ("VAC-beta").

Da erstens die eingesetzte Radioaktivitätsmenge sowie die aufgetragene Menge mRNA pro Spur etwa gleich war und zweitens die Hybridisierung eines Genom-Blots in derselben Lösung Banden gleicher Intensität mit beiden cDNAs erbab (siehe unten), ist zu schließen, daß die kürzere mRNA ("VAC-alfa") in größeren Mengen als die längere ("VAC-beta") mRNA in Plazenta vertreten ist.

Zur Sequenzanalyse der VAC-alfa") cDNA wurden die cDNA- Klone pP6/5, pP6/6 und pP11/3 total, sowie die der Klone Lambda-VAC1 bis -12 partiell sequenziert. Das Resultat ist in Fig. 4 abgebildet. Es wurden insgesamt 1465 Basen sequenziert. Die cDNA weist einen langen, offenen Leserahmen auf, der für 320 Aminosäuren kodieren kann. Wird die DNA Sequenz in eine Aminosäuresequenz übersetzt, so können alle sequenzierten Peptide der tryptischen Fragmente in dieser Sequenz untergebracht werden (Fig. 5). Es handelt sich daher bei dieser cDNA um jene, deren korrespondierende mRNA für VAC-protein kodiert. Da die Sequenzen der zweiten isolierten cDNA für ein ähnliches, aber von VAC verschiedenes Protein kodiert, wird hier der Name-VAC-alfa eingeführt.

Dem ersten ATG-Codon (Basen 35-37) geht im selben Leserahmen ein Stop-Codon voran. Die Basen 30 bis 38 erfüllen ziemlich gut die Kozakregel (M. Kozak, Nature 308 [1984], pp. 241-246), die die Konsensussequenz in der Nähe des Translationsstartcodons mit CC(A/G)CCAUGG angibt, die entsprechende Sequenz hier lautet TCGCTATGG. Die 3′ nichttranslatierte Region ist 471 Basen lang. 15 Basen von Beginn des poly-A Abschnitts befindet sich die Polyadenylierungssequenz AATAAA (N.J. Proudfoot et al., Nature 263 [1976], pp. 211-214). Wird eine Kettenlänge von 150 bis 200 Basen für den Poly-A-Abschnitt der mRNA gerechnet, beträgt die Gesamtlänge der nRNA auf Grund der cDNA Sequenz 1600-1650 Basen. Da im Northern-Blot-Experiment ein höherer Wert bestimmt wurde, ist die 5′ nichttranslatierte Region in keiner cDNA komplett enthalten.

Die cDNA des Klons pP6/5 weist im Gegensatz zu allen anderen cDNA-Klonen an Position 100 C statt A auf. Dadurch würde sich das Triplett 98-100 (22. Codon) von GAA nach GAC ändern und für Asp anstelle von Glu kodieren. Diese Abweichung kann mehrere Ursachen haben: a) die Reverse Transkriptase baute ein falsches Nukleotid ein, b) es handelt sich um die Transkripte zweier alleler, an dieser Stelle verschiedener Gene oder c) es gibt zwei nicht allele Gene, die sich an dieser Position unterscheiden.

Der lange, offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit 320 Aminosäuren, von dem das Met-1 wahrscheinlich abgespalten, und das folgende Alanin an der Aminogruppe, möglicherweise durch Acylierung, blockiert wird. Das errechnete Molekulargewicht beträgt 35 896 D und ist höher als der Wert nach SDS-PAGE. Allerdings ist der Anteil geladener Aminosäuren (Asp, Glu, Lys, Arg, His) mit 30,6% (98/320) überdurchschnittlich hoch verglichen mit dem durchschnittlichen Wert von 25,1%. Dies würde das veränderte Wanderungsverhalten des Proteins bei der SDS-PAGE erklären. Innerhalb der stark geladenen Aminosäuren überwiegen die sauren Aminosäuren (Asp und Glu) mit 54 gegenüber den basischen (Lys und Arg) mit 41. Dies erklärt den sauren, isoelektrischen Punkt des VAC-alfa-Proteins (pI = 4,4 bis 4,8). VAC-alfa enthält nur ein für Cystein codierendes Triplett (Aminosäure-Position 316); eine typische N-Glykosylierungsstelle Asn-XXX-Ser/Thr) ist nicht vorhanden.

Eine Strukturanalyse der Aminosäuresequenz (modifiziert nach Pustell, J et al., Nucleic Acids Res. 10 [1982] pp 4765-4782) ergibt eine vierfache Wiederholung einer 67 Aminosäure langen Sequenz (Fig. 6), im folgenden "Repeats" genannt. Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 15 Aminosäuren (22,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 28 Positionen (41,8%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure. Auffällig ist auch der 6 Aminosäuren lange Abschnitt am Ende jeder Repeat, der fast ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren besteht ("oooooo" in Fig. 6).

Die Sequenzanalyse der Klone Nr. 15, Nr. 19 und Nr. 22 ergab für die VAC-beta cDNA 1940 bp, die in einen poly-A- Abschnitt übergeht (Fig. 7). 16 Basen vor dem poly-A- Abschnitt findet sich das Polyadenylierungssignal AATAAA. Allerdings kommt diese Konsensussequenz bereits an der Nukleotidposition 1704-1709 vor. Weshalb diese Sequenz nicht als Polyadenylierungssignal verwendet wird, ist unbekannt. Die zusätzlich erforderliche Sequenz an der 3′-Seite der AATAAA-Sequenz, YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 [1984], pp. 473-474) kommt erst relativ weit entfernt vor (TGTGTTAT, Position 1735-1742); möglich, daß dies die Erklärung für ein Nichtakzeptieren dieser ersten Polyadenylierungssequenz darstellt.

Die cDNA enthält einen langen, offenen Leserahmen, der vom Beginn der cDNA bis Position 1087 reicht. Es würde ein Kodierungspotential für 362 Aminosäuren beinhalten. Aus Analogiegründen zu VAC-alfa und aufgrund der Tatsache, daß auch ein 34 000 D-Protein bei der Reinigung von VAC anfällt (siehe E. P. A. 1 81 465) wurde das erste Methioninkoden (ATG, Position 107-109) als Translationsstart angenommen. Die Kozakregel ist hier nicht so gut erfüllt wie bei VAC-alfa (AAGAGATGG auf Position 102-110). Das resultierende Protein (VAC-beta) ist 327 Aminosäuren lang. Es besitzt 4 Cysteinreste (Aminosäureposition 161, 206, 250 und 293) und eine potentielle N-Glykosylierungsstelle (Asn-Lys-Ser, Aminosäureposition 225-227). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 36 837 (Fig. 9). Auch in VAC-beta gibt es überdurchschnittlich viele geladene Reste: 97/327 (29,6%), wobei die sauren Aminosäuren (Asp + Glu: 49) über die basischen (Lys + Arg 42) überwiegen; eine Erklärung für das nach SDS-PAGE ermittelte niedrigere Molekulargewicht.

Auch VAC-beta zeigt eine interen Wiederholung einer 67 Aminosäuren langen Sequenz (Fig. 8). Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 17 Aminosäuren (15,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 25 Positionen (37,7%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure. Auch VAC-beta zeigt gute Übereinstimmung mit der 17 Aminosäuren langen Konsenussequenz. Die Ausführungen zum VAC-alfa gelten analog für VAC-beta.

Durch gezielte Mutationen in diesem Bereich könnte versucht werden, die biologische Aktivität der Proteine zu verändern. Erfindungsgemäßen Mutationen sehen beispielsweise den vollständigen oder teilweisen Ersatz der für die 17 Aminosäuren der konservierten Region kodierenden Bereiche vor.

Bei dem Vergleich der Proteine stellt man fest, daß der auffälligste Unterschied zwischen den Proteinen bei den N-terminalen Peptiden vorliegt. Erfindungsgemäße Modifikationen sehen daher den gegenseitigen Austausch dieser N-terminalen Peptide vor. Herstellen lassen sich diese modifizierten Proteine dadurch, daß die für diese N-terminalen Peptide kodierenden DNA-Moleküle, beispielsweise durch Oligonukleotidsynthese in an sich bekannter Weise hergestellt werden und mit der "Rest-DNA", die für die verbleibenden Repeats und die Linker-Abschnitte kodiert, ligiert wird. Mit dieser DNA versehene Expressionsvektoren können in bekannter Weise in geeigneten Wirtsorganismen zur Expression gebracht werden; das exprimierte Protein wird isoliert und gereinigt.

Die Analyse chromosomaler DNA aus humaner Plazenta nach Southern zeigt ein komplexes Bild. Die DNA wurde mit EcoRI, HindIII, BamHI und PstI geschnitten. Die auf Nitrozellulose transferierte DNA wurde sowohl mit einer VAC-alfa DNA (pP11/3) als auch mit einer VAC-beta DNA (pRH203) hybridisiert. Obwohl das Waschen der Filter unter stringenten Bedingungen erfolgte, ergaben sich bei jedem Verdau relativ viele Banden (Fig. 10). Der Vergleich der beiden Blots zeigt, daß die Kreuzreaktion von VAC-alfa und VAC-beta unter diesen Bedinungen eher auszuschließen ist. Die Vielzahl der Banden ist entweder durch die Existenz jeweils ähnlicher Gene zu dem VAC-alfa bzw. VAC-beta- Gen zu erklären, oder aber es handelt sich um jeweils ein Gen, das durch viele und/oder lange Introns unterbrochen ist.

In Fig. 11 ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen von VAC-alfa mit VAC-beta wiedergegeben. Die wiederholten Strukturen lassen sich in beiden Proteinen gleich anordnen. Die Verbindungspeptide sind ebenfalls gleich lang mit Ausnahme jener zwischen der 2. und 3. Repeat. In dieses Verbindungspeptid muß bei VAC-alfa eine Lücke eingeführt werden, um eine optimale Anpassung der beiden Sequenzen zu erlauben. Das N-terminale Peptid der beiden Proteine ist unterschiedlich lang, 19 Aminosäuren bei VAC-alfa, 25 Aminosäuren bei VAC-beta. Dieses Peptid weist auch die geringste Homologie auf. Die beiden Proteine sind an 176 von 320 Aminosäurepositionen ident, was einem Homologiegrad von 55,0% entspricht.

An dieser Stelle sei auch der Vergleich der Nukleotidsequenzen der VAC-alfa und VAC-beta-cDNAs eingefügt. Werden zwei Gene und deren Produkte miteinander verglichen, sieht man auf der DNA(=RNA)- Ebene eine größere Homologie als auf der Aminosäureebene, was durch die Tatsache erklärt ist, daß bei der Nukleinsäure bereits eine Veränderung in einem Basentriplett ausreicht, um eine neue Aminosäure zu kodieren.

In Fig. 12 ist der Vergleich der kodierenden Regionen von VAC-alfa und VAC-beta-cDNA wiedergegeben. Überraschenderweise zeigen die DNAs nur einen Homologiegrad von 54,2%, also etwas weniger als die beiden Proteine.

In Fig. 13 sind die Hydrophilizitätsprofile der beiden Proteine abgebildet. Dabei wurde der Algorithmus von Hopp und Wood verwendet (T. P. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 [1981] pp. 3824-3828). Die vier Repeatbereiche sind durch die Balken angedeutet, die Verbindungspeptide in der darunter angegebenen Sequenz eingerahmt. Überraschenderweise ist das Verbindungspeptid zwischen der zweiten und dritten Repeat besonders hydrophil. In diesem Peptid befindet sich sowohl bei VAC-alfa als auch bei VAC-beta ein Arginin an identer Position. Es wäre daher möglich, daß dieses Arginin einen bevorzugten Angriffspunkt für eine Protease mit trypsinartiger Spezifität darstellt. Dabei müßte das Molekül in zwei etwa gleich große Hälften zerfallen. Es wäre denkbar, daß bereits ein solches "Halbmolekül" eine biologische, beispielsweise eine antikoagulierende Wirkung entfalten kann. Neben dem gezielten Verdau des Proteins beispielsweise mit einer Protease trypsinartiger Spezifität lassen sich diese Halbmoleküle oder Halbmoleküle mit geringen Modifikationen auf vielfältige Weise darstellen. So ist es möglich, die für diese Halbmoleküle kodierenden DNA-Moleküle, die nach sich bekannten Verfahren herstellbar sind in geeigneten Expressionsvektoren so einzufügen, daß diese DNA von den Expressionskontrollsequenzen reguliert wird und durch Kultivierung eines mit diesen Vektoren transformierten Wirtsorganismus die Halbmoleküle zu exprimieren, zu isolieren und zu reinigen.

Halbmoleküle mit geringen Modifikationen erhält man beispielsweise durch Einfügung von Spaltstellen, die dem vollständigen Protein die für bestimmte Proteasen erforderliche Spezifität verleihen. So läßt sich beispielsweise ein Protein mit einer Spaltstelle mit Faktor Xa-artiger Spezifität herstellen, indem in dem Abschnitt, der für die Linker-Sequenz zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur kodiert, ein Oligonukleotid eingefügt wird, das für das Erkennungs-Tetrapeptid der Faktor-Xa-Protease kodiert. Hierdurch erhält man zunächst ein vollständiges Protein, das möglicherweise veränderte Eigenschaften, beispielsweise veränderte Stabilität gegenüber proteolytischem Angriff aufweist, andererseits aber eine hochspezifische Spaltstelle für die Faktor Xa-Protease enthält, wodurch gezielt zwei Halbmoleküle hergestellt werden und zum therapeutischem Einsatz gelangen können.

Durch gezielte Mutation der für Proteine mit VAC-Aktivität kodierenden DNA lassen sich außerdem Proteine herstellen, die einem proteolytischen Angriff besser widerstehen. So führt möglicherweise der Austausch des VAC-alfa und VAC-beta gemeinsamen Arginins zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur durch z. B. Histidin zu besserer Stabilität der Proteine. Auch der gezielte Ersatz der übrigen Arginine und der Lysine durch Histidin, möglich durch Ersatz der entsprechenden Codone führt zu Proteinen, die erschwert durch Trypsin hydrolisiert werden können. Diese gezielten Mutationen lassen die biologischen, beispielsweise antikoagulierenden Eigenschaften der Proteine/Polypeptide im wesentlichen unbeeinflußt, führen andererseits jedoch zur Veränderung, beispielsweise zur Verbesserungen der Stabilität der Proteine, d. h. zu einer Veränderung der Halbwertszeit der Proteine.

In manchen Fällen ist es, beispielsweise für die Expression von Proteinen vorteilhaft, dem reifen, gewünschten Protein/Polypeptid eine Signalsequenz oder auch eine dem Wirtsorganismus eigene Proteinsequenz vorzuschalten, so daß als Expressionsprodukt ein Fusionsprotein entsteht. Die für ein Signalpeptid kodierende Signalsequenz kann microbieller Herkunft sein oder aus Säuretierzellen stammen; vorzugsweise ist das Signalpeptid homolog zu dem Wirtsorganismus. Um diese Produkte in das gewünschte reife Protein überführen zu können, bedarf es einer spezifischen Spaltstelle zwischen dem Signal-/Fusionsanteil und dem reifen Protein. Hierzu kann man beispielsweise, wie oben beschrieben, an dieser Stelle ein Oligonukleotid einfügen, das für das Erkennungs- Tetrapeptid der Faktor-Xa-Protease kodiert. Hierdurch läßt sich das exprimierte Fusionsprotein gezielt mit der Faktor-Xa-Protease spalten. man erhält das reife Protein.

Ersetzt man gezielt die für Methionin verantwortlichen Codone, außer dem an Aminosäureposition 1, durch Codone, die für Leucin, Isoleucin oder Valin kodieren, so läßt sich ein eventuell erhaltenes unreifes- oder Fusionsprotein durch BrCN-Spaltung in das reife Protein überführen.

Sollte sich erweisen, daß derart modifizierte Proteine gleiche oder gegebenenfalls verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen, so wäre dies ein möglicher Weg zur Ausbeutesteigerung und gegebenenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit besseren Eigenschaften als die natürlichen VAC-Proteine.

Als weitere gezielte Mutation ist der gezielte Austausch von einem, gegebenenfalls mehreren Cysteinen durch Serin oder Valin zu nennen, indem die entsprechenden Codone ausgetauscht werden. Beeinflußt dieser Austausch die biologische Aktivität nicht nachteilig, so könnte dieser Weg eine Verbesserung der Isolierung und/oder Ausbeute der Proteine bewirken. Nicht auszuschließen ist auch hierbei eine Verbesserung der Eigenschaften der Proteine. Als weitere Mutation ist die Kombination verschiedener vollständiger- oder Teil-Sequenzen der für die erfindungsgemäßen Proteine kodierenden DNAs vorgesehen, wodurch Hybridproteine mit vascular-antikoagulierenden Eigenschaften erhalten werden. Alle durch diese oder ähnliche Mutationen erhältlichen Proteine, die für diese kodierenden DNAs, deren Herstellung und Verwendung sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Aus Fig. 13 ist weiterhin leicht zu erkennen, daß weder VAC-alfa noch VAC-beta einen längeren, hydrophoben Bereich aufweisen, der entweder die Sekretion durch, oder das Einlagern der Proteine in eine Membran erlauben würde. Es ist daher anzunehmen, daß es sich bei VAC-alfa und VAC-beta um intrazelluläre Proteine handelt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch DNA-Moleküle nicht-humanen Ursprungs, die von diesen kodierten Proteine, deren Herstellung und Verwendung, die in einer, der vorliegenden Erfindung analogen Weise herstellbar sind.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die erfindungsgemäßen Proteine codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig durch Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Proteine codiert (d. h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der erfindungsgemäßen Proteine codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (beispielsweise Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren) beinhalten.

Die Hybridisierungen werden in 6×SSC/5 Denhardt′s Lösung/0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS/6°C und für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS 65°C geeignet.

Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die eine für VAC kodierende DNA-Sequenz enthalten, die von einer Expressionskontrollsequenz derart reguliert wird, daß in einer mit diesem Expressionsvektoren transformierten Wirtszelle Polypeptide mit VAC-Aktivität exprimiert werden.

Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden z. B. hergestellt, indem man in eine Vektor-DNA, welche eine Expressionskontrollsequenz enthält, eine VAC-codierte DNA-Sequenz derart einfügt, daß die Expressionskontrollsequenz besagte DNA-Sequenz reguliert.

Die Wahl eines geeigneten Vektors ergibt sich aus der zur Transformation vorgesehenen Wirtszellen. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere Bakterienstämme, die über kein Restriktions- oder Modifikationsenzym verfügen, vor allem Stämme von Escherichia coli, z. B. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221(30) oder E. coli K12 Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Steptococcus und andere, ferner Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte humane oder tierische Zellinien. Bevorzugte Wirtszellen sind die gesamten Stämme von E. coli, insbesondere E. coli HB101, E. coli JM101 und E. coli W3110.

Grundsätzlich sind alle Vektoren geeignet, welche die erfindungsgemäßen heterologen, für die VAC kodierenden DNA-Sequenzen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren.

Beispiele für Vektoren, die zur Expression des VAC-Gens in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bacteriophagen, z. B. Derivate des Bacteriophagen λ, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid co1E1 und seine Derivate, z. B. pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung leiten sich von Plasmid pBR322 ab. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replicon und ein Markierungsgen, welches die Selektion und Identifizierung der mit den Expressionsplasmiden transformierten Mikroorganismen auf Grund eines phänotyprischen Merkmals ermöglicht. Geeignete Markierungen verleihen dem Mikroorganismus beispielsweise Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen. Weiterhin enthalten bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung außerhalb der Replicon- und Markierungsgen-Regionen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so daß an diesen Stellen die für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz und gegebenenfalls die Expressions-Kontrollsequenz eingefügt werden können. Ein bevorzugter Vektor, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktres Replicon, gegen Tetracyclin und Ampicillin Resistenz verleihende Markierungsgene (tet® und amp®) und eine Reihe von nur einmal vorkommenden Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, z. B. PstI (schneidet im amp®-Gen, das tet®-Gen bleibt intakt), BamHI, HindIII, SalI (schneiden alle im tet®-Gen, das amp®-Gen bleibt intakt), NruI und EcoRI.

Mehrere Expressionskontrollsequenzen können zur Regulation der VAC-Expression eingesetzt werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen stark exprimierter Gene der zur transformierenden Wirtszelle verwendet. Im Falle von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsorganismus sind beispielsweise die Expressionskontrollsequenzen (welche unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) des Lactoseoperons, Tryptophanogerons, Arabinoseoperons und dergleichen, des b-Lactamasegens, die entsprechenden Sequenzen des Phage λ N-Gens oder des Phage fd-Schichtproteingens und andere geeignet.

Während der Promotor des β-Lactamasegens (β-lac-Gen) bereits in Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die übrigen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden. Bevorzugt als Expressionskontrollsequenz in der vorliegenden Erfindung ist diejenige des Tryptophanoperons (trp po) sowohl von Serratia marcescens als auch aus E. coli und der alkalischen Phosphatase-Promotor bzw. deren Hydrid.

Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die erfindungsgemäßen Proteine kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (P_L) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist ein besonders effektiver steuerbarer Promotor. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressor, von dem benachbarten Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches Allel dieses Repressor-Gens kann in einen Vektor, der eine Protein-Gen-Sequenz enthält, eingefügt werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor aktiviert. Durch die Verwendung dieses Systems ist es möglich, eine Clon-Bank zur etablieren, in der eine funktionelle Protein-Gen-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom- Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-P_L-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden.

Die Expression und Translation einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Proteine kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. So enthält z. B. chromosomale DNA von einem Lactose-abhängigen E. coli ein Lactose oder Lac-Operon, das durch Ausschüttung des Enzyms Beta-Galactosidase den Lactose-Abbau ermöglicht.

Die Lac-Kontrollelemente können aus dem Bacteriophagen Lambda-plac5, der infektiös für E. coli ist, erhalten werden. Das Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus derselben Bakterien-Spezies stammen. Regulationssysteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden können, können auch aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.

Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile hiervon können genausogut verwendet werden: beispielsweise Colicine-E₁-Operator, Galactose-Operator, Xylose-A-Operator, tac-Promotor u. ä.

Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete von den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist.

Zur Replikation und Expression in Hefe geeignete Vektoren enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikationsstart enthalten, z. B. das chromosomale autonom replizierende Segment (ars), bleiben nach der Transformation innerhalb der Hefezelle extra-chromosomal erhalten und werden bei der Mitose autonom repliziert. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschumper et al., Gene 10, 157 [1980]) und das Plasmid YEp13 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 [1979]) verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRP1-Gen, das eine Selektionierungsmarkierung für eine Hefemutante, die unfähig ist, in trypthophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr. 44 076.

Das Vorhandensein des TRP1-Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, wenn ohne Tryptophan kultiviert wird. Ganz ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YEp13, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält.

Weitere geeignete Markierungsgene für Hefe sind im Fall von auxotrophen Hefemutanten, im allgemeinen Gene, die Wirtsdefekte komplementieren. Entsprechende Gene sorgen für Prototrophie in einer auxotophen Hefemutante, z. B. das URA3- und HIS3- Gen. Vorzugsweise enthalten Hefe-Hydridvektoren weiterhin einen Replikationsstart und ein Marierungsgen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, damit die Konstruktion und die Klonierung der Hybridvektoren und ihrer Vorstufen in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann. Weitere für die Expression in Hefe geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise diejenigen des PHO3- oder PHO5-Gens, ferner in glykolytischen Abbau involvierte Promotor, z. B. der PGK- und GAPDH-Promotor.

Andere geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe Vektoren beinhalten die 5′-flankierende Region der Gene des ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 [1983]), 3-Phosphoglycerate-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Kawaski und Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 [1982]) wie Enolasse, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA zu ermöglichen.

Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogena- se-2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnten Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFa 1, STE2, STE3, STE5 können bei temperatur- regulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon [1979], Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 [1981], Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating-Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating-Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

So können auch Hybridvektoren, die der Hefe-2µ-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination innerhalb der Zelle bereits vorhandenen 2µ-Plasmiden einverleibt oder replizieren autonom. 2µ-Sequenzen sind besonders für Plasmide mit großer Transformationshäufigkeit geeignet und gestatten eine hohe Kopienzahl.

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Zellkulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirtsorganismen. Im Prinzip ist jede dieser Zellkulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierzellkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors [1973]). Beispiele solch nützlicher Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, CHO-Zellen und WI38, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit allen notwendigen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Splicing-Stelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung in Säugetierzellen stammen die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Polyoma-, Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die frühen und späten Promotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch noch die virale Replikationsstelle des SV 40 enthält. (Fiers et al., Nature 273, 113 [1978]). Auch können kleinere oder größere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz, die von der HindIII Schnittstelle bis zur BglI Schnittstelle in dem viralen Replikationsstartpunkt reicht. Außerdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen.

Ein Replikationsstartpunkt kann entweder durch entsprechende Vektorkonstruktion vorgesehen werden, um einen exogenen Startpunkt einzubauen, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) oder kann durch die chromosomalen Replikationsmechnismen der Wirtszelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus).

Insbesondere betrifft die Erfindung zur Replikation und phänotypischen Selektionen befähigte Expressionsvektoren, welche eine Expressionskontrollsequenz und eine für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthalten, wobei besagte DNA-Sequenz mitsamt Transkriptionsstartsignal und -terminationssignal sowie Translationsstartsignal und -stopsignal in besagtem Expressionsplasmid unter Regulation besagter Expressionskontrollsequenz so angeordnet ist, daß in einer mit besagtem Expressionsplasmid transformierten Wirtszelle VAC exprimiert wird.

Um eine effektive Expression zu erreichen, muß das VAC-Gen richtig (in "Phase") mit der Expressionskontrollsequenz angeordnet sein. Es ist vorteilhaft, die Expressionskontrollsequenz in den Bereich zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ATG der Genkodiersequenz, welche natürlich mit dem Expressionskontrollsequenz verknüpft ist (z. B. die β-lac-Kodiersequenz bei Verwendung des β-lac-Promotors), mit dem VAC-Gen, welches vorzugsweise sein eigenes Translationsstartsignal (ATG) und Translationsstopsignal (z. B. TAG) mitbringt, zu verknüpfen. Dadurch wird eine effektive Transkription und Translation gewährleistet.

Beispielsweise wird ein Vektor, insbesondere pBR322, mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und, gegebenenfalls nach Modifikation des so gebildeten linearisierten Vektors, eine mit entsprechenden Restriktionsenden versehenen Expressionskontrollsequenz eingeführt. Die Expressionskontrollsequenz enthält am 3′-Ende (in Translationsrichtung) die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonulcease, so daß der die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltene Vektor mit besagtem Restriktionsenzym verdaut und das mit passenden Enden versehene VAC-Gen eingesetzt werden kann. Dabei entsteht ein Gemisch von zwei Hybridplasmiden, welche das Gen in richtiger bzw. in falscher Orientierung enthalten. Vorteilhaft ist es, den die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltenden Vektor noch mit einer zweiten Restriktionsendonuclease innerhalb der Vektor-DNA zu spalten und in das entstandenen Vektor-Fragment das mit richtigen Enden versehene VAS-Gen einzusetzen. Alle Operationen am Vektor erfolgen vorzugsweise in einer Weise, daß die Funktion des Replicons und zumindest eines Markierungsgens nicht beeinträchtigt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein von pBR322 abgeleiteter Vektor, welcher eine Expressionskontrollsequenz, insbesondere diejenige vom Tryptophan-Operon (trp po), enthält, die am 3′-Ende (zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ersten ATG) die Erkennungssequenz für eine, vorzugsweise kohäsive Enden bildende, Restriktionsendoculcease, z. B. EcoRI, trägt, mit der genannten Restriktionsendonuclease und im Vektor-DNA-Teil mit einer zweiten Restriktionsendonuclease, welche flache oder bevorzugt kohäsive Enden bilden, z. B. BamHI, verdaut, wonach der so linearisierte Vektor mit der entsprechende Enden aufweisenden VAC-DNA (z. B. mit einem EcoRI-Ende vor dem ATG-Start und einem BamHI-Ende nach dem Translationsstop-Codon) verknüpft wird. Die Verknüpfung erfolgt in bekannter Weise durch Paarung der komplementären (kohäsiven) Enden und Ligierung, z. B. mit T₄-DNA-Ligase.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in dem Expressionsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 [1983] und EP-A-0 115 613 - hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983), in dem Plasmid parpER33 (EP-A-0 115 613) oder dem Plasmid pRH100 exprimiert werden, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen.

Erfindungsgemäß wird als Expressionsvektor für das synthetische Protein Gen das Plasmid pRH100 verwendet, das den regulierbaren Tryptophanpromotor aus Serratia marcescens und eine artifizielle Ribosomenbindungsstelle enthält. Zur Herstellung des Expressionsplasmides pRH100 wurde das Plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 [1983] 237-248, EP-A-0 115 613) mit der Restriktionsendonuklease HindIII linearisiert und die Oligonukleotidsequenz

eingefügt (siehe EPA . . .).

Die über den nRNA-Weg, aus genomischer DNA oder synthetisch gewonnene, mit entsprechenden (insbesondere EcoRI- und BamHI-) Enden versehene VAC-DNA kann vor dem Einbringen in ein Expressionsplasmid auch in einen Vektor, z. B. pBR322, kloniert werden, um größere Mengen an VAC-DNA, beispielsweise für die Sequenzanalyse, zu gewinnen. Die Isolierung der Klone, welche das Hybridplasmid enthalten, wird beispielsweise mit einer VAC-DNA spezifischen, radioaktiv-markierten Oligonucleotid-Probe (siehe oben) durchgeführt. Die Charakterisierung der VAC-DNA erfolgt beispielsweise nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (11).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Teilstücke der VAC-DNA synthetisiert. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthält, transformiert.

Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise die oben genannten Mikroorganismen, wie Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis und insbesondere Escherichia coli. Die Transformation mit dem erfindungsgemäßen Expressionsplasmiden erfolgt beispielsweise wie in der Literatur beschrieben, so für S. cerevisiae (12), B. subtilis (13) und E. coli (14). Die Isolierung der transformierten Wirtszellen erfolgt vorteilhaft aus einem selektiven Nährmedium, dem das Biocid zugesetzt wird, gegen welches das im Expressionsplasmid enthaltende Markierungs-Gen Resistenz verleiht. Wenn, wie bevorzugt, die Expressionsplasmide das amp®-Gen enthalten, wird dem Nährmedium demgemäß Ampicillin zugesetzt. Zellen, welche das Expressionsplasmid nicht enthalten, werden in einem solchen Medium abgetötet.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die auf dem genannten Weg erhältlichen transformierten Wirtszellen.

Die transformierten Wirtszellen können zur Herstellung von Verbindungen mit VAC-Aktivität verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Wirtszellen kultiviert und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird.

Die Erfindung betrifft daher vor allem ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit VAC-Aktivität und von Salzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierte Wirtszellen in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert werden und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird, und, falls erforderlich, ein verfahrensgemäß erhältliches Produkt mit einem zur Aufspaltung der Disulfidbindungen geeigneten Reduktionsmittel versetzt und das erhältliche reduzierte Polypeptid gegebenenfalls mit einem zur Neuknüpfung von Disulfidbindungen geeigneten Oxidationsmittel behandelt wird, und gewünschtenfalls, eine erhältliche VAC-Verbindung in eine andere VAC-Verbindung überführt wird, ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen mit VAC-Aktivität in die einzelnen Komponenten aufgetrennt wird und/oder, gewünschtenfalls, ein erhaltenes Salz in das Polypeptid und ein erhaltenes Polypeptid in das entsprechende Salz desselben überführt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von VAC-Verbindungen.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen transformierten Wirtszellen erfolgt in an sich bekannter Weise. So können für die Kultivierung der erfindungsgemäßen, transformierten Wirtsmikroorganismen verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder allein oder in geeigneten Gemischen verwendet werden kann. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte; weiterhin Hefeextrakte, Malzextrakt, wie auch Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die ebenfalls verwendet werden können, sind z. B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

Weiterhin enthält das Medium z. B. wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, z. B. Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen, die das Expressionsplasmid verloren haben, verhindern. So wird dem Medium beispielsweise Ampicillin zugesetzt, wenn das Expressionsplasmid ein amp®-Gen enthält. Ein solcher Zusatz von antibiotisch wirksamen Substanzen bewirkt auch, daß kontaminierende, Antibiotika-empfindliche Mikroorganismen abgetötet werden.

Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß maximale VAC-Titer erhalten werden. So wird ein E. coli- oder ein Hefe-Stamm bevorzugt unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise etwa 30°C, und einem pH-Wert von 4 bis 9, (vorzugsweise etwa 30°C, und einem pH-Wert von 4 bis 9), vorzugsweise bei pH 7, während etwa 4 bis 20 h, vorzugsweise 8 bis 12 h, kultiviert. Dabei sammelt sich das Expressionsprodukt intrazellulär an.

Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultivierung abgebrochen und das Produkt, falls erforderlich, aus den Zellen des Mikroorganismus freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, z. B. durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder mit Lysozym oder einem gleichartigen wirkenden Enzym lysiert. Alternativ der zusätzlich kann man mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z. B. X-Presse, French-Presse, Dyne-Mill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndes Einfrieren, z. B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, z. B. auf 30°C bis 40°C, sowie Ultraschall zum Brechen der Zellen anwenden. Die resultierende Mischung, die Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, wird nach der Zentrifugation in an sich bekannter Weise an Proteinen angereichert. So wird z. B. der größte Teil der Nicht-Protein-Bestandteile durch Polyäthylenimin-Behandlung abgetrennt und die Proteine einschließlich der VAC-Verbindungen z. B. durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen ausgefällt. Weitere Reinigungsschritte umfassen beispielsweise chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie. HPLC, Reverse-Phase-HPLC und dergleichen. So erfolgt die Auftrennung der Mischbestandteile durch Dialyse, nach Ladung mittels Gel- oder trägerfreier Elektrophorese, nach Molekülgröße mittels einer geeigneten Sephadex-Säule, durch Affinitätschromatographie, z. B. mit Antikörpern, oder mit Thrombin gekuppelt an einen geeigneten Träger zur Affinitätschromatographie, oder durch weitere, insbesondere aus der Literatur bekannte Verfahren.

Beispielsweise umfaßt die Isolierung der exprimierten VAC-Verbindungen die folgenden Stufen. Abtrennung der Zellen aus der Kulturlösung mittels Zentrifugation; Herstellung eines Rohextraktes durch Zerstören der Zellen, z. B. durch Behandlung mit einem lysierenden Enzym und/oder abwechselndem Einfrieren und Wiederauftauchen; Abzentrifugieren der unlöslichen Bestandteile; Ausfällen der DNA durch Zugabe von Polyäthylenimin; Fällung der Proteine durch Ammoniumsulfat; Affinitätschromatographie des gelösten Niederschlags an einer monoklonalen Anti-VAC-Antikörper-Säule; Entsalzung der so gewonnenen Lösung mittels Dialyse oder Chromatographie an Sephadex G25 oder Sephadex G10.

Weitere Reinigungsschritte schließen Gelfiltrationen an Sephadex G50 (oder G75) und Reverse-Phase-HPLC ein. Entsalzung wieder an Sephadex G25.

Zum Nachweis der VAC-Aktivität kann der Test mit Anti-VAC-Antikörpern (z. B. aus Kaninchen/Maus erhältliche, oder aus Hybridomazellen erhältliche monoklonale Antikörper) oder können die in der EPA 0 1 81 465 beschriebenen Tests herangezogen werden.

Wie bereits erwähnt, ist der alkalische Phosphatasepromotor besonders geeignet für die Expression der erfindungsgemäßen Proteine.

Das Gen für die alkalische Phosphatase (PhoA) aus E. coli unterliegt einer strengen Regulation. In Gegenwart von Phosphat wird das Gen komplett abgeschaltet, bei Abwesenheit von Phosphat im Medium erfolgt Genexpression. H. Schuttleworth et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 8689 sowie C. N. Chang et al., Gene 44 (1986), pp. 121-125 beschreiben die Nukleotidsequenz dieses Gens. Zur Konstruktion eines geeigneten Expressionsvektors wurde aus mehreren Oligonukleotiden die Promotorregion des PhoA Gens zusammengesetzt und in EcoRI-ClaI geschnittenes pAT153 (Amersham) eingesetzt. Vor der ribosomalen Bindungsstelle wurde eine XhoI Stelle eingeführt. Die originale EcoRI Stelle wird beim Einligieren des synthetischen DNA-Fragmentes zerstört. Nach der ribosomalen Bindungsstelle wurde ein Translationsstart-ATG vorgesehen, dessen G das erste Nukleotid einer SacI(= SstI)-Stelle ist. Der Expressionsvektor läßt sich durch Schnitt mit SacI an dieser Stelle linearisieren und der 3′-Überhang durch Behandlung mit DNA-Polymerase I - Klenow Fragment in Gegenwart von dGTP in ein gerades Ende überführen. Dadurch kann jedes beliebige Gen an dieser Stelle eingefügt werden, für korrekte Expression muß es mit der ersten Base der kodierenden Region beginnen.

Das HindIII-SalI-Fragment des pAT-Anteils wurde entfernt und durch den alkalischen Phosphatase-Transkriptionsterminator ersetzt. Die originale SalI-Stelle wurde zerstört. Dafür wurde sie von dem Terminator zusammen mit der ebenfalls aus pAT153 deletierten BamHI-Stelle wieder eingebracht. Die Sequenz der synthetisch hergestellten DNA ist in Fig. 15 abgebildet. Der resultierende Vektor wurde pRH284T genannt.

Zur Herstellung eines Vektors, der zur Expression von VAC-alfa geeignet ist, wurde in den pRH284T ein für VAC-alfa kodierendes DNA-Molekül eingefügt. Hierzu wurde beispielsweise der cDNA-Klon pP6/5 mit BglII und PstI geschnitten und das 980 bp lange Fragment isoliert, das den Hauptteil der kodierenden und ca. 200 bp 3′nichttranslatierte Region enthält. Mittels Oligonukleotiden wurde das fehlende 5′-Ende der kodierenden Region ersetzt. Dabei wurde durch zwei Mutationen (GGC -< GGT, Gly-7 und ACT-< ACC, Thr-8) gleichzeitig eine KpnI-Schnittstelle in die VAC-cDNA eingeführt.

Die Oligonukleotide hatten folgendes Aussehen:

Der so hergestellte Vektor wurde pRH291 genannt (Fig. 16).

Zur Expression von VAC-beta wurde vorzugsweise als Expressionsvektor das Plasmid pER103 verwendet (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21 [1983], 237-248). Der Vektor wurde mit HindIII linearisiert. Das 5′überhängende Ende wurde mit dATP und DNA-Polymerase I/Klenowfragment partiell eingefüllt, und der verbleibene Einzelstrangrest mit S1-Nuklease verdaut. Der Vektor wurde mit BamHI nachgeschnitten und das große Fragment isoliert (Fig. 17). In den so vorbereiteten Vektor wurde das für VAC-beta kodierende DNA-Molekül ligiert. Hierzu wurde beispielsweise aus dem Klon pRH203 das 440 bp lange MaeIII-BamHI Fragment isoliert, das die Codons 13 bis 157 enthält. Das fehlende 5′Ende wurde durch Oligonukleotide ergänzt:

Dabei wurden für E. coli optimale Codons verwendet (z. B. R. Grantham et al., Nucleic Acids Res. 8 [1980], 1893-1912). Dieser Codonaustausch resultierte in einer neuen HindIII-Stelle bei Codon 5 bis 7. Nach dem Nachschnitt mit BamHI wurde das 5′terminale VAC-Fragment in den vorbereiteten pER103-Vektor ligiert. Der entstehende Vektor wurde pRH211 benannt. Um die für VAC-beta kodierende Region zu ergänzen, wurde aus dem Klon pRH201 das 1230 bp lange BamHI-SphI- Fragment isoliert. Der ca. 200 bp lange pBR322- Abschnitt von BamHI bis SphI aus dem Plasmid pRH211 wurde entfernt und durch den entsprechenden VAC-cDNA- Teil ersetzt. Es resultierte der Vektor pRH212. Das EcorRI-BamHI-Fragment, das den Trp-Promotor (S. marcescens), die ribosomale Bindungsstelle und den synthetisch hergestellten Beginn des VAC-beta-Gens enthält, wurde durch Sequenzieren überprüft. Der Nachweis des plasmidkodierten VAC-beta erfolgte im Maxizell-system (A. Sancar et al., J. Bacteriol. 137 [1979], pp. 692-693).

Besonders bevorzugt für die Expression des VAC-beta ist die Konstruktion eines Expressionsvektors ausgehend von pRH284T. Hierzu wurde in den Expressionsvektor in geeigneter Weise das für VAC-beta kodierende Insert ligiert. Als Ausgangsmaterial für dieses Insert kann beispielsweise der Vektor pRH212 dienen.

Der Expressionsvektor pRH284T wurde mit SacI linearisiert und die 3′überhängenden Ende mit DNA-Polymerase I/Klenowfragment und dGTP in gerade Enden übergeführt. Der Vektor wurde mit SalI nachgeschnitten, und das große Fragment isoliert. Das HindIII-SalI-Insert des Klons pRH212 wurde isoliert. Das Oligonukleotidpaar

wurde mit dem VAC-beta Insert und dem vorbereiteten pRH284T ligiert. E. coli HB101 wurde mit der Ligaselösung transformiert. Der resultierende Klon wurde pRH292 benannt (Fig. 18).

Kompetente Wirtsorganismen, beispielsweise E. coli, besonders bevorzugt E. coli HB101 wurden mit den so hergestellten Expressionsvektoren transformiert und in geeigneten Medien kultiviert.

Ein für die Expression von VAC-alfa und VAC-beta gut geeignetes Medium sei im folgenden mit seinen Komponenten angeführt.

0,2-2,0 g/l
(NH₄)₂HPO₄
0,1-1,5 g/l	K₂HPO₄ · 3 H₂O
0,1-5 g/l	KCl
0,1-10 g/l	NaCl
0-5 g/l	NH₄Cl
0,1-5 g/l	MgSO₄ · 7 H₂O
0,001-0,1 g/l	CaCl₂
1-50 mg/l	Thiamin · HCl
0,5-100 mg/l	(NH₄)₂Fe(SO₄)₂ · 6 H₂O
0,1-5 mg/l	AlCl₃ · 6 H₂O
0,1-10 mg/l	CoCl₂ · 6 H₂O
0,2-5 mg/l	KCr(SO₄)₂ · 12 H₂O
0,1-5 mg/l	CuSo₄ · 5 H₂O
0,05-1 mg/l	H₃BO₃
0,1-5 mg/l	MnSO₄ · H₂O
0,1-5 mg/l	NiSO₄ · 6 H₂O
0,1-5 mg/l	Na₂MoO₄ · 2 H₂O
0,1-5 mg/l	ZnSO₄ · 4 H₂O
10-30 g/l	Caseinhydrolysat (Merck Art. #2238)
0-100 g/l	Caseinhydrolysat (Sigma C9386)
0,10-1 mg/l	Cystein
0-10 g/l	Hefeextrakt (Difco)
0-2 g/l	Citronensäure
0-50 g/l	Glucose (Start)
5-50 g/l	Glucose (Zufütterung während der Fermentation)

Besonders geeignet ist das Medium der Zusammensetzung:

Medien:
1) Vorkultur

10 g/l
Trypton
5 g/l	Hefeextrakt
4 g/l	Glucose
9 g/l	Na₂HPO₄ · 2 H₂O
1 g/l	NH₄Cl
1 g/l	KCl
1 ml/l	1M MgSO₄ · 7 H₂O
100 mg/l	Ampicillin

Start-pH = 7,2

2) Hauptkultur

0,68 g/l
(NH₄)₂HPO₄
0,62 g/l	K₂HPO₄ · 3 H₂O
2,33 g/l	KCl
0,5 g/l	NaCl
0,53 g/l	NH₄Cl
1,23 g/l	MgSO₄ · 7 H₂O
0,011 g/l	CaCl₂
10 mg/l	Thiamin · HCl
3,92 mg/l	(NH₄)₂Fe(SO₄)₂ · 6 H₂O
0,72 mg/l	AlCl₃ · 6 H₂O
0,71 mg/l	CoCl₂ · 6 H₂O
1,5 mg/l	KCr(SO₄)₂ · 12 H₂O
0,75 mg/l	CuSo₄ · 5 H₂O
0,19 mg/l	H₃BO₃
0,51 mg/l	MnSO₄ · H₂O
0,79 mg/l	NiSO₄ · 6 H₂O
0,73 mg/l	Na₂MoO₄ · 2 H₂O
0,86 mg/l	ZnSO₄ · 4 H₂O
21 g/l	Caseinhydrolysat (Merck Art. #2238)
25 g/l	Caseinhydrolysat (Sigma C9386)
100 mg/l	Cystein
2 g/l	Hefeextrakt
1 g/l	Citronensäure
11 g/l	Glucose · H₂O (Start bzw. Feed)

Zur Fermentation wurde beispielsweise das Vorkulturmedium mit E. coli, transformiert mit dem entsprechenden Expressionsvektor, angeimpft und unter Rühren und Sauerstoffzufuhr inkubiert. Ein Teil dieser Vorkultur wurde dann in einen Fermenter mit dem Hauptkulturmedium überführt und unter Rühren und Belüften kultiviert. Während der Fermentationszeit wurde die Glucosekonzentration und der Sauerstoffpartialdruck beobachtet und entsprechend optimiert. Nach etwa 20 Stunden Fermentationszeit wurde der Ansatz abgekühlt, das Nährmedium von der Biomasse abgetrennt und eingefroren.

Der Nachweis der exprimierten Proteine erfolgte beispielsweise durch Western Blot. Das Ergebnis ist in Fig. 19 weitergegeben.

"+Phosphat" ist die Kontrolle ohne Expression, "-Phosphat" zeigt die Expression von VAC-alfa(Klon HB101/pRH291)- bzw. VAC-beta(Klon HB101/pRH292)- Protein unter der Kontrolle des alkalischen Phosphatase-Promotors. Sowohl VAC-alfa- als auch VAC-beta-Protein sind bereits auf dem gefärbten Gel zu erkennen. Die gebildete Menge an VAC-Proteinen beträgt überraschenderweise mindestens 20 mg/l/OD_{600 nm} Bakterienkultur.

Der Western Blot zeigt deutlich die angefärbte VAC-alfa Bande. Zusätzlich sind einige Proteine niedrigeren Molekulargewichts im Bereich bis 30 kD erkennbar, die möglicherweise durch proteolytische Spaltung am N- und/oder C-Terminus des VAC-alfa-Proteins entstanden sind. Auffällung ist außerdem ein durch das Antiserum erkanntes Protein im Bereich kleiner 20 kD, das ein durch Proteolyse entstandenes Halbmolkül des VAC-alfa- Proteins darstellen könnte. Überraschenderweise wurde auch VAC-beta durch Anti-VAC-Antiserum erkannt. Da diese Bande wesentlich schwächer als die VAC-alfa-Bande gefärbt ist, andererseits aber die VAC-beta-Bande im Coomassie Blau gefärbten Gel in ihrer Intensität dem VAC-alfa entspricht, ist daraus zu schließen, daß die Erkennung des VAC-beta-Proteins durch das Anti-VAC-Antiserum wesentlich schlechter als jene des VAC-alfa-Proteins erfolgt.

Zur Isolierung und Reinigung der exprimierten Proteine wurde die gefrorene Biomasse in einem geeigneten Lyse-Puffer suspendiert. Die Zellen wurden anschließend mechanisch, beispielsweise durch eine Manton-Gaulin- Presse zerstört. Nach Zugabe eines Fällungsmittels für Nicht-Protein-Bestandteile, wie Polyethylenimin, wurden die festen Bestandteile beispielsweise durch Zentrifugation entfernt. Nach Ausfüllung der Proteine, vorzugsweise durch Ammoniumsulfatfraktionierung, Auflösung des Präzipitates, Entfernung des Fällungsmittels und Klärung der Lösung wurde der so erhaltene Extrakt verschiedenen chromatographischen Reinigungsschritten unterworfen. Ein für die Reinigung der erfindungsgemäßen Proteine geeigneter chromatographischer Reinigungszyklus bestand beispielsweise aus einer DEAE-Fast-Flow-Sepharose-, einer Sephacryl-S-200-High-Resolution- und einer Q-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie. Die Reinheit der so erhältlichen erfindungsgemäßen Proteine wurde mittels SDS-PAGE, Western Blot, Gelpermeations HPLC, Reverse HPLC und isoelektrischer Fokussierung bestimmt.

Die für sämtliche Kultierungs-, Isolierungs- und Reinigungsschritte erforderlichen einzuhaltenden Parameter wie Temperatur, Mengenverhältnisse, Reihenfolge der einzelnen Schritte, pH-Werte, besondere Reagentien etc. sind dem Fachmann bestens bekannt. Die unten angegebenen Beispiele können, falls gewünscht, in geeigneter, dem Fachmann bekannter Weise abgewandelt werden.

Von besonderer Bedeutung ist in Frage, ob ein durch gentechnische Methoden hergestelltes VAC-Protein, im folgenden VAC genannt, mit dem aus natürlichem Material erhältlichen VAC-Protein (s. EPA 0 81 465), im folgenden VAC genannt, identisch ist; identisch sowohl in seiner Struktur als auch in seinen biologischen Eigenschaften.

Zur Beantwortung dieser Fragen wurden folgende Methoden verwendet:

1. Gelpermeations-HPLC
2. Reverse Phase HPLC
3. N-terminale Sequenzierung
4. Tryptische Peptid Karte
5. SDS-Geleletkrophorese
6. Western Blot
7. Isoelektrische Fokussierung

Die Gelpermeations-HPLC weist für VAC ein Molekulargewicht von 34 000, für r-VAC von 33 000 auf, was innerhalb der Genauigkeit der Methode als gleichwertig zu betrachten ist. Es ist zu beachten, daß die verwendete Säule streng genommen nicht nach dem Molekulargewicht sondern nach der Molekülgröße differenziert.

Bei der Reverse Phase HPLC eluieren beide Proteine nach einer Retentionszeit von etwa 29 Minuten.

Die N-terminale Sequenzierung des r-VAC bis zur Aminosäure 39 ergab 100%ige Übereinstimmung mit der erwarteten Sequenz. N-terminales Methionin, oft bei gentechnisch hergestellten Proteinen zusätzlich anzutreffen, konnte überraschenderweise nicht nachgewiesen werden. Wie zu erwarten war, liegt der N-Terminus der r-VAC unblockiert vor.

Bei dem Vergleich der tryptischen Fragmentierung ergab sich ein praktisch identisches Peptidmuster.

Auch der Vergleich der beiden Proteine mittels SDS-PAGE zeigte praktisch gleichartiges Verhalten. Beide beinhalten dimere Formen, die offensichtlich über Disulfidbrücken gebunden sind und mit Dithiothreitol reduziert werden können.

Ebenso bestätigte der immunologische Vergleich durch Western Blot die Identität der beiden Proteine.

Der bei der Ermittlung des isoelektrischen Punktes festzustellende Unterschied von +0,1-pH-Einheiten bei r-VAC läßt sich durch den freien N-Terminus erklären.

Zur Überprüfung der biologischen Aktivität des r-VAC wurden verschiedene Koagulationstests durchgeführt und die Ergebnisse mit denen verglichen, die mit VAC aus natürlichem Material erhalten wurden. Alle durchgeführten Tests, der modifzierten Prothrombin Zeit Test, ebenso wie der Thrombin-Test, ebenso wie die Faktor-X_a-Generation in Gewebefaktor-aktiviertem Plasma belegen eindeutig, daß r-VAC biologische Aktivität aufweist, und daß diese nicht zu unterscheiden ist von der des VAC aus natürlichem Material.

Verfahrensgemäß erhältliche VAC-Proteine können in an sich bekannter Weise in andere VAC-Proteine (Peptide) überführt werden.

Untersuchungen haben gezeigt, daß Disulfidbrücken für die gerinnungshemmende Aktivität von natürlichem VAC ohne Bedeutung ist. Je nach Wahl der Wirtszelle kann nicht ausgeschlossen werden, daß eine Verknüpfung der Cystein-Reste im primären Translationsprodukt unter Bildung von Disulfidbrücken in einer Weise erfolgt, die sich vom natürlichen ablaufenden Vorgang unterscheidet. Es ist möglich, daß die sich einstellende "falsche" Tertiärstruktur des Produktes eine Verminderung oder sogar den Verlust, evtl. aber auch eine Verbesserung, der wertvollen pharmakologischen Eigenschaften, insbesondere der gerinnungshemmenden Aktivität, zur Folge hat, was sich mit Hilfe der oben genannten VAC-Assays feststellen läßt. In einem solchen Fall ist es gegebenenfalls zweckmäßig, die Disulfidbindungen mit einem geeigneten Reduktionsmittel zu spalten und das reduzierte Polypeptid zur Neuknüpfung der Disulfidbindungen mit einem geeigenten Oxidationsmittel zu behandeln. Anhand der VAC-Aktivität des gebildeten Produktes läßt sich feststellen, ob die gewählten Bedingungen (Reduktions- und/oder Oxidationsmittel) zur gewünschten Steigerung der biologischen Aktivität geführt haben oder ob die Bedingungen in bekannter Weise modifiziert werden müssen.

Zur Aufspaltung von Disulfidbrücken geeignete Reduktionsmittel sind beispielsweise Thiol-Verbindungen, wie Thiophenol, 4-Nitrothiophenol, 1,4-Butandithiol und insbesondere 1,4-Dithiothreit. Die Reduktion wird vorteilhaft in einem wäßrig-alkalischen Medium, beispielsweise in der verdünnten wäßrigen Lösung eines Alkalimetallhydroxids, z. B. Natriumhydroxid, Alkalimetallcarbonats, z. B. Natriumcarbonats, oder einer organischen Base, insbesondere eines Triniederalkylamins, z. B. Triäthylamin, bei Raumtemperatur durchgeführt.

Oxidationsmittel, welche zur Neuknüpfung von Disulfidbindungen in den reduzierten Polypeptiden geeignet sind, sind beispielsweise Luftsauerstoff, welcher durch eine wäßrige Lösung des Polypeptids, der gegebenenfalls eine katalytische Menge eines Übergangsmetallsalzes, z. B. Eisen(III)-sulfat, Eisen(III)-chlorid oder Kupfer(II)-sulfat, beigefügt wurde, geleitet wird; Jod, auch in Form des Kaliumjodid-Adduktes KJ₃, welches vorzugsweise in alkoholischer, z. B. methanolischer, oder wäßrig-alkoholischer, z. B. wäßrig-methanolischer Lösung eingesetzt wird; Kaliumhexacyanoferrat-(III) in wäßriger Lösung; 1,2-Dÿodäthan oder Azodicarbonsäuredimethylester oder -diäthylester, welche in Wasser oder in einer Mischung bestehend aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, z. B. Methanol, zur Reaktion gebracht werden. Die Oxidation wird insbesondere bei Raumtemperatur ausgeführt.

Die Abtrennung der Reagentien, insbesondere der Salze und der Oxidations- bzw. der Reduktionsmittel und ihrer Folgeprodukte, von der gewünschten VAC-Verbindung erfolgt nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Molekulargewichtsfiltration, z. B. an Sephadex oder Biogel.

Ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen mit VAC-Aktivität kann in an sich bekannter Weise in die einzelnen Komponenten aufgetrennt werden. Geeignete Trennverfahren sind beispielsweise chromatographische Verfahren, z. B. Adsorptions-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, HPLC oder Reverse-Phase HPLC, ferner multiplikative Verteilung oder elektrophoretische Methoden, z. B. Elektrophorese an Celluloseacetat oder Gelelektrophorese, insbesondere Polyacrylamid-Gelelektrophorese ("PAGE").

Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen können nicht nur in freier Form, sondern auch in Form ihrer Salze, insbesondere ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, vorliegen. Da sie mehrere Aminosäurereste mit freien Aminogruppen enthalten, können die erfindungsgemäßen Verbindungen z. B. in Form von Säureadditionssalzen vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen insbesondere physiologisch verträgliche Salze mit üblichen, therapeutisch anwendbaren Säuren in Betracht; als anorganische Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren, wie die Chlorwasserstoffsäure, aber auch Schwefelsäure und Phosphor- bzw. Pyrophosphorsäure zu nennen; als organische Säuren sind in erster Linie Sulfonsäuren, wie die Benzol- oder p-Toluosulfonsäure oder Niederalkansulfonsäuren, wie Methansulfonsäure, sowie Carbonsäuren, wie Essigsäuren, Milchsäure, Palmithin- und Stearinsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Citronensäure geeignet. Da die VAC-Verbindungen auch Aminosäurereste mit freien Carboxylgruppen enthalten, können sie auch als Metallsalz, insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, z. B. Natrium-, Calcium- oder Magnesiumsalz, oder auch als Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammoniak oder einer physiologisch verträglichen, organischen stickstoffhaltigen Base, vorliegen. Da sie aber zugleich freie Carboxylgruppen und freie Aminogruppen enthalten, können sie auch als innere Salz vorliegen.

Je nach Arbeitsweise erhält man die erfindungsgemäßen Verbindungen in freier Form, in Form von Säureadditionssalzen oder Salzen mit Basen. Aus den Säureadditionssalzen und den Salzen mit Basen können in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Einstellen des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt, die freien Verbindungen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzen mit Säuren bzw. Basen, z. B. mit solchen, die die oben genannten Salze bilden, und Eindampfen oder Lyophilisieren therapeutisch annehmbare Säureadditionssalze bzw. Salze mit Basen gewinnen.

Die Eigenschaft von Antikörpern, spezifische Antigene zu binden, findet außerhalb des Körpers praktische Anwendung bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung (Immuno-Assay) und bei der Reinigung der Antigene (Immunoaffinitätschromatographie). Serum immunisierter Tiere enthält normalerweise eine Vielzahl verschiedener Antikörper, die mit dem gleichen Antigen an verschiedenen Bindungsstellen mit verschiedener Affinität reagieren, dazu aber auch Antikörper gegen andere Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individuums widerspiegeln. Die erfolgreiche Anwendung von Antikörpern zur Bestimmung und Reinigung von Antigenen erfordert aber hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit.

Homogene Antikörper, die diese Anforderungen erfüllen, sind durch die von Köhler und Milstein (17) beschriebene Hybridoma-Technik zugänglich geworden. Prinzipiell besteht die Technik darin, daß Antikörper ausscheidende B-Lymphozyten, z. B. aus der Milz, immunisierter Tiere mit Tumorzellen verschmolzen ("fusioniert") werden. Die gebildeten Hybridoma-Zellen kombinieren die Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung durch Teilung mit der Fähigkeit, einen einheitlichen Typ Antikörper zu bilden und auszuscheiden. Durch Kultivierung in einem selektiven Medium, in dem nicht fusionierte Tumorzellen absterben, Hybridoma-Zellen sich aber vermehren, und durch geeignete Manipulationen können Klone, d. h. Zellpopulationen, die sich von einer einzigen Hybridoma-Zelle ableiten und genetisch identisch sind, gewonnen und kultiviert und die durch die Zellen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen VAC, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper, die spezifisch mit VAC reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-VAC-α und Anti-VAC-β-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit VAC immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert.

Die Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitätschromatographie- Säulen und Test-Kits für Immunoassays, die diese Antikörper enthalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mäuse, z. B. Balb/c-Mäuse, auf an sich bekannte Weise immunisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird VAC etwa wöchentlich oder auch in größeren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise 5 bis 12 Wochen, injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat.

B-Lymphozyten enthaltende Organe, z. B. Milzzellen, der immunisierten Mäuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jene mit der Bezeichnung X63-Ag8, X63-Ag8 . 6 . 6 . 3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 oder SP 2/0. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zell-Linie X63-Ag8 . 6 . 5 . 3 fusioniert.

Die Fusion wird nach an sich bekannten Verfahren durch Mischen der B-Lymphozyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zellfusionsagens, wie Polyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polyethylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, das mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myelomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten.

Die Überstände der Hybridoma-Kulturen können mit an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit Radio-Immunoassay oder Agglutinierung. Dabei wird überraschenderweise festgestellt, daß mit dem beschriebenen Verfahren Hybridoma-Zellen gewonnen werden können, die Antikörper spezifisch gegen VAC ausscheiden. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an sich bekannten Verfahren, das "limiting dilution" genannt wird, Kulturen ausgehend von einer einzigen wachsenden Zelle angesetzt.

Zur Massenproduktion werden die Hybridoma-Zellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medien in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszites-Flüssigkeit entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfat-Lösung Antikörper isoliert.

Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie-Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörper-Lösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschließend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert.

Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedenen Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immuno-Assay, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno-Fluoreszenz oder immunochemischen Enzym-Tests. Solche Kits können neben gewöhnlichen Antikörpern verschiedener Herkunft Antikörper-Konjugate mit Enzymen oder Fluoreszenzträgern enthalten, daz 91780 00070 552 001000280000000200012000285919166900040 0002003737367 00004 91661u VAC markiert mit radioaktiven Isotopen wie J¹²⁵, oder konjugiert mit Enzymen, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, ferner Enzymsubstrate, geeignete Puffer, Gele, Latex, Polystyrol oder andere Füllmaterialien und Träger.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen bekannten Proteine (Peptide) weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf und können prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen neuen VAC-Verbindungen können daher in Analogie zu natürlichem VAC zur Therapie und Prophylase von Thrombosen und Thromboembolien, einschließlich zur Prophylase von postoperativen Thrombosen, zur aktiven Schock-Therapie (z. B. bei septischem oder polytraumatischem Schock), zur Therapie von Verbrauchskoagulopathien, bei Hämodialysen, Hämoseparationen, Blutkonserven und im extrakorporalen Kreislauf verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, welche wenigstens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Hilfsstoffen, enthalten. Diese Zusammensetzungen können insbesondere bei den oben angegebenen Indikationen Verwendung finden, wenn sie z. B. parenteral, wie intravenös, intracutan, subcutan oder intramuskulär, oder topisch verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen für die porphylaktische und therapeutische Behandlung des menschlichen und tierischen Körpers, insbesondere bei den oben angegebenen Krankheitsbildern, in erster Linie zur Hemmung der Gerinnung des Blutes innerhalb und außerhalb des menschlichen und tierischen Körpers.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie bzw. Prophylaxe ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema kann am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles bestimmt werden: die dazu erforderlichen Methoden zur Bestimmung von relevanten Blutfaktoren sind dem Fachmann geläufig. Im Normalfall liegt bei einer Injektion die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen im Dosisbereich von etwa 0,005 bis etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Bevorzugt wird der Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt durch intravenöse, intramuskuläre oder subcutane Injektion. Dementsprechend enthalten pharmazeutische Präparate zur parenteralen Verabreichung in Einzeldosis-Form in Abhängigkeit von der Applikationsart pro Dosis etwa 0,4 bis etwa 7,5 mg der erfindungsgemäßen Verbindung. Neben dem Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise noch einen Puffer, z. B. einen Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 halten soll, und ferner Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zur Einstellung der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen, wobei Lösungen ein antibakteriell wirkendes Konservierungsmittel, z. B. 0,2 bis 0,3% 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester, enthalten können. Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wäßrige Lösung, Lotion oder Gelee, ölige Lösung oder Suspension, oder fetthaltige oder insbesondere Emulsions-Salbe vorliegen. Ein Präparat in Form einer wäßrigen Lösung erhält man beispielsweise dadurch, daß man die erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon in einer wäßrigen Pufferlösung von pH 4 bis 6,5 löst und gewünschtenfalls einen weiteren Wirkstoff, z. B. ein Antiinflammatorikum, und/oder ein polymeres Haftmittel, z. B. Polyvinylpyrrolidon, und/oder ein Konservierungsmittel zufügt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in 10 ml einer Lösung bzw. 10 g eines Geles.

Eine ölige Applikationsform für die topische Verabreichung erhält man beispielsweise durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon in einem Öl, gegebenfalls unter Zusatz von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder grenzflächenaktiven Mitteln (Tensiden), deren HLB-Wert ("hydrophilic-lipophilic- balance") unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z. B. Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fetthaltige Salbe erhält man z. B. durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer streichbaren Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tensids vom HLB-Wert unter 10. Eine Emulsionssalbe erhält man durch Verreiben einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer weichen, streichbaren Fettunterlage unter Zusatz eines Tensids, dessen HLB-Wert unter 10 liegt. Alle diese topischen Applikationsformen können auch Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration des Wirkstoffes beträgt 0,1 bis 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 0,1 mg, in etwa 10 g der Grundmasse.

Neben der oben beschriebenen und ihren analogen pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für einen direkten medizinischen Einsatz am Körper des Menschen oder eines Säugetieres bestimmt sind, betrifft die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Präparate zur medizinischen Anwendung außerhalb des lebenden Körpers des Menschen oder der Säugetiere. Solche Zusammensetzungen und Präparate verwendet man in erster Linie als gerinnungshemmenden Zusatz zu Blut, welches außerhalb des Körpers einer Zirkulation oder Behandlung (z. B. extrakorporaler Kreislauf oder Dialyse in künstlichen Nieren), Konservierung oder Modifizierung (z. B. Hämoseparation) unterzogen wird. In ihrer Zusammensetzung sind derartige Zubereitungen in Einzeldosis-Form, den oben beschriebenen Injektionspräparaten ähnlich; zweckmäßigerweise wird aber die Wirkstoffmenge bzw. -konzentration auf das Volumen des zu behandelnden Blutes bezogen. Je nach dem spezifischen Zweck beträgt die geeignete Dosis etwa 0,01 bis etwa 1,0 mg Wirkstoff/l Blut, wobei die obere Grenze ohne Gefahr noch überschritten werden darf.

Insbesondere betrifft die Erfindung die in den Belegbeispielen beschriebenen, für die für VAC-Proteine kodierenden DNA-Moleküle, solche DNA-Moleküle enthaltende Expressionsplasmide, mit solchen Expressionsplasmiden transformierte Mikroorganismen, monoklonale Antikörper gegen VAC, Hybridoma-Zellen, die solche Antikörper produzieren, und Test-Kits für Immunoassays, die solche Antikörper enthalten, die in den Beispielen beschriebenen Verfahren zu ihrer Herstellung und das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung von Proteinen/Polypeptiden mit VAC-Aktivität mit Hilfe der transformierten Mikroorganismen, sowie die in den Beispielen beschriebenen neuen VAC-Verbindungen.

Wird in der vorliegenden Anmeldung von vascular-antikoagulierenden Proteinen oder in der Kurzform VAC-Protein gesprochen, so bedeutet das wenn nicht anders angegeben, daß hiermit Polypeptide/ Proteine gemeint sind, die im wesentlichen die Eigenschaften aufweisen, die den Proteinen eigen sind, die in der EPA 1 81 465 erstmals beschrieben wurden. Diese Eigenschaften lassen sich durch die dort angegebenen Test- und Charakterisierungsverfahren feststellen und überprüfen (VAC-Aktivität).

Weiterhin fallen unter diese Definition auch die Polypeptide/Proteine, die Aggregationen wie beispielsweise Dimere, Trimere oder Tetramere darstellen, auch wenn diese in der aggregierten Form per se nicht oder nur eingeschränkte biologische Aktivitäten aufweisen, unter der Voraussetzung, daß diese in vivo oder in vitro in zumindest eine aktive Komponente zu überführen sind.

Werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polypeptide/Proteine erhalten, die per se nicht oder nur eingeschränkte biologische Aktivitäten aufweisen, beispielsweise Fusionsproteine oder sogenannte "pro-drugs", Polypeptide/Proteine, die für den Fachmann in an sich bekannter Weise in die aktiven Komponenten überführbar sind, beispielsweise durch in vitro oder in vivo Prozessierung oder Polypeptide/Proteine, die erst in vivo ihre Aktivität entfalten, so sollen auch diese unter die Definition vascular-antikoagulierende-, kurz VAC-Proteine, gefaßt sein und damit zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehören.

Unter "Verbindungen mit VAC-Aktivität" werden auch solche, von den genannten transformierten Wirtszellen exprimierte Polypeptide verstanden, welche eine VAC-Wirkung und eine positive Reaktion mit anti-VAC-Antikörpern zeigen und welche die Primärstruktur von VAC oder eine davon abgeleitete Struktur aufweisen. Unter VAC-Verbindungen mit einer von der Primärstruktur von VAC abgeleiteten Struktur werden modifizierte VAC-Verbindungen verstanden, wobei die Modifizierung in einer Verkürzung der Primärstruktur des VAC, in einer Umordnung der Repeat-Struktur oder in einer Modifizierung, die zu einer Veränderung des Stabilität bzw. Aktivität führt.

VAC-DNA/Gen steht in der vorliegenden Erfindung für die DNA-Moleküle, die für die oben definierten VAC-Proteine kodieren.

Die folgenden Beispiele und Zeichnungen dienen zur Illustration der Erfindung und sollen sie in keiner Weise einschränken.

Um die nachfolgenden Beispiele zu vereinfachen, werden oft wiederkehrende Methoden kurz beschrieben.

Plasmide werden mit einem kleinen "p" bezeichnet, gefolgt von Großbuchstaben und Ziffern. Ausgangsplasmide sind käuflich oder ohne Einschränkung öffentlich erhältlich. Sie können auch aus solchen Plasmiden mittels publizierter Methoden konstruiert werden.

"Schneiden" oder "Verdauen" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen sind käuflich erhältlich und werden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen (Puffer, Rinderserumalbumin (BSA) als Trägerprotein, Dithiothreit (DTT) als Oxidationsschutz) eingesetzt.

Restriktionsendonukleasen werden mit einem Großbuchstaben, meist gefolgt von Kleinbuchstaben und normalerweise einer römischen Ziffer bezeichnet. Die Buchstaben hängen von dem Mikroorganismus ab, aus dem die betreffende Restriktionsendonuklease isoliert wurde (z. B.: Sma I: Serratia marcescens). Üblicherweise wird etwa 1µg DNA in einer oder mehreren Einheiten des Enzyms in etwa 20 µl Pufferlösung geschnitten. Normalerweise wird eine Inkubationsdauer von 1 Stunde bei 37°C verwendet, kann aber laut den Verwendungsvorschriften des Herstellers variiert werden. Nach dem Schneiden wird manchmal die 5′Phosphatgruppe durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP) entfernt. Dies dient zur Verhinderung einer ungewünschten Reaktion der spezifischen Stelle in einer nachfolgenden Ligasereaktion (z. B. Zirkularisierung eines linearisierten Plasmids ohne Insertierung eines zweiten DNA-Fragmentes). Wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Fragmente nach dem Schneiden mit Restriktionsendonukleasen normalerweise nicht dephosphoryliert. Reaktionsbedingungen für die Inkubation mit alkalischer Phosphatase sind z. B. dem M13 Cloning und Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12) zu entnehmen.

Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zusatz von Äthanol präzipitiert.

"Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments bedeutet die Auftrennung der geschnittenen DNA auf einem z. B. 1% Agarosegel. Nach der Elektrophorese und dem Sichtbarmachen der DNA im UV-Licht durch Anfärben mit Äthidiumbromid (EtBr) wird das gewünschte Fragment anhand mitaufgetragener Molekulargewichtsmarker lokalisiert und durch weitere Elektrophorese an DE 81 Papier (Schleicher und Schüll) gebunden. Die DNA wird durch Spülen mit Niedrigsalzpuffer (200 mM NaCl, 20 mM Tris pH = 7,5, 1 mM EDTA) gewaschen und anschließend mit einem Hochsalzpuffer (1M NaCl, 20 mM Tris pH = 7,5, 1 mM EDTA) eluiert. Die DNA wird durch Zusatz von Äthanol präzipitiert.

"Southern Analyse" ist jene Methode, durch die die Gegenwart eines bestimmten DNA-Fragments in einem DNA-Gemisch durch Hybridisierung mit einer bekannten, markierten Oligonukleotidsonde oder einem markierten DNA-Fragment nachgewiesen wird. Southern Analyse bedeutet im folgenden, so nicht anders spezifiziert, die Auftrennung des DNA-Gemischs auf einem 1% Agarosegel, Denaturierung und Transfer auf Nichtzellulosefilter (Schleicher und Schüll, BA 85) mittels der Methode von E. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1978), pp. 503-517, und Hybridisierung wie beschrieben in R. Hauptmann et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), pp. 4739-4749.

"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einem Organismus, so daß die DNA dort replizierbar ist, entweder extra-chromosomal oder als chromosomale Integrante. Transformation von E. coli folgt der im M13 Cloning and Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12) angegebenen Methode.

"Sequenzieren" einer DNA bedeutet die Analyse der Nukleotidsequenz in einer DNA. Dazu wird die DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten, und die Fragmente in entsprechend geschnittene M13 mp8, mp9, mp18 oder mp19 Doppelstrang DNA eingebracht, oder die DNA wird mittels Ultraschall, nachfolgender Reparatur der Enden und Größenselektion in Sma I geschnittene, dephosphorylierte M13 mp8 DNA (Shotgun Methode) eingebracht. Nach der Transformation von E. coli JM 101 wird Einzelstrang DNA aus rekombinaten M13-Phagen entsprechend dem M13 Cloning and Sequencing manuel (Cloning and Sequencing Handbook, Fa Amersham, PI/129/83/12) isoliert und nach der Sanger′schen Dideoxymethode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 [1977], pp. 5463-5467) sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgt mittels der ursprünglich von R. Staden entwickelten (R. Staden, Nucleic Acids Res. 10 [1982], pp. 4731-4751) und von Ch. Pieler modifizierten (C. Pieler 1987, Dissertation, Universität Wien) Computerprogramme.

"Ligieren" bezieht sich auf den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Enden von Doppelstrang-DNA Fragmenten. Üblicherweise werden zwischen 0,02 und 0,2 µg DNA-Fragmente in 10 µl mit etwa 5 units T₄-DNA-Ligase ("Ligase") in einer geeigneten Pufferlösung ligiert (T. Maniatis et al., Molecular cloning, 1982, p. 474).

"Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolierung der Plasmid DNA aus Bakterien mittels der alkalischen SDS-Methode modifiziert nach Birnboim und Doly (T. Maniats et al., Molecular cloning, 1982, pp. 368-369) unter Weglassen des Lysozyms. Dabei werden die Bakterien aus 1,5 bis 50 ml Kultur verwendet.

"Oligonukleotide" sind kurze Polydesoxynukleotide, die chemisch synthetisiert werden. Dazu wurde der Applied Biosystems Synthesizer Modell 381A verwendet. Die Oligonukleotide werden entsprechend dem Modell 381A User Manual (Applied Biosystems) aufgearbeitet und durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gereinigt.

"Phosphorylieren" bedeutet die enzymatische Übertragung des gamma-Phosphatrestes aus ATP auf eine freie 5′OH-Gruppe einer Nukleinsäure, meist ein Oligonukleotid. In 10 µl Lösung werden bis zu 100 pMol des Oligonukleotids mit 10 Einheiten T₄- Poly-nukleotidkinase in Gegenwart von 100 pMol ATP in geeigneter Pufferlösung (70 mM Tris, pH = 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT) 30 Minuten bei 37°C phosphoryliert. Die Reaktion wird meist durch 10 Minuten Erhitzen auf 100°C gestoppt.

Einige verwendete Abkürzungen sollen kurz erklärt werden:

bp:
Basenpaare
BSA:	Rinderserumalbumin
DTT:	Dithiothreit
EDTA:	Aethylendinitrilotetraessigsäure, di-Natriumsalz
SDS:	Natriumdodecylsulfat
Tris:	Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Denhardt:	0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA
LB:	10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl
1× SSC:	150 mM NaCl, 15 mM tri-Natriumcitrat, pH=7
TE:	10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA

Verzeichnis der Abbildungen:

1:
Screening-Oligonukleotide EBI-386, -387 und -388
1A:	Tryptische Fragmente aus Placenta-VAC
1B:	HPLC der tryptischen Peptide aus Placenta-VAC
1C:	HPLC der tryptischen Peptide aus Nabelschnur-VAC
1D/E:	Gelpermeations-HPLC von Placenta- und Nabelschnur-VAC
1F:	Reverse-Phase-HPLC von Placenta-VAC
1G:	SDS-Gelelektrophorese von Placenta-VAC
2:	Screening-Oligonukleotide EBI-118 und EBI-119
3:	Northern Blot Analyse mit VAC-alfa und VAC-beta-cDNA
4:	VAC-alfa-cDNA-Sequenz
5:	Anordnung der Peptidsequenzen in der VAC-alfa-cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz
6:	Vierfach wiederholte Subsequenz im VAC-alfa-Protein
7:	Vac-beta-cDNA-Sequenz
8:	Vierfach wiederholte Subsequenz im VAC-beta-Protein
9:	Aminosäurezusammensetzung von VAC-alfa und VAC-beta
10:	Genomische Southern Blot Analyse mit VAC-alfa und VAC-beta-cDNA
11:	Aminosäurevergleich von VAC-alfa mit VAC-beta
12:	Nukleotidvergleich zwischen VAC-alfa und -beta-cDNA
13:	Hydrophilizitätsplot von VAC-alpha und VAC-beta
14:	Vergleich von VAC-alfa, VAC-beta, Lipocortin I und Lipocortin II
15:	Sequenz des Promotor- und Terminator Teils in pRH248
16:	Konstruktion von pRH291
17:	Konstruktion von pRH212
18:	Konstruktion von pRH292
19:	SDS-Gelelektrophorese der exprimierten Proteine
	a) Coomassie Blau gefärbtes Proteingel
	b) Western Blot
	Legende:
	M = Molekulargewichtsmarke
	+Phosphat = Inhibitation der VAC-Expression
	-Phosphat = VAC-Expression (pho Promotor induziert)
20:	Reinigung von VAC-alfa; Coomassie Blau gefärbtes SDS-Gelektrophorese-Gel
	Banden:
	1: roher Extrakt
	2: Ammoniumsulfatpellet (gelöst und dialysiert) 12: 5 µg DEME-FF-Sepharose Fraktionen 1-11
	3: VAC-Pool nach DEAE-FF-Sepharose Chromatographie
	4: VAC-Pool nach Sephacryl-S 200 HR Chromatographie
	5: gereinigtes VAC nach Q-Sepharose-FF-Chromatographie
	6: gereinigtes, natürliches VAC aus Human-Placenta
	7: Molekulargewichtsmarker (Pharmacia; 94kD, 67kD, 43kK, 30kD, 20kD und 14kD)
21:	Sephacryl S-200 HR Chromatographie von vorgereinigtem r-VAC-α
22:	Q-Sepharose-FF-Chromatographie von vorgereinigtem r-VAC-α
23:	Gelpermeations-HPLC von natürlichem VAC
24:	Gelpermeations-HPLC von rekombinantem VAC-α
25:	Reverse Phase HPLC von natürlichem VAC
26:	Reverse Phase HPLC von rekombinantem VAC-α
27:	HPLC der tryptischen Fragmente aus natürlichem VAC
28:	HPLC der tryptischen Fragmente aus rekombinantem VAC-α
29:	SDS-Gel von einem Vergleich zwischen natürlichem und rekombinantem VAC-α in An- oder Abwesenheit von DTT
30:	SDS-Gel von rekombinantem VAC-α in An- oder Abwesenheit von DTT
31:	Western Blot Analyse von natürlichem VAC und rekombinantem VAC-α
32:	Isoelektrische Fokussierung von natürlichem VAC und rekombinantem VAC-α
33:	Modifizierter Prothrombin Zeit Test mit natürlichem und rekombinantem VAC
34:	Thrombin Zeit Test mit natürlichem und rekombinantem VAC
35:	Faktor Xa-Bildung im Plasma durch natürliches und rekombinantes VAC
36:	Bindung von VAC an Phospholipid-Doppelschichten

Beispiel 0

Das aus Nabelschnurgefäßen und/oder Placenta isolierte und gereinigte Material wurde mit Hilfe einer Reverse-Phase HPLC nachgereinigt.

Stationäre Phase:
Bakerbond WP-RP 18, 4,6 × 250 mm, 5 µm Teilchen, 300 A Poren
Mobile Phase A:	0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, pH 2,2
Mobile Phase B:	0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient:	20-68% B in 24 min
Fluß:	1 ml/min
Detektion:	UV, 214 nm

Anschließend an diese Reinigungsstufe wurden beide Materialien, jeweils die Substanz, die das Molekulargewicht 32 000 aufwies, mit Trypsin verdaut.

Reaktionsbedingungen

30 µg VAC aus Placenta in 135 µl 0,15 M NH₄HCO₃, pH 8,0
+ 2% w/w Trypsin (Worthington) 6 Stunden bei 37°C
+ 2% w/w Trypsin (Worthington), über Nacht bei 37°C

30 µg VAC aus Nabelschnur in 100µl 1% NH₄HCO₃, pH 8,0
+ 2% w/w Trypsin (Worthington) 6 Stunden bei 37°C
+ 2% w/w Trypsin (Worthington), über Nacht bei 37°C

Die erhaltenen Bruchstücke wurden mit Hilfe von HPLC aufgetrennt und einer Sequenzierung mit einem Gasphasensequenator Typ 470A von Applied Biosystems, Programm 02 RPTH zugeführt.

HPLC-Trennbedingungen
Stationäre Phase:
µBondapak C18, 3,6 × 300 mm, 10 µm Teilchen
Mobile Phase A:	0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, pH 2,2
Mobile Phase B:	0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient:	0-55% B in 55 min
Fluß:	1 ml/min
Detektion:	UV, 214 nm (obere Spur), 280 nm (untere Spur)

Neben dem tryptischen Verdau wurde das über Reverse-Phase-HPLC gereinigte Material auch noch einer BrCN-Spaltung unterzogen. Auch diese Spaltpeptide wurden sequenziert und mit den Daten der Peptide aus dem tryptischen Verdau verglichen.

BrCN-Spaltung

111 µg über RP-HPLC gereinigtes VAC wurden in 111 µl 70% Ameisensäure gelöst. Diese enthielt bereits den 250fachen molaren Überschuß an BrCN (90 µg). Die Inkubation erfolgte im Dunkeln, 17 Stunden bei Raumtemperatur. 100 µl wurden für die HPLC-Auftrennung verwendet.

HPLC-Säule:
µBondapak C 18
Mobile Phase A:	0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Mobile Phase B:	0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient:	0-70% B in 70 min
Fluß:	1 ml/min
Detektion:	UV, 214 nm und 280 nm

Ein Vergleich der hiermit erzielten Ergebnisse sowie die Analyse mittels Gelpermeations-HPLC und SDS-Gelelektrophorese belegt die Identität von VAC aus Placenta und VAC aus Nabelschnur.

Gelpermeations HPLC
Stationäre Phase:
Waters I-125, 7,8 × 600 mm, 10 µm Teilchen
Mobile Phase:	0,5 M Na₂SO₄, 0,02 M Na₂PO₄, pH 7,0, 25% Propylenglykol, 0,04% Tween 20
Fluß:	0,5 ml/min
Detektion:	UV, 214 nm

SDS-Gelelektrophorese
SDS-Gel:|15%
Gelstärke:	0,7 mm
Elektrophoresebedingungen:	20 mA/Platte, 2-3 Stunden Laufzeit
Färbung:	Coomassie Blue
Proben:	8 µg VAC aus Nabelschnur bzw. 7 µg VAC aus Placenta

Beispiel 1 Herstellung einer humanen plazentalen cDNA-Bibliothek a) Gesamt-RNA-Isolierung aus Plazenta

GT:
5 M Guanidinium-Thiocyanat, 50 mM Tris pH=7,4, 25 mM EDTA. Vor Gebrauch 8% (v/v) beta-Mercaptoäthanol zusetzen. 20 ml GT werden 5 bis 10 Minuten vor Gebrauch auf Eis gekühlt, GT soll dabei nicht präzipitieren.
GH:	6 M Guanidium-Hydrochlorid, 25 mM EDTA, 10 mM beta-Mercaptoäthanol, pH=7,0. Eiskühlen.

1 g tiefgefrorener und mechanisch pulverisierter Plazenta werden in 20 ml GT (0°C) 20 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit mit einem Polytron (Brinkmann) gemixt. Das Volumen des Homogenats wird bestimmt, in 0,3 vol Äthanol (-20°C) gegossen, gemischt und sofort bei 12 000 rpm 5′ bei -10°C (Beckman JA 21 Zentrifuge, JS13.1 Rotor) zentrifugiert. Ein eventueller Proteinfilm sowie der Überstand werden entfernt. 10 ml eiskaltes GH werden dem Pellet zugesetzt und 10 Sekunden mit dem Polytron homogenisiert. Die Suspension wird 5 Minuten bei -10°C und 12 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird in ein steriles Corexröhrchen transferiert, das Pellet verworfen. Zum Überstand werden 0,025 vol 1 M Essigsäure und 0,75 vol kalter Äthanol (-20°C) zugesetzt und gut durchgemischt. Nach ca. 2 Stunden Inkubation bei -20°C wird 10 Minuten bei 6000 rpm bei -20°C (JA20 Rotor) zentrifugiert. Der Proteinfilm und der Überstand werden sorgfältig entfernt. 2 ml GH (0°C) werden zum Pellet zugegeben, das Pellet resuspendiert, und die Suspension in ein 15 ml Corexröhrchen transferiert. Mit weiteren 8 ml GH wird das alte Corexröhrchen nachgespült, die Lösung mit den 2 ml vereint. Es ist wichtig, daß das gesamte Pellet suspendiert ist, eventuell ist durch mildes Sonikieren nachzubehandeln. 0,025 vol 1 M Essigsäure und 0,5 vol kalter Äthanol (-70°C) werden zugesetzt und ca. 2 Stunden bei -20°C inkubiert. Zentrifugation (6000 rpm, 10 min, JA20 Rotor), Lösen und Präzipitieren werden zweimal wiederholt, wobei die totale GH-Menge auf 5 ml halbiert wird. Nach der letzten Zentrifugation soll kein Proteinfilm mehr über der Lösung sichtbar sein, sonst ist dieser Reinigungsschritt zu wiederholen. Das Pellet wird mit 5 ml Diäthylpyrocarbonat behandeltem Wasser (0°C) 2 Minuten gevortext. Die klare Lösung wird dekantiert, zu dem eventuell zurückbleibenden Pelletrest wird nochmals Wasser gegeben und 0,1 vol 3 M Na-Azetat (pH=5,8), 2,5 vol Äthanol und 1 Stunde Inkubation bei 0°C bei -70°C wird die RNA 10 Minuten bei 6000 rpm bei 4°C abzentrifugiert. Lösen und präzipitieren wird einmal wiederholt. Letztendlich wird die RNA in Aethanol bei -20°C aufbewahrt.

b) poly-A⁺-RNA-Isolierung

0,5 mg oligo dT-Zellulose (Collaborative Research, Typ 3, Bindungskapazität: 5 mg poly-A⁺-RNA/g) werden im Bindungspuffer suspendiert (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 10 mM Tris, pH=7,4, 1 mM EDTA). 1 ml dieser Suspension wird in eine Säule gepackt und nacheinander mit 10 ml Wasser, 10 ml 0,1 N NaOH, 10 ml Wasser und letztlich mit 10 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Gesamt-RNA wird aus der alkalischen Lösung durch Zentrifugieren (10 Min., 6000 rpm, JA20 Rotor) pelletiert. Ca. 10 mg RNA werden in 4,5 ml Wasser gelöst. Nach Zusatz von 50 µl 2% SDS wird die Lösung 3 Min. auf 70°C erhitzt und unmittelbar auf Eis gekühlt. Nach dem Zusatz von 50 µl 1 M Tris (pH=7,4), 10 µl 0,5 M EDTA und 200 µl 5 M NaCl wird die Lösung sofort auf die Säule aufgetragen. Die aus der Säule tropfende Lösung wird wieder auf die Säule aufgetragen. Diese Prozedur wird insgesamt dreimal wiederholt. Anschließend wird die Säule mit 30 ml Bindungspuffer gewaschen. Die gebundene RNA wird mit 5 ml 0,2% SDS eluiert. Die Säule wird mit 10 ml Wasser, 10 ml 0,1 N NaOH und 10 ml H₂O gewaschen und mit 10 ml Bindungspuffer äquilibriert. Die RNA Lösung wird nochmals 3 Minuten auf 70°C erhitzt, rasch auf Eis abgekühlt, 50 µl 1 M Tris pH=7,4, 10 µl 0,5 M EDTA und 200 µl 5 M NaCl zugesetzt und auf die Säule aufgetragen. Die durchlaufende Lösung wird insgesamt dreimal auf die oligo-dT-Säule aufgetragen. Nach dem Waschen wird die RNA mit 30 ml 0,2% SDS eluiert.

Durch Zugabe von 0,1 vol 3 M Na-Azetat pH=5,6 und 2,5 vol Aethanol sowie Inkubation bei -20°C (16 Stunden) wird die RNA ausgefällt. Die RNA wird abzentrifugiert (10 000 rpm, 15 Min., JA-20 Rotor) und in Wasser mit einer Konzentration von 1 µg/µl gelöst.

c) Konstruktion der Lambda-gt10-cDNA-Bibliothek

Die Synthese der cDNA, das Methylieren der inerten EcoRI-Stellen, das Anbringen von EcoRI-Linkern, das Nachschneiden mit EcoRI, die Abtrennung der kurzen DNA-Fragmente, das Ligieren mit den Lambda-gt10-Armen und das in vitro Verpacken der ligierten DNA erfolgte mit dem cDNA-Synthese-System von Amersham (RPN 1256) sowie dem cDNA-Kloniersystem Lambda-gt10 (Amersham, RPN 1257). Die beigefügten Arbeitsvorschriften wurden genau eingehalten. Ausgehend von etwa 3 µg wurden mRNA letztendlich ca. 0,5×10⁶ rekombinante Lambda-gt10 Phagen erhalten.

Beispiel 2 cDNA Isolierung a) Durchsuchen der Lambda-gt10-Bibliothek mit Oligonukleotiden

Zum Durchschauen der cDNA-Bibliothek nach für VAC-protein kodierender cDNA wurden entsprechend der Sequenzen des tryptischen Peptides P16/II zwei und des Staph A Peptides P20/I/6 ein Oligonukleotid synthetisiert (Fig. 1). Diese Oligonukleotide stellen jeweils eine Mischung aller Varianten dar, die jede Kodierungsmöglichkeit der entsprechenden mRNA berücksichtigen. EBI-386 weist bei einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden 512 Variationen auf und paßt zu dem Staph-A Peptid P20/I/6. Um die Variation bei dem Oligonukleotid für das tryptische Peptid P16/II niedriger zu halten, wurden zwei Oligonukleotide (20-mere) synthetisiert: EBI-387: 128 Variationen, EBI-388: 64 Variationen.

Weiters wurden zu dem tryptischen VAC-Peptid P30/I passend zwei Oligonukleotide unter Verwendung von Desoxyinosin als Base bei "Wobble" Positionen synthetisiert (Fig. 2): EBI-118 und EBI-119. Diese Substitution wurde von E. Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260/5 (1985), pp. 2605-2608, sowie Y. Takahashi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1985) pp. 1931-1935, beschrieben. Inosin basenpaart gut mit Cytosin, stört jedoch kaum die Ausbildung der Doppelhelix, wenn andere Nukleotide als Partner angeboten werden.

Jeweils 60 pMol jedes Oligonukleotids wurden mit 60 pMol gamma-³²P-ATP (Amersham, PB 218, 5000 Ci/mMol) in 30 µl Lösung unter Verwendung von 20 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Die Lösung enthielt 70 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 5 mM DTT, die Inkubationsdauer betrug 30 Minuten. Durch Zugabe von 30 mM EDTA und 5 Minuten Erhitzen auf 70°C wurde die Reaktion gestoppt. Das markierte Oligonukleotid wurde durch Säulenchromatographie über Biogel P6DG (Biorad) von nicht eingebauter Radioaktivität getrennt. Pro Oligonukleotid wurden zwischen 70 und 110×10⁶ cpm Phosphor-32 eingebaut.

Je 15 pMol EBI-118 und EBI-119 wurden in 90 µl unter Einsatz von 45 pMol gamma-³²P-ATP (Amersham, PB 218, <5000 Ci/mMol) mit 10 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase phosphoryliert und anschließend über Biogel P6DG gereinigt. Insgesamt wurden 70×10⁶ cpm Phosphor-32 eingebaut.

Ungefähr 1,2×10⁶ pfu (Plaque forming units) rekombinante Phagen einer humanen, plazentalen cDNA Bibliothek im Phagen Lambda-gt10 wurden verwendet, um 13,5 cm Petrischale plattiert (LB, 10 mM MgSO₄, 15 g/l Bacto-Agar). Nachdem die Plaques fast konfluent waren, wurden von jeder Platte 2 Abzüge auf Nitrozellulosefilter hergestellt (Schleicher und Schüll, BA 85) (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982, pp 320-321).

Die Filter wurden 3×20 Minuten in TE bei 100°C behandelt und anschließend über Nacht bei 65°C gewaschen:

Waschlösung:
1 M NaCl
1 mM EDTA
0,1% SDS

Danach wurden die Filter 4 Stunden bei 49°C prähybridisiert:

Prähybridisierlösung:
6 × SSC
5 × Denhardt
0,1% SDS
1 mM Na-Pyrophosphat
50 mM NaH₂PO₄ pH=6,5
100 µM ATP
80 µg/ml denaturierte Hering Sperm DNA

Die Hybridisierung erfolgte in der gleichen Lösung unter Einsatz der gesamten Menge markierter Oligonukleotide. Die doppelten Abzüge der Platten 1 bis 6 wurden mit EBI-386, jene der Platten 7-12 mit EBI-387 und EBI-388 16 Stunden bei 49°C hybridisiert. Die Abzüge der Platten 13-24 wurden 16 Stunden mit EBI-118 und EBI-119 bei 37°C hybridisiert. Nach erfolgter Hybridisierung wurden die Filter zweimal mit 6×SSC/0,01% SDS gespült, 2×30 Minuten bei Raumtemperatur mit 6×SSC/0,01% SDS und 3×20 Minuten in der gleichen Lösung bei 49°C bzw. 37°C gewaschen. Nach dem Lufttrocknen wurden die Filter an Kodak X-Omat-S-Film bei -70°C unter Verwendung einer Verstärkerfolie exponiert.

Lambda-Phagen, die auf beiden Filtern Hybridisierung mit dem Oligonukleotid zeigten, wurden unter Verwendung desselben Hybridisierungsprotokolls zur Homogenität gereinigt.

Aus der Hybridisierung mit EBI-386, -387 und -388 resultierten die Phagen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5, Lambda-P6/6. Die Hybridisierung mit EBI-118 und -119 resultierte in den Phagen Lambda-Nr.15, Lambda-Nr.19 und Lambda-Nr.22.

b) Isolierung der cDNA-Inserts

E. coli C 600 wurde mit 2,5×10⁶ pfu (Plague forming units) Phagen infiziert und mit 6 ml Topagarose (0,7% Agarose, 10 mM MgSO₄, LB) auf 13,5 cm Agarplatten (LB, 10 mM MgSO₄, 1,5% Agarose, 0,2% Glukose) plattiert. Nach 5½ Stunden Inkubation bei 37°C waren die Plagues konfluent. Die Platten wurden 30 Minuten bei 4°C gekühlt und die Agarose mit 10 ml Lambda-Diluent (10 mM Tris, pH=8, 10 mM MgSO₄, 0,1 mM EDTA) überschichtet. Die Phagen wurden über Nacht bei 4°C unter leichten Schütteln eluiert. Die überstehende Phagensuspension (ca. 8 ml) wurde in Corexröhrchen transferiert und 10 Minuten bei 15 000 rpm (4°C, JA 21 Zentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wurde in Polycarbonatröhrchen dekantiert und bei 50 000 rpm (20°C, L70 Beckman-Zentrifuge, 20°C, 50 Ti Rotor) bis omega²t=3×10¹⁰ (ca. 23 Minuten) zentrifugiert. Die pelletierten Phagen wurden nach Entfernen des Überstandes in 0,5 ml Lambda-Diluent resuspendiert und in Eppendorf Röhrchen transferiert. Die Suspension wurde durch kurzes Zentrifugieren von nichtsuspendierten Teilchen befreit, der Überstand in ein neues Röhrchen gefüllt. Nach Zusatz von 10 µg/ml RNaseA und 1 µg/ml DNase I wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 25 mM EDTA, 25 mM Tris, pH=8, 0,2% SDS wurde 30 Minuten bei 70°C inkubiert. Als nächstes wurde 1 vol Phenol/Chloroform (1 : 1) zugegeben, und Proteine durch Kippen des Röhrchens extrahiert. Nach 2 Minuten Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge wurde die wäßrige Phase mit 1 vol Chloroform extrahiert (nur Kippen, nicht Vortexen). Nach der Phasentrennung durch Zentrifugation wurden dem Überstand ½₀ vol 3 M Na-Azetat und 1 ml Äthanol zugesetzt. Dabei fiel die Phagen DNA fadenförmig aus. Nach 5 Minuten Inkubation bei 0°C wurde die DNA abzentrifugiert (10 Minuten). Das Pellet wurde einmal mit 70% Äthanol gewaschen, getrocknet und über Nacht in 50 µl TE gelöst (4°C). Die DNAs wurden mit EcoRI geschnitten und die entstehenden Fragmente auf einem 1% Agarosegel getrennt. Die cDNA Inserts der Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 hatten die Größe von etwa 1300 bis 1400 bp. Die Sequenzanalyse zeigte, daß alle drei Klone von ein und derselben mRNA abgeleitet waren. Das 5′-Ende der mRNA fehlte jedoch in den cDNAs. Die Inserts der Phagen Lambda-Nr.15, Lambda-Nr.19 und Lambda-Nr.22 hatten Längen von ca. 1600, 1100 und 1000 bp. Die Sequenzanalyse ließ eine annähernd vollständige cDNA vermuten. Die cDNAs der beiden Phagengruppen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 sowie Lambda-Nr.15, Lambda-Nr.19 und Lambda-Nr.22 sind von zwei verschiedenen mRNAs abgeleitet, wie die nachfolgende Sequenzanalyse ergab.

Die EcoRI Inserts der drei Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnitten Bluescribe M13⁺-Vektor ligiert (Vector Cloning Systems, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Die resultierenden Klone wurden pP6/5, pP6/6 und pP11/3 genannt.

Die EcoRI Inserts der drei Klone Lambda-Nr.15, Lambda-Nr.19 und Lambda-Nr.22 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺-Vektor ligiert Die resultierenden Klone wurden pRH201, pRH202 und pRH203 genannt.

c) Weitere VAC-cDNA-Klone

Um weitere cDNA-Klone zu erhalten, wurde die humane, plazentale Lambda-gt10-Bibliothek nochmals durchsucht, diesmal mit dem EcoRI-Insert des pP11/3 als Sonde.

Dieses DNA-Fragment wurde durch Nickeltranslation radioaktiv markiert (T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982, pp. 109-112, keine DNase I verwendet). Insgesamt wurden 4×10⁵ Phagen auf 8 Platten durchsucht. Die Behandlung der Nitrozellulosefilter erfolgte wie in T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982, pp. 320-321 beschrieben. Die Hybridisierungslösung enthielt 6× SSC, 5× Denhardt′s, 0,1% SDS sowie 20×10⁶ cpm pP11/3 Insert. Die Hybridisierungsdauer betrug 16 h bei 65°C. Die Filter wurden danach 3×10 Minuten bei Raumtemperatur mit 6× SSC/0,01% SDS und 3×45 Minuten bei 65°C und mit 0,2× SSC gewaschen. Insgesamt wurden 69 positiv reagierende Klone erhalten (Lambda-VAC1 bis Lambda-VAC69).

12 dieser Klone wurden im kleinen Maßstab wie oben beschrieben präpariert, die cDNA-Inserts mit EcoRI freigesetzt und auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Dabei zeigte sich, daß das Insert des Klons Lambda-VAC10 den gesamten für VAC-Protein kodierenden Leserahmen enthält.

Beispiel 3 Charakterisierung der cDNAs kodierend für VAC-alfa und VAC-beta a) Northern Blot Experiment

Zu 2 µg poly-A⁺ RNA wurden 5 µl Wasser, 16 µl Formamid, 6 µl Formaldehyd und 3 µl 0,1 M NaOH zugesetzt, die Lösung 10 Minuten bei 68°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Nach Zusatz von 5 µl Farbstofflösung (je 0,4% Bromphenolblau und Xylencyanol in 50% Glyzerin, 1 mM EDTA) wurde die RNA auf einem Formamid-Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 10 mM Na-Phosphat pH=7,6, 1 mM Na-Azetat, 6% Formaldehyd, Elektrophorese 100 V, 3 Stunden, Laufpuffer wie Gelpuffer, ohne Formaldehyd). Als Referenz wurde Gesamt-RNA aufgetragen. Diese Spur wurde nach der Elektrophorese abgetrennt und mit EtBr angefärbt, um die Lage der 28 und 18 S rRNA zu bestimmen. Der Rest des Gels wurde zweimal 10 Minuten in 10× SSC gewaschen, und die RNA mit 20× SSC auf Nitro-zellulosefilter übertragen. Das Filter wurde mit 2× SSC gewaschen, getrocknet und 2 Stunden im Vakuum bei 80°C gebacken. Jeweils 1 µg pP11/3 und pRH203 wurden mit dem Multiprime DNA labelling System (Amersham, RPN 1601) radioaktiv markiert. Das Nitro-zellulosefilter wurde 2 h bei 65°C in 6× SSC/5× Denhart′s/0,1% SDS prähybridisiert. Jeweils eine Spur wurde mit 180×10⁶ cpm pP11/3 bzw. pRH203 hybridisiert (16 h 65°C). Die Filter wurden zweimal 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2× SSC/0,1% SDS und zweimal 30 Minuten bei 65°C mit 0,2× SSC/0,01% SDS gewaschen, getrocknet und an Kodak X-Omat-S-Film mit Verstärkerfolie exponiert.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 abgebildet. Die cDNA des Klons pP11/3 hybridisiert an eine mRNA der Größe von etwa 1700 Basen ("VAC-alpha"), die cDNA des Klons pRH203 an eine mRNA der Größe von etwa 2200 Basen ("VAC-beta").

Da erstens die eingesetzte Radioaktivitätsmenge sowie die aufgetragene Menge mRNA pro Spur etwa gleich war und zweitens die Hybridisierung eines Genom-Blots in derselben Lösung Banden gleicher Intensität mit beiden cDNAs ergab (siehe unten), ist zu schließen, daß die kürzerer mRNA ("VAC-alfa") in größeren Mengen als die längere ("VAC-beta") mRNA in Plazenta vertreten ist.

b) Sequenzanalyse der VAC-alfa-cDNA

Die cDNA-Klone pP6/5, pP6/6 und pP11/3 wurden total, sowie die der Klone Lambda-VAC1 bis -12 partiell sequenziert. Das Resultat ist in Fig. 4 abgebildet. Es wurden insgesamt 1465 Basen sequenziert. Die cDNA weist einen langen, offenen Leserahmen auf, der für 320 Aminosäuren kodieren kann. Wird die DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz übersetzt, so können alle sequenzierten Peptide in dieser Sequenz untergebracht werden (Fig. 5). Es handelt sich daher bei dieser cDNA um jene, deren korrespondierende mRNA für VAC-protein kodiert. Da die Sequenzen der zweiten isolierten cDNA (siehe unten) für ein ähnliches, aber von VAC verschiedenes Protein kodiert, wird hier der Name VAC-alfa eingeführt.

Dem ersten ATG-Codon (Basen 35-37) geht im selben Leserahmen ein Stop-Codon voran. Die Basen 30 bis 38 erfüllen ziemlich gu die Kozakregel (M. Kozak, Nature 308 [1984], pp. 241-246), die die Konsenssequenz in der Nähe des Translationsstartcodons mit CC(A/G)CCAUGG angibt, die entsprechende Sequenz hier lautet TCGCTATGG. Die 3′nichtranslatierte Region ist 471 Basen lang. 15 Basen vor Beginn des poly-A Abschnitts befindet sich die Polyadenylierungssequenz AATAAA (N. J. Proudfoot et al., Nature 263 [1976], pp. 211-214). Wird eine Kettenlänge von 150 bis 200 Basen für den Poly-A Abschnitt der mRNA gerechnet, beträgt die Gesamtlänge der mRNA auf Grund der cDNA-Sequenz 1600-1650 Basen. Da im Northern Blot Experiment ein höherer Wert bestimmt wurde, ist die 5′nichttranslatierte Region in keiner cDNA komplett enthalten.

Die cDNA des Klons pP6/5 weist im Gegensatz zu allen anderen cDNA-Klonen an Position 100 C statt A auf. Dadurch würde sich das Triplett 98-100 (22. Codon) von GAA nach GAC ändern und für Asp anstelle von Glu kodieren. Diese Abweichung kann mehrere Ursachen haben: a) die Reverse Transkriptase baute ein falsches Nukleotid ein, b) es handelt sich um die Transkripte zweier alleler, an dieser Stelle verschiedener Gene oder c) es gibt zwei nicht allele Gene, die sich an dieser Position unterscheiden.

Der lange, offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit 320 Aminosäuren, von dem das Met-1 wahrscheinlich abgespalten, und das folgende Alanin an der Aminogruppe, möglicherweise durch Acylierung, blockiert wird. Das errechnete Molekulargewicht beträgt 35 896 D und ist höher als der Wert nach SDS-PAGE. Allerdings ist der Anteil geladener Aminosäuren (Asp, Glu, Lys, Arg, His) mit 30,6% (98/320) überdurchschnittlich hoch verglichen mit dem durchschnittlichen Wert von 25,1%. Dies würde das veränderte Wanderungsverhalten des Proteins bei der SDS-PAGE erklären. Innerhalb der stark geladenen Aminosäuren überwiegen die sauren Aminosäuren (Asp und Glu) mit 54 gegenüber den basischen (Lys und Arg) mit 41. Dies erklärt den sauren, isoelektrischen Punkt des VAC-alfa-Proteins (pI=4,4 bis 4,8) VAC-alfa enthält nur ein für Cystein codierendes Triplett (Aminosäure-Position 316); ein typisches N-Glykosilierungsstelle (Asn-XXX-Ser/Thr) ist nicht vorhanden. Eine Strukturanalyse der Aminosäuresequenz (modifiziert nach Pustell, J. et al., Nucleic Acids Res. 10 [1982] pp. 4765-4782) ergibt eine vierfache Wiederholung einer 67 Aminosäure langen Sequenz (Fig. 6), im folgenden "Repeats" genannt. Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 15 Aminosäuren (22,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 28 Positionen (41,8%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure.

c) Sequenzanalyse der VAC-beta-cDNA

Die VAC-beta-cDNA-Sequenz der Klone Nr.15, Nr.19 und Nr.22 ergab 1940 bp und geht in einen poly-A-Abschnitt über (Fig. 7) 16 Basen vor dem poly-A-Abschnitt findet sich das Polyadenylierungssignal AATAAA. Allerdings kommt diese Konsenussequenz bereits an der Nukleotidposition 1704-1709 vor. Weshalb diese Sequenz nicht als Polyadenylierungssignal verwendet wird, ist unbekannt. Die zusätzlich erforderliche Sequenz an der 3′-Seite der AATAAA Sequenz, YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 [1984], pp. 473-474) kommt erst relativ weit entfernt vor (TGTGTTAT, Position 1735-1742); möglich, daß dies die Erklärung für ein Nichtakzeptieren dieser ersten Polyadenylierungssequenz darstellt.

Die cDNA enthält einen langen, offenen Leserahmen, der vom Beginn der cDNA bis Position 1087 reicht. Er würde ein Kodierungspotential für 362 Aminosäuren beinhalten. Aus Analogiegründen zu VAC-alfa und aufgrund der Tatsache, daß auch ein 34 000 D Protein bei der Reinigung von VAC anfällt (siehe E. P. A. 1 81 465) wurde das erste Methioninkodon (ATG, Position 107-109) als Translationsstart angenommen. Die Kozakregel ist hier nicht so gut erfüllt wie bei VAC-alfa (AAGAGATGG auf Position 102-110).

Das resultierende Protein (VAC-beta) wäre 327 Aminosäuren lang. Es besitzt 4 Cysteinreste (Aminosäureposition 161, 206, 250 und 293) und eine Aminosäureposition 225-227). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 36 837 (Fig. 9). Auch in VAC-beta gibt es überdurchschnittlich viele geladene Reste: 97/327 (29,6%), wobei die sauren Aminosäuren (Asp+Glu: 49) über die basischen (Lys+Arg 42) überwiegen; eine Erklärung für das nach SDS-PAGE ermittelte niedrigere Molekulargewicht.

d) Genomische Southernblot Analyse

Die Analyse chromosomaler DNA aus humaner Plazenta nach Southern zeigt ein komplexes Bild. Die DNA wurde mit EcoRI, HindIII, BamHI und PstI geschnitten. Die auf Nitrozellulose transferierte DNA wurde sowohl mit einer VAC-alfa-DNA (pP11/3) als auch mit einer VAC-beta DNA (pRH203) hybridisiert. Das Waschen der Filter geschah unter stringenten Bedingungen (siehe Punkt a), d. h. mit 0,2× SSC und 65°C. Trotzdem ergaben sich bei jedem Verdau relativ viele Banden (Fig. 10). Der Vergleich der beiden Blots zeigt, daß die Kreuzreaktion von VAC-alfa und VAC-beta-DNA unter diesen Bedingungen eher auszuschließen ist. Die Vielzahl der Banden ist entweder durch die Existenz jeweils ähnlicher Gene zu dem VAC-alfa bzw. VAC-beta-Gen zu erklären, oder aber es handelt sich um jeweils ein Gen, das durch viele und/oder lange Introns unterbrochen ist.

Beispiel 4 Protein-Analyse

In Fig. 11 ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen von VAC-alfa mit VAC-beta wiedergegeben. Die wiederholten Strukturen lassen sich in beiden Proteinen gleich anordnen. Die Verbindungspeptide sind ebenfalls gleich lang mit Ausnahme jener zwischen der 2. und 3. Repeat. In dieses Verbindungspeptid muß bei VAC-alfa eine Lücke eingeführt werden, um einen optimale Anpassung der beiden Sequenzen zu erlauben. Das N-terminale Peptid der beiden Proteine ist unterschiedlich lang, 19 Aminosäuren bei VAC-alfa, 25 Aminosäuren bei VAC-beta. Dieses Peptid weist auch die geringe Homologie auf. Die beiden Proteine sind an 176 von 320 Aminosäurepostionen ident, was einem Homologiegrad von 55,0% entspricht.

An dieser Stelle sei auch der Vergleich der Nukleotidsequenzen der VAC-alfa und VAC-beta-cDNAs eingefügt. Werden zwei Gene und deren Produkte miteinander verglichen, sieht man auf der DNA(=RNA)- Ebene eine größere Homologie als auf der Aminosäureebene, was durch die Tatsache erklärt ist, daß bei der Nukleinsäure bereits eine Veränderung in einem Basentriplett ausreicht, um eine neue Aminosäure zu kodieren.

In Fig. 12 ist der Vergleich der kodierenden Regionen von VAC-alfa- und VAC-beta-cDNA wiedergegeben. Überraschenderweise zeigen die DNAs nur einen Homologiegrad von 54,2%, also etwas weniger als die beiden Proteine.

In Fig. 13 sind die Hydrophilizitätsprofile der beiden Proteine abgebildet. Dabei wurde der Algorithmus von Hopp und Wood verwendet (T. P. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 [1981] pp. 3824-3828). Die vier Repeatbereiche sind durch die Balken angedeutet, die Verbindungspeptide in der darunter angegebenen Sequenz eingerahmt. Dabei fällt auf, daß das Verbindungspeptid zwischen der zweiten und dritten Repeat besonders hydrophil ist. In diesem Peptid befindet sich sowohl bei VAC-alfa als auch bei VAC-beta ein Arginin an identer Position. Es wäre daher möglich, daß dieses Arginin einen bevorzugten Angriffspunkt für eine Protease mit trypsinartiger Spezifität darstellt. Dabei müßte das Molekül in zwei etwa gleich große Hälften zerfallen. Es wäre denkbar, daß bereits ein solches "Halbmolekül" eine biologische, beispielsweise eine antikoagulierende Wirkung entfalten kann. Auf der anderen Seite könnte vielleicht der Austausch dieses Arginins durch z. B. Histidin den VAC-Proteinen eine größere Stabilität vermitteln.

Aus Fig. 13 ist weiterhin leicht zu erkennen, daß weder VAC-alfa noch VAC-beta einen längeren, hydrophoben Bereich aufweisen, der entweder die Sekretion durch, oder das Einlagern der Proteine in eine Membran erlauben würden. Es ist daher anzunehmen, daß es sich bei VAC-alfa und VAC-beta um intrazelluläre Proteine handelt.

Beispiel 5 Expression von VAC-alfa in E. coli a) pRH284T: Expressionsvektor mit dem alkalischen Phosphatasepromotor und Terminator

Das Gen für die alkalische Phosphatase (PhoA) aus E. coli unterliegt einer strengen Regulation. In Gegenwart von Phosphat wird das Gen komplett abgeschaltet, bei Abwesenheit von Phosphat im Medium erfolgt Genexpression. H. Shuttleworth et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 8689 sowie C. N. Chang et al., Gene 44 (1986), pp. 121-125 beschreiben die Nukleotidsequenz dieses Gens.

Aus mehreren Oligonukleotiden wurde die Promotorregion des PhoA-Gens zusammengesetzt und in EcoRI-ClaI geschnittenes pAT153 eingesetzt. Vor der ribosomalen Bindungsstelle wurde eine XhoI-Stelle eingeführt. Die originale EcoRI-Stelle wird beim Einligieren des synthetischen DNA-Fragmentes zerstört. Nach der ribosomalen Bindungsstelle wurde ein Translationsstart-ATG vorgesehen, dessen G das erste Nukleotid einer SacI(=SstI)-Stelle ist. Der Expressionsvektor läßt sich durch Schnitt mit SacI an dieser Stelle linearisieren und der 3′-Überhang durch Behandlung mit DNA-Polymerase I - Klenow Fragment in Gegenwart von dGTP in ein gerades Ende überführen. Dadurch kann jedes beliebige Gen an dieser Stelle eingefügt werden, für korrekte Expression muß es mit der ersten Base der kodierenden Region beginnen.

Das HindIII-SaII-Fragment des pAT-Anteils wurde entfernt und durch den alkalischen Phosphatase-Transkriptionsterminator ersetzt. Die originale SalI-Stelle wurde zerstört. Dafür wurde sie vor dem Terminator zusammen mit der ebenfalls aus pAT153 deletierten BamHI-Stelle wieder eingebracht. Die Sequenz der synthetisch hergestellten DNA ist in Fig. 15 abgebildet.

b) Expressionsklon pRH291

Der cDNA-Klon pP6/5 wurde mit BglII und PstI geschnitten und das 980 bp lange Fragment isoliert, das den Hauptteil der kodierenden und ca. 200 bp 3′nichttranslatierte Region enthält. Mittels Oligonukleotiden wurde das fehlende 5′Ende der kodierenden Region ersetzt. Dabei wurde durch zwei Mutationen (GGC→GGT, Gly-7 und ACT→ACC, Thr-8) gleichzeitig eine KpnI-Schnittstelle in die VAC-cDNA eingeführt.

Die Oligonukleotide hatten folgendes Aussehen:

Die Oligonukleotide EBI-680, -677, -678 und -682 wurden am 5′-Ende phosphoryliert. EBI-678 und -680, EBI-677 und -679 sowie EBI-682 und -681 wurden paarweise auf 100°C erhitzt und langsam abgekühlt (je 100 pMol in 20 µl). Die Doppelstrang-Oligonukleotide wurden vereint und ligiert. pRH284T wurde mit SacI linearisiert, das 3′überhängende Ende durch Behandlung mit DNA-PolymeraseI/ Klenow Fragment in Gegenwart von dGTP zu einem geraden Ende reduziert, und mit BamHI nachgeschnitten. Ca. 30 ng Vektor, 200 ng cDNA und 250 nMol Oligonukleotide wurden in 15 µl Lösung ligiert. Kompetente E. coli HB101 wurden mit der Ligaselösung transformiert. Der resultierende Klon wurde pRH291 benannt (Fig. 16).

Beispiel 6 VAC-beta-Expression in E. coli a) Expressionsklon pRH212

Als Expressionsvektor wurde das Plasmid pER103 verwendet (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21 [1983], 237-248). Der Vektor wurde mit HindIII linearisiert. Das 5′überhängende Ende wurde mit dATP und DNA-Polymerase I/Klenowfragment partiell eingefüllt, und der verbleibende Einzelstrangrest mit S1-Nuklease verdaut. Der Vektor wurde mit BamHI nachgeschnitten und das große Fragment isoliert (Fig. 17). Aus dem Klon pRH203 wurde das 440 bp lange MaeIII-BamHI-Fragment isoliert, das die Codons 13 bis 157 enthält. Das fehlende 5′Ende wurde durch Oligonukleotide ergänzt:

Dabei wurden für E. coli optimale Codons verwendet (z. B. R. Grantham et al., Nucleic Acids Res. 8 [1980], 1893-1912). Dieser Codonaustausch resultiert in einer neuen HindIII-Stelle bei Codon 5 bis 7. Das Oligonukleotid EBI-306 wurde phosphoryliert, mit EBI-307 hybridisiert und mit dem VAC-beta-Fragment ligiert. Nach dem Nachschnitt mit BamHI wurde das 5′terminale VAC-Fragment in den vorbereiteten pER103-Vektor ligiert. Der entstehende Klon wurde pRH211 benannt. Um die für VAC-beta kodierende Region zu ergänzen, wurde aus dem Klon pRH201 das 1230 bp lange pBR322 Abschnitt von BamHI bis SphI aus dem Plasmid pRH211 wurde entfernt und durch den entsprechenden VAC-cDNA-Teil ersetzt. Es resultierte der Klon pRH212. Das EcoRI-BamHI-Fragment, das den Trp-Promotor (S. marcescens), die ribosomale Bindungsstelle und den synthetisch hergestellten Beginn des VAC-beta-Gens enthält, wurde durch Sequenzieren überprüft.

b) Expression von VAC-beta (pRH212)

Der Nachweis des plasmidkodierten VAC-beta erfolgte im Maxizell-system (A. Sancar et al., J. Bacteriol, 137 [1979], pp. 692-693). Ecoli CSR603 (F^-, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recA1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, Lambda^-, supE44) wurde mit pRH212 transformiert und bis zu einer OD₆₀₀ bei 37°C gezüchtet. 20 ml Kultur wurden in einer offenen Petrischale mit einer UV-Germicidlampe (15 W) aus 50 cm Entfernung 5 Sekunden lang bestrahlt und anschließend 1 Stunde weiter inkubiert. Der Kultur wurden 100 µg D-Cycloserin zugesetzt. Nach 16 Stunden wurden die Bakterien abzentrifugiert, zweimal mit Hershey-Salzlösung gewaschen (5,4 g/l NaCl, 3,0 g/l KCl, 1,1 g/l NH4Cl, 15 mg/l CaCl₂ 2 H₂O, 0,2 g/l MgCl₂×6 H₂O, 0,2 mg/l FeCl₃×6 H₂O, 87 mg/l KH₂PO₄, 12,1 g/l Tris pH=7,4), in 5 ml Hersheymedium resuspendiert (pro 100 ml Hersheysalze: 2,0 ml 20% Glukose, 0,5 ml 2% Threonin, 1,0 ml 1% Leucin, 1,0 ml 2% Prolin, 1,0 ml 2% Arginin, 0,1 ml 0,1% Thiamin-HCl) und mit 20 µg/ml Indolacrylsäure 2 Stunden inkubiert. Nach Zusatz von 5 µCi/ml ³⁵S-Methionin und weiterer Inkubation bei 37°C (1 Stunde) wurden die plasmidkodierten Proteine radioaktiv markiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und in 200 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen (Lämmli-Gel System, z. B. L. G. Davies et al., Methods in Molecular Biology [1986] pp. 306-310). Die markierten Produkte wurden auf einem 15% Acrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und an Kodak X-Omat-S-Film exponiert. Als Referenz wurde gereinigtes VAC-alfa Protein mitlaufen gelassen und durch Anfärben sichtbar gemacht. VAC-alfa läuft etwas schneller als das pRH212 kodierte VAC-beta, wie es auch dem Molekulargewicht nach zu erwarten war. Die Expression von VAC-beta ist außerdem durch Zugabe des Induktors Indolacrylsäure stimulierbar (Fig. 18).

c) Expressionsklon pRH292

Der Expressionsvektor pRH284T wurde mit SacI linearisiert und die 3′überhängenden Enden mit DNA-Polymerase I/Klenowfragment und dGTP in gerade Enden übergeführt. Der Vektor wurde mit SalI nachgeschnitten, und das große Fragment isoliert. Das HindIII-SalI-Insert des Klons pRH212 wurde isoliert. 0,2 pMol des Oligonukleotidpaares

wurde mit 0,2 pMol VAC-beta-Insert und 0,015 pMol vorbereiteten pRH284T ligiert. E. coli HB101 wurde mit der Ligaselösung transformiert. Der resultierende Klon wurde pRH292 benannt (Fig. 19).

Beispiel 7 Nachweis der Expression von VAC-alfa und VAC-beta in E. coli a) Anzucht der Klone HB101/pRH291 und HB101/pRH292

Medien:
1)Vorkultur

10 g/l
Trypton
5 g/l	Hefeextrakt
4 g/l	Glucose
9 g/l	Na₂HPO₄ · 2 H₂O
1 g/l	NH₄Cl
1 g/l	KCl
1 ml/l	1 M MgSO₄ · 7 H₂O
100 mg/l	Ampicillin

Start-pH = 7,2

2) Hauptkultur

0,68 g/l
(NH₄)₂HPO₄
0,62 g/l	K₂HPO₄ · 3 H₂O
2,33 g/l	KCl
0,5 g/l	NaCl
0,53 g/l	NH₄Cl
1,23 g/l	MgSO₄ · 7 H₂O
0,011 g/l	CaCl₂
10 mg/l	Thiamin · HCl
3,92 mg/l	(NH₄)₂Fe(SO₄)₂ · 6 H₂O
0,72 mg/l	AlCl₃ · 6 H₂O
0,71 mg/l	CoCl₂ · 6 H₂O
1,5 mg/l	KCr(SO₄)₂ · 12 H₂O
0,75 mg/l	CuSO₄ · 5 H₂O
0,19 mg/l	H₃BO₃
0,51 mg/l	MnSO₄ · H₂O
0,79 mg/l	NiSO₄ · 6 H₂O
0,73 mg/l	Na₂MoO₄ · 2 H₂O
0,86 mg/l	ZnSO₄ · 7 H₂O
21 g/l	Caseinhydrolysat (Merck Art. #2238)
25 g/l	Caseinhydrolysat (Sigma C9386)
100 mg/l	Cystein
2 g/l	Hefeextrakt
1 g/l	Citronensäure
11 g/l	Glucose · H₂O (Start bzw. Feed)

700 ml Vorkulturmedium wurden mit dem Expressionsklon angeimpft und bei 37°C unter Rühren (1000 rpm (=Umdrehungen pro Minute), Magnetstab) und Sauerstoffzufuhr (5 vvm (=vol/vol/min), Belüftungsfritte) 12 bis 15 Stunden inkubiert. 600 ml dieser Vorkultur wurden in einen Fermenter mit 12 l Hauptkulturmedium überführt. Die Hauptkultur wurde unter folgenden Bedingungen fermentiert:

Belüftung:|1,0 vvm
Temperatur:	28°C
pH:	6,5 (25% NH₃ zur Korrektur)

Während der Fermentation wurde die Glucosekonzentration gemessen. Bei Absinken auf 5 g/l wurde 10 g/l Glucose nachgefüttert. Alle weiteren Nachfütterungen zu je 10 g/l erfolgten bei einem Absinken der Glucose­ konzentration im Fermenter auf 10 g/l. Fiel der Sauerstoffpartialdruck auf etwa 0,05 atm ab, wurde der Druck im Fermenter auf 0,3 bar erhöht. Nach 20 Stunden wurde auf 15°C abgekühlt, die Biomasse über eine CEPA-Zentrifuge vom Nährmedium abgetrennt und bei -70°C eingefroren.

b) Nachweis des rekombinanten Vac-alfa bzw. Vac-beta Proteins

Lösungen:

Probenpuffer:
125 mM Tris pH = 6,8
4% SDS
10% Mercaptoäthanol
10% Glyzerin
0,02% Bromphenolblau

Acrylamidgel:

Sammelgel:
3% Acrylamid
0,1% Bisacrylamid
125 mM Tris pH = 6,8
0,1% SDS

Trenngel:
13,5% Acrylamid
0,45% Bisacrylamid
375 mM Tris pH = 8,8
0,1% SDS

Laufpuffer:
14,4 g/l Glycin
3,025 g/l Tris
5 ml 20% SDS

Proteingel-Färbelösung:
0,1% Coomassieblau
50% Methanol
10% Essigsäure

Entfärbelösung:
5% Methanol
10% Essigsäure

Glycerinlösung:
7% Essigsäure
2% Glyzerin

Transferpuffer:

10× Transferpuffer:
24,2 g/l Tris
112,6 g/l Glycin

1× Transferpuffer:
100 ml/l 10× Transferpuffer
200 ml/l Methanol
1 ml/l Empigen

Blocklösung:
1% Tween 20
1% BSA (Rinderserumalbumin)
10% fötales Kälberserum (GIBCO) in PBS

PBS:
8 g/l NaCl
0,2 g/l KCl
1,15 g/l Na₂PO₄
0,2 g/l KH₂PO₄
0,1 g/l MgCl₂
0,7 g/l CaCl₂

alkalische Phosphatase-Puffer:
100 mM Tris pH = 9,5
100 mM NaCl
5 mM MgCl₂

Am Ende der Fermentation wurde die optische Dichte der Brühe bestimmt und ein Aliquot entnommen. Die Bakterien wurden in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert, mit einer Konzentration von 20 OD_{600 nm} (optische Dichte bei 600 nm) in Probenpuffer resupendiert und fünf Minuten bei 100°C denaturiert. Unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugieren in der Eppendorfzentrifuge pelletiert. 5 µl Aliquots wurden auf das Acrylamidgel geladen. Als Referenz dienten Expressionsklone, die ständig bei hoher Phosphatkonzentration gezüchtet worden waren (0,08 mM Phosphat). Unter diesen Bedingungen wurde der alkalische Phosphatasepromotor nicht aktiviert.

Die Proteine wurden bei 6,5 V/cm (Sammelgel) bzw. bei 13 V/cm (Trenngel) entsprechend dem Molekulargewicht aufgetrennt, bis der Bromphenolblaufarbstoff das Ende des Gels erreicht hatte. Eine Hälfte des Gels wurde mit Coomassieblau gefärbt. Dazu wurde das Gel 30 Minuten in der Färbelösung bewegt und anschließend eine Stunde in der Entfärbelösung behandelt. Zur besseren Entfernung des überschüssigen Farbstoffs wurde ein mit Aktivkohle gefüllter Dialysenschlauch in die Entfärbelösung getaucht. Das Gel wurde abschließend 30 Minuten in der Glyzerinlösung behandelt und mittels eines Geltrockners getrocknet.

Die Proteine der zweiten Gelhälfte wurden auf ein Nitrozellulosefilter übertragen. Dazu wurde der Sandwich Whatman 3MM Papier-Gel-Nitrozellulose (Schleicher-Schuell, BA85)-Whatman 3MM Papier in einer Biorad-Transferapparatur in 1× Transferpuffer zwei Stunden einer Spannung von 150 V (Stromstärke 1000 mA) unter Kühlung ausgesetzt. Das Nitrozellulosefilter wurde über Nacht bei Raumtemperatur in 50 ml Blocklösung behandelt. Das Filter wurde drei Stunden in 5 ml Blocklösung/1 : 1000 verdünntes Rabbit-Anti- Vac-Antiserum inkubiert und anschließend 30 Minuten in Fließwasser, sowie dreimal 15 Minuten in PBS/1% Tween 20 (Merck-Schuchardt # 822184) gewaschen. Das Filter wurde in 20 ml Blocklösung mit einer 1 : 2000 Verdünnung des Anti-Rabbit IgG (Fc) alkaline phosphatase conjugate (Promega-ProtBlot Immunoscreening System) drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde wie oben in Fließwasser und PBS/1% Tween 20 gewaschen. Der Nachweis des gebundenen Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugates erfolgte durch eine Farbreaktion (Promega-ProtoBlot Immunoscreening System). 66 µl NBT (50 mg/ml Nitro-blue-tetrazolium in 70% Dimethylformamid) und 33 µl BCIP (50 mg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat in Dimethylformamid) wurden in 10 ml alkalische- Phosphate-Puffer gelöst. Das Nitrozellulosefilter wurde bis zur Farbentwicklung in dieser Lösung inkubiert und anschließend 30 Minuten mit Fließwasser gewaschen. Das Filter wurde getrocknet und in Plastikfolie eingeschweißt.

In Fig. 19 ist das Resultat wiedergegeben. "+Phosphat" ist die Kontrolle ohne Expression, "-Phosphat" zeigt die Expression von Vac-alfa(Klon HB101/pRH291)- bzw. Vac-beta(Klon HB101/pRH292)-Protein unter der Kontrolle des alkalischen Phosphatase Promotors. Sowohl Vac-alfa- als auch Vac-beta-Protein sind bereits auf dem gefärbten Gel zu erkennen. Die gebildete Menge an Vac-Proteinen beträgt überraschenderweise mindestens 20 mg/l/OD600 nm Bakterienkultur.

Der Westernblot zeigt deutlich die angefärbte Vac-alfa- Bande. Zusätzlich sind einige Proteine niedrigeren Molekulargewichts im Bereich bis 30 kD erkennbar, die möglicherweise durch proteolytische Spaltung am N- und/oder C-Terminus des Vac-alfa-Proteins entstanden sind. Auffällig ist außerdem ein durch das Antiserum erkanntes Protein im Bereich kleiner 20 kD, das eventuell ein durch Proteolyse entstandenes Halbmolekül des Vac-alfa-Proteins darstellen könnte.

Überraschenderweise wurde auch Vac-beta durch das Anti-Vac-Antiserum erkannt. Da diese Bande wesentlich schwächer als die Vac-alfa-Bande gefärbt ist, andererseits aber die Vac-beta-Bande im Coomassie Blau gefärbten Gel in ihrer Intensität dem Vac-alfa entspricht, ist daraus zu schließen, daß die Erkennung des Vac-beta-Proteins durch das Anti-Vac-Antiserum wesentlich schlechter als jene des Vac-alfa-Proteins erfolgt.

Beispiel 8 Reinigung von rekombinantem VAC-alpha Ausgangsmaterial: E. coli HB101/pRH 291 Die Zellen waren zentrifugiert und bei -70°C eingefroren worden. a) Zell Homogenisierung und Extraktion

103,5 g gefrorener Zellkuchen wurde in 500 ml eiskaltem Lyse-Puffer (100 mM TRIS/HCl, 50 mM EDTA und 200 mM NaCl, pH 7,5) suspendiert und mit einem Ultra-Turrax (5 kurze Impulse) zur Zerstörung von Klumpen behandelt. Die Suspension wurde danach 3mal durch eine Manton-Gaulin-Presse bei 6000 psi geführt. Zuletzt wurde die Presse mit 300 ml Lyse-Puffer gespült. Zur homogenisierten Suspension wurde langsam eine 5%ige Lösung PEI (Polyethylenimin, Molekulargewicht 30000-40000), das mit 5 N HCl auf pH8 eingestellt worden war, bis zu einer Endkonzentration von 0,5% PEI, hinzugefügt. Nach 30minütigem Rühren in einem Eisbad wurde die Lösung bei 9000 g, 60 min und 4°C unter Verwendung einer Beckmann J2-21-Zentrifuge geklärt (roher Extrakt).

b) Ammoniumsulfat Fraktionierung

Festes Ammoniumsulfat wurde langsam zum gerührten rohren Extrakt bis zu einer Sättigung von 30% (176 g/l) gegeben. Der Niederschlag wurde nach einer Nacht im Kühlraum entfernt. Der klare Überstand wurde langsam bis zu einer Sättigung von 65% mit festem Ammoniumsulfat versetzt (235 g/l Überstand) und zwei Stunden gerührt. Das Präzipitat wurde dann durch Zentrifugation bei 10000 g 30 min bei 4°C gesammelt. Es wurde in 500 ml 20 mM TRIS/HCl + 50 mM NaCl, pH 7,4 gelöst und gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis alles Ammoniumsulfat entfernt worden war (bestimmt durch das Ausbleiben einer BaSO₄-Bildung nach Zugabe von BaCl₂ zum Dialysat).

c) Chromatographie an DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW

Das Dialysat wurde durch Zentrifugation geklärt und auf eine 160 ml DEAE-FF-Sepharose-Kolonne (Pharmacia), die mit 20 mM TRIS/HCl + 50 mM NaCl pH 7,4 equilibriert worden war, aufgetragen. Sobald der OD_{280 nm} des Eluates den Puffer-Level erreichte, wurde ein Gradient von 50-500 mM NaCl in 20 mM TRIS/HCl pH 7,4 gefahren (insgesamt 10 Kolonnen-Volumina des linearen Gradienten). Das Eluat wurde bei OD_{280 nm} kontrolliert und durch SDS-PAGE und Western Blot, unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums gegen Placenta-VAC hergestellt, wie für das Rinder-VAC in der EPA 01 81 465 beschrieben, und eines Schweine Anti-Kaninchen IgG gekuppelt an alkalischer Phosphatase, analysiert. VAC-enthaltende Fraktionen wurden gesammelt, wobei einige Fraktionen am Ende des Hauptpeaks verworfen wurden. Der VAC-Pool wurde unter Verwendung einer AMICON Ultrafiltrationszelle und eines PM 10-Typ Ultrafilters konzentriert.

d) Chromatographie an Sephacryl S-200 "High Resolution"

Eine Pharmacia K 26/100 Kolonne (500 ml) wurde mit Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) beladen und mit 20 mM Bis-TRIS/HCl + 100 mM NaCl pH 6,3 bei einer Durchflußrate von 15-20 ml/Stunde equilibriert. 6-15 ml Aliquots des konzentrierten DEAE-FF-Sepharose-Pools (total 87,4 ml) und anschließend der Bis-TRIS-Puffer (s.o.) wurden auf die Säule aufgetragen. Das Eluat wurde bei OD 280 nm überwacht. Der VAC repräsentierende Peak war der letzte auffällige Peak des UV-Profils wie durch SDS-PAGE und Western Blots von Aliquots gezeigt werden konnte. Er wurde gesammelt, die Pools aller Versuche vereinigt (insgesamt 7) und gegen 20 mM Bis-TRIS/HCl pH 6,3 dialysiert.

e) Chromatographie an einer Q-SEPHAROSE-FAST-FLOW

Eine 40-ml-Kolonne (K 16/20) einer Q-Sepharose-Fast-Flow (Pharmacia) wurde an das FPLC-System (Pharmacia) angeschlossen und mit 20 mM Bis-TRIS/HCl pH 6,3 equilibriert. Der dialysierte VAC-Pool wurde auf die Säule aufgetragen und so lange mit 20 mM Bis-TRIS gewaschen, bis der OD_{280 nm} des Eluates wieder den Puffer-Level erreicht hatte. ein NaCl-Gradient in 20 mM Bis-TRIS/HCl pH 6,3 wurde zur Elution verwendet:

  0-105 mM NaCl in 1 Kolonnen-Volumen (40 ml)
105-245 mM NaCl in 20 Kolonnen-Volumen (800 ml)
245-350 mM NaCl in 2 Kolonnen-Volumen (80 ml)

VAC konnte im letzten prominenten Peak des UV-Profils identifiziert werden, der bei ungefähr 0,14 M NaCl eluierte. Die Reinheit wurde mittels SDS-PAGE, Western Blot, Reverse HPLC und isoelektrischer Fokussierung bestimmt. Der VAC-Pool wurde bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 9 Vergleich Rekombinantes/natürliches VACα

Verwendete Methoden:

a) Gelpermeations-HPLC
b) Reverse Phase HPLC
c) N-terminale Sequenzierung
d) Tryptic Peptid Map
e) SDS-Gelelektrophorese
f) Western Blot
g) Isoelektrische Fokussierung

Für den Vergleich wurde einerseits natürliches VAC, andererseits rekombinantes VAC-alfa verwendet. Im folgenden werden die Versuchsbedingungen für die einzelnen Analysenmethoden beschrieben.

a) Gelpermeations-HPLC

Säule:
Waters Protein Pak I 125, 2×(7,8×300 mm), 10 µm Teilchendurchmesser
Eluens:	0,5 M Na₂SO₄, 0,02 M NaH₂PO₄, pH 7,0, 0,04% Tween 10, 25% Propylenglykol
Fluß	0,5 ml/min
Detektion:	UV-Absorption, 214 nm

Die Chromatogramme von natürlichem und rekombinantem VAC-alfa zeigen den Hauptpeak des VAC-Monomeren bei einem Molekulargewicht von 34000 bzw. 33000. Daneben gibt es jeweils einen geringen Anteil von früher eluierendem Dimeren des VAC. Die Eichung der Molekulargewichtsskala erfolgte über 4 Standardproteine. Die Säule trennt streng genommen nach Molekülgröße und nicht nach Molekulargewicht.

b) Reverse Phase HPLC

Säule:
Bakerbond WP C₁₈, 4,6×250, 5 µm Teilchendurchmesser, 30 nm Porendurchmesser
Eluens A:	0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Eluens B:	0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient:	20% B für 2 min, 20-68% B in 24 min, 68% B für 10 min, 68-20% B in 1 min
Fluß:	1,0 ml/min
Detektion:	UV-Absorption, 214 nm und 280 nm

Die Chromatogramme von natürlichem und rekombinantem VAC zeigen für VAC eine Retentionszeit von etwa 29 min. Die daneben vorliegenden sehr kleinen Peaks sind nur zum Teil Verunreinigungen der VAC-Probe. Alle mit BW gekennzeichneten Peaks stammen aus dem Blindwert der Säule.

c) N-terminale Sequenzierung

Sequenziert wurde ein über Reverse Phase HPLC entsalzter Peak von rekombinantem VAC-alfa. Die Sequenzierung erfolgte mit einem Gasphasensequenator der Firma Applied Biosystems (Modell 470A) mit dem Programm 40APTH. Die Probe wurde in 50 µl 70% HCOOH gelöst. Am Sequenator wurden 2×25 µl aufgetragen. Mit einer Ausgangsmenge von 2,3 nMol konnte bis zur Aminosäure 39 sequenziert werden. Es wurde 100%ige Übereinstimmung mit der erwarteten Sequenz (aus natürlichem Protein und cDNA) gefunden. Zusätzliches N-terminales Met konnte nicht nachgewiesen werden (1%). Der N-Terminus liegt bei rekombinantem VAC-alfa frei und nicht blockiert vor wie bei natürlichem VAC.

d) Tryptic Peptid Map

Verglichen wurden natürliches VAC und rekombinantes VAC-alfa. Aus beiden Proben wurde VAC über Reverse Phase HPLC entsalzt, getrocknet und in 0,1% NH₄HCO₃ gelöst. Für die Spaltung wurden 4 Gewichts-% Trypsin (Worthington, TPCK behandelt, gelöst zu je 1 mg/ml in Wasser) zugesetzt, nach 6 Stunden Inkubation bei 37°C nochmals 4 Gewichts-% Trypsin. Nach weiterer Inkubation über Nacht wurden die entstandenen Peptide über Reverse Phase HPLC getrennt. Die beiliegenden Chromatogramme (214 nm und 280 nm) zeigen ein praktisch identisches Peptidmuster.

Säule:
Waters µBondapak C₁₈, 3,8×300 mm,
	10 µm Teilchendurchmesser
	10 nm Porendurchmesser
Eluens A:	0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Eluens B:	0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient:	0-55% B in 55 min, 55% B für 15 min, 55-0% B in 1 min
Fluß:	1,0 ml/min
Detektion:	UV-Absorption, 214 nm und 280 nm

e) SDS-Gelelektrophorese

SDS-Gelelektrophorese wurde weitgehend nach der Originalvorschrift von U.K. Laemmli durchgeführt (Nature 227, 680-685 [1979]). Die Silberfärbung erfolgte nach der Methode von Oakley (Anal. Biochem. 105, 361-363 [1980]). Das erste Gel zeigt einen Vergleich zwischen natürlichem und rekombinantem VAC-alfa. Der Gehalt an dimerem VAC wurde durch Scannen mit einem Laserdensitometer quantifiziert und betrug 2% beim natürlichen und 4% beim rekombinantem VAC. Das zweite Gel zeigt nur rekombinantes VAC-alfa, aufgetragen mit und ohne DTT (Dithiothreitol, Reduktionsmittel). Daraus ist ersichtlich, daß das SDS-stabile Dimere offensichtlich über Disulfidbrücken gebunden ist, die mit DTT reduziert werden können.

Stammlösungen der Reagenzien

15% Ammonium-persulfat-Lösung (APS)
150 mg Ammonium-persulfat werden in 1 ml dest. Wasser gelöst.

30% Acrylamid + 0,8% Bis Acrylamid

Das Acrylamid wird in dem entsprechenden Wasservolumen gelöst und vor der Verwendung filtriert.

Trenngel-Puffer
1,5 M TRIS-HCl, 0,4% SDS (Sodium-dodecylsulfat), pH 8,8, 18,16 g TRIS + 0,4 g SDS mit konz. HCl auf pH 8,8 einstellen und mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen.

Stackinogel-Puffer
0,5 M TRIS-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8, 6,04 g TRIS + 0,4 g SDS mit konz. HCl auf pH 6,8 einstellen und mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen.

Laufpuffer
25 mM TRIS, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 0,005% Na-azid, pH 8,5, 12 g TRIS + 57,6 Glycin + 4 g SDS + 0,2 g Natriumazid werden in ca. 3,5 l dest. Wasser gelöst, auf pH 8,5 eingestellt und auf 4,0 l aufgefüllt. Es empfiehlt sich die Leitfähigkeit des neuen Laufpuffers mit den vorhergehenden Chargen zu vergleichen.

0,05% Coomassie-Blue-Färbelösung
0,55 g Coomassie Brillant Blue R 850 werden in 500 ml Methanol gelöst, 30 min gerührt und filtriert. Dazu gibt man 100 ml Eisessig und 500 ml dest. Wasser.

Entfärbelösung
a) Manuelles Entfärben
Die Entfärbelösung entspricht der Färbelösung ohne Farbstoff: 500 ml Methanol + 500 ml dest. Wasser + 100 ml Eisessig
b) Elektrophoretisches Entfärben in 7,5% Essigsäure

4× SDS Auftragepuffer (ca. 1 Monat haltbar)
Farbstoffkonzentrat:

Bromphenolblau|50 mg
Glycerin	0,5 ml
Wasser (dest.) auf	10 ml

Die Lösung ist ca. 3 Monate haltbar.

Auftragepuffer:

Farbstoffkonzentrat|0,4 ml
SDS	0,8 g
Glycerin	4 g
Wasser (dest.) auf	10 ml

1× SDS Auftragepuffer
Verdünnung 1 : 4 des 4× SDS Auftragepuffers mit dest. Wasser.

Silberfärbung nach Oakley
Reagenzien
Destainer:

Ethanol|200 ml
Essigsäure (conc.)	62,5 ml
Dest. Wasser auf	1000 ml

10% Glutardialdehyd-Lösung

25% Glutardialdehyd-Lösung
20 ml bzw. 40 ml
Dest. Wasser auf	50 ml bzw. 100 ml

Die Lösung muß im Kühlschrank aufbewahrt werden.

0,1 N ammoniakalische Silberlösung:
Erst direkt vor Gebrauch herstellen:

Entwickler-Lösung
Unmittelbar vor Gebrauch herstellen:

0,5% Citronensäure (1,25 g/250 ml)|5 ml
dest. Wasser	1 l
37% Formaldehyd	1 ml

Entfärbe-Lösung (Photo-Fixierer)
Kodak-Fixierer (Photolabor) Verdünnung 1 : 4 mit dest. Wasser. Die Verdünnung ist mehrfach verwendbar, jedoch nimmt die Dauer des Entfärbens nach häufigerer Verwendung zu.

2% Glycerin-Lösung
23 g Glycerin 87% in 1 l dest. Wasser

Durchführung der Silberfärbung nach Oakley

Nach beendeter Elektrophorese wurde das Gel an einer Ecke markiert und durchlief danach folgende Färbeschritte im Schüttler:

• - 30 min im Destainer-Bad
• - 30 min in 20% Glutardialdehyd-Lösung (50 ml)
• - 30 min in fließendem Wasser oder über Nacht in ca. 2 l Wasser
• - 10 min in ammoniakalischer Silberlösung (50 ml)
• - 3 min in fließendem Wasser
• - ca. 5 min in Entwickler-Lösung

Der Entwicklungsvorgang wurde nicht nach einer exakten Zeitdauer beendet, sondern dann, wenn die Banden ausreichend gefärbt waren oder spätestens wenn sich der Hintergrund zu färben begann. Gestoppt wurde die Entwicklung durch

• - 30 min Wässern der Gele (in einer Wanne oder unter Fließwasser)

Die Entwicklung dauerte auch noch an, wenn das Gel bereits im Wasser war! (Diffusionszeit). Das Entfärben des Gels war nur dann erforderlich, wenn der Hintergrund zu stark gefärbt war!

• - ca. 5-10 min in Kodak-Fixierer, bis ein optimaler Kontrast zwischen den Banden und dem Hintergrund erreicht war. Achtung! Das Entfärben erfolgte auch noch nach unmittelbarem Abstoppen in fließendem Wasser (Diffusionszeit).
• - 30 min in 2% Glycerin-Lösung

Danach konnte das Gel auf Filterpapier bei 80°C 1 Std. getrocknet werden.

f) Western Blot

Der immunologische Nachweis erfolgte für VAC mit rabbit anti VAC Serum (1 : 1000 verdünnt) und mit swine anti rabbit IgG (1 : 500 verdünnt), das mit Alkalischer Phosphatase konjugiert ist. Zum Nachweis der Enzymaktivität der Alkalischen Phosphatase wurden die Substrate BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat) und NBT (Nitro Blue Tetrazolium) eingesetzt. Die vergleichende Proteineinfärbung auf der Nitrocellulose erfolgte mit Amidoschwarz.

Western-blotting im semi-dry Verfahren 1. Materialien

Semy-dry Electroblotter (Fa. Sartorius) SM 175 56; Filterpapier in der Größe des zu blottenden Gels; Nitrocellulose-Membran (Porengröße 0,45 µm) in Gelgröße.

2. Reagenzien

Anodenpuffer 1: pH 10,4

0,3 M TRIS
3,63 g/80 ml
20% Methanol	20 ml

Anodenpuffer 2: pH 10,4

25 mM TRIS
0,3 g/80 ml
20% Methanol	20 ml

Kathodenpuffer: pH 9,4

25 mM TRIS
0,3 g/80 ml
40 mM ε-Aminocapronsäure	0,52 g/80 ml (MW 131,3)
20% Methanol

Amidoschwarz-Protein-Färbemedium

0,5% (w/v) Amidoschwarz
0,5 g in 40 ml
50% Methanol	50 ml
10% Essigsäure	10 ml

Entfärber

PBS (Phosphate buffered saline) 10× Konzentrat
pH 7,2
136 mM Natriumchlorid|80 g
26 mM Kaliumchlorid	2 g
80 mM di-Natriumhydrogenphosphat	11,3 g
(80 mM di-Natriumhydrogenphosphat · 12 H₂O	28,7 g)
14 mM Kalium-dihydrogenphosphat	2 g
mit dest. Wasser auffüllen auf	1 l

Vor Gebrauch ¹/₁₀ verdünnen!!!

Blocking Puffer:
1% BSA
0,1% Tween 20
in 1× PBS

Waschpuffer:
1× PBS
1× PBS + 0,1% Tween 20
1× PBS

Färbepuffer für Alkalische Phosphatase-Färbung:
pH 9,9
100 mM TRIS|1,22 g
100 mM Natriumchlorid	0,58 g
5 mM Magnesiumchlorid · 6 H₂O	0,10 g
mit dest. Wasser auffüllen auf	100 ml

NBT (Nitro-Blue Tetrazolium)-Lösung
50 mg NBT (Fa. Sigma N-6876)/ml 70% Dimethylformamid

BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat)-Lösung
50 mg BCIP (Fa. Sigma B-8503)/ml in 100% Dimethylformamid

Färbemedium für Alkalische Phosphate

Färbungspuffer|10 ml
BCIP	0,033 ml
NBT	0,065 ml

Antikörperreagenzien:
Rabbit anti VAC-Serum mit alkalischer Phosphatase konjugiert.

3. Durchführung des Blots

Das Blotten erfolgte bei 0,8 mA/cm² Gelfläche über 60 min.

4. Nachweis der Proteine auf der Nitrocellulose-Membran 4.1. Proteinfärbung mit Amidoschwarz

Der für die Proteinfärbung vorgesehene Anteil der Nitrocellulose-Membran wurde abgeschnitten und 5 Minuten in Amidoschwarz-Färbelösung gelegt. Danach wurde die mehrfach verwendbare Färbelösung abgegossen und überschüssige Färbelösung von der Nitrocellulose-Membran mit Wasser abgespült.

4.2 Immunologischer Nachweis 4.2.1 Blockierung der Nitrocellulose-Membran

Vor dem immunologischen Nachweis wurde die Nitrocellulose-Membran mindestens 60 min (oder auch über Nacht) mit 1% BSA in 1× PBS mit 0,1% Tween 20 blockiert.

4.2.2 Nachweis mit Enzym-markierten Antikörpern

Nach dem Blockieren wurde die Nitrocellulose-Membran mit rabbit anti VAC Serum (in geeigneter Verdünnung in Blockierungsmedium) 60 min inkubiert.

Danach wurde 3× gewaschen: 1× PBS, PBS mit 0,1% Tween, 20,1× PBS. Darauf erfolgte die Inkubation der Membran mit swine anti rabbit IgG, das mit Alkalischer Phosphate konjugiert war (ebenso in einer geeigneten Verdünnung in Blockierungsmedium über 60 min). Danach wurde erneut 3× mit PBS gewaschen wie oben angegeben.

4.2.3 Enzymatische Färbung des Blots

Die Nitrocellulose-Membran wurde in Färbemedium gelegt (für ein Minigel reichten 10 ml aus) und im Schüttler langsam bewegt, bis sich eine ausreichende Anfärbung der Banden zeigte. Die Färbung wurde durch Auswaschen des Färbemediums mit Wasser beendet, danach die Nitrocellulose-Membran an der Luft getrocknet.

5. Bewertung des Western-Blots

Die immunologisch/enzymatisch nachgewiesenen Banden des Blots wurden mit den Banden der Proteinfärbung des Blots und auch mit dem entsprechenden Bandenmuster der SDS-Elektrophorese verglichen und einander zugeordnet.

7. Isoelektrische Fokussierung

Der isoelektrische Punkt (pI) für rekombinantes VAC-alfa liegt mit 4,9 um 0,1-pH-Einheiten höher als für natürliches VAC (4,8).

Polyacrylamidgel-Isoelektrische Fokussierung (PAGIF oder IEF) Material und Reagenzien

Polyacrylamidgelplatten für Isoelektrische Fokussierung auf Folie aufpolymerisiert. (LKB-"PAGplate", SERVA- "Servalyt Precotes").

Elektrodenlösungen für die jeweiligen pH-Bereiche:

pH 3,5-9,5 (LKB-PAGplate)

Anodenlösung:
1 M Phosphorsäure
Kathodenlösung:	1 M Natronlauge

pH 5,5-8,5 (LKB-PAGplate)

Anodenlösung:
0,4 m HEPES (mit Na-azid)
Kathodenlösung:	0,1 M NaOH

pH 4,0-6,5 (LKB-PAGplate)

Anodenlösung:
0,5 M Phosphorsäure + 0,1 M Glutaminsäure
Kathodenlösung:	0,1 M Beta-Alanin (mit Na-azid)

pH 3,5-9,5 (SERVALYT-Precotes)

Anodenlösung:
25 mM Asparaginsäure + 25 mM Glutaminsäure
Kathodenlösung:	2 M Ethylendiamin + 25 mM Arginin Base + 37,5 mM Lysin Base
Kühlvermittler:	Kerosin (Fa. SERVA)
Fixierlösung:	10% Trichloressigsäure (TCA) mit 5% Sulfosalicylsäure, 0,05% Coomassie Blue Färbelösung
Entfärber:	500 ml Methanol + 500 ml Wasser + 100 ml Eisessig
Proben:	Die Proben sollen salzarm oder besser noch salzfrei sein. Höhere Salzkonzentration müssen vor der IEF gegen ca. 5-10 mM Puffer oder Wasser dialysiert werden. NaCl kann jedoch bis zu 100 mM enthalten sein, ohne daß die Lauffronten gestört werden.

Fixierung des IEF-Gels vor Proteinfärbung

Das Gel wurde ca. 20 min in die Fixierlösung gelegt, jedoch ohne dabei zu schütteln! (Es löste sich dabei leicht von der Folie ab) Danach wurde 5 min gewässert.

Proteinfärbung der EIF-Gele mit Coomassie Blue

Die fixierten Gele wurden ca. 2 Std. in Färbelösung gelegt und dabei nur sehr leicht bewegt.

Entfärben der IEF-Gele

Nach der Färbung wurde die überschüssige Färbelösung mit Wasser abgespült und durch häufiges Wechseln des Entfärbers das Gel entfärbt. Nach ausreichendem Entfärben wurde das Gel wieder gewässert, bis der Entfärber ausgewaschen war.

Trocknen der IEF-Gele

Die Gele wurden auf eine nasse, wasserdurchlässige Klarsichtfolie oder Dialysemembran gelegt, mit der wasserundurchlässigen Seite nach oben und 1 Std. bei 80°C getrocknet.

Beispiel 10 Biologische Aktivität von rekombinantem VAC A. Modifizierter Prothrombin Zeit Test (s. EPA 01 81 465)

Zitriertes, Plättchen freies Plasma (PFP) wurde in An- oder Abwesenheit von rekombinantem VAC (r-VAC) oder natürlichem VAC zwei Minuten bei 37°C gerührt. Nach der Inkubation wurde eine Lösung aus brain tissue factor und Ca⁺⁺ zugegeben. Die Fibrinbildung wurde beobachtet, die Gerinnungszeit optisch registriert. Die Ergebnisse sind in Fig. 33 dargestellt und belegen, daß r-VAC und VAC die Fibrinbildung dosisabhängig inhibieren. Die spezifischen Aktivitäten des r-VAC und des VAC bewegen sich in derselben Größenordnung.

B. Thrombin Zeit Test (s. EPA 01 81 465)

Zitriertes PFP wurde in An- oder Abwesenheit von r-VAC oder VAC zwei Minuten bei 37°C gerührt. Nach der Inkubation wurde Thrombin und Ca⁺⁺ zugegeben. Die Fibrinbildung wurde optisch beobachtet. Sowohl r-VAC als auch VAC inhibieren nicht die Thrombin-induzierte Fibrinbildung wie aus Fig. 34 zu entnehmen ist. Folglich inhibieren sowohl r-VAC als auch VAC die Thrombinbildung, nicht jedoch die Thrombinwirkung.

C. Faktor Xa-Bildung in Gewebefaktor-aktiviertem Plasma (s. EPA 01 81 465)

Zitriertes PFP wurde in An- oder Abwesenheit von r-VAC oder VAC zwei Minuten bei 37°C gerührt.

Anschließend wurde eine Lösung von "brain tissue factor" und Ca⁺⁺ zum PFP gegeben, um so die Koagulation in Gang zu setzen. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben entnommen und in einem Puffer 1000fach verdünnt. 10 µl dieser Lösung wurden zu 40 µl einer Mischung, die die nachfolgenden Komponenten des Prothrombinase-Komplexes enthielten, zugegeben.

0,6 nM Faktor Va
50 µM Phospholipide (80% Dioleoyl-phospatidyl-cholin/ 20% Dioleoyl-phosphatidylserin)
1,0 µM Prothrombin

Nach einer Reaktionszeit von zwei Minuten wurde der Anteil an aktiviertem Prothrombin durch die amidolytische Aktivität unter Verwendung des chromogenen Substrats S 2238 beurteilt. Die Menge an amidolytischer Aktivität, die so gemessen wurde, ist der Menge an aktivem Faktor X_a in dem PFP direkt proportional.

Nach 1000facher Verdünnung bei Anwesenheit von VAC in dem PFP konnte keine Auswirkung auf die Prothrombin-Aktivierung beobachtet werden.

Eine typische Faktor-X_a-Bildungskurve und die Auswirkungen von r-VAC und VAC sind in Fig. 35 dargestellt. Durch diese Ergebnisse kann festgestellt werden, daß r-VAC die Gewebefaktorinduzierte Faktor-X-Aktivierung im Plasma, in dosisabhängiger Weise wie VAC inhibiert.

Die Ergebnisse zeigen weiterhin indirekt, daß sowohl r-VAC als auch VAC den Faktor X_a direkt nicht in einer zeitabhängigen Weise inaktivieren. Diese Aussage kann aus der Form der Kurve hergeleitet werden. Nachdem ein Maximum erreicht ist, beginnt die Menge an aktivem Faktor X_a in dem PFP, einer Kinetik Pseudo 1. Ordnung folgend, abzunehmen. Diese Abnahme resultiert vermutlich aus der Inaktivierung des Faktors X_a durch Antithrombin III. Die Geschwindigkeitskonstante Pseudo 1. Ordnung, die aus diesen Daten berechnet wurde, beträgt ca. 0,25 min^-1 und ändert sich nicht bei Abwesenheit von r-VAC und VAC.

Diese Daten belegen eindeutig, daß r-VAC VAC-Aktivität zeigt. Obwohl die spezifische Aktivität von r-VAc in diesem Koagulationstest identisch ist mit der von VAC und obwohl r-VAC Faktor X_a und Thrombin direkt nicht inaktiviert, wurden zusätzlich noch Untersuchungen zur r-VAC-Bindung an Phospholipide durchgeführt, um zweifelsfrei die Zugehörigkeit der VAC-Aktivität zum r-VAC zu demonstrieren.

Die Bindung von r-VAC und VAC an eine Phospholipid- Doppelschicht, die aus Dioleoylphosphatidylcholin und Dioleoylphosphatidylserin (80%/20%) besteht, wurde durch Verwendung eines automatischen Ellipsometers bestimmt. Dies Verfahren wurde von Cuypers et al. in J. Biol. Chem. 258 (1983), 2426-2431 beschrieben.

Ein typisches Ergebnis dieser Studie gibt Fig. 36 wieder. Sowohl r-VAC als auch VAC zeigen identische Bindungskinetik an die Doppelschicht, wenn sie in einer Konzentration von 1 µg VAC/ml dieser Doppelschicht zugesetzt wurden. Die Bindung erfolgt in Anwesenheit von Ca²⁺ und ist, wie durch die Zugabe von EDTA gezeigt werden konnte, reversibel.

Zusammenfasen kann festgestellt werden, daß r-VAC biologisch aktiv ist und von natürlichem VAC nicht zu unterscheiden ist.

Claims (86)

1. DNA, kodierend für ein Polypeptid/Protein mit im wesentlichen den biologischen Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei XXX für GAA oder GAC steht.

3. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht.

4. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls XXX für GAA oder GAC steht und/oder nach dem letzten AGA ein Stop-Codon steht.

5. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls vor dem ersten GAC ein Initiationscodon steht.

6. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls nach dem letzten AGG ein Stopcodon steht.

7. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls vor dem ersten GAT ein Initiationscodon steht.

8. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Abschnitt, der für die Linker-Sequenz zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur kodiert, ein Oligonukleotid eingefügt wird, das für eine Erkennungssequenz einer spezifischen Protease kodiert.

9. DNA nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das für Arginin +161 (VAC-α ) bzw. +167 (VAC-β ) kodierende Triplett ersetzt wird durch ein Codon, das für eine Aminosäure kodiert, die nicht von Trypsin als bevorzugte Spaltstelle erkannt wird, beispielsweise für Histidin.

10. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für Lysin und/oder Arginin kodierenden Tripletts gezielt ersetzt werden durch Tripletts, die für Histidin kodieren.

11. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das oder gegebenenfalls die für Cystein kodierenden Tripletts ersetzt wird/werden durch für Serin oder Valin kodierende Tripletts.

12. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem N-terminalen 5′-Ende eine für den jeweiligen Wirt homologe Signalsequenz vorangestellt ist.

13. DNA nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalsequenz am 3′-Ende eine spezifische Erkennungs-Spaltstelle für eine Protease kodiert.

14. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem N-terminalen 5′-Ende eine für einen Fusionsproteinanteil kodierende Sequenz vorangestellt ist.

15. DNA nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Fusionsproteinanteil kodierende DNA am 3′-Ende eine spezifische Erkennungs-Spaltstelle für eine Protease kodiert.

16. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Allel zu einer der in den vorhergehenden Ansprüchen beschriebenen DNA darstellt.

17. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine degenerative Form einer der in den vorhergehenden Ansprüchen beschriebenen DNA darstellt oder daß sie aus Kombinationen verschiedener vollständiger- oder Teil-Sequenzen einer der vorhergehenden Ansprüche besteht, kodierend für Hybridproteine im wesentlichen mit vascular-antikoagulierenden Eigenschaften.

18. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem der DNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 17 unter Bedingungen hybridisieren, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 90% erkennen lassen, wobei die DNA aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein kann und mit den DNA-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 17 durch Mutation, Nukleotid-Substitutionen, Nukleotid-Deletionen, Nukleotid-Insertionen und Nukleotid-Inversionen verwandt sein kann und für ein Polypeptid/Protein mit im wesentlichen den biologischen Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine kodiert.

19. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einen Vektor eingefügt ist.

20. DNA nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Vektor in funktioneller Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, in Mikroorganismen und/oder Säugetierzellen replizierbar.

21. DNA nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist, replizierbar in Prokaryoten.

22. DNA nach einem der Ansprüche 19 der 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist, replizierbar in Eukaryoten.

23. DNA nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Säugetierzellen replizierbar ist.

24. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einer DNA nach einem der Ansprüche 19 bis 23 transformiert ist.

25. Wirtsorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Prokaryot, vorzugsweise E. coli ist.

26. Wirtsorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Eukaryot ist.

27. Wirtsorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Säugetierzellinie ist.

28. Verfahren zur Herstellung von DNA-Molekülen die für Polypeptide/Proteine im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular antikoagulierenden Proteine kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer genomischen DNA-Bibliothek das für dieses Polypeptid kodierende Gen isoliert oder aus der zu diesem Gen gehörenden mRNA eine komplementäre für dieses Polypeptid kodierende DNA mit Hilfe des Enzyms Revese Transkiptase herstellt oder daß die für dieses Polypeptid kodierende DNA mit Hilfe chemisch und/oder enzymatischer Verfahren hergestellt wird.

29. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA einer der in den Ansprüchen 1 bis 17 beschriebenen entspricht.

30. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA eine mit entsprechenden Enden versehene DNA einfügt, die für ein Polypeptid im wesentlichen mit den Eigenschaften der vaskular-antikoagulierenden Proteine kodiert.

31. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA, die Expressionskontrollsequenzen enthält, eine mit entsprechenden Enden versehene DNA, die für ein Polypeptid mit im wesentlichen den Eigenschaften von vakular-antikoagulierenden Proteinen kodiert, so einfügt, daß die Expressionskontrollsequenzen die eingefügte DNA reguliert.

32. Verfahren zur Herstellung transformierter Wirtsorganismen nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirtsorganismus mit einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 19 bis 23 transformiert.

33. Polypeptid, im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine.

34. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 kodiert wird.

35. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei XX für Glu oder Asp steht und gegebenenfalls an Position 1 das Methionin abgespalten ist und das Alanin an Position 2 gegebenenfalls blockiert ist und/oder wobei gegebenenfalls Aggregationen durch beispielsweise intermolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an Position 316 vorliegen.

36. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls an Position 1 das Methionin abgespalten ist und das Alanin an Position 2 gegebenenfalls blockiert ist und/oder wobei gegebenenfalls intramolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an den Positionen 161 und/oder 206 und/oder 250 und/oder 293 und/oder Aggregationen durch intermolekulare Disulfidbrücken zwischen den genannten Positionen vorliegen.

37. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei XX für Glu oder Asp steht und gegebenenfalls an Position 1 das Methionin abgespalten ist und das Alanin an Position 2 gegebenenfalls blockiert ist und/oder wobei gegebenenfalls Aggregationen vorliegen.

38. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei X für Methionin oder Wasserstoff steht und/oder wobei gegebenenfalls Aggregationen durch beispielsweise intermolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an Position 156 vorliegen.

39. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls an Position 1 das Methionin abgespalten ist und das Alanin an Position 2 gegebenenfalls blockiert ist und/oder wobei gegebenenfalls Aggregationen durch beispielsweise intermolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an Position 161 vorliegen.

40. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel entspricht, wobei X für Methionin oder Wasserstoff steht und/oder wobei gegebenenfalls intramolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an den Positionen 40 und/oder 84 und/oder 127 und/oder Aggregationen durch intermolekulare Disulfidbrücken zwischen den genannten Positionen vorliegen.

41. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, völlig frei von homologen Polypeptiden.

42. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.

43. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,

• a) daß es einen Fusionsproteinanteil enthält und/oder
• b) daß es aus Teilbereichen der Polypeptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche besteht (Hybridproteine).

44. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) ein geeigneter Wirtsorganismus mit genetischen Informationen, kodierend für ein VAC-Protein transformiert,
• b) die Information zur Produktion des VAC-Proteins im Wirtsorganismus exprimiert und
• c) das VAC-Protein isoliert wird.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus gemäß den Ansprüchen 24 bis 27 definiert ist.

46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß die genetischen Informationen in den DNA-Molekülen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 enthalten sind.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß das VAC-Protein gemäß einem der Ansprüche 33 bis 43 definiert ist.

48. Polypeptid herstellbar nach einem der Ansprüche 44 bis 47.

49. Pharmazeutisch tolerierbare Salze der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48.

50. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

51. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 zur Herstellung pharmazeutischer Präparate.

52. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 als blutgerinnungshemmende Mittel.

53. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 als Thrombin-inhibierende Mittel.

54. Mittel zur therapeutischen Behandlung, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 enthält.

55. Hybrid-Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Antikörper gegen eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 sezerniert.

56. Monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die Wirkung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 ganz oder teilweise neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide binden.

57. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 56 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48.

58. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 56 zur Reinigung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48.

59. Test Kit zur Bestimmung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper nach Anspruch 56 enthält.

60. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach Anspruch 56 dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit einem der Polypeptide nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 immunisiert, B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert, die die monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybrid-Zellen subkloniert und in vitro oder in vivo kultiviert werden.

61. Oligonukleotid EBI 118.

62. Oligonukleotid EBI 119.

63. Oligonukleotid EBI 386.

64. Oligonukleotid EBI 387.

65. Oligonukleotid EBI 388.

66. Oligonukleotid EBI 677.

67. Oligonukleotid EBI 678.

68. Oligonukleotid EBI 679.

69. Oligonukleotid EBI 680.

70. Oligonukleotid EBI 681.

71. Oligonukleotid EBI 682.

72. Oligonukleotid EBI 306.

73. Oligonukleotid EBI 307.

74. Plasmid pRH 201.

75. Plasmid pRH 202.

76. Plasmid pRH 203.

77. Expressionsvektor pRH 284T.

78. Expressionsvektor pRH 291.

79. Expressionsvektor pRH 292.

80. Expressionsvektor pRH 212.

81. Plasmid pP6/5.

82. Plasmid pP6/6.

83. Plasmid pP11/3.

84. Polypeptid nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48, dadurch gekennzeichnet, daß es als Dimeres, Trimeres, Tetrameres oder Multimeres vorliegt.

85. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte und kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 mit einem inerten Träger, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

86. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte oder kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 33 bis 43 oder 48 mit zum Beispiel Polyethylenglykol, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.