DE3710364A1 - Vascular-antikoagulierende proteine, dna die diese kodieren, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind biologisch aktive Proteine, die für diese kodierenden DNA-Moleküle, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung.

In den meisten Säugetieren existieren Proteine, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen. Diese Proteine können in drei Gruppen eingeteilt werden, wobei die Einteilung auf den unterschiedlichen Wirkmechanismen beruht.

• 1. Proteine, die mit dem Gerinnungsfaktor einen Komplex bilden und dadurch den Gerinnungsfaktor unwirksam machen. Dazu gehören die Proteine:
  • a) Antithrombin-III (Tromb. Res. 5, 439-452 (1974))
  • b) α₁-Protease Inhibitor (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))
  • c) α₂-Makroglobulin (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))
  • d) C₁-Inhibitor (Biochemistry 20, 2738-2743 (1981))
  • e) Protease Nexin (J. Biol. Chem. 258, 10439-10444, (1983)).
• 2. Proteine, die einen Gerinnungsfaktor proteolytisch zerschneiden und dadurch den Gerinnungsfaktor desaktivieren. Als einziges Protein dieser Art ist bisher Protein C beschrieben (J. Biol. Chem. 251, 355-363, (1976)).
• 3. Proteine, die die negativ geladenen Phospholipide abschirmen und/oder hydrolisieren, so daß die Phospholipid-abhängigen Reaktionen des Blutgerinnungsmechanismus gehemmt werden. Bisher sind nur Phospholipasen, die aus verschiedenen Schlangegiftsorten isoliert wurden, beschrieben worden (Eu. J. Biochem. 112, 25-32 (1980)).

Das stufenweise ablaufende Gerinnungssystem ist in den letzten Jahren intensiv untersucht worden. Es wird als ein sich verstärkendes Mehrstufensystem verschiedener miteinander verbundener, proteolytischer Reaktionen verstanden, bei dem ein Enzym ein Zymogen in die aktive Form umsetzt (vgl. Jackson C.M., Nemerson Y., Ann. Rev. Biochem. 49, 765-811, (1980)). Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird in entscheidender Weise durch die Anwesenheit von Phospholipiden und anderer Kofaktoren wie Faktor V_a und Faktor VIII_a vergrößert. In vivo werden die Prokoagulationsreaktionen durch verschiedene Inhibitationsmechanismen geregelt, die einem explosiv thrombotischen Trauma nach einer geringen Aktivierung der Gerinnungskaskade vorbeugen.

Die Antigerinnungsmechanismen könne wie folgt eingeteilt werden (Rosenbert, R.D., Rosenbert, J.S., J. Clin. Invest. 74, 1-6 (1984)):

• 1. Der Serin-Protease-Faktor X_a und Thrombin werden infolge ihrer Bindung an Antithrombin III bzw. an den Antithrombin/Heparin-Komplex inaktiviert. Sowohl die Prothrombin-Aktivierung als auch die Bildung von Fibrin kann auf diese Weise gehemmt werden. Neben Anti-thrombin III gibt es noch verschiedene andere Plasma-Protease-Inhibitoren wie beispielsweise α₂-Makroglobulin und Antitrypsin, deren Wirkung zeitabhängig ist.
• 2. Die Entdeckung des Proteins C führte zur Aufdeckung eines weiteren Antigerinnungsmechanismus. Ist das Protein C einmal aktiviert worden, wirkt es durch die selektive Proteolyse der Proteinkofaktoren Faktor V_a und VIII_a, durch die die Prothrombinase und das Enzym, das den Faktor X umsetzt, inaktiviert werden, als Antikoagulanz. Einwirkung von Thrombin auf Fibrinogen, wodurch der Bildung eines unlöslichen Fibrins vorgebeugt wird (Nossel, H.L., Nature, 291, 165-167 (1981)).

Von den oben genannten, in den Gerinnungsprozeß eingreifenden körpereigenen Proteinen ist z. Zt. nur das Anthribombin III in klinischem Einsatz. Als erheblicher Nachteil hat sich jedoch die bei der Anwendung dieses Proteins auftretende Erhöhung der Blutungsneigung herausgestellt.

Alle bisher als Antikoagulantien eingesetzten Mittel, ob körpereigener oder synthetischer Natur machen in irgendeiner Weise die Gerinnungsfaktoren unwirksam und führen dadurch zu Nebenwirkungen, die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozeß auswirken können.

Überraschenderweise konnten neben diesen Proteinen weitere körpereigene Stoffe isoliert werden, die zwar die gewünschten blutgerinnungshemmenden Eigenschaften unter besonderen Bedingungen zeigen, hierbei aber die Blutungsgefahr nicht erhöhen. Bei größeren Blutungen verlieren diese Proteine ihre blutgerinnungshemmenden Eigenschaften und stören dadurch bei deren Verwendung nicht die in solchen Fällen überlebensnotwendigen Gerinnungsprozesse. Da sie erstmals isoliert wurden aus stark vaskularisiertem Gewebe, wurden sie "vascular anticoagulating proteins", VAC genannt.

Die aus stark vaskularisierten Geweben wie Nabelschnurgefäßen und Placenta isolierten Proteine weisen Molekulargewichte von ca. 70 × 10³, ca. 60 × 10³, ca. 34 × 10³ und ca. 32 × 10³ auf, von denen die Substanzen mit den Molekulargewichten 34 respektive 32 × 10³ aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen. Die genaue biochemische Charakterisierung dieser Proteine, sowie deren Isolierung und Reinigung findet sich in der EP-A-01 81 465 vom 21. Mai 1986.

Proteine mit VAC-Aktivität stellen natürliche Blutgerinnungshemmstoffe dar, die bei der Blutgerinnungskaskade an zwei Stellen eingreifen.

Das erste Mal inhibieren sie bei der durch die Faktoren IXa und VIIIa katalysierten Aktivierung des Faktors X zu Xa, das zweite Mal unterbinden sie die Spaltung von Prothrombin zu Thrombin, die durch die Faktoren Xa und Va vermittelt wird. Beiden Aktivierungsschritten ist gemeinsam, daß sie Kalzium-Ionen und Phospholipide benötigen. Offenbar können VAC-Proteine ebenfalls mit Phospholipiden in Wechselwirkung treten, und durch diese Bindung die Aktivierungsschritte der Gerinnungsfaktoren blockieren.

Ihre Eigenschaften machen die Proteine zu interessanten, pharmakologisch äußerst wertvollen Wirkstoffen. Um sie jedoch in ausreichenden Mengen in hochreiner Form zur Verfügung zu haben ist deren Herstellung auf anderen als proteinreinigendem Weg aus natürlichem Gewebe erforderlich. Hierzu bietet sich die gentechnische Methode an.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, Proteine mit VAC-Aktivität gentechnisch herzustellen.

Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß die Aminosäuresequenz von Teilen der aus stark vaskularisiertem Gewebe isolierten und hochgereinigten Proteine mit VAC-Aktivität (EPA 01 81 465) aufgeklärt wurde, anhand dieser Sequenzen synthetische DNA-Sonden hergestellt wurden und hiermit geeignete cDNA-Bibliotheken durchsucht wurden. Nach Isolierung von mit den Sonden hybridisierender cDNA, deren Sequenzbestimmung sowie entsprechender Manipulation wurden diese cDNA in geeigneten Wirtssystemen beispielsweise in Bakterien, Hefen oder Säugetierzellen zur Expression gebracht.

Eines von den gereinigten Proteinen wurde enzymatisch mit Trypsin gespalten. Die entstandenen Peptide wurden aufgetrennt und ausgewählte Fragmente sequenziert. Die Sequenz des N-Terminus widersetzte sich jedoch einer direkten Analyse, da die erste Aminosäure offensichtlich blockiert ist. Die entstandenen Subfragmente wurden sequenziert. Auf Grund dieser Information kann der Beginn der Information in einer cDNA festgestellt werden, zumal auch das Molekulargewicht des N-terminalen Fragments bekannt ist (FAB-MS).

Die Sequenzinformationen sind nachfolgend aufgeführt.

Zur Herstellung einer geeigneten DNA-Sonde sind prinzipiell drei Wege möglich. Ist ein längerer Abschnitt des Proteins, etwa 30 oder mehr Aminosäuren lang, bekannt, besteht die Möglichkeit, unter Beachtung der bevorzugt verwendeten Codons bei Säugern eine wahrscheinlichste Sequenz für den korrespondierenden mRNA-Abschnitt zu erstellen. Eine solche Sonde ist im schlechtesten Fall etwa 66% homolog zur tatsächlichen Sequenz. Dies ist auch der Grund, weshalb die Sonde relativ lang sein müßte, um unter nicht stringenten Bedingungen hybridisieren zu können.

Die zweite Möglichkeit besteht darin, für einen kurzen Peptidabschnitt, ca. sechs bis sieben Aminosäuren lang, alle erdenklichen Variationen an Oligonukleotiden zu synthetisieren. Werden solch komplexe Mischungen beim Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken verwendet, können relativ viel "falsch" positiv reagierende Klone isoliert werden. Außerdem kann das Hybridisierungs­ signal sehr schwach ausfallen, da das perfekt passende Einzeloligonukleotid nur einen geringen Anteil an der Gesamtmischung ausmacht.

Der dritte Weg umgeht zwar nicht die Variabilität einer Oligonukleotidsonde, sorgt aber durch die Wahl eines speziellen Nukleotidtriphosphats (ITP) dafür, daß an die gesuchte (oder auch "falsche") cDNA alle Moleküle der Sonde binden können. So wurden zu dem Tryptischen Peptid [?] passende 23 Basen lange Oligonukleotide unter Verwendung von Inosintriphosphat synthetisiert.

Wie bereits erwähnt, können VAC-Proteine aus stark vaskularisiertem Gewebe isoliert werden. Gewebe der Wahl sind Nabelschnurgefäße oder Placenta. Daher und da bekannt ist, daß in der Placenta im Gegensatz zu anderen Spezial-Geweben fast alle Gene exprimiert werden, wurden die oben erwähnten DNA-Sonden verwendet, um eine placentale cDNA-Bibliothek die aus placentalen Gewebe in an sich bekannter Weise hergestellt worden war nach cDNA-Molekülen, die für VAC-Proteine kodieren, zu durchsuchen.

Zum Durchsuchen der cDNA-Bibliothek nach für VAC-Protein kodierender cDNA wurden entsprechend der Sequenz des tryptischen Peptides P16/II zwei und des Staph A Peptides P20/I/6 ein Oligonukleotid synthetisiert (Fig. 1). Diese Oligonukleotide stellen jeweils eine Mischung aller Varianten dar, die jede Kodierungsmöglichkeit der entsprechenden mRNA berücksichtigen. EBI-386 weist bei einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden 512 Variationen auf und paßt zu dem Staph-A Peptid P20/I/6. Um die Variation bei dem Oligonukleotid für das tryptische Peptid P16/II niedriger zu halten, wurden zwei Oligonukleotide (20-mere) synthetisiert: EBI-387: 128 Variationen, EBI-388: 64 Variationen.

Weiteres wurden zu dem tryptischen VAC-Peptid P30/I passend zwei Oligonukleotide unter Verwendung von Desoxynosin als Base bei "Wobble" Positionen synthetisiert (Fig. 2): EBI-118 und EBI-119. Diese Substitution wurde von E. Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260/5 (1985), pp.2605-2608, sowie Y. Takahashi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1985) pp. 1931-1935, beschrieben. Inosin basenpaart gut mit Cytosin, stört jedoch kaum die Ausbildung der Doppel-helix, wenn andere Nukleotide als Partner angeboten werden.

Nachdem jedes dieser Oligonukleotide in bekannter Weise radioaktiv markiert worden war, wurden Abzüge von Phagen-Platten hiermit nach bekannten Verfahren hybridisiert.

Aus der Hybridisierung mit EBI-386, -387 und -388 resultierten die Phagen Lamda-P11/3, Lambda-P6/5, Lambda-P6/6. Die Hybridisierung mit EBI-118 und -119 resultierte in den Phagen Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22.

Die aus den Phagen isolierten DNAs wurden mit EcoRI geschnitten und die entsehenden Fragmente isoliert. Die cDNA Inserts der Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 hatten Größen von etwa 1300 bis 1400 bp. Die Sequenzanalyse zeigte, daß alle drei Klone von ein und derselben mRNA abgeleitet waren. Das 5′-Ende der mRNA fehlte jedoch in den cDNAs. Die Inserts der Phagen Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 hatten Längen von ca. 1600, 1100 und 1000 bp. Die Sequenzanalyse ließ eine annähernd vollständige cDNA vermuten.

Die cDNAs der beiden Phagengruppen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 sowie Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 sind von zwei verschiedenen mRNAs abgeleitet, wie die Sequenzanalyse ergab. Die EcoRI-Inserts der drei Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺ Vektor ligiert (Vector Cloning Systems, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Die resultierenden Klone wurden pP6/5, pP6/6 und pP11/3 genannt.

Die EcoRI Inserts der drei Klone Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺ Vektor ligiert. Die resultierenden Klone wurden pRH201, pRH202 und pRH203 genannt.

Um weitere cDNA-Klone zu erhalen, wurde die humane, plazentale Lambda-gt10 Bibliothek nochmals durchsucht, diesmal mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Insert des pP11/3 als Sonde.

Insgesamt wurden 69 positiv reagierende Klone erhalten (Lambda-VAC1 bis Lambda-VAC69).

12 dieser Klone wurden im kleinen Maßstab wie oben beschrieben präpariert, die cDNA Inserts mit EcoRI freigesetzt und isoliert. Dabei zeigte sich, daß das Insert des Klons Lambda-VAC10 den gesamten für VAC- Protein kodierenden Leserahmen enthält. Zur Charakterisierung der für VAC-alfa und VAC-beta kodierenden cDNAs wurden ein Northernblot-Experiment, Sequenzanalysen und eine genomische Southernblot- Analyse durchgeführt.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 abgebildet. Die cDNA des Klons pP11/3 hydridisiert an eine mRNA der Größe von etwa 1700 Basen ("VAC-alpha"), die cDNA des Klons pRH 203 an eine mRNA der Größe von etwa 2200 Basen ("VAC-beta").

Da erstens die eingesetzte Radioaktivitätsmenge sowie die aufgetragene Menge mRNA pro Spur etwa gleich war und zweitens die Hybridisierung eines Genom-Blots in derselben Lösung Banden gleicher Intensität mit beiden cDNAs ergab (siehe unten), ist zu schließen, daß die kürzere mRNA ("VAC-alfa") in größeren Mengen als die längere ("VAC-beta") mRNA und Plazenta vertreten ist.

Zur Sequenzanalyse der VAC-alfa cDNA wurden die cDNA Klone pP6/5, pP6/6 und pP11/3 total, sowie die der Klone Lambda-VAC1 bis -12 partiell sequenziert. Das Resultat ist in Fig. 4 abgebildet. Es wurden insgesamt 1465 Basen sequenziert. Die cDNA weist einen langen, offenen Leserahmen auf, der für 320 Aminosäuren kodieren kann. Wird die DNA Sequenz in eine Aminosäuresequenz übersetzt, so können alle sequenzierten Peptide der tryptischen Fragmente in dieser Sequenz untergebracht werden (Fig. 5). Es handelt sich daher bei dieser cDNA um jene, deren korrespondierende mRNA für VAC-protein kodiert. Da die Sequenzen der zweiten isolierten cDNA für ein ähnliches, aber von VAC verschiedenes Protein kodiert, wird hier der Name VAC-alfa eingeführt.

Dem ersten ATG-Codon (Basen 35-37) geht im selben Leserahmen ein Stop-Codon voran. Die Basen 30 bis 38 erfüllen ziemlich gut die Kozakregel (M. Kozak, Nature 308 (1984), pp. 241-246), die die Konsensussequenz in der Nähe des Translationsstartcodons mit CC(A/G)CCAUGG angibt, die entsprechende Sequenz hier lautet TCGCTATGG. Die 3′ nichttranslatierte Region ist 471 Basen lang. 15 Basen vor Beginn des poly-A Abschnitts befindet sich die Polyadenylierungssequenz AATAAA (N.J. Proudfoot et al., Nature 263, (1976), pp. 211-214). Wird eine Kettenlänge von 150 bis 200 Basen für den Poly-A Abschnitt der mRNA gerechnet, beträgt die Gesamtlänge der mRNA auf Grund der cDNA Sequenz 1600-1650 Basen. Da im Northern Blot Experiment ein höherer Wert bestimmt wurde, ist die 5′nichttranslatierte Region in keiner cDNA komplett enthalten.

Die cDNA des Klons pP6/5 weist im Gegensatz zu allen anderen cDNA Klonen an Position 100 C statt A auf. Dadurch würde sich das Triplett 98-100 (22. Codon) von GAA nach GAC ändern und für Asp anstelle von Glu kodieren. Diese Abweichung kann mehrere Ursachen haben: a) die Reverse Transkriptase baute ein falsches Nukleotid ein, b) es handelt sich um die Transkripte zweier allerler, an dieser Stelle verschiedener Gene oder c) es gibt zwei nicht allele Gene, die sich an dieser Position unterscheiden.

Der lange, offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit 320 Aminosäuren, von dem das Met-1 wahrscheinlich abgespalten, und das folgende Alanin an der Aminogruppe, möglicherweise durch Acylierung, blockiert wird. Das errechnete Molekulargewicht beträgt 35.896 D und ist höher als der Wert nach SDS-PAGE. Allerdings ist der Anteil geladener Aminosäuren (Asp, Glu, Lys, Arg, His) mit 30,6% (98/320) überdurchschnittlich hoch verglichen mit dem durchschnittlichen Wert von 25,1%.

Dies würde das veränderte Wanderungsverhalten des Proteins bei der SDS-PAGE erklären. Innerhalb der stark geladenen Aminosäuren überwiegen die sauren Aminosäuren (Asp und Glu) mit 54 gegenüber den basichen (Lys und Arg) mit 41. Dies erklärt den sauren, isolektrischen Punkt des VAC-alfa Proteins (pI=4,4 bis 4,8) VAC-alfa enthält nur ein für Cystein codierendes Triplett (Aminosäure-Position 361); eine typische N-Glykosilierungsstelle (Asn-XXX-Ser/Thr) ist nicht vorhanden.

Eine Strukturanalyse der Aminosäuresequenz (modifiziert nach Pustell, J et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982) pp 4765-4782) ergibt eine vierfache Wiederholung einer 67 Aminosäure langen Sequenz (Fig. 6), im folgenden "Repeats" genannt. Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 15 Aminosäuren (22,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 28 Positionen (41,8%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure.

Ein Vergleich mit publizierten Literaturdaten (J.J. Gisow, FEBS Letters 203 (1986), pp. 99-103, M.J. Geisow et al., TIBS 11 (1986, pp 420-423) ergab überraschenderweise, daß VAC-alfa damit zu einer größeren Gruppe Ca⁺⁺ abhängiger Phospholipidbindungsproteine gehört. Es wird eine Konsensussequenz beschrieben (Lys-Gly-fob-Gly-Thr- Asp-Glu-var-var-Leu-Ile-fil-Ile-Leu-Ala-fob-Arg; fob=hydrophob, fil=hydrophil, war=variabel), die an der Ca⁺⁺ Bindung beteiligt sein könnte (M.J. Geisow et al., Nature 320 (1986), pp. 636-638). Diese Sequenz findet sich in jeder der vier wiederholten 67 Aminosäure langen Subsequenzen der erfindungsgemäßen Proteine (Fig. 6). Auffällig ist auch der 6 Aminosäuren lange Abschnitt am Ende jeder Repeat, der fast ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren besteht ("oooooo" in Fig. 6).

Die Sequenzanalyse der Klone Nr15, Nr19 und Nr22 ergab für die VAC-beta cDNA 1940 bp, die in einen poly-A Abschnitt übergeht (Fig. 7). 16 Basen vor dem poly-A Abschnitt findet sich das Polyadenylierungssignal AATAAA. Allerdings kommt diese Konsensussequenz bereits an der Nukleotidposition 1704-1709 vor. Weshalb diese Sequenz nicht als Polyadenylierungssignal verwendet wird, ist unbekannt. Die zusätzlich erforderliche Sequenz an der 3′-Seite der AATAAA Sequenz YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 (1984), pp. 473-474) kommt erst relativ weit entfernt vor (TGTGTTAT, Position 1735-1742); möglich, daß dies die Erklärung für ein Nichtakzeptieren dieser ersten Polyadenylierungssequenz darstellt.

Die cDNA enthält einen langen, offenen Leserahmen, der vom Beginn der cDNA bis Position 1087 reicht. Er würde ein Kodierungspotential für 362 Aminosäuren beinhalten. Aus Analogiegründen zu VAC-alfa und aufgrund der Tatsache, daß auch ein 34.000 D Protein bie der Reinigung von VAC anfällt (siehe E.P.A. 1 81 465) wurde das erste Nethioninkodon (ATG, Position 107-109) als Translationsstart angenommen. Die Kozakregel ist hier nicht so gut erfüllt wie bei VAC-alfa (AAGAGATGG auf Position 102-110).

Das resultierende Protein (VAC-beta) ist 327 Aminosäuren lang. Es besitzt Cysteinreste (Aminosäureposition 161, 206, 250 und 293) und eine potentielle N-Glykosylierungsstelle (Asn-Lys-Ser, Aminosäureposition 225-227). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 36.837 (Fig. 9). Auch in VAC-beta gibt es überdurchschnittlich viele geladene Reste: 97/327 (29,6%), wobei die sauren Aminosäuren (Asp+Glu: 49) über die basischen (Lys+Arg 42) überwiegen; eine Erklärung für das nach SDS-PAGE ermittelte niedrigere Molekulargewicht.

Auch VAC-beta zeigt eine interne Wiederholung einer 67 Aminosäuren langen Sequenz (Fig. 8). Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 17 Aminosäuren (25,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 25 Positionen (37,7%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure. Auch VAC-beta zeigt gute Übereinstimmung mit der 17 Aminosäuren langen Konsensussequenz. Die Ausführungen zum VAC-alfa gelten analog vür VAC-beta.

Die Analyse chromosomaler DNA aus humaner Plazenta nach Southern zeigt ein komplexes Bild. Die DNA wurde mit EcoRI, HindIII, BamHI und PstI geschnitten. Die auf Nitrozellulose transferierte DNA wurde sowohl mit einer VAC-alfa DNA (pP11/3) als auch mit einer VAC-beta DNA (pRH203) hybridisiert. Obwohl das Waschen der Filter unter stringenten Bedingungen erfolgte, ergaben sich bei jedem Verdau relativ viele Banden (Fig. 10). Der Vergleich der beiden Blots zeigt, daß die Kreuzreaktion von VAC-alfa und -beta DNA unter diesen Bedingungen eher auszuschließen ist. Die Vielzahl der Banden ist entweder durch die Existenz jeweil ähnlicher Gene zu dem VAC-alfa bzw. VAC-beta Gen zu erklären, oder aber es handelt sich um jeweils ein Gen, das durch viele und/oder lange Introns unterbrochen ist.

In Fig. 11 ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen von VAC-alfa mit VAC-beta wiedergegeben. Die wiederholten Strukturen lassen sich in beiden Proteinen gleich anordnen. Die Verbindungspeptide sind ebenfalls gleich lang mit Ausnahme jener zwischen der 2. und 3. Repeat. In dieses Verbindungspeptid muß bei VAC-alfa eine Lücke eingeführt werden, um eine optimale Anpassung der beiden Sequenzen zu erlauben. Das N-terminale Peptid der beiden Proteine ist unterschiedlich lang, 19 Aminosäuren bei VAC-alfa, 25 Aminosäuren bei VAC-beta. Dieses Peptid weist auch die geringste Homologie auf. Die beiden Proteine sind an 176 von 320 Aminosäurepositionen ident, was einem Homologiegrad von 55,0% entspricht.

An dieser Stelle sei auch der Vergleich der Nukleotidsequenzen der VAC-alfa und -beta cDNAs eingefügt. Werden zwei Gene und deren Produkte miteinander verglichen, sieht man auf der DNA (=RNA) Ebene eine größere Homologie als auf der Aminosäureebene, was durch die Tatsache erklärt ist, daß bei der Nukleinsäure bereits eine Veränderung in einem Basentriplett ausreicht, um eine neue Aminosäure zu kodieren.

In Fig. 12 ist der Vergleich der kodierenden Regionen von VAC-alfa und VAC-beta cDNA wiedergegeben. Überraschenderweise zeigen die DNAs nur einen Homologiegrad von 54,2%, also etwas weniger als die beiden Proteine.

In Fig. 13 sind die Hydrophilizitätsprofile der beiden Proteine abgebildet. Dabei wurde der Algorithmus von Hopp und Wood verwendet (T.P. Hopp et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 78 (1981) pp. 3824-3828). Die vier Repeatbereiche sind durch die Balken angedeutet, die Verbindungspeptide in der darunter angegebenen Sequenz eingerahmt. Überraschenderweise ist das Verbindungspeptid zwischen der zweiten und dritten Repeat besonders hydrophil. In diesem Peptid befindet sich sowohl bei VAC-alfa als auch bei VAC-beta ein Arginin an identer Position. Es wäre daher möglich, daß dieses Arginin einen bevorzugten Angriffspunkt für eine Protease mit trypsinartiger Spezifität darstellt. Dabei müßte das Molekül in zwei etwa gleich große Hälften zerfallen. Es wäre denkbar, daß bereits ein solches "Halbmolekül" eine biologische, beispielsweise eine antikoagulierende Wirkung entfalten kann. Neben dem gezielten Verdau des Proteins beispielsweise mit einer Protease trypsinariger Spezifität lassen sich diese Halbmoleküle oder Halbmoleküle mit geringen Modifikationen auf vielfältige Weise darstellen. So ist es möglich, die für diese Halbmoleküle kodierenden DNA-Moleküle, die nach an sich bekannten Verfahren herstellbar sind in geeignete Expressionsvektoren so einzufügen, daß diese DNA von den Expressionskontrollsequenzen reguliert wird und durch Kultivierung eines mit diesen Vektoren transformierten Wirtsorganismus die Halbmoleküle zu exprimieren, zu isolieren und zu reinigen.

Halbmoleküle mit geringen Modifikationen erhält man beispielsweise durch Einfügen von Spaltstellen, die dem vollständigen Protein die für bestimmte Proteasen erforderliche Spezifität verleihen. So läßt sich beispielsweise ein Protein mit einer Spaltstelle mit Faktor Xa-artiger Spezifikation herstellen, indem in dem Abschnitt, der für die Linker-Sequenz zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur kodiert, ein Oligonukleotid eingefügt wird, das für das Erkennungs-Tetrapeptid der Faktor-Xa-Protease kodiert. Hierdurch erhält man zunächst ein vollständiges Protein, das möglicherweise veränderte Eigenschaften, beispielsweise veränderte Stabilität gegenüber proteolytischem Angriff aufweist, andererseits aber eine hochspezifische Spaltstelle für die Faktor Xa-Protease enthält, wodurch gezielt zwei Halbmoleküle hergestellt werden und zum therapeutischem Einsatz gelangen können.

Durch gezielte Mutation der für Proteine mit VAC-Aktivität kodierenden DNA lassen sich außerdem Proteine herstellen, die einem proteolytischen Angriff besser widerstehen. So führt möglicherweise der Austausch des VAC-alfa und VAC-beta gemeinsamen Arginins zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur durch z. B. Histidin zu besserer Stabilität der Proteine. Auch der gezielte Ersatz der übrigen Arginine und der Lysine durch Histidin, möglich durch Ersatz der entsprechenden Codone führt zu Proteinen, die erschwert durch Trypsin hydrolisiert werden können. Diese gezielten Mutationen lassen die biologischen, beispielsweise antikoagulierenden Eigenschaften der Proteine/Polypeptide im wesentlichen unbeeinflußt, führen andererseits jedoch zur Veränderung, beispielsweise zur Verbesserung der Stabilität der Proteine, d. h. zu einer Veränderung der Halbwertszeit der Proteine.

In manchen Fällen ist es, beispielsweise für die Expression von Proteinen vorteilhaft, dem reifen, gewünschten Proteine/Polypeptid eine Signalsequenz oder auch eine dem Wirtsorganismus eigene Proteinsequenz vorzuschalten, so daß als Expressionsprodukt ein Fusionsprotein entsteht die für ein Signalpeptid kodierende Signalsequenz kann microbieller Herkunft sein oder aus Säugetierzellen stammen; vorzugsweise ist das Signalpeptid homolog zu dem Wirtsorganismus. Um diese Produkte in das gewünschte reife Protein überführen zu können, bedarf es einer spezifischen Spaltstelle zwischen dem Signal-/Fusionsanteil und dem reifen Protein. Hierzu kann man beispielsweise, wie oben beschrieben, an dieser Stelle ein Oligonukleotid einfügen, das für das Erkennungs- Tetrapeptid der Faktor-Xa-Protease kodiert. Hierdurch läßt sich das exprimierte Fusionsprotein gezielt mit der Faktor-Xa-Protease spalten. Man erhält das reife Protein.

Ersetzt man gezielt die für Methionin verantwortlichen Codone, außer dem an Aminosäureposition 1, durch Codone, die für Leucin, Isoleucin oder Valin kodieren, so läßt sich ein eventuell erhaltenes unreifes- oder Fusionsprotein durch BrCN-Spaltung in das reife Protein überführen.

Sollte sich erweisen, daß derart modifizierte Proteine gleiche oder gegebenenfalls verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen, so wäre dies ein möglicher Weg zur Ausbeutesteigerung und gegebenenfalls ein Verfahren zur Herstellugn von Proteinen mit besseren Eigenschaften als die natürlichen VAC-Proteine.

Als weitere gezielte Mutationen ist der gezielte Austausch von einem, gegebenenfalls mehreren Cysteinen durch Serin oder Valin zu nennen, indem die entsprechenden Codone ausgetauscht werden. Beeinflußt dieser Austausch die biologische Aktivität nicht nachteilig, so könnte dieser Weg eine Verbesserung der Isolierung und/oder Ausbeute der Proteine bewirken. Nicht auszuschließen ist auch hierbei eine Verbesserung der Eigenschaften der Proteine.

Aus Fig. 13 ist weiterhin leicht zu erkennen, daß weder VAC-alfa noch VAC-beta einen längeren, hydrophoben Bereich aufweisen, der entweder die Sekretion durch, oder das Einlagern der Proteine in eine Membran erlauben würden. Es ist daher anzunehmen, daß es sich bei VAC-alfa und VAC-beta um intrazelluläre Proteine handelt. Wallner et al (Nature 320 (1986), pp. 77-81) berichten die Struktur des humanen Lipocortin I, Saris et al. (Cell 46 (1986), pp. 201-212) und Huang et al (Cell 46 (1986), pp. 191-199) die Struktur des murinen bzw. humanen Calpactin I, das auch Lipocortin II genannt wird. Diese Proteine gehören ebenfalls zu der Klasse der Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteinen. Ihre Struktur läßt sich analog zu VAC-alfa und -beta anschreiben (Fig. 14). Die Strukturunterschiede beschränken sich im wesentlichen auf die N-terminalen Nicht-Repeatbereiche, die 46 Aminosäuren bei Lipocortin I und 37 Aminosäuren bei Lipocortin II besitzen. Die Homologien zwischen VAC-alfa und VAC-beta sind jedoch ausgeprägter als jene zwischen VAC und Lipocortin:

VAC-alfa-VAC-beta55,0% VAC-alfa-Lipocortin I41,9% VAC-alfa-Lipocortin II43,8% VAC-beta-Lipocortin I41,7% VAC-beta-Lipocortin II44,6%

Anzunehmen ist daher, daß auch die Lipocortine aufgrund ihrer analogen Struktur antikoagulierende Wirkung haben, und demzufolge als Antikoagulanzien einzusetzen sind und weiterhin, daß dies eine generelle Eigenschaft dieser Klasse von Ca⁺⁺ abhängiger Phospholipid­ bindungsproteine ist. Weiterhin ist aufgrund der analogen Strukturen anzunehmen, daß die erfindungsgemäßen Proteine neben der antikoagulierenden Wirkung auch die bereits bekannten Eigenschaften der Klasse von Ca⁺⁺ abhängiger Phospholipidbindungs- proteine aufweisen. Beispielhaft genannt seien hier die antiinflammatorischen Eigenschaften der Lipocortine. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine als antiinflammatorische Mittel sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine bei der Behandlung sämtlicher für die Lipocortine geltenden Indikationen wie beispielsweise rheumatische Erkrankungen. Auch für diesen Einsatzzweck lassen sich die, den natürlichen Proteinen entsprechenden erfindungsgemäßen Produkte in der bereits erwähnten Weise abändern und deren Eigenschaften gegebenenfalls verbessern. Bei dem Vergleich der Proteine VAC-alfa, VAC-beta, Lipocortin I und Lipocortin II stellt man fest, daß der auffälligste Unterschied zwischen den Proteinen bei den N-terminalen Peptiden vorliegt, insbesondere zwischen den VAC-Proteinen auf der einen und den Lipocortinen auf der anderen Seite. Eine erfindungsgemäße Modifikation sieht daher den gegenseitigen Austausch dieser N-terminalen Peptide vor. Herstellen lassen sich diese modifizierten Proteine dadurch, daß die für diese N-terminalen Peptiden kodierenden DNA-Moleküle, beispielsweise durch Oligonukleotidsynthese in an sich bekannter Weise hergestellt werden und mit der "Rest-DNA", die für die verbleibenden Repeats und die Linker-Abschnitte kodiert, ligiert wird. Mit dieser DNA versehene Expressionsvektoren können in bekannter Weise in geeigneten Wirtsorganismen zur Expression gebracht werden; das exprimierte Protein wird isoliert und gereinigt.

Viele Mitglieder der Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteine binden an gereinigte sekretorische Vesikel oder andere Bestandteile des Cytoskeletts (siehe R.H. Krestinger et al., Nature 320 (1986), p. 573 für eine Zusammenfassung). Bei der Sekretion kapseln sich die Vesikel vom Golgi-Apparat der Zelle ab, wandern zur Zellmembran und fusionieren mit ihr. Dabei wird der Inhalt der Vesikel von der Zelle freigesetzt. In Analogie zur Kupplung von Erregung mit der Muskelkontraktion wurde vorgeschlagen (W.W. Douglas, Br.J. Pharmac. 34 (1968), 451), daß auch der Stimulus und die Sekretion über Ca⁺⁺ gekoppelt ist. Dabei könnten die Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteine eine wichtige Rolle spielen. In der konservierten, 17 Aminosäuren langen Region jeder Repeat besitzt VAC-alfa 5 bis 6 Hydroxylgruppen-enthaltende Aminosäuren (Asp, Glu, Thr, Ser), jeweils drei davon an identischer Position. Bei VAC-beta finden sich in jeder Repeat vier dieser Aminosäuren. Obwohl keines der Proteine die in Calmodulin, Troponin C, S-100 und Parvalbumin beobachtete EF-Hand Struktur aufweist (R.H. Kretsinger et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 8 (1980), p119), die in diesen Molekülen für die Ca⁺⁺ Bindung verantwortlich ist, verleitet die Konservierung dieses Unterabschnitts in jeder Repeat zu dem Schluß, daß diese Region für die Ca⁺⁺ Bindung verantwortlich ist. Durch gezielte Mutationen in diesem Bereich könnte versucht werden, die biologische Aktivität der Proteine zu verändern. Erfindungsgemäßen Mutationen sehen beispielsweise den vollständigen oder teilweisen Ersatz der für die 17 Aminosäuren der konservierten Region kodierenden Bereiche vor:

• a. aus den VAC-Proteinen durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren der Lipocortine kodieren,
• b. aus VAC-alfa durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren des VAC-beta kodieren und umgekehrt,
• c. aus Lipocortin I durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren des Lipocortins II kodieren und umgekehrt,
• d. aus den Lipocortinen durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren der VAC-Proteine kodieren oder
• e. bei den übrigen Polypeptiden/Proteinen durch Bereiche die die entsprechenden Aminosäuren der jeweils anderen Polypeptiden/Proteine kodieren, indem die entsprechenden für diese Aminosäuren kodierenden Bereiche ausgetauscht werden.

Die oben erwähnte analoge Struktur läßt außerdem erwarten, daß Proteine, die diese Analogien aufweisen, sowohl antiinflammatorische als auch antikoagulierende Wirkung zeigen und daher entsprechend therapeutisch und/oder prophylaktisch einsetzbar sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch DNA-Moleküle, die für ein Polypeptid/Protein mit Repeat-Bereichen kodieren, DNA-Moleküle, die für einen der Repeat-Bereiche kodieren, DNA-Moleküle, dadurch gekennzeichnet, daß die für die vollständigen Repeats kodierenden Bereiche umgeordnet sind, die von diesen kodierten Proteine, deren Herstellung und Verwendung.

Alle durch diese oder ähnliche Mutationen erhältlichen Proteine, die für diese kodierenden DNAs, deren Herstellung und Verwendung sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung, wobei die bekannten zum Teil in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Proteine, die für diese kodierenden DNAs, deren bekannte Herstellung und Verwendung ausdrücklich ausgenommen sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch DNA-Moleküle nicht-humanen Ursprungs, die von diesen kodierten Proteine, deren Herstellung und Verwendung, die in einer, der vorliegenden Erfindung analogen Weise herstellbar sind.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die erfindungsgemäßen Proteine codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig durch Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Proteine codiert (d. h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der erfindungsgemäßen Proteine codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (beispielsweise Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren) beinhaltet.

Die Hybridisierungen werden in 6 × SSC/5× Denhardt′s Lösung/0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt auf DNA-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2x SSC/0,01% SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1x SSC/0,1% SDS 65°C geeignet.

Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die eine für VAC kodierende DNA-Sequenz enthalten, die von einer Expressionskontrollsequenz derart reguliert wird, daß in einer mit diesem Expressionsvektoren transformierten Wirtszelle Polypeptide mit VAC-Aktivität exprimiert werden.

Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden z. B. hergestellt, indem man in eine Vektor-DNA, welche eine Expressionskontrollsequenz enthält, eine VAC kodierende DNA-Sequenz derart einfügt, daß die Expressionskontroll- sequenz besagte DNA-Sequenz reguliert.

Die Wahl eines geeigneten Vektors ergibt sich aus der zur Transformation vorgesehenen Wirtszelle. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere Bakterienstämme, die über kein Restriktions- oder Modifikationsenzym verfügen, vor allem Stämme von Escherichia coli, z. B. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221(30) oder E. coli K12 Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, ferner Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte humane oder tierische Zellinien. Bevorzugte Wirtszellen sind die gesamten Stämme von E. coli, insbesondere E. coli HB101, E. coli JM101 und E. coli W3110.

Grundsätzlich sind alle Vektoren geeignet, welche die erfindungsgemäßen heterologen, für die VAC kodierenden DNA-Sequenzen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren.

Beispiele für Vektoren, die zur Expression des VAC-Gens in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bacteriophagen, z. B. Derivate des Bacteriophagen γ, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid colE1 und seine Derivate, z. B. pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung leiten sich von Plasmid pBR322 ab. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replicon und ein Markierungsgen, welches die Selektion und Identifizierung der mit den Expressionsplasmiden transformierten Mikroorganismen auf Grund eines phänotypischen Merkmals ermöglicht. Geeignete Markierungen verleihen dem Mikroorganismus beispielsweise Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen. Weiterhin enthalten bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung außerhalb der Replicon- und Markierungsgen- Regionen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so daß diesen Stellen die für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz und gegebenenfalls die Expressions-Kontrollsequenz eingefügt werden können. Ein bevorzugter Vektor, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktes Replicon, gegen Tetracyclin und Ampicillin Resistenz verleihende Markierungsgene (tet^R und amp^R) und eine Reihe von nur einmal vorkommenden Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, z. B. PstI (schneidet im amp^R-Gen, das tet^R-Gen bleibt intakt), BamHI, HindXIII, SalI (schneiden alle im tet^R-Gen, das amp^R-Gen bleibt intakt), NruI und EcoRI.

Mehrere Expressionskontrollsequenzen können zur Regulation der VAC-Expression eingesetzt werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen stark exprimierter Gene der zu transformierenden Wirtszelle verwendet. Im Falle von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsorganismus sind beispielsweise die Expressionskontrollsequenzen (welche unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalen) des Lactoseoperons, Tryptophanoperons, Arabinoseoperons und dergleichen, des β-Lactamasegens, die entsprechenden Sequenzen des Phage γN-Gens oder des Phage fd-Schichtproteingens und andere geeignet. Während der Promotor des β-Lactamasegens (b-lac-Gen) bereits in Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die übrigen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden. Bevorzugt als Expressionskontrollsequenz in der vorliegenden Erfindung ist diejenige des Tryptophanoperons (trp po) sowohl von Scaratia marcescens als auch aus E. coli und der alkalische Phosphatase-Promotor bzw. deren Hybrid.

Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die erfindungsgemäßen Proteine kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftwart-Promotors des Bakteriophagen Lambda (P_L) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist ein besonders effektiver steuerbarer Promotor. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressor, von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches Allel dieses Repressor-Gens kann in einen Vektor, der eine Protein-Sequenz enthält, eingefügt werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor aktiviert. Durch die Verwendung dieses Systems ist es möglich, eine Clon-Bank zu etablieren, in der eine funktionelle Protein-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom- Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-P_L-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden.

Die Expression und Translation einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Proteine kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. So enthält z. B. chromosomale DNA von einem Lactose-abhängigen E. coli eine Lactose oder Lac-Operon, das durch Ausschüttung des Enzyms Beta-Galactosidase den Lactose-Abbau ermöglicht.

Die Lac-Kontrollelemente können aus dem Bacteriophagen Lambda-plac5, der infektiös für E. coli ist, erhalten werden. Das Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus derselben Bakterien-Spezies stammen. Regulationssysteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden können, können auch aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.

Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile hiervon können genausogut verwendet werden: beispielsweise Colicine E₁-Operator, Galactose-Operator, Xylose-A-Operator, tac- Promotor u. ä.

Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikro­ organismen, wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete von den eukaryp- tischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist.

Zur Replikation und Expression in Hefe geeignete Vektoren enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikationsstart enthalten, z. B. das chromosomale autonom replizierende Segment (ars), bleiben nach der Transformation innerhalb der Hefezelle exta-chromosomal erhalten und werden bei der Mitose autonom repliziert. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) und das Plasmid YEp13 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)) verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRP1-Gen, das eine Selektionierungsmarkierung für eine Hefemutante, die unfähig ist, in tryphthophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr. 44076.

Das Vorhandensein des TRP1 Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, wenn ohne Tryptophan kultiviert wird. Ganz ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YE13, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält.

Weitere geeignete Markierungsgene für Hefe sind im Fall von auxotrophen Hefemutanten, im allgemeinen Gene, die Wirtsdefekte komplementieren. Entsprechende Gene sorgen für Prototrophie in einer auxotophen Hefemutante, z. B. das URA3- und HIS3- Gen. Vorzugsweise enthalten Hefe-Hybridvektoren weiterhin einen Replikationsstart und ein Markierungsgen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, damit die Konstruktion und die Klonierung der Hybridvektoren und ihrer Vorstufen in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann. Weitere für die Expression in Hefe geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise diejenigen des PHO3- oder PHO5-Gens, ferner in glykolytischen Aufbau involvierte Promotor, z. B. der PGK- und GAPDH-Promotor.

Andere geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe Vektoren beinhalten die 5′-flankierende Region der Gene des ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-Phosphoglycerate-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Kawaski und Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressions­ plasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′Ende der zu experimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA zu ermöglichen.

Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFα1, STE2, STE3, STE5 können bei temperatur­ regulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating-Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Matin-Typ abhängigen Promotoren.

Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

So können auch Hybridvektoren, die der Hefe-2µ-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination innerhalb der Zelle bereits vorhandenen 2µ-Plasmiden einverleibt oder replizieren autonom. 2µ-Sequenzen sind besonders für Plasmide mit großer Transformationshäufigkeit geeignet und gestatten eine hohe Kopienzahl

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirtsorganismen. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltier­ zellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973)). Beispiele solch nützlicher Wirtszellen sind VERO- und HeLa-Zellen, CHO-Zellen und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit allen notwendigen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Splicin-Stelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung in Säuretierzellen stammen die Kontroll­ funktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Polyoma Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die frühen und späten Endpromotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch noch die virale Replikationsstelle des SV 40 enthält. (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Auch können kleinere oder größere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz, die von der HindIII Schnittstelle bis zur BglI Schnittstelle in dem viralen Replikationsstartpunkt reicht. Außerdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen.

Ein Replikationsstartpunkt kann entweder durch entsprechende Vektorkonstruktion vorgesehen werden, um einen exogenen Startpunkt einzubauen, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno. VSV, PBV, etc.) oder kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das Wirtszellen- chromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus).

Insbesondere betrifft die Erfindung zur Replikation und phänotypischen Selektionen befähigte Expressionsvektoren, welche eine Expressionskontrollsequenz und eine für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthalten, wobei besagte DNA-Sequenz mitsamt Transkriptionsstartsignal und -terminationssignal sowie Translationsstartsignal und -stopsignal in besagtem Expressionsplasmid unter Regulation besagter Expressionskontrollsequenz so angeordnet ist, daß in einer mit besagtem Expressionsplasmid transformierten Wirtszelle VAC exprimiert wird.

Um eine effektive Expression zu erreichen, muß das VAC-Gen richtig (in "Phase") mit der Expressionskontrollsequenz angeordnet sein. Es ist vorteilhaft, die Expressionskontrollsequenz in den Bereich zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ATG der Genkodiersequenz, welche natürlich mit dem Expressionskontrollsequenz verknüpft ist (z. B. die β-lac-Kodiersequenz bei Verwendung des β-lac-Promotors), mit dem VAC-Gen, welches vorzugsweise sein eigenes Translationsstartsignal (ATG) und Translationsstopsignal (z. B. TAG) mitbringt, zu veknüpfen. Dadurch wird eine effektive Transkription und Translation gewährleistet.

Beispielsweise wird ein Vektor, mit insbesondere pBR322, mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und, gegebenenfalls nach Modifikation des so gebildeten linearisierten Vektors, eine mit entsprechenden Restriktionsenden versehenen Expressionskontrollsequenz eingeführt. Die Expressionskontrollsequenz enthält am 3′-Ende (in Translationsrichtung) die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuclease, so daß der die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltende Vektor mit besagtem Restriktionsenzym verdaut und das mit passenden Enden versehene VAC-Gen eingesetzt werden kann. Dabei entsteht ein Gemisch von zwei Hybridplasmiden, welche das Gen in richtiger bzw. in falscher Orientierung enthalten. Vorteilhaft ist es, den die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltenden Vektor noch mit einer zweiten Restriktionsendonuclease innerhalb der Vektor-DNA zu spalten und in das entstandene Vektor-Fragment das mit richtigen Enden versehene VAC-Gen einzusetzen. Alle Operationen am Vektor erfolgen vorzugsweise in einer Weise, daß die Funktion des Replicons und zumindest eines Markierungsgens nicht beeinträchtigt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein von pBR322 abgeleiteter Vektor, welcher eine Expressionskontrollsequenz, insbesondere diejenige vom Tryptophan-Operon (trp po), enthält, die am 3′-Ende (zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ersten ATG) die Erkennungssequenz für eine, vorzugsweise kohäsive Enden bildende, Restriktionsendonuclease, z. B. EcoRI, trägt, mit der genannten Restriktionsendonuclease und im Vektor-DNA-Teil mit einer zweiten Restriktionsendonuclease, welche flache oder bevorzugt kohäsive Enden bildet, z. B. BamHI, verdaut, wonach der so linearisierte Vektor mit der entsprechenden Enden aufweisenden VAC-DNA (z. B. mit einem EcoRI-Ende vor dem ATG-Start und einem BamHI-Ende nach dem Translationsstop-Codon) verknüpft wird. Die Verknüpfung erfolgt in bekannter Weise durch Paarung der komplementären (kohäsiven) Enden und Ligierung, z. B. mit T₄-DNA-Ligase.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in dem Expressionsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) und EP-A-01 15 613 - hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983), in dem Plasmid parpER 33 (EP-A-01 15 613) oder dem Plasmid pRH100 exprimiert werden, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen. Erfindungsgemäß wird als Expressionsvektor für das synthetische Protein Gen das Plasmid pRH100 verwendet, das den regulierbaren Tryptophanpromotor aus Serratia marcescens und eine artifizielle Ribosomenbindungsstelle enthält. Zur Herstellung des Expressionsplasmides pRH100 wurde das Plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-01 15 613) mit der Restriktionsendonuklease HindIII linearisiert und die 5′terminalen Phosphatreste wurden entfernt.

Die über den mRNA-Weg, aus genomischer DNA oder synthetisch gewonnene, mit entsprechenden (insbesondere EcoRI- und BamHI-) Enden versehene VAC-DNA kann vor dem Einbringen in ein Expressionsplasmid auch in einen Vektor, z. B. pBR322, kloniert werden, um größere Mengen an VAC-DNA, beispielsweise für die Sequenzanalyse, zu gewinnen. Die Isolierung der Klone, welche das Hybridplasmid enthalten, wird beispielsweise mit einer VAC-DNA spezifischen, radioaktiv-markierten Oligonucleotid-Probe (siehe oben) durchgeführt. Die Charakterisierung der VAC-DNA erfolgt beispielsweise nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (11).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Teilstücke der VAC-DNA synthetisiert. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthält, transformiert.

Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise die oben genannten Mikroorganismen, wie Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis und insbesondere Escherichia coli. Die Transformation mit dem erfindungsgemäßen Expressionsplasmiden erfolgt beispielsweise wie in der Literatur beschrieben, so für S. cerevisiae (12), B. subtilis (13) und E. coli (14). Die Isolierung der transformierten Wirtszellen erfolgt vorteilhaft aus einem selektiven Nährmedium, dem das Ciocid zugesetzt wird, gegen welches das im Expressionsplasmid enthaltende Markierungs-Gen Resistenz verleiht. Wenn, wie bevorzugt, die Expressionsplasmide das amp^R-Gen enthalten, wird dem Nährmedium demgemäß Ampicillin zugesetzt. Zellen, welche das Expressionsplasmid nicht enthalten, werden in einem solchen Medium abgetötet.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die auf dem genannten Weg erhältlichen transformierten Wirtszellen.

Die transformierten Wirtszellen können zur Herstellung von Verbindungen mit VAC-Aktivität verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Wirtszellen kultiviert und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird.

Die Erfindung betrifft daher vor allem ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit VAC-Aktivität und von Salzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von VAC kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierte Wirtszellen in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert werden und das Produkt aus dem Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird, und, falls erforderlich, ein verfahrensgemäß erhältliches Produkt mit einem zur Aufspaltung der Disulfidbindungen geeigneten Reduktionsmittel versetzt und das erhältliche reduzierte Polypeptid gegebenenfalls mit einem zur Neuknüpfung von Disulfidbindungen geeigneten Oxidationsmittel behandelt wird, und gewünschtenfalls, eine erhältliche VAC-Verbindung in eine andere VAC-Verbindung überführt wird, ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen mit VAC-Aktivität in die einzelnen Komponenten aufgetrennt wird und/oder, gewünschtenfalls ein erhaltenes Salz in das Polypeptid und ein erhaltenes Polypeptid in das entspechende Salz dsselben überführt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von VAC-Verbindungen der Formel.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen transformierten Wirtszellen erfolgt in an sich bekannter Weise. So können für die Kultivierung der erfindungsgemäßen, transformierten Wirtsorganismen verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder allein oder in geeigneten Gemischen verwendet werden kann. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte; weiterhin Hefeextrakte, Malzextrakt, wie auch Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die ebenfalls verwendet werden können, sind z. B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

Weiterhin enthält das Medium z. B. wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, z. B. Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen, die das Expressionsplasmid verloren haben, verhindern. So wird dem Medium beispielsweise Ampicillin zugesetzt, wenn das Expressionsplasmid ein amp^R-Gen enthält. Ein solcher Zusatz von antibiotisch wirksamen Substanzen bewirkt auch, daß kontaminierende, Antibiotika-empfindliche Mikroorganismen abgetötet werden.

Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß maximele VAC-Titer erhalten werden. So wird ein E. coli- oder ein Hefe-Stamm bevorzugt unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise etwa 30°C, und einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise etwa 30°C, und einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise bei pH 7, während etwa 4 bis 20h. vorzugsweise 8 bis 12h, kultiviert. Dabei sammelt sich das Expressionsprodukt intrazellulär an.

Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultivierung abgebrochen und das Produkt, falls erforderlich, aus den Zellen des Mikroorganismus freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, z. B. durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder mit Lysozym oder einem gleichartig wirkenden Enzym lysiert. Alternativ oder zusätzlich kann man mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z. B. X-Presse, French-Presse, Dyno-Mill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndes Einfrieren, z. B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, z. B. auf 30° bis 40°C, sowie Ultraschall zum Brechen der Zellen anwenden. Die resultierende Mischung, die Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, wird nach der Zentrifugation in an sich bekannter Weise an Proteinen angereichert. So wird z. B. der größte Teil der Nicht-Protein-Bestandteile durch Polyäthylenimin-Behandlung abgetrennt und die Proteine einschließlich der VAC-Verbindungen z. B. durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen ausgefällt. Weitere Reinigungsschritte umfassen beispielsweise chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie. HPLC, Reverse-Phase-HPLC und dergleichen. So erfolgt die Auftrennung der Mischbestandteile durch Dialyse, nach Ladung mittels Gel- oder trägerfreier Elektrophorese, nach Molekülgröße mittels einer geeigneten Sephadex-Säule, durch Affinitätschromatographie, z. B. mit Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin gekuppelt an einen geeigneten Träger zur Affinitätschromatographie, oder durch weitere, insbesondere aus der Literatur bekannte Verfahren.

Beispielsweise umfaßt die Isolierung der exprimierten VAC-Verbindungen die folgenden Stufen. Abtrennung der Zellen aus der Kulturlösung mittels Zentrifugation; Herstellung eines Rohextraktes durch Zerstören der Zellen, z. B. durch Behandlung mit einem lysierenden Enzym und/oder abwechselndem Einfrieren und Wiederauftauen; Abzentrifugieren der unlöslichen Bestandteile; Ausfällen der DNA durch Zugabe von Polyäthylenimin; Fällung der Proteine durch Ammoniumsulfat; Affinitätschromatographie des gelösten Niederschlags an einer monoklonalen Anti-VAC-Antikörper-Säule; Entsalzung der so gewonnen Lösung mittels Dialyse oder Chromatographie an Sephadex G25 oder Sephadex G10.

Weitere Reinigungsschritte schließen Gelfiltrationen an Sephadex G50 (oder G75) und Reverse-Phase-HPLC ein. Entsalzung wieder an Sephadex G25.

Zum Nachweis der VAC-Aktivität kann der Test mit Anti-VAC-Antikörpern (z. B. aus Kaninchen/Maus erhältliche, oder aus Hybridomazellen erhältliche monoklonale Antikörper) oder können die in der EPA 01 81 465 beschriebenen Tests herangezogen werden.

Verfahrensgemäß erhältliche VAC-Proteine können in an sich bekannter Weise in andere VAC-Proteine (Peptide) überführt werden.

Untersuchungen haben gezeigt, daß die Disulfidbrücken für die gerinnungshemmende Aktivität von natürlichem VAC ohne Bedeutung ist. Je nach Wahl der Wirtszelle kann nicht ausgeschlossen werden, daß eine Verknüpfung der Cystein-Reste im primären Translationsprodukt unter Bildung von Disulfidbrücken in einer Weise erfolgt, die sich vom natürlich ablaufenden Vorgang unterscheidet. Es ist möglich, daß die sich einstellende "falsche" Tertiärstruktur des Produktes eine Verminderung oder sogar den Verlust, evtl. aber auch eine Verbesserung, der wertvollen pharmakologischen Eigenschaften, insbesondere der gerinnungshemmenden Aktivität, zur Folge hat, was sich mit Hilfe der oben genannten VAC-Assays feststellen läßt. In einem solchen Fall ist es gegebenenfalls zweckmäßig, die Disulfidbindungen mit einem geeigneten Reduktionsmittel zu spalten und das reduzierte Polypeptid zur Neuknüpfung der Disulfidbindungen mit einem geeigneten Oxidationsmittel zu behandeln. Anhand der VAC-Aktivität des gebildeten Produktes läßt sich feststellen, ob die gewählten Bedingungen (Reduktions- und/oder Oxidationsmittel) zur gewünschten Steigerung der biologischen Aktivität geführt haben oder ob die Bedingungen in bekannter Weise modifiziert werden müssen.

Zur Aufspaltung von Disulfidbrücken geeignete Reduktionsmittel sind beispielsweise Thiol-Verbindungen, wie Thiophenol, 4-Nitrothiophenol, 1,4-Butandithiol und insbesondere 1,4-Dithiothreitol. Die Reduktion wird vorteilhaft in einem wäßrig-alkalischen Medium, beispielsweise in der verdünnten wäßrigen Lösung eines Alkalimetallhydroxids, z. B. Natriumhydroxid, Alkalimetallcarbonats, z. B. Natriumcarbonats, oder einer organischen Base, insbesondere eines Triniederalkylamins, z. B. Triäthylamin, bei Raumtemperatur durchgeführt.

Oxidationsmittel, welche zur Neuverknüpfung von Disulfidbindungen in den reduzierten Polypeptiden geeignet sind, sind beispielsweise Luftsauerstoff, welcher durch eine wäßrige Lösung des Polypeptids, der gegebenenfalls eine katalytische Menge eines Übergangsmetallsalzes, z. B. Eisen-(III)-sulfat, Eisen-[III)-chlorid oder Kupfer-(II)-sulfat, beigefügt wurde, geleitet wird; Jod, auch in Form des Kaliumjodid-Adduktes KJ₃, welches vorzugsweise in alkoholischer, z. B. methanolischer, oder wäßrig-alkoholischer, z. B. wäßrig-methanolischer Lösung eingesetzt wird; Kaliumhexacyanoferrat-(III) in wäßriger Lösung; 1,2-Dÿodäthan oder Azodicarbonsäuredimethylester oder -diäthylester, welche in Wasser oder in einer Mischung bestehend aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, z. B. Methanol, zur Reaktion gebracht werden. Die Oxidation wird insbesondere bei Raumtemperatur ausgeführt.

Die Abtrennung der Reagentien, insbesondere der Salze und der Oxidation- bzw. der Reduktionsmittel und ihrer Folgeprodukte, von der gewünschten VAC-Verbindung erfolgt nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Molekulargewichtsfiltration, z. B. an Sephadex oder Biogel.

Ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen mit VAC-Aktivität kann in an sich bekannter Weise in die einzelnen Komponenten aufgetrennt werden. Geeignete Trennverfahren sind beispielsweise chromatographische Verfahren, z. B. Adsorptious-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, HPLC oder Reverse-Phase HPLC, ferner multiplikative Verteilung oder elektrophoretische Methoden, z. B. Elektrophorese an Celluloseacetat oder Gelelektrophorese, insbesondere Polyacrylamid- Gelelektrophorese ("PAGE").

Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen können nicht nur in freier Form, sondern auch in Form ihrer Salze, insbesondere ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, vorliegen. Da sie mehrere Aminosäurereste mit freien Aminogruppen enthalten, können die erfindungsgemäßen Verbindungen z. B. in Form von Säureadditionssalzen vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen insbesondere physiologisch verträgliche Salze mit üblichen, therapeutisch anwendbaren Säuren in Betracht; als anorganische Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren, wie die Chlorwasserstoffsäure, aber auch Schwefelsäure und Phosphor- bzw. Pyrophosphorsäure zu nennen; als organische Säuren sind in erster Linie Sulfonsäuren, wie die Benzol- oder p-Toluosulfonsäure oder Niederalkansulfonsäuren, wie Methansulfonsäure, sowie Carbonsäure, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitin- und Stearinsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Citronensäure geeignet. Da die VAC-Verbindungen auch Aminosäurereste mit freien Carboxylgruppen enthalten, können sie auch als Metallsalz, insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, z. B. Natrium-, Calcium- oder Magnesiumsalz, oder auch als Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammoniak oder einer physiologisch verträglichen, organischen stickstoffhaltigen Base, vorliegen. Da sie aber zugleich freie Carboxylgruppen in freie Aminogruppen enthalten, können sie auch als innere Salze vorliegen.

Je nach Arbeitsweisen erhält man die erfindungsgemäßen Verbindungen in freier Form, in Form von Säureadditionssalzen oder Salzen mit Basen. Aus den Säureadditionssalzen und den Salzen mit Basen können in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Einstellen des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt, die freien Verbindungen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzen mit Säuren bzw. Basen, z. B. mit solchen, die die oben genannten Salze bilden, und Eindampfen oder Lyophilisieren therapeutisch annehmbare Säureadditionssalze bzw. Salze mit Basen gewinnen.

Die Eigenschaft von Antikörpern, spezifische Antigene zu binden, findet außerhalb des Körpers praktisch Anwendung bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung (Immuno-Assay) und bei der Reinigung der Antigene (Immunoaffinitätschromatographie). Serum immunisierter Tiere enthält normalerweise eine Vielzahl verschiedener Antikörper, die mit dem gleichen Antigen an verschiedenen Bindungsstellen mit verschiedener Affinität reagieren, dazu aber auch Antikörper gegen andere Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individiums widerspiegeln. Die erfolgreiche Anwendung von Antikörpern zur Bestimmung und Reinigung von Antigenen erfordert aber hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit.

Homogene Antikörper, die diese Anforderungen erfüllen, sind durch die von Köhler und Milstein (17) beschriebene Hybridoma-Technik zugänglich geworden. Prinzipiell besteht die Technik darin, daß Antikörper ausscheidende B-Lymphozyten, z. B. aus der Milz, immunisierter Tiere mit Tumorzellen verschmolzen ("fusioniert") werden. Die gebildeten Hybridoma-Zellen kombinieren die Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung durch Teilung mit der Fähigkeit, einen einheitlichen Typ Antikörper zu bilden und auszuscheiden. Durch Kultivierung in einem selektiven Medium, in dem nicht fusionierte Tumorzellen absterben, Hybridoma-Zellen sich aber vermehren, und durch geeignete Manipulationen können Klone, d. h. Zellpopulationen, die sich von einer einzigen Hybridome-Zelle ableiten und genetisch identisch sind, gewonnen und kultiviert und die durch die Zellen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen VAC, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedene monoklonale Antikörper, die spezifisch mit VAC reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-VAC und Anti-VAC-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit VAC immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert.

Die Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitäts­ chromatographie-Säulen und Test-Kits für Immunoassays, die diese Antikörper enthalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mäuse, z. B. Balb/c-Mäuse, auf an sich bekannte Weise immunisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird VAC etwa wöchentlich oder auch in größeren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise 5 bis 12 Wochen, injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat.

B-Lymphozyten enthaltende Organe, z. B. Milzzellen, der immunisierten Mäuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jene mit der Bezeichnung X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 oder SP 2/0. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zell-Linie X63-Ag8.6.5.3 fusioniert.

Die Fusion wird nach an sich bekannten Verfahen durch Mischen der B-Lymphozyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zellfusionsagens, wie Polyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polythylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, da somit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myelomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten.

Die Überstände der Hybridoma-Kulturen können mit an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit Radio-Immunoassay oder Agglutinierung. Dabei wird überraschenderweise festgestellt, daß mit dem beschriebenen Verfahren Hybridoma-Zellen gewonnen werden können, die Antikörper spezifisch gegen VAC ausscheiden. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an sich bekannten Verfahren, das "limitin dilution" genannt wird, Kulturen ausgehend von einer einzigen wachsenden Zelle angesetzt.

Zur Massenproduktion werden die Hybridoma-Zellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medium in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszites-Flüssigkeit entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfat-Lösung Antikörper isoliert.

Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie- Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörper-Lösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschließend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert.

Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnenen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedene Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immuno-Assay, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno-Fluoreszenz oder immunochemischen Enzym-Tests. Solche Kits können neben gewöhnlichen Antikörpern verschiedener Herkunft Antikörper-Konjugate mit Enzymen oder Fluoreszenzträgern enthalten, dazu VAC markiert mit radioaktiven Isotopen wie J¹²⁵, oder konjugiert mit Enyzmen, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, ferner Enzymsubstrate, geeignete Puffer, Gele, Latex, Polystyrol oder andere Füllmaterialien und Träger.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen bekannten Proteine (Peptide) weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf und können prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen neuen VAC-Verbindungen können daher in Analogie zu natürlichem VAC zur Therapie und Prophylaxe von Thrombosen und Thromboembolien, einschließlich zur Prophylaxe von postoperativen Thrombosen, zur akuten Schock-Therapie (z. B. bei septischem oder polytraumatischem Schock), zur Therapie von Verbrauchskoagulopathien, bei Hämodialysen, Hämoseparationen, Blutkonserven und im extrakorporalen Kreislauf verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, welche wenigstens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Hilfsstoffen, enthalten. Diese Zusammensetzungen können insbesondere bei den oben angegebenen Indikationen Verwendung finden, wenn sie z. B. parenteral, wie intravenös, intracutan, subcutan oder intramuskulär, oder topisch verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen für die prophylaktische und therapeutische Behandlung des menschlichen und tierischen Körpers, insbesondere bei den oben angegebenen Krankheitsbildern, in erster Linie zur Hemmung der Gerinnung des Blutes innerhalb und außerhalb des menschlichen und tierischen Körpers.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie bzw. Prophylaxe ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema kann am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles bestimmt werden: die dazu erforderlichen Methoden zur Bestimmung von relevanten Blutfaktoren sind dem Fachmann geläufig. Im Normalfall liegt bei einer Injektion die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen im Dosisbereich von etwa 0,005 bis etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Bevorzugt wird der Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt durch intravenöse, intramuskuläre oder subcutane Injektion. Dementsprechend enthalten pharmazeutische Präparate zur parenteralen Verabreichung in Einzeldosis-Form in Abhängigkeit von der Applikationsart pro Dosis etwa 0,4 bis etwa 7,5 mg der erfindungsgemäßen Verbindung. Neben dem Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise noch einen Puffer, z. B. einen Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 halten soll, und ferner Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zur Einstellung der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen, wobei Lösungen ein antibakteriell wirkendes Konservierungsmittel, z. B. 0,2 bis 0,3% 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester, enthalten können. Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wäßrige Lösung, Lotion oder Gelee, ölige Lösung oder Suspension, oder fetthaltige oder insbesondere Emulsions-Salbe vorliegen. Ein Präparat in Form einer wäßrigen Lösung erhält man beispielsweise dadurch, daß man die erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon in einer wäßrigen Pufferlösung von pH 4 bis 6,5 löst und gewünschtenfallls einen weiteren Wirkstoff, z. B. ein Antiinflammatorikum, und/oder ein polymeres Hilfsmittel, z. B. Polyvinylpyrrolidon, und/oder ein Konservierungsmittel zufügt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in 10 ml einer Lösung bzw. 10 g eines Gelees.

Eine ölige Applikationsform für die topische Verabreichung erhält man beispielsweise durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon in einem Öl, gegebenenfalls unter Zusatz von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder grenzflächenaktiven Mitteln (Tensiden), deren HLB-Wert ("hydrophilic-lipophilic- balance") unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z. B. Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fetthaltige Salbe erhält man z. B. durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer streichbaren Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tensids vom HLB-Wert unter 10. Eine Emulsionssalbe erhält man durch Verreiben einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer weichen, streichbaren Fettunterlage unter Zusatz eines Tensids, dessen HLB-Wert unter 10 liegt. Alle diese topischen Applikationsformen können auch Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration des Wirkstoffes beträgt 0,1 bis 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 0,1 mg, in etwa 10 g der Grundmasse.

Neben den oben beschriebenen und ihren analogen pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für einen direkten medizinischen Einsatz am Körper des Menschen oder eines Säugetieres bestimmt sind, betrifft die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Präparate zur medizinischen Anwendung außerhalb des lebenden Körpers des Menschen oder der Säugetiere. Solche Zusammensetzungen und Präparate verwendet man in erster Linie als gerinnungshemmenden Zusatz zu Blut, welches außerhalb des Körpers einer Zirkulation oder Behandlung (z. B. extrakorporaler Kreislauf oder Dialyse in künstlichen Nieren), Konservierung oder Modifizierung (z. B. Hämoseparation) unterzogen wird. In ihrer Zusammensetzung sind derartige Präparate, wie Vorratslösungen oder auch Zubereitungen in Einzeldosis-Form, den oben beschriebenen Injektionspräparaten ähnlich; zweckmäßigerweise wird aber die Wirkstoffmenge bzw. -konzentration auf das Volumen des zu behandelnden Blutes bezogen. Je nach dem spezifischen Zweck beträgt die geeignete Dosis etwa 0,01 bis etwa 1,0 mg Wirkstoff/l Blut, wobei die obere Grenze ohne Gefahr noch überschritten werden darf.

Insbesondere betrifft die Erfindung die in den Belegbeispielen beschriebenen, für die für VAC-Proteine kodierenden VAC-Moleküle, solche VAC-Moleküle enthaltende Expressionsplasmide, mit solchen Expressionsplasmiden transformierte Mikroorganismen, monoklonale Antikörper gegen VAC, Hybridoma-Zellen, die solche Antikörper produzieren, um Test-Kits für Immunoassays, die solche Antikörper enthalten, die in den Beispielen beschriebenen Verfahren zu ihrer Herstellung und das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung von Proteinen/Polypeptiden mit VAC-Aktivität mit Hilfe der transformierten Mikroorganismen, sowie die in den Beispielen beschriebenen neuen VAC-Verbindungen.

Wird in der vorliegenden Anmeldung von vascular-antikoagulierenden Proteinen oder in der Kurzform VAC-Protein gesprochen, so bedeutet das wenn nicht anders angegeben, daß hiermit Polypeptide/ Proteine gemeint sind, die im wesentlichen die Eigenschaften aufweisen, die den Proteinen eigen sind, die in der EPA 18 14 465 erstmals beschrieben wurden. Diese Eigenschaften lassen sich durch die dort angegebenen Test- und Charakterisierungsverfahren feststellen und Überprüfen (VAC-Aktivität).

Weiterhin fallen unter diese Definition auch die Polypeptide/Proteine, die Aggregationen wie beispielsweise Dimere, Trimere oder Tetramere darstellen, auch wenn diese in der aggregierten Form per se nicht oder nur eingeschränkte biologische Aktivitäten aufweisen, unter der Voraussetzung, daß diese in vivo oder in vitro in zumindest eine aktive Komponente zu überführen sind.

Werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polypeptide/Proteine erhalten, die per se nicht oder nur eingeschränkte biologische Aktivitäten aufweisen, beispielsweise Fusionsproteine oder sogenannte "pro-drugs", Polypeptide/Proteine, die für den Fachmann in an sich bekannter Weise in die aktiven Komponenten überführbar sind, beispielsweise durch in vitro oder in vivo Prozessierung oder Polypeptide/Proteine, die erst in vivo ihre Aktivität entfalten, so sollen auch diese unter die Definition vascular-antikoagulierende-, kurz VAC-Proteine gefaßt sein und damit zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehören.

Unter "Verbindungen mit VAC-Aktivität" werden auch solche, von den genannten transformierten Wirtszellen exprimierte Polypeptide verstanden, welche ein VAC-Wirkung und eine positive Reaktion mit anti-VAC-Antikörpern zeigen und welche die Primärstruktur von VAC oder eine davon abgeleitete Struktur aufweisen. Unter VAC-Verbindungen mit einer von der Primärstruktur von VAC abgeleiteten Struktur werden modifizierte VAC-Verbindungen verstanden, wobei die Modifizierung in einer Verkürzung der Primärstruktur des VAC, in einer Umordnung der Repeat-Struktur oder in einer Modifizierung, die zu einer Veränderung der Stabilität bzw. Aktivität führt.

VAC-DNA/Gen steht in der vorliegenden Erfindung für die DNA-Moleküle, die für die oben definierten VAC-Proteine kodieren.

Die folgenden Beispiele und Zeichnungen dienen zur Illustration der Erfindung und sollen sie in keiner Weise einschränken.

Um die nachfolgenden Beispiele zu vereinfachen, werden oft wiederkehrende Methoden kurz beschrieben.

Plasmide werden mit einem kleinen "p" bezeichnet, gefolgt von Großbuchstaben und Ziffern. Ausgangsplasmide sind käuflich oder ohne Einschränkung öffentlich erhältlich. Sie können auch aus solchen Plasmiden mittels publizierter Methoden konstruiert werden.

"Schneiden" oder "Verdauen" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme) an für diese spezifischen Stellen, Restriktionsstellen genannt. Restriktionsendonukleasen sind käuflich erhältlich und werden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen (Puffer, Rinderserumalbumin (BSA) als Trägerprotein (DTT) als Oxidationsschutz) eingesetzt. Restriktionsendonukleasen werden mit einem Großbuchstaben, meist gefolgt von Kleinbuchstaben und normalerweise einer römischen Ziffer bezeichnet. Die Buchstaben hängen von dem Mikroorganismus ab, aus dem die betreffende Restriktionsendonuklease isoliert wurde (z. B. Sma I: Serratia marcescens). Üblicherweise wird etwa 1µg DNA mit einer oder mehreren Einheiten des Enzyms in etwa 20 µl Pufferlösung geschnitten. Normalerweise wird eine Inkubationsdau 48522 00070 552 001000280000000200012000285914841100040 0002003710364 00004 48403er von 1 Stunde bei 37°C verwendet, kann aber laut den Verwendungsvorschriften des Herstellers variiert werden. Nach dem Schneiden wird manchmal die 5′Phosphatgruppe durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase als Kalbsdarm (CIP) entfernt. Dies dient zur Verhinderung einer ungewünschten Reaktion der spezifischen Stelle in einer nachfolgenden Ligasereaktion (z. B. Zirkularisierung eines linearisierten Plasmids ohne Insertierung eines zweiten DNA-Fragmentes). Wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Fragmente nach dem Schneiden mit Restriktionsendonukleasen normalerweise nicht dephosphoryliert. Reaktionsbedingungen für die Inkubation mit alkalischer Phosphatase sind z. B. dem M13 Cloning und Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12) zu entnehmen. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zusatz von Äthanol präzipitiert.

"Isolierung" eines bestimmten DNA Fragments bedeutet die Auftrennung der geschnittenen DNA auf einem z. B. 1% Agarosegel. Nach der Elektrophorese und dem Sichtbarmachen der DNA im UV-Licht durch Anfärben mit Äthidiumbromid (EtBr) wird das gewünschte Fragment anhand mit aufgetragener Molekulargewichtsmarker lokalisiert und durch weitere Elektrophorese an DE 81 Papier (Schleicher und Schüll) gebunden. Die DNA wird durch Spülen mit Niedrigsalzpuffer (200 mM NaCl, 20 mM Tris pH=7,5, 1 mM EDTA) gewaschen und anschließend mit einem Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH=7,5, 1 mM EDTA) eluiert. Die DNA wird durch Zusatz von Äthanol präzipitiert. "Southern Analyse" ist jene Methode, durch die die Gegenwart eines bestimmten DNA-Fragments in einem DNA-Gemisch durch Hybridisierung mit einer bekannten, markierten Oligonukleotidsonde oder einem markierten DNA-Fragment nachgewiesen wird. Southern Analyse bedeutet im folgenden, so nicht anders spezifiziert, die Auftrennung des DNA Gemischs auf einem 1% Agorosegel, Denaturierung und Transfer auf Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schüll), BA 85) mittels der Methode von E. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1978), pp.503-517, und Hybridisierung wie beschrieben in R. Hauptmann et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), pp.4739-4749.

"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus, so daß die DNA dort replizierbar ist, entweder extra-chromosomal oder als chromosomale Integrante. Transformation von E. coli folgt der im M13 Cloning and Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12) angegebenen Methode.

"Sequenzieren" einer DNA bedeutet die Analyse der Nukleotid-sequenz in einer DNA. Dazu wird die DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten, und die Fragmente in entsprechend geschnittene M13 mp8, mp9, mp18 oder mp19 Doppelstrang DNA eingebracht, oder die DNA wird mittels Ultraschall, nachfolgender Reperatur der Enden und Größenselektion in Sma I geschnittene, dphosphorylierte M13 mp8 DNA (Shotgun Methode) eingebracht. Nach der Transformation von E. coli JM 101 wird Einzelstrang DNA aus rekombinanten M13 Phagen entsprechend dem M13 Cloning and Sequencing manual (Cloning and Sequencing Handbook, Fa Amersham, PI/129/83/12) isoliert und nach der Sanger′schen Diedoxymethode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), pp.5463-5467) sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgt mittels der ursprünglich von R. Staden entwickelten (R. Staden, Nucleic Aceds Res. 10 (1982), pp.4731-4751) und von Ch. Piegler modifizierten (C. Pieler 1987, Dissertation, Universität Wien) Computerprogramme.

"Ligieren" bezieht sich auf den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Enden von Doppelstrang-DNA Fragmenten. Üblicherweise werden zwischen 0,02 und 0,2 µg DNA-Fragmente in 10 µl mit etwa 5 units T4-DNA Ligase ("Ligase") in einer geeigneten Pufferlösung ligiert (T. Maniatis et al., Molecular cloning, 1982, p.474).

"Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolierung der Plasmid DNA aus Bakterien mittels der alkenischen SDS Methode modifiziert nach Birnboim und Doly (T. Maniatis et al., Molecular cloning, 1982, pp. 368-369) unter Weglassen des Lysozyms. Dabei werden die Bakterien aus 1,5 und 50 ml Kultur verwendet.

"Oligonukleotide" sind kurze Polydesoxynukleotide, die chemisch synthetisiert werden. Dazu wurde der Applied Biosystems Synthesizer Modell 381A verwendet. Die Oligonukleotide werden entsprechend dem Modell 381A User Manual (Applied Biosystems) aufgearbeitet und durch Polyacrylamidgelektrophore (PAGE) gereinigt.

"Phosphorylieren" bedeutet die enzymatische Übertragung des gamma-Phosphatrests aus ATP auf eine freie 5′OH-gruppe einer Nukleinsäure, meist ein Oligonukleotid. In 10 µl Lösung werden bis zu 100 pMol des Oligonukleotids mit 10 Einheiten T 4 -Poly-nukleotidkinase in Gegenwart von 100 pMol ATP in geeigneter Pufferlösung (70 mM Tris, pH=7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT) 30 Minuten bei 37°C phosphoryliert. Die Reaktion wird meist durch 10 Minuten Erhitzen auf 100°C gestoppt.

Einige verwendete Abkürzungen sollen kurz erklärt werden:

bpBasenpaare BSARinderserumalbumin DTTDithiothreit EDTAÄthylendinitrilotetraessigsäure, diNatriumsalz SDSNatriumdodecylsulfat TrisTris(hydroxymethyl)-aminomethan Denhardt0,01% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02 BSA LB10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl 1× SSC150 mM NaCl, 15 mM tri-Natriumcitrat, pH=7 TE10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA

Verzeichnis der Abbildungen:

1Screening-Oligonukleotide EBI-386, -387 und -388 1ATryptische Fragmente 1BHPLC 1CHPLC 1D/1EGelpermeations-HPLC 1FReverse-Phase-HPLC 1GSDS-Gelektrophorese 2Screening-Oligonukleotide EBI-118 und EBI-119 3Northern Blot Analyse mit VAC-alfa und VAC-beta cDNA 4VAC-alfa cDNA Sequenz 5Anordnung der Peptidsequenzen in der VAC-alfa cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz 6Vierfach wiederholte Subsequenz im VAC-alfa Protein 7VAC-beta cDNA Sequenz 8Vierfach wiederholte Subsequenz im VAC-beta Protein 9Aminosäurezusammensetzung von VAC-alfa und VAC-beta 10Genomische Southern Blot Analyse mit VAC-alfa und VAC-beta cDNA 11Aminosäurevergleich von VAC-alfa mit VAC-beta 12Nukleotidvergleich zwischen VAC-alfa und -beta cDNA 13Hydrophilizitätsplot von VAC-alfa und VAC-beta 14Vergleich von VAC-alfa, VAC-beta, Lipocortin I und Lipocortin II 15Sequenz des Promotor- und Terminator Teils in pRH284 16Konstruktion von pR291 17Konstruktion von pRH212 18Konstruktion von PRH292

Beispiel 0

Das aus Nabelschnurgefäßen und/oder Placenta isolierte und gereinigte Material wurde mit Hilfe einer Reverse-Phase HPLC nachgereinigt.

Stationäre PhaseBakerbond WP-RP 18, 4,6×250 mm, 5 µm Teilchen, 300 A Poren Mobile Phase A0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, pH 2,2 Mobile Phase B0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril Gradient20-68% B in 24 min Fluß1 ml/min DetektionUV, 214 nm

Anschließend an diese Reinigungsstufe wurden beiden Materialien, jeweils die Substanz, die das Molekulargewicht 32 000 aufwies, mit Trypsin verdaut.

Reaktionsbedingungen

30 µg VAC aus Placenta in 135 µl 0,15 M NH₄HCO₃, pH 8,0

+2% w/w Trypsin (Worthington) 6 Stunden bei 37°C

+2% w/w Trypsin (Worthingon), über Nacht bei 37°C
30 µg VAC aus Nabelschnur in 100 µl 1% NH₄HCO₃, pH 8,0

+2% w/w Trypsin (Worthington) 6 Stunden bei 37°C

+2% w/w Trypsin (Worthington), über Nacht bei 37°C

Die erhaltenen Bruchstücke wurden mit Hilfe von HPLC aufgetrennt und einer Sequenzierung mit einem Gasphasensequenator Typ 470A von Applied Biosystems, Programm 02 RPTH zugeführt.

HPLC-Trennbedingungen

Stationäre PhaseµBondapak C 18, 3,8×200 mm, 10 µ Teilchen Mobile Phase A0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, pH 2,2 Mobile Phase B0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril Gradient0-55% B in 55 min Fluß1 ml/min DetektionUV, 214 nm (obere Spur)
    280 nm (untere Spur)

Neben dem tryptischen Verdau wurde das über Reverse-Phase-HPLC gereinigte Material auch noch einer BrCN-Spaltung unterzogen. Auch diese Spaltpeptide wurden sequenziert und mit den Daten der Peptide aus dem tryptischen Verdau verglichen.

BrCN-Spaltung

111 µg über RP-HPLC gereinigtes VAC in 111 µl 70% Ameisensäure gelöst. Diese enthielt bereits den 250- fachen molaren Überschuß an BrCN (90 µg). Die Inkubation erfolgte im Dunkeln, 17 Stunden bei Raumtemperatur. 100 µl wurden für die HPLC-Auftrennung verwendet.

HPLC-SäuleµBondapak C 18 Mobile Phase A0,1% Trifluoressigsäure in Wasser Mobile Phase B0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril Gradient0-70% B in 70 min Fluß1 ml/min DetektionUV, 214 und 280 nm

Ein Vergleich der hiermit erzielten Ergebnisse sowie die Analyse mittels Gelpermeations-HPLC und SDS-Gelektrophorese belegt die Identität von VAC aus Placenta und VAC aus Nabelschnur.

Gelpermeations HPLC

Stationäre PhaseWaters I-125, 7,8×600 mm, 10 µm Teilchen Mobile Phase B0,5M Na₂SO₄, 0,02 M Na₂PO₄, pH 7,0, 25% Propylenglykol, 0,04% Tween 20 Fluß0,5 ml/min DetektionUV, 214 nm

SDS-Gelelektrophorese

SDS-Gel15% Gelstärke0,7 mm Elektrophoresebedingungen20 mA/Platte, 2-3 Stunden Laufzeit FärbungCoomassie Blue Proben: 8 µg VAC aus Nabelschnur bzw.
: 7 µg VAC aus Placenta

Beispiel 1 Herstellung einer humanen plazentalen cDNA-Bibliothek a) Gesamt-RNA Isolierung aus Plazenta

GT:5 M Guanidinium-Thiocyanat, 50 mM Tris pH=7,4, 25 mM EDTA. Vor Gebrauch 8% (v/v) beta-Mercaptoäthanol zusetzen. 20 ml GT werden 5 bis 10 Minuten vor Gebrauch auf Eis gekühlt, GT soll dabei nicht präzipitieren. GH:6 M Guanidium-Hydrochlorid, 25 mM EDTA, 10 mM beta-Mercaptoäthanol, pH=7,0. Eiskühlen.

1 g tiefgefrorener und mechanisch pulverisierter Plazenta werden in 20 ml GT (0°C) 20 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit mit einem Polytron (Brinkmann) gemixt. Das Volumen des Homogenats wird bestimmt, in 0,3 vol Äthanol (-20°C) gegossen, gemischt und sofort bei 12000 rpm 5′ bei -10°C (Beckmann JA 21 Zentrifuge, JS13.1 Rotor) zentrifugiert. Ein eventueller Proteinfilm sowie der Überstand werden entfernt. 10 ml eiskaltes GH werden dem Pellet zugesetzt und 10 Sekunden mit dem Polytron homogenisiert. Die Suspension wird 5 Minuten bei -10°C und 12000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird in ein steriles Corexröhrchen transferiert, das Pellet verworfen. Zum Überstand werden 0,025 vol 1 M Essigsäure und 0,75 vol kalter Äthanol (-20°C) zugesetzt und gut durchmischt. Nach ca. 2 Stunden Inkubation bei -20°C wird 10 Minuten bei 6000 rpm bei -20°C (JA20 Rotor) zentrifugiert. Der Proteinfilm und der Überstand werden sorgfältig entfernt. 2 ml GH (0°C) werden zum Pellet zugegeben, das Pellet resuspendiert, und die Suspension in ein 15 ml Corexröhrchen transferiert. Mit weiteren 8 ml GH wird das alte Corexröhrchen nachgespült, die Lösung mit den 2 ml vereint. Es ist wichtig, daß das gesamte Pellet suspendiert ist, eventuell ist durch mildes Sonikieren nachzubehandeln. 0,025 vol l M Essigsäure und 0,5 vol kalter Äthanol (-70°C) werden zugesetzt und ca. 2 Stunden bei -20°C inkubiert. Zentrifugation (6000 rpm, 10 min, JA20 Rotor), Lösen und Präzipitieren werden zweimal wiederholt, wobei die totale GH-Menge auf 5 ml halbiert wird. Nach der letzten Zentrifugation soll kein Proteinfilm mehr über der Lösung sichtbar sein, sonst ist dieser Reinigungsschritt zu wiederholen. Das Pellet wird mit 5 ml Diäthylpyrocarbonat behandeltem Wasser (0°C) 2 Minuten gevortext. Die klare Lösung wird dekantiert, zu dem eventuell zurückbleibenden Pelletresten wird nochmals Wasser gegeben und gevortextet, bis die Lösung klar ist. Durch Zusatz von 0,1 vol 3 M Na-Azetat (pH=5,8), 2,5 vol Äthanol und 1 Stunde Inkubation bei 0°C bei -70°C wird die RNA 10 Minuten bei 6000 rpm bei 4°C abzentrifugiert. Lösen und präzipitieren wird einmal wiederholt. Letztendlich wird die RNA in Äthanol bei -20°C aufbewahrt.

b) poly-A^±-RNA Isolierung

0,5 mg oligo dT-Zellulose (Collaborative Research, Typ 3, Bindungskapazität: 5 mg poly-A⁺-RNA/g) werden im Bindungspuffer suspendiert (200 mM NaCl, 0,2%SDS, 10 mM Tris, pH=7,4, 1 mM EDTA), 1 ml dieser Suspension wird in eine Säule pepackt und nacheinander mit 10 ml Wasser, 10 ml 0,1 N NaOH, 10 ml Wasser und letztlich mit 10 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Gesamt-RNA wird aus der alkalischen Lösung durch Zentrifugieren (10 Min., 6000 rpm, JA20 Rotor pelletiert. Ca. 10 mg RNA werden in 4,5 ml Wasser gelöst. Nach Zusatz von 50 µl 2% SDS wird die Lösung 3 Min. auf 70°C erhitzt und unmittelbar auf Eis gekühlt. Nach dem Zusatz von 50 µl 1M Tris (pH=7,4), 10 µl 0,5 M EDTA und 200 µl 5 M NaCl wird die Lösung sofort auf die Säule aufgetragen. Die aus der Säule tropfende Lösung wird wieder auf die Säule aufgetragen. Diese Prozedur wird insgesamt dreimal wiederholt. Anschließend wird die Säule mit 30 ml Bindungspuffer gewaschen. Die gebundene RNA wird mit 5 ml 0,2 SDS eluiert. Die Säule wird mit 10 ml Wasser, 10 ml 0,1 N NaOH und 10 ml H₂O gewaschen und mit 10 ml Bindungspuffer äquilibriert. Die RNA Lösung wird nochmals 3 Minuten auf 70°C erhitzt, rasch auf Eis abgekühlt, 50 µl 1 M Tris pH=7,4, 10 µl 0,5 M EDTA und 200 µl 5 M NaCl zugesetzt und auf die Säule aufgetragen. Die durchlaufende Lösung wird insgesamt dreimal auf die oligo-dT Säule aufgetragen. Nach dem Waschen wird die RNA mit 30 ml 0,2% SDS eluiert.

Durch Zugabe von 0,1 vol 3M Na-Azetat pH=5,6 und 2,5 vol Aethanol sowie Inkubation bei -20°C (16 Stunden) wird die RNA ausgefällt. Die RNA wird abzentrifugiert (10 000 rpm, 15 Min., JA-20 Rotor) und in Wasser mit einer Konzentration von 1 µg/ µl gelöst.

c) Konstruktion der Lambda gt10 cDNA Bibliothek

Die Synthese der cDNA, das Methylieren der internen EcoRI-Stellen, das Anbringen von EcoRI Linkern, das Nachschneiden mit EcoRI, die Abtrennung der kurzen DNA-Fragmente, das Ligieren mit den Lambda-gt10 Armen und das in vitro Verpacken der ligierten DNA erfolgte mit dem cDNA Synthese System von Amersham (RPN 1256) sowie dem cDNA Kloniersystem Lambda-gt10 (Amersham, RPN 1257). Die beigefügten Arbeitsvorschriften wurden genau eingehalten. Ausgehend von etwa 3 µg wurden letztendlich ca. 0,5×10⁶ rekombinante Lamda-gt10 Phagen erhalten.

Beispiel 2 cDNA Isolierung a) Durchsuchen der Lambda-gt10 Bibliothek mit Oligonukleotiden

Zum Durchsuchen der cDNA-Bibliothek nach für VAC-protein kodierender cDNA wurden entsprechend der Sequenzen des tryptischen Peptides P16/II zwei und des Staph A Peptides P20/I/6 ein Oligonukleotid synthetisiert (Fig. 1). Diese Oligonukleotide stellen jeweils eine Mischung aller Varianten dar, die jede Kodierungsmöglichkeit der entsprechenden mRNA berücksichtigen. EBI-386 weist bei einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden 512 Variationen auf und paßt zu dem Staph-A Peptid P20/I/6. Um die Variation bei dem Oligonukleotid für das tryptische Peptid P16/II niedriger zu halten, wurden zwei Oligonukleotide (20-mere) synthetisiert: EBI-387: 128 Variationen, EBI-388: 64 Variationen.

Weiters wurden zu dem tryptischen VAC-Peptid P30/I passen zwei Oligonukleotide unter Verwendung von Desoxinosin als Base bei "Wobble" Positionen synthetisiert (Fig. 2): EBI-119. Diese Substitution wurde von E. Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260/5 (1985), pp. 2605-2608, sowie Y. Takahashi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1985) pp. 1931-1935, beschrieben. Inosin basenpaart gut mit Cytosin, stört jedoch kaum die Ausbildung der Doppelhelix, wenn andere Nukleotide als Partner angeboten werden.

Jeweils 60 pMol gamma-³²P-ATP (Amersham, PB 218, 5000 Ci/mMol) in 30 µl Lösung unter Verwendung von 20 Einheiten T₄ Polynukleotidkinase phosphoryliert. Die Lösung enthielt 70 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 5 mM DTT, die Inkubationsdauer betrug 30 Minuten. Durch Zugabe von 30 mM EDTA und 5 Minuten Erhitzen auf 70°C wurde die Reaktion gestoppt. Das markierte Oligonukleotid wurde durch Säulenchromatographie über Biogel P6DG (Biorad) von nicht eingebauter Radioaktivität getrennt. Pro Oligonukleotid wurden zwischen 70 und 110×10⁶ cpm Phosphor-32 eingebaut.

Je 15 pMol EBI-118 und EBI-119 wurden in 90 µl unter Einsatz von 45 pMol gamma-³²P-ATP (Amersham, PB 218, <5000 Ci/mMol) mit 10 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase phosphoryliert und anschließend über Biogel P6DG gereinigt. Insgesamt wurden 70×10⁶ cpm Phosphor-32 eingebaut.

Ungefähr 1,2×10⁶ pfu (Plaque forming units) rekombinanten Phagen einer humanen, plazentalen cDNA Bibliothek im Phagen Lambda-gt10 wurden verwendet, um E. coli C600 zu infizieren. Etwa 50 000 Phagen wurden pro 13,5 cm Petrischale plattiert (LB, 10 mM MgSO₄, 15 g/l Bacto-Agar). Nachdem die Plaques fast konfluent waren, wurden von jeder Platte 2 Abzüge auf Nitrozellulosefilter hergestellt (Schleicher und Schüll, BA 85) (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982, pp 320-321).

Die Filter wurden 3×20 Minuten in TE bei 100°C behandelt und anschließend über Nacht bei 65°C gewaschen:

Waschlösung:50 mM Tris pH=8
1 M NaCl
1 mM EDTA
0,1% SDS

Danach wurden die Filter 4 Stunden bei 49°C prähybridisiert:

Prähybridisierlösung:6 × SSC
5 × Denhardt
0,1% SDS
1 mM Na-Pyrophosphat
50 mM NaH₂PO₄, pH=6,5
100 µM ATP
80 µg/ml denaturierte Hering
Sperm DNA

Die Hybridisierung erfolgte in der gleichen Lösung unter Einsatz der gesamten Menge markierter Oligonukleotide. Die doppelten Abzüge der Platten 1 bis 6 wurden mit EBI-386, jene Platten 7-12 mit EBI-387 und EBI-388 16 Stunden bei 49°C hybridisiert. Die Abzüge der Platten 13-24 wurden 16 Stunden mit EBI-118 und EBI-119 bei 37°C hybridisiert.

Nach erfolgter Hybridisierung wurden die Filter zweimal mit 6× SSC/0,01% SDS gespült, 2 × 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 6× SSC/0,01% SDS und 3 × 10 Minuten in der gleichen Lösung bei 49°C bzw. 37°C gewaschen. Nach dem Lufttrocknen wurden die Filter an Kodak X-Omat S Film bei -70°C unter Verwendung einer Verstärkerfolie exponiert.

Lambda-Phagen, die auf beiden Filtern Hybridisierung mit dem Oligonukleotid zeigten, wurden unter Verwendung desselben Hybridisierungsprotokolls zur Homogenität gereinigt.

Aus der Hybridisierung mit EBI-386, -387 und -388 resultierten die Phagen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5, Lambda-P6/6. Die Hybridisierung mit EBI-118 und -119 resultierte in den Phagen Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22.

b) Isolierung der cDNA Inserts

E. coli C 600 wurde mit 2,5 × 10⁶ pfu (Plague forming units) Phagen infiziert und mit 6 ml Topagarose (0,7% Agarose, 10 mM MgSO₄, LB) auf 13,5  cm Agarplatten (LB, 10 mM MgSO₄, 1,5% Agarose, 0,2% Glukose) plattiert. Nach 5½ Stunden Inkubation bei 37°C waren die Plagues konfluent. Die Platten wurden 30 Minuten bei 4°C gekühlt und die Agarose mit 10 ml Lambda-Diluent (10 mM Tris, pH=8, 10 mM MgSO₄, 0,1 mM EDTA) überschichtet. Die Phagen wurden über Nacht bei 4°C unter leichten Schütteln eluiert. Die überstehende Phagensuspension (ca. 8 ml) wurden in Corexröhrchen transferiert und 10 Minuten bei 15 000 rpm (4°C, JA 21 Zentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wurde im Polycarbonatröhrchen dekantiert und bei 50 000 rpm (20°C, L70 Beckmann-Zentrifuge, 20°C, 50 Ti Rotor) bis omega²t = 3 × 10¹⁰ (ca 23 Minuten) zentrifugiert. Die pelletierten Phagen wurden nach Entfernen des Überstandes in 0,5 ml Lambda-Diluent resuspendiert und in Eppendorf Röhrchen transferiert. Die Suspension wurde durch kurzes Zentrifugieren von nichtsuspendierten Teilchen befreit, der Überstand in eine neues Röhrchen gefüllt. Nach Zusatz von 10 µl/ml RNaseA und 1 µg/ml DNase I wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 25 mM EDTA, 25 mM Tris, pH=8, 0,2% SDS wurde 30 Minuten bei 70°C inkubiert. Als nächstes wurde 1 vol Phenol/Chloroform (1 : 1) zugegeben, und Proteine durch Kippen des Rörchen extrahiert. Nach 2 Minuten Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge wurde die wäßrige Phase mit 1 vol Chloroform extrahiert (nur Kippen, nicht Vortexen). Nach der Phasentrennung durch Zentrifugation wurden dem Überstand 1/20 vol 3 M Na-Azetat und 1 ml Äthanol zugesetzt. Dabei fiel die Phagen DNA fadenförmig aus. Nach 5 Minuten Inkubation bei 0°C wurde die DNA abzentrifugiert (10 Minuten). Das Pellet wurde einmal mit 70% Äthanol gewaschen, getrocknet und über Nacht in 50 µl TE gelöst (4°C).

Die DNAs wurden mit EcoRI geschnitten und die entstehenden Fragmente auf einem 1% Agarosegel getrennt. Die cDNA Inserts der Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 hatten die Größen von etwa 1300 bis 1400 bp. Die Sequenzanalyse zeigte, daß alle drei Klone von ein und derselben mRNA abgeleitet waren. Das 5′-Ende der mRNA fehlte jedoch in den cDNAs. Die Inserts der Phagen Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 hatten Längen von ca. 1600, 1100 und 1000 bp. Die Sequenzanalyse ließ eine annähernd vollständige cDNA vermuten. Die cDNAs der beiden Phagengruppen Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 sowie Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 sind von zwei verschiedenen mRNAs abgeleitet, wie die nachfolgende Sequenzanalyse ergab.

Die EcoRI Inserts der drei Klone Lambda-P11/3, Lambda-P6/5 und Lambda-P6/6 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺ Vektor ligiert (Vector Cloning Systems, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Die resultierenden Klone wurden pP6/5, pP6/6 und pP11/3 genannt.

Die EcoRI Inserts der drei Klone Lambda-Nr15, Lambda-Nr19 und Lambda-Nr22 wurden isoliert und in den EcoRI-geschnittenen Bluescribe M13⁺ Vektor ligiert. Die resultierenden Klone wurden pRH201, pRH202 und pRH203 genannt.

c) Weitere VAC cDNA Klone

Um weitere cDNA Klone zu erhalten, wurde die humane, plazentale Lambda-gt10 Bibliothek nochmals durchsucht, diesmal mit dem EcoRI-Insert des pP11/3 als Sonde. Dieses DNA-Fragment wurde durch Nicktranslation radioaktiv markiert (T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982, pp. 109-112, keine DNase I verwendet). Insgesamt wurden 4×10⁵ Phagen auf 8 Platten durchsucht. Die Behandlung der Nitrozellulosefilter erfolgte wie in T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982, pp. 320-321 beschrieben. Die Hybridisierungslösung enthielt 6× SSC, 5× Denhardt′s SDS sowie 20×10⁶ cpm pP11/3 Insert. Die Hybridisierungsdauer betrug 16 h bei 65°C. Die Filter wurden danach 3 × 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 6× SSC/0,1% SDS und 3×45 Minuten bei 65°C und mit 0,2× SSC gewaschen. Insgesamt wurden 69 positiv reagierende Klone erhalten (Lambda-VAC1 bis Lambda-VAC69).

12 dieser Klone wurden im kleinen Maßstab wie oben beschrieben präpariert, die cDNA Inserts mit EcoRI freigesetzt und auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Dabei zeigte sich, daß das Insert des Klons Lambda-VAC10 den gesamten für VAC Protein kodierenden Leserahmen enthält.

Beispiel 3 Charakterisierung der cDNAs kodierend für VAC-alfa und VAC-beta a) Northern Blot Experiment

Zu 2 µg poly-A⁺ RNA wurden 5 µl Wasser, 16 µl Formamid, 6 µl Formaldehyd und 3 µl 0,1 M NaOH zugesetzt, die Lösung 10 Minuten bei 68°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Nach Zusatz von 5 µl Farbstofflösung (je 0,4% Bromphenolblau und Xylencyanol in 50% Glyzerin, 1 mM EDTA) wurde die RNA auf einem Formamid-Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 10 mM Na-Phosphat pH=7,6, 1 mM EDTA, 5 mM Na-Azetat, 6% Formaldehyd, Elektrophorese 100 V, 3 Stunden, Laufpuffer wie Gelpuffer, ohne Formaldehyd). Als Referenz wurde Gesamt-RNA aufgetragen. Diese Spur wurde nach der Elektrophorese abgetrennt und mit EtBr angefärbt, um die Lage der 28 und 18 S rRNA zu bestimmen. Der Rest des Gels wurde zweimal 10 Minuten in 10× SSC gewaschen, und die RNA mit 20× SSC auf Nitro-Zellulosefilter übertragen. Das Filter wurde mit 2× SSC gewaschen, getrocknet und 2 Stunden im Vakuum bei 80°C gebacken. Jeweils 1 µg pP11/3 und PRH203 wurden mit dem Multiprime DNA labelling System (Amersham, RPM 1601) radioaktiv markiert. Das Nitro-zellulosefilter wurde 2 h bei 65°C in 6× SSC/5× Denhart′s/0,1% SDS prähybridisiert. Jeweils eine Spur wurde mit 180×10⁶ cpm pP11/3 bzw. pRH203 hybridisiert (16h 65°C). Die Filter wurden zweimal 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 6×SSC/0,01% SDS und zweimal 30 Minuten bei 65°C mit 0,2× SSC/0,1% SDS gewaschen, getrocknet und an Kodak X-Omat S Film mit Verstärkerfolie exponiert.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 abgebildet. Die cDNA des Klons pP11/3 hybridisiert an eine mDNA der Größe von etwa 1700 Basen ("VAC-alpha"), die cDNA des Klons pRH 203 an eine mRNA der Größe von etwa 2200 Basen ("VAC-beta").

Da erstens die eingesetzte Radioaktivitätsmenge sowie die aufgetragene Menge mRNA pro Spur etwa gleich war und zweitens die Hybridisierung eines Genom-Blots in derselben Lösung Banden gleicher Intensität mit beiden cDNAs ergab (siehe unten), ist zu schließen, daß die kürzere mRNA ("VAC-alfa") in größeren Mengen als die längere ("VAC-beta") mRNA in Plazenta vertreten ist.

b) Sequenzanalyse der VAC-alfa cDNA

Die cDNA Klone pP6/5, pP6/6 und pP11/3 wurden total, sowie die der Klone Lambda-VAC1 bis -12 partiell sequenziert. Das Resultat ist in Fig. 4 abgebildet. Es wurden insgesamt 1465 Basen sequenziert. Die cDNA weist einen langen, offenen Leserahmen auf, der für 320 Aminosäuren kodieren kann. Wird die DNA Sequenz in eine Aminosäuresequenz übersetzt, so können alle sequenzierten Peptide in dieser Sequenz untergebracht werden (Fig. 5). Es handelt sich daher bei dieser cDNA um jene, deren korrespondierende mRNA für VAC-protein kodiert. Da die Sequenzen der zweiten isolierten cDNA (siehe unten) für ein ähnliches, aber von VAC verschiedenes Protein kodiert, wird hier der Name VAC-alfa eingeführt.

Dem ersten ATG-Codon (Basen 35-37) geht im selben Leserahmen ein Stop-Codon voran. Die Basen 30 bis 38 erfüllen ziemlilch gut die Kozakregel (M. Kozak, Nature 308 (1984), pp. 241-246), die die Konsensussequenz in der Nähe der Translationsstartcodons mit CC(A/G)CCAUGG angibt, die entsprechende Sequenz hier lautet TCGCTATGG. Die 3′ nichttranslatierte Region ist 471 Basen lang. 15 Basen vor Beginn des poly-A Abschnitts befindet sich die Polyadenylierungssequenz AATAAA (N.J. Proudfoot et al., Nature 263 (1976), pp. 211-214). Wird eine Kettenlänge von 150 bis 200 Basen für den Poly-A Abschnitt der mRNA gerechnet, beträgt die Gesamtlänge der mRNA auf Grund der cDNA Sequenz 1600-1650 Basen. Da im Northern Blot Experiment ein höherer Wert bestimmt wurde, ist die 5′nichttranslatierte Region in keiner cDNA komplett enthalten.

Die cDNA des Klons pP6/5 weist im Gegensatz zu allen anderen cDNA Klonen an Position 100 C statt A auf. Dadurch würde sich das Triplett 98-100 (22. Codon) von GAA nach GAC ändern und für Asp anstelle von Glu kodieren. Diese Abweichung kann mehrere Ursachen haben: a) die Reverse Transkriptase baute ein falsches Nukleotid ein, b) es handelt sich um die Transkripte zweier alleler, an dieser Stelle verschiedener Gene oder c) es gibt zwei nicht allele Gene, die sich an dieser Position unterscheiden.

Der lange, offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit 320 Aminosäuren, von dem das Met-1 wahrscheinlich abgespalten, und das folgende Alanin an der Aminogruppe, möglicherweise durch Acylierung, blockiert wird. Das errechnete Molekulargewicht beträgt 35 896 D und ist höher als der Wert nach SDS-PAGE. Allerdings ist der Anteil geladener Aminosäuren (Asp, Glu, Lys, Arg, His) mit 30,6% (98/320) überdurchschnittlich hoch verglichen mit dem durchschnittlichen Wert von 25,1%. Dies würde das veränderte Wanderungsverhalten des Proteins bei der SDS-PAGE erklären. Innerhalb der stark geladenen Aminosäuren überwiegen die sauren Aminosäuren (Asp und Glu) mit 54 gegenüber den basischem (Lys und Arg) mit 41. Dies erklärt den sauren, isoelektrischen Punkt des VAC-alfa Proteins (pI=4,4 bis 4,8) VAC-alfa enthält nur ein für Cystein codierendes Triplett (Aminosäure-Position 316); eine typische N-Glykosilierungsstelle (Asn-XXX-Ser/Thr) ist nicht vorhanden. Eine Strukturanalyse der Aminosäuresequenz (modifiziert nach Pustell, J et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982) pp 4765-4782) ergibt eine vierfache Wiederholung einer 67 Aminosäure langen Sequenz (Fig. 6), in folgenden "Repeats" genannt. Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 15 Aminosäuren (22,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 28 Positionen (41,8%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure.

Ein Vergleich mit publizierten Literaturdaten (M.J. Geisow, FEBS Letters 203 (1986), pp. 99-103, M.J. Geisow et al., TIBS 11 (1986), pp. 420-423) ergab überraschenderweise, daß VAC-alfa damit zu einer größeren Gruppe Ca⁺⁺ abhängiger Phospholipidbindungsproteine gehört. Es wird eine Konsensussequenz beschrieben (Lys-Gly-fob-Gly-Thr-Asp-Glu-var-var-Leu-Ile-fil-Ile-Leu- Ala-fob-Arg; fob-hydrophob, fil-hydro-phil, var=variabel), die an der Ca⁺⁺ Bindung beteiligt sein könnte (M.J. Geisow et al., Nature 320 (1986), pp. 636-638). Diese Sequenz findet sich in jeder der vier wiederholten 67 Aminosäuren langen Subsequenzen der erfindungsgemäßen Proteine (Fig. 6). Auffällig ist auch der 6 Aminosäuren lange Abschnitt am Ende jeder Repeat, der fast ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren besteht ("oooooo" in Fig. 6).

c) Sequenzanalyse der VAC-beta cDNA

Die VAC-beta cDNA Sequenz der Klone Nr15, Nr19 und Nr22 ergab 1940 bp und geht in einen poly-A Abschnitt über (Fig. 7). 16 Basen vor dem poly-A Abschnitt findet sich das Polyadenylierungssignal AATAAA. Allerdings kommt diese Konsensussequenz bereits an der Nukleotidposition 1704-1709 vor. Weshalb diese Sequenz nicht als Polyadenylierungssignal verwendet wird, ist unbekannt. Die zusätzlich erforderliche Sequenz an der 3′Seite der AATAAA Sequenz, YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 (1984), pp. 473-474) kommt erst relativ weit entfernt vor (TGTGTTAT, Position 1735-1742); möglich, daß dies die Erklärung für ein Nichtakzeptieren dieser ersten Polyadenylierungssequenz darstellt.

Die cDNA enthält einen langen, offenen Leserahmen, der vom Beginn der cDNA bis Position 1087 reicht. Er würde ein Kodierungspotential für 362 Amninosäuren beinhalten. Aus Analogiegründen zu VAC-alfa und aufgrund der Tatsache, daß auch ein 34 000 D Protein bei der Reinigung von VAC anfällt (siehe E.P.A. 1 81 465) wurde das erste Methioninkodon (ATG, Position 107-109) als Translationsstart angenommen. Die Kozakregel ist hier nicht so gut erfüllt wie bei VAC-alfa (AAGAGATGG) auf Position 102-110).

Das resultierende Protein (VAC-beta) wäre 327 Aminosäuren lang. Es besitzt 4 Cysteinreste (Aminosäureposition 161, 206, 250 und 293) und eine potentielle N-Glykosylierungsstelle (Asn-Lys-Ser, Aminosäureposition 225-227). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 36 837 (Fig. 9). Auch in VAC-beta gibt es überdurchschnittlich viele geladene Reste: 97/327 (29%), wobei die sauren Aminosäuren (Asp+Glu: 49) über die basischen (Lys+Arg 42) überwiegen; eine Erklärung für das nach SDS-PAGE ermittelte niedere Molekulargewicht.

Auch VAC-beta zeigt eine interne Wiederholung einer 67 Aminosäuren langen Sequenz Fig. 8). Innerhalb dieser Sequenz sind 7 Aminosäuren (10,4%) in allen vier Repeats konserviert, 17 Aminosäuren (25,4%) kommen in drei von vier Repeats vor, an 25 Positionen (37,7%) enthalten jeweils zwei Repeats dieselbe Aminosäure. Auch VAC-beta zeigt gute Übereinstimmung mit der 17 Aminosäuren langen Konsensussequenz. Die Ausführungen zum VAC-alfa gelten analog für VAC-beta.

d) Genomische Southernblot Analyse

Die Analyse chromosomaler DNA aus humaner Plazenta nach Southern zeigt ein komplexes Bild. Die DNA wurde mit EcoRI, HindIII, BamHI und PstI geschnitten. Die auf Nitrozellulose transferierte DNA wurde sowohl mit einer VAC-alfa DNA (pP11/3) als auch mit einer VAC-beta DNA (pRH203) hybridisiert. Das Waschen der Filter geschah unter stringenten Bedingungen (siehe Punkt a)), d. h. mit 0,2× SSC und 65°C. Trotzdem ergaben sich bei jedem Verdau relativ viele Banden (Fig. 10). Der Vergleich der beiden Blots zeigt, daß die Kreuzreaktion von VAC-alfa und -beta DNA unter diesen Bedingungen eher auszuschließen ist. Die Vielzahl der Banden ist entweder durch die Existenz jeweils ähnlicher Gene zu dem VAC-alfa bzw. VAC-beta Gen zu erklären, oder aber es handelt sich um jeweils ein Gen, das durch viele und/oder lange Introns unterbrochen ist.

Beispiel 4 Protein-Analyse

In Fig. 11 ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen von VAC-alfa mit VAC-beta wiedergegeben. Die wiederholten Strukturen lassen sich in beiden Proteinen gleich anordnen. Die Verbindungspeptide sind ebenfalls gleich lang mit Ausnahme jener zwischen der 2. und 3. Repeat. In dieses Verbindungspeptid muß bei VAC-alfa eine Lücke eingeführt werden, um eine optimale Anpassung der beiden Sequenzen zu erlauben. Das N-terminale Peptid der beiden Proteine ist unterschiedlich lang, 19 Aminosäuren bei VAC-alfa, 25 Aminosäuren bei VAC-beta. Dieses Peptid weist auch die geringste Homologie auf. Die beiden Proteine sind an 176 von 320 Aminosäurepositionen ident, was einem Homologiegrad von 55,0% entspricht.

An dieser Stelle sei auch der Vergleich der Nukleotidsequenzen der VAC-alfa und -beta cDNAs eingefügt. Werden zwei Gene und deren Produkte miteinander verglichen, sieht man auf der DNA (=RNA) Ebene eine größere Homologie als auf der Aminosäureebene, was durch die Tatsache erklärt ist, daß bei der Nukleinsäure bereits eine Veränderung in einem Basentriplett ausreicht, um eine neue Aminosäure zu kodieren.

In Fig. 12 ist der Vergleich der kodierenden Regionen von VAC-alfa und VAC-beta cDNA wiedergegeben. Überraschenderweise zeigen die DNAs nur einen Homologiegrad von 54,2%, also etwas weniger als die beiden Proteine.

In Fig. 13 sind die Hydrophilizitätsprofile der beiden Proteine abgebildet. Dabei wurde der Algorithmus von Hopp und Wood verwendet (T.P. Hopp et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 78 (1981) pp.3824-3828). Die vier Repeatbereiche sind durch die Balken angedeutet, die Verbindungspeptide in der darunter angegebenen Sequenz eingerahmt. Dabei fällt auf, daß das Verbindungspeptid zwischen der zweiten und dritten Repeat besonders hydrophil ist. In diesem Peptid befindet sich sowohl bei VAC-alfa als auch bei VAC-beta ein Arginin an identer Position. Es wäre daher möglich, daß dieses Arginin einen bevorzugten Angriffspunkt für eine Protease mit trypsinartiger Spezifität darstellt. Dabei müßte das Molekül in zwei etwa gleich große Hälften zerfallen. Es wäre denkbar, daß bereits ein solches "Halbmolekül" eine biologische, beispielsweise eine antikoagulierende Wirkung entfalten kann. Auf der anderen Seite könnte vielleicht der Austausch dieses Arginins durch z. B. Histidin den VAC-proteinen eine größere Stabilität vermitteln.

Aus Fig. 13 ist weiterhinn leicht zu erkennen, daß weder VAC-alfa noch VAC-beta einen längeren, hydrophoben Bereich aufweisen, der entweder die Sekretion durch oder das Einlagern der Proteine in eine Membran erlauben würden. Es ist daher anzunehmen, daß es sich bei VAC-alfa und VAC-beta um intrazelluläre Proteine handelt. Wallner et al (Nature 320 (1986), pp. 77-81) berichten die Struktur des humanen Lipoxortin I, Saris et al. (Cell 46 (1986), pp. 201-212) und Huang et al. (Cell 46 (1986), pp. 191-199) Die Struktur des murinen bzw. humanen Calpactin I, das auch Lipocortin II genannt wird. Diese Proteine gehören ebenfalls zu der Klasse der Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteinen. Ihre Struktur läßt sich analog zu VAC-alfa und -beta anschreiben (Fig. 14). Die Strukturunterschiede beschränken sich im wesentlichen auf die N-terminalen Nicht-Repeatbereiche, die 46 Amino-säuren bei Lipocortin I und 37 Aminosäuren bei Lipocortin II besitzen. Die Homologien zwischen VAC-alfa und VAC-beta sind jedoch ausgeprägter als jene zwischen VAC und Lipocortin:

VAC-alfa - VAC-beta55,0% VAC-alfa - Lipocortin I41,9% VAC-alfa - Lipocortin II43,8% VAC-beta - Lipocortin I41,7% VAC-beta - Lipocortin II44,6%

Anzunehmen ist daher, daß auch die Lipocortine aufgrund ihrer analogen Struktur antikoagulierende Wirkung haben, und demzufolge als Antikoagulanzien einzusetzen sind und weiterhin, daß dies eine generelle Eigenschaft dieser Klaße von Ca⁺⁺ abhängiger Phospholipidbindungsproteine ist.

Viele Mitglieder der Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteine binden an gereinigte sekretorische Vesikel oder andere Bestandteile des Cytoskeletts (siehe R.H. Kretsinger et al., Nature 320 (1986), p. 573 für eine Zusammenfassung). Bei der Sekretion kapseln sich die Vesikel vom Golgi-Apparat der Zelle ab, wandern zur Zellmembran und fusionieren mit ihr. Dabei wird der Inhalt der Vesikel von der Zelle freigesetzt. In Analogie zur Kupplung von Erregung mit der Muskelkontraktion wurde vorgeschlagen (W.W. Douglas, Br.J.Pharmac. 34 (1968), 451), daß auch der Stimulus und die Sekretion über Ca⁺⁺ gekoppelt ist. Dabei könnten die Ca⁺⁺ abhängigen Phospholipidbindungsproteine eine wichtige Rolle spielen. In der konservierten, 17 Aminosäuren langen Region jeder Repeat besitzt VAC-alfa 5 bis 6 Hydroxylgruppen-enthaltende Aminosäuren (Asp, Glu, Thr, Ser), jeweils drei davon an identischer Position. Bei VAC-beta finden sich in jeder Repeat vier dieser Aminosäuren. Obwohl keines der Proteine die in Calmodullin, Troponin C, S-100 und Parvalbumin beobachtete EF-Hand Struktur aufweist (R.H. Kretsinger et al., CRC Crit. Rev.Biochem. 8 (1980), p119), die in diesen Molekülen für die Ca⁺⁺ Bindung verantwortlich ist, verleitet die Konservierung dieses Unterabschnitts in jeder Repeat zu dem Schluß, daß diese Region für die Ca⁺⁺ Bindung verantwortlich ist. Durch gezielte Mutationen in diesem Bereich könnte versucht werden, die biologische Aktivität von VAC-Proteinen zu verändern.

Beispiel 5 Expression von VAC-alfa in E. coli a) pRH284T: Expressionsvektor mit dem alkalischen Phosphatasepromotor und Terminator

Das Gen für die alkalische Phosphatase (PhoA) aus E. coli unterliegt einer strengen Regulation. In Gegenwart von Phosphat wird das Gen komplett abgeschaltet, bei Abwesenheit von Phosphat im Medium erfolgt Genexpression. H. Shuttleworth et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 8689 sowie C.N. Chang et al., Gene 44 (1986), pp. 121-125 beschrieben die Nukleotidsequenz dieses Gens.

Aus mehreren Oligonukleotiden wurde die Promotorregion des PhoA Gens zusammengesetzt und in EcoRI-ClaI geschnittenes pAT153 eingesetzt. Vor der ribosomalen Bindungsstelle wurde ein XhoI Stelle eingeführt. Die origniale EcoRI Stelle wird beim Einligieren des synthetischen DNA-Fragmentes zerstört. Nach der ribosomalen Bindungsstelle wurde ein Translationsstart-ATG vorgesehen, dessen G das erste Nukleotid einer SacI (=SstI) Stelle ist. Der Expressionsvektor läßt sich durch Schnitt mit SacI an dieser Stelle linearisieren und der 3′Überhang durch Behandlung mit DNA-Polymerase I - Klenow Fragment in Gegenwart von dGTP in ein gerades Ende überführen. Dadurch kann jedes beliebige Gen an dieser Stelle eingefügt werden, für korrekte Expression muß es mit der ersten Base der kodierenden Region beginnen.

Das HinIII-SalI Fragment des pAT-Anteils wurde entfernt und durch den alkalischen Phosphatase-Transkriptionsterminator ersetzt. Die originale SalI Stelle wurde zerstört. Dafür wurde sie vor dem Terminator zusammen mit der ebenfalls aus pAT153 deletierten BamHI Stelle wieder eingebracht. Die Sequenz der synthetisch hergestellten DNA ist in Fig. 15 abgebildet.

b) Expressionsklon pRH291

Der cDNA Klon pP6/5 wurde mit Bg1II und PstI geschnitten und das 980 bp lange Fragment isoliert, das den Hauptteil der kodierenden und ca. 200 bp 3′nichttranslatierte Region enthält. Mittels Oligonukleotiden wurde das fehlende 5′Ende der kodierenden Region ersetzt. Dabei wurde durch zwei Mutationen (GGC → GGT, Gly-7 und ACT → ACC, Thr-8) gliechzeitig eine KpnI-Schnittstelle in die VAC-cDNA eingeführt. Die Oligonukleotide hatten folgendes Aussehen:

Die Oligonukleotide EBI-680, -677, -678 und -682 wurden am 5′Ende phosphoryliert. EBI-678 und -680, EBI-677 und -679 sowie EBI-682 und -681 wurden paarweise auf 100°C erhitzt und langsam abgekühlt (je 100 pMol in 20 µl). Die Doppelstrang-Oligonukleotide wurden vereint und ligiert. pRH284T wurde mit SacI linearisiert, das 3′überhängende Ende durch Behandlung mit DNA-Polymerase I/ Klenow Fragment in Gegenwart von dGTP zu einem geraden Ende reduziert, und mit BamHI nachgeschnitten. Ca. 30 ng Vektor, 200 ng cDNA und 250 nMol Oligonukleotide wurden in 15 µl Lösung ligiert. Kompetente E. coli HB101 wurden mit der Ligaselösung transformiert. Der resultierende Klon wurde pRH291 benannt (Fig. 16).

Beispiel 6 Vac-beta Expression in E. coli a) Expressionsklon pRH212

Als Expressionsvektor wurde das Plasmit pER103 verwendet (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21 (1983), 237-248). Der Vektor wurden mit HindIII linearisiert. Das 5′überhängende Ende wurde mit dATP und DNA-Polymerase I/ Klenowfragment partielle eingefüllt, und der verbleibende Einzelstrangrest mit S1 Nuklease verdaut. Der Vektor wurde mit BanHI nachgeschnitten und das große Fragment isoliert (Fig. 17). Aus dem Klon pRH203 wurde das 440 bp lange MäIII-BamHI Fragment isoliert, das die Codons 13 bis 157 enthält. Das fehlende 5′Ende wurde druch Oligonukleotide ergänzt:

Dabei wurden für E. coli optimale Codons verwendet (z. B. R. Grantham et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 1893-1912). Dieser Codonaustausch resultiert in einer neuen HindIII-Stelle bei Codon 5 bis 7. Das Oligonukleotid EBI-306 wurde phosphoryliert, mit EBI-306 hybridisiert und mit dem VAC-beta Fragment ligiert. Nach dem Nachschnitt mit BamHI wurde das 5′terminale VAC-Fragment in den vorbereiteten pER103 Vektor ligiert. Der entstehende Klon wurde pRH211 benannt. Um die für VAC-beta kodierende Region zu ergänzen, wurde aus dem Klon pRH201 das 1230 bp lange BamHI-SpHI Fragment isoliert. Der ca. 200 bp lange pBR322 Abschnitt von BamHI bis SphI aus dem Plasmid pRH211 wurde entfernt und durch den entsprechenden VAC-cDNA Teil ersetzt. Es resultierte der Klon pRH212. Das EcoRI-BamHI Fragment, das den Trp-Promotor (S. marcescens), die ribosomale Bindungsstelle und den synthetisch hergestellten Beginn des VAC-beta Gens enthält, wurde durch Sequenzieren überprüft.

b) Expression von VAC-beta (pRH212)

Der Nachweis des plasmidkodierten VAC-beta erfolgte im Maxizell-system (A. Sancar et al., J. Bacteriol. 137 (1979), pp. 692-693.). Ecoli CSR603 (F, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, reca1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, Lambda, supE44) wurde mit pRH212 transformiert und bis zu einer OD₆₀₀ bei 37°C gezüchtet. 20 ml Kultur wurden in einer offenen Petrischale mit einer UV-Germicidlampe (15W) aus 50 cm Entfernung 5 Sekunden lang bestrahlt und anschließend 1 Stunde weiter inkubiert. Der Kultur wurden 100 µg D-Cycloserin zugesetzt. Nach 16 Stunden wurden die Bakterien abzentrifugiert, zweimal mit Hershey-Salzlösung gewaschen (5,4 g/l NaCl, 3,0 g KCl, 1,1 g/l NH₄Cl, 15 mg/l CaCl₂×2 H₂O, 0,2 g/l MgCl₂×6 H₂O, 0,2 mg/l FeCl₃×6 H₂O, 87 mg/l KH₂POI₄, 12,1 g/l Tris pH=7,4), in 5 ml Hersheymedium resuspendiert (pro 100 ml Hersheysalze: 2,0 ml 20% Glukose, 0,5 ml 2% Threonin, 1,0 ml 1% Leucin, 1,0 ml Prolin, 1,0 ml 2% Arginin, 0,1 ml 0,1% Thiamin-HCl) und mit 20 µg/ml Indolacrylsäure 2 Stunden inkubiert. Nach Zusatz von 5 µCi/ml ³⁵S-Methionin und weiterer Inkubation bei 37°C (1 Stunde) wurden die plasmidkodierten Proteine radioaktiv markiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und in 200 µl SDS-Probenpuffer aufgenommmen (Lämmli-Gel System, z. B. L.G. Davies et al., Methods in Molecular Biology (1986) pp. 306-310). Die markierten Produkte wurden auf einem 15% Acrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und an Kodak X-Omat S Film exponiert. Als Referenz wurde gereinigtes VAC-alfa Protein mitlaufen gelassen und durch Anfärben sichtbar gemacht. VAC-alfa läuft etwas schneller als das PRH212 kodierte VAC-beta, wie es auch dem Molekulargewicht nach zu erwarten war. Die Expression von VAC-beta ist außerdem durch Zugabe des Induktors Indolacrylsäure stimulierbar (Fig. 18).

c) Expressionsklon pRH292

Der Expressionsverstärker pRH284T wurde mit SacI linearisiert und die 3′überhängenden Ende mit DNA-Polymerase I/Klenowfragment und dGTP in gerade Enden übergeführt. Der Vektor wurde mit SalI nachgeschnitten, und das große Fragment isoliert. Das HindIII-SalI Insert des Klons pRH212 wurden isoliert. 0,2 pMol des Oligonukleotidpaares

wurde mit 0,2 pMol VAC-beta Insert und 0,015 pMol vorbereiteten pRH284T ligiert. E. coli HB101 wurde mit der Ligaselösung transformiert. Der resultierende Klon wurde pRH292 benannt (Fig. 19).

Claims (64)

1. DNA, kodierend für ein Polypeptid/Protein mit im wesentlichen den biologischen Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei XXX für GAA oder GAC steht.

3. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht.

4. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls XXX für GAA oder GAC steht und/oder nach demletzten AGA ein Stop-Codon steht.

5. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls vor dem ersten GAC ein Initiationscodon steht.

6. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls nach dem letzten AGG ein Stopcodon steht.

7. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entspricht, wobei gegebenenfalls vor dem ersten GAT ein Initiationscodon steht.

8. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Abschnitt, der für die Linker-Sequenz zwischen der zweiten und dritten Repeat-Struktur kodiert, ein Oligonukleotid eingefügt wird, das für eine Erkennungssequenz einer spezifischen Protease kodiert.

9. DNA nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das für Arginin +161 (VAC-alfa) bzw. +167 (VAC-beta) kodierende Triplett ersetzt wird durch ein Codon, das für eine Aminosäure kodiert, die nicht von Trypsin als bevorzugte Spaltstelle erkannt wird, beispielsweise für Histidin.

10. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für Lysin und/oder Arginin kodierenden Tripletts gezielt ersetzt werden durch Tripletts, die für Histidin kodieren.

11. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das oder gegebenenfalls die für Cystein kodierenden Tripletts ersetzt wird/werden durch für Serin oder Valin kodierende Tripletts.

12. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid/Protein mit Repeat-Bereichen kodiert.

13. DNA nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine der Repeat-Bereiche kodiert.

14. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die für die vollständigen Repeats kodierenden Bereiche umgeordnet sind.

15. DNA nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die für die 17 Aminosäuren der konvervierten Region kodierenden Bereiche modifiziert sind.

16. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die für die 17 Aminosäuren der konservierten Region kodierenden Bereiche vollständig oder teilweise ersetzt werden

• a. bei den VAC-Proteinen durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren bei den Pipocortinen kodieren,
• b. bei VAC-alfa durch Bereiche die die entsprechenden Aminosäuren des VAC-bata kodieren und umgekehrt,
• c. bei Lipocortin I durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren des Lipocortins II kodieren und umgekehrt,
• d. bei den Lipocortinen durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren bei den VAC-Proteinen kodieren oder
• e. bei den übrigen Polypeptiden/Proteinen durch Bereiche, die die entsprechenden Aminosäuren der jeweils anderen Polypeptide/Proteine kodieren.

17. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche, die für das N-terminale Peptid kodieren ausgetauscht werden durch Oligonukleotide, die für das N-terminale Peptid eines der anderen, eine Repeat-Struktur aufweisenden Proteine kodiert.

18. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem N-terminalen 5′-Ende eine für den jeweiligen Wirt homologe Signalsequenz vorangestellt ist.

19. DNA nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalsequenz am 3′-Ende eine spezifische Erkennungs-Spaltstelle für eine Protease kodiert.

20. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem N-terminalen 5′-Ende eine für einen Fusionsproteinanteil kodierende Sequenz vorangestellt ist.

21. DNA nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Fusionsproteinanteil kodierende DNA am 3′-Ende eine spezifische Erkennungs-Spaltstelle für eine Protease kodiert.

22. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Allel zu einer der in der vorhergehenden Ansprüche beschriebenen DNA darstellt.

23. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine degenerative Form einer der in den vorhergehenden Ansprüchen beschriebenen DNA darstellt.

24. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem der DNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 23 unter Bedingungen hybridisieren, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 90% erkennen lassen, wobei die DNA aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein kann und mit den DNA-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 23 durch Mutation, Nukleotid-Substitutionen, Nukleotid-Deletionen, Nukleotid-Insertionen und Nukleotid-Inversionen verwandt sein kann und für eine Polypeptid/Protein mit im wesentlichen den biologischen Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine kodiert.

25. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einen Vektor eingefügt ist.

26. DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Vektor in funktioneller Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, in Mikroorganismen und Säugetierzellen replizierbar.

27. DNA nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist, replizierbar in Prokaryoten.

28. DNA nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist, replizierbar in Eukaryoten.

29. DNA nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Säuretierzellen replizierbar ist.

30. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einer DNA nach einem der Ansprüche 25 bis 29 transformiert ist.

31. Wirtsorganismus nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Prokaryot, vorzugsweise E. coli ist.

32. Wirtsorganismus nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Eukaryot ist.

33. Wirtsorganismus nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Säugetierzellinie ist.

34. Verfahren zur Herstellung von DNA-Molekülen die für Polypeptide/Proteine im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular antikoagulierenden Proteine kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer genomischen DNA-Bibliothek das für dieses Polypeptid kodierende Gen isoliert oder aus der zu diesem Gen gehörenden mRNA eine komplementäre für dieses Polypeptid kodierende DNA mit Hilfe des Enzyms Revese Transkiptase herstellt oder daß die für dieses Polypeptid kodierende DNA mit Hilfe chemisch und/oder enzymatischer Verfahren hergestellt wird.

35. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA einer der in den Ansprüchen 1 bis 23 beschriebenen entspricht.

36. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA eine mit entsprechenden Enden versehene DNA einfügt, die für ein Polypeptid im wesentlichen mit den Eigenschaften der vaskular­ antikoagulierenden Proteine kodiert.

37. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA, die Expressionkontrollsequenzen enthält, eine mit entsprechenden Enden versehene DNA, die für ein Polypeptid mit im wesentlichen den Eigenschaften von vaskular-antikoagulierenden Proteinen kodiert, so einfügt, daß die Expressionskontrollsequenzen die eingefügte DNA reguliert.

38. Verfahren zur Herstellung transformierter Wirtsorganismen nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirtsorganismus mit einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 25 bis 29 transformiert.

39. Polypeptid, im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine.

40. Polypeptid nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 kodiert wird.

41. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, völlig frei von homologen Polypeptiden.

42. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein leader-Peptid enthält.

43. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Fusionsproteinanteil enthält.

44. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden im wesentlichen mit den Eigenschaften der vascular-antikoagulierenden Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß

• a. ein geeigneter Wirtsorganismus mit genetischen Informationen, kodierend für ein VAC-Protein transformiert,
• b. die Information zur Produktion des VAC-Proteins im Wirtsorganismus exprimiert und
• c. das VAC-Protein isoliert wird.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus gemäß den Ansprüchen 30 bis 33 definiert ist.

46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß die genetischen Informationen in den DNA-Molekülen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 enthalten sind.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß das VAC-Protein gemäß einem der Ansprüche 39 bis 43 definiert ist.

48. Polypeptid herstellbar nach einem der Ansprüche 44 bis 47.

49. Pharmazeutisch tolerierbare Salze der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48

50. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

51. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 zur Herstellung pharmazeutischer Präparate.

52. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 als blutgerinnungshemmende Mittel.

53. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 als antinflammatorische Mittel.

54. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 als Thrombin-inhibierende Mittel.

55. Mittel zur therapeutischen Behandlung, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 enthält.

56. Hybrid-Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Antikörper gegen eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 sezerniert.

57. Monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die Wirkung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 ganz oder teilweise neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide binden.

58. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 57 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48.

59. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 57 zur Reinigung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48.

60. Test Kit zur Bestimmung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonale Antikörper nach Anspruch 57 enthält.

61. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit einem der Polypeptide nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 immunisiert, B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert, die die monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybrid-Zellinien subkloniert und in vitro oder in vivo kultiviert werden.

62. Polypeptid nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48, dadurch gekennzeichnet, daß es als Dimeres, Trimeres, Tetrameres oder Multimeres vorliegt.

63. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte oder kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 mit einem inerten Träger, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

64. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte oder kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 39 bis 43 oder 48 mit zum Beispiel Polyethylenglykol, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.